FRAMMENTAZIONE DEL DNA SPERMATICO - Policlinico S ......La frammentazione del DNA si propone come...
Transcript of FRAMMENTAZIONE DEL DNA SPERMATICO - Policlinico S ......La frammentazione del DNA si propone come...
![Page 1: FRAMMENTAZIONE DEL DNA SPERMATICO - Policlinico S ......La frammentazione del DNA si propone come candidato a nuovo parametro predittivo della fertilitàmaschile FRAMMENTAZIONE DEL](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060100/60af7b7bf16aca0d5d1c86f2/html5/thumbnails/1.jpg)
Monica Muratori
Sezione di Medicina della Sessualità e Andrologia, Università di Firenze
FRAMMENTAZIONE DEL DNA SPERMATICO
Il manuale WHO 2010 per l’esame del liquido seminale: luci e ombre
Bologna 29 Gennaio 2011
![Page 2: FRAMMENTAZIONE DEL DNA SPERMATICO - Policlinico S ......La frammentazione del DNA si propone come candidato a nuovo parametro predittivo della fertilitàmaschile FRAMMENTAZIONE DEL](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060100/60af7b7bf16aca0d5d1c86f2/html5/thumbnails/2.jpg)
FRAMMENTAZIONE DEL DNA NEGLI SPERMATOZOI
• Ha un’origine probabilmente multifattoriale:
• Presenza di tagli a singola e doppia elica nel DNA degli spermatozoi
• E’ un anomalia genomica frequentemente rinvenuta nei pazienti sub e infertili (Gorczyca et al, 1993)
- apoptosi abortiva (nucleasi apoptotiche)
- difetti nella maturazione
cromatinica (topoisomerasi)
- stress ossidativo (ROS)
![Page 3: FRAMMENTAZIONE DEL DNA SPERMATICO - Policlinico S ......La frammentazione del DNA si propone come candidato a nuovo parametro predittivo della fertilitàmaschile FRAMMENTAZIONE DEL](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060100/60af7b7bf16aca0d5d1c86f2/html5/thumbnails/3.jpg)
Determinare la frammentazione del DNA nel seme fornisce maggiori
informazioni sullo stato di fertilità maschile rispetto a quelle
ottenute con lo spermiogramma ?
I livelli di frammentazione nel seme predicono gli esiti della
riproduzione?
![Page 4: FRAMMENTAZIONE DEL DNA SPERMATICO - Policlinico S ......La frammentazione del DNA si propone come candidato a nuovo parametro predittivo della fertilitàmaschile FRAMMENTAZIONE DEL](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060100/60af7b7bf16aca0d5d1c86f2/html5/thumbnails/4.jpg)
Spermiogramma
Limiti di predittività clinica
Necessità di nuovi parametri
La frammentazione del DNA si propone come candidato
a nuovo parametro predittivo della fertilità maschile
![Page 5: FRAMMENTAZIONE DEL DNA SPERMATICO - Policlinico S ......La frammentazione del DNA si propone come candidato a nuovo parametro predittivo della fertilitàmaschile FRAMMENTAZIONE DEL](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060100/60af7b7bf16aca0d5d1c86f2/html5/thumbnails/5.jpg)
FRAMMENTAZIONE DEL DNA E QUALITA’ DEL SEME
Lopes et al, 1998; Irvine et al, 2000; Muratori et al, 2000
Sperm DNA Fragmentation
![Page 6: FRAMMENTAZIONE DEL DNA SPERMATICO - Policlinico S ......La frammentazione del DNA si propone come candidato a nuovo parametro predittivo della fertilitàmaschile FRAMMENTAZIONE DEL](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060100/60af7b7bf16aca0d5d1c86f2/html5/thumbnails/6.jpg)
FRAMMENTAZIONE ED IMPATTO SULLA RIPRODUZIONE
Studi sull’animale: netto impatto negativo della frammentazione sugli indici riproduttivi e salute della progenie (Fatehi et al, 2006;
Fernandez Gonzalez et al, 2009).
