Fluorocromos para citometría de flujo
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BUAPFacultad Ciencias Químicas
-Análisis Espectrofotométricos-TLQ Neftalí Pérez Pérez
Catedrático: Dr. Ulises Peña Rosas
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Iniciada en los 60’s como importante avance (medir y contar partículas y células)
Citómetro de flujo (CMF): Mide partículas biológicas en suspensión celular.
Sorters: Mismas capacidades, solo que pueden separar partículas especificas.
Introducción
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Moldavan (1937)
•Primer contador automático.
•Un microscopio con un capilar (problemas) y contador fotosensible.
Crosland & Taylor (1953)
•Cámara de flujo con inyección de muestra.
•Diámetro del capilar mayor enfoque (hoy en día).
1967-69 Van Dilla
•Mejora la cámara de Crosland/Taylor, pero aplica a procesos biomédicos.
•Demostró la cuantificación por fluorescencia de ADN.
Historia
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Características estructurales y funcionales de células.
Sus aplicaciones son fundamentalmente científicas y de investigación clínica (biología y medicina).
Identifica antígenos celulares por inmunofluorescencia, contenido del ADN, y fases del ciclo celular.
Aplicaciones
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Biomedicina
Hematología: Contaje celular, fórmula leucocitaria, análisis de medula ósea y conteo reticulocitario.
Farmacología: Estudios de cinética celular.
Inmunología: Subpoblaciones T, tipaje celular, estimulación linfocitaria.
Oncología: Diagnóstico/pronóstico, monitorear tratamientos.
Bacteriología: Diagnóstico bacteriano y vírico, sensibilidad a antibióticos.
Genética: Cariotipo, diagnóstico de portador, diagnóstico prenatal.
CMF en el mundo
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Sistema óptico
Fuentes de luz
Detectores
• Basados en una fuente de iluminación laser, perpendiculares al paso de la muestra (elimina ruido).
• La fluorescencia se recoge a 90º (espejo 90%)
• Sintonizables o de emisión fija (Argón o Kriptón).
• Lámparas de Hg o Xe (decrece con el tiempo)
• Fotomultiplicadores (PMT): Detectan la señal a 90º con buen ratio señal/ruido.
• Diodos: Detecta Dispersión frontal de la luz (señales fuertes).
Características generales de un CMF 1
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Cámaras de flujo
•Laser: Cerradas flujos laminares lentos y menor ruido (coágulos) y abiertas o de chorro al aire.
•De arco: Hay varios tipos y cada uno tiene su complejidad.
Sistemas de inyección de muestra
•Por Presión: Mantiene una velocidad constante.
•Por inyección isovolumetrica: Con jeringa y mantiene velocidades bajas.
Componente electrónico
•Los pulsos de los fotodetectores van de un amplificador, a un conversor digital.
•Existe la posibilidad de un ‘’umbral de señal’’.
Características generales de un CMF 2
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Configuración óptica de un Citómetro de flujo
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Configuración óptica de un Sorter
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Tinción
•Fluorocromos que se unen específicamente a un constituyente celular.
Inyección
•En un flujo laminar y pasan una por una a un punto iluminado por un laser.
Señal
•Dependiendo de su contenido de fluorocromo, emitirán una señal fluorescente (individuales).
Proceso de muestra
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Sangre periférica, médula ósea y otros fluidos biológicos.
Tumores sólidos o muestras parafinadas, requieren de disgregación intensa (enzimas).
Soluciones con concentración bacteriana desconocida.
Que puedo meter ahí?
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Estructura, función y vitalidad de las células.
Método sensible
Unión covalente del fluorocromo a componentes específicos celulares.
Uso I
Fluorocromos que varían sus características en función del microambiente que les rodea.
Uso II
Fluorocromos
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Ejemplo
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¿Que te hace fluorocromo?
Alto coeficiente de extinción a la λ de excitación (probabilidad de absorber luz).
Alto rendimiento cuántico (emisión de luz)
Elevada fotosensibilidad
Corto estado de excitación (si estará unido a algo, debe ser insensible a cambios de pH, polaridad y microambiente).
Propiedades ideales de un fluorocromo
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Uso:
•Reaccionan y marcan proteínas, lípidos u otras moléculas biológicas.
•Altamente selectivos y reactivos.
Se emplean:
•Cromóforos con grupos isotiocianato, clorotrizinil y esteres de succinimida.
•Fluoresceína y ficoeritrina (Gran absorción y rendimiento, puede excitarse a 488nm pero emite mas allá de ese espectro/doble análisis).
Detección:
•Anticuerpos conjugados (cada uno con diferente marcador).
•Tinción de células cancerígenas.
Marcadores fluorescentes de unión covalente
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Debido a su especial composición, se unen a determinados componentes moleculares.
Marcadores ADN/ARN O Bases: Hoechst33342 (A-T), CromomicinaA3 ( G-C), mitramicina (G-
C) naranja de acridina (ADN y ARN dif. λ).
Marcadores de potencial de membrana: Cianinas y rodamina123, marcan mitocondrias debido a su alta interferencia en potencial de
membrana.
Fluorocromos de unión no covalente
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Estiman las prioridades del ambiente (espectro de
absorción)
pH(6-carboxi-fluoresceina), potencial
redox(diclorofluoresceína)
Actividad enzimática(substratos),
polaridad (anilino-naftalina-sulfato)
Sensibles a su micro-entorno
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Proceso de
diferenciación celular
Gen de desarrollo
Gen de función
Productos del gen
Superficie celular
Intracelulares (caracterizar
sub-poblaciones)
El inmunofenotipaje (perfil de alergias)
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Antígeno entra al organismo
Linfocitos B segregan Ig (una
parte)
Neutralizan a una sustancia especifica
Anticuerpos
terminaciones
Fab (especificidad)Fc
(región constante)
Gran especificidad (pequeñas diferencias
estructurales)
Fluorocromo (se une con el anticuerpo),
puede marcar varios y no daña la célula..
Respuesta inmune
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No sabía que era alérgico…
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Procedimientos técnicos
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Aumento de la señal fluorescente (lecturas precisas)
Antisueros: Mezcla de Ig después de coagular, fusionadas con marcador y antígenos puros.
Tinción inmunofluorescente: técnicas directas (poco background y baja fluorescencia) o directas (aumenta background, pero es mayor la fluorescencia
con unión).
Fluoresceína (FITC), para IgA.
Incremento de la señal/ruido
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Resultados
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Deben ser almacenadas, inmediatamente después del análisis inmunofenotípico.
• Se deben de guardar en condiciones criogénicas.
En medios de cultivo con 0.1% de NaH3
(amoniaco) en hielo a 4ºC.
• Se puede (no se precisa viabilidad celular), fijar con paraformaldheido y guardar a 4ºC en cámara oscura.
Almacenaje de muestras
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http://web.udl.es/dept/medicina/sedaicmf/sedai/
imf.htm Responsable del artículo: SEDAI de Citometría. Rovira Roure 80.02198 Lleida +34973702208
Técnicas de fluorescencia en microscopía y citométrica Escrito por Andrés Sampedro,J. R. de Los Toyos,Ángel Martínez Nistal
Bioquímica clínica y patología molecular. I, Volumen 1 X. Fuentes Arderiu
Bibliografía