“ESTUDO DO METABOLISMO ENERGÉTICO DE EMBRIÕES...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO ABC CENTRO DE CIÊNCIAS HUMANAS E NATURAIS Curso de Pós-Graduação em Biotecnociência Dissertação de Mestrado Carlos Alexandre Soares “ESTUDO DO METABOLISMO ENERGÉTICO DE EMBRIÕES BOVINOS PRODUZIDOS IN VITRO E SUA RELAÇÃO COM CINÉTICA EMBRIONÁRIA” Santo André 2014
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO ABC
CENTRO DE CIÊNCIAS HUMANAS E NATURAIS
Curso de Pós-Graduação em Biotecnociência
Dissertação de Mestrado
Carlos Alexandre Soares
“ESTUDO DO METABOLISMO ENERGÉTICO DE
EMBRIÕES BOVINOS PRODUZIDOS IN VITRO E SUA
RELAÇÃO COM CINÉTICA EMBRIONÁRIA”
Santo André
2014
Curso de Pós-Graduação em Biotecnociência
Dissertação de Mestrado
Carlos Alexandre Soares
“ESTUDO DO METABOLISMO ENERGÉTICO DE
EMBRIÕES BOVINOS PRODUZIDOS IN VITRO E SUA
RELAÇÃO COM CINÉTICA EMBRIONÁRIA”
Trabalho apresentado como requisito parcial
para obtenção do título de Mestre em
Biotecnociência, sob orientação do Professor
Doutor Marcella Pecora Milazzotto.
Santo André
2014
AQUI TEM QUE COLOCAR A
FOLHA COM AS ASSINATURAS
ORIGINAIS
Este exemplar foi revisado e alterado em relação à versão original, de acordo com as
observações levantadas pela banca no dia da defesa, sob responsabilidade única do autor
e com a anuência de seu orientador.
Santo André, ____de _______________ de 2014.
Assinatura do autor: _____________________________________
Assinatura do orientador: _________________________________
Dedicatória
Dedico este trabalho a minha mãe Odilia
Maria das Graças Soares. À minha
maneira, meu cabelo continua comprido e
ainda não parei de estudar. Obrigado por
tudo.
Agradecimentos
Sem colaboração e incentivo este trabalho não poderia ter sido realizado...
Agradeço todos meus amigos e amigas que emanaram luz suficiente para
iluminar meu caminho tornando minhas mudanças simples formas de repensar a vida.
A Marcelo Anderson Nagatomo por escrever na parede do meu quarto “It's not a
coincidence”. Hoje meu lar é desenhado e colorido e tudo realmente, não é coincidência.
A Graci Marieli por ter aceitado estar do meu lado dividindo todos meus pesares
cotidianos, todas as frustrações desta minha caminhada e toda a gloria resultante. Sem
você eu não me lembraria que “Estou onde devo estar” e não teria a vida feliz que tenho.
A Kelly Annes, Thais Silva, Erika Cristina e Glaucia Alves por participarem de
todos os procedimentos diários fazendo com que, o que parecia difícil, fosse mais suave e
delicado.
A todos os alunos e professores do laboratório 502-3 da Universidade Federal do
ABC, pois vocês também fizeram parte deste caminho.
Ao programa de Pós Graduação da Universidade Federal do ABC e a
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior por concederem as
primeiras bolsas de estudo que obtive.
A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo que fomentou o
apoio financeiro ao projeto e a maior parte das bolsas de estudo que recebi.
A Universidade Federal do ABC, que se tornou minha casa, meu trabalho e
agente efetivo e insubstituível para minhas mudanças e meu aprimoramento cientifico e
humano.
Em especial, a Marcella Pecora Milazzotto, por ter acreditado em mim em
momentos onde eu mesmo não acreditei. Sem você, não sei se teria conseguido completar
esta minha jornada cientifica. Obrigado !!
“O que comumente se toma como "a realidade",
incluindo a realidade pessoal e individual, de
maneira nenhuma significa algo fixo, mas sim
algo ambíguo, não único, mas existindo muitas
realidades e cada uma compreendendo também
uma diferente consciência do ego." – LSD, My
Problem Child - Albert Hofmann
Resumo
Atualmente, diversas tecnologias vêm sendo exploradas e têm sido sugeridas
para evidenciar diferenças metabólicas entre embriões que resultem na identificação
daqueles mais aptos a gerarem prenhes. Na produção in vitro de embriões bovinos
podemos observar diferentes velocidades de desenvolvimento embrionário que
apresentam características diferencias em relação ao metabolismo energético, o que se
reflete na viabilidade destes embriões. Além disso, por se desenvolverem
diferencialmente e apresentarem características metabólicas diferentes, esses embriões
também poderão secretar e consumir diferencialmente moléculas no meio de cultivo que
serviriam como biomarcadores da viabilidade embrionária. O objetivo principal deste
trabalho foi é a identificação de biomarcadores relacionados ao metabolismo energético e
sua possível relação com a qualidade embrionária. Para isso, embriões foram
classificados, de acordo com sua cinética de clivagem, em embriões rápidos (4 ou mais
células) e embriões lentos (2 ou 3 células) às 22 horas após o início do cultivo in vitro
(40hpi). Desta forma, foi gerado dois grupos (rápido e lento) que foram avaliados nos
estágios de clivagem (40hpi), mórula (96hpi) e blastocisto (168hpi). Em cada momento
de análise os grupos foram avaliados em relação a quantidade de glicose, piruvato, lactato
e glutamato no meio de cultivo, quantidade de glicogênio intracelular e expressão dos
genes candidatos GLUT1, GLUT3, G6PD e GSK3. Como resultado embriões dos grupos
rápido e lento variaram em relação ao consumo de glutamato, piruvato e glicose no meio
de cultivo, sugerindo uma maior atividade metabólica dos embriões do grupo rápido. O
estoque de glicogênio, apesar de similar entre os grupos nas fases de clivagem e mórula,
na fase de blastocisto apenas embriões do grupo lento o apresentaram. Embriões de
desenvolvimento rápido e lento apresentam diferenças em relação ao padrão de expressão
de genes relacionados ao metabolismo energético em algumas das fases analisadas. De
acordo com os dados obtidos, nenhum dos metabolitos parece ser um biomarcador que
reflita relação com a qualidade embrionária. No entanto, os padrões encontrados
associados com dados de expressão gênica obtidos pelo nosso grupo sugerem que
embriões lentos são mais próximos do que seria o padrão in vivo.
Sumário
Revisão de literatura ............................................................................................. 1
Metabolismo energético embrionário ............................................................ 3
Glicose ........................................................................................................... 4
Lactato ........................................................................................................... 6
Piruvato ......................................................................................................... 7
Glutamato ...................................................................................................... 9
Glicogênio ................................................................................................... 10
GLUT1 e GLUT3 ........................................................................................ 11
G6PD ........................................................................................................... 13
GSK3 ........................................................................................................... 14
O metabolismo energético e a cinética de desenvolvimento ...................... 15
Objetivos .............................................................................................................. 16
Objetivo geral ................................................................................................ 16
Objetivos específicos...................................................................................... 16
Materiais e métodos ............................................................................................ 17
Delineamento experimental .......................................................................... 17
Procedimento experimental para PIV de embriões bovinos ..................... 18
Colheita e maturação in vitro de oócitos ..................................................... 18
Obtenção dos espermatozóides ................................................................... 18
Fecundação e cultivo in vitro ...................................................................... 18
Avaliação do grupo “clivado” ...................................................................... 19
Avaliação do grupo “mórula” ...................................................................... 20
Avaliação do grupo “blastocisto” ................................................................. 20
Avaliações bioquímicas ................................................................................. 21
Padronização dos kits de avaliação bioquímica. ......................................... 21
Avaliações moleculares por RT-PCR .......................................................... 27
Extração de RNA total ................................................................................ 27
Sintese de cDNA ......................................................................................... 28
PCR em tempo real...................................................................................... 28
Análise dos resultados ................................................................................... 29
Resultados ........................................................................................................... 30
Avaliações bioquímicas ................................................................................. 30
Concentração de Glicose. ............................................................................ 30
Concentração de Piruvato. ........................................................................... 31
Concentração de Lactato. ............................................................................ 32
Concentração de Glutamato. ....................................................................... 33
Concentração de Glicogênio. ...................................................................... 34
Avaliações moleculares por RT-PCR .......................................................... 35
Expressão de GLUT1 .................................................................................. 35
Expressão de GLUT3 .................................................................................. 36
Expressão de GSK3 ..................................................................................... 37
Expressão de G6PD ..................................................................................... 38
Discussão ............................................................................................................ 39
Conclusão ........................................................................................................... 45
Objetivos específicos...................................................................................... 45
Objetivo geral ................................................................................................ 45
Referências ......................................................................................................... 46
ANEXOS A ......................................................................................................... 52
ANEXO B............................................................................................................ 55
Well of the Well (WOW)............................................................................... 55
ANEXO C............................................................................................................ 57
Processamento dos dados .............................................................................. 57
1
Revisão de literatura
A pecuária corresponde hoje a mais da metade da produção agrícola em países
desenvolvidos e mais de um quarto em países em desenvolvimento. Em resposta ao
crescimento populacional e ao padrão de consumo que eleva-se com o aumento da renda,
a produção pecuária cresce mais rápido do que outros setores da agricultura. O Brasil, em
particular, é um país onde a produção animal bovina é de grande importância tendo o
segundo maior rebanho do mundo e assumindo a liderança nas exportações desde 2004.
Em 2013 as projeções para o mercado de carne bovina no Brasil indicam crescimento de
2,0% ao ano para os próximos 10 anos. Já no mesmo período o consumo da carne
crescerá 3,6% ao ano e as exportações ficarão numa média de crescimento de 2,5% ao
ano (MINISTÉRIO DA AGRICULTURA PECUÁRIA E ABASTECIMENTO, 2013).
Pela sua importância econômica, o homem tem realizado esforços para
incrementar a produtividade na exploração das espécies domésticas, e isto tem sido
verificado de diversas formas. Modificações na nutrição, instalações, manejo sanitário e
reprodutivo têm sido pesquisadas há várias décadas, mas mesmo assim, a produção
bovina ainda tem dificuldades de atingir sua eficiência máxima (BAYARD et al., 2007)
(LONERGAN; FAIR, 2008). Novas tecnologias e pesquisas inovadoras são necessárias
visando o melhoramento genético e o aumento de produtividade e, neste cenário, um dos
enfoques tecnológicos mais promissores é a técnica de produção in vitro de embriões
(PIV). Com o advento da aspiração folicular in vivo e o aprimoramento das condições de
cultivo in vitro há alguns anos tornou-se viável a aplicação da PIV em escala comercial
(BAYARD et al., 2007). Em 2013 o número de embriões PIV transferidos foi de 443.533
em todo o mundo, levando ao aumento na PIV