impatto sul rate di fertilizzazione (Tarozzi et al, 2007):IVF: discussoICSI: inesistente
Controversa è l’associazione con:lo sviluppo embrionale, l’impianto, il tasso di gravidanza (Zini and Sigman 2009, Zini 2010)
Soggetti infertili hanno maggiori livelli di frammentazione del DNA rispetto a soggetti fertili (Sergerie et al, 2005; Evenson et al, 1999)
![Page 7: FRAMMENTAZIONE DEL DNA SPERMATICO - Policlinico S ......La frammentazione del DNA si propone come candidato a nuovo parametro predittivo della fertilitàmaschile FRAMMENTAZIONE DEL](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060100/60af7b7bf16aca0d5d1c86f2/html5/thumbnails/7.jpg)
Invece c’è un buon accordo nel ritenere che aumentati livelli di danno al DNA spermatico causino un aumento degli aborti
(Zini et al, 2008)
FRAMMENTAZIONE ED IMPATTO SULLA RIPRODUZIONE
![Page 8: FRAMMENTAZIONE DEL DNA SPERMATICO - Policlinico S ......La frammentazione del DNA si propone come candidato a nuovo parametro predittivo della fertilitàmaschile FRAMMENTAZIONE DEL](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060100/60af7b7bf16aca0d5d1c86f2/html5/thumbnails/8.jpg)
![Page 9: FRAMMENTAZIONE DEL DNA SPERMATICO - Policlinico S ......La frammentazione del DNA si propone come candidato a nuovo parametro predittivo della fertilitàmaschile FRAMMENTAZIONE DEL](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060100/60af7b7bf16aca0d5d1c86f2/html5/thumbnails/9.jpg)
![Page 10: FRAMMENTAZIONE DEL DNA SPERMATICO - Policlinico S ......La frammentazione del DNA si propone come candidato a nuovo parametro predittivo della fertilitàmaschile FRAMMENTAZIONE DEL](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060100/60af7b7bf16aca0d5d1c86f2/html5/thumbnails/10.jpg)
LE TECNICHE
Rivelano lo stesso tipo di danno?
I dati sono confrontabili?
SCSA
TUNEL
ISNT
Sperm Chromatin Structure Assay
(TdT)-mediated fluorescein-dUTP nick end labeling
In Situ Nick Translation
Acridine Orange Test
Sperm Chromatin Dispersion Test
COMET
AO Test
SCD test (Halosperm)
Single Cell Gel Electrophoresis assay
![Page 11: FRAMMENTAZIONE DEL DNA SPERMATICO - Policlinico S ......La frammentazione del DNA si propone come candidato a nuovo parametro predittivo della fertilitàmaschile FRAMMENTAZIONE DEL](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060100/60af7b7bf16aca0d5d1c86f2/html5/thumbnails/11.jpg)
DNA Fragmentation
TUNELterminal deoxynucleotidyl transferase–mediated
fluorescein–dUTP nick end labeling
•- Microscopia a fluorescenza e Citofluorimetria•- Risultati come percentuale di cellule frammentate
![Page 12: FRAMMENTAZIONE DEL DNA SPERMATICO - Policlinico S ......La frammentazione del DNA si propone come candidato a nuovo parametro predittivo della fertilitàmaschile FRAMMENTAZIONE DEL](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060100/60af7b7bf16aca0d5d1c86f2/html5/thumbnails/12.jpg)
SCSASperm Chromatin Structure Assay
DFI
DNA denaturato
DNA totaleDFI=
Fluorescenza rossa =DNA denaturato
Flu
ore
scenza
verd
e =
DNA n
ativo
Arancio di Acridina
•- Citofluorimetria•- Risultati come percentuale di cellule frammentate
![Page 13: FRAMMENTAZIONE DEL DNA SPERMATICO - Policlinico S ......La frammentazione del DNA si propone come candidato a nuovo parametro predittivo della fertilitàmaschile FRAMMENTAZIONE DEL](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060100/60af7b7bf16aca0d5d1c86f2/html5/thumbnails/13.jpg)
COMETo SCGE, Single Cell Gel Electrophoresis
•Inclusione degli spermatozoi in gel di agarosio, lisi ed elettroforesi in elevate concentrazioni saline
•Microscopia a fluorescenza•Elevata sensibilità (50 single-strand breaks per cell)•Percentuale di cellule danneggiate e misura del danno/cellula
Cellula frammentata
Cellula non frammentata
![Page 14: FRAMMENTAZIONE DEL DNA SPERMATICO - Policlinico S ......La frammentazione del DNA si propone come candidato a nuovo parametro predittivo della fertilitàmaschile FRAMMENTAZIONE DEL](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060100/60af7b7bf16aca0d5d1c86f2/html5/thumbnails/14.jpg)
