Curso básico de citometría de flujo
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1
CURSO BÁSICO DE CITOMETRÍA DE FLUJO.
Javier Godino.César Vallejo.
Desirée Perebom
Servicio de separación celular y
citometría
CITOMETRÍA DE FLUJO.
FUNDAMENTOS.
• Que es la citometría de flujo.
• Componentes de un citómetro de flujo.
• Dispersión de la luz.
• Fluorescencia. Fluorocromos, Compensación defluorescencias.
• Ventajas e inconvenientes de la citometría de flujo
2
La citometría de flujo es una técnica que permite
medir simultáneamente múltiples características
ópticas (dispersión de luz y fluorescencia) de cada
una de las células o partículas presentes en una
suspensión.
¿Qué es la citometría de flujo?
• Suspensión de células individuales .
- Buffer + EDTA o DNAsa.
- Células en frío.
- Lisados tisulares: Disgregación enzimática + filtrado
• Comprobar que el método de disgregación o recolección
del cultivo no afecta a los parámetros que queremos
medir.
Parámetros medibles
• Directos.
- Tamaño y complejidad celular
• Indirectos. Se añaden a la suspensión celular reactivos con
propiedades ópticas determinadas: FLUOROCROMOS.
- Unión a componentes nucleares: ADN.
- Parámetros metabólicos: pH, concentración de Ca2+
- Unión a proteínas de membrana o intracelulares a través
de anticuerpos conjugados a fluorocromos
3
¿Que es un citómetro?
•Sistema que hace pasar células de una en una haciendo
incidir sobre ellas un láser.
• Mide dispersión frontal (FSC), dispersión lateral (SSC) y
emisión de fluorescencia.Boquilla de inyección
Señal fluorescenteSeñal fluorescenteDispersiónDispersión
Láser incidente Láser incidente focalizadofocalizado
DispersiónDispersión
Partes de un citómetro de flujo
• Sistema de Fluidos– Crea un flujo constante de fluido envolvente– Transporta la muestra al punto de interrogación– Alinea las partículas de modo que pasen de una en una por
el punto de interrogación
• Óptica– Focaliza el láser de excitación– recoge y mide la luz emitida
• Electrónica– Convierte la señal óptica en un pulso electrónico – Envía la señal al procesador para ser analizado
• Software– Muestra gráficamente los datos– Controla la configuración del sistema
Sistema de fluidos del FACSAria
Plenum Cámara
Basura
Fluidoenvolvente
Carro de fluidos
Presión
Tubo de muestra
4
Enfoque hidrodinámico
Fluido envolvente Muestra
EnvolventeMuestra
Baja velocidad de inyección
Alta velocidad de inyección
El flujo laminar permite mantener las células en el centro
del flujo y evita la formación de turbulencias.
Enfoque hidrodinámico
Flujo laminarFlujo laminar
Flujo turbulentoFlujo turbulento
Enfoque hidrodinámico
5
10 psi
10.2 psi
10 psi
10.4 psi
10 psi
10.8 psi
Enfoque hidrodinámico
• La diferencia entre las presiones de la muestra y la del
líquido envolvente determina el diámetro del “capilar
virtual”
Inte
nsid
ad d
e lu
z
Velocidad de muestra bajaVelocidad de muestra baja((difdif. presión bajo). presión bajo)
Velocidad de muestra altaVelocidad de muestra alta((difdif. presión alto). presión alto)
Haz láser
Muestra
Líquido de arrastre
Máxima iluminaciónMáxima iluminaciónCV bajosCV bajos
Iluminación variableIluminación variableCV altosCV altos
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
CD4 FITC
0
100
200
300
400
# C
ells
Enfoque hidrodinámico
Haz del láser
Óptica de excitación
• Excitación mediante
fuentes de luz coherentes.
Láseres
• Un sistema de prismas
dirige la luz hacia la
cámara de flujo.
• Enfoca el láser sobre el
flujo de células
6
Óptica de emisión
• Una vez que el láser incide la célula responde emitiendo luz
a varias longitudes de onda, en función de que fluorocromos
hayamos usado → Tenemos que separar la fluorescencia
asociada a cada característica celular: FILTROS
Óptica de emisión: Filtros
400nm400nm 500nm500nm 600nm600nm 700nm700nm
Tra
nsm
itta
nce
Tra
nsm
itta
nce
400nm400nm 500nm500nm 600nm600nm 700nm700nm
Tra
nsm
itta
nce
Tra
nsm
itta
nce
Óptica de emisión: Filtros
7
400nm400nm 500nm500nm 600nm600nm 700nm700nm
Tra
nsm
itta
nce
Tra
nsm
itta
nce
Óptica de emisión: Filtros
Óptica de emisión: Espejos
Óptica de emisión
PMT 4
PMT 3
DicroicosFiltros
BandpassFilters
Laser
Cámara de flujo
PMT 2
FSC
SSC
PMT 1
8
Óptica de emisión
PMT 1
PMT 4
PMT 3
DicroicosFiltros
BandpassFilters
Laser
Cámara de flujo
PMT 2
FSC
SSC
Óptica de emisión
SSC
PE
PE-Cy7
FITC
PerCP-Cy5.5
PE-Txred
Óptica de emisión
9
Detectores
• Convierten la señal luminosa en corriente eléctrica. La
intensidad de esta señal es proporcional a la luz que llega.
• En citometría se usan de 2 tipos ambos basados en el
efecto fotoeléctrico:
- Fotodiodos de silicio: Los fotones que inciden en una
placa de silicio liberan electrones.
