Estudo dos supercomplexos da cadeia respiratória de Bacillus subtilis 26 a 30 de Julho...
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Estudo dos supercomplexos da cadeia respiratória de Bacillus
subtilis
26 a 30 de Julho
Responsável: Ana
Melo
Monitores: Pedro
Sousa
Filipe
Santos
Participantes:
Carolina Camelo
Inês Santos
Magda Paiva
Sara Silva
2010
Cadeia respiratória de B. subtilis
Δ qoxB (1x)
H2O Milipore
Ferver 5 min.
1 min. a 12000 RPM
Lise celularDesnaturação DNAses
PCR de Colónias
DNA
H2O estéril
Tampão
dNTP
Primer Fw
Primer Rev
Taq Polimerase
Gel de agarose
qoxB(100 bp)
Wt (2x)
ΔqoxA (1x)
qoxA(100 bp)
Marcador gap (>100 bp)
Amplificação do gene codificante da subunidade A da citocromo c oxidase (qoxA) de B. subtilis.
WT
Colónia
Ligação do gene ao vector plasmídico (pSKEcoRV)
GTGATCCTCTTGTTCAGAGCATTTAAACCACTGATTATGCTGACTCTGCTTTCCTCCGTTTTTTTATTGGGCGGCTGCAGTCAAATCGCGGTATTGGAT
Ligação
H2O estéril
Tampão da ligase
pSKEcoRV (desfosforilado)
Produto de PCR (qoxA ou qoxB)
T4 DNA ligase22ºC
qoxA
Transformação do produto da ligação nas células de E. coli.
Produto da ligação:
pSK_qoxA
37ºC
Transformação
Ecoli XL1Blue
Incubar overnight
Colónias de bactérias com plasmídeo sem produto de ligação
Colónias de bactérias com plasmídeo com produto de ligação
NDH-2
SDH
Q
caa3
bd
aa3
bc1
cytc
Grupo prostético
Comprimento de onda
Hemo a 441
Hemo a 601
Hemo b 429
Hemo b 550
Hemo c 560
Hemo d 631
Podemos concluir que as oxidases terminais caa3 e bd da cadeia respiratória de B. subtilis estão presentes neste crescimento.
Cadeia respiratória de B. subtilis
Espectros de UV/Visível de B. subtilis
Actividade NADH:K3[Fe(CN)6] oxidorredutase= 110 nmol NADH min-1 mg-1
Actividade succinato:DCPIP oxidorredutase = 151,7 nmol DCPIP min-1 mg-1
Actividade succinato:oxigénio oxidoredutase
Após succinato 14,32 nmol min-1 mg-1
Após KCN 10,58 nmol min-1 mg-1
% (inibição) 26,12
Actividade NADH:oxigénio oxidoredutase
Após NADH 28,9 nmol min-1 mg-1
Após KCN 15,7 nmol min-1 mg-1
% (inibição) 45,7
Actividades enzimáticas
Supercomplexos identificados:
-(SDH)3
- NDH-2:(SDH)3
Massa Molecular dos complexos isolados
NDH-2 45 kDacaa3 145 kDaaa3 147 kDabc1 73 kDa
SDH 116 kDabd 218 kDa ou 90 kDa
BN-PAGE
Banda 7Bandas 2 e 6
Nota: É necessário confirmar os resultados
obtidos por Espectrometria de Massa