TUNEL
Mancanza di standardizzazione delle procedure
Shen et al. 2000; Sergerie et al. 2005; Frydman et al. 2008; Pecou et al. 2009Subtraction method
Cohen-Bacrie P 2009; Muratori et al. 2000 and 2008a; Domínguez-Fandos D 2008; Zhang et al. 2008Threshold setting methodFLOW CYTOMETRY
DATA ANALYSIS
Muratori et al. 2008a, Sepaniak 2006; Frydman et al. 2008; Martin et al. 2005; Sergerie et al. 2005; Varum et al. 2007; Stronati et al. 2006; Ramos et al. 2008; Younglai et al. 2001; O'Flaherty et al. 2008
Flow cytometry
Chohan et al. 2006; R. Smith et al. 2006; Tesarik et al. 2004; Borini et al. 2006; Young et al, 2003; Avendaño et al. 2009a and 2009b; Smith et al. 2006; Tunc et al. 2008; Caglar et al. 2007
Fluorescence microscopyDETECTION
Varum et al. 2007; Sargerie et al. 2005; Piasecka et al. 2007; Younglai et al. 2001; Frydman et al. 2008; Muciaccia et al. 2007; Long et al. 2007; Martin et al. 2005; Zini et al. 2001
Indirect labeling Many commercial kits
O'Flaherty et al. 2008; Zhang et al. 2008; Aoki et al. 2006; Torregrosa et al. 2006; Young et al. 2003; Muratori et al. 2008a;.Greco et al. 2005; Paasch et al. 2004; Brugnon et al. 2006; Donelly et al. 2000
Direct labeling Many commercial kits
LABELLING
Chohan et al. 2006; Aoki et al. 2006; Caglar et al. 2007; Varum et al. 2007; Muratori et al. 2008a and 2009; Tunc et al. 2008; Frydman et al. 2008; Avendaño et al. 2009a and 2009b
Present 0.1; 1; 0.5 and 2% Triton X at different times
Martin et al. 2005; O'Flaherty et al. 2008; Young et al. 2003; Said et al. 2006Absent PERMEABILIZATION with detergents
Muratori et al. 2003; Caglar et al. 2007; Tarozzi et al. 2009; Domínguez-Fandos et al. 2008; Young et al. 2003; Avendaño et al. 2009a and 2009b; Stronati et al. 2006; Ramos et a. 2008; Tesarik et al. 2004
Formaldeyde At 1; 2; 3.5; 3.7%
Muciaccia et al. 2007; O'Flaherty et al. 2008; Cohen-Bacrie et al. 2009; Tunc et al. 2008; Martin et al. 2005
Alcohols EtOH, MeOH, MeOH-EtOH
FIXATION
Ramos et al. 2008; Avendaño et al. 2009a; Pecou et al. 2009Cryopreserved With or without cryoprotectant
Bian et al. 2004; Xia et al. 2005; Sepaniak et al. 2006; Stronati et al. 2006; Long et al. 2007; O'Flaherty et al. 2008
Frozen At -20°C, -70°C, -80°C
Muratori et al. 2000; Sergerie et al. 2005; Greco et al. 2005; Chohan et al. 2006; Smith et al. 2006; Domínguez-Fandos et al. 2008; Varum et al. 2007; Piasecka et al. 2007; Zhang et al. 2008; Cohen-Bacrie et al. 2009
Fresh
SAMPLE
REFERENCESVARIANTSSTEPS
Muratori et al, SBRM 2010
![Page 15: FRAMMENTAZIONE DEL DNA SPERMATICO - Policlinico S ......La frammentazione del DNA si propone come candidato a nuovo parametro predittivo della fertilitàmaschile FRAMMENTAZIONE DEL](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060100/60af7b7bf16aca0d5d1c86f2/html5/thumbnails/15.jpg)
21.2±16.4Data analysis
26.0±16.0Labelling kit
(TMR vs FITC)
22.7±11.2Time storage
(0 vs 24 h)
15.1±11.2PFA concentration
(1% vs 3.7%)
CV%Effect of:
Intra-assay CV=4.3±1.4%, n=12
Muratori et al, J Androl, 2009
2.36±1.37%, n=29Younglai et al, 2001
39.82 ± 23.75%, n=66Domínguez-Fandos D et al, 2007
Letteratura 2000-2009, valori del TUNEL nel seme di soggetti subfertili
EFFETTO DELLE VARIANTI DEL TUNEL
Parte d
ella confli
ttualit
à della
letteratu
ra
può ris
iedere
nell’eteroge
neità
e nella
manca
nza di
standa
rdizzaz
ione d
elle
tecniche
![Page 16: FRAMMENTAZIONE DEL DNA SPERMATICO - Policlinico S ......La frammentazione del DNA si propone come candidato a nuovo parametro predittivo della fertilitàmaschile FRAMMENTAZIONE DEL](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060100/60af7b7bf16aca0d5d1c86f2/html5/thumbnails/16.jpg)
Colorazione May-Grunwald Giemsa
Muratori et al, 2004 ; Marchiani et al, 2007
M540 Bodies:corpi apoptotici di probabile origine testicolare
