Genetyka molekularna Prokaryota

1

Genomy bakterii i archeonów

2

  Od 0,5 (mykoplazmy) do ~ 5 Mb   Wyjątkowo 9 Mb (Bradyrhizobium japonicum) – 13 Mb

(Sorangium cellulosum)   archeony z reguły 1,5-2,5 Mb

  Gęste upakowanie genów (~1 gen/kb)   Krótkie obszary międzygenowe i regulatorowe   Tylko sporadycznie występują introny   Kodowane białka krótsze, niż u Eukaryota

  Tworzy z białkami upakowaną strukturę nukleoidu

Figure 8.6 Genomes 3 (© Garland Science 2007)

Gęste upakowanie genomu E. coli

Figure 8.1 Genomes 3 (© Garland Science 2007)

Nukleoid bakterii

Figure 8.3 Genomes 3 (© Garland Science 2007)

Upakowanie DNA

Organizacja genomu

6

  Typowa – pojedynczy “chromosom” kolisty   Możliwe liczne warianty

  Więcej cząsteczek kolistych   Cząsteczki liniowe

  “Chromosomy” i plazmidy   Plazmidy mogą być koliste lub liniowe   Z reguły mniejsze od chromosomów, ale mogą być bardzo

duże (megaplazmidy)   Plazmidy zwykle są opcjonalne, mogą też występować u

wielu gatunków   Rozróżnienie – chromosomy zawierają geny metabolizmu

podstawowego, niezbędne do życia, plazmidy – nie.

Figure 8.5 Genomes 3 (© Garland Science 2007)

Ewolucyjna zmienność Prokaryota

7

  Przy podobnej liczbie genów ogromna różnorodność zestawu genów

  Duże różnice między szczepami   np. E. coli O157:H7 vs. E. coli K12 - ~1300 genów w O nie

w K i ~500 w K nie w O(!)   Częsty poziomy transfer genów (do kilkunastu procent

genomu), nawet między odległymi gatunkami   Problem definicji gatunku

  Bakterie mają genomy podobnej wielkości, mieszczące 2000-6000 genów

  Około połowy genomu tworzą rodziny podobnych genów powstałych przez powielenie (duplikację) – tzw. rodziny paralogów

  To, które geny są powielone świadczy o kierunku specjalizacji ewolucyjnej bakterii

Genomika porównawcza bakterii sposobem poznania ich fizjologii

Genomika porównawcza bakterii sposobem poznania ich fizjologii

9

  H. influenzae – heterotrof pasożytniczy – powielone geny kodujące białka rozkładające różne związki organiczne

  Methanococcus janaschii – chemoautotrof – powielone geny kodujące enzymy szlaków biosyntetycznych

  Pseudomonas aeruginosa – groźny patogen oporny na wiele leków i szybko dostosowujący się do zmian środowiska – powielone geny kodujące białka usuwające antybiotyki, rozkładające substancje organiczne, umożliwiające zagnieżdżanie się w powierzchniach.

Droga od DNA do białka

  Ekspresja genów jest najważniejszym dla funkcjonowania komórek i organizmów procesem

  Ekspresja genów składa się z wielu złożonych etapów, z których kazdy może podlegać regulacji

10

DNA

RNA

BIAŁKO

Centralna hipoteza („dogmat”)

11

Ekspresja genów prokariotycznych   Prokaryota

  dominuje regulacja na poziomie transkrypcji   policistronowe jednostki transkrypcyjne o wspólnej regulacji

transkrypcyjnej – operony   mRNA szybko degradowane, translacja zachodzi zasadniczo

równocześnie z transkrypcją

12

Elementy systemów regulacji   Elementy cis

  Znajdują się w obrębie tej samej cząsteczki, co element podlegający regulacji   Elementy cis w obrębie DNA

  np. promotory, operatory, enhancery   Elementy cis w obrębie RNA

  sekwencje wiążące białka regulujące translację, splicing, degradację itp.

13

Elementy systemów regulacji   Elementy trans

  Odrębne cząsteczki oddziałujące z elementami cis i modulujące ekspresję   Białka regulujące transkrypcję (czynniki transkrypcyjne),

aktywatory, represory itp.   Białka regulujące inne etapy ekspresji (aktywatory/represory

translacji, splicingu itp.)   RNA regulatorowe (siRNA, miRNA itp.)

14

Podstawy regulacji genu   Regulacja pozytywna

  czynnik trans jest aktywatorem – zwiększa ekspresję   Regulacja negatywna

  czynnik trans jest represorem – osłabia ekspresję

15

Podstawy regulacji genu   Regulacja indukowalna

  Sygnał zwiększa (indukuje) ekspresję   Regulacja reprymowalna

  Sygnał zmniejsza (reprymuje) ekspresję

  Możliwe są różne układy, np. regulacja negatywna indukowalna

  Nie należy mylić pojęć: pozytywna/negatywna dotyczy aktywności czynnika trans a indukowalna/reprymowalna – odpowiedzi na sygnał

16

Operony

17

  Typowy dla bakteri i archeonów system ekspresji   Policistronowy transkrypt – wspólna ekspresja wielu

genów z jednego promotora   Przeważnie geny związane funkcją, ale są wyjątki

Figure 8.8 Genomes 3 (© Garland Science 2007)

Regulacja

18

  Polimeraza stosunkowo prosta, proste sekwencje promotorowe   Rdzeń katalityczny wspólny, kilka podejednostek sigma o

różnej specyficzności odpowiadających za rozpoznanie promotorów   σ70 (RpoD) – główny czynnik sigma ("housekeeping”) – większość

genów   σ54 (RpoN) – głód azotowy   σ38 (RpoS) – głód/faza stacjonarna   σ32 (RpoH) – szok cieplny   σ28 (RpoF) – wić

  Aktywatory i represory wpływają na wiązanie polimerazy z DNA

Przykład – operon lac

W. S Klug, M.R Cummings “Concepts of Genetics” 8th edition, Prentice Hall, 2005 19

Operon lac – regulacja przez CAP

20 W. S Klug, M.R Cummings “Concepts of Genetics” 8th edition, Prentice Hall, 2005

Operon lac

21

  Regulacja na poziomie inicjacji transkrypcji   Negatywna indukowalna – przez laktozę/represor lacI   Pozytywna reprymowalna – przez glukozę/białko CAP

  Białko to reguluje szereg operonów związanych z wykorzystywaniem źródeł węgla - regulon

Terminacja transkrypcji

22

  Podczas transkrypcji cały czas konkurencja między kontynuowaniem a dysocjacją polimerazy

  Zależy od związanych białek, struktury transkryptu   Terminatory

samodzielne Rho zależne

Figure 12.8 Genomes 3 (© Garland Science 2007)

Regulacja na poziomie terminacji - antyterminacja

23

  Antyterminacja   Regulacja pozytywna, czynnik trans wiążąc się z DNA znosi

działanie terminatora   Typowy przykład – geny kaskady litycznej faga λ

Najwcześniejsze

Wczesne-opóźnione

Genomes 3 (© Garland Science 2007)

Regulacja na poziomie terminacji - atenuacja

24

  Fakultatywna sekwencja terminatora na początku transkryptu, zależnie od warunków   Kinetyka translacji – dostępność naładowanego tRNA   Wiązanie specyficznych białek   Wiązanie ligandów drobnocząsteczkowych –

ryboprzełączniki (niektóre)

Atenuacja – operon trp E. coli

25

  Zależnie od dostępności załadowanego tRNATrp sekwencja lidera mRNA przyjmuje różne konformacje

tRNATrp dostępny tRNATrp niedostępny

W. S Klug, M.R Cummings “Concepts of Genetics” 8th edition, Prentice Hall, 2005

Operon trp u Bacillus subtilis

26

  Białko TRAP wiąże naładowany tRNATrp

  Kompleks TRAP z tRNATrp wiąże mRNA

  Dodatkowo białko AT (anty-TRAP) wiąże TRAP gdy bardzo mało naładowanego tRNATrp

tRNATrp dostępny W. S Klug, M.R Cummings “Concepts of Genetics” 8th edition, Prentice Hall, 2005

Ryboprzełączniki

27

  Wiązanie związków drobnocząsteczkowych bezpośrednio z mRNA zmienia konformację, wpływając na ekspresję   Atenuacja   Dostępność miejsca wiązania rybosomu

Ryboprzełącznik TPP – operon thi E. coli

28

  Odpowiada za biosyntezę tiaminy

SD- Shine-Dalgarno TPP- pirofosforan tiaminy

Winkler et al. (2002) Nature 419, 952-956

Transdukcja sygnału – systemy dwuskładnikowe

29

  Systemy umożliwiające regulację genów w odpowiedzi na czynniki zewnętrzne (transdukcja sygnału)   Sensor– domena wiążąca ligand + domena kinazy histydynowej

(HK) – autofosforylacja w odpowiedzi na sygnał   Efektor (RR – response regulator) – fosforylowany przez aktywny

sensor (w asparaginie) reguluje transkrypcję

West & Stock (2001) . Trends Biochem. Sci., 26, 369-376

Globalne systemy regulujące - regulony

30

  Skoordynowana regulacja działania wielu operonów   Represja kataboliczna (aktywator CAP)

  zależny od poziomu glukozy poziom cAMP   Odpowiedź ścisła

  brak składników odżywczych, alarmon ppGpp, interakcja z polimerazą RNA, wybór podjednostki σ38 (RpoS)

  Odpowiedź SOS   uszkodzenia genomu, białko RecA – indukowana aktywność

proteazy, tnie m. in. represor LexA

Życie społeczne bakterii – quorum sensing

31

  Mechanizm wyczuwania liczebności   Ekspresja zależna od gęstości bakterii   Komórki wydzielają cząsteczki sygnałowe – autoinduktory

(peptydy, związki laktonowe, pochodne S-AM)   Przekroczenie progowego stężenia autoinduktorów –

aktywacja systemu dwuskładnikowego, zmiana ekspresji

Quorum sensing Vibrio fischeri

32

  Bioluminescencja tylko przy dużej gęstości   w planktonie - nie   w symbiozie z głowonogiem - tak

Produkowany przez enzym LuxI autoinduktor wiąże aktywator LuxR, co aktywuje operon lucyferazy

http://www.che.caltech.edu/groups/fha/quorum.html

Quorum sensing - biofilmy

33

  Tworzenie biofilmu – kluczowe dla patogenezy, oporności na antybiotyki   Np. Pseudomonas aeruginosa – przewlekłe

infekcje w płucach   Infekcje oportunistyczne, np. u chorych na

mukowiscydozę

Fuqua & Greenberg (2002) Nature Reviews Molecular Cell Biology 3, 685-695

Kod genetyczny   Trójkowy

  20 aminokwasów   kodony po 3 nukleotydy: 34=64 możliwości (dwa: za mało)   Dowody: badanie mutantów insercyjnych i delecyjnych (3

kolejne insercje lub delecje przywracały funkcje)

34

Kod genetyczny   Nienakładający się

  Dowody:   załóżmy sekwencję GTACA: jeden kodon: TAC, pozostałe: GTA i

ACA (nakładanie 2 nukleotydów). Przy danym kodonie “centralnym”, możliwe tylko 42 = 16 różnych kombinacji trzyaminokwasowych. W naturze natomiast występują wszystkie możliwe kombinacje trzyaminokwasowe (202=400).

  Pojedyncza zmiana nukleotydowa w sekwencji kodującej zmienia tylko jeden aminokwas, a nie dwa sąsiednie

35

Kod genetyczny   Bezprzecinkowy   Zdegenerowany

  3 kodony STOP, pozostałe 61 kodonów koduje 20 aminokwasów

36

Kod genetyczny

37

Regularności w kodzie   Trzecia pozycja kodonu najmniej znacząca

  (np. UCx – Ser)   Aminokwasy o podobnych właściwościach często z

podobnymi kodonami   Np.

  AAA, AAG: lizyna; AGA, AGG: arginina   UCx: seryna; ACx: treonina

38

Parowanie wobble

  W 3 pozycji kodonu (1 antykodonu) dozwolone parowanie G-U oraz I-U/A/A (I – inozyna)

39

Translacja

40

Nobel 2009 - chemia

41

42

http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/ribo/homepage/mov_and_overview.html