Genski polimorfizmi i poligenske bolesti

Poligenske bolesti

Genetička osnova

(više parova gena)

Faktori sredine

fenotip

Genetički-DNK polimorfizam

Varijacije u naslednoj osnovi čoveka

Humani genom:

3x109 parova svaki 1000.

nukleotid nukleotida je polimorfan

Razlike u nukleotidnom sastavu tj. gradji DNK koje se sreću u populaciji zdravih ljudi

f alela > 1%, hetrozigoti > 2% predispozicija za bolest ???

Tipovi DNK polimorfizma Polimorfizam pojedinačnih nukleotida (SNP)

Različiti broj uzastopnih ponovaka (VNTR)

Deleciono/insercione varijante

(CA)10 = ALEL 2(CA)15 = ALEL 3

(CA)5 = ALEL 1

(CA)20 = ALEL 4(CA)25 = ALEL 5

AAGGT C ili T GTTC

Studije asocijacije

Udruženost genskih polimorfizama sa nekom od poligenskih bolesti.

Sklonost tj. podložnost!

Pristupi u izučavanju genetičke osnove poligenskih bolesti

Studije asocijacije

Geni kandidati

Čitav genom

bolesni zdravi

Učestalost polimorfizma:

:

Izbor gena-kandidata Na osnovu poznavanja etio-

patogenetskih činilaca

Geni identifikovani u analizama vezanosti

Geni identifikovani kod animalnih modela

Cerebralna venska tromboza DNK polimorfizmi:

Faktor V Laiden (Arg506Gly) f=2,5% kod belaca Heterozigoti: 7X veći rizik Homozigoti: 80x veći rizik

Protrombin (G20210A u 3’ UTR) f=2,4% kod belaca 3-7X veći rizik

Oralni kontraceptivi 22x veći rizik

+ heteroz. Laiden

149Xveći rizik!

Dijabetes melitus Tip I DM:

Udruženost sa HLA DR3 i DR4 HLA DR haplotip:

Asp na poziciji 57 u DQ lancuZaštićeni od DM I

Oboleli: 90% homozigoti za DQ bez Asp!

Još >13 lokusa!!! VNTR u promotoru gena za insulin...

E4

E3

E2Cys Cys

Cys Arg

Arg Arg

112 158 299

Receptor vezujući domen

Domen za asocijaciju sa lipidima

191

E4

E3

E2Cys Cys

Cys Arg

Arg Arg

112 158 299



191

E4

E3

E2Cys Cys

Cys Arg

Arg Arg

112 158 299



191

Alzheimer-ova demencijaApo E polimorfizam

Alzheimer-ova demencija ApoE polimorfizam

4 alel PREDISPOZICIJA! ranije obolevanje (4/4, 4/3) ! 50-75% heterozig. NE OBOLEVA! drugi geni, faktori sredine...

genotip AD Kontr. AD Kontr.

4/4, 4/3, 4/2 64% 31% 47% 17%

3/3, 2/3, 2/2 36% 69% 53% 83%

SAD Japan

gen polimorfizam lipidni parametri

metabolizam lipidaAPOEAPOBAPOC3 CETP PONLPL

kodoni (112 i 158)Thr7Ile-482C/T, -455T/C,3206T/G, 3175C/G,1100C/TIle405ValGln192ArgSer447Ter

UH, LDL, apoBLDL, apoBTGTGTG, apoC-IIIHDL, apoA-I, CETPPON aktivnostTG, HDL

sistem renin-angiotenzinAT1RAGTACE

1166A/CMet235ThrIns/Del

-TG, UHLDL

agregacija trombocitaGpIIIafibrinogen

GpIIIa p1A1/A2

-455G/A

TG, VLDL-TGUH, HDL, LDL, TG

metabol. homocisteinaMTHFR

677C/T

UH, TG

adhezija molekulaSELE

98G/T

LDL

ateroskleroza

Polimorfizam gena za ACE

egzon 16 egzon 17

Delvarijanta

Ins+287 bp

DD genotip povezan sa: KM, infarktom miokarda, hipertenzijom… ???

