Geneticky Modifikovany Organizmus (GMO)
description
Transcript of Geneticky Modifikovany Organizmus (GMO)
Geneticky modifikovaný organizmus
s Geneticky modifikovaný organizmus je organizmus, ktorého genetický materiál bol zmenený spôsobom, ktorý sa prirodzene pri pohlavnom rozmnožovaní a prirodzenej rekombinácii nevyskytuje.
s Zásahy do genetického materiálu organizmov môžeme rozdeliť: s náhodné; odrody získané pôsobením mutagénov -‐ napríklad
odrody pšenice získané ožarovaním ich semien, s cielené; získané tak, že do rastliny vnesieme alebo v nej cielene
deaktivujeme nejaké konkrétne gény.
s 70-‐té roky 20. str.
2
http://ec.europa.eu/food/food/biotechnology/qanda/a1_en.htm#a
Transgénny organizmus
s Je geneticky modifikovaný organizmus, do ktorého bol metódami genetického inžinierstva prenesený gén z iného druhu
3
Geneticky modifikované rastliny
s Rastliny, do ktorých bol za pomoci Agrobacterium tumefaciens vnesený gén pre odolnosť proti herbicídom alebo pre produkciu insekticídov (napr. bt-‐kukurica)
4
http://www.efsa.europa.eu/en/panels/gmo.htm
5
Biotechnologické plodiny
6
Hlavné znaky GMO rastlín
s Tolerancia na herbicídy (71%)
s Rezistencia na hmyz (28 %)
s Kvalitatívne znaky (1%)
7
Hlavné znaky GMO
8
Hlavné plodiny
s Sója
s Kukurica
s Bavlna
s Repka
s Zemiaky
9
Hlavné krajiny
10
Zákaz kultivácie GMO
s Šesť členských štátov EU v súčasnosti uplatňuje ochranné ustanovenia pre GMO: s Rakúsko s Francúzsko s Grécko s Maďarsko s Nemecko s Luxembursko
11
EU register geneticky modifikovaných potravín a krmív
s Kukurica (23)
s Bavlna (7)
s Soja (3)
s Repka olejná (3)
s Cukrová repa (1)
s Zemiaky (1)
12
http://ec.europa.eu/food/dyna/gm_register/index_en.cfm
GMO v Europe a na Slovensku
s http://www.gmo.sk/sk/?page=38
s Max. 0,9%
s Max. Korea 3%
s Max. Japónsko/Korea 5%
13
Produkty uvedené na trh podľa smernice
2001/18/ES
Použitie
Používateľ
Štát podania žiadosti
Rozhodnutie
Komisie
poznámka
Kukurica Roundup Ready NK603 tolerantná k herbicídom s účinnou látkou glyfosát
dovoz a spracovanie,
nie pestovanie
Monsanto
Španielsko
2004/643/ES
Kukurica MON 863 odolná voči hmyzu Diabrotica (kukuričiar koreňový)
dovoz a spracovanie,
nie pestovanie
Monsanto
Nemecko
2005/608/ES
Povolená aj ako potravina - rozh. Komisie 2006/68/ES (ešte podľa nariadenia 258/97).
Repka línia GT 73 tolerantná k herbicídom s účinnou látkou glyfosát
dovoz a spracovanie,
nie pestovanie
Monsanto
Holandsko
2005/635/ES
Kukurica línia 1507 Odolná voči hmyzu Lepidoptera (zavíjač kukuričný) a tolerantná k herbicídom s účinnou látkou glufosinát
dovoz a spracovanie do
krmív, nie pestovanie
Pioneer / Mycogen
Holandsko
2005/772/ES
Povolená aj ako potravina - rozh. Komisie 2006/197/ES (ešte podľa nariadenia 258/97). V Španielsku podaná žiadosť (podľa smernice) na pestovanie.