![Page 17: FRAMMENTAZIONE DEL DNA SPERMATICO - Policlinico S ......La frammentazione del DNA si propone come candidato a nuovo parametro predittivo della fertilitàmaschile FRAMMENTAZIONE DEL](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060100/60af7b7bf16aca0d5d1c86f2/html5/thumbnails/17.jpg)
Incidenza degli M540 Bodies nel seme di soggetti sub/infertili
N=Normozoospermici, AT= AsthenoteratozoospermiciT=Teratozoospermici, OAT=Oligoasthenoteratozoospermici
% M
540
bo
die
ssu
l to
tale
dei
bo
die
se
sper
mat
ozo
i
Muratori et al, 2004 ; Marchiani et al, 2007
% M
540
bo
die
svs
sp
erm
ato
zoi
![Page 18: FRAMMENTAZIONE DEL DNA SPERMATICO - Policlinico S ......La frammentazione del DNA si propone come candidato a nuovo parametro predittivo della fertilitàmaschile FRAMMENTAZIONE DEL](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060100/60af7b7bf16aca0d5d1c86f2/html5/thumbnails/18.jpg)
M540 Bodies: un interferenza nelle analisi citofluorimetriche degli spermatozoi
Muratori et al, 2004 ; Marchiani et al, 2007
![Page 19: FRAMMENTAZIONE DEL DNA SPERMATICO - Policlinico S ......La frammentazione del DNA si propone come candidato a nuovo parametro predittivo della fertilitàmaschile FRAMMENTAZIONE DEL](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060100/60af7b7bf16aca0d5d1c86f2/html5/thumbnails/19.jpg)
TUNEL/PI
Frammentazione del DNA
PI
Frammentazione del DNA
Controllo negativo Campione test
Propidium Iodide,PI
Bright field
Muratori et al, 2008
![Page 20: FRAMMENTAZIONE DEL DNA SPERMATICO - Policlinico S ......La frammentazione del DNA si propone come candidato a nuovo parametro predittivo della fertilitàmaschile FRAMMENTAZIONE DEL](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060100/60af7b7bf16aca0d5d1c86f2/html5/thumbnails/20.jpg)
Muratori et al, Hum Reprod 2008
Percentuale ricavata dal semplice TUNEL meno percentuale ricavata dal TUNEL/PI
SIMPLE TUNEL versus TUNEL/PI
Simple TUNEL underestimates
Simple TUNEL overerestimates-50 -40 -30 -20 -10 0 10
Muratori et al, Cytometry A, 2008
![Page 21: FRAMMENTAZIONE DEL DNA SPERMATICO - Policlinico S ......La frammentazione del DNA si propone come candidato a nuovo parametro predittivo della fertilitàmaschile FRAMMENTAZIONE DEL](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060100/60af7b7bf16aca0d5d1c86f2/html5/thumbnails/21.jpg)
SPERM SORTINGby FACSAria
Unpublished results
PI
PIbr
PIdim
![Page 22: FRAMMENTAZIONE DEL DNA SPERMATICO - Policlinico S ......La frammentazione del DNA si propone come candidato a nuovo parametro predittivo della fertilitàmaschile FRAMMENTAZIONE DEL](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060100/60af7b7bf16aca0d5d1c86f2/html5/thumbnails/22.jpg)
Diversa relazione con la qualità del seme
Muratori et al, 2008
DNA Fragmentation
PI La frammentazione nella PI dimmer si associa strettamente a scarsa qualità del seme
La frammentazione nella PI brighterè indipendente dalla qualità del seme
0.001-0.3775Normal
morphology
0.005-0.2975Progressive motility
0.050-0.1975Total motility
0.001-0.3575Sperm concentration
(sperm/ml)
0.016-0.2575Sperm count (sperm/ejaculate)
prho
% diframmentazionesul totale deglispermatozoinParameters
0.000-0.51
0.000-0.41
0.003-0.32
0.000-0.52
0.000-0.46
prho
% diframmentazione
nellaPI Dimmer
![Page 23: FRAMMENTAZIONE DEL DNA SPERMATICO - Policlinico S ......La frammentazione del DNA si propone come candidato a nuovo parametro predittivo della fertilitàmaschile FRAMMENTAZIONE DEL](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060100/60af7b7bf16aca0d5d1c86f2/html5/thumbnails/23.jpg)
La vitalità cellulare è diversa nelle due popolazioni
Test SampleP
I fluorescence
Dead cells(L-23101 fluorescence)
Negative Control
![Page 24: FRAMMENTAZIONE DEL DNA SPERMATICO - Policlinico S ......La frammentazione del DNA si propone come candidato a nuovo parametro predittivo della fertilitàmaschile FRAMMENTAZIONE DEL](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060100/60af7b7bf16aca0d5d1c86f2/html5/thumbnails/24.jpg)
Il danno nella popolazione brighter è indipendente dalla qualità del seme.