Tetrahidro-folat metionin

5,10 metilen-tetrahidrofolat

CH3

MTHFR

5-metil- tetrahidrofolat homocistein

Metabolički put folne kiseline i metionina

Polimorfizam MTHFR gena C677T (Ala222Val)

Kodon GCT Kodon GTT Alanin valin

Zamena u katalitičkom domenu enzima Termolabilna forma enzima, disocijacija dimera

Mogući genotipovi: C/C normalan homozigot C/T heterozigot T/T homozigot za mutaciju: 5-20% u opštoj

populaciji

Polimorfizam MTHFR gena C677T

Različita frekvenca alela T crna rasa < bela rasa < žuta rasa (efekat

osnivača ?!)

Evropa: 0,24-0,4

Afrika: 0,065

J. Amerika: 0,19Australija: 0,047

Polimorfizam MTHFR gena i defekti nervne cevi

Deficit folata - poznati faktor rizika

Homocistein deluje i direktno teratogeno Majka TT – 2-3x veći rizik za NTD (van der Put,

1997.)

MTHFR genotip deteta i majke prvi genetički faktor rizika za NTD dokazan na

molekularnom nivou (Christensen, 1999.) 677TT = 20% (NTD) i 18% (m) (11% k) Oboje TT i/ili deficit folata - rizika

Polimorfizam MTHFR gena i defekti nervne cevi

Korelacija sa tipom i lokalizacijom defekta:

(Wenstrom, 2000.) Cervikalni region Lumbalni region Okcipitalna encefalocela

Anencefalija Egzencefalija Sakralni region

+

-

Uticaj polimorfizma MTHFR gena na fenotip

Činioci koji utiču na nivo homocisteina: sredinski genetički

Osnova genetičke kontrole: par kodominantnih gena L/H MTHFR C677T

Regulacija je multifaktorska

pretpostavka

Studije asocijacije u čitavom genomu(Genome Wide Association Studies, GWAS)

Studije asocijacije čitavog genoma(Genome Wide Association Studies, GWAS)

Simultana analiza >10.000 SNP Microarray tehnologija (genski čip)

GWAS i Alzheimerova bolest

GWAS i Alzheimerova bolest Meta analiza 12 GWAS studija + 5,043 ispitanika sa Mayo klinike (2,455 AB : 2,588 K) “Investigation of 15 of the top candidate

genes for late-onset Alzheimer’s disease” Belbin et al, 2011

GWAS i Alzheimerova bolest BIN1, bridging integrator-1 CLU, clusterin ili complement lysis inhibitor (CLI) CR1,complement receptor

EXOC3L2, exocyst complex component 3-like 2 PICALM phosphatidylinositol binding clathrin assembly protein

imunomodulacija

unutraćelijski transport

GWAS i Alzheimerova bolest TNK1, tyrosine kinase, non-receptor, 1 GAB2, GRB2-associated-binding protein 2

(adapter, aktivator fosfatidil inozitol kinaze 3)

LOC651924 GWA_14q32.13,

PGBD1, piggyBac transposable element derived 1

EBF3, early B-cell factor 3 Regulator ćelijskog ciklusa, TSG

PSEUDOGEN, sličan sa Ubiquitin-like 1-activating enzyme E1B

GWAS i Parkinsonova bolest

Simon-Sanchez et al, 2009, Nature Genetics

GWAS i Parkinsonova bolest

GWAS u PB – meta analiza

Evropska i američka populacija

5333 bolesnika i 12 019 zdravih

7 689 524 SNPs

Replika: 7053 bolesnika i 9007 zdravih

International Parkinson Disease Genomics Consortium, 2011

GWAS u PB – meta analiza 6 poznatih gena podložnosti:

MAPT, SNCA, HLA-DRB5, BST1, bone marrow stromal cell antigen

1 GAK, Cyclin G-associated kinase LRRK2

GWAS u PB – meta analiza 5 novih gena podložnosti:

ACMSD, aminocarboxymuconate semialdehyde decarboxylase

STK39, serine threonine kinase 39 SYT11, synaptic vesicle gene CCDC62/HIP1R, huntingtin-interacting protein 1–

related gene MCCC1/LAMP3

Part B, Neuropsychiatric Genetics

Association of GWAS loci with PD in China.

Chang XL et al, april 2011.

636 pacijenata i 510 zdravih ispitanika Više SNPs u genima LRRK2 i SNCA udruženo sa

PB PARK16 (1q32)= niži rizik za PB u Kini

Populaciona specifičnost?

