Giovanni DI BONAVENTURA, Ph.D.

CI Medicina di Laboratorio

CL Medicina e Chirurgia

Università “G. d’Annunzio” di Chieti-Pescara

AA 2014-2015

L’ingestione di microrganismi patogeni può causare un gran numero di infezioni, confinate all’intestino o disseminate

Quotidianamente vengono ingerite quantità rilevanti di microrganismi. Tuttavia, grazie ai numerosi meccanismi di difesa dell’ospite, raramente essi sopravvivono fin all’intestino in un numero sufficiente per causare infezione

Un’ampia gamma di microrganismi, sia batterici che virali, può infettare il tratto gastroenterico

Le tossinfezioni alimentari insorgono in

seguito ad ingestione di cibo contaminato

con tossine batteriche (Clostridium

botulinum, Staphylococcus aureus)

Nel caso di infezioni veicolate da alimenti,

il cibo costituisce terreno di coltura per i

patogeni che si accrescono fino a raggiungere

concentrazioni infettanti (Salmonella)

oppure il cibo funge da solo veicolo

(Campylobacter)

La diarrea è il sintomo più comune delle infezioni del tratto gastroenterico

Esse possono presentarsi come forme lievi, moderati e gravi fino all’exitus del paziente

Rappresentano un meccanismo di clearancedell’infezione ma anche di sua diffusione

Nel Terzo Mondo la diarrea è tra le principali cause di morte nell’infanzia

non diagnosticate per modesta sintomatologia

assenza di strutture mediche adeguate

Nei Paesi industrializzati, invece, la diarrea è modesta ed auto-limitante, tranne che nei neonati, anziani ed immunocompromessi

Escherichia coli appartiene alla Famiglia delle Enterobacteriaceae.

E’ uno dei patogeni più versatili esistenti in natura. Accanto ai ceppi apatogeni (flora autoctona intestinale) esistono ceppi virulenti in grado di causare infezioni nel tratto gastroenterico ed in altri apparati, quello urinario in particolare.

Inizialmente tutti classificati come enteropatogeni, E. coli in grado di causare infezioni gastroenteriche con meccanismi peculiari sono classificati in 6 diversi gruppi: E. coli ENTEROPATOGENI (EPEC)

E. coli ENTEROTOSSIGENI (ETEC)

E. coli ENTEROEMORRAGICI (EHEC)

E. coli ENTEROINVASIVI (EIEC)

E. coli ENTEROAGGREGATIVI (EAEC)

E. coli DIFFUSIVI-AGGREGATIVI (DAEC)

EPEC sono in grado di aderire all’epitelio del tenue grazie alla produzione di: pili riuniti in fasci (bundle-forming pili, Bfp)

intimina (adesina)

proteina associata all’intimina (traslocated intiminreceptor, Tir)

Provocano distruzione dei microvilli con conseguente diarrea (soprattutto nei lattanti e bambini)

Insieme con ETEC, gli EPEC sono gli agenti causali di diarrea più frequenti in tutto il mondo

DIAGNOSI DI LABORATORIO: Coprocoltura (isolamento)

Determinazione del sierotipo con sieri polivalenti

Tests molecolari per fattori di adesività

Adesione a cellule in coltura (colorazione con actina fluorescente)

EPEC and EHEC bind to plasma membrane of epithelial cells via

hollow EspA filaments (a). Protein translocation is followed by

interaction between the outer membrane adhesin intimin (d)

and Tir (e,f). Intimin-Tir interaction leads to reorganisation of

both micro (e) and intermediate (ck) filaments (f) underneath

the attached bacteria, pedestal formation (c) and intimate

attachment (b).

EPEC aderiscono agli enterociti, distruggendo la normale architettura dei

microvilli, inducendo la caratterisica lesione “adesione-distacco”. Riarangiamenti

del citoscheletro sono accompagnati da risposta infiammatoria e diarrea. 1.

Adesione iniziale, 2. Traslocazione proteina mediante secrezione di tipo III, 3.

Formazione di pedestalli.

ETEC sono in grado di aderire all’epitelio del tenue grazie alla produzione di adesine fimbriali

Producono potenti enterotossine: Tossina termolabile (LT-1), causa sindrome colera-like poichè simile

per struttura e meccanismo d’azione alla tox colerica

Altri ceppi producono le tossine termostabili (ST-s), da sole o in associazione con LT-1. Meccanismo simile a LT-1: attivano la guanilato–ciclasi causando un aumento di GTP e conseguente incremento di secrezione di fluidi nel lume intestinale

Principale causa della diarrea del viaggiatore. Insieme con gli EPEC, ETEC sono la più frequente causa batterica di diarrea nel mondo

L’acqua contaminata da deiezioni umane/animali è la principale fonte di contagio

DIAGNOSI DI LABORATORIO: Abbondanti feci diarroiche acquose

Coprocoltura (isolamento)

Ricerca sierologica delle tossine nel surnatante di colture batteriche

Tests molecolari (sonde geniche) per i geni codficanti LT-1 e STs, per la ricerca in feci, alimenti ed acqua

Laboratory methods for isolation and identification of ETEC.

(Medical Microbiology. S. Baron, 4th edition)

EHEC sono in grado di aderire all’epitelio del crasso con un

meccanismo simile agli EPEC

Producono la verotossina (tossica vs cellule Vero), simile a quella

prodotta da Shigella, che danneggia direttamente l’epitelio

causando diarrea con abbondante sangue. Sono agenti di:

Colite emorragica

Sindrome uremo-emolitica (recettori per verotox anche sull’epitelio

renale)

Il sierotipo più comune è O157:H7

Alimenti (carne cruda) e latte pastorizzato sono importanti per la

diffusione

DIAGNOSI DI LABORATORIO:

Coprocoltura (isolamento): la proporzione di EHEC nel campione può

essere molto bassa (< 1% E. coli totali)

Ricerca sierologica (ELISA, EIA) della verotox nel campione fecale

Saggio biologico

Sonde geniche per la ricerca dei geni codificanti verotox

EIA, ELISA tests per la ricerca di verotox

EHEC causa adesione-distruzione nel colon.

Caratteristica di EHEC è la produzione di

verotox, il cui assorbimento sistemico determina

gravi complicanze.

(Kaper, JB, Nataro JP, Mobley HLT. 2004.

Pathogenic Escherichia coli. Nature Reviews

Microbiology 2, 123-140)

EHEC invadono le cellule sfruttando il meccanismo della

endocitosi

Una volta nelle cellule, lisano il vacuolo e invadono cellule

adiacenti, provocando danno tessutale, infiammazione, necrosi

(alla base del reperto di sangue e muco nelle feci)

Infezioni di origine esclusivamente alimentare

DIAGNOSI DI LABORATORIO:

Coprocoltura (isolamento)

Ricerca sierologica (ELISA, EIA) delle proteine invasive

Saggio di invasività in colture cellulari

Tests molecolari per la ricerca di geni codificanti proteine

invasive

EIEC invadono l’epitelio colico, lisano i fagosomi e si muovono

attraverso le cellule nucleando i microfilamenti di actina.

I batteri possono muoversi lateralmente attraverso l’epitelio

attraverso cellule contigue o possono uscire per poi re-

invadere la cellula nella membrana baso-laterale.

(Kaper, JB, Nataro JP, Mobley HLT. 2004. Pathogenic

Escherichia coli. Nature Reviews Microbiology 2, 123-14)

EAEC

tendono a formare aggregati, per la presenza di fimbrie codificate da

plasmidi. Producono anche tossine termo-labili sebbene a significato

patogenetico incerto.

Causano diarree infantili persistenti nei Paesi in via di sviluppo

DAEC

producono una -emolisina ed il fattore citotossico necrotizzante 1

incerto significato patogenetico nella malattia diarroica

DIAGNOSI DI LABORATORIO:

Coprocoltura (isolamento)

Utilizzo di colture cellulari per l’evidenziazione del caratteristico

pattern aggregativo-adesivo

Tests molecolari per la ricerca di geni codificanti proteine invasive

EAEC aderisce al piccolo e largo intestino organizzandosi come

biofilm e secerne enterotossine e citotossine.