• Menos eficientes se usan para medir la dispersión
frontal (FSC)
- Tubos fotomultiplicadores: Mas eficientes: Se usan para
medir fluorescencias y dispersión lateral (SSC)
Tubo fotomultiplicador
ELECTRONICACreación de un pulso de voltaje
Tiempo
LaserLaser
Vol
taje
1
LaserLaser
Tiempo
Vol
taje
2
Tiempo
LaserLaser
Vol
taje
3
10
Área, altura, anchura
Time (µs)
Vol
tage
Pulse area(A)
Pul
se H
eigh
t(H
)
Pulse Width (W)
400
(Vol
ts)
0
10
(Vol
ts)
Rel
ativ
e B
righ
tnes
s
Cha
nnel
Num
ber
6.21 volts
1.23 volts
3.54 volts
10
1
.1
.01
.001
10
100
1000
10,000
1
256
196
64
0
128
(1mV)
(Vol
ts)
0
10
(Vol
ts)
Rel
ativ
e B
righ
tnes
s
Cha
nnel
Num
ber
6.21 volts
1.23 volts
3.54 volts
10
1
.1
.01
.001
10
100
1000
10,000
1
256
196
64
0
128
(1mV)
UMBRAL
Umbral de adquisición (Treshold)
• Eliminamos las señales muy bajas que en general
corresponden a restos celulares que no nos interesan
11
Láser (488 nm) Forward scatter tamaño (488 nm)
Side scatter Complejidad (488 nm)
Dispersión frontal (FSC)
� se mide en la dirección de la luzincidente (2-5 grados) a la mismaλ
� Relacionado con el tamaño/superficie celular (relación linealsólo para partículas esféricas)
Dispersión lateral (SSC)
� Medido perpendicularmente ala dirección de la luz incidente ala misma λ
� Relacionado con la complejidadcelular (granularidad)
Medición del tamaño y la complejidad celular
Representación de la información: Histogramas
LaserLaser
Tamaño- FSC
Tiempo
Vol
taje
LaserLaser
Tiempo
Vol
taje
Tamaño- FSC
Representación de la información: Histogramas
12
LaserLaser
Tiempo
Vol
taje
Tamaño- FSC
Representación de la información: Histogramas
FSC
Tamaño- FSC
Representación de la información: Histogramas
LaserLaser
Tamaño/Complejidad
Tiempo
Vol
taje
Tamaño
Tiempo
Vol
taje
Complejidad
Representación de la información: Diagrama de
puntos
13
Tamaño y complejidad:
Células sanguíneas
Granulocitos
Debris Linfocitos
Monocitos
Fluorescencia
� El fluorocromo absorbe la energía de la luz incidente y
se excita
� Disipa la energía absorbida de forma prácticamente
instantánea:
� Vibración y generación de calor
� emisión de un fotón de mayor longitud de onda
(menos energético)
hλ
S0
S2
S1
Absorción Emisión
Moléculas orgánicas pequeñas.Isotiocianato de fluoresceina(FITC)
Proteínas. Ficoeritrina (PE)
Fluorocromos
14
Quantum dots
• Nanoesferas de material semiconductor: Cd+ Se o Te.
• Rodeadas de ZnS y un polímero orgánico.
• Funcionalizadas para poder unirse aanticuerpos.
Quantum dots
• Funcionan como fluorocromos. Alrecibir un fotón emiten otro de mayorlongitud de onda.
• La λ a la que emiten es proporcionalal tamaño del núcleo del materialsemiconductor.
Quantum dots
• Ventajas:
- Pico de absorción ancho: Con unláser excitamos muchos QD.
- Pico de emisión estrecho: Mejorcompensación.
- Más estables.
• Inconvenientes:
- Poca disponibilidad.
- Toxicidad: Liberan metalespesados.
- ¿Conjugación con anticuerpos?,¿marcaje intracelular?
15
Brilliant violet
• Polímeros orgánicos conductores• Ultra brillantes. Entre PE y APC.• Un solo láser (405) excita todos los BV
Cytometry Part A 81A: 456466, 2012 PK Chattopadhyay
Fluoresceina (FITC)
400 nm 600 nm 700 nm500 nm
ExcitationEmission
Inte
nsid
ad re
lativ
a
Fluorocromos
Ficoeritrina (PE)
400 nm 600 nm 700 nm
ExcitationEmission
500 nm
Inte
nsid
ad re
lativ
a
Fluorocromos
16
Fluoresceina (FITC) Ficoeritrina (PE)
400 nm 600 nm 700 nm500 nm
ExcitationEmission
Fluorocromos
Inte
nsid
ad re
lativ
a
λλλλ=488 nm
Excitación
λλλλ=520 nm
Emisión
Inmunofenotipado
λλλλ=580 nm
17
• La fluorescencia emitida por cada fluorocromo o
colorante debido a la excitación por el láser es emitida en
todas direcciones.
• Situamos el detector a 90º para minimizar interferencias.
• La especificidad de la detección está controlada por la
selección de longitudes de onda por parte de espejos y
filtros ópticos.
Láser Detector FSC
Detector de FLs(PMT3, PMT4 etc.)
EthidiumEthidium
PEPE
ciscis--Parinaric acidParinaric acid
Texas RedTexas Red
PEPE--TR Conj.TR Conj.
PIPI
FITCFITC
600 nm300 nm 500 nm 700 nm400 nm457350 532 610 632488407
Los citómetros de flujo pueden llevar incorporados diversos
láseres de forma simultanea.
18
488488
Compensación de Señales Fluorescentes
505505--520520 570570--590590
Inte
nsid
ad R
elat
iva
Inte
nsid
ad R
elat
iva
Longitud de ondaLongitud de onda
FITCPE
Células marcadassólo con FITC
Compensación de Señales Fluorescentes
Muestra compensada
F CompensadaPE = F Medida PE - % FFITC
Compensación de Señales
Fluorescentes
19
PE
FITC
SIN COMPENSAR COMPENSADA
Universidad de Purdue
Compensación de Señales Fluorescentes
Compensación de Señales Fluorescentes
Universidad de Purdue
El valor de la compensación depende de la intensidad de la señal
PE
FITC
PE
PE
FITC
• COMP BEADS: Mezcla de bolas de látex de 2 tipos:
- Recubiertas de anticuerpos anti cadena κ.
- “Desnudas”
• Al añadir cualquier anticuerpo con cadenas ligeras κ se
unirá a las partículas recubiertas y no a las desnudas.
• Preparamos tantos tubos como fluorocromos vamos a
usar y encada uno añadimos un anticuerpo con un
fluorocromo diferente
Compensación de Señales Fluorescentes
20
Compensación de Señales Fluorescentes. Comp Beads
• La compensación es correcta cuando la media de la
fluorescencia para PE es igual para las 2 poblaciones
Compensación de Señales Fluorescentes
• Fluorocromos en tándem
• El desplazamiento de λ entre absorción y emisión espequeño: Limita los fluorocromos utilizablessimultáneamente→ FLUOROCROMOS EN TANDEM
APC Cy7Láser Emisión
21
• Cuidado con los flurocromos en Tándem. El “fluorocromo
lejano” se puede excitar directamente al pasar por un láser
adecuado.
PE Cy7
Láser azul
770 nm
Láser azulLáser azul
Láser rojo
PE Cy7 770 nm
• Aumenta el número defluorocromos utilizables,pero se rompen confacilidad.
Fluorocromos en tándem
0 horas0 horas
2 horas2 horas
22,5 horas22,5 horas
S.C Bendall et al.
22
ASPECTOS PRÁCTICOS
¿Qué fluorocromo uso?
• No todos los fluorocromos son igual de “buenos”
produciendo fluorescencia.
• Rendimiento cuántico: Cuantos fotones necesita recibir un
fluorocromo para emitir uno → Determina el llamado “indice
de marcado”
D = Diferencia entre la mediana de los picos
W = 2 x SD (Desviación estandar)
Indice de marcado = D / W
CD127 PE
300 400 500 600 7000
5
10
15
20
25
30
35
40
25 mW green laser (532 nm)
100 mW blue laser (488 nm)
25 mW blue laser (488 nm)
PMT voltage
Sta
in in
dex
• Hay que elegir la combinación “mas brillante” posible, en
cualquier caso, los fluorocromos más brillantes deben
reservarse para los marcajes más débiles y debe minimizarse la
compensación .
23
AUTOFLUORESCENCIA
Espectro de absorción y emisión de NAD(P)H
• Tambien FAD, AA aromáticos, Vit A….
• Sobre todo azul-verde (FITC).
• Granulocitos, monocitos, linfocitos activados
S.C Bendall et al.
Hay vida más allá de la fluorescencia: CYTOF
Hay vida más allá de la fluorescencia: CYTOF
24
Hay vida más allá de la fluorescencia: CYTOF
• En teoría + de 100 marcajes simultáneos (contaminación y
oxidación bajan el número) sin necesidad de compensación
• Índice de Marcado peor que los fluorocromos más
brillantes pero muy parecido entre ellos.
• Vmax 1000 cels/seg. Además sólo aprovecha el 30% de
la muestra.
• No FSC/SSC, ni niveles de calcio, división celular………
¿ Que podemos medirpor citometría de flujo?
Metabolitos
Características de la citometría de flujo
-El análisis es multiparamétrico y simultáneo . - El análisis
se realiza sobre partículas individuales dentro de una
población compleja.
- El análisis se realiza a velocidades de entre 500 y 4000
partículas/segundo lo que resulta en una elevada fiabilidad
estadística (permite analizar poblaciones representadas en
baja frecuencia).
- Se pueden analizar partículas de tamaños 0,5-100 µm
(bacterias, levaduras, células eucarióticas).
25
•El análisis no permite determinar la localización de la
fluorescencia.
• En el caso de células adherentes tenemos que
despegarlas del soporte de cultivo, lo que puede alterar
su fisiología.
• Se consume muestra. La citometría convencional no
permite re-análisis de la misma.
Características de la citometría de flujo
CITOMETRÍA DE FLUJO.
INMUNOFENOTIPADO
• ¿Qué es un anticuerpo?.
• Marcaje directo extracelular. Representación de la
información: Histogramas, gráficas de puntos y densidad,
escalas.
• Otras estrategias de marcado: Marcaje intracelular, marcaje
indirecto.
• Controles en inmunofenotipado: Isotipo, biológicos y FMO.
• Bloqueo de receptores Fc
• ¿Cuánto anticuerpo uso?
26
• Se basa en la unión específica de los anticuerpos con su
antígeno correspondiente.
• Se generan anticuerpos frente a las proteínas cuya
presencia en la célula queremos determinar y se les acopla
un fluorocromo.
• Si la célula expresa la proteína el anticuerpo se une y
veremos fluorescencia asociada a esa célula
Anticuerpos
• Son glicoproteínas producidas por linfocitos B. Reconocen
con alta afinidad sustancias extrañas y activan la posterior
respuesta inmune.
• Principal Característica: Enorme diversidad.
- Recombinación somática.
- Hipermutación
- Cambio de clase.
• En proteínas reconoce zonas pequeñas (± 7 aa). Se
pueden generar varios anticuerpos misma proteína
Región variable
Región variable
Estructura de las inmunoglobulinas
α, δ, ε, γ, µκ, λ
Anticuerpos
27
Anticuerpos monoclonales.
• Cuando inmunizamos un animal con un antígeno
obtenemos una mezcla de anticuerpos contra los diferentes
epítopos→ Anticuerpo policlonal.
- Producción limitada: Necesidad de sucesivas
inmunizaciones.
• Anticuerpos monoclonales. Son producidos por un único
clon específico de linfocitos B, pertenecen a una clase y
subclase determinadas y tienen una especificidad única
frente a un antígeno determinado.
Anticuerpos
Anticuerpos
λλλλ=488 nm
Excitación
λλλλ=530 nm
Emisión
Marcaje superficial
28
Marcaje superficial
• La intensidad del marcaje es proporcional al número de
moléculas diana que hay en la superficie
Estudio monoparamétrico
Triplesnegativos
Simplespositivos
Doblespositivos
Triplespositivos
Estudio multiparamétrico
29
Representación de la información
• Gráficas bidimensionales
S.C Bendall et al. Trens in Immunology
Representación de la información
Gráficas tridimensionales Gráficas n-dimensionales
30
Representación de la información
• Diagrama de puntos • Diagrama de densidad o de contorno.
Representación de la información
Representación de la información
Escala lineal.
Escala logarítmica
31
Escala Logicle-biexponencial: Nos muestra los valoresnegativos: Los software realizan una corrección del ruido defondo (baseline) que puede hacer que ciertas partículas muypoco fluorescentes nos den un valor negativo
Representación de la información
Escala Logicle-biexponencial
Representación de la información
Estrategia de análisis
32
Estrategia de análisis
CD 95
CD
28
HY Maecker Cytometry Part A 62A:169–173 (2004)
Fluorocromosen Tándem.Falsospositivos
33
• El marcaje pude ser superficial o intracelular.
• En el caso del marcaje intracelular hay que.
- Permeabilizar la célula. Los anticuerpos no difunden
a través de la membrana celular → Detergentes
(Saponina, Tween).
- Fijar la célula para evitar que el contenido intracelular
salga al exterior → paraformaldehido, etanol.
• Comprobar que el tratamiento no afecte al marcaje.
Marcaje intracelular
Marcaje
superficial Fijación
Marcaje
intracelular
Permeabilización
Primario conjugado(directo)
Primario sin conjugar(indirecto)
Primario conjugadocon biotina
Complejo avidina-fluorocromo
Secundario conjugado(indirecto)
Estrategias de marcado
Directo Indirecto Avidina-Biotina
34
• Para realizar el marcaje simplemente se añade el anticuerpo
a la suspensión celular, se deja incubar 15-30 min. A 4º C, se
lava para eliminar el exceso de anticuerpo, se resuspende y
se lleva al citómetro
• En el caso de marcaje indirecto se hacen 2 incubaciones
consecutivas con un paso de lavado intermedio.
• Si trabajamos directamente con sangre debemos realizar un
paso final de lisis de eritrocitos sin afectar a los leucocitos.
• Si no podemos analizarlas en el momento se puede fijar las
células
Controles de isotipo.
• El anticuerpo puede unirse inespecíficamente a la
superficie celular o a las proteínas citoplasmáticas →
Falso positivo.
• Para controlar este problema se usan los controles de
isotipo: Anticuerpos de la misma clase del que usamos y
con el mismo fluorocromo pero diseñados para reconocer
moléculas que nunca están presentes en las células → el
marcaje que aparezca sólo será por uniones
inespecíficas.
Primario conjugado(directo)
Control de isotipo
Controles de isotipo
Unión específica Unión inespecífica Control de isotipo
35
Representación de la información: Controles de isotipo
CONTROLES BIOLÓGICOS
• Para que los controles de isotipo sean adecuados es
necesario que se comporten igual que los anticuerpos que
vamos a usar → Difícil de asegurar (¿concentración?
¿moléculas de fluorocromo por anticuerpo?)
• El mejor control es usar nuestro anticuerpo en unas células lo
mas parecidas posibles a las que queremos estudiar pero que
no expresen el marcador de interés→ Control biológico.
CONTROLES BIOLÓGICOS
CD8
36
Perfetto et al. Nature Review Immunology (4) 648-655, 2004
Controles FMO
• No corrigen la unión inespecífica sino la interferencia entre
fluorocromos que no elimina la compensación
•Se añaden en un tubo todos los fluorocromos menos el
“controlado”→ Fluorescence Minus One
H.T MAECKER BD Biosciences
Controles
Comparación de controles
Bloqueo de receptores Fc
• Diversos tipos de leucocitos poseen receptores que se unen a
la zona constante de los anticuerpos.
• Unen por lo tanto inespecíficamente cualquier anticuerpo que
se les añada
Receptor FcReceptor Fc
AntígenoAntígeno
Anticuerpo Anticuerpo conjugadoconjugado
37
Bloqueo de receptores Fc
• Para solucionar este problema, antes de añadir el
anticuerpo específico, se incuba la suspensión celular con
un gran exceso de anticuerpo sin marcar
• Especialmente importante si la señal fluorescente es
débil, en el caso de marcajes intensos aunque disminuye la
relación señal/ruido no es imprescindible
Receptor Fc
Antígeno
Anticuerpo conjugado
IgG (ratón)
Bloqueo de receptores Fc
ASPECTOS PRÁCTICOS
¿Cuánto anticuerpo añado?
• Si añadimos más anticuerpo tenemos más unión a la
proteína problema, pero también más unión inespecífica.
Concentración de anticuerpo
Señ
al/ r
uido
Titulación del anticuerpo:
Probar diferentes cantidades
hasta encontrar la que da la
relación señal/ruido óptima
38
Concentración de anticuerpo
Señ
al
Unión específica
Unión inespecífica.
ASPECTOS PRÁCTICOS
¿Cuánto anticuerpo añado?
• Lavar después de añadir el anticuerpo disminuye mucho la
unión inespecífica
CITOMETRÍA DE FLUJO.
ESTUDIO DE CICLO CELULAR Y PROLIFERACIÓN
• Estudio de ácidos nucleicos.
- Fluorocromos usados.
- Aplicaciones:
+ Detección de células nucleadas.
+ Discriminación de células muertas.
+ Estudio de ciclo celular. Fundamento, adquisición yeliminación de dobletes.
- Ciclo celular y BrdU
- Ciclo celular e inmunofenotipado.
• Estudios de proliferación. Número de divisiones celulares
39
• Se usan fluorocromos con las siguientes características.
- Unión estequiométrica a los ácidos nucleicos.
- Fijación estable a los mismos.
- La fluorescencia aumenta al unirse.
• Diversas especificidades: Unión a ADN y ARN, pares A-T,pares G-C.
• 2 tipos.
- Impermeables. No atraviesan la membrana plasmáticaintacta.
- Permeables. Atraviesan la membrana plasmática.
Detección de células nucleadas
Stuart T.F et al Blood 2006
• Incubamos con una sonda permeable de unión al ADN.
Entra en todas las células y tiñe aquellas que tienen
núcleo
• Interesante si trabajamos en
sangre con poblaciones
minoritarias: Elimina hematíes
y agregados plaquetarios
40
Viabilidad celular.
• Cuando la célula muere se abren poros en la membrana lo
que permite la entrada de colorantes que se unen al ADN
incapaces de atravesar la membrana intacta
Importante eliminar del
análisis las células muertas
→ Más autofluorescentes y
más unión inespecífica del
anticuerpo.
Viabilidad celular.
Vivas/muertas Marcaje inespecífico
Ciclo celular y
contenido de ADN.
G0/G1→ 2n.
S → 2n/4n.
G2/M → 4n
Ciclo Celular
41
• La cantidad de fluorescencia emitida es proporcional a la
cantidad de ADN.
• El colorante más usado es el yoduro de propidio.
• El PI tiene una elevada eficiencia cuántica y es barato, pero
se une también a RNA bicatenario (hay que tratar con RNAsa)
y tiene un espectro de emisión ancho (dificulta la posibilidad
de otros marcajes).
Ciclo Celular
PIFijación
Permeabilización
G0/G1
SG2/M
Ciclo Celular
Ciclo Celular.
Adquisición en el citómetro.
• Siempre en escala lineal: Mayor separación de los picos.
• Muy importante conseguir la mayor resolución de los picos
(bajo CV).
- Adquirir a la menor presión y velocidad de inyección
posibles.
- Adquirir el máximo número de células posible (> 10.000)
42
Yellow-W0 30 60 90 120
Yel
low
-A0
3060
9012
0
R1
PI Anchura
PI A
rea
Ciclo Celular
2n2n 4n4n 2n+2n2n+2n
Igual área pero diferente anchura del pulso.
Contenido de DNA
Tiempo
Láser
Discriminación de dobletes.
Ciclo Celular
Discriminación de dobletes
Ciclo Celular
CARIOTIPO DE FLUJO
43
G0/G1
SG2/M
G0/G1
SG2/M
• No es posible la
delimitación exacta de
las fases del ciclo
Ciclo Celular
Channels (Yellow-A)0 30 60 90 120 150
Num
ber
070
140
210
280
G0/G1
S
G2/M
• Se puede recurrir a
programas informáticos
que utilizan modelos
matemáticos para delimitar
las fases
Ciclo Celular
Channels (Yellow-A)0 30 60 90 120 150
Num
ber
040
080
012
0016
00
• Mezcla de 2 poblaciones
celulares con diferente
contenido de ADN
Ciclo Celular
44
Channels (Yellow-A)0 50 100 150 200 250
Num
ber
020
040
060
080
0 • Mezcla de poblaciones 2n y 4n
Ciclo Celular
Ciclo Celular
• Controles en ciclo celular.
Timocitos de ternera
Eritrocitos de pollo 35% delADN humano
Ciclo Celular. BrdU
• La BromodeoxiUridina es un análogo de la Timidina. Se
incorpora al ADN de aquellas células que están duplicando el
ADN.
• Añadiendo posteriormente un anticuerpo anti BrdU y un
fluorocromo que se una al ADN podemos determinar que
células están en la fase S del ciclo.
• Problema. Para que el anticuerpo llegue hasta la BrdU es
necesario desnaturalizar el ADN (Calor, DNAsas, ácidos).
Existen otros análogos de la T que no requieren este paso.
45
BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine)
Br
Br
Incubación
Desnaturalización
Ciclo Celular. BrdU
EdU (5-ethynyl-2 '-deoxyuridine)
Incubación
Ciclo Celular. EdU
Ormerod M. Basic flow cytometry
Ciclo Celular. BrdU
46
Gary Warnes. University of London
• Si añadimos BrdU al
cultivo, incubamos,
lavamos y vamos
recogiendo células a
diversos intervalos tenemos
una imagen dinámica del
ciclo
Ciclo Celular. BrdU
Ciclo Celular
• No se puede distinguir la fase G0 de la G1 (ambas 2n) y la
fase G2 de la M (ambas 4n)
• Si medimos el contenido en ARN podemos separa G0 de
G1
• Mediante inmunofenotipado de proteínas cuya expresión
cambia durante las fases del ciclo podemos discriminar G0
de G1 y G2 de M
Ciclo Celular.
Contenido de ARN
� Pyronina. Intercalante en dsNA.
- Más especificidad por dsRNA, aunque no exclusivo.
- Marca rRNA y tRNA no RNA total.
- Exc 547-560nm, emi 565-574nm.
� Naranga de acridinio.
- Mide el RNA total.
- Se excita a 488nm y emite en rojo unido al RNA y verdeunido al DNA
- Muy dependiente de las condiciones: concentración,fuerza iónica, detergentes.
47
WOODWARD et al. PNAS 2007
Ciclo Celular.
Contenido de ARN
Ormerod M. Basic flow cytometry
Ciclo Celular. Inmunofenotipado
• Diferenciación de fase G2- M
Ciclo Celular. Inmunofenotipado
Expresión de ciclinas y ciclo celular
Ormerod M. Basic flow cytometry.
48
CFSE
XX
Fluorescencia / célulaFluorescencia / célula
X / 2X / 2 X / 4X / 4
Sin dividir
Tras una división
Tras dos divisiones
Estudio del número de divisiones celulares
• Se usa una sonda que difunde a través de la membrana y
una vez en el interior de la célula se modifica, se vuelve
fluorescente y no pueda salir.
No proliferantesProliferantes
Estudio del número de divisiones celulares
• El número de ciclos distinguibles es limitado: Dilución
excesiva de la sonda.
• La fluorescencia depende del tamaño, poblaciones con
mucha dispersión del mismo dan resultados pobres.
Estudio del número de divisiones celulares
• Combinación con marcajede membrana
• Combinación con estudio de viabilidad
49
CITOMETRÍA DE FLUJO.
ESTUDIO APOPTOSIS Y MUERTE CELULAR
Apoptosis
• La apoptosis es un modo de muerte celular activo y
fisiológico en el que la célula ejecuta el programa de su
propia muerte. Regulado por Caspasas
• La necrosis es una muerte accidental debida a un estrés:
choque térmico, hipotónico, pH..
• Los métodos deben distinguirlas
Apoptosis
50
Apoptosis
Apoptosis
Apoptosis Necrosis
Grupos de células
Núcleo Condensación densade la cromatina
Agrupación irregular de la cromatina
Organelascitoplásmicas
Intactas morfológicamente
Anormales
Membrana celular Cuerpos apoptóticos Blebbing
Blebbing y pérdida de la integridad
Volumen celular Se incrementaSe reduce
En tejidos Células aisladas
Respuesta tisular Ninguna Inflamación
Diferencias entre apoptosis y necrosis
51
Apoptosis y patología.
• Aumentada:
- SIDA
-Enfermedades neurodegenerativas:
Alzeheimer, Parkinson, ELA, Retinitis
pigmentosa
- Anemia aplásica.
- Isquemia: Infarto, Accidente cerebro
vascular
- Cirrosis alcohólica
• Disminuida:
- Cancer: Linfomas foliculares, tumores
con mutación en p53, tumores
hormonodependientes (mama, próstata,
ovario)
- Enfermedades autoinmunes: LES,
Glomerulonefritis
- Virus: Herpesvirus, poxvirus,
adenovirus
Apoptosis Métodos De Análisis por
citometría
• Exposición fosfatidilserina
• Fragmentación de ADN
• Detección de caspasas activadas.
• Función mitocondrial.
• Otros: Radicales de oxígeno, cambios en la permeabilidad
de membrana, niveles de iones, Familia Bcl2, cambios en
tamaño y complejidad
PS: Fosfatidil serina
Estudio de apoptosis.Anexina V/PI
52
Anexina V
Yodu
ro d
e P
ropi
dio
10 10 10 10 100 1 2 3 4
14%
37%
1010
1010
100
12
34
Control Fármaco
10 10 10 10 100 1 2 3 4
6%
5%
1010
1010
100
12
34
15%
5%
Células vivas
Apoptosis tardía Necrosis
Apoptosis temprana
Estudio de apoptosis.Anexina V/PI
• Método sencillo, rápido y relativamente barato.
• Fácil de combinar con inmunofenotipado de membrana: La
anexina se puede marcar con el fluorocromo que queramos y
el PI se puede sustituir por otra sonda similar (7-AAD).
• Limitaciones:
- Apoptosis sin exposición de PS.
- En la necrosis puede haber marcaje de Anexina V.
Estudio de apoptosis.Anexina V/PI
Estudio de apoptosis.Anexina V/PI
VIVAS
APOPTOSIS TEMPRANA
APOPTOSIS TARDIA + ¿NECROSIS?
NECROSIS
53
Estudio de apoptosis.Fragmentación del ADN
Rotura internucleosomal
T – Tdt mediatedU – dUTP-biotinN – nickE – endL – labelling
3’-OH-ADN
TdtPoli-BrdU
Anti-BrdU-FITC
3’-OH-ADN-UTP-Brd
3’-OH-ADN
3’-OH-ADNADN3’-OH-ADN
Estudio de apoptosis.Fragmentación del ADN
• Técnica relativamente sencilla.
• Implica fijar las células.
• Existen procesos apoptoticos sin rotura internucleosomal
Estudio de apoptosis.Fragmentación del ADN
• Se puede combinar con inmunofenotipado y con estudio
del ciclo celular.
Ormerod M. Basic flow cytometry
54
0 40 80 120 160 200
G1
S
G2/M
Channels (FL2-A-PI CONTROL 24H)
3%
Con
trol
G1
S
G2/M
Channels (FL2-A-PI MITO 24H)
0 40 80 120 160 200
21%
Mito
xant
rona
0.25
µg/
mL
Estudio de apoptosis.Fragmentación del ADN
• Pico sub-diploide
Estudio de apoptosis.Activación de caspasas
• El método más directo
es usar anticuerpos
marcados contra la
forma activada de las
caspasas
Estudio de apoptosis.Activación de caspasas
• Detección de rotura de sustratos.
- Anticuerpos anti-proteínas rotas por caspasas (PARP).
- Rotura de sustratos con cambio de fluorescencia.
SUSTRATO- SUSTRATO +
• Inhibidores fluorescentes (FLICA)
CASPASA
55
Ormerod. Basic flow Cytometry
Estudio de apoptosis.Activación de caspasas
• Rotura de sustrato fluorescente
Control Estaurosporina
Estudio de apoptosis.Función mitocondrial
• La mitocondria es el mediador clave en la apoptosis
inducida por estrés celular.
• Uno de los primeros cambios que ocurre al iniciarse la
apoptosis es una pérdida del potencial de membrana
mitocondrial (Ψm).
• Existen fluorocromos cuya fluorescencia varia con Ψm
Estudio de apoptosis.Función mitocondrial
• Moléculas fluorescentes que se acumulan en la mitocondria
si Ψm está conservado, sino, salen de la mitocondria y de la
célula.
DiOC6(3)
Control KCN
Ormerod. Basic flow Cytometry
N: Vivas; D: muertas; A: apoptóticas
56
Estudio de apoptosis.Función mitocondrial
• Moléculas que cambian su fluorescencia en función de su
estado de agregación: Si Ψ2 está intacto se acumulan en la
mitocondria (alta concentración, agregados) si no salen al
citoplasma (baja concentración monómeros)
JC-1.
• Agregados: rojos.
• Monómeros: Verdes
A: Control; B: Apoptosis
• Existen otros parámetros mitocondriales que se afectan
en la apoptosis y que podemos estudiar por citometría
• Liberación cit c.
• Producción de ROS: Disfunción de la cadena respiratorio
• Apo 2.7: Anticuerpo que reacciona con una proteína
mitocondrial que aparece en membrana en la apoptosis.
muy temprano
Estudio de apoptosis.Función mitocondrial
Estudio de apoptosis.Proteínas de la familia Bcl2
• Familia de proteínas que controla la formación de poros en
la membrana mitocondrial y regula la apoptosis.- Pro apoptóticas: Bax, Bak, Bid, Bik, Bcl-Xs, Bad
- Anti apoptóticas : Bcl2, Bcl-XL, Bcl-w, Mcl-1, Brag-1, Bfl-1
Neutralidad
Supervivencia Muerte
Ratio Bcl2/Bax
57
APOPTOSIS VOLUMEN COMPLEJIDAD
inicial Disminución Aumento
tardía Disminución Disminución
NECROSIS
inicial Aumento Disminución
tardía Disminución Disminución
Cambios en el volumen yla complejidad celular
Poco específico y poco sensible: células muertas, debris,
núcleos aislados, cuerpos apoptóticos
Cambios en volumen y complejidad celular
0 64 128 192 256
064
128
192
256
SS
C
FSC
Control Fármaco
0 64 128 192 256
064
128
192
256
Cambios en la permeabilidad de la
membrana
Ormerod. Basic flow Cytometry
• A medida que aumenta la
apoptosis la membrana va
siendo mas permeable a
fluorocromos con carga como
PI, aunque no pierde totalmente
su funcionalidad.
• La cantidad de fluorocromo que entra es demasiado
pequeña para dar el máximo de fluorescencia posible
58
Formación apoptosoma
Disminución ∆ψm
Activación caspasa
Proteólisis PARP
Externalización FS
Fragmentación ADN
Cambios morfológicos
Membrana permeable
Horas aproximadas después de la inducción por anti-FAS
2 4 6 8 10
Estudio de apoptosis.Secuencia de acontecimientos.
CITOMETRÍA DE FLUJO.
ANÁLISIS FUNCIONAL.
• Producción de ROS.
• Medida de pH
• Medida de concentración intracelular de Ca2+ libre
• Potencial de membrana
• Actividad enzimática.
• Estudio de genes reporteros: Proteínas fluorescentes.
• Estudio de la “side population”.
• Estudio de componentes celulares.
• Otras aplicaciones.
59
• Se acopla un cambio de emisión a un proceso biológico:
Moléculas cuya fluorescencia cambia con pH, nivel de iones,
procesamiento por una enzima, potencial de membrana celular
o mitocondrial ….. y que se retiene en la célula.
APLICACIONESEstudios funcionales
Producción de especies reactivas de oxígeno
Dihidrorodamina 123
RODAMINA 123RODAMINA 123
HH22OO22
• Fluorocromos cuya
fluorescencia cambia
con su estado redox
Ormerod M. Basic Flow Cytometry
Producción de especies reactivas de oxígeno
• Estallido respiratorio en
neutrófilos estudiado con
dihidroetidina
60
Structure Reactive Oxygen Species Detection Reagents
H2O2 Hydrogen peroxideCarboxy-H2DCFDA ,CM-H2DCFDA ,Dihydrocalcein AMDihydrorhodamine 123 , Dihydrorhodamine 6G , H2DCFDA ,Lucigenin Luminol , RedoxSensor Red CC-1
HO• Hydroxyl radical3'-(p-Aminophenyl) fluorescein (APF), 3'-(p-Hydroxyphenyl)fluorescein (HPF), CM-H2DCFDA Proxyl fluorescamine ,TEMPO-9-AC
HOCl Hypochlorous acid Aminophenyl fluorescein (APF) , Dihydrorhodamine 123 ,Luminol
NO Nitric oxide DAF-FM , DAF-FM diacetate, DAA , 2,3-Diaminonaphthalene ,Luminol
ROO•Peroxyl radical, including bothalkylperoxyl and hydroperoxylradicals (wherein R = H)
BODIPY FL EDA, BODIPY 665/676, H2DCFDA, Carboxy-H2DCFDA,CM-H2DCFDA, DPPP, Luminol, cis-Parinaric acid, RedoxSensor RedCC-1
ONOO– Peroxynitrite anion
3'-(p-Aminophenyl) fluorescein (APF), 3'-(p-Hydroxyphenyl)fluorescein (HPF), H2DCFDA, Carboxy-H2DCFDA, CM-H2DCFDA,Coelenterazine Dihydrorhodamine 123, Dihydrorhodamine 6G,Luminol
1O2 Singlet oxygenSinglet Oxygen Sensor Green reagent, trans-1-(2'-methoxyvinyl)pyrene
•O2– Superoxide anion
Coelenterazine, Dihydroethidium, Fc OxyBURST Green assayreagent OxyBURST Green H2DCFDA SE, OxyBURST Green H2HFFBSA, Lucigenin Luminol, MCLA, MTT, NBT, RedoxSensor Red CC-1,TEMPO-9-AC, XTT
Medida del pH
• Generalmente ácidos débiles con un pKa cercano a 7 y
con un fluorescencia diferente en las formas
desprotonadas y protonadas.
Cambio en la intensidad de
fluorescencia de la fluoresceina
con el pH
Medida del pH
• Generalmente se usan
fluorocromos con distintos
picos de emisión entre la forma
protonada y desprotonada →
Medidas ratiométricas
Espectro de emisión de SNARF-1 en función del pH
61
O´Connor JE et al. IUBMIB Life. 2001
Medida del pH
• Medidas cinéticas de cambio de pH intracelular en leucocitos
tras acidificación del medio con BCEF (ratio amarillo/verde)
Medida del pH
• Método cuantitativo → Crear
curvas de calibración
6.5 7 7.5
MUESTRA
Medida del pH
62
Concentración de Ca 2+
libre intracelular
• Moléculas cuya fluorescencia varía con los niveles de Ca2+
intracelular
Cambio en la intensidad
Espectros de emisión fluo-3 yfura red en función de laconcentración de Ca 2+
Cambio en la λ de emisión
Espectro de emisión Indo-1 enfunción de la concentración deCa2+
Concentración de Ca 2+
libre intracelular
Medidas directas
Cambios en laconcentración de Ca 2+
intracelular en linfocitos,monocitos y macrófagosmedidos con Fluo 3
Medidas ratiométricas
Medida de Ca 2+ intracelular en célulasJurkatJ6 después de añadir un anticuerpoanti-CD3 con una mezcla de Fluo3 y Fura Red(ratio 525/675)
Concentración de Ca 2+
libre intracelular
63
Medida del potencial de membrana
Despolarización de Staphylococcusaureus inducida por CCCP medidacon DiOC2(3).
Polarizada
Despolarizada
Medida del potencial de membrana
• Se añade un sustrato que difunde en la célula y al ser
procesado por la enzima se vuelve fluorescente (sustrato
fluorogénico).
• Podemos medir la actividad de proteasas (caspasas),
esterasas (CFSE), oxidasas, dehidrogenasas, transferasas,
fosforilasas…….
Medida de la actividad enzimática
64
ACTIVIDAD DE ALDOLASAEstudio de la actividad de aldolasa
Con actividad enzimática Sin actividad enzimática
A
Genes reporteros, proteínas fluorescentes
Control sin transfectar Células transfectadas con GFP
Chudakov D M et al. Physiol Rev 2010;90:1103-1163
©2010 by American Physiological Society
65
Estudio de la “side population”
• Las células progenitoras presenta gran actividad de
transportadores de la familia ABC que expulsan fuera de la célula
el Hoechst 33342
Bone Marrow
Estudio de la “side population”
Hoechst Far Red
Hoe
chst
Blu
e
+ verapamil
A B
Estudio de la “side population”
• Se excita con laser UV y se mide emisión a 420 y 670 nm
66
Detección de componentes celulares
• Marcaje con rojo nilo y Syto
62 para estudiar células
nucleadas con depósitos de
lípidos neutros
Otras aplicaciones
O´Connor JE et al. IUBMIB Life. 2001
CITOMETRÍA DE FLUJO.
SEPARACIÓN CELULAR.
67
Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)
• Separación individualizada de células en función de
parámetros definidos por citometría de flujo.
• Posteriores estudios de biología molecular (RT-PCR,
FISH), clonación de líneas celulares, estudios
funcionales, etc.
Sorting Electroestático
Punto de incidencia del láser y de decisión
oooo oooo ooooIzq basura der
Transductor Vibra a una frecuencia determinada para producir separación del chorro en gotas.
o o o o oo o o o oo o o oo o o
oooooooo
Carga de la gota + Azul - rojo.
-+ Gotas cargadas son separadas en un campo electroestático ± 3000 V
o-o+
oo+
o-oo
+-
++
Drop delay
Recogida
Nozzle
68
Gota satélite
Amplitud
Frecuencia
• Se generan hasta100.000 cels/seg.
• Lo ideal es quehaya un máximo de1 célula cada 3gotas
Separación de dos poblaciones celulares
Separación de dos poblaciones celulares
69
Separación de dos poblaciones celulares
Separación de cuatro poblaciones celulares
Separación de cuatro poblaciones celulares
70
• Se pueden separar células individuales directamente en
placas de 96 pocillos.
• Se puede separar directamente en placas de 6, 12, 24
pocillos o en un porta de microscopia.
• Se puede mantener la muestra a
4 o 37º C.
• Se puede recoger la muestra a 4
o 37º C.
• El parámetro crítico es el drop delay: Tiempo que transcurre
desde que seleccionamos la célula hasta que se carga la gota
que la contiene.
• Depende de cómo se
forman las gotas → Ajustar
cada vez que hacemos una
separación.
• Separación de esferas
fluorescentes sobre un porta
• Accudrop. Sistema automatizado basado en esferas
fluorescentes. Un láser en la parte inferior del sorter nos
permite ver donde están.
71
• Recuperación-eficiencia : % de partículas sorteadas
recogidas del total de partículas que nos interesan.
• Pureza : % de partículas sorteadas recogidas que
cumplen los criterios seleccionados en función del total
sorteado.
• Si aumentamos la pureza disminuimos la
recuperación y viceversa
pureza
rendimiento
Nº deseado de células
1.00010.000
Concentración de células en la muestra
0,1%8 min1,4 h
1,0%48 sg8 min
5,0%10 sg
1,7 min
50,0%1 sg
10 sg100.000
1.000.00010.000.000
100.000.000
14 h5,8 d1,9 m1,6 a
1,4 h14 h5,8 d1,9 m
17 min2,8 h1,2 d12 d
1,7 min17 min2,8 h1,2 d
Velocidad lectura 2.000 cels/sg
¿ Y esto cuanto tarda?
72
• Sistemas de cámara abierta→ RIESGO BIOLÓGICO .
• Sistemas Caros. Tanto equipamiento como consumibles.
• Sistemas lentos. Pureza depende de cuantas
células/segundo analicemos y la resolución de la citometría
es mejor si el número de células por segundo es bajo.
• Viabilidad celular variable: Tipo celular, tiempo y presión
de sorting, medio de recogida.
Sorters hidraúlicos
� Cámara cerrada: no contaminación
� Poco complicados, baratos y adaptables
� Sistemas sin necesidad ajuste
� Facilidad de uso (similar a analizador)
� Baja velocidad de separación
� Baja viabilidad del producto
� Baja concentración celular
Emplean jeringas, energía acústica, etc.. para desviar el flujo
líquido durante algunos milisegundos y con él la célula
seleccionada.
Sorters hidraúlicos
73
Sorting de partículas grandes. BIOSORT
Nanopartículasunidas a la célula
MACS
• Magnetic activated cell sorting. Utiliza partículas
magnéticas unidas a anticuerpos
ELECTROIMÁN N S
MATRIZ
FERROMAGNÉTICA
Anticuerpo unido a nanopartícula magnética
MACS
74
FACS vs MACS: Uno o los dos?
Son dos sistemas compatibles
FACS MACSSeparación multiparamétrica
Separación por un soloparámetro
No permitenseparaciones masivas
Separan un número elevadode células.
Equipos caros, peroamortizables a medioplazo
Muy caros
Indicado para separarpoblaciones pocofrecuentes
Rápidos
CITOMETRÍA DE FLUJO.
ANÁLISIS MULTIPLEX.
• Estudio de moléculas solubles por citometría de flujo.
• El límite de detección en citometría de flujo es de 0.5 µ,
para poder estudiarlas necesitamos retenerlas en esferas
fluorescentes que se pueden detectar por el citómetro.
• La citometría nos permite estudiar diversas moléculas
simultáneamente asociando cada una a una esfera
diferente que puede distinguirse por citometría.
75
• Método realizable en cualquier citómetro aunque existen
equipos especialmente diseñados para el análisis
multiplex.
• Mezcla de beads de diferentes tamaños y con diferente
concentración de un fluorocromo que se excita con un láser rojo.
Diferenciación de las esferas
Diferenciación de las esferas
• Esferas del mismo tamaño
(5,6-6,5 µ) con una diferente
mezcla de 2 colorantes
excitados por el láser rojo
76
Matriz de microesferas coloreadas
Color 1
Color 2
Diferenciación de las esferas
Diferenciación de las esferas
Discriminador de dobletes
Elimina por tamaño restos y agregados de esferas
77
Diferenciación de las esferas
• Esferas del mismo tamaño con una
diferente mezcla de 3 colorantes
excitados por el láser rojo → Genera
500 esferas diferentes
• Las esferas se funcionalizan con diferentes moléculas
en función de lo que queramos estudiar
Multiplex
ILIL--22
ILIL--44 ILIL--1010
IFNIFN--gg
TNFTNF--alfaalfa
ILIL--55
ELISAELISA
PE
PE PE
PE
PE
PE
análisis de concentración de proteínas solubles
78
The Microsphere is a 5.6mM polystyrene bead with two fluorescent dyes incorporated into it in different ratios.
A primary antibody specific for the analyte isconjugated to the bead surface by an amine coupling reaction
The primary antibody binds to the specific analyte – no crossreactivity with other analytes occurs.
A biotinylated, analyte specific reporter antibody is added to the assay after another wash step.
After another wash step Streptavidin PE is added to the assay. The biotinylated reporter antibody binds to one of the four available sites.
In assays with high analyte numbers excess biotinylated reporter antibodies bind to the Strep-PE in a non-specific manner.
Free excess streptavidin-PE binds to the non-specifically bound biotinylated reporter antibody leading to a signal amplification.
The phycoerythrin is excited by the reporter laser and emits a fluorescence which is quantified by the Luminex reader.
The immune-complex/ microsphere is then excited by the ****** laser. The bead specific emmission is quantified by the luminex and the bead identified.
tomado de UPSTATE. Serological corporation
análisis de concentración de proteínas solubles
Laser A
Laser B
análisis de concentración de proteínas solubles
0102030405060708090
1er trim. 2do trim . 3er trim. 4to trim. Este
Oeste
Norte
Col
or a
naliz
ador
Color clasificador 1
Una vez clasificada la esfera con el primer láser, el segundo
mide la fluorescencia del fluorocromo asociado al segundo
anticuerpo que es proporcional a la cantidad de proteína en la
muestra
análisis de concentración de proteínas solubles
79
análisis de concentración de proteínas solubles
• Generando una curva de calibración podemos cuantificar la
concentración
5000 pg/ml625 pg/ml
156 pg/ml40 pg/ml0 pg/ml
312.5 pg/ml
Curva de calibraciónCurva de calibraciónCurva de calibraciónCurva de calibraciónSe genera una curva de calibración asociando la
fluorescencia medida a unas concentraciones de analito
conocidas
Curva de calibraciónCurva de calibraciónCurva de calibraciónCurva de calibración
80
Control negativoControl negativo
Por último los valores de fluorescencia obtenidos para cada
muestra se interpolan en la curva de calibración y se
calcula la concentración
MuestraMuestra
• Permite determinar hasta 500 proteínas en un solo ensayo.
• Gran ahorro:
- Económico: Equipamiento más caro que un ELISA pero se
compensa con el menor coste de los reactivos
- Tiempo
- Muestra: Con sólo 25 µl podemos determinar las 500
proteínas.
81
Aplicaciones en biología molecular
• En lugar de anticuerpo funcionalizamos las esferas con
sondas de ácidos nucleicos.
• Se puede aplicar a múltiples aplicaciones: Genotipado
(estudios de SNPs), expresión génica, concentración de
micro RNAs, reordenamientos génicos.
• Funcionalizando con sondas de ácidos nucleicos también
podemos estudiar expresión de factores de trascripción
82
Genotipado Genotipado Genotipado Genotipado
Genotipado
Genotipado
83
Genotipado
Ding C, Jin S. Methods Mol Biol. 2009
Comparación de métodos
MULTIPLEX
Cuantificación de Cuantificación de Cuantificación de Cuantificación de microRNAsmicroRNAsmicroRNAsmicroRNAs
• No necesita amplificación por PCR
Cuantificación de Cuantificación de Cuantificación de Cuantificación de microRNAsmicroRNAsmicroRNAsmicroRNAs
84
• No es necesarioconvertirlo en cDNA.
Expresión génicaExpresión génicaExpresión génicaExpresión génica
Grandes reordenamientos
Factores de Trascripción
85
Factores de Trascripción
• Sistema no basado en citometría de flujo.
• Requiere el uso de beads magnéticas.
• Equipo mas barato que los citómetros pero menos sensible
• Las partículas magnéticas
se retienen sobre un imán y
se iluminan con 2 LEDs:
Rojo y verde.
• La fluorescencia se lee con
una cámara CCD.
86