GEN TEDAVİSİ

Prof.Dr.Öztürk ÖZDEMİR

Nisan 2006

GEN TEDAVİSİ

Kalıtsal geçişli bir hastalığın gen düzeyinde yapılan onarımlarla ortadan kaldırılmasına “gen tedavisi - gene therapy” adı verilir.

İki şekilde yapılır;

a- Biyosentez

b- Terapi

Bir kişinin hastalığını tedavi etmek yada durumunu iyileştirmek amacı ile hücrelerinin genetik modifikasyona uğratılması işlemi.

Gen Tedavisi

Modifikasyonun etkisine ve modifiye hücrelerin tiplerine göre;1. Germline gen tedavisi

2. Somatik gen tedavisi

Gen Tedavisi

Germ hücreli gen Tedavisi

Gamet/zigot/erken embriyo’ya yapılan genetik modifikasyonlardır.

Somatik Gen Tedavisi

Hastalığa yol açan doku veya spesifik hücrelerdeki genetik sorunun düzeltilmesidir.

İnsandaki tüm çalışmalar somatik hücrelerdeki genetik bozukluğun düzeltilmesine yöneliktir

Somatik hücreler çeşitli yollar ile modifiye edilebilir;

Gen artışı/eklenmesi Gen değiştirme Hedeflenmiş gen ekspresyonunun baskılanması Hedeflenmiş spesifik hücrelerin öldürülmesi

A- BİYOSENTEZ

Eksik yada yanlış sentezlenen bir gen ürünün (protein) in vitro ortamda sentezlenerek organizmaya verilmesi - eksikliğinin giderilmesini amaçlar.

- Belli aralıklarla tekrarlanmayı gerektirir.

- Konak hücre, vektör ve besi ortamı gerektirir.

- Konak hücre olarak genellikle bir bakteri hücresi kullanılır

- Ökaryotik bir hücreye ait genin intron alt birimi içermemesine dikkat edilir.

- Sentez sonrası modifikasyonlar gereklidir:

1-Rekombine protein şeklinde sentezlenen peptidin CnBr (Siyanin Bromür) ile muamelesi ile (methionin taşıması şartıyla) öncelikle non-rekombine

hale getirilmesi,

2- Proteinin saflaştırılması,

3- Konsantrasyon analizi ve uygulamaya hazır hale getirilmesi ve

4- Pazarlama

ÜRÜNLERI- Somatostatin (büyüme hormonu inhibitörü olarak)

II- Büyüme hormonu (büyüme geriliklerin giderlmesi, 3 derece ağır yanıkların tedavisi)

III- Sinir sistemi inhibitörleri (Ağrı - acı ve stres durumunda tedavi edici olarak kullanılır)

- Endorfinler (opioid peptitler)

- Enkefalinler(opioid peptitler)

IV- İnsülin(rekombine yolla elde dilen insülin preparatları diğerlerine oranla daha avantajlıdır). A zinciri (21 aa) ve B zinciri (30 aa)

V- İnterferonlar (F- İnt, L-İnt), Viral immünyetmezliklerin tedavisi.

VI-İnterlökinler (çeşitli kanser grupları tedavisinde)

VII-Hemofilik faktör VIII

VIII-Ürokinaz

IX- Aşılar

GEN TEDAVİ YÖNTEMLERİ Tedavi Hastalık

I-Eksik proteinin verilmesi (antihemofilik protein) Hemofilia

II- Eksik vitamin - koenzim verilmesi

B6 Sistinirua

B12 Metilmalanisidemia

Biotin Propicidinemia

D D-resistant riketsilar

III- Diyetden substrat çekmekIII-a.Amino asit;

Fenilalanin Fenilketonuri

Lösin, izolösin ve Valin Maple Syrup Urine Disease

Methionin Homosistinuria

III-b. Karbonhidrat;

Galaktoz Galaktozemia

Tedavi HastalıkIII-c.Lipidler

Kolesterol Kolesterolemia

III-d. Total Protein Üre döngü defektleri

IV- Eksik ara ürün ilevesi

Kortizon Adrenogenital sendromu

Cystein Homosistinuria

Tiroksin Konjenital kretinizm

Uridin Orotik asidinemia

V- Koruyucu

VI- Hasta dokunun yenilenmesi

Böbrek transplantasyonu Polikistik böbrek anomalisi

Korneal graft Konjenital katarakt

Kemik iliği transplantasyonu İmmünyetmezlikler

VII- Zararlı materyalin uzaklaştırılması (Dializ) Polikistik böbrek anomalisi

VIII- Hasta dokunun uzaklaştırılması (Kolektomi) Poliposiz koli

B- GEN TERAPİSİ

I- Supressör tRNA aracılı tedaviII- Demetilatörler / Hipermetilatörler aracılı tedaviIII- Gene replacement

A- Embriyonal hücre (Germline) tedavisiB- Somatik hücre - doku tedavisiC- Elemanları

1- Hasta-mutant genin ilgili hücre-dokudan uzaklaştırılması2- Sağlıklı, non-mutant genin eldesi3- Host hücre-dokuya vektör aracılı gen transferi

4- siRNA tedavisi

Gen Transferinde Kullanılan Vektörler

Plazmid 5-10 kb

Bakteriyofaj 20 kb

Cosmid 50 kb

YAC 100 kb

Baculovirus 150 kb

BAC 200 kb

PAC 250-300 kb

Lentivirus ** ~ 100-200 kb

Mikroinjection değişken

LENTİVİRUSLAR

Gen tedavisinde vektör olarak kullanılmak üzere ( özellikle somatik hücre gen tedavisinde)non-patojen hale getirilmiş viruslara denir.

A- Adenovirus orijinli lentiviruslar (DNA) : 30 kb DNA

B- Retroviral lentiviruslar(RNA) : 8 kb DNA kabul eder

C- Non-viral vekrörler (liposomlar vs)

LENTİVİRUS ARACILI GEN TRANSFERİNDE BAŞARISIZLIK NEDENLERİ

1- Lizojeni zayıf olabilir

2- Düşük ekspresyon

3- Daha büyük (uzun DNA) gen transferi zor

4- Virusa karşı olası immün yanıt gelişebilir

5- Onkogenezis

GEN TEDAVİSİ YAPILAN GENETİK HASTALIKLAR

Hastalık Hedef hücre GenSCID (ADA yetmezliği) Kemikiliği stem adenosine deaminase

Hemophilia B Hepatosit, deri fibroblast Faaktör IX

Familial hypercholesterolemia Hepatosit LDL reseptör

Cystic fibrosis Solunumyolu epitel CFTR

Malignant melanoma Melanoma tümör HLA B7

DMD Myoblastlar Dysrophin

Akciğer kanseri Tümör Normal p53

Beyin tümörü Beyin herpes timidine kinase

Ovum kenseri Tümör herpes timidine kinase

TEDAVİ EDİLMEK İSTENİLEN HÜCRELER

(Hedef dokular genellikle: Karaciğer, beyin, kas, kemikiliği ve eklemler olmaktadır) Bunlar;

1- Kolay edinilebilir olmalı2- Kültüre edilebilinmeli3- Manipülasyonlara müsait- dayanıklı olmalı4- Vücuda dönüşümleri kolay olmalı5- Lentivirus transfeksiyonuna uygun olmalı6- Replase sonrası olabildiğince uzun yaşamalı.7- Bölünebilme potansiyeli yüksek olmalı (telomerik

DNA uzunlukları ideal olmalıdır).

1. Gen Artış Tedavisi

Fonksiyon kaybının olduğu durumlarda Örneğin, kistik fibröz BMD tedavisinde

Kanser tedavisinde Tümöre karşı immün yanıtın arttırılması veya defektif tümör supressör

genin değiştirilmesi

X geni

Hastalıklı hücreler Normal fenotipX geninin ürünü artar

2. Hedeflenmiş Gen Mutasyonunun Düzeltilmesi

X geni

Hastalıklı hücreler (mutant X geni)

Normal fenotip(mutasyon fonksiyonel gen ile düzeltilir)

Fonksiyon kazandıran mutasyonu olan hastalıkların tedavisinde

“Gene replacement” tedavisi

4. siRNA tedavisi

Patojenik genin ekspesyonunun engellenmesi

siRNA komplementerlik tedavisi Özellikle infeksiyon hastalıklarının tedavisinde Kanserde aktive olmuş onkogenlerin baskılanmasında Otoimmün hastalıklarda Kalıtımsal hastalıklarda fonksiyonu artan mutant allelin

baskılanmasında

4a. Hastalıklı Hücrelerin Direkt Öldürülmesi

İlaç

Toksin geni

Proilaç geni

Hastalıklı hücreler

Hastalıklı hücreler

Eksprese olan toksin tarafından hücreler öldürülür

İlaç tarafındanhücreler öldürülür

Beyin tümöründe in vivo prodrug ilaç yaklaşımı

•Retrovirusler Herpes simplexThymidine- kinase üretecek şekilde yapılandırılır

•Vector-üreten hücreler tümöre enjekte edilir, virüs sadece bölünen tm hücresini enfekte eder

•Prodrug Gancyclovir IV verilir

•HsTK + hücreler bunu toksik gcv-triphosphat a dönüştürür ve hücre ölür!

4b. İmmün Sistem Hücreleri Tarafından Hastalıklı Hücrelerin Öldürülmesi

Antijen geni

Sitokin geni

Hastalıklı hücre

Hastalıklı hücre

hastalıklı olmayan hücre, özellikle immün sistem hücresi

Artmış immün yanıttan dolayı hastalıklı hücrelerin öldürülmesi

Somatik Gen Tedavi Stratejileri

Ex vivo gen tedavisi In vivo gen tedavisi

Hedef hc’lere başarılı terapötik genetik materyal aktarımı

(gen transferi)

ex vivo Gen Tedavisi

Hastanın kendi hücreleri kullanılır (otolog) immun rxn gözlenmezpahalıdır

Transfeksiyon mümkün olduğu kadar verimli olmalı

Transgenin devamlı ekpresyonuna ihtiyaç vardır.

Ex Vivo Gen Tedavisi

in vivo Gen Tedavisi Hastanın vücudundaki

hücrelere genetik manipulasyon yapılır.

Düzeltici gen nasıl verilmeli? Retroviral vektörler

İnsert’ün büyüklük limitasyonu

Güvenlik faktörleriHedef hücrelerin aktif olarak

çoğalmaları gerekmekte Diğer seçenekler

Çıplak DNA’nın enjeksiyonuLipozomlarPartikül bombardımanı

Non-Viral

-Plasmidler

-Oligonukleotitler

-Liposomlar

İn vivo Gen Transferi

Viral

• -AV vektörler

• -AAV vektörler

• -Retro vektörler

Gen Transferinde

• Etkinlik

• Spesifiklik

• Uzun süreli ekspresyon

• İmmun yanıt

• Toksisite

293T 293T

Non-replikatifLentivirus

1. Transfer vektörü

2. gag/pol

3. Rev

4. Zarf (VSV-G)