Kukurica MON 863 x MON 810 odolná voči škodcom Diabrotica a Lepidoptera
dovoz a spracovanie,
nie pestovanie
Monsanto
Nemecko
2006/47/ES
Povolenie aj podľa nariadenia 1829/2003: rozhodnutie Komisie 2010/140/EÚ
Repka línia Ms8, línia Rf3 a Ms8xRf3 tolerantná k herbicídom s účinnou látkou glufosinát
dovoz a spracovanie semien,
nie pestovanie
Bayer
Belgicko
2007/232/ES
Klinček línia 123.2.38 Moonlite zmenená farba kvetu
dovoz rezaných
kvetov
Florigene
Holandsko
2007/364/ES
Klinček línia 123.2.12 Moonaqua zmenená farba kvetu
dovoz rezaných
kvetov
Florigene
Holandsko
2009/244/ES
Zemiak EH92-527-1 vysoký obsah amylopektínu, obchodný názov Amflora
pestovanie a spracovanie na výrobu technického
škrobu
BASF Plant Science (predtym Amylogene)
Švédsko
2010/135/EU
Zvyšky možu byť použité ako krmivo na základe rozhodnutia 2010/136/EU vydaného podľa nariadenia 1829/2003.
14
GMO v
Eur
ope
15
GMO n
a Slove
nsku
Metódy genetických modifikácií
s Pre prípravu transgénnych rastlín sa používajú dve základné metódy: s transformácia pomocou agrobaktérie s “nastrelenie” DNA do bunkového jadra
16
Ako pripraviť transgénny organizmu
http://cls.casa.colostate.edu/TransgenicCrops/animation.html
17
1. Prehľad procesu
3. Klonovanie génov Baktéria
2. Izolácia DNA
4. Výber génov
5. Transformácia a kultivácia
6. Kríženie rastlín
Klónovanie génov
18
Klonovanie je proces využívaný na lokalizáciu a vytvorenie kópií špecifického génu v genomickej DNA daného organizmu.
Táto baktéria má jeden gén
(červený segment), ktorý chceme klonovať do iného organizmu.
Izolácia DNA
http://www.accessexcellence.org/RC/VL/GG/index.php#Anchor-‐Biological-‐3800
Klónovanie génov
19
Štiepenie DNA
Štiepenie plazmidovej
DNA
Rovnaká restrikčná endonukleáza
EcoRI: CAATTC
20
21
Klónovanie génov
22
Štiepenie DNA
Štiepenie plazmidovej
DNA
Rovnaká restrikčná endonukleáza
Zmiešanie a ligovanie pomocou ligázy
Vytvorenie rekombinantnej
DNA
Klónovanie génov
23
Vytvorenie rekombinantnej
DNA
Transformácia baktérií
Kultivácia na pôde s ATB
Klónovanie génov
24
Kultivácia na pôde s ATB Bakterie s rekombinantnou DNA porastú
= máme génovú knižnicu
Selekcia hľadaného klonu
Klónovanie génov
25
Pomnoženie vybraného klonu bakterií s rekombinantnou
DNA
Selekcia hľadaného klonu
Preočkovanie hľadaného klonu
Metódy genetických modifikácií
s Pre prípravu transgénnych rastlín sa používajú dve základné metódy: s transformácia pomocou agrobaktérie s “nastrelenie” DNA do bunkového jadra
26
Agrobacterium tumefaciens (starý názov: Rhizobium radiobacter)
s G-‐, nesporulujúca tyčinkovitá baktéria
s Nachádza sa v rizosfére
s Vyvoláva tvorbu nádorov u viac než 140 druhov dvojklíčnych rastlín
27 Ricín obyčajný
Agrobacterium tumefaciens
s Pri transformácii pomocou baktérie Agrobacterium tumefaciens sa využíva prirodzená schopnosť tejto patogénnej baktérie prenášať určité gény z tzv. Ti (Tumor inducing) plazmidu do genómu rastliny.
s Tieto gény prinútia rastlinu vytvoriť nádor a syntetizovať špeciálne aminokyseliny, ktorými sa potom baktérie živia.