E’ il danno della popolazione brighter a fornire informazioni addizionali/alternative sullo stato di fertilità maschile rispetto allo spermiogramma?
Le cellule della popolazione dimmer sono morte
Sono gli spermatozoi frammentati della brighter ad impattare negativamente sulla riproduzione?
![Page 25: FRAMMENTAZIONE DEL DNA SPERMATICO - Policlinico S ......La frammentazione del DNA si propone come candidato a nuovo parametro predittivo della fertilitàmaschile FRAMMENTAZIONE DEL](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060100/60af7b7bf16aca0d5d1c86f2/html5/thumbnails/25.jpg)
CONFRONTO FRA SOGGETTI FERTILI ED INFERTILI
unpublished data PATIENTS FERTILE MEN
n=29 n=28
02468
101214161820222426283032
NS
FRAMMENTAZIONE DIMMER
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
*p<0.00001
FRAMMENTAZIONE BRIGHTER
PATIENTS FERTILE MEN
n=29 n=28
0
10
20
30
40
50
60
70
*p<0.001
FRAMMENTAZIONE TOTALE
Fertili= concepimento entro l’anno dalla data del test
Pazienti= afferenti al laboratorio di Seminologia per l’esecuzione dello spermiogramma
E’il da
nno de
lla pop
olazione
brighte
r il
param
etro in
dipend
ente d
alla qu
alità d
el sem
e
che dis
crimina
fra fer
tili ed
infertili
![Page 26: FRAMMENTAZIONE DEL DNA SPERMATICO - Policlinico S ......La frammentazione del DNA si propone come candidato a nuovo parametro predittivo della fertilitàmaschile FRAMMENTAZIONE DEL](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060100/60af7b7bf16aca0d5d1c86f2/html5/thumbnails/26.jpg)
FRAMMENTAZIONE DEL DNA NEI SOLI SPERMATOZOI VIVI
Mitchell et al, 2010
Aitken et al, 2010
Spermatozoi vivi frammentati
![Page 27: FRAMMENTAZIONE DEL DNA SPERMATICO - Policlinico S ......La frammentazione del DNA si propone come candidato a nuovo parametro predittivo della fertilitàmaschile FRAMMENTAZIONE DEL](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060100/60af7b7bf16aca0d5d1c86f2/html5/thumbnails/27.jpg)
FRAMMENTAZIONE DEL DNA E DANNO OSSIDATIVO RIVELATO CON LA COMET
Simon et al, 2010
= 8-hydroxy, 2 deoxy guanosine(8-OHdG)
Formamidopyrimidine-DNA Glycosylase =FPG
COMET
![Page 28: FRAMMENTAZIONE DEL DNA SPERMATICO - Policlinico S ......La frammentazione del DNA si propone come candidato a nuovo parametro predittivo della fertilitàmaschile FRAMMENTAZIONE DEL](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060100/60af7b7bf16aca0d5d1c86f2/html5/thumbnails/28.jpg)
FPG
FRAMMENTAZIONE DEL DNA +
DANNO OSSIDATIVO
![Page 29: FRAMMENTAZIONE DEL DNA SPERMATICO - Policlinico S ......La frammentazione del DNA si propone come candidato a nuovo parametro predittivo della fertilitàmaschile FRAMMENTAZIONE DEL](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060100/60af7b7bf16aca0d5d1c86f2/html5/thumbnails/29.jpg)
![Page 30: FRAMMENTAZIONE DEL DNA SPERMATICO - Policlinico S ......La frammentazione del DNA si propone come candidato a nuovo parametro predittivo della fertilitàmaschile FRAMMENTAZIONE DEL](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060100/60af7b7bf16aca0d5d1c86f2/html5/thumbnails/30.jpg)
RINGRAZIAMENTI
Prof. Elisabetta Baldi Prof. Gianni FortiProf. Mario Maggi
Dr. Sara MarchianiDr. Lara TamburrinoDr. Marta CambiDr. Margarita MontoyaFrancesca Di FilippoDr.Erminio FilimbertiDr. Selene Degl’Innocenti
Dpt di Ginecologia, Perinatologiae Riproduzione Umana:
Prof. Ivo Noci
Azienda U.S.L. 3 di Pistoia
Presidio Ospedaliero di Pescia
Dr. Ilaria Natali
Dpt Fisiopatologia Clinica,
sz. Medicina della Sessualità e Andrologia: