1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-------------------------

PHẠM HOÀI LINH LY

NGHIÊN CỨU SỰ LƯU HÀNH CỦA VIRUS CÚM B TẠI MIỀN BẮC

VIỆT NAM

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60420107

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : TS. Nguyễn Lê Khánh Hằng

GS. TS. Phạm Văn Ty

HÀ NỘI-2014

2

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.

Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công

bố trong bất kỳ công trình nào khác.

HỌC VIÊN

Phạm Hoài Linh Ly

3

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới:

Ban Giám hiệu Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học QGHN

Ban Giám đốc, Ban Chủ nhiệm Khoa Virút, Viện Vệ sinh Dịch tễ TƯ

Đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Tôi xin được tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn

Lê Khánh Hằng, Khoa Virút, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã tận tình chỉ bảo

và dìu dắt tôi trong suốt quá trình nghiên cứu từ bước đầu tới khi hoàn thiện luận

văn, tạo mọi điều kiện nghiên cứu thuận lợi để tôi có được kết quả như ngày hôm

nay. Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến GS. TS. Phạm Văn Ty,

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN đã hướng dẫn tôi những kiến thức

chuyên ngành hữu ích trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Tôi xin trân trọng cảm ơn các Thầy, Cô Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh

học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN đã cho tôi những kiến thức

chuyên ngành quý báu và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành khóa học.

Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới PGS. TS. Lê Thị Quỳnh Mai, Phó Viện

trưởng Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, ThS. Hoàng Vũ Mai Phương, ThS.

Nguyễn Cơ Thạch cùng các anh chị công tác tại Phòng Thí nghiệm Cúm, Khoa

Virút, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, nhiệt tình

hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn.

Cuối cùng, tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và đồng

nghiệp - những người đã tiếp thêm cho tôi nguồn động viên quý giá, luôn bên cạnh

chia sẻ và giúp đỡ để tôi đạt được thành quả hôm nay.

Hà Nội, ngày 14 tháng 4 năm 2014

Phạm Hoài Linh Ly

4

MỤC LỤC

Trang phụ bìa

Lời cam đoan

Mục lục

Danh mục các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình

MỞ ĐẦU………………………………………………………................ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN……………………………………………. 3

1.1. VIRUS CÚM B…………..…………………………………...…… 3

1.1.1. Đặc điểm chung………………………………..………………… 3

1.1.2. Hình thái và cấu trúc virion của virus cúm B................................. 4

1.1.3. Cấu trúc phân tử của virus cúm B và chức năng….……………... 5

1.1.4. Cơ chế nhân lên của virus cúm B……………………..…………. 8

1.2. SỰ LƯU HÀNH CỦA VIRUS CÚM B TRÊN THẾ GIỚI…….. 10

1.3. SỰ LƯU HÀNH CỦA VIRUS CÚM B TẠI VIỆT NAM………. 12

1.4. SỰ TIẾN HÓA CỦA VIRUS CÚM B…………..…..…………… 13

1.5. BIỂU HIỆN LÂM SÀNG VÀ SINH BỆNH HỌC BỆNH CÚM.. 14

1.5.1. Biểu hiện lâm sàng của bệnh cúm……………………………….. 14

1.5.2. Sinh bệnh học bệnh cúm………………………….……………… 14

1.6. ĐIỀU TRỊ VÀ DỰ PHÒNG BỆNH CÚM……………………….

1.6.1. Các thuốc kháng virus……………………………...……...……..

15

15

5

1.6.2. Dự phòng…………….……………………………………...……. 17

1.7. CHẨN ĐOÁN VIRUS HỌC…...………………………..………..

1.7.1. An toàn phòng thí nghiệm………………………………………...

1.7.2. Thu thập mẫu để chẩn đoán virus …...………….……………...…

1.7.3. Phương pháp phân lập chủng và định typ virus……………..........

1.7.4. Phương pháp xác định trình tự gen (Sequence)………………......

19

19

20

20

21

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…. 23

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU..………………………..……….. 23

2.2. VẬT LIỆU...……………………………………………………… 23

2.2.1. Chủng virus cúm B……….……………………………………….. 23

2.2.2. Sinh phẩm……………...………………………………………….. 23

2.2.3. Trang thiết bị và dụng cụ………………..………….……...……… 25

2.3. PHƯƠNG PHÁP..………………..…………………...…………. 25

2.3.1. Định typ virus bằng phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu

(HAI)……………………………………………………..………..

25

2.3.2. Giải trình tự gen…………………………...………...………….... 27

2.3.3. Phương pháp phân tích kết quả và xử lý số liệu………..…………. 34

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN……………….………….…. 36

3.1. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ KHUẾCH ĐẠI CÁC CHỦNG

VIRUS CÚM B TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM, 2010-2012…….……...

3.1.1. Sự lưu hành của virus cúm B tại miền Bắc Việt Nam, 2010-2012.

3.1.2. Kết quả phân lập virus cúm B tại miền Bắc Việt Nam, 2010-

2012………………………………………………….……….

36

36

37

6

3.2. ĐẶC TÍNH KHÁNG NGUYÊN CỦA VIRUS CÚM B, 2010-

2012 ………………………………………………………………………

39

3.3. ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ PROTEIN HA CÁC CHỦNG

VIRUS CÚM B TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM, 2010-2012……….…...

46

3.3.1. Sự phân bố các chủng virus cúm B theo thời gian...……………… 46

3.3.2. Kết quả khuếch đại đoạn gen HA của virus cúm B………………. 46

3.3.3. Cây gia hệ gen HA……………………………………………...… 48

3.3.4. Protein HA….………………...…………………………………… 52

3.4. ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ PROTEIN NA CÁC CHỦNG

VIRUS CÚM B TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM, 2010-2012……………

3.4.1. Kết quả khuếch đại đoạn gen NA của virus cúm B.……………....

57

57

3.4.2. Cây gia hệ gen NA………………………………………………... 61

3.4.3. Protein NA………………………………………….…………….. 65

KẾT LUẬN……………………………………………………………… 72

KIẾN NGHỊ………………………………………………………........... 74

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

7

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Acid Deoxy Ribonucleic

ARN Acid Ribonucleic

CDC Centers for Disease Control and Prevention (Trung tâm phòng chống

và kiểm soát bệnh tật Hoa Kỳ)

HA Hemaglutination Assay (Phương pháp ngưng kết hồng cầu)

HI Hemaglutination Inhibition test (Phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu)

ILI Influenza like illness (Hội chứng cúm)

MDCK Madin-Darby Canine Kidney Cells (Tế bào thận chó thường trực)

PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase)

QIV Quadrivalent Influenza Vaccine (Vắc xin gồm 4 thành phần virus

H1N1, H3N2, B/Yamagata và B/Victoria)

RNP Phức hợp Ribonucleoprotein

TCYTTG World Health Oganization (Tổ chức Y tế Thế giới )

VSDTTƯ Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương

8

DANH MỤC BẢNG

Bảng Tên bảng Trang

1.1. Các phân đoạn ARN của virus cúm và chức năng………................ 5

3.1. Kết quả phân lập virus cúm B tại miền Bắc Việt Nam, 2010-2012.. 38

3.2. Kết quả định typ virus cúm B bằng phương pháp HAI, 2010-2012.. 39

3.3. Hiệu giá HI của các chủng virus cúm B, 2010-2012………………. 41

3.4. So sánh hiệu giá HAI giữa hai dòng B/Victoria và B/Yamagata….. 42

3.5. So sánh kháng nguyên virus cúm B tại Miền Bắc Việt Nam với

thành phần vắc xin cúm tại Bắc và Nam Bán cầu theo khuyến cáo

của TCYTTG, 2010-2012………………………………………….

43

3.6. Số lượng chủng phân tích gen HA và NA ………………………… 46

3.7. Vị trí axit amin thay đổi trên protein HA dòng B/Vitoria, 2010-

2012................................................................................................... 53

3.8. Vị trí axit amin thay đổi trên protein HA dòng B/Yamagata, 2010-

2012…………………………………................................................ 55

3.9. Số lượng trung bình axit amin thay đổi trên protein HA so với

virus dự tuyển vắc xin của TCYTTG, 2010 -2012………………… 57

3.10. Vị trí axit amin thay đổi trên protein NA dòng B/Vitoria, 2010-

2012………………………………………………………………… 64

3.11. Vị trí axit amin thay đổi trên protein NA dòng B/Yamagata, 2010-

2012………………………………………………………………… 65

3.12. Số lượng trung bình axit amin thay đổi trên protein NA so với

virus dự tuyển vắc xin của TCYTTG, 2010 -2012………………… 66

9

DANH MỤC HÌNH

Hình Tên hình Trang

1.1. Mô hình cấu trúc chung của virus cúm...................................... 4

1.2. Chu trình nhân lên của virus cúm ……………………………. 8

1.3. Các vị trí đột biến trên cấu trúc không gian 3 chiều của

Neuraminidase ………………………………….……………. 16

3.1. Sự lưu hành của virus cúm B tại miền Bắc Việt Nam, 2010 -

2012…………………………………....................................... 37

3.2. Tỷ lệ lưu hành 2 dòng kháng nguyên virus cúm B theo năm ... 40

3.3. Sản phẩm gen HA sau PCR …………………………………..

47

3.4. Sản phẩm gen HA sau khi tinh sạch…………………………. 47

3.5. Cây gia hệ gen HA (1140 nucleotide) dòng B/Yamagata và

dòng B/Victoria, 2010-2012.........................…………………. 48

3.6. Cây gia hệ gen HA (1140 nucleotide) dòng B/Victoria, 2010-

2012…………………………………………….……………... 49

3.7. Cây gia hệ gen HA (1140 nucleotide) dòng B/Yamagata,

2010-2012…………………………………..………………… 50

3.8. Vị trí axit amin thay đổi trên protein HA dòng B/Victoria…… 53

3.9. Vị trí axit amin thay đổi trên protein HA dòng B/Yamagata..... 54

3.10. Số axit amin khác nhau trên protein HA dòng B/Victoria giữa

các chủng nghiên cứu và chủng dự tuyển vắc xin……………. 56

10

3.11. Số axit amin khác nhau trên protein HA dòng B/Yamagata

giữa các chủng nghiên cứu và chủng dự tuyển vắc xin………. 56

3.12. Sản phẩm gen NA sau PCR…………………………………... 58

3.13. Sản phẩm gen NA sau khi tinh sạch…………………………. 58

3.14. Cây gia hệ gen NA (1557 nucleotide) dòng B/Victoria và

dòng B/Yamagata, 2010-2012……………..…………………. 59

3.15. Cây gia hệ gen NA (1557 nucleotide) dòng B/Victoria, 2010-

2012............…………………………………………………… 60

3.16. Cây gia hệ gen NA (1557 nucleotide) dòng B/Yamagata,

2010-2012………………………………………………….…. 61

3.17. Vị trí axit amin thay đổi trên protein NA dòng B/Victoria…… 63

3.18. Vị trí axit amin thay đổi trên protein NA dòng B/Yamagata… 64

3.19. Số axit amin khác nhau trên protein NA dòng B/Victoria giữa

các chủng nghiên cứu và chủng dự tuyển vắc xin………….… 65

3.20. Số axit amin khác nhau trên protein NA dòng B/Yamagata

giữa các chủng nghiên cứu và chủng dự tuyển vắc xin………. 66

3.21. Các vị trí axit amin trên protein NA của 2 dòng B/Yamagata

và B/Victoria liên quan đến đột biến kháng thuốc hoặc giảm

độ nhạy của thuốc oseltamivir và zanamivir………………… 68

11

MỞ ĐẦU

Hàng năm trên Thế giới cũng như tại Việt Nam, virus cúm vẫn tiếp tục gây

ra các vụ dịch/ đại dịch cúm với tỉ lệ mắc và tử vong cao [31]. Trong đó, virus cúm

A được quan tâm nghiên cứu hơn cả do loại virus này có khả năng gây ra các

dịch/đại dịch nghiêm trọng, gần đây nhất có thể kể đến đại dịch H1N1 (2009) cũng

như các vụ dịch do virus cúm độc lực cao lây truyền từ gia cầm sang người

A/H5N1. Nguyên nhân là do virus cúm A có đối tượng gây nhiễm đa dạng như gia

cầm, thủy cầm, chim di cư, động vật có vú và người [8].

Trong nhiều thập kỷ qua, virus cúm B được biết đến như một loại virus gây

bệnh cảm lạnh thông thường, không gây thành dịch/đại dịch lớn. Khác với virus

cúm A, virus cúm B chỉ có những thay đổi nhỏ kháng nguyên (đột biến) [43]. Tuy

nhiên, trong một số nghiên cứu đã cho thấy triệu chứng lâm sàng khi nhiễm cúm B

cũng như tỷ lệ nhập viện và tử vong liên quan đến cúm B và viêm phổi do bội

nhiễm cũng tương tự khi nhiễm virus cúm A. Tại Mỹ, trong giai đoạn 2004-2008,

trong 309 trẻ tử vong liên quan đến virus cúm mùa có 34% trường hợp tử vong do

virus cúm B [23]. Trong mùa cúm 2011-2012, tỷ lệ trẻ em tử vong do virus cúm B

chiếm tới 38 % (44/115), trong đó chỉ có 50% số trẻ em được điều trị các loại thuốc

kháng virus. Chính vì vậy, các trường hợp nhiễm cúm B này đã không có cơ hội

được điều trị và can thiệp kịp thời tránh bội nhiễm, biến chứng dẫn tới tử vong [18].

Khi nghiên cứu 45 trường hợp tử vong do virus cúm B cho thấy 1/3 trong số này bội

nhiễm vi khuẩn Staphylococcus aureus, trong đó số trường hợp tử vong trong 3 và 4

ngày sau khi nhiễm virus là 50% và 70% [20]. Như vậy, thời gian từ khi nhiễm

virus cúm B đến khi tử vong nhanh hơn so với virus cúm A/H1N1 1918, A/H2N2

1957, A/H3N2 1968, A/H1N1pdm 2009 và A/H3N2 [21, 26, 32, 35,]. Mặt khác,

virus cúm B kết hợp với các virus gây viêm đường hô hấp khác sẽ có khả năng gây

biến chứng nguy hiểm cho trẻ em, người già, người suy giảm miễn dịch hoặc mắc

các bệnh mạn tính và phụ nữ mang thai nếu không có biện pháp phòng ngừa kịp

thời.

12

Trên thế giới, từ những năm 1970, vắc xin cúm được sản xuất là vắc xin đa

giá, thành phần vắc xin bao gồm 2 phân týp virus cúm A (A/H1N1, A/H3N2) và 1

dòng virus cúm B (Trivalent influenza vaccine - TIV). Vào những năm của thập kỷ

80, virus cúm B đã xuất hiện 2 dòng, B/Yamagata và B/Victoria, lưu hành đồng thời

ở nhiều nước nhưng thành phần vắc xin vẫn lựa chọn chủng đại diện cho một dòng

kháng nguyên virus cúm B [37, 48]. Vì vậy, những năm virus cúm B lưu hành cả 2

dòng kháng nguyên thì hiệu quả của vắc xin dự phòng sẽ hạn chế. Mặt khác, nhiều

năm đã có sự không phù hợp giữa chủng virus cúm B đang lưu hành và chủng virus

cúm B được lựa chọn trong thành phần vắc xin hàng năm.

Tại Việt Nam, kể từ khi dịch viêm đường hô hấp cấp tính nặng (SARS), cúm

gia cầm A/H5N1 xuất hiện năm 2003 đến nay gánh nặng bệnh cúm gần đây đã được

quan tâm nhiều hơn. Tuy nhiên, virus cúm B dường như vẫn chưa đươc quan tâm

đúng mực. Với những gánh nặng bệnh của virus cúm B như vậy, việc triển khai

nghiên cứu về sự lưu hành, đặc điểm di truyền cũng như đặc tính kháng nguyên của

virus cúm B tại Việt Nam là hết sức cần thiết. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên

cứu đề tài:

“Nghiên cứu sự lưu hành của virus cúm B tại miền Bắc Việt Nam”

Với mục tiêu:

1. Xác định đặc điểm di truyền gen HA và NA của virus cúm B lưu hành tại miền

Bắc Việt Nam, 2010-2012.

2. Xác định đặc tính kháng nguyên và các axit amin thay đổi liên quan đến sự thay

đổi đặc tính kháng nguyên của virus cúm.

13

Chương 1

TỔNG QUAN

1.1. VIRUS CÚM B

1.1.1. Đặc điểm chung

Virus cúm B thuộc họ Orthomyxoviridae [9], ngoài ra trong họ này còn có

các nhóm virus khác như: virus cúm A, virus cúm C, virus Thogoto và virus Isa.

Trong đó, virus cúm A lưu hành phổ biến trên gia cầm, người và các động vật khác

như lợn, ngựa..., là căn nguyên gây nên các đại dịch lớn trên toàn cầu. Virus cúm B

và C chỉ lưu hành chủ yếu ở người và thường chỉ gây nên các vụ dịch vừa và nhỏ

[8]. Gây ra dịch bệnh theo mùa là đặc tính của virus cúm A và B, xảy ra chủ yếu

vào cuối mùa thu và đầu mùa đông. Khi có những thay đổi lớn kháng nguyên

(antigenic shift) xuất hiện ở kháng nguyên của virus cúm A, các vụ dịch lớn có thể

xảy ra với tỷ lệ mắc bệnh và tử vong cao. Virus cúm B không có những thay đổi lớn

kháng nguyên nhưng có thể tiến hóa bởi những thay đổi nhỏ kháng nguyên

(antigenic drift) và không gây nên các vụ đại dịch nghiêm trọng. Tuy nhiên những

biến chứng thể nặng có thể dẫn tới tử vong do virus cúm B đã được ghi nhận.

Danh pháp quốc tế được quy định cho virus cúm B được viết như sau: B/nơi

phân lập/mã số PTN/năm phân lập (ví dụ: B/HongKong/330/2001). Do sự thay đổi

về kháng nguyên bề mặt của virus cúm B hầu như không quan sát được nên danh

pháp quốc tế của virus cúm B không có sự tham gia của kháng nguyên bề mặt HA

và NA như đối với danh pháp quốc tế được quy định cho virus cúm A.

Virus cúm B được phân chia thành 2 dòng kháng nguyên phân biệt vào

những năm 1980, đó là dòng B/Victoria (B/Victoria/2/87-lineage viruses) và dòng

B/Yamagata (B/Yamagata/16/88-lineage viruses). Các dòng virus này được đặt tên

sau khi xuất hiện các đại diện đầu tiên là B/Victoria/2/87 - like virus và

B/Yamagata/16/88 - like virus [48].

14

1.1.2. Hình thái và cấu trúc của virus cúm B

Thành phần cấu trúc của virus cúm B gồm có: 1% ARN, 70% protein, 20%

lipit và 5-8% carbohydrate. Virion cúm (hạt virus hoàn chỉnh, dạng virus nghỉ ở

ngoài tế bào) có hình dáng rất đa dạng: hình cầu, hình trứng hoặc hình sợi kéo dài

tới 2000nm, đường kính trung bình từ 80-120nm. Virus cúm B có cấu trúc phức tạp

và có vỏ ngoài bao bọc. Vỏ ngoài virus có bản chất là protein có nguồn gốc từ màng

tế bào chất của vật chủ, bao gồm một số glycoprotein và một số protein dạng trần

không được glycosyl hoá. Các virion cúm có các tính chất hóa lý như rất nhạy cảm

khi xử lý bằng cách đun nóng, dùng dung môi lipit, chất tẩy rửa không chứa ion,

formaldehyde, tác nhân ô xi hóa, khả năng lây nhiễm của các virus cúm cũng bị

giảm đi sau khi chúng tiếp xúc với bức xạ.

Hình 1.1. Mô hình cấu trúc chung của virus cúm

*Nguồn: Funtional and structure studies of influenza B virus Hemagglutinin

by Fengyun Ni [22 ]

Trên bề mặt vỏ ngoài virus có đính các gai glycoprotein, đó là các kháng

nguyên haemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA). Virus cúm C chỉ có một gai

glycoprotein. Protein HA gây ngưng kết hồng cầu, có vai trò quyết định trong việc

15

gắn virus vào tế bào chủ, protein NA có chức năng phá vỡ liên kết giữa virus và tế

bào chủ để giải phóng virus ra khỏi tế bào nhiễm. Tỉ lệ HA/NA là 4/1 (hình 1.1).

1.1.3. Cấu trúc phân tử của virus cúm B và chức năng

Genome của virus cúm B gồm 8 phân đoạn giống như virus cúm A, còn

virus cúm C chỉ gồm 7 phân đoạn, trên mỗi phân đoạn có thể ghi dấu cho nhiều mật

mã di truyền. Sợi ARN của virus cúm là sợi đơn âm, có chiều dài khoảng ~13.6kb

đối với virus cúm A và ~14.6kb đối với virus cúm B [6]. Mỗi phân đoạn mã hoá

cho 1 hoặc 2 protein cấu trúc hoặc không cấu trúc.

Bảng 1.1. Các phân đoạn ARN của virus cúm và chức năng [52]

Phân

đoạn

ARN

Protein Chức năng

1 PB2 Tìm thấy trong quá trình tổng hợp ARN thông tin

(mRNA). Đóng vai trò làm enzyme phiên mã: gắn kết,

kéo dài, tham gia vào quá trình sinh tổng hợp virus thế

hệ mới trong tế bào chủ

2 PB1

3 PA Tìm thấy trong quá trình tổng hợp ARN virion (vRNA).

4 HA

(Haemagglutinin

)

Phân tử có cấu trúc trimer, cắt bởi enzyme thuỷ phân

thành HA1 và HA2, là cơ sở cho khả năng nhiễm trùng.

HA gắn với tế bào túc chủ, dung hợp giải phóng phức

hợp ribonucleoprotein (RNP), mở đầu cho quá trình

nhân lên của virus.

5 NP

(Nucleoprotein)

Là thành phần protein chủ yếu của phức hợp RNP, chứa

một trong các kháng nguyên đặc hiệu týp, phân biệt 3

16

týp cúm A, B, C.

6 NA

(Neuraminidase)

NB (=M2)

Phân tử có cấu trúc tetramer, thuỷ phân bằng protease,

cho phép virus tiến qua lớp niêm dịch tới các tế bào của

đường hô hấp trong quá trình nhiễm trùng.

Loại bỏ phân tử axít sialic của phân tử HA từ các virion

mới được tổng hợp, làm lộ HA ra ngoài, tăng khả năng

nhiễm trùng.

7 M1-M2

(matrix protein)

M1: là kháng nguyên đặc hiệu týp, có chức năng ổn

định cấu trúc virus, điều khiển hoạt tính RNA-

polymerase và tham gia vào quá trình lắp ráp virus

(70%).

M2: kênh ion.

8 NS1-NS2 Là protein không cấu trúc, kết thúc quá trình tổng hợp

protein của tế bào túc chủ, chỉ có trong tế bào nhiễm

virus.

Qua những nghiên cứu về hoạt động chức năng các protein của virus cúm

trong quá trình nhân lên và sao chép trong tế bào chủ cho thấy vùng gen HA của

virus cúm B tiến hóa chậm hơn vùng gen của virus cúm A. Phân đoạn HA của virus

cúm B có cấu trúc và chức năng tương tự phân đoạn HA của virus cúm A, đó là một

kháng nguyên bề mặt chủ yếu, giúp virus bám dính và xâm nhập vào tế bào chủ [10,

47]. Khác với virus cúm A, virus cúm B được ghi nhận chỉ lưu hành ở người và hải

cẩu. Vì vậy chỉ quan sát thấy các thay đổi nhỏ kháng nguyên ở virus cúm B. Các

thay đổi nhỏ kháng nguyên ở phân đoạn HA của virus cúm B xuất hiện như ở virus

cúm A, bởi sự tích tụ của các axit amin thay thế trong polypeptide HA1, nhưng chỉ

17

khoảng ¼ tỉ lệ này ở virus cúm A. Do đó virus cúm B không gây ra đại dịch như

một số virus cúm A.

Vào những năm 1980, virus cúm B đã được phân chia thành hai dòng kháng

nguyên phân biệt là B/Victoria và B/Yamagata. Hai dòng virus cúm B được phân

biệt bởi sự khác nhau ở axit amin vị trí 269. Axit amin vị trí 269 của dòng

Yamagata là Pro nhưng ở tất cả các virus dòng Victoria là Ser. Sự biến đổi từ Pro

sang Ser là một biến đổi bất bảo toàn, liên quan đến sự phân phối điện tích (trung

tính thành có cực) và hình dạng của các axit amin [19].

Hiện nay, thử nghiệm ngăn ngưng kết hồng cầu (Heamagglutinin inhibition

test - HI) sử dụng kháng huyết thanh đặc hiệu với hai dòng virus đã cho phép phân

biệt hai dòng kháng nguyên này của virus cúm B.

18

1.1.4. Cơ chế nhân lên của virus cúm B

Hình 1.2. Chu trình nhân lên của virus cúm

* Nguồn: Funtional and structure studies of influenza B virus Hemagglutinin [22]

Đầu tiên, virus sẽ gắn vào các thụ thể đặc hiệu trên màng sinh chất của tế bào

chủ nhờ gai glycoprotein HA theo nguyên tắc khóa - chìa. Các thụ thể đặc hiệu có

bản chất là các axit sialic (N- acetyl neuraminic acid - NANA). Sau đó virus xâm

nhập vào bên trong tế bào theo cơ chế nhập bào. Các virion virus ấn sâu vào màng

Gắn vào các

receptor Nảy chồi

Nhập bào

Thể nội bào

Cởi vỏ

Màng tế bào Màng nhân

Biến đổi sau dịch

mã

Dịch mã

19

tế bào tạo hốc rồi khép lại tạo túi nội bào hay bọng (endosome) nằm bên trong tế

bào chất. Bơm proton trong endosome vận chuyển H+ vào làm cho pH trong

endosome giảm xuống 5, pH thấp tạo điều kiện cho protein F (fusion) chồi lên cắm

vào màng endosome như chiếc neo, kéo vỏ ngoài virus sát với endosome và tiến

hành dung hợp với màng endosome để giải phóng nucleocapsid vào tế bào chất. Sự

hợp nhất này chỉ xảy ra khi phân tử HA tiền thân (HA0) phân tách thành HA1 và

HA2 nhờ protease phổ biến là furin. Phân tử HA2 có đầu - N đóng vai trò hoà tan

trung gian giữa vỏ virus và màng nội bào (hình 1.2). Protein M2 ở virus cúm A hay

còn gọi là kênh ion (ion - channels) cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình

thay đổi pH và dung hợp này.

Hầu hết các virus ARN tiến hành sao chép trong tế bào chất vì chúng có thể

mã hóa cho tất cả các enzym cần cho sao chép genome mà không cần đến các

enzym của tế bào nằm trong nhân, nhưng đối với virus cúm, chúng lại cần bộ máy

cắt nối của tế bào nên genome của chúng phải được đưa vào nhân. Sau khi hợp nhất

màng, nucleocapsid được vận chuyển vào trong nhân tế bào. Trong nhân, sợi ARN

(-) ban đầu được làm khuôn để tổng hợp nên sợi ARN (+) theo cơ chế bổ sung

[cARN (+)] nhờ enzyme RNA - polymerase phụ thuộc ARN của virus. Chính các

cARN (+) này lại được dùng làm khuôn để tổng hợp các sợi ARN (-) mới là nguyên

vật liệu di truyền của virus. Các sợi ARN (-) được tạo thành này là một sợi hoàn

chỉnh về độ dài (có độ dài đủ - full length ARN), không được mũ hoá ở đầu 5’ và

không được adenyl hoá ở đầu 3’. Các ARN (-) mới này một phần được phiên mã

tạo ra các mRNA (+) ngắn hơn. Sau đó, quá trình dịch mã thành các protein với các

chức năng khác nhau xảy ra ở tế bào chất. Các protein này bao gồm 7 protein cấu

trúc PB1, PB2, PA, HA, NA, NP và M1 và 3 protein không cấu trúc NS1, NS2 và

M2 đối với virus cúm A và 1 protein không cấu trúc NB đối với virus cúm B. Các

protein NS1, M1 và NP được vận chuyển vào nhân kết hợp với sợi ARN (-) mới

tổng hợp để hình thành nên nucleocapsid, sau đó được vận chuyển ra tế bào chất.

Tại đây, các protein HA, NA, M2 được chuyển qua lưới nội chất tới bộ máy Golgi,

tương tác với nhau, bao bọc nucleocapsid, khởi đầu cho việc nảy chồi của virus. Hạt

20

virion mới được tạo thành bằng cách nảy chồi từ màng sinh chất. Phân tử NA phân

cắt axit sialic giải phóng virus ra khỏi tế bào chủ để bắt đầu một chu trình lây nhiễm

mới [8].

1.2. SỰ LƯU HÀNH CỦA VIRUS CÚM B TRÊN THẾ GIỚI

Hoạt động của virus cúm B được báo cáo trên nhiều quốc gia trong những

năm gần đây với sự lưu hành đồng thời của cả 2 dòng B/Yamagata và dòng

B/Victoria. Cúm B lưu hành đồng thời từ cuối thập niên 80 thế kỷ 19 khi biến thể

của virus cúm B là B/Panada/45/90 lần đầu tiên được quan sát thấy. Chủng này và

các biến thể thuộc dòng Yamagata đã lan ra khắp thế giới, trong khi các chủng của

dòng B/Victoria/2/87 trước đó lại tiếp tục lưu hành ở Châu Á rồi sau đó trải qua các

tiến hóa không phụ thuộc trở thành dòng phân biệt về đặc tính kháng nguyên [46].

Trên thế giới, hai dòng virus cúm B đều được xác định lưu hành hàng năm,

tuy nhiên một trong hai dòng sẽ chiếm ưu thế trong từng năm. Dựa vào kết quả

giám sát này, Tổ chức Y tế thế giới (TCYTTG) sẽ đưa ra khuyến cáo về sự lựa chọn

dòng kháng nguyên B trong thành phần vắc xin cúm hàng năm cho các nước thuộc

khu vực Bắc bắn cầu hoặc Nam bán cầu. Trong giai đoạn từ năm 1999 đến năm

2002, dòng B/Yamagata chiếm ưu thế hơn đã được lựa chọn vào thành phần vắc

xin. Các virus cúm B thuộc dòng Yamagata trong giai đoạn này có đặc tính kháng

nguyên và di truyền giống với chủng B/Sichuan/379/99. Trong giai đoạn tiếp theo

từ năm 2002 đến năm 2004, ở cả Nam bán cầu và Bắc bán cầu dòng virus cúm B

chiếm ưu thế lại là dòng Victoria với các virus có đặc tính kháng nguyên và di

truyền giống với chủng B/HongKong/330/2001. Tương tự như vậy, dường như sự

lưu hành của virus cúm B có một quy luật lặp lại 2-3 năm một lần. Khi mà trong

giai đoạn từ năm 2004 đến năm 2006, dòng Yamagata quay trở lại chiếm ưu thế trên

thế giới với đại diện là chủng B/ShangHai/361/2002. Trong giai đoạn từ năm 2006

đến năm 2008, trên cả Nam bán cầu và Bắc bán cầu, dòng chiếm ưu thế là dòng

Victoria với đại diện là chủng B/Malaysia/2506/2004. Trong giai đoạn tiếp theo từ

21

năm 2008 đến năm 2009, dòng virus cúm B lưu hành chiếm ưu thế là dòng

Yamagata với đại diện là chủng B/Florida/4/2006.

Từ năm 2009 đến năm 2011, virus cúm B xuất hiện ở trên khắp các Châu

lục, cả 2 dòng virus cúm B là dòng Victoria và dòng Yamagata lưu hành đồng thời

nhưng dòng chiếm ưu thế là dòng Victoria. Các virus cúm B thuộc dòng Victoria có

mối quan hệ gần gũi về đặc tính kháng nguyên và di truyền với chủng vắc xin

B/Brisbane/60/2008. Phần lớn các virus thuộc dòng Yamagata có các đặc tính gần

với chủng đại diện trước đó là chủng B/Florida/4/2006. Tuy nhiên bắt đầu từ cuối

năm 2011, cả 2 dòng cúm B được quan sát thấy với tỉ lệ ngang nhau ở một số quốc

gia, điều này gợi ý đến khả năng quay trở lại lưu hành của dòng Yamagata mặc dù

số lượng virus thu thập được là tương đối ít. Hầu hết các virus dòng Yamagata đã

có sự khác biệt về tính kháng nguyên và di truyền với chủng B/Florida/4/2006 trước

đó mà có các đặc tính có mối liên hệ gần hơn với chủng B/Bangladesh/3333/2007,

B/Hubei-Wujiang/158/2009 và B/Wisconsin/1/2010. Trong năm 2012, hoạt động

lan rộng và có tính chất vùng miền của virus cúm B được báo cáo trên nhiều quốc

gia, vùng miền và lãnh thổ ở Bắc bán cầu trong giai đoạn từ tháng 2 đến tháng 7 bao

gồm Châu Mỹ, Châu Á và Châu Âu. Ở Nam bán cầu, hoạt động này cũng được báo

cáo ở Bolivia, Ecuador, Paraguay và Peru trong khoảng tháng 6 đến tháng 8. Ở

Châu Đại dương và Châu Úc các vụ dịch cũng xuất hiện vào tháng 8. Ở Nam Mỹ,

hoạt động của virus cúm B tăng lên vào tháng 7 và trở nên mang tính chất vùng

miền vào tháng 8. Trong thời gian này vẫn có sự lưu hành đồng thời của cả 2 dòng

virus cúm tuy nhiên dòng Yagamata đã tăng lên ở một số nơi và trở nên chiếm ưu

thế. Và phần lớn các virus thuộc dòng Yamagata đều có mối liên hệ mật thiết về

tính chất kháng nguyên và di truyền với chủng B/Wisconsin/1/2010 [46].

Vào cuối năm 2012 và đầu năm 2013, hoạt động virus cúm B tăng lên ở Nam

Mỹ từ tháng 11 với các vụ dịch mang tính chất vùng miền được báo cáo ở Mexico

và Mỹ. Các vụ dịch lan rộng cũng được báo cáo ở Châu Âu vào tháng 1 năm 2013.

Ở Châu Á, hoạt động của virus cúm B nhìn chung thấp. Hoạt động của virus cúm B

22

không liên tục và mang tính chất vùng miền cũng được báo cáo ở một số quốc gia ở

Bắc Phi. Trong thời điểm này, virus cúm B vẫn lưu hành ở cả 2 dòng đồng thời, tuy

nhiên các virus cúm B dòng Yamagata vẫn tiếp tục tăng tỷ lệ và trở nên chiếm ưu

thế ở nhiều quốc gia. Hầu hết các virus thuộc dòng Yamagata phân lập được trong

giai đoạn này có tính chất kháng nguyên phân biệt với chủng vắc xin trước đó là

B/Wisconsin/1/2010 mà có những đặc tính có mối liên hệ gần hơn với chủng

B/Massachusett/2/2012.

Nhìn chung có thể thấy rằng sự lưu hành của virus cúm B trên Thế giới trong

thời gian qua tuân theo một quy luật 2-3 năm lại thay đổi dòng chiếm ưu thế là dòng

B/Victoria hoặc dòng B/Yamagata.

1.3. SỰ LƯU HÀNH CỦA VIRUS CÚM B TẠI VIỆT NAM

Hội chứng cúm (Influenza like illness - ILI) là một trong 26 bệnh truyền

nhiễm có tỷ lệ mắc cao nhất trong các bệnh truyền nhiễm gây dịch tại Việt Nam.

Vai trò của virus cúm trong ILI cũng như ảnh hưởng của nhiễm virus cúm, gánh

nặng bệnh tật cùng với các biến chứng do virus cúm gây ra như viêm phổi cấp tính,

phụ nữ có thai 3 tháng đầu nhiễm virus cúm... với sức khỏe cộng đồng tại Việt

Nam vẫn chưa có những thống kê chính xác. Bắt đầu từ năm 2001, việc giám sát

chủ động sự lưu hành của virus cúm đã được triển khai tại Hà Nội. Theo Niên giám

thống kê các bệnh truyền nhiễm 2001-2005, tỷ lệ hội chứng cúm trung bình trong 5

năm (2001-2005) là 2040,4/ 100.000 dân, đứng đầu trong 10 bệnh có tỷ lệ mắc cao

nhất tại Việt Nam [1-5]. Năm 2006, Viện Viện Vệ sinh Dịch tễ (VSDTTƯ) đã bước

đầu thiết lập và triển khai hệ thống giám sát cúm trọng điểm để phát hiện và xác

định các chủng virus cúm gây bệnh hàng năm ở 15 điểm trong toàn quốc. Kết quả

giám sát cho thấy virus cúm lưu hành đồng thời các chủng cúm mùa khác nhau như

A/H3N2, A/H1N1 và B. Khác với virus cúm A là các phân týp A/H3N2 hoặc

A/H1N1có thể là căn nguyên chính trong mỗi năm và xuất hiện xen kẽ giữa các

năm, virus cúm B lưu hành hàng năm. (Nguồn từ Chương trình giám sát Cúm Quốc

Gia-Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương do CDC-Mỹ tài trợ).

23

Trong giai đoạn từ năm 2001 đến năm 2008, tại miền Bắc Việt Nam, virus

cúm B và các virus cúm mùa khác là A/H3N2 và A/H1N1 lưu hành quanh năm,

thường tập trung vào 2 thời điểm là cuối mùa xuân (tháng 2-3) và giữa mùa hè

(tháng 7-8). Trong đó, virus cúm B là căn nguyên chủ yếu gây ra các vụ dịch vào

cuối mùa xuân (2001, 2006 và 2008), virus cúm A/H1N1 hoặc A/H3N2 là căn

nguyên chủ yếu gây ra các vụ dịch vào giữa mùa hè. Đặc biệt virus cúm B đóng vai

trò gây bệnh nổi trội vào năm 2001. Đặc tính kháng nguyên của virus cúm B lưu

hành tại miền Bắc Việt Nam trong giai đoạn này tương đồng với các chủng virus

cúm được Tổ chức Y tế Thế giới khuyến cáo cho sản xuất thành phần vắn xin khu

vực Bắc bán cầu cho từng năm. Cụ thể là sự xuất hiện dòng kháng nguyên

Yamagata được xác định tại Miền Bắc Việt Nam vào các năm 2001, 2005 và 2008,

dòng Victoria vào các năm 2003, 2004, 2006 và 2007. Đã xác định được sự lưu

hành đồng thời của 2 dòng kháng nguyên của virus cúm B trong cùng một năm [7].

1.4. SỰ TIẾN HÓA CỦA VIRUS CÚM B

Ở virus cúm A có thể xảy ra các biến đổi trong vật liệu di truyền như sự thay

đổi kháng nguyên: thay đổi nhỏ kháng nguyên (antigen drift) hoặc thay đổi lớn

kháng nguyên (antigen shift) [15, 27]. Nguyên nhân là do virus A có đối tượng gây

nhiễm đa dạng như gia cầm, thủy cầm, chim di cư, động vật có vú và người. Mà vật

liệu di truyền ARN của virus luôn chịu tác động của vật chủ trong quá trình xâm

nhập vào bên trong tế bào, tiến hành phiên mã, nhân lên, tích hợp, nảy chồi và giải

phóng virus mới ra khỏi tế bào vật chủ. Kết quả là đã xảy ra các đột biến trong vật

liệu di truyền hoặc sự pha trộn các phân đoạn gen của virus cúm A khác nhau khi

cùng đồng nhiễm trên một tế bào thông qua quá trình trao đổi và tích hợp. Sự biến

đổi trong vật liệu di truyền của virus cúm A chính là nguyên nhân gây ra các vụ

dịch lẻ tẻ hoặc đại dịch cúm cho nhân loại. Những thay đổi trong vật liệu di truyền

của virus cúm A là động lực cho sự tiến hóa của nó [8].

So với virus cúm A, đối tượng gây nhiễm của virus cúm B ít hơn rất nhiều,

chỉ bao gồm con người và hải cẩu. Do đó sự tiến hóa của virus cúm B cũng xảy ra

24

với tần suất thấp hơn [33, 36]. Hiện nay trên thế giới lưu hành 2 dòng cúm B là

dòng B/Victoria/2/87-like virus và dòng B/Yamagata/16/88-like virus, trong đó

dòng B/Victoria/2/87-like virus lưu hành chủ yếu ở Đông Nam Á còn dòng

B/Yamagata/16/88-like virus lưu hành trên khắp thế giới trong thế kỷ XX [48, 49].

Sự trao đổi chéo và tích hợp vật liệu di truyền của virus cúm B chỉ xảy ra khi hai

dòng này lưu hành đồng thời. Hiện tượng này đã được ghi nhận ở một số nước

Châu Âu vào năm 2001 [57].

1.5. BIỂU HIỆN LÂM SÀNG VÀ SINH BỆNH HỌC BỆNH CÚM

Bệnh cúm là bệnh viêm nhiễm cấp tính đường hô hấp gây nên bởi virus cúm.

1.5.1. Biểu hiện lâm sàng của bệnh cúm

Sau thời gian ủ bệnh từ 2 - 4 ngày, bệnh thường khởi phát đột ngột với các

triệu chứng toàn thân như sốt cao, rét run, cơ thể rất mệt và yếu. Đồng thời xuất

hiện những dấu hiệu viêm đường hô hấp như ho khan, đau họng và viêm mũi. Với

trẻ em những triệu chứng như viêm tai giữa, buồn nôn và nôn cũng thường xảy ra.

Biến chứng thường gặp nhất của cúm là viêm phổi, trong đó viêm phổi do

bội nhiễm vi khuẩn là dạng phổ biến nhất và viêm phổi nguyên phát là dạng trầm

trọng nhất. Bệnh cúm kèm bội nhiễm vi khuẩn làm cho bệnh nặng lên nhiều lần [6].

Trong các vụ dịch thường có dạng kết hợp viêm phổi virus và vi khuẩn. Ngoài ra

còn có các biến chứng khác như viêm cơ, hội chứng sốc nhiễm độc, hội chứng Rey

[16, 51].

1.5.2. Sinh bệnh học bệnh cúm

Phương thức lây truyền virus cúm từ người sang người là virus cúm có trong

chất tiết hô hấp và hạt khí dung được phát tán trong không khí do bệnh nhân cúm

ho và hắt hơi đã thải virus ra không khí từ khoang mũi. Phương thức lây truyền

virus cúm từ động vật sang người là do con người đã tiếp xúc trực tiếp với gia cầm,

phân gia cầm bị bệnh hoặc ăn thịt gia cầm, tiết canh gia cầm chưa nấu kỹ. Nhiễm

25

trùng đầu tiên được gây ra bởi virus cúm là viêm đường hô hấp trên, do virus xâm

nhập và nhân lên chủ yếu trong tế bào biểu mô trụ của đường hô hấp và gây phá

hủy nhung mao, nơi được coi là hàng rào bảo vệ đầu tiên và quan trọng trong hệ

thống hô hấp của cơ thể, dẫn đến hoại tử và bong biểu mô hô hấp. Kèm theo sự

nhân lên của virus, interferon được phát hiện trong giai đoạn cấp tính của bệnh là

nguyên nhân của sự nguy hiểm do nhiễm virus cúm [6].

Virus cúm B kết hợp với các virus gây viêm đường hô hấp khác sẽ có khả

năng gây biến chứng nguy hiểm cho trẻ em, người già, người suy giảm miễn dịch

hoặc mắc các bệnh mạn tính và phụ nữ mang thai nếu không có biện pháp phòng

ngừa kịp thời. Ngoài ra virus cúm B còn có khả năng gây bội nhiễm vi khuẩn

Staphylococcus aureus với tỷ lệ tử vong cao [30].

1.6 . ĐIỀU TRỊ VÀ DỰ PHÒNG BỆNH CÚM

1.6.1. Các thuốc kháng virus

Hiên nay, có 2 nhóm thuốc được sử dụng để dự phòng và điều trị cúm [8].

Đó là:

- Nhóm thuốc ức chế hoạt động kênh ion M2: 2 loại thuốc

+ Amantadine và Rimantadine (Flumadine).

- Nhóm thuốc ức chế neuraminidase (NAIs): 4 loại thuốc

+ Oseltamivir (Tamiflu ®) và Zanamivir (Relenza ®)

+ Peramivir (Rapiacta ®) và Laninamivir (Inavir ®)

Để điều trị virus cúm B nên sử dụng các thuốc ức chế Neuraminidase là

Oseltamivir, Zanamivir, Permivir và Laninamivir, không sử dụng thuốc ức chế

kênh ion M2 như đối với virus cúm A vì virus cúm B không có protein M2. Tất cả

các thuốc đều có tác dụng điều trị hiệu quả nhất nếu được sử dụng trong vòng vài

giờ khi triệu chứng bắt đầu và thường được phép sử dụng trong vòng 48 tiếng sau

khi có triệu chứng đầu tiên. Thuốc có tác dụng làm giảm bớt mức độ trầm trọng của

bệnh cũng như các triệu chứng cúm và làm rút ngắn thời gian bệnh khoảng 1 - 3

ngày.

26

Thuốc ức chế neuraminidase: Virus cúm B khi muốn giải phóng virus thế

hệ mới ra khỏi tế bào nhiễm cần có sự tham gia trực tiếp của enzyme

neuraminidase. Neuraminidase của virus tham gia cắt tách các phần dư axit sialic từ

màng glycoprotein của virus, đóng một vai trò quan trọng khi phóng thích các hạt

virus thế hệ mới và tạo điều kiện thuận lợi cho virus lan rộng trong đường hô hấp.

Thuốc ức chế có tác dụng can thiệp vào chức năng bình thường của enzyme

neuraminidase (NA), ức chế hoạt động của enzyme này do đó ngăn cản sự giải

phóng virus khỏi tế bào nhiễm, virus sẽ bị giữ lại bên trong tế bào và không có cơ

hội tấn công các tế bào khác.

Hình 1.3. Các vị trí đột biến trên cấu trúc không gian 3 chiều của

Neuraminidase ( * Các axit amin được đánh số dựa trên hệ thống đánh số

N2 NA. Các vị trí đột biến tương ứng trên virus cúm B/Beijing/1/87 là

Asp196, Ile220, Ser248 và Gly406. Đối với các týp virus cúm B lưu hành

trong thời gian gần đây, các vị trí đột biến tương ứng lần lượt là Asp197,

Ile221, Ser249 và Gly407).

Nguồn: Shuji Hatakeyama, Norio Sugaya, Mutsumi Ito, et al, JAMA [50]

27

Trong nghiên cứu giám sát sự giảm hoặc kháng thuốc điều trị của virus cúm

A và B trên thế giới giai đoạn 2004-2008 cho thấy đã xác định được 12/3261 (0,4%)

chủng kháng thuốc và 16/3261 (0,5%) chủng giảm độ nhạy với thuốc điều trị

Oseltamivir hoặc Zanamvir. Trong đó, xác định được 3 chủng giảm độ nhạy với

thuốc (đột biến tại H274Y, I222T và T326I) [54]. Nghiên cứu tại Nhật bản 2004-

2005, xuất hiện 1/74 (1,4%) chủng có đột biến tại vị trí G407S làm giảm độ nhạy

của Oseltamivir đối với bệnh nhân nhiễm virus cúm B sau khi điều trị. 7/422 (1,7%)

chủng virus cúm B xuất hiện đột biến tại các vị trí D197N, I221T, S249G. Tỷ lệ

chủng virus giảm/kháng thuốc ở virus cúm B (1,4%) là thấp hơn so với virus cúm A

(5,5%-18%), tuy nhiên những chủng này đã được ghi nhận lây truyền từ người sang

người [50].

Như vậy, việc sử dụng các loại thuốc kháng virus như oseltamivir và

zanamivir có thể dẫn đến những đột biến thích nghi trên gen NA của virus cúm và

có thể dẫn đến kháng hoặc giảm độ nhạy của thuốc điều trị. Vì vậy, việc kiểm soát

phác đồ điều trị, giám sát sự kháng thuốc của virus cúm và nghiên cứu, phát triển

thuốc mới trong điều trị bệnh cúm là điều rất cần thiết.

1.6.2. Dự phòng

Biện pháp hữu hiệu của sức khỏe cộng đồng để đề phòng virus cúm A và B

là gây miễn dịch bằng cách sử dụng vắc xin cúm. Tuy nhiên do tính dễ bị biến dị

của virus cúm nên việc sản xuất virus cúm gặp nhiều khó khăn. Vắc xin làm từ

kháng nguyên của týp virus gây bệnh cúm năm nay rất khó bảo vệ được cơ thể đối

với týp gây bệnh cúm năm sau. Có hai cách khắc phục khó khăn trên trong nghiên

cứu phát triển vắc xin cúm: một là sản xuất vắc xin cúm đa týp kháng nguyên; hai là

căn cứ vào dự đoán dịch tễ học để dự đoán týp virus cúm mới sẽ xuất hiện trong

năm tới để sản xuất vắc xin phòng ngừa týp đó. Khối lượng vắc xin sản xuất hàng

năm thường không đáp ứng đủ nhu cầu của cộng đồng nên việc tiêm vắc xin thường

được ưu tiên cho những đối tượng sau:

28

- Nhóm đối tượng có nguy cơ cao: người già trên 65 tuổi, người tàn tật, trẻ em,

bệnh nhân suy hô hấp, suy tim, bệnh chuyển hóa như đái tháo đường hoặc

mắc các bệnh mạn tính khác, phụ nữ mang thai.

- Nhóm tiếp xúc với các tác nhân gây bệnh: nhân viên làm việc trong phòng

thí nghiệm.

- Nhóm người làm việc tại các dịch vụ công cộng: nhân viên y tế, cảnh sát…

Vắc xin nên được tiêm sớm vào mùa thu trước đợt bùng nổ bệnh cúm và

nhắc lại hàng năm để duy trì chống lại những chủng virus cúm phổ biến nhất. Hiện

nay có các loại vắc xin cúm như sau:

Vắc xin bất hoạt (Inactivated vaccine): Vắc xin bất hoạt gồm các phân týp

virus cúm được bất hoạt bởi formalin hoặc ether. Bao gồm các loại sau [25]:

- Vắc xin toàn bộ hạt virus bất hoạt: sử dụng formalin hoặc ß-

propiolactone.

- Vắc xin tiểu đơn vị hoặc kháng nguyên bề mặt HA và NA (subunit hoặc

surface).

- Vắc xin thành phần tách rời của virus: toàn bộ hạt virus nhưng bị tách rời

bằng ether (split).

Vắc xin sống giảm độc lực (Live attenuated influenza virus - LAIV):được

phát triển dựa trên các kỹ thuật di truyền, người ta tạo ra các chủng virus

không gây bệnh, được ghép gen mã hóa tổng hợp HA và NA. Vắc xin cúm

sống giảm động lực được sử dụng bằng cách nhỏ vắc xin vào mũi hoặc bơm

xịt vắc xin vào mũi họng. Vắc xin này có hiệu lực kém hơn các loại vắc xin

bất hoạt và chỉ dùng cho người khỏe mạnh trong độ tuổi 5 - 49 [13, 41].

Vắc xin bất hoạt bằng công nghệ di truyền ngược (Reassortment vaccine): tái

tạo các virus từ các phân đoạn gen có lựa chọn khác nhau bằng kỹ thuật di

truyền ngược (reverse genetic) [39, 40, 42].

Hiện tại, vắc xin cúm mùa đang dùng phổ biến là vắc xin sống bất hoạt,

thành phần vắc xin bao gồm virus cúm A/H1N1, A/H3N2 và B. Thành phần vắc xin

29

cúm theo mùa hàng năm cũng lựa chọn chủng đại diện cho một dòng kháng nguyên

Yamagata hoặc Victoria. Vì vậy những năm virus cúm B lưu hành cả 2 dòng kháng

nguyên thì hiệu quả của vắc xin dự phòng là hạn chế.

1.7. CHẨN ĐOÁN VIRUS HỌC

Để có thể chẩn đoán chính xác tác nhân gây bệnh của bệnh truyền nhiễm,

chúng ta không thể chỉ dựa trên dấu hiệu lâm sàng và triệu chứng, vì một bệnh có

thể có nhiều căn nguyên và mỗi căn nguyên có thể gây bệnh với những biểu hiện

lâm sàng và triệu chứng nặng hay nhẹ khác nhau. Do đó việc chẩn đoán trong

phòng thí nghiệm là rất quan trọng, giúp cho các nhà lâm sàng có thể chẩn đoán

được chính xác.

Bên cạnh các kỹ thuật chẩn đoán cúm cơ bản, nhờ có sự phát triển của khoa

học kỹ thuật mà ngày nay đã có nhiều các kỹ thuật chẩn đoán mới nhanh và hiện đại

hơn. Nhờ đó sớm xác định được sự nhiễm virus cúm để có các biện pháp xử lý,

cách li, điều trị kịp thời, giúp tránh lây nhiễm trong cộng đồng , tránh được những

thiệt hại to lớn về tính mạng con người và kinh tế mà các vụ dịch cúm có thể gây ra.

Quá trình phân tích các mẫu bệnh phẩm trong phòng thí nghiệm có giá trị quan

trọng trong việc tìm hiểu đặc điểm sinh học của tác nhân gây bệnh, quá trình sinh

kháng thể sau khi lây nhiễm, cũng như quá trình khu trú và phát tán virus trong cơ

thể.

1.7.1 An toàn phòng thí nghiệm

Trong phòng thí nghiệm chẩn đoán virus, làm việc với những mẫu bệnh

phẩm lâm sàng có thể tiềm tàng tác nhân gây nhiễm dưới dạng khí dung, mà nhân

viên phòng thí nghiệm có nguy cơ phơi nhiễm hàng ngày. Do đó, an toàn phòng thí

nghiệm là hết sức quan trọng và cần thiết, trong quá trình làm việc cần có những

trang thiết bị cũng như các phương tiện bảo hộ phù hợp để bảo vệ cả người làm việc

cũng như công việc đang làm không bị nhiễm chéo.

30

1.7.2. Thu thập mẫu để chẩn đoán virus

Thu thập mẫu để chẩn đoán virus cần quan tâm đến thời gian lấy mẫu sau khi

mắc, vị trí lấy mẫu, cách bảo quản và vận chuyển có liên quan đến kết quả chẩn

đoán phòng thí nghiệm.

Để phân lập virus, mẫu bệnh phẩm cần thu thập trong giai đoạn sớm của

bệnh (thời gian nhiễm virus huyết) và trong suốt thời gian đào thải virus.

Để chẩn đoán huyết thanh, các mẫu huyết thanh lấy trong giai đoạn cấp và

giai đoạn hồi phục cần được lấy theo đúng thời gian quy định, ví dụ như mẫu huyết

thanh lấy trong giai đoạn cấp được lấy càng sớm càng tốt, mẫu huyết thanh lấy

trong giai đoạn hồi phục lấy sau đó 2 - 4 tuần.

Lựa chọn loại mẫu để thu thập đối với từng bệnh đòi hỏi có sự hiểu biết về

bệnh sinh của bệnh đó.

1.7.3. Phương pháp phân lập chủng và định týp virus

Phân lập chủng virus

Phân lập virus được coi là “tiêu chuẩn vàng” trong giám sát cúm [17]. Chủng

virus phân lập được trong vụ dịch được nghiên cứu về các đặc điểm sinh học cũng

như sự biến đổi di truyền và tính chất kháng nguyên, từ đó có thể dự đoán được sự

lan truyền của chủng một virus mới có độc lực cao trong giai đoạn tiếp theo và lựa

chọn thành phần vắc xin cúm hàng năm phù hợp.

Việc phân lập virus cúm B cùng với các virus cúm mùa khác là A/H1N1 và

A/H3N2 được tiến hành trong phòng thí nghiệm an toàn cấp độ 2 và sử dụng dòng

tế bào cảm thụ MDCK. Virus cúm B có thể nhân lên trên các dòng tế bào tiên phát

như tế bào thận khỉ, thận chuột đất, thận bê hoặc trên dòng tế bào thường trực như

MDCK, Vero. MDCK là dòng tế bào thích hợp nhất để phân lập virus cúm trên

người. Ưu điểm của phương pháp phân lập trên tế bào MDCK là đơn giản, thuận

tiện, dễ thực hiện, có thể phân lập được một số lượng lớn mẫu bệnh phẩm trong một

lần tiến hành. Để sản xuất vắc xin thì phương pháp phân lập trên trứng vẫn là lựa

chọn tối ưu vì nó có khả năng khuếch đại một lượng lớn virus với hiệu giá cao [24,

31

43]. Việc sản xuất vắc xin trên tế bào MDCK và Vero cũng đang được nghiên cứu

[14, 29].