s Takto napadnuté rastliny sú prirodzene transgénnymi rastlinami
28
Ti (Tumor inducing) plazmid
s Stráca sa z buniek ak rastú pri >280C
s Má dva typy génov: s Onkogénne gény
zodpovedné za syntézu auxínov (rastlinné hormóny) a cytokínov – za vznik nádoru
s Gény kodujúce syntézu opinov – sú pre baktériu zdrojom dusíku a energie
29
Ti (Tumor inducing) plazmid
s T-‐DNA oblasť je zodpovedná za inzerciu DNA do chromozómu a za nádorovú transformáciu buniek
s Gény potrebné k transferu plazmidu sú mimo T-‐DNA oblasti
30
Využitie Ti plazmidu na prípravu transgénnych rastlín
31
Infekcia rastlinných buniek
32
s Klonovaný gén je vložený do vektora (Ti plazmid), v ktorom je aj markerový gén (identifikácia transformantov) -‐ spektinomycín
s Rekombinantný plazmid je vnesený do A.tumefaciens, ktorými sú následne infikované rastlinné bunky
s Bunky sú kultivované v in vitro podmienkach
s Výsledok: rastlina, ktorá má v každej bunke inkorporovaný nový gén
Transformácia rastlinných buniek pomocou nastreľovania
33
s Klonovaný gén je naviazaný na častice zlata
s Tieto sú nastrelené do rastlinnej bunky, prechádzajú do jadra, kde sa uvoľnujú a rekombinantný gén sa včlení do chromozómu
s Bunky sú kultivované v in vitro podmienkach
s Výsledok: rastlina, ktorá má v každej bunke inkorporovaný nový gén
Kríženie rastlín
s Transgenná rastlina sa kríži s normálnou rastlinou prostredníctvom opelenia
s Výsledok: transgénny hybrid
34
Modifikácia génu
35
Modifikácia génu
36
V molekule DNA sú tisícky génov
Jeden gén (tri oblasti)
Modifikácia génu
37
Ø Promotor je časť génu, na ktorú sa viaže RNA polymeráza Ø Funguje na princípe “on-‐of” Ø Určuje množstvo kópii mRNA t.j. v akom množstve sa
bude daný proteín syntetizovať Ø Určuje, kedy sa bude daný proteín syntetizovať (celú
sezónu alebo len určitú dobu) Ø Určuje, kde sa bude daný proteín syntetizovať (v každom
pletive alebo iba v niektorých častiach rastliny)
Modifikácia génu
38
Kódujúca časť určuje, ktorý proteín sa bude syntetizovať
Modifikácia génu
39
Terminačná sekvencia (terminátor) signalizuje koniec génu.
RNA polymeráza sa oddelí od vlákna DNA
Modifikácia génu
40
Génový inžinieri môžu zmeniť alebo nahradiť ktorúkoľvek časť daného génu za tým účelom,
aby zabezpečili expresiu daného génu v rastlinných bunkách
Príklady modifikácie rastlín
41
Hlavné ciele pri príprave GMO rastlín
s Tolerancia na herbicídy (71%)
s Rezistencia na hmyz (28 %)
s Kvalitatívne znaky (1%)
42
Bt proteín (CrylA proteín)
s Prirodzene sa nachádza v Bacillus thuringiensis a je toxický pre víjačku kukuričnú (Ostrinia nubilalis)
43
Víjačka kukuričná (Ostrinia nubilalis)
s Vijačka kukuričná je motýľ, ktorý patrí k významným škodcom kukurice.
s Larvy škodcu vyžierajú do stebiel kukurice chodby a zvonka na steblách pozorovať trus. Steblá sa v dôsledku poškodenia často lámu. Okrem stebiel larvy môžu poškodzovať aj šúľky.
s Zníženie úrody kukurice spôsobené vijačkou kukuričnou dosahuje pri 50% napadnutých rastlín 10% a pri 80% napadnutých rastlín takmer 20%.
s Ak je napadnutých 80-‐100% rastlín, zníženie úrody môže byť väčšie ako 30%.
44
http://www.floraservis.sk/vijacka-‐kukuricna.php http://carozahrady.sk/skodce/vijackakukuricna.html
Modifikácia Bt génu Promótor Kódujúca oblasť Terminačná sekvencia
35S AGATTACA
Bt. CrylA GTCAGCTTATGCCAT
ACCGATACGTTACA
Bt. CRY 9 CAAGTAAGTGCCAAT
45
s Kukurica, ktorá nesie gén pre Bt proteín môže ho expresovať v každej bunke: s Bt gén je klonovaný spolu s promótorom génu
mozaikového vírusu karfiolu
Bt-‐ toxín Bacillus thuringiensis
Modifikácia Bt génu Promótor Kódujúca oblasť Terminačná sekvencia
Bt. CrylA GTCAGCTTATGCCAT
ACCGATACGTTACA
PEP KARBOXYLÁZA GACCTTACA
Bt. CRY 9 CAAGTAAGTGCCAAT
46
s Kukurica, ktorá nesie gén pre Bt proteín môže ho expresovať iba v zelenom tkanive : s Bt gén je klonovaný spolu s promótorom rastlinného
génu kódujúceho fosfoenolpyruvatovú (PEP) karboxylázu s Bt proteín s PEP promótorom je aktívny iba v zelenom
pletive rastlín s Na konci sezóny rastliny s takýmito Bt génmi nebudú
mať tento endotoxín na zrne
Bt-‐ toxín Bacillus thuringiensis
Rezistenciu na Roundup
47
s Roundup je herbicíd – likviduje listy, výhonky aj korene.
s Gén pochádza z pôdnych agrobaktérií, ktoré sú prirodzene rezistentné na Roundup
Modifikácia génu zabezpečujúceho
rezistenciu na Roundup
Promótor Kódujúca oblasť Terminačná sekvencia 35S
AGATTACA Rezistencia na ROUNDUP
TTTGGCTTTACCTTT
ACCGATACGTTACA
48
s rastlina, ktorá nesie gén klonovaný spolu s promotorom 35S bude rezistentná po celú dobu.
s Gén je expresovaný v každej bunke.
Prečo robiť detekciu GMO?
s Slobodný výber pre konzumenta
s Súlad s nariadeniami EU
49
50
Detekcia GMO
51 http://passel.unl.edu/pages/informationmodule.php?idinformationmodule=1081367867&topicorder=2&maxto=8&minto=1
Vložený nový gén
Tvorba nových proteínov
Genomická DNA
Zmena vlastností rastliny alebo semien
Analýza DNA -‐ genotyp
Analýza proteínov -‐ fenotyp
GMO Detection method Database (GMDD) http://gmdd.shgmo.org/index/search
Metódy detekcie GMO
52
s Analýza biologických vlastností -‐ biotesty s Testovanie rezistencie na herbicídy
s Analýza fenotypu s Metódy založené na proteínoch
s ELISA s Imunochromatografia -‐ strip testy
s Analýza genotypu s Metódy založené na DNA amplifikácii
Analýza biologických vlastností -‐ biotesty
53
s Klíčenie semien
s Sprejový test s herbicídmi
s Obvykle sa testuje 200-‐400 semien s Jednoduché s Lacné
s Vyžadujú čas s Ťažká interpretácia
Detekcia proteínov v rastlinách
s Výber je daný: s Ktorý proteín nás zaujíma? s V ktorej časti rastlín je prítomny? s V ktorom vývojovom štádiu rastliny je tvorený?
54
Detekcia proteínov v rastlinách
s ELISA s Sendvičová ELISA
s http://www.youtube.com/watch?v=Tp61S-‐2F2B4&feature=related
s http://www.youtube.com/watch?v=70TPrfL_8-‐M&feature=relmfu
s Stripové testy s Lateral Flow Strip Test
s http://passel.unl.edu/pages/informationmodule.php?idinformationmodule=1081367867&topicorder=7&maxto=8&minto=1
55
Stripové testy na GMO
56
http://www.seedburo.com/productDetail.asp_Q_catID_E_517_A_subCatID_E_2583_A_productID_E_3182_A_Trait_GMO_E_Trait_GMO
DNA metódy
s Kvalitatívne PCR
s Kvantitatívne RT-‐PCR
s Alternatívne metódy s DNA čípy s Biosenzory
57
http://gmdd.shgmo.org/index/search http://www.seedtest.org/upload/cms/user/5EnricoNoli.pdf
GMO Detection method Database (GMDD) http://gmdd.shgmo.org/index/search
s Hlavné PCR stratégie na identifikáciu GMO -‐ hľadávanie s Screening GMO
s Modifikovaných génov
s Špecifických konštruktov
s Častí špecifických pre GMO
58
Multiplex PCR
59
Princíp microarray
60
Vzorka
Extrakcia DNA
PCR so značenými primermi
(multiplex) Proby uchytené na
sklíčku
Hybridizácia
Detekcia
61
(1) DNA is extracted from leaves or powder. (2) A PCR amplification is performed with consensus primers. During this amplification, the DNA is labelled with biotin. (3) Capture probes, complementary of the amplified sequences, are grafted on a chemically treated glass slide. (4) The amplified product is laid down on the biochips. The amplified sequences will hybridize with their complementary
capture probes. (5) After the washing steps, the biotinylated sequences, which stay hybridized on the capture probe, are detected by a
colorimetric technique (streptavidin conjugated-‐ nanogold particles, silver salt precipitation, SilverquantÒ reagent). (6) Comparison of the hybridization pattern.
62
GMO Chip
63
The first class was capture probes specific for the GMOs The second class of capture probes (‘‘Plant GMOchip’’) allowed the specific identification of five plant species, i.e. kukurica, sója, repka, paradajky a cukrová repa The third class was named ‘‘Screening GMO-‐ chip’’ Four capture probes specifically hybridize with DNA elements often occurring in GMOs, i.e. CaMV 35S promoter, nos terminator, nptII and pat genes.
Vyhodnotenie
64
Porovnanie testov Metóda Vhodnosť Časová
náročnosť Výhody Nevýhody
PCR Detekcia Identifikácia Kvantifikácia
5 – 7 dní Veľmi citlivé a presné, Kvalitatívne a kvantitatívne meranie cieľovej DNA sekvencie
Nákladné, vyžadujúce špeciálne vybavenie a skúsený personál
ELISA Špecifická identifikácia
2 – 4 dní Rýchle, menej nákladné , kvantitatívne stanovenie hladiny proteínov
Neumožňujú detekciu denaturovaných proteínov, nemôžu identifikovať GM vzorky v ktorých sa nachádza ?
Strípové testy
Špecifická identifikácia
10 – 20 minút Rýchle, kvalitatívna stanovenie prítomnosti alebo neprítomnosti hľadaného proteínu
Nie sú na kvantifikáciu, nemôžu identifikovať GM vzorky v ktorých sa nachádza ?
Biotesty na herbicídy
Špecifická identifikácia
7 – 10 dní Nie sú nákladné, veľmi presné, identifikácia plodína semien
Iba životaschopné semená môžu byť testované Iba detekcia tolerancie na herbicíd
65
Leena Tripathi: Techniques for detecting genetically modified crops and products. African Journal of Biotechnology Vol. 4 (13), pp. 1472-‐1479, December, 2005,
Dôležité www stranky o GMO
s http://www.gate2biotech.com/agbios/
s http://www.cera-‐gmc.org/?action=gm
s http://gmdd.shgmo.org/
s http://www.gmo-‐compass.org/eng/home/
s http://www.crl.edu/
Ďakujem Vám za pozornosť
67