DAEC induce una caratteristica trasduzione del segnale negli

enterociti del piccolo intestino che si manifesta con la formazione di

proiezioni cellulari finger-like che avvolgono il batterio.

AAF, aggregative adherence fimbriae; DAF, decay-accelerating factor;

EAST1, enteroaggregative E. coli ST1; ShET1, Shigella enterotoxin 1.

(Kaper, JB, Nataro JP, Mobley HLT. 2004. Pathogenic Escherichia coli.

Nature Reviews Microbiology 2, 123-140)

E’ la causa più frequente di diarrea associata al consumo di alimenti in molte nazioni sviluppate

Appartiene alla Famiglia delle Enterobacteriaceae. Oltre 2000 sierotipi: antigeni di parete cellulare (O)

antigeni flagellari (H)

Tutte le salmonelle, ad eccezione di S. typhi e S. paratyphi, si repertano sia negli animali che nell’uomo

S. enterica è la più virulenta per l’uomo

Esistenza di un rilevante serbatoio animale che trasferisce all’uomo l’infezione mediante ingestione di cibi (pollame, prodotti caseari) contaminato. Meno frequente è la diffusione dell’infezione mediante acqua

E’ possibile la trasmissione interpersonale epidemie secondarie all’interno di nuclei familiari

DIAGNOSI DI LABORATORIO:

La diarrea da Salmonella può essere

diagnosticata mediante isolamento colturale

(coprocoltura):

Semina su terreni selettivi

Incubazione per 24 h (non esigente)

Rapida identificazione preliminare

Tipizzazione completa richiede almeno 48 h

Sono fra le più comuni cause di diarrea.

La diarrea è clinicamente simile a quella

causata da Salmonella e Shigella, sebbene la

malattia possa avere un periodo di

incubazione più lungo.

Analogamente a Salmonella, esiste un

importante serbatoio animale da cui l’uomo

(per ingestione di cibi, acqua e latte

contaminati) contrae l’infezione.

Microaerofili e termofili (optimum di crescita

a 42°C)

A differenza di Salmonella e Campylobacter, V. cholerae causa infezioni solo nell’uomo

Gli individui asintomatici sono probabilmente il serbatoio naturale della malattia

La trasmissione diretta interpersonale è infrequente ed avviene principalmente mediante contaminazione fecale del cibo

La sua azione patogena è da ricondursi alla produzione di una enterotossina, sebbene mostri anche altri fattori di virulenza

Sierotipo O1 (2 biotipi: classico, El Tor) è il più importante

Produzione di feci ad “acqua di riso” (perdita di fluidi > 1 L/h, fino a 20 L/die)

In assenza di terapia, la mortalità è pari al 40-60%

Morfologia caratteristica (RNA ds, frammentato)

I rotavirus in attiva proliferazione causano diarrea in quanto interferiscono con i normali meccanismi di trasporto delle molecole e dei fluidi nell’intestino

L’infezione è comune nei bambini < 2 aa, con sintomatologia più grave nei Paesi in via di sviluppo

DIAGNOSI DI LABORATORIO: Microscopia elettronica

Individuazione antigeni virali nelle feci (ELISA)

A differenza della semplicità di raccolta del campione, l’isolamento dei

patogeni è, invece, complicata dalla presenza di un’abbondante flora

autoctona a livello intestinale

Il campione fecale viene raccolto e posto in un recipiente apposito a bocca

larga a chiusura ermetica (tappo a vite). Evitare contaminazione con urine

Il campione deve essere trasportato in lab entro 1-2 h dal prelievo.

Alternativamente, almeno 2 gr di campione prelevati mediante tampone,

debbono essere trasferiti in terreno di trasporto (Stuart, Amies, Cary-Blair).

Eccezionalmente, il campione può essere conservato a +4°C per max 24 h.

Il campione viene “arricchito” in terreno liquido:

Brodo-selenite F: inibisce la crescita di commensali (E. coli ed altri batteri

coliformi, batteri Gram-positivi, lieviti), favorendo la crescita di Salmonella e

Shigella

Acqua peptonata alcalina (peptone 1%, NaCl 1%, pH 8.6) per V. cholerae

Semina brodo di arricchimento su terreni selettivi:

Salmonella-Shigella (SS) agar, Hektoen enteric (HE) agar: per Salmonella e Shigella

Agar saccarosio tiosolfato citrato ai sali biliari (TCBS): per V. cholerae

Incubazione: Salmonella e Shigella richiedono 24h a 37°C (10% CO2, 42°C, 48-

72h per isolamento Campylobacter)

Identificazione di specie mediante saggi biochimici e sierologici

Ricerche particolari (Yersinia, Clostridium difficile,Vibrioni, E. coli O157, Rotavirus, protozoi) devono essere specificamente richieste. Se il campione di feci non è accompagnato da richieste specifiche, il laboratorio di norma esegue di base la ricerca di Salmonella, Shigella e Campylobacter.

La richiesta di indagini aggiuntive potrebbe richiedere più campioni.

ROTAVIRUS. Dopo i 5/6 anni di età la ricerca dei Rotavirus è sconsigliata in quanto i pazienti sono nella quasi totalità immunizzati.

CLOSTRIDIUM DIFFICILE. La ricerca di C. difficile va richiesta nei pazienti sottoposti a terapia antibiotica, comunque in situazioni di dismicrobismo.

MICOBATTERI. Raccogliere tre campioni fecali n tre giorni diversi (consegnare ogni campione entro 2 h dal prelievo)

PROTOZOI. Nel caso di ricerca di Giardia o Amoeba porre il campione in un contenitore termostatico (thermos).

La malattia può essere diagnosticata mediante ricerca

diretta del parassita su differenti campioni (feci; succo

duodenale, mediante enterotest; biopsia duodenale).

E’ consigliabile ripetere la ricerca (positività: 70% con

un singolo esame, 85% con un secondo esame, 95% con

un terzo esame) in quanto nelle forme croniche il

parassita ha dei periodi di replicazione alternati con

periodi di stasi.

Esame microscopico (feci, succo duodenale da entero-

test; biopsia duodenale)

«a fresco», di feci normoformate per la ricerca di cisti

(con 2 o 4 nuclei) oppure di feci diarroiche per la ricerca

di trofozoiti (mobili, con 2 o 4 flagelli, forma "a goccia«, a

volte è visibile il disco adesivo con il quale il parassita si

lega al tessuto intestinale).

di campioni colorati con Ematossilina ferrica, colorazione

di Lugol o Giemsa.

Ricerca di Ag mediante DFA (Direct Fluorescent Assay):

100% sensibilità/specificità

DFA (Direct Fluorescent Assay)

Trofozoiti. Colorazione di Lugol

Cisti. Osservazione «a fresco»

Entero-test (string test)

Esame colturale (isolamento da feci)

non si effettua di routine, in quanto tecnicamente difficoltosa.

tuttavia, può essere utile per escludere la presenza di altri

patogeni quali causa di infezione.

Trofozoiti. Isolamento da campione fecale

Esame istologico (biopsia duodenale) previa colorazione

H/E o PAS per la ricerca di trofozoiti «annidati» nelle

cripte duodenali.

Ricerca antigene specifico GSA-65 di G. intestinalis,

mediante:

EIA (Enzyme ImmunoAssay): 87%-100% sensibilità / 100%

specificità

Immunocromatografia: rapido (10 min)

Ricerca «molecolare» di sequenze geniche specifiche

mediante PCR.

La giardiasi non è associata ad eosinofilia. EIA (Enzyme ImmunoAssay)

Esame istologico di biopsia duodenale

PCR (Polymerase Chain Reaction)