“A genome-wide survey of human short-term memory”

909.622 lokusa

Faza 1: Švajcarska (333 ispitanika) Faza 2: Švajcarska (254 ispitanika) Faza 3: Nemačka (922 ispitanika) Faza 4: Srbija (523 ispitanika)

A Papassotiropoulos etal, 2010

“A genome-wide survey of human short-term memory”

rs6731900rs565348

rs10930201

rs2278729

rs11235714

rs225344

Hromozom 2 11 21

Gen SCN1A

SCN1A (rs10930201) genotip:

AC AA

…Funkcionalna NMR

"A genome-wide survey and functional brain imaging study identify CTNNBL1 as a memory-related gene"

CTNNBL1 = Beta catenin like protein 1 Hromozom 20

A Papassotiropoulos etal, , 2012.

Problemi kod studija asocijacije Nekonzistentnost rezultata usled:

Različite brojnosti ispitivanih populacija

Geografskih/etničkih specifičnosti

Razlika između polova

Sadejstva gen-gen i gen-sredina

“Missing heritability”

B. Maher, Nature, 2008

Moguća objašnjenja Rešenje nam je “pred nosom” Odgovorne su retke varijante

SNPs, koje GWAS ne analiziraju Ključne su CNV (copy number

variations) a ne SNP U pitanju je vrlo složena interakcija

gena i sredine, kroz generacije...

Perspektive

Korelacija sa kliničkim i biohemijskim pokazateljima?

Interakcija gen gen? gen faktori sredine?

Primena DNK analiza u identifikaciji osoba

DNK otisak – identifikacija osoba

DNK fingerprint, otisak, profil:Kombinacija DNK polimorfizama karakterističnaza osobu.

DNK otisak – identifikacija osoba

Farmakogenetika

Farmakogenetika

Ista dijagnoza,ista terapija

Lek NIJE toksičanali NE deluje

Lek je toksičanali deluje

Lek NIJE toksičani deluje

Lek je toksičani NE deluje

pacijenti

Farmakogenetika Razvoj lekova i izbor terapije na bazigenetičkih – DNK varijacija

30% osoba ne reaguje na Th statinima 35% // blokatorima 50% // tricikličnim

antidepresivima

Farmakogenetika SAD:

2 miliona hospitalizacija godišnje zbog reakcija na lekove

>100. hiljada ljudi umre

Farmakogenetika Uticaj polimorfizma:

Na metabolizam leka Enzimi...

Na strukturu ciljnog proteina Receptor, enzim...

Genski polimorfizmi mogu da utiču na:

Dozu Efikasnost Toksičnost Farmakokinetiku Farmakodinamiku

Gen: CYP2D6 Superfamilija citohrom P450

Protein: debrisokin hidroksilaza

Polimorfizam: Utiče na metabolizam >25% lekova

-blokatori, neuroleptici, tricikl. antidepresivi

CYP2D6

CYP2D6

CYP2D6, 50 ALELA *5 alel, delecija čitavog gena, gubitak enz. aktivnosti *2 alel, više kopija gena, ultra brzi metabolizam

Selektivni inhibitori serotonina (SSRi)Tamoksifen

CYP2C19 Gen CYP2C19

Aleli: CYP2C19*1 (wt), *2, *3 (nema enz. akt.) Genotip: CYP2C19 *1/*1 (normalna akt.) *1/*2, *1/3 (smanjena akt.) *2/*2, *2/*3, *3/*3 (nema akt.)

Specifičan SNP češći u Azijskim populacijama nego kod belaca!

Plavix (Clopidogrel) Nosioci varijanti CYP2C19:

<nivo aktivnog metabolita 3,58x veći rizik za teške KV komplikacije kombinacija alela 2, 3: najveći rizik

Oznakaod 2010.,

gentski test!

Do 14% osobau populaciji

CYP2C19

CYP2C19*3 Prevremeni STOP kodon Inhibitori protonske pumpe (Omeprazol, lansoprazol)

Th. H. Pylori (omeprazol i amoksicilin)

CYP2C19 *2/*3 : *1/* 1 =100% : 28,6% stope izlečenja bolesti

CYP450 AmpliChip CYP450 (Roche Diagnostics)

Prvi test za CYP2D6 i CYP2C19 odobren od FDA

Loš ili ultrabrz metabolizator Beta blokatori, antipsihotici, opijati,

antikonvulzivi, PPIs

Varfarin (oralni antikoagulant) R-izomer i S-izomer

Metaboliše ga CYP2C9 2, 3 aleli: <enz. aktivnost, >conc. leka

Inhibira VKORC1 (vitamin K epoxsid reduktase complex subunit 1)

VKORC1 1173 C T, -1639 G A, 3673 G A

Varfarin

VKORC1 3673 G A

AA genotip: < doze

(Takeuchi isar., 2009.)

Varfarin Genetsko testiranje se preporučuje:

Na početku th Kod pacijenata uključenih u naučne studije

Najbolja predikcija doze! Nije zamena za redovno praćenje INR!

Cost – benefit = ?

Irinotecan UDP glukuronil transferaza 1A1

(UGT1A1) *1 alel: (TA)6, normalna aktivnost *28 alel: (TA)7, <ekspresija i

aktivnost Toksičnost Irinotecan-a, neutropenija,diarea!(inhibitor topoizomeraze I,Ca kolona)

FDA 2005. god..označila: < dozekod homozigota

Za *28 alel!

Abacavir Inhibitor rev. transkriptaze (anti HIV) HLA-B*5701 alel, > rizik za hipersenzitivnu reakciju

(≥50% svh HSR)

Učestalist alela: 7,2% kod belaca, 2,8% u crnoj rasi, 5,6% kod ostalih

2-8%

Oznakaod 2008.!

Aktivacija CD8+ T ćelijaGroznica, osip, GT simptomi, mučnina, slabost,

respiratorni simptomiStevens-Johnson sy., SLE, toks. epidermalna nekroliza

Laktična acidoza, hepatomegalija, smrt

TPMT Azatioprin i 6-merkaptopurin (ALL)

Teška mijelosupresija zbog deficita tiopurin metiltransferaze

Dati 1/10 doze!!! Postoji DNK test!

TPMT*3A alelDve nesinonimne zamene:G A, Ala ThrA G, Tyr Cys

DHPDH

5-fluouracil (Ca dojke)

Teška neurotoksičnost zbog deficita

dihidropirimidin dehidrogenaze

Postoji DNK test

Th Alzhajmerove demencije Takrin (Alzhajmer)

Reguju osobe koje nemaju 4 alel za ApoE!

Etička i socijalno-medicinska pitanja

Raspolaganje rezultatima poverljivost podataka odnos cene i koristi (cost – benefit) pitanje etničke i/ili rasne pripadnosti

Genetičke varijacije u ljudskim populacijama genetičke varijacije

unutar populacije

izmedjupopulacija>

93-95% 3-5%

pojam LJUDSKA RASA nemabiološku definiciju!

BiDil Antihipertenziv Fiksna kombinacija

Izososrbid dinitrat Hidralazin hidrohlorid

Personalizovana terapija

Cilj farmakogenetike i farmakogenomike

Terapija prema etničkoj i/ili rasnoj pripadnosti!?

Farmakogenetska istraživanja kod dece Više od 75% lekova koji se primenjuju kod

dece nije testirano u pedijatrijskoj populaciji

Veći rizik za neželjene reakcije! VULNERABILNA GRUPA, POTREBANE POSEBNE MERE

OPREZA I ZAŠTITE:

•Neophodno istraživanje•Neposredna korist za dete•Poverljivi podaci•Informisani pristanak roditelja, uz saglasnost deteta•Minimalan fizički rizik za dete

DiskriminacijaStigmatizacija

Uticaj na životne izbore

Farmakogenetska istraživanja kod dece

ATF5 polymorphisms influence ATF function and response to treatment in children with childhood acute lymphoblastic leukemia Blood 2011 118:5883-5890

Asparaginaza, regul. polim. U basic region leucine zipper activating transcription factor 5 (ATF5)

Phosphodiesterase type 4D gene polymorphism: association with the response to short-acting bronchodilators in pediatric asthma patientsMediators of Infllamation, 2011key regulator of b2-adrenoceptor-induced cAMP turnover

Kompanije za analizu genoma pojedinaca

Podaci su poverljivi, nije dozvoljena diskriminacija na osnovu genotipa

Farmakogenomika i edukacija

PharmGenEd program edukacije za profesionalce (2008-2011)

Genska terapija

Genska terapija

Def.: tretman (lečenje) bolesti unošenjem genetičkog materijala (DNK ili RNK)

Vektori: Virusi (retro, adeno, herpes) Ne-viralni (npr. lipozomi, genski pištolj )

Tipovi genske terapije: Somatska Genska terapija germinativnih ćelija

POJAČAVANJE DELOVANJA GENA

(GENE AUGMENTATION -GAT):

Uvodjenje dodatne kopije gena da bi se obezbedio produkt

CILJANO UBIJANJE SPECIFIČNIH ĆELIJA:

Kod maligniteta

Strategije genske terapije

DNK (gen)

vektor jedro

ciljna ćelija

Strategije genske terapije

CILJNA INHIBICIJA GENSKE EKSPRESIJE:

Kod maligniteta, infektivnih bolesti (postoji nov ili neadekvatan genski produkt)

Na nivou: DNK RNK proteina

POPRAVKA CILJNE MUTACIJE:

Na nivou DNK ili RNK Kod dominantno-

negativnih mutacija

Antisens strategija1. gen sa mutacijomi njegova RNK2. antisens RNK3. aktivira se meha-nizam koji ubija ćeliju

Terapija ribozimima1. gen sa mutacijomi njegova RNK2. ribozim (“molekularne makaze”)3. iseca se oštećenideo RNK

Tehnologija klasične genske terapije

klonirani gen

(normalan alel, odsutan u ćelijamabolesnika)

nukleinska kiselina virusa

retrovirus

ugradnja normalnog alelau retrovirus

retrovirus inficiraćelije kosne srži bolesnikakoje su izdvojene i kultivisane

virusna DNK kojanosi normalan alelugradjuje se u hromozom

povratak ćelijabolesniku

ćelija kosnesržibolesnika

k.srž

Tehnologija klasične genske terapije PRENOS (TRANSFER) kloniranog gena:

Ex vivo: kultura tkiva (SELEKCIJA !!!) In vivo: preko vektora

(EFIKASNOST ?)

Problem VELIČINE GENA Mini-geni (cDNK)

Odnos unetog gena i nasledne osnove domaćina:

Integracija u genom Ne-integrisana forma (epizom)

Odnos unetog gena i nasledne osnove domaćina

Gen se integriše: Stabilna ekspresija Slučajna ugradnja

Gen se ne integriše: Kratkotrajna ekspresija

Vektori kod genske terapije

+-neLIPOZOMI-neENDOCITOZA

POMOĆU RECEPTORA

?da adeno-assoc.+-ne HSV+-ne adeno

?+da retro

In vivoEx vivo

Integr.Efikasnost transfera

VIRUSI:

+

++

++

Vektori kod genske terapije

gen za th+promotor

adeno-virus

lipozom

DNK kojase prenosi

lipozom

metalne čestice geni za prenos

genskipištolj

Protokoli za gensku terapiju kod ljudi

Monogenske bol.(CF, SCID, DMD) 17%

Kancer 69%

Infektivne bol. (SIDA) 12%

Kriterijumi izbora bolesti za gensku terapiju

Identifikovan gen

Ne postoji drugi efikasan način lečenja

Zahvaćen (prvenstveno) jedan organ

Postoji “terapijski prozor” u razvoju

bolesti

Postoji animalni model i uspeh terapije

na humanim ćelijama in vitro

Sigurna procedura

Rizici genske terapije

• Razvoj virusne infekcije kod viralnih vektora:

• Npr.: smrtni slučaj kod lečenja deficita OTK rekombinovanim adeno virusom (1999.)

• Integrisani gen dovodi do:• razvoja maligniteta:

• Aktivacija protoonkogena:Npr.: LMO2 kod bolesnika sa X-SCID

• Inaktivacija tumor supresorskih gena• gubitka funkcije važnog ćelijskog gena

Primeri razvoja genske terapije Deficit adenozin-

deaminaze (SCID): Transplantacija

kosne srži Nadoknada enzima

(animalni,+PEG) Genska terapija

T limfociti iz krvi (1990.)

Stem ćelije iz pupčane vrpce (1993.)

ćelije iz kosne srži (2000.)

Rhys Evans, SCID

Primeri razvoja genske terapije Hemofilija A:

Nadoknada faktora koagulacije:

Humani Rekombinantni

(1990.) Genska terapija

Virusni vektor unet in vivo, i.v. (1999.)

Virusni vektor unet u kulturu fibroblasta kože trbušni zid (2001.)

Primeri razvoja genske terapije 37 god., blaga forma BMD, pokretan

delecija egz. 17-48(46% kodir. regiona)

cDNK za mini-gen *

Duchenne-ova MD

Normalno DMD BMD

Genska th DMD – regulacija ekspresije mutiranog gena

strategija delovanje/efekat prednosti nedostaci perspektiva

Himerni oligo-nukleotidi

Popravka mutacija u DNK

Kumulativan, stalan efekat

Niska efikasnost in vivo +

Antisens oligo-nukleotidi

Modifikacija splajsovanja pre-iRNK

Sintetski mali molekuli, relt. sigurna procedura, restituišu se sve izoforme dys.

Ponovljene aplikacije, oligonukl. specifični za mutaciju

+++

Supresija prevremenog STOP kodona

Prepoznavanje STOP kodona u iRNK, na ribozomima

konvencionalni lek(gentamicin)

Slaba reproducibilnost, sporedni efekti

+

“Preskakanje” egzona (exon skipping)

“OUT-OF-FRAME” DELECIJA

“IN-FRAME” DELECIJA


DNK

RNK

translacija

G* AAAAAA

protein

obrada


DNK sa del. egzona 50

iRNK “out of frame”

nema sinteze distrofinadistrofin


Antisense oligonukleotidmaskira “out-of-frame” egzon

iRNK bez egzona 50 i 51 =

ponovo uspostavljen okvir čitanjaSkraćen ali funkcionalan protein

distrofin

(K Foster i sar., 2006.)

“Preskakanje” egzona (exon skipping) 2001-2003 – in vivo 2005-2006 – sistemska administracija

96% ekspresije u skletnim mm.58% ekspresije u srčanom m.


PRO051, Holandija: 4 dečaka, m. tibialis anterior(van Deutekom i sar.,

2007)

AVI-4658, Velika Britanija: m. extensor digitorum brevis

sistemski unos, subkutano, 5 i 13 nedelja

sistemski unos, 12 nedelja

(F. Muntoni & K. Bushby, 2008.)


Preparati PRO051 AVI-4658 koktel anti-sens oligonukleotida

za egzon 51, 13% DMD populacije

problemi

Efikasnostunosa

Efikasnostdejstva

za egzone 45-55, 63%DMD populacije


30-60% normalnog

nivoadys

3-35% normalnog

nivoadys

Sadašnji rezultati Željeni rezultati


DNK

RNK

obrada

translacija

G* AAAAAA

protein


Gentamicin PTC124

Kod point mutacija (5-13% bolesnika)

Na ribozomima,koriguje se samo PREVREMENI STOP kodon

Distrofin pune dužine, samo 1ak promenjena!!!!


Na animalnim modelima Klinički trajali

Dobra iskustva: 35-60%

normalnog nivoadys

Genska th DMD – drugi pristupi

strategija delovanje/efekat prednosti nedostaci perspektiva

Transplantacija mioblasta

Unos ćelija koje produkuju dys.

Neinfektivno, relet. sigurna procedura

Niska efikasnost, potrebna imunosupresija

+

Th matičnim ćelijama

Konvencionalna, relt. sigurna procedura

++

Povećana ekspresija utrofina

Nadoknada dys. utrofinom

Sintetski mali molekuli, relat. sigurna procedura

Još uvek nije identifikovan specifični kompleks

++

Zigot: totipotentan

Matične ćelije: pluripotentne

Diferencirane ćelije: unipotentne

Terapija matičnim ćelijama

• razlikuju se po obliku, građi i funkciji

Embrionalne matične ćelije

kloniranje pluripotentnih matičnih (stem) ćelijau cilju lečenja

1964. god., Leskovac

Dr Duško Ilić, lekar i molekularni biolog

1960. god., Vukovar

Hvala na pažnji!

Genski polimorfizmi i poligenske bolesti

Documents

Transcript of Genski polimorfizmi i poligenske bolesti