Ngoài ra đối với virus cúm gia cầm (cúm A/H5N1): là virus nguy hiểm mức

độ 3 (theo phân loại của TCYTTG) nên việc phân lập virus phải được tiến hành

trong phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp độ 3 và được TCYTTG khuyến cáo là

phân lập trên trứng gà đạt tiêu chuẩn (Specific Pathogenic Free - SPF) 10-11 ngày

tuổi.

Định týp virus: virus sau khi phân lập được định týp (xác định đặc tính

kháng nguyên) bằng phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu (HI).

1.7.4. Phương pháp xác định trình tự gen (Sequence)

Các phòng thí nghiệm hiện nay đều dùng phản ứng giải trình tự bằng phương

pháp enzyme và khi giải trình tự thường sử dụng các máy phân tích chuỗi tự động

như ABI PRISM 3130-Avant (Applied Biosystems), hoặc Beckman Coulter (Mỹ).

Để thực hiện được giải trình tự của các máy tự động thì các mach ADN đơn sản

sinh ra trong ống nghiệm phải được đánh dấu huỳnh quang để các vạch điện di của

các mạch đơn này phát sáng khi đi qua một chùm tia sáng laser. Sự xuất hiện của

các dideoxynucleotide (các nucleotide mất gốc -OH ở vị trí cacbon 3' và được thay

bằng -H, đã được đánh dấu huỳnh quang với các màu khác nhau) trong quá trình

tổng hợp ADN bổ sung (mẫu gen cần giải trình tự ở dạng ADN sợi đơn) tạo ra

những đoạn ADN có độ dài khác nhau. Những đoạn ADN này được điện di qua

mao quản từ nhỏ đến lớn và các dideoxynucleotide được phát hiện bởi đầu đọc

laser. Trình tự gen của mẫu chính là trình tự bổ sung các dideoxynucleotide được

phát hiện bởi đầu đọc laser [8].

Cấu tạo của một máy giải trình tự tự động gồm hai phần chính là phần điện

di với gel polyacrylamide và phần phát hiện các vạch điện di. Phần điện di

polyacrylamide là các ống mao quản chứa gel. Phần phát hiện vạch điện di là những

con mắt cảm quang và một chùm tia laser đi qua trước nó. Trong suốt quá trình điện

32

di, mỗi khi có một vạch điện di đi qua chùm tia laser thì vạch điện di sẽ phát sáng

lên và sự phát sáng này sẽ được con mắt cảm quang ghi nhận và lưu lại thành một

đỉnh cường độ ánh sáng trong biểu đồ. Từ biểu đồ của các đỉnh cường độ sáng này,

máy sẽ so dòng của các đỉnh tương ứng với các màu để cuối cùng phân tích thành

trình tự của đoạn ADN.

Phương pháp xác định trình tự gen đóng một vai trò quan trọng trong việc

nghiên cứu đặc điểm di truyền học, so sánh giữa các gen của virus cúm để xây dựng

cây gia hệ. Qua đó có thể xác định được tần suất tiến hóa, các đột biến trên một số

gen liên quan đến khả năng tăng độc lực của virus, giảm độ nhạy của thuốc kháng

virus và phát hiện các yếu tố tiềm tàng của sự trao đổi và tích hợp của các chủng

virus cúm đang lưu hành.

33

Chương II

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu là tổng số 115 chủng virus cúm B được phân lập từ

bệnh phẩm lâm sàng thu thập trên bệnh nhân hội chứng cúm trong 3 năm (2010 -

2012) tại Hà Nội và các tỉnh miền Bắc Việt Nam. Các chủng virus cúm này được

cung cấp bởi Phòng thí nghiệm Cúm - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương.

2.2. VẬT LIỆU

2.2.1. Chủng virus cúm B

Các chủng phân lập virus cúm B được sử dụng trong nghiên cứu cần có hiệu

giá virus đạt ≥ 8 đơn vị HA xác định bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu (HA).

2.2.2. Sinh phẩm

2.2.2.1. Sinh phẩm sử dụng cho định týp virus

Bộ sinh phẩm kháng huyết thanh chuẩn dùng trong phản ứng ngăn ngưng kết

hồng cầu (HI) để định týp virus cúm được TCYTTG cung cấp hàng năm (2010 -

2012) tùy theo từng năm.

Kháng nguyên chuẩn

(reference antigens)

Kháng huyết thanh chuẩn

(reference antisera)

A/H1N1 A/H1N1

A/H3N2 A/H3N2

B/Florida/4/2006 (B/Yamagata lineage) hoặc

B/Wisconsin/01/2010 (B/Yamagata lineage)

B/Florida/4/2006 (B/Yamagata lineage) hoặc

B/Wisconsin/01/2010 (B/Yamagata lineage)

B/Brisbane/60/2008 ( B/Victoria lineage) B/Brisbane/60/2008 ( B/Victoria lineage)

34

2.2.2.2. Sinh phẩm sử dụng cho phương pháp xác định trình tự gen

- Uni 12 primer (CDC - Mỹ)

- cADN SuperscriptIII Reverse Transcriptase, P/N 02321, Invitrogen

- Hotstar Hifidelity Polymerase Kit, Cat No 202605, Qiagen

- Bộ sinh phẩm tinh sạch sản phẩm PCR: Qiaquick PCR Purification kit 250,

Cat.No. 28106, Qiagen và Qiaquick Gel Extraction kit 250, Cat.No. 28706,

Qiagen.

- Bộ sinh phẩm cho chu kỳ nhiệt tạo đoạn ADN gắn các dideoxynucleotide

(Cycle sequencing): BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit P/N:

4336917, ABI.

- Bộ sinh phẩm tinh sạch sản phẩm đã gắn các dideoxynucleotide : Big Dye X

Terminator Purification Kit, Cat. No. 4376486, ABI.

- Hệ thống mồi:

Tên mồi Trình tự

HA-25F ATCCACAAAATGAAGGCA

HA-36F GAAGGCAATAATTGTACT

HA-482F GCAACAATGGCTTGGGC

HA-660R TATCAGAGTGGAACCCC

HA-760R GCCGCCAATCTGAGAAAC

HA-1140R ACCAGCAATAGCTCCGAA

NA-F1 AGCAGAAGCAGAGCATCTTCTCAA

NA-560F CTCCATTTTCCACATGGCAGCTTG

NA-620R ATTACTGTCAGGGCCATCAAC

NA-1557R AGTAGTAACAAGAGCATTTTTCAGAAA

35

2.2.3. Trang thiết bị và dụng cụ

2.2.3.1. Trang thiết bị

Trang thiết bị Hãng

Phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp độ 2 Viện VSDTTƯ

Tủ an toàn sinh học cấp độ 2 (Biosafety Cabinet - Class2) Bioquell - Anh

Tủ ấm CO2 Jouan - Pháp

Tủ lạnh 4oC,

- 20

oC và

- 80

oC Sanyo - Nhật

Máy li tâm Rotofex - Mỹ

Máy khuếch đại gen Biorad - Mỹ

Máy phân tích trình tự gen ABI-3130 Avant Hitachi - Nhật

Máy lắc (vortex) IKA - Malaysia

2.2.3.2. Dụng cụ

- Phiến nhựa 96 giếng, đáy chữ U và đáy chữ V.

- Pipet tự động vi lượng các loại từ 0,5µl đến 1000µl.

- Pipet đa kênh các loại từ 20µl đến 300µl.

- Đầu côn vô trùng các loại, có phin lọc từ 0,5µl đến 1000µl.

- Tuýp eppendorf các loại từ 0,2ml đến 1,5ml.

Và các dụng cụ thí nghiệm cần thiết khác.

2.3. PHƯƠNG PHÁP

2.3.1. Định týp virus bằng phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu (HI)

2.3.1.1. Chuẩn độ hiệu giá kháng nguyên bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu

(HA)

36

Phương pháp này được tiến hành trên phiến nhựa 96 giếng đáy chữ V (hồng

cầu gà) hoặc phiến nhựa 96 giếng đáy chữ U (hồng cầu chuột lang).

Các bước tiến hành:

(1) Chuẩn bị hồng cầu gà 0,5% hoặc hồng cầu chuột lang 0,75% trong dung

dịch đệm PBS, pH 7,2.

(2) Cho 50µl đệm PBS vào các giếng từ hàng thứ 2 đến hàng thứ 12.

(3) Cho 100µl hỗn dịch nuôi cấy virus vào giếng đầu tiên. Trộn đều và chuyển

50µl hỗn dịch này sang giếng thứ 2, pha loãng bậc 2 hỗn dịch nuôi cấy virus

từ hàng thứ 2 đến 12. Loại bỏ 50µl ở hàng cuối cùng.

(4) Cho 50µl hồng cầu gà 0,5% hoặc hồng cầu chuột lang 0,75% vào toàn bộ

96 giếng. Lắc đều, ủ 30 phút (với hồng cầu gà) hoặc 60 phút (với hồng cầu

chuột lang) ở nhiệt độ phòng.

Nhận định kết quả: Hiệu giá kháng nguyên là độ pha loãng cuối cùng của

kháng nguyên gây ngưng kết hồng cầu hoàn toàn. Đó chính là một đơn vị

ngưng kết hồng cầu của kháng nguyên, 50µl kháng nguyên 8 đơn vị hay 25µl

kháng nguyên 4 đơn vị.

2.3.1.2. Định týp virus bằng phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu (HI)

Xử lý kháng huyết thanh chuẩn:

Trước khi tiến hành phản ứng HI cần xử lý kháng huyết thanh chuẩn để loại

bỏ những chất ức chế không đặc hiệu có trong kháng huyết thanh chuẩn.

(1) Cho 1 thể tích kháng huyết thanh kết hợp với 3 thể tích dung dịch RDE

(enzyme phá hủy các thụ thể-Recepter Destroying Enzyme). Ủ 37oC

trong 18 giờ hoặc qua đêm.

(2) Bất hoạt tại nhiệt độ 56oC trong vòng 30 phút.

(3) Bổ sung 6 thể tích nước muối sinh lý NaCl 0,85% để kháng huyết thanh

chuẩn được pha loãng 1/10.

Các bước tiến hành:

37

(1) Cho 25µl đệm PBS vào các giếng từ hàng B tới hàng H (trừ cột 6 và cột

12) của tấm nhựa 96 giếng. Cột 6 và cột 12 cho 50µl đệm PBS.

(2) Cho 50µl kháng huyết thanh chuẩn đã xử lý vào hàng A (trừ các giếng

A6, A12)

(3) Hút từ hàng A chuyển xuống hàng B 25µl kháng huyết thanh chuẩn và

bắt đầu pha loãng bậc 2 từ hàng B tới hàng H, tại hàng H bỏ đi 25µl. Cột

6 và cột 12 giữ nguyên.

(4) Cho thêm 25µl kháng nguyên 4 đơn vị HA thích hợp (dịch nuôi cấy tế

bào và chứng dương) vào các giếng tương ứng. Lắc nhẹ để kháng nguyên

và kháng huyết thanh tiếp xúc với nhau rồi để ủ ở nhiệt độ phòng trong

1h.

(5) Cho 50µl hồng cầu gà 0,5% hoặc hồng cầu chuột lang 0,75% vào tất cả

các giếng. Lắc nhẹ, để ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ.

Nhận định kết quả:

- Phản ứng đọc được khi:

+ Kháng huyết thanh chuẩn: ngăn ngưng kết hoàn toàn.

+ Chứng hồng cầu: ngăn ngưng kết hoàn toàn.

- Hiệu giá ức chế ngưng kết hồng cầu của chủng virus: là giá trị tại độ pha

loãng cao nhất của kháng huyết thanh chuẩn và chủng virus gây nên hiện

tượng ngăn ngưng kết hồng cầu.

- Phân týp của virus được xác định tại kháng huyết thanh chuẩn cho hiệu

giá ngăn ngưng kết hồng cầu cao nhất.

2.3.2. Giải trình tự gen

2.3.2.1. Tách chiết vật liệu di truyền từ chủng virus cúm phân lập được

Sử dụng bộ sinh phẩm tách chiết ARN: QIAamp viral RNA Mini Kit, 250

preps, Cat No 52904, Qiagen. Các bước thực hiện tách chiết theo thường quy bộ

sinh phẩm như sau:

38

(1) Trộn đều 140µl mẫu (dịch nổi phân lập thu hoạch được) với 560µl đệm

AVL. Ủ tại nhiệt độ phòng trong 10 phút.

(2) Thêm 560µl Ethanol tuyệt đối (100%) vào hỗn dịch trên, lắc đều bằng

máy vortex rồi li tâm nhẹ.

(3) Đặt cột QIAamp spin vào tuýp li tâm 2ml sạch. Chuyển 630µl hỗn dịch

trên vào cột QIAamp spin. Li tâm 8000 vòng/phút/1 phút. Loại bỏ tuýp li

tâm. Sau đó lặp lại bước (3).

(4) Đặt cột QIAamp spin vào tuýp li tâm 2ml sạch, rửa cột QIAamp spin

bằng 500µl dung dịch đệm AW1, li tâm 8000 vòng/phút/1 phút. Loại bỏ

tuýp li tâm.

(5) Đặt cột QIAamp spin vào tuýp li tâm 2ml sạch, tiếp tục rửa cột QIAamp

spin bằng 500µl dung dịch đệm AW2, li tâm 14000 vòng/phút/3 phút.

Loại bỏ dung dịch trong tuýp li tâm.

(6) Đặt cột QIAamp spin vào tuýp li tâm vừa được loại bỏ dung dịch. Li

tâm 14000 vòng/phút/1 phút. Loại bỏ tuýp li tâm.

(7) Đặt cột QIAamp spin vào tuýp eppendorf 1,5ml sạch. Cho 60µl dung

dịch đệm AVE vào chính giữa màng lọc của cột, ủ tại nhiệt độ phòng

trong 1 phút, li tâm 8000 vòng/phút/1 phút. Loại bỏ cột QIAamp spin.

Phần dung dịch thu được trong tuýp li tâm chính là ARN của chủng virus

thu thập được.

(8) Bảo quản ARN tại -20oC hoặc -80

oC.

2.3.2.2. Tổng hợp sợi ADN bổ sung (cDNA)

Với những đoạn gen có kích thước > 1000bp, cần phải tổng hợp sợi ADN bổ

trợ sau đó mới thực hiện phương pháp PCR.

Hôn hợp 1

Thành phần Thể tích(µl)

Mồi Uni 12 (10µM) 5

dNTP (10µM) 1

39

ARN 10

Tổng 16

Ủ hỗn hợp này ở 65oC / 5 phút. Giữ lạnh ngay trong đá.

Hỗn hợp 2

Thành phần Thể tích(µl)

Buffer 5x 5

DTT (0,1M) 1

RNase inhibitor 1

SuperSriptIII (200U/µl) 1

Tổng 8

Trộn hỗn hợp 1 và hỗn hợp 2 rồi ủ 50oC/45 phút, 70

oC/15 phút.

2.3.2.3. Thực hiện PCR

Sử dụng bộ sinh phẩm Hotstar Hifidelity Polymerase Kit, Cat No 202605,

Qiagen.

Thành phần Thể tích(µl)

Đệm 5x 10

Mồi xuôi (100pmol) 0,5

Mồi ngược (100pmol) 0,5

Hifi Taq polymerase 2

Nước cất tinh khiết 31

40

cADN 6

Tổng 50

Mồi sử dụng trong phản ứng này là:

Tên mồi Trình tự

HA-25F ATCCACAAAATGAAGGCA

HA-1140R ACCAGCAATAGCTCCGAA

NA-F1 AGCAGAAGCAGAGCATCTTCTCAA

NA-1557R AGTAGTAACAAGAGCATTTTTCAGAAA

Chu kỳ nhiệt:

(1) 95oC trong 5 phút

(2) 94oC 15 giây lặp lại (2) 35 lần

50oC 1 phút

68oC 2 phút

(3) 68oC 10 phút

(4) 10oC ∞

Điện di sản phẩm PCR: Sử dụng thạch 1% và thang trọng lượng phân tử

1kb (Hãng Promega).

2.3.2.4. Tinh sạch sản phẩm PCR

Tinh sạch sản phẩm PCR nhằm loại bỏ những sinh phẩm và mồi thừa trong

quá trình PCR để tránh gây nhiễu trong quá trình giải trình tự.

41

Nếu sản phẩm PCR sau điện di cho kết quả đặc hiệu: sử dụng bộ sinh

phẩm Qiaquick PCR Purification kit 250, Cat.No. 28106, Qiagen để tinh sạch.

Thành phần của bộ Kit:

+ Cột Quiquick 250 chiếc

+ Đệm PB 150ml

+ Đệm PE 55ml

+ Đệm EB 15ml

+ Tuýp 2 ml: 250 chiếc

Trước khi tiến hành tinh sạch, cần thêm 220ml cồn tuyệt đối (96 - 100%) vào

đệm PE.

Các bước tiến hành:

(1) Trộn 5 thể tích đệm PB vào 1 thể tích sản phẩm PCR đã có.

(2) Dùng pipet chuyển toàn bộ hỗn dịch đã trộn ở bước (1) vào cột

Qiaquick đặt trong tuýp 2ml, li tâm 13000 vòng/phút/1 phút.

(3) Loại bỏ dung dịch ở tuýp 2ml, đặt lại cột vào tuýp.

(4) Dùng pipet hút 750µl đệm PE cho vào cột Qiaquick để rửa ADN, li

tâm 13000 vòng/phút/1 phút.

(5) Loại bỏ dung dịch rửa ở tuýp 2ml, đặt lại cột vào tuýp, li tâm 13000

vòng/phút/1 phút để đảm bảo loại bỏ hoàn toàn dung dịch rửa.

(6) Chuyển cột Qiaquick sang tuýp eppendorf 1,5ml sạch đã chuẩn bị

sẵn.

(7) Cho 30µl đệm EB vào chính giữa màng lọc của cột Qiaquick, ủ tại

nhiệt độ phòng trong 1 phút, li tâm 13000 vòng/phút/1phút. Sản phẩm thu

được chính là ADN đã được tinh sạch. ADN sau khi tinh sạch giữ ở -

20oC đến -80

oC.

Nếu sản phẩm PCR sau khi điện di không cho kết quả đặc hiệu: Sử dụng

bộ sinh phẩm Qiaquick Gel Extraction kit 250, Cat.No. 28706, Qiagen.

42

Thành phần bộ Kit:

+ Cột Qiaquick 250 chiếc

+ Đệm QG 150ml

+ Đệm PE 55ml

+ Đệm EB 15ml

+ Tuýp 2ml 250 chiếc

Trước khi tiến hành tinh sạch cần thêm 220ml cồn tuyệt đối (96-100%) vào

đệm PE trước khi sử dụng.

Các bước tiến hành:

(1) Cắt băng sản phẩm cần giải trình tự trên thạch 1% đã điện di (dưới đèn

chiếu tia cực tím)

(2) Cân trọng lượng thạch chứa băng sản phẩm. Cho 3 lần thể tích dung

dịch đệm QG vào 1 lần thể tích thạch (100µg ≈ 100µl)

(3) Ủ tại 50oC trong 10 phút cho tới khi thạch tan hết trong dung dịch đệm

QG. Để thạch có thể tan nhanh hơn có thể lắc tuýp bằng máy lắc sau mỗi

2-3 phút ủ.

(4) Đặt cột Qiaquick vào tuýp 2ml.

(5) Dùng pipet chuyển 750µl hỗn dịch ở bước (3) sang cột Qiaquick, li tâm

13000 vòng/phút/1 phút.

(6) Loại bỏ dung dịch ở tuýp 2ml, đặt lại cột vào tuýp.

(7) Lặp lại bước (5) và (6) cho tới khi hết hỗn dịch ở bước (3).

(8) Dùng pipet chuyển 500µl dung dịch đệm QG vào cột Qiaquick, li tâm

13000 vòng/phút/1 phút.

(9) Dùng pipet chuyển 750µl dung dịch đệm PE vào cột Qiaquick, li tâm

13000 vòng/phút/1 phút.

(10) Loại bỏ dung dịch ở tuýp 2ml, đặt lại cột vào tuýp, li tâm 13000

vòng/phút/1 phút.

43

(11) Chuyển cột Qiaquick sang tuýp 1,5ml sạch

(12) Cho 30µl đệm EB vào chính giữa màng lọc của cột Qiaquick để thu

ADN, ủ tại nhiệt độ phòng trong 1 phút, li tâm 13000 vòng/phút/1 phút.

ADN sau khi tinh sạch giữ ở -20oC đến -80

oC.

2.3.2.5. Chu trình nhiệt tạo đoạn ADN gắn các dideoxynucleotide (Cycle

sequencing)

Sử dụng bộ sinh phẩm Bigdye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit P/N:

4336917, ABI.

Thành phần Thể tích (µl)

Đệm 5x 3

BDX 64 1,5

Bigdye 1/3 1,5

Mồi (3.2 pmol) xuôi hoặc ngược 1

Sản phẩm ADN đã tinh sạch 2

Nước cất tinh khiết 11

Tổng số 20

Chu kỳ nhiệt:

(1) 96oC trong 3 phút

(2) 96 oC 10 giây lặp lại (2) 35 lần

50 oC 5 giây

60 oC 2 phút

(3) 4 oC ∞

44

2.3.2.6. Tinh sạch sản phẩm sau khi chạy chu trình nhiệt gắn dideoxynucleotide

Mục đích: Loại bỏ những dideoxynucleotide và sinh phẩm còn thừa sau khi

chạy chu trình nhiệt gắn dideoxynucleotide, tránh tín hiệu nhiễu trong quá trình giải

trình tự.

Sử dụng bộ sinh phẩm Big Dye X Terminator Purification Kit, Cat. No.

4376486, ABI.

Thành phần: XTerminator Solution 9ml

SAM Solution 2ml

Các bước tiến hành:

(1) Dùng pipet hút 45µl SAM Solution vào tuýp 0,2 ml đặt trên giá PCR 96

giếng.

(2) Dùng pipet và đầu côn cắt hút 10µl XTerminator Solution cho tiếp vào tuýp

trên.

(3) Dùng pipet hút 10µl sản phẩm sau khi chạy chu trình nhiệt gắn

dideoxynucleotide cho tiếp vào tuýp trên.

(4) Dùng giấy bạc bọc giá PCR 96 giếng này lại, lắc đều trong 30 phút bằng

máy vontex.

(5) Li tâm nhẹ trong 5 phút. Hút 20µl sản phẩm tinh sạch sang phiến 96 giếng,

tránh không để đầu côn chạm vào thành tuýp hay đáy tuýp.

(6) Chuyển phiến 96 giếng vào máy.

(7) Cài đặt chương trình, tạo tệp dữ liệu và bắt đầu chạy máy.

2.3.3. Phương pháp phân tích kết quả và xử lý số liệu

Sử dụng phần mềm DNAstar: chỉnh sửa các tín hiệu lỗi, nối các đoạn

nucleotide lại với nhau tạo thành một gen hoàn chỉnh.

45

Sử dụng phần mềm BioEdit: So sánh các đoạn gen của virus cúm B tại Miền

Bắc Việt Nam năm 2010-2012 với các virus cúm B lưu hành trong khu vực

và trên thế giới.

Sử dụng phần mềm Mega 4 [53]: Xây dựng cây gia hệ của các gen HA của

virus Cúm B tại Miền Bắc Việt Nam năm 2010-2012: sử dụng phương pháp

ước tính khả năng chênh lệch tối đa (maximum likelihood) thông qua mô

hình NJ (Neighbor-Joining). Trình tự của các chủng vắc xin được sử dụng

làm gốc của cây gia hệ được lấy từ GenBank.

46

Chương 3

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ KHUẾCH ĐẠI CÁC CHỦNG VIRUS CÚM

B TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM, 2010-2012

3.1.1. Sự lưu hành của virus cúm B tại miền Bắc Việt Nam, 2010 - 2012

Tại Việt Nam, Chương trình giám sát cúm Quốc gia được triển khai từ năm

2006 do sự tài trợ của Trung tâm phòng chống và kiểm soát bệnh tật Hoa Kỳ

(CDC) tại 4 vùng là miền Bắc, miền Trung, miền Nam và Tây Nguyên với mục

đích xác định sự lưu hành của các phân týp virus cúm bằng phản ứng RT-PCR. Tại

miền Bắc Việt Nam từ năm 2010 đã triển khai 4 điểm giám sát bệnh nhân hội

chứng cúm (ILI): Bệnh viện Nhi Trung Ương, Trung tâm Y tế huyện Cao Lộc -

Lạng Sơn, Trung tâm Y tế huyện Kiến Xương - Thái Bình, Phòng khám đa khoa

Thanh Xuân - Hà Nội.

Trong giai đoạn nghiên cứu, 2010 - 2012, sự lưu hành của virus cúm B được

quan sát theo số liệu của chương trình Giám sát cúm Quốc gia tại các điểm nghiên

cứu như sau:

47

Hình 3.1. Sự lưu hành của virus cúm B tại miền Bắc Việt Nam, 2010 -

2012

Nguồn: Chương trình Giám sát Cúm Quốc gia- Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung

Ương

Thông qua Dự án Giám sát Cúm Quốc gia được triển khai tại Việt Nam với

sự phối hợp của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương và Trung tâm phòng chống và

kiểm soát bệnh tật Hoa Kỳ (CDC) từ năm 2006 đến nay cho thấy virus cúm B được

quan sát thấy hàng năm, cùng với 2 loại virus cúm mùa khác là A/H1N1 và

A/H3N2, virus cúm B lưu hành quanh năm tại Việt Nam, trong đó virus cúm B

thường tập trung lưu hành chủ yếu vào mùa đông xuân (tháng 2 - 3).

3.1.2. Kết quả phân lập virus cúm B tại miền Bắc Việt Nam, 2010 - 2012

Virus cúm B cùng với các virus cúm mùa khác là A/H1N1 và A/H3N2 được

tiến hành phân lập trong phòng thí nghiệm an toàn cấp độ 2 và sử dụng dòng tế bào

0

5

10

15

20

25

30

Tỷ

lệ

%

Năm

Tỷ lệ % bệnh nhân ILI dương tính với virus cúm B, Việt Nam 2006–

2012, N=37,636 B

48

cảm thụ MDCK. MDCK là dòng tế bào thích hợp nhất để phân lập virus cúm B trên

người do virus cúm B có khả năng thích ứng tốt nhất trên dòng tế bào này.

Bảng 3.1. Kết quả phân lập virus cúm B tại Miền Bắc Việt Nam, 2010 - 2012

Trong tổng số 397 mẫu bệnh phẩm được xác định là dương tính với virus

cúm B trong 3 năm (2010 - 2012) đã phân lập được 115 chủng virus cúm B

(29,0%), trong đó số mẫu dương tính phân lập của năm 2010 chiếm tỉ lệ thấp hơn

hẳn so với năm 2011 và 2012, mặc dù số mẫu dương tính với virus cúm B trong

năm 2010 là cao nhất. Kết quả của phương pháp phân lập virus phụ thuộc rất nhiều

vào chất lượng bệnh phẩm, điều kiện bảo quản cũng như kỹ năng phân lập. Trong

năm 2011, 2012 điều kiện và kỹ năng phân lập đã được nâng cao, do đó đã làm tăng

tỷ lệ phân lập từ 7,5% năm 2010 lên 43,4% và 40,1% vào năm 2011 và 2012.

Phân lập virus được coi là “tiêu chuẩn vàng” trong chẩn đoán nhiễm virus

cúm [17]. Bên cạnh những nhược điểm như quy trình phân lập virus đòi hỏi nhiều

thời gian (3 tuần) cũng như phụ thuộc rất nhiều vào chất lượng bệnh phẩm, vì vậy

tỷ lệ dương tính sẽ không cao. Phương pháp này cũng có những ưu điểm như cho

phép tìm hiểu đặc điểm di truyền cũng như đặc tính kháng nguyên - hệ quả của quá

trình tiến hóa của virus cúm [7]. Chủng virus phân lập được phục vụ cho việc

nghiên cứu về các đặc điểm sinh học cũng như sự biến đổi di truyền và tính chất

kháng nguyên, từ đó có thể dự đoán được sự lan truyền của một chủng virus mới có

Năm Số mẫu có hội

chứng cúm

Số mẫu phân

lập được Tỷ lệ (%)

2010 147 11 7,5

2011 113 49 43,4

2012 137 55 40,1

Tổng số 397 115 29,0

49

độc lực cao trong giai đoạn tiếp theo và lựa chọn thành phần vắc xin cúm hàng năm

phù hợp.

3.2. ĐẶC TÍNH KHÁNG NGUYÊN CỦA VIRUS CÚM B, 2010-2012

Đặc tính kháng nguyên của virus cúm được quyết định bởi những thay đổi

trong vật liệu di truyền tại một số vị trí đặc biệt trên gen HA. Đặc tính kháng

nguyên của virus quyết định hiệu quả bảo vệ của vắc xin phòng chống virus và

được thể hiện rất rõ trong lịch sử phát triển của vắc xin cúm trong hơn 50 năm qua.

Thông thường đặc tính kháng nguyên của virus được xác định thông qua khả

năng tương tác với các kháng huyết thanh chuẩn (reference antisera) được sản xuất

từ các chủng dự tuyển vắc xin thông qua phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu (HI).

Các chủng virus cúm B phân lập được từ các bệnh nhân hội chứng cúm (ILI) từ

năm 2010-2012 tại Miền Bắc Việt Nam có hiệu giá HA ≥ 8 sẽ được xác định đặc

tính kháng nguyên bằng phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu (HI) sử dụng kháng

huyết thanh chuẩn do TCYTTG cung cấp hàng năm (bảng 3.2).

Bảng 3.2. Kết quả định týp virus cúm B bằng phương pháp HI, 2010-

2012

Năm

Dòng kháng nguyên

2010 2011 2012 Tổng

n % n % n %

B/Victoria/2/87 9 81,8 41 83,7 22 40,0 65

B/Yamagata/16/88 2 18,2 8 16,3 33 60,0 50

Tổng số 11 100 49 100 55 100 115

50

Hình 3.2. Tỷ lệ lưu hành 2 dòng kháng nguyên virus cúm B theo năm

Tại Việt Nam, khác với virus cúm A là xuất hiện xen kẽ giữa các năm với

phân týp khác nhau (A/H1N1, A/H3N2), virus cúm B xuất hiện hàng năm và đều có

sự lưu hành đồng thời 2 dòng kháng nguyên B/Yamagata/16/88 và B/Victoria/2/87,

trong đó sẽ có một dòng kháng nguyên chiếm ưu thế. Mùa cúm năm 2007-2008,

dòng B/Yamagata chiếm ưu thế; năm 2009 được thay thế bằng dòng Victoria (theo

số liệu Giám sát Cúm Quốc gia). Trong nghiên cứu của chúng tôi, 2010-2012, dòng

kháng nguyên B/Victoria chiếm ưu thế trong 2 năm 2010 và 2011 với tỷ lệ gần như

ngang bằng nhau (81,8% và 83,7%) và giảm dần vào năm tiếp theo (40% năm

2012). Thay vào đó, dòng kháng nguyên B/Yamagata năm 2010, 2011 có tỷ lệ thấp

(18,2% và 16,3%), và dần chiếm ưu thế vào năm 2012 với tỷ lệ 60% (hình 3.2). Kết

quả này phù hợp với quy luật lưu hành của virus cúm B là 2 dòng kháng nguyên

virus cúm B gồm có B/ Victoria và B/Yamagata thay phiên nhau chiếm ưu thế trong

2-3 năm.

18.2 16.3

60

81.8 83.7

40

0

20

40

60

80

100

120

B/Yamagata/16/88 B/Victoria/2/87

2010 2011 2012

51

Tỷ lệ này chỉ dựa trên những chủng vius phân lập và khuếch đại được với

hiệu giá HA ≥ 8 (115/397 mẫu, chiếm tỷ lệ 29,0%). Số mẫu dương tính với RT-

PCR nhưng phân lập không thành công hoặc hiệu giá HA ≤ 8 còn lại (chiếm tỷ lệ

71%) không cho phép phân tích được đặc tính kháng nguyên. Tuy nhiên kết quả so

sánh về tỷ lệ lưu hành của 2 dòng cúm B trong giai đoạn này vẫn mang tính đại diện

cao, phù hợp với quy luật lưu hành của virus cúm B tại các nước Đông Nam Á.

Bảng 3.3. Hiệu giá HI của các chủng virus cúm B, 2010-2012

Dòng kháng

nguyên

Hiệu

giá HI

2010

(n)

2011

(n)

2012

(n)

Tổng

n %

B/Victoria ≥160 9 34 19 62 86,1

80 0 5 2 7 9,7

≤40 0 2 1 3 4,2

Tổng 9 41 22 72 100

B/Yamagata ≥ 320 2 4 18 24 55,8

160 0 3 7 10 23,3

≤80 0 1 8 9 20,9

Tổng 2 8 33 43 100

Bảng 3.3 cho thấy, trong dòng kháng nguyên B/Victoria, tỷ lệ chủng virus có

hiệu giá HI ≥ 160 khi tương tác với kháng huyết thanh tạo ra từ chủng virus vắc xin

dự tuyển B/Brisbane/60/2008, tương đương với hiệu giá chuẩn, là 86,1% (62/72

chủng). Trong khi đó, tỷ lệ này ở dòng B/Yamagata là 55,8% (24/43 chủng) với

hiệu giá HI ≥ 320. Tỷ lệ hiệu giá HI của các chủng virus thấp hơn 1-2 bậc so với

hiệu giá chuẩn của dòng B/Victoria là 9,7% và 4,2%, thấp hơn so với dòng

B/Yamagata là 23,3 và 20,9%. Điều này cho thấy hiệu quả bảo vệ của vắc xin có

chủng virus cúm B/Victoria với chủng virus thuộc dòng B/Victoria lưu hành tại

Việt Nam cao hơn so với các chủng B/Yamagata.

52

Bảng 3.4. So sánh hiệu giá HI giữa hai dòng B/Victoria và B/Yamagata

Năm Mã số PTN Kết quả HI Kết quả

định týp

Kháng huyết

thanh chuẩn

Dòng B/Yamagata Dòng B/Victoria

2010

TX 72 320 >640 B/ Victoria

TX 73 160 >640 B/ Victoria

TX 121 160 640 B/ Victoria

N 101 80 >640 B/ Victoria

N131 80 >640 B/ Victoria

N121 >640 160 B/Yamagat

a

2011

N32 80 >640 B/ Victoria

N361 80 160 B/ Victoria

N373 ≥1280 40 B/Yamagat

a

2012

N15 80 ≥1280 B/ Victoria

N22 80 160 B/ Victoria

N27 80 160 B/ Victoria

Để tìm hiểu khả năng bảo vệ chéo giữa 2 dòng kháng nguyên, chúng tôi lựa

chọn các chủng đã được xác định đặc tính kháng nguyên bằng phản ứng HI có

kháng thể bảo vệ chéo với dòng kháng nguyên còn lại với hiệu giá kháng thể bằng

hoặc thấp hơn từ 1 đến 2 bậc pha loãng. Đối với các chủng B/Victoria có hiệu giá

53

tương đương với chủng chuẩn là HI ≥160 và B/Yamagata là HI ≥320, chúng tôi sẽ

lựa chọn những chủng thuộc dòng B/Vitoria có hiệu giá với kháng huyết thanh

chuẩn dòng B/Yamagata là HI= 320, 160 và 80 hoặc ngược lại những chủng thuộc

dòng B/Yamagata có hiệu giá với kháng huyết thanh chuẩn dòng B/Victoria là

HI=160, 80 và 40. Kết quả đã xác định được 6 chủng năm 2010, 3 chủng năm 2011

và 3 chủng năm 2012 (bảng 3.4). Như vậy, khi lựa chọn một trong 2 dòng kháng

nguyên trong thành phần vắc xin cúm 2010-2012, tỷ lệ nhóm được bảo vệ với dòng

kháng nguyên còn lại là 12/115 (10,4%).

Bảng 3.5. So sánh kháng nguyên virus cúm B tại Miền Bắc Việt Nam với

thành phần vắc xin cúm tại Bắc và Nam Bán cầu theo khuyến cáo của

TCYTTG, 2010-2012

Mùa

cúm

Dòng KN Nam Bán cầu Bắc Bán cầu Miền Bắc Việt Nam

2010/

2011

B/Victoria B/Brisbane/60/2008-

like virus

B/Brisbane/60/2008-

like virus

B/ Brisban/60/2008

-like virus

B/Yamagata B/Florida/4/2006-

like virus

2011/

2012

B/Victoria B/Brisbane/60/2008-

like virus

B/Brisbane/60/2008-

like virus

B/ Brisban/60/2008

-like virus

B/Yamagata B/Florida/4/2006-

like virus

2012/

2013

B/Victoria B/Brisbane/60/2008-

like virus

B/ Brisban/60/2008 -

like virus

B/Yamagata B/Wisconsin/1/2010-

like virus

B/Wisconsin/1/2010-

like virus

Nguồn: Khuyến cáo về thành phần vắc xin cúm mùa hàng năm của TCYTTG

54

Kháng nguyên virus cúm B lưu hành trên thế giới từ trước năm 1983 đến nay

được chia thành 2 dòng: dòng Yamagata (B/Yamagata/16/88-lineage viruses) và

dòng Victoria (B/Victoria/2/87-lineage viruses) [48]. Trong 2 năm 2010 - 2011,

virus cúm B được khuyến cáo trong thành phần vắc xin tại Bắc Bán cầu và Nam

Bán cầu đều thuộc dòng kháng nguyên B/Victoria (B/Brisbane/60/2008-like virus).

Đến năm 2012, dòng kháng nguyên B/Victoria được khuyến cáo trong thành phần

vắc xin tại Nam Bán cầu, trong khi đó dòng kháng nguyên B/Yamagata

(B/Wisconsin/1/2010-like virus) được khuyến cáo cho thành phần vắc xin tại Bắc

Bán cầu. Đặc tính kháng nguyên của virus cúm B lưu hành tại Miền Bắc Việt Nam

trong nghiên cứu của chúng tôi tương đồng với các chủng virus trong thành phần

vắc xin tại Bắc Bán cầu và Nam Bán cầu trong 3 năm.

Trong nghiên cứu này, virus cúm B/Yamagata lưu hành với tỷ lệ thấp năm

2010, 2011 (18,2% và 16,3%) và có xu hướng tăng và chiếm ưu thế năm 2012

(60%) (bảng 3.2). Vì vậy, thành phần vắc xin cúm B khuyến cáo tại Bắc bán cầu

năm 2012 sẽ phù hợp hơn tại miền Bắc Việt Nam. Tuy nhiên, dù lựa chọn 1 trong

2 dòng cúm B lưu hành chiếm ưu thế trong năm để khuyến cáo làm chủng dự tuyển

vắc xin thì khả năng bảo vệ là hạn chế do virus cúm B lưu hành cả 2 chủng kháng

nguyên với tỷ lệ B/Yamagata (60%) và B/Victoria (40%).

Trên thế giới, từ những năm 1970, vắc xin cúm được sản xuất là vắc xin đa

giá, thành phần vắc xin bao gồm 2 phân týp virus cúm A (A/H1N1, A/H3N2) và 1

dòng cúm B (Trivalent influenza vaccine - TIV). Vào những năm của thập kỷ 80,

virus cúm B đã xuất hiện 2 dòng, Yamagata và Victoria, lưu hành đồng thời ở nhiều

nước nhưng thành phần vắc xin vẫn lựa chọn chủng đại diện cho một dòng kháng

nguyên virus cúm B [37, 48]. Vì vậy, những năm virus cúm B lưu hành cả 2 dòng

kháng nguyên thì hiệu quả của vắc xin dự phòng sẽ là hạn chế. Mặt khác, nhiều năm

đã có sự không phù hợp giữa chủng virus cúm B đang lưu hành và chủng cúm B

được lựa chọn trong thành phần vắc xin hàng năm. Năm 2007, các quan chức y tế

đã đưa ra một quyết định sai lầm. Tại thời điểm đó, trên thế giới dòng B/Yamagata

55

chiếm ưu thế (98%) nhưng các nhà y tế đã khuyến cáo trong thành phân vắc xin là

dòng B/Victoria [55]. Trong phân tích nhóm trẻ em sử dụng vắc xin cúm sống giảm

độc lực, hiệu quả bảo vệ với chủng virus cúm B giống với chủng virus đang lưu

hành là 86%, với chủng virus cúm B dòng kháng nguyên khác là 31% [12]. Nghiên

cứu tại Thổ Nhĩ Kỳ trong 9 mùa cúm liên tiếp (2003-2012), 2 mùa cúm có sự lưu

hành đồng thời của 2 dòng kháng nguyên và 6 mùa có sự lưu hành của 1 trong 2

dòng kháng nguyên. Phân tích về tính kháng nguyên cho thấy virus cúm B lưu hành

chỉ tương đồng một phần hoặc toàn bộ với thành phần trong vắc xin 3/8 mùa [11].

Chính vì vậy, việc phát triển vắc xin cúm mùa bao gồm cả 2 dòng kháng

nguyên B/Yamagata và B/Victoria là hết sức cần thiết. Đó là vắc xin gồm 4 thành

phần virus (H1N1, H3N2, B/Yamagata và B/Victoria- Quadrivalent Influenza

Vaccine/QIV). Ngày 29/2/2012, vắc xin cúm giảm độc lực QIV (FluMist

Quadrivalent) của công ty MedImmune, LLC (Hoa Kỳ) là vắc xin gồm 4 chủng

virus cúm đầu tiên trên thế giới đã được Cục Quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ

chấp thuận sử dụng cho lứa tuổi từ 2-49 tuổi [56]. Hiện nay, các công ty như Sanofi

Pasteur, GlaxoSmithKline (GSK) và Novartis cũng đang nỗ lực phát triển vắc xin

cúm QIV. Gần đây nhất, 11/12/2013, vắc xin FluLaval Quadrivalent của công ty

GlaxoSmithKline cũng đã được Cục Quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ chấp

thuận sử dụng cho nhóm từ 3 tuổi trở lên.

Hiện nay, tại Việt Nam, vắc xin cúm được sử dụng là vắc xin Bắc Bán cầu.

Vì vậy, việc giám sát và xác định tính kháng nguyên của virus cúm mùa lưu hành

tại Việt Nam nói chung và Miền Bắc nói riêng có ý ‎nghĩa lớn trong việc sử dụng và

phát triển vắc xin cúm tại Việt Nam trong tương lai. Ngoài ra, giám sát sự thay đổi

đặc tính kháng nguyên của virus cúm sẽ cung cấp các thông cần thiết cho mạng

lưới giám sát cúm toàn cầu (Global Influenza Surveillance and Response System -

GISRS) trong việc phát triển vắc xin phòng chống cúm cho khu vực, các quốc gia

có chung điều kiện khí hậu, kinh tế... để nâng cao hiệu quả bảo vệ của vắc xin cúm.

56

3.3. ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ PROTEIN HA CÁC CHỦNG VIRUS CÚM

B TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM, 2010-2012

3.3.1. Sự phân bố của các chủng virus cúm B theo thời gian

Bảng 3.6. Số lượng chủng phân tích gen HA và NA

Năm Số chủng phân tích

Gen HA Gen NA

2010 5 5

2011 22 14

2012 14 7

Tổng số 41 26

Trong tổng số 115 chủng virus cúm B đã được xác định đặc tính kháng

nguyên, chúng tôi tiến hành lựa chọn và phân tích 41 chủng virus đại diện cho các

điểm giám sát tại Miền Bắc Việt Nam theo thời gian. Số chủng phân tích gen HA

là 41 chủng và gen NA là 26 chủng.

3.3.2. Kết quả khuếch đại đoạn gen HA của virus cúm B

Sử dụng các cặp mồi thiết kế cho phân tách phân đoạn gen HA của virus

cúm B kết hợp với enzym DNA polymerase Hifi trong kỹ thuật PCR có khả năng

khuếch đại và tổng hợp các gen mong muốn từ các chủng virus phân lập được với

kích thước lớn và độ đặc hiệu, chính xác cao. Đây là một bước đệm trong quá trình

giải trình tự gen tìm ra các biển đổi trên vật liệu di truyền.

Kết quả khuếch đại đoạn gen HA của virus cúm B bằng phương pháp PCR

trong nghiên cứu của chúng tôi cho sản phẩm có kích thước băng đặc hiệu là

1140bp (hình 3.3). Đoạn gen này sau khi tinh sạch đã được loại bỏ những sản

phẩm thừa không đặc hiệu trong quá trình phản ứng (hình 3.4). Sản phẩm tinh

sạch này được sử dụng trong quá trình giải trình tự.

57

Hình 3.3. Sản phẩm gen HA sau PCR

(M: Thang trọng lượng phân tử)

Hình 3.4. Sản phẩm gen HA sau khi tinh sạch

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

← HA

1140bp

← HA

1140bp

1 2 3 4 5 6 7 8 M 9 10 11 12 13 14 15 16

58

3.3.3. Cây gia hệ gen HA

Hình 3.5. Cây gia hệ gen HA (1140 nucleotide) dòng B/Yamagata và dòng

B/Victoria, 2010-2012

Chủng năm 2010

Chủng năm 2011

Chủng năm 2012

Chủng vắc xin

Chủng năm 2008, 2009

59

Hình 3.6. Cây gia hệ gen HA (1140 nucleotide) dòng B/Victoria, 2010-2012

Chủng năm 2010

Chủng năm 2011

Chủng năm 2012

Chủng vắc xin

Chủng năm 2008, 2009

60

Hình 3.7. Cây gia hệ gen HA (1140 nucleotide) dòng B/Yamagata, 2010-2012

Chủng năm 2010

Chủng năm 2011

Chủng năm 2012

Chủng năm 2008, 2009

Chủng Vắc xin

61

Cây gia hệ gen HA được xây dựng dựa trên việc phân tích gen HA (1140

nucleotide) của 41 chủng virus cúm B phân lập được tại Việt Nam, 2010-2012 bằng

phần mềm MEGA 4 trên cơ sở ước tính khả năng chênh lệch tối đa (maximum

likelihood) thông qua mô hình NJ (Neighbor-Joining). Trong 41 chủng cúm B phân

tích gen HA, có 5 chủng thuộc năm 2010, 22 chủng thuộc năm 2011, 14 chủng

thuộc năm 2012. Cây gia hệ được thiết lập dựa trên các dữ liệu thu thập trên

Genbank bao gồm các chủng vắc xin dự tuyển giai đoạn 2004-2012 (B/

Malaysia/2506/2004, B/Ohio/1/2005 và B/Brisbane/60/2008), các chủng virus cúm

B lưu hành tại một số nước trên thế giới (Thái Lan, Trung Quốc, Đài Loan, Nhật

Bản, Úc, Mỹ...) và các chủng virus cúm B lưu hành tại Việt Nam giai đoạn 2009-

2013. Tại Việt Nam cũng như nhiều nước trên thế giới, virus cúm B dường như

chưa được quan tâm đúng mực. Do vậy, các nghiên cứu về đặc tính di truyền, kháng

nguyên virus cúm B chưa nhiều nên các dữ liệu trên Genbank cũng hạn chế.

Trong giai đoạn 2010-2012, cả 2 dòng kháng nguyên B/Vicroria

(B/Victoria/2/87-lineage) và B/Yamagata (B/Yamagata/16/88-lineage) lưu hành

đồng thời tại Việt Nam với số lượng chủng lần lượt là 24 và 17. Trong đó, các virus

cúm dòng B/Victoria được chia thành 2 nhóm: nhóm Victoria 1 (V1) gồm chủ yếu

các chủng lưu hành năm 2010-2011 (3 chủng năm 2010 và 13 chủng năm 2011) và

nhóm Vitoria 2 (V2) gồm chủ yếu các chủng lưu hành năm 2012 (7 chủng năm

2012 và 1 chủng năm 2011). Cũng giống dòng B/Victoria, virus cúm dòng

B/Yamagata trong giai đoạn nghiên cứu cũng được chia thành 2 nhóm Yamagata 1

(Y1) và Yamagata 2 (Y 2). Tuy nhiên, 16/17 chủng nghiên cứu thuộc dòng

B/Yamagata đều thuộc phân nhóm Y1, có độ tương đồng cao với chủng vắc xin

B/Florida/04/2006. Có duy nhất 1 chủng năm 2012 (B/Vietnam/IS0712401/2012)

thuộc nhóm Y2, cùng nhóm với chủng vắc xin B/Wisconsin/01/2010 (hình 3.5 và

hình 3.7). Sự chuyển dịch này cũng được phản ánh trong phản ứng ngăn ngứng kết

hồng cầu. Hiệu giá của chủng virus B/Vietnam/IS0712401/2012 với kháng huyết

thanh chuẩn dòng B/Yamagata (B/Frolida/04/2006 reference antisera) thấp hơn 3

bậc pha loãng so với kháng nguyên chuẩn (HI=40) (phụ lục).

62

Như vậy, phân tích cây gia hệ gen HA của virus cúm B đã cho thấy có sự

tiến hóa về mặt di truyền trong từng dòng virus cúm B. Trong khoảng thời gian

2010-2011, các virus xuất hiện trong phân nhóm V1, có độ tương đồng cao về mặt

di truyền học, trong đó có 2 chủng virus cúm B tại Việt Nam năm 2008 và 2009

(B/Vietnam/DN353/2008 và B/Vietnam/TX532/2009) cũng nằm trong phân nhóm

này. Sau đó, phát triển phân nhóm V2 và có độ tương đồng cao với các chủng lưu

hành cùng thời gian tại Thái Lan, Trung Quốc... Toàn bộ các virus thuộc nhóm V1

trong nghiên cứu được nhóm vào cùng phân nhóm với virus B/Brisbane/60/2008 là

chủng vắc xin cho Nam Bán cầu trong 3 năm 2010-2012 và Bắc bán cầu trong 2

năm 2010, 2011. Trong khi đó, virus dòng B/Yagamata trong 3 năm nghiên cứu

phần lớn thuộc nhóm Y1, có độ tương đồng cao với các chủng virus tại Đài Loan,

Nhật Bản, Thái Lan...

3.3.4. Protein HA

Khi so sánh mức độ tương đồng về axit amin trên protein HA của các chủng

virus cúm B lưu hành tại miền Bắc Việt Nam năm 2010-2012 với chủng

B/Brisbane/60/2008-like virus (chủng dự tuyển vắc xin Bắc Bán cầu 2010, 2011) và

chủng B/Wisconsin/1/2010-like virus (chủng dự tuyển vắc xin Bắc Bán cầu 2012)

cho thấy thay đổi axit amin như sau:

63

Hình 3.8. Vị trí axit amin thay đổi trên protein HA dòng B/Victoria

Bảng 3.7. Vị trí axit amin thay đổi trên protein HA dòng B/Vitoria, 2010-2012

Chủng Năm Vị trí axit amin thay đổi

3

8

4

8

5

2

7

3

9

0

1

0

5

1

4

4

1

6

1

1

6

9

1

8

0

1

8

7

1

9

8

2

1

2

2

1

7

2

3

3

2

4

0

2

7

0

B/Brisbane/60/20

08.vac

E T T L K V N I A K P E N A N V S

Vic 1 2010 I N V N S I

2011 D S I N I V N S S Y

Vic 2 2011 V S

2012 P N I S V E G S E S

Chủng virus B/Brisbane/60/2008 được lựa chọn trong thành phần vắc xin

cúm trong 3 năm ở Nam bán cầu (2010-2012) và 2 năm ở Bắc bán cầu (2010-2011)

được lựa chọn làm chủng chuẩn để so sánh sự khác biệt về axit amin với các virus

thuộc dòng B/Vicroria. Sự so sánh này cho phép xác định các axit amin đóng vai

trò quyết định sự phân tách nhóm V1 (năm 2010-2011) và V2 (chủ yếu năm 2012).

64

Kết quả phân tích trên protein HA cho thấy có 17 axit amin thay đổi so với chủng

vắc xin B/Brisbane/60/2008, nằm trên protein HA1 (bảng 3.7). Thay đổi axit amin

K90N và I161V xuất hiện trong ở cả 2 nhóm V1 và V2 (các chủng năm 2012),

trong khi đó, thay đổi tại T52I , K180N và P187S chỉ xuất hiện tại nhóm Vic 1

trong cả 2 năm 2010 và 2011. Kết quả trên gợi ý 3 sự thay đổi trên có thể là

nguyên phân tách nhóm V1 và V2. Trong đó, nhóm V1 xuất hiện 6 axit amin

(2010) đến 10 axit amin (2011) thay đổi so với chủng vắc xin.

Hình 3.9. Vị trí axit amin thay đổi trên protein HA dòng B/Yamagata

65

Bảng 3.8. Vị trí axit amin thay đổi trên protein HA dòng B/Yamagata, 2010-

2012

Chủng Năm Vị trí đột biến axit amin

6

3

9

1

1

0

5

1

2

3

1

2

5

1

3

1

1

3

6

1

3

8

1

6

1

1

6

5

1

8

0

1

9

0

1

9

6

2

1

7

2

4

4

2

6

5

3

1

3

3

2

7

3

4

0

3

5

2

B/Wisconsin/

01/2010.vac

R T V P L N T N A I Y E T S D M K E K R

Yam 1 2010

2011

2012

K

K

K

A

A

A

A

A

A

I

I

I

A

A

A

K

K

K

T

T

T

S

S

S

N

N

N

K

K

K

A

A

A

N

N

N

G

G

G

L

L

L

N

N

N

K

K

K

Yam 2 2012 I K E K

Chủng virus B/Wisconsin/01/2010 được lựa chọn trong thành phần vắc xin ở

Bắc bán cầu năm 2012 được lựa chọn làm chủng chuẩn để so sánh sự khác biệt về

axit amin với các virus thuộc dòng B/Yamagata lưu hành tại Việt Nam giai đoạn

2010-2012. Trong tổng số 17 chủng nghiên cứu, có 16 chủng thuộc nhóm Yam 1

có 16 axit amin thay đổi so với chủng chuẩn. Trong đó có 7 axit amin thay đổi với

tần xuất cao 100% (16/16): R63K, P123A, I165S, Y180N, T196A, S217N và

D244G. Chỉ có 1 chủng duy nhất (B/Vietnam/IS0712401/2012) không xác định

được sự thay đổi 7 axit amin trên nhưng lại xuất hiện sự thay đổi axit amin tại 4 vị

trí khác. Như vậy, có thể sự thay đổi 7 axit amin nói trên dẫn tới sự phân tách

nhóm Y1 và Y2.

66

Hình 3.10. Số axit amin khác nhau trên protein HA dòng B/Victoria giữa các

chủng nghiên cứu và chủng dự tuyển vắc xin

Hình 3.11. Số axit amin khác nhau trên protein HA dòng B/Yamagata giữa

các chủng nghiên cứu và chủng dự tuyển vắc xin

67

Bảng 3.9. Số lượng trung bình axit amin thay đổi trên protein HA so với

virus dự tuyển vắc xin của TCYTTG, 2010 -2012

Năm Virus dự tuyển vắc xin Số virus

(n)

Phân

nhóm

Số aa thay

đổi

2010 B/Brisbane/60/2008-like virus 3 V1 4,0

2011 B/Brisbane/60/2008-like virus 14 V1, V2 3,9

2012 B/Brisbane/60/2008-like virus (NBC)

B/Wisconsin/1/2010-like virus (BBC)

7

7

V2

Y1, Y2

2,9

6,3

Trong giai đoạn 2010 - 2012, sự khác biệt trung bình về axit amin của các

virus trong từng năm với virus vắc xin B/Brisbane/60/2008 (Nam Bán cầu) từ 2,9

đến 4,0 axit amin, so với virus vắc xin B/Wisconsin/1/2010 (Bắc bán cầu năm

2012) là 6,3 axit amin (bảng 3.9). Kết quả này gợi ý rằng cả hai dòng virus cúm B/

Victoria và B/Yamagata lưu hành tại Việt Nam đều có độ tương đồng cao với

chủng virus vắc xin ở cả Bắc và Nam Bán cầu. Sự khác biệt từ 2,9 axit amin đến

6,3 axit amin đều cho thấy khả năng bảo vệ cao của vắc xin cúm. Trong năm 2012,

khi chủng vắc xin ở Bắc Bán cầu và Nam Bán cầu là khác nhau thì sự khác biệt

axit amin của các chủng ở Bắc Bán cầu cao hơn so với các chủng ở Nam Bán cầu.

3.4. ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ PROTEIN NA CÁC CHỦNG VIRUS

CÚM B TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM, 2010-2012

3.4.1. Kết quả khuếch đại đoạn gen NA của virus cúm B

Trong nghiên cứu của chúng tôi, kết quả khuếch đại đoạn gen NA của virus

cúm B bằng phương pháp PCR cho sản phẩm có kích thước băng đặc hiệu là

1557bp (hình 3.12). Đoạn gen này sau khi tinh sạch đã được loại bỏ những sản

68

phẩm thừa không đặc hiệu trong quá trình phản ứng (hình 3.13). Sản phẩm tinh

sạch này được sử dụng trong quá trình giải trình tự.

Hình 3.12. Sản phẩm gen NA sau PCR

(M: Thang trọng lượng phân tử)

Hình 3.13. Sản phẩm gen NA sau khi tinh sạch

← NA

1557bp

← NA

1557bp

1 2 3 4 5 6 7 8 M 9 10 11 12 13 14 15 16

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 M

69

3.4.2. Cây gia hệ gen NA

Hình 3.14. Cây gia hệ gen NA (1557 nucleotide) dòng B/Victoria và dòng

B/Yamagata, 2010-2012

Chủng năm 2010

Chủng năm 2011

Chủng năm 2012

Chủng Vắc xin

70

Hình 3.15. Cây gia hệ gen NA (1557 nucleotide) dòng B/Victoria, 2010-

2012

Chủng năm 2010

Chủng năm 2011

Chủng năm 2012

Chủng Vắc xin

71

Hình 3.16. Cây gia hệ gen NA (1557 nucleotide) dòng B/Yamagata, 2010-2012

Chủng năm 2010

Chủng năm 2011

Chủng năm 2012

Chủng năm vắc xin

72

Cũng tương tự như gen HA, cây gia hệ gen NA được xây dựng dựa trên việc

phân tích gen NA (1557 nucleotide) của 26 chủng virus cúm B phân lập được tại

Việt Nam, 2010-2012, trong đó có 5 chủng thuộc năm 2010, 14 chủng thuộc năm

2011 và 7 chủng thuộc năm 2012. Cây gia hệ được thiết lập dựa trên các dữ liệu thu

thập trên Genbank bao gồm các chủng vắc xin dự tuyển giai đoạn 2004-2012

(B/Victoria: B/ Malaysia/2506/2004, B/Ohio/1/2005, B/Brisbane/60/2008 và

B/Yamagata: B/Floria/04/2006, B/Wisconsin/01/2010), các chủng virus cúm B lưu

hành tại một số nước trên thế giới (Thái Lan, Trung Quốc, Úc, Mỹ...) và các chủng

virus cúm B lưu hành tại Việt Nam giai đoạn 2010-2012.

Kết quả phân tích trên cây gia hệ NA cho thấy trong giai đoạn 2010-2012 cả

2 dòng kháng nguyên B/Vicroria (B/Victoria/2/87-lineage) và B/Yamagata

(B/Yamagata/16/88-lineage) lưu hành đồng thời tại Việt Nam với số lượng chủng

lần lượt là 19 và 7. Các virus cúm thuộc dòng B/Victoria được chia thành 2 phân

nhóm là Victoria 1 (V1) và Victoria 2 (V2) trong đó phân nhóm V1 gồm chủ yếu

các chủng lưu hành năm 2010-2011 (năm 2010, 2011 và 2012 là 3, 8 và 1 chủng) và

phân nhóm V2 gồm các chủng lưu hành năm 2012 (6 chủng) và năm 2011 (1

chủng), tương đồng cao về mặt di truyền với các chủng virus tại Thái Lan, Trung

Quốc... Cũng giống dòng B/Victoria, virus cúm dòng B/Yamagata trong giai đoạn

nghiên cứu cũng được chia thành 2 phân nhóm Yamagata 1 (Y1) và Yamagata 2 (Y

2). Kết quả nghiên cứu cho thấy 7/7 chủng thuộc dòng B/Yamagata đều thuộc phân

nhóm Y1, có độ tương đồng cao với chủng vắc xin B/Florida/04/2006 và các virus

tại Thái Lan, Đài Loan, Nhật Bản...Vì số lượng virus được sử dụng để nghiên cứu

gen NA không nhiều nên có thể không xác định được chủng virus nào trong nghiên

cứu thuộc nhóm Y2, cùng nhóm với chủng vắc xin B/Wisconsin/01/2010 (hình 3.14

và hình 3.16).

Kết quả phân tích cây gia hệ gen cho thấy sự tiến hóa giữa gen HA và NA

của virus cúm B dường như là giống nhau. Các virus trong nghiên cứu cùng thuộc

nhóm di truyền giống nhau ở cả 2 gen HA và NA. Chỉ phát hiện duy nhất 1 chủng

73

(B/Vietnam/LS62/2012) có gen HA thuộc nhóm V2 nhưng gen NA thuộc nhóm V1.

Tuy nhiên, hiệu giá của chủng virus này với kháng huyết thanh chuẩn tương đồng

thuộc dòng B/Vicoria (B/Brisbane/60/2008 reference antisera) vẫn đạt hiệu giá bằng

chủng chuẩn (HI = 160 ) (phụ lục). Điều này cho thấy tính kháng nguyên là không

thay đổi, vẫn tương đồng với chủng vắc xin B/Brisbane/60/2008.

3.4.3. Protein NA

Cùng với protein HA, protein NA mặc dù không quyết định đặc tính kháng

nguyên của virus nhưng protein NA là một trong 2 protein bề mặt có ảnh hưởng

đến khả năng miễn dịch trong cộng đồng. Trong những năm gần đây, các loại

thuốc kháng virus ức chế Neuraminidase ngày càng phát triển nhiều. Vì vậy, việc

giám sát sự thay đổi gen/protein NA ngày càng được quan tâm.

So sánh sự tương đồng của các axit amin giữa các chủng lưu hành tại Việt

Nam 2010-2012 với chủng dự tuyển vắc xin đại diện cho dòng B/Victoria

(B/Brisbane/60/2008) và B/Yamagata (B/Wisconsin/01/2010) cho thấy một số vị trí

axit amin thay đổi.

Hình 3.17. Vị trí axit amin thay đổi trên protein NA dòng B/Victoria

74

Bảng 3.10. Vị trí axit amin thay đổi trên protein NA dòng B/Vitoria, 2010-2012

Chủng Năm Vị trí axit amin thay đổi

34 41 125 204 210 220 320 329 358

B/Brisbane/60/2008.vac S S N V Y K D N E

V1 2010 L P K I N E D A

2011 L P K I F N E D A

2012 L P K I F N K D A

V2 2011 D

2012 D K

Kết quả phân tích trên protein NA thuộc dòng B/Vitoria cho thấy đã xác định

được 36 axit amin thay đổi so với chủng vắc xin B/Brisbane/60/2008. Trong đó, có

9 axit amin thay đổi với tần xuất cao, xác định được ở phần lớn các chủng lưu hành

tại Việt Nam năm 2010-2011 thuộc nhóm V1: S34L, S41P, N125K,, V204I,

Y210F, K220N, D320E, N329D và E358A. Các đột biến này không thấy xuất hiện

trong nhóm V2 lưu hành năm 2012 (chỉ xác định được 2/6 chủng năm 2012 và 1

chủng năm 2011 tại 1 vị trí N329D). Kết quả trên có thể thấy rằng sự thay đổi axit

amin tại 9 vị trí này có thể là nguyên nhân phân tách giữa nhóm V1 và V2.

Hình 3.18. Vị trí axit amin thay đổi trên protein NA dòng B/Yamagata

75

Bảng 3.11. Vị trí axit amin thay đổi trên protein NA dòng B/Yamagata, 2010-

2012

Chủng Năm Vị trí axit amin thay đổi

42 68 106 125 128 248 295 340

B/Wisconsin/01/2010.vac R T T K K I S N

Y1 2010 Q A I T V R D

2011 Q A I T R V R D

Tương tự như dòng B/Victoria, khi phân tích protein NA dòng B/Yamagata,

các chủng virus trong nghiên cứu có 17 axit amin khác biệt so với chủng chuẩn

B/Wisconsin/01/2010. Trong đó, có 8 axit amin xuất hiện với tần xuất cao, được

xác định tại các virus lưu hành trong năm 2010-2011 thuộc nhóm Y1: R42Q,

T68A, T106I, K125T, K128R, I248V, S295R và N340D. Số lượng chủng được

giải trình tự năm 2012 là hạn chế nên trong nghiên cứu này, không xác định được

chủng virus thuôc nhóm Y2.

Hình 3.19. Số axit amin khác nhau trên protein NA dòng B/Victoria giữa các

chủng nghiên cứu và chủng dự tuyển vắc xin

76

Hình 3.20. Số axit amin khác nhau trên protein NA dòng B/Yamagata giữa các

chủng nghiên cứu và chủng dự tuyển vắc xin

Bảng 3.12. Số lượng trung bình axit amin thay đổi trên protein NA so với

virus dự tuyển vắc xin của TCYTTG, 2010 -2012

Năm Virus dự tuyển vắc xin Số virus

(n)

Phân

nhóm

Số aa

thay đổi

2010 B/Brisbane/60/2008-like virus 3 V1 8,7

2011 B/Brisbane/60/2008-like virus 9 V1, V2 9,6

2012 B/Brisbane/60/2008-like virus (NBC) 7 V1,V2 4,9

Trong giai đoạn 2010- 2012, sự khác biệt trung bình về axit amin của các

virus trong từng năm với virus vắc xin B/Brisbane/60/2008 (Nam Bán cầu) từ 4,9

đến 9,6 axit amin (bảng 3.12). Kết quả này gợi ý rằng virus cúm B/Victoria lưu

hành tại Việt Nam đều có độ tương đồng cao với chủng virus vắc xin ở Nam Bán

cầu.

Trong nghiên cứu về sự đa dạng di truyền gen HA và NA của virus cúm B,

2010-2012 tại Ningbo, Đông Nam Trung Quốc, virus lưu hành chủ yếu là dòng

B/Victoria (102/109 chủng - 93,6%). Phân tích đặc điểm di truyền gen HA cho

77

thấy tất cả các chủng virus đều thuộc nhóm 1, nhóm có sự khác biệt từ 1-5 axit

amin so với chủng vắc xin B/Brisbane/60/2008; trong khi đó gen NA được chia

thành các nhóm khác nhau và có sự khác biệt về axit amin với chủng vắc xin là 6-

16 axit amin. Sự tiến hóa di truyền trên gen NA nhanh hơn trên gen HA [28].

Nghiên cứu về virus cúm B tại Hanan, Trung Quốc giai đoạn 2007-2010 cho thấy

các virus dòng B/Victoria và B/Yamagata cũng được chia thành 2 nhóm: V1

(2007-2009) và V2 (2010); Y1 (2007) và Y2 (2009-2010). Khi phân tích gen NA

của các chủng virus cho thấy tất cả gen NA đều thuộc dòng B/Yamagata. Điều này

cho thấy các virus này đều có nguồn gốc B/Yamagata [34]. Điều tương tự này cũng

đã được ghi nhân tại Italy khi phân tích các chủng cúm B mùa cúm 2002/2003 và

2003/2004 cho thấy có sư trao đổi và tích hợp giữa gen HA và NA: đó là các chủng

virus HA/Victoria và NA/Yamagata [45].

*Các đột biến axit amin tại protein NA liên quan đến giảm độ nhạy/kháng

thuốc của thuốc kháng virus Oseltamivir và Zanamivir

Protein NA đóng vai trò enzyme giúp giải phóng virus mới được tổng hợp ra

khỏi tế bào nhiễm. Thuốc kháng virus được phát triển dựa trên cơ sở hoạt động ức

chế hoạt động của enzyme neuraminidase này là Oseltamivir và Zanamivir. Một số

đột biến được xác định liên quan đến khả năng làm giảm độ nhạy/kháng thuốc của

virus cúm B được ghi nhận: D197N, I221T, S249G, H273Y, T325I và G407S (giảm

độ nhạy với oseltamivir) [50, 54].

78

Hình 3.21. Các vị trí axit amin trên protein NA của 2 dòng B/Victoria và

B/Yamagata liên quan đến đột biến kháng thuốc hoặc giảm độ nhạy của thuốc

oseltamivir và zanamivir

79

Như vậy, việc sử dụng các loại thuốc kháng virus như oseltamivir và

zanamivir có thể dẫn đến những đột biến thích nghi trên gen NA của virus cúm và

có thể dẫn đến kháng hoặc giảm độ nhạy của thuốc điều trị. Vì vậy, việc kiểm soát

phác đồ điều trị, giám sát sự kháng thuốc của virus cúm và nghiên cứu, phát triển

thuốc mới trong điều trị bệnh cúm là điều rất cần thiết. Trong nghiên cứu của chúng

tôi không phát hiện được đột biến axit amin tại các vị trí được cho là liên quan đến

giảm độ nhạy/kháng thuốc oseltamivir và zanamivir. Kết quả này cho thấy việc điều

trị bằng nhóm thuốc ức chế neuraminidase vẫn có hiệu quả tốt với virus cúm B.

Nghiên cứu trên thế giới giai đoạn 2004-2008 cũng đã ghi nhận những chủng

virus cúm B kháng/giảm độ nhạy của thuốc tại Mỹ, Nhật Bản (B/Michigan/20/2005,

B/California/4/2005…) (đột biến tại vị trí I221T, H273Y, T325I…)

80

KẾT LUẬN

1, Đặc tính di truyền ở các chủng virus cúm B lưu hành tại miền Bắc Việt

Nam, 2010-2012: lưu hành đồng thời 2 dòng kháng nguyên B/Vicroria

(B/Victoria/2/87-lineage) và B/Yamagata (B/Yamagata/16/88-lineage), trong đó

dòng B/Victoria chiếm ưu thế năm 2010, 2011 và dòng B/Yamagata chiếm ưu thế

năm 2012.

- Dòng B/Victoria trên gen HA và NA đều được chia thành 2 nhóm V1

(2010-2011), cùng phân nhóm với chủng B/Brisbane/60/2008 và V2 (chủ yếu năm

2012) có độ tương đồng cao với các chủng lưu hành cùng thời gian tại Thái Lan và

Trung Quốc.

- Dòng B/Yamagata trên gen HA và NA cũng được chia thành 2 nhóm: Y1

(2010-2012) có độ tương đồng cao với chủng vắc xin B/Florida/40/2006 và nhóm

Y2 (2012) cùng nhóm với chủng vắc xin B/Wisconsin/01/2010.

- Sự tiến hóa giữa gen HA và NA của các virus cúm B, 2010-2012 dường

như là giống nhau. Dòng B/Victoria dường như tiến hóa nhanh hơn so với dòng

B/Yamagata ở cả hai gen HA và NA. Chỉ phát hiện duy nhất 1 chủng B/Viet

Nam/LS62/2012 có gen HA thuộc nhóm V2, gen NA thuộc nhóm V1 nhưng tính

kháng nguyên vẫn tương đồng với chủng B/Brisbane/60/2008.

2, Đặc tính kháng nguyên và các axit amin thay đổi liên quan đến sự thay đổi

đặc tính kháng nguyên của virus cúm.

- Đặc tính kháng nguyên dòng B/Victoria các chủng virus lưu hành tại miền

Bắc Việt Nam có độ tương đồng với virus dự tuyển vắc xin B/Brisbane/60/2008 với

hiệu giá HI ≥ 160 là 86,1% (62/72 chủng).

- Đặc tính kháng nguyên dòng B/Yamagata các chủng virus lưu hành tại

miền Bắc Việt Nam có độ tương đồng với virus dự tuyển vắc xin

B/Wisconsin/01/2010 với hiệu giá HI ≥ 320 là 55,8% (24/43 chủng).

81

- Trên protein HA của các virus cúm B phát hiện sai khác từ 2,9 đến 4,0 axit

amin so với virus vắc xin B/Brisbane/60/2008 (Nam Bán cầu) và 6,3 axit amin với

virus vắc xin B/Wisconsin/1/2010 (Bắc Bán cầu).

- Trên protein NA của các virus cúm B phát hiện sai khác từ 4,9 đến 9,6 axit

amin với virus vắc xin B/Brisbane/60/2008 (Nam Bán cầu).

- Không phát hiện đột biến liên quan đến sự giảm độ nhạy/kháng thuốc

oseltamivir và zanamivir trên protein NA trên cả 2 dòng B/Victoria và B/Yamagata.

82

KIẾN NGHỊ

Từ những kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi xin nêu một số kiến nghị như

sau:

1, Tiếp tục giám sát sự tiến hóa về mặt di truyền học của virus cúm B để theo

dõi sự thay đổi tính kháng nguyên liên quan đến khả năng bảo vệ của vắc xin tương

thích giúp phòng ngừa và kiểm soát bệnh ở mức độ tốt nhất. Nên sử dụng vắc xin

gồm 4 thành phần virus (H1N1, H3N2, B/Yamagata và B/Victoria- Quadrivalent

Influenza Vaccine/QIV) để nâng cao hiệu quả bảo vệ của vắc xin cúm.

2, Tiếp tục giám sát chặt chẽ các đột biến axit amin liên quan đến hiện tượng

giảm độ nhạy/kháng thuốc của thuốc kháng virus Oseltamivir và Zanamivir.

83

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Bộ Y tế (2002), Thống kê bệnh truyền nhiễm năm 2001, Nhà xuất bản Y

học, Hà Nội.

2. Bộ Y tế (2003), Thống kê bệnh truyền nhiễm năm 2002, Nhà xuất bản Y

học, Hà Nội.

3. Bộ Y tế (2004), Niên giám thống kê bệnh truyền nhiễm năm 2003, Nhà xuất

bản Y học, Hà Nội.

4. Bộ Y tế (2005), Niên giám thống kê bệnh truyền nhiễm năm 2004, Nhà xuất

bản Y học, Hà Nội.

5. Bộ Y tế (2006), Niên giám thống kê bệnh truyền nhiễm năm 2005, Nhà xuất

bản Y học, Hà Nội.

6. Lê Huy Chính (2007), Vi sinh vật y học, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.

7. Nguyễn Lê Khánh Hằng, Lê Quỳnh Mai (2011), “Sự lưu hành của virut cúm

mùa tại Hà Nội và miền Bắc Việt Nam, 2001-2008”, Tạp chí Y học Thực

hành, 771, tr. 127-129.

8. Nguyễn Cơ Thạch (2010), Nghiên cứu sự tiến hóa về mặt di truyền học của

virus cúm A/H3N2 tại miền Bắc Việt Nam, 2008-2010, Luận văn Thạc sĩ Kỹ

thuật, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội.

9. Phạm Văn Ty (2005), Vi rút học, Nhà xuất bản Giáo dục, Hà Nội.

Tiếng Anh

10. Air, G M., and R. W. Compans (1983), “Influenza B and influenza C

viruses. In P. Palese and D. W. Kingsbury (ed.), Genetic of influenza

viruses, p. 280-304, Springer-Verlag, New York.

11. Akçay Ciblak M., Kanturvardar Tütenyurd M., Asar S., Tulunoğlu

M., Fındıkçı N., Badur S. (2012), “Influenza surveillance in nine

consecutive seasons, 2003-2012: results from National Influenza Reference

84

Laboratory, Istanbul Faculty Of Medicine, Turkey”, Mikrobiyol Bul, 46(4),

pp. 575-93.

12. Belshe RB, Coelingh K., Ambrose CS, Woo JC, Wu X. (2010), “Efficacy

of live attenuated influenza vaccine in children against influenza B viruses

by lineage and antigenic similarity”, Vaccine, 25,28(9), pp. 2149-56.

13. Belshe RB, M.P., Treanor J., King J., Gruber WC, et al. (1998), “The

efficacy of live attenuated, cold-adapted, trivalent, intranasal influenzavirus

vaccine in children”, N Engl J Med, 338, pp. 1405-1412.

14. Brands R, V.J., Medema J., Palache AM, van Scharrenburg GJ (1999),

“Influvac: a safe Madin Darby canine kidney (MDCK) cell culture-based

influenza vaccine”, Dev Biol Stand, 98, pp. 93-100.

15. Buonagurio DA, S.N., JD Parvin, M. Krytal, P. Palese and WM Fitch

(1986), “Evolution of human influenza A viruses over 50 years: rapid

uniform rate of change in NS gene”, Science, 232, pp. 980-982.

16. CDC 1986- Centers for Disease Control (1986), “Toxic shock syndrome

associated with influenza - Minnesota”, MMWR, 35, pp. 143-4.

17. Centers for Disease Control and Prevention (August 13-14, 2003),

Laboratory Techniques for Influenza Diagnosis, Surveillance Coordinator’s

Conference Atlanta, Georgia, US.

18. Centers for Disease Control and Prevention (September 2010-August

2011), “Influenza-associated pediatric deaths - United States”, MMWR Morb

Mortal Wkly Rep2011, 60, pp. 1233-8.

19. Chang - Sung Tung, Joshua L. Goodman, Henry Lu and Catherine A.

Macken (2004), “Homology model of the structure of influenza B virus

HA1”, Journal of General Virology, 85, pp. 3249-3259.

20. Christopher D. Paddock, Lindy Liu, Amy M. Denison, et al. (2012),

“Myocardial Injury and Bacterial Pneumonia Contribute to the Pathogenesis

of Fatal Influenza B Virus Infection”, JID, 205, pp. 895-905.

85

21. Feldman P, Cohanand M, Hierholzer W. (1972), “Fatal Hong Kong

influenza: a clinical, microbiological and pathological analysis of nine

cases”, Yale J Biol Med, 45, pp. 49-63.

22. Fengyun Ni (2013), Funtional and Structural Studies of Inffluenza B virus

Hemagglutinin, Thesis submitted in parital fulfillment of the requirement

for the degree Doctor of Philosophy, Rice University, Texas.

23. Finelli L., Fiore A., Dhara R., et al. (2008), “Influenza-associated pediatric

mortality in the United States: increase of Staphylococcus aureus

coinfection”, Pediatrics, 122, pp. 805-11.

24. Gubareva LV, K.L., Hayden, FG (2000), “Influenza virus neuraminidase

inhibitors”, Lancet, 355, pp. 827-835.

25. Harper SA, F.K., Uyeki TM, Cox NJ, Bridges CB. Prevention and control

of influenza (2005), “Recommendations of the Advisory Committee on

Immunization Practices (ACIP)”, MMWR Recomm Rep, 54, pp. 1-40.

26. Hers JFP, Masurel N, Mulder J. (1958), “Bacteriology and histopathology

of the respiratory tract and lungs in fatal Asian influenza”, Lancet, 2,

pp.1141-3.

27. Holland PM, A.R., Watson R and Gelfand DH (1991), “Detection of

specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5’-3’

exonuclease activity of the Thermus aquaticus”, Proc Natl Acad Sci USA,

88, pp. 7276-7280.

28. Hu FJ, Li YD, Jiao SL, Zhang S. (2013), “Genetic variation of the

hemagglutinin and neuraminidase of influenza B viruses isolated in Ningbo

during 2010-2012”, Chinese Journal of Preventive Medicine, 47(12), pp.

1100-4.

29. Kistner O, B.P., Mundt W, Reiter M, Schober-Bendixen S, Dorner F

(1998), “Development of a mammalian cell (Vero) derived candidate

influenza virus vaccine”, Vaccine, 16, pp. 960-968.

86

30. Knipe, D.M.H., Peter M (2007), Fields Virology, 5th Edition, , Lippincott

Williams & Wilkins, II (II), Specific Virus Families, 48.

31. Li CK, C.B., Wong TW (2006), “Influenza - related deaths and hospital

izations in HongKong: a subtropical area”, Public Health, 120, pp. 517-24.

32. Lindsay MI, Hermann EC, Morrow GW, Brown AL. (1970), “Hong Kong

influenza: clinical, microbiologic, and pathologic features in 127 cases”,

JAMA, 214, pp. 1825-32.

33. Linstrom SE, Y.H., H Nishimura, T Saito, R Nerome and K Nerome

(1999), “Comparative analysis of evolutionary mechanism of the

heamagglutinin and three internal protein genes of influenza B virus:

multiple cocirculating lineages and frequent teasorrtment of the NP, M and

NS genes”, J. Virol, 73, pp. 4413-4426.

34. Liu YZ, Zhao X, Huang YW, Chen Z, Li FC, Gao LD, et al. (2012),

“Analysis of genetic features of influenza B virus in Hunan province from

2007 to 2010”, Chinese Journal of Preventive Medicine, 46(3), pp. 258-63.

35. Martin CM, Kunin CM, Gottlieb LS, Barnes MW, Liu C, Finland M.

(1959), “Asian influenza A in Boston, 1957-1958. I. Observations in thirty-

two influenza-associated fatal cases”, AMA Arch Intern Med, 103, pp. 515-

31.

36. McCuller, J., GC Wang, S He and R Webter (1999), “Reassortment and

insertion-deletion are strategies for the evolution of influenza B viruses in

nature”, J. Virol, 73, pp. 7343-7348.

37. McCullers JA, Saito T, Iverson AR. (2004), “Multiple genotypes of

influenza B virus circulated between 1979 and 2003”, J Virol, 78(23),

pp. 12817-28.

38. Morens DM, Taubenberger JK, Fauci AS. (2008), “Predominant role of

bacterial pneumonia as a cause of death in pandemic influenza: implications

for pandemic influenza preparedness”, J Infect Dis, 198, pp. 962-70.

87

39. Neumann G, W.T., Ito H, Watanabe S, Goto H, et al. (1999), “Generation

of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs”, Proc Natl Acad Sci

USA, 96, pp. 9345-9350.

40. Neumann G, F.K., Kino Y, Kawaoka Y (2005), “An improved reverse

genetics system for influenza A virus generation and its implications for

vaccine production”, Proc Natl Acad Sci USA, 102, pp. 16825-16829.

41. Nichol KL, M.P., Mallon KP, Jackson LA, Gorse GJ, et al. (1999),

“Effectiveness of live, attenuated intranasal influenza virus vaccine in

healthy, working adults: a randomized controlled trial”, JAMA, 282, pp.

137-144.

42. Nicolson C, M.D., Wood JM, Robertson JS (2005), “Generation of

influenza vaccine viruses on Vero cells by reverse genetics: an H5N1

candidate vaccine strain produced under a quality system”, Vaccine, 23, pp.

2943-2952.

43. Pasteur Institute of Iran, I.U. Avaiable from:

http://www.pasteur.ac.ir/researchDepartment/flu/images/flu_structure.gif&i

mgrefurl

44. Pereira, H. G. (1979), “Influenza : antigenic spectrums”, Prog. Med. Virol,

11, pp. 46-69.

45. Puzelli S, Frezza F, Fabiani C, Ansaldi F, Campitelli L, et al. (2004),

“Changes in the hemagglutinins and neuraminidases of

human influenza B viruses isolated in Italy during the 2001-02, 2002-03,

and 2003-04 seasons”, Journal of Medical Virology, 74(4), pp. 629-40.

46. Q Sue Huang (2010), “Recommendation for seasonal influenza vaccine

composition for New Zealand 2011”, Institude of Environmental Science

and Research Limited.

47. Q. Wang, F. Cheng, M. Lu, X. Tian, J. Ma (2008), “Crystal structure of

unliganded influenza B virus hemagglutinin”, Journal of Virology, 82, 3011-

20.

88

48. Rota PA, T.W., MW Harmon, JS Rota, AP Kendal and K Nerome (1990),

“Cocirculation of two distinct evolutionary lineages of influenza type B

virus since 1983”, Virology, 175, pp. 59-68.

49. Shaw MW, X.X., Y Li, S Normand, RT Ueki, et al. (2002), “Reappearance

and global spread of variants of influenza B/Victoria/2/87 lineage viruses in

the 2000-2001 and the 2001-2002 seasons”, Virology, 303, pp. 1-8.

50. Shuji Hatakeyama, Norio Sugaya, Mutsumi Ito, et al. (2007), “Emergence

of Influenza B Viruses With Reduced Sensitivity to Neuraminidase

Inhibitors”, JAMA, pp.1435-1442.

51. Starko KM, et al. (1980), “ReyeŽs syndrome and salicylate use”,

Pediatrics, 66, pp. 859-864.

52. Steinhaer DA, S.J. (2002), “Gennetic of Influenza viruses”, Ann Rev Genet,

36, pp. 305-332.

53. Tamura K, D.J., Nai M, Kumar S (2007), “MEGA 4: Molecular

Evolutionary Genetics analysis (MEGA) software version 4.0”, Mol Biol

Evol, 24(8), pp. 1596-1599.

54. Tiffany G. Sheu, Varough M. Deyde, Margaret Okomo-Adhiambo, et al.

(2008), “Surveillance for Neuraminidase Inhibitor Resistance among Human

Influenza A and B Viruses Circulating Worldwide from 2004 to 2008”,

Antimicrobial Agents and Chemotherapy, pp. 3284-3292.

55. Toback SL, Rothstein E, Bhatt P, Carr W, Ambrose CS. (2012), “In-

office influenza vaccination by US pediatric providers varies greatly

and is higher among smaller offices”, Clin Pediatr (Phila), 51(6), pp.

551-9.

56. Traynor K. (2012), “First quadrivalent flu vaccine approved”, Am J

Health Syst Pharm, 69(7), pp. 538.

57. X Sherry Chi, T.V.B., Ping Zhao, Ruth Rappaport and Sheau-Mei Cheng

(2003), “Cocirculation and evolution of two lineages of influenza B viruses

89

in Europe nad Isarel in the 2001-2002 season”, J Clin Microbiol, 41(12), pp.

5770-5773.

90

PHỤ LỤC

1, Hiệu giá HI của các chủng virus cúm B, 2010

(Bộ sinh phẩm 2010-2011 của TCYTTG)

Kháng nguyên

chuẩn

Kháng huyết thanh chuẩn

A/ H1N1 A/H3N2 B/Florida/4/2006

(B/Yama)

B/Brisbane/60/2008

(B/Vic)

A/ H1N1 ≥1280 <10 <10 <10

A/H3N2 <10 ≥1280 <10 <10

B/ Florida/4/2006 <10 <10 >640 80

B/Brisbane/60/2008 <10 <10 <10 320

Chủng virus cúm phân lập

STT Mã số

PTN

Hiệu giá HI Kết quả định typ

B/Florida/4

/2006

B/Brisbane/60/

2008

B/Florida/4/2006

(B/Yama)

B/Brisbane/60/2008

(B/Vic)

1 TX 72 320 >640 B/Victoria

2 TX 73 160 >640 B/Victoria

3 NC 433 >320 <10 B/Yamagata

4 N 101 80 >640 B/Victoria

5 TX 121 160 640 B/Victoria

6 N 121 >640 160 B/Yamagata

7 N 131 80 >640 B/Victoria

8 N 133 40 >640 B/Victoria

91

9 N 134 40 320 B/Victoria

10 N 343 10 320 B/Victoria

11 N 351 20 >1280 B/Victoria

92

2, Hiệu giá HI của các chủng virus cúm B, 2011

(Bộ sinh phẩm 2011-2012 của TCYTTG)

Kháng nguyên chuẩn Kháng huyết thanh chuẩn

A/ H1N1 A/H3N

2

B/Wisconsin/01/2010

(B/Yama)

B/Brisbane/60/2008

(B/Vic)

A/ H1N1 ≥1280 <10 <10 <10

A/H3N2 <10 ≥1280 <10 <10

B/ Wisconsin/01/2010 <10 <10 320 <10

B/Brisbane/60/2008 <10 <10 40 160

Chủng virus cúm phân lập

ST

T

Mã số

PTN

Hiệu giá HI Kết quả định typ

B/Wisconsin/

01/2010

B/Brisbane/60/

2008

B/Wisconsin/01/2010

(B/Yama)

B/Brisbane/60/2008

(B/Vic)

1 BS 282 320 <10 B/Yamagata

2 B2 283 80 10 B/Yamagata

3 TX 23 40 320 B/Victoria

4 BS 288 160 <10 B/Yamagata

5 N 32 80 >640 B/Victoria

6 CBD 96/4 20 160 B/Victoria

7 DV 1103 10 320 B/Victoria

8 LS 71 10 320 B/Victoria

9 LS 91 10 80 B/Victoria

10 N 33 10 320 B/Victoria

93

11 N 50 <10 160 B/Victoria

12 N 54 640 10 B/Yamagata

13 N 62 160 <10 B/Yamagata

14 TB 102 <10 160 B/Victoria

15 TB 54 <10 >320 B/Victoria

16 TB 55 10 160 B/Victoria

17 TB 71 40 320 B/Victoria

18 TB 72 20 320 B/Victoria

19 TB 75 20 160 B/Victoria

20 TB 76 40 320 B/Victoria

21 TB 79 10 320 B/Victoria

22 TB 83 10 640 B/Victoria

23 TB 87 40 320 B/Victoria

24 TB 88 40 640 B/Victoria

25 TB 90 20 160 B/Victoria

26 TB 92 20 160 B/Victoria

27 TB 96 20 320 B/Victoria

28 TB 98 40 320 B/Victoria

29 TX 66 <10 160 B/Victoria

30 TX 68 20 320 B/Victoria

31 BS 02 40 320 B/Victoria

32 BS 14 10 320 B/Victoria

33 N 85 10 160 B/Victoria

34 TB 107 <10 160 B/Victoria

35 TB 114 10 160 B/Victoria

94

36 TB 143 <10 40 B/Victoria

37 TX 114 <10 160 B/Victoria

38 TX 81 10 160 B/Victoria

39 TX 85 10 160 B/Victoria

40 LS 147 20 80 B/Victoria

41 LS 182 <10 80 B/Victoria

42 TX 116 <10 80 B/Victoria

43 TX 120 <10 80 B/Victoria

44 N 155 <10 160 B/Victoria

45 N 254 20 80 B/Victoria

46 N 334 320 <10 B/Yamagata

47 N 361 80 160 B/Victoria

48 N 370 160 <10 B/Yamagata

49 N 373 ≥1280 40 B/Yamagata

95

3, Hiệu giá HI của các chủng virus cúm B, 2012

(Bộ sinh phẩm 2012-2013 của TCYTTG)

Kháng nguyên chuẩn Kháng huyết thanh chuẩn

A/ H1N1 A/H3N2 B/Wisconsin/01/2010 B/Brisbane/60/2008

A/ H1N1 ≥1280 <10 <10 <10

A/H3N2 <10 ≥1280 <10 <10

B/ Wisconsin/01/2010 <10 <10 320 <10

B/Brisbane/60/2008 <10 <10 40 160

Chủng virus cúm phân lập

STT Mã số PTN Kết quả HI Kết quả định typ

B/Wisconsin

/01/2010

B/Brisbane/60/

2008

B/Wisconsin/

01/2010

(B/Yama)

B/Brisbane/60/

2008

(B/Vic)

1 LS 28 20 <10 B/Yamagata

2 LS 30 640 <10 B/Yamagata

3 LS 32 160 <10 B/Yamagata

4 20154 80 <10 B/Yamagata

5 20201 80 <10 B/Yamagata

6 IS/02/12/39 1280 20 B/Yamagata

7 IS/09//12/057 <10 1280 B/Victoria

8 LS 39 160 <10 B/Yamagata

9 LS 46 640 <10 B/Yamagata

10 LS 50 80 10 B/Yamagata

11 LS 56 160 <10 B/Yamagata

96

12 LS 58 320 <10 B/Yamagata

13 LS 62 <10 160 B/Victoria

14 LS 65 80 <10 B/Yamagata

15 N 11 10 80 B/Victoria

16 N 15 80 ≥1280 B/Victoria

17 N 22 80 160 B/Victoria

18 N 27 80 160 B/Victoria

19 N 38 160 <10 B/Yamagata

20 TB 30 80 <10 B/Yamagata

21 TB 31 160 <10 B/Yamagata

22 TB 52 10 40 B/Victoria

23 IS/07/12/92 320 <10 B/Yamagata

24 IS/09/12/091 160 <10 B/Yamagata

25 LS 93 160 <20 B/Yamagata

26 N 61 10 80 B/Victoria

27 IS/07/12/302 40 <10 B/Yamagata

28 IS/02/12/401 40 <10 B/Yamagata

29 IS/02/12/424 640 20 B/Yamagata

30 IS/02/12/007 <10 640 B/Victoria

31 IS/02/12/010 640 <10 B/Yamagata

32 IS/02/12/014 640 <10 B/Yamagata

33 IS/02/12/021 <10 640 B/Victoria

34 IS/02/12/024 <10 640 B/Victoria

35 IS/02/12/044 1280 <10 B/Yamagata

36 IS/02/12/045 <10 640 B/Victoria

97

37 IS/02/12/048 <10 640 B/Victoria

38 IS/02/12/090 <10 640 B/Victoria

39 IS/07/12/040 <10 160/640 B/Victoria

40 IS/07/12/053 <10 160/640 B/Victoria

41 IS/07/12/079 1280 <10 B/Yamagata

42 IS/07/12/081 1280 <10 B/Yamagata

43 IS/07/12/106 640 <10 B/Yamagata

44 IS/07/12/107 1280 <10 B/Yamagata

45 IS/07/12/115 <10 640 B/Victoria

46 IS/07/12/143 <10 640 B/Victoria

47 IS/09/12/048 640 <10 B/Yamagata

48 IS/09/12/049 640 <10 B/Yamagata

49 IS/09/12/061 <10 640 B/Victoria

50 IS/09/12/068 640 <10 B/Yamagata

51 IS/09/12/080 <10 640 B/Victoria

52 IS/09/12/081 <10 640 B/Victoria

53 IS/09/12/094 <10 640 B/Victoria

54 IS/09/12/103 640 <10 B/Yamagata

55 IS/09/12/114 640 <10 B/Yamagata

98

4, Viết tắt ký hiệu mẫu

- TX: Thanh Xuân

- LS: Lạng Sơn

- TB: Thái Bình

- N: Nhi Trung ương

- IS/02: Nhi Trung ương

- IS/07: Thái Bình

- IS/09: Lạng Sơn

99

5, Trình tự nucleotide gen HA

B/Vietnam/TB55/2011:

B/Vietnam/TX81/2011:

B/Vietnam/NC433/2010:

B/Vietnam/TB31/2012:

B/Vietnam/IS0912057/2012:

100

6, Trình tự nucleotide gen NA

B/Vietnam/TX73/2010:

B/Vietnam/LS62/2012:

B/Vietnam/N121/2010:

B/Vietnam/BS288/2011:

B/Vietnam/N27/2010: