Fluorescencia extrínseca - Facultad de Ciencias,...
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Fluoróforos en bioquímica
• Fluorescencia intrínseca fluorescencia natural, propia del sistema
• Fluorescencia extrínsecaagrego a la muestra un fluoróforo externo
(sonda fluorescente)
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Fluorescencia en:
• Proteínas, fluorescencia intrínseca debido a residuos aminoacídicos aromáticos, predomina el triptofano. Además marcado con sondas fluorescentes (FITC, DNS). GFP y derivados.
• Ácidos nucleicos, sin fluorescencia intrínseca, se agregan sondas fluorescentes catiónicas planares (EtBr, DAPI) o fosfolípidos marcados
• Membranas, no fluorescentes, se agregan sondas liposolubles con baja fluorescencia en agua (DPH, ANS)
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Fluorescencia en:
• NAD(P)H
• FAD, FMN
• Piridoxal fosfato (PLP)
• Clorofilas
• Indicadores fluorescentes (pH, Na+, Cl-, Ca2+, O2)
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0.4 ns en solución1-5 ns unido a DH
4.7 ns en solución(2.3 ns FMN)0.3-1 ns unido a prot.
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Sondas fluorescentes para proteínas
DNS-Cl sensible a polaridad del entorno, fluorescencia polarizada
Fluoresceína (y Rodaminas) absorbe y emite en el visible, alto rendimiento, ε=80.000 M-1cm-1
Problema: autoquenching, fotosensible, pH
Prof. Gregorio Weber1916 - 1997
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Compuestos de B (BODIPY) absorben y emiten en el visible, alto rendimiento, ε=80.000 M-1cm-1, fotoestables, insensible al solvente y pH
http://probes.invitrogen.com/handbook/
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Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG antibody/pH 8.0.
http://probes.invitrogen.com/handbook/
No autoquenching
Fotoestable
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Sondas fluorescentes para membranas
DPH = difenil hexatrieno
LiposolubleEmisión polarizada
Ácido cis-parinárico
Ácido graso fluorescente, sensible a polaridad del solvente
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Sonda fluorescente unida al ácido graso o fosfolípido
Colesterol = no fluorescente
Análogo fluorescente del colesterol
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Sondas fluorescentes para ácidos nucleicos
Bases modificadas fluorescentes
Sondas que se unen (no covalentemente) al ADN
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Sondas que emiten en el NIR
Cianinas
Excitación en el visible con laser
No autofluorescencia
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Sondas fluorescentes para detectar bioanalitos
Desactivación por cloruro Cl-
Cambioespectralpor Ca2+
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Sondas fluorogénicas
Producto de la reacción es fluorescente – especificidad -
Formaciòn de sonda fluorescente por reacción con grupos amino
Medida de actividad enzimática por foramción de producto fluorescente
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Product Spectra - JC-1/pH 8.2
Sondas fluorescentes para medir potencial de membrana
Adipocitos cargados con JC-1
(5 µM, 37ºC, 30 min) + 10 nM FCCP.
Exc. = 488 nm Em = entre 515–545 nm y 575–625 nm.
514/529585/590
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Fluoróforos de vida media larga
• Pirenos (100 – 400 ns)
• Lantánidos (0.5 – 3 ms)
Eu (III), Tb (III)
Baja absorción (10 M-1 cm-1), se usan complejos metálicos conligandosorgáncios.
Emisión desde orbitales 4f, transición prohibida, lenta
Emisión no polarizada
• Complejo metal transición-ligando
Ru(II), Re(I), Os(II), ligando diimina
Eimisión por transferencia de carga metal-ligando, parcialmente prohibida
Emisión polarizada
τ larga, evita autofluorescencia
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GFP = Green Fluorrescent Protein
Formación espontánea del fluoróforo al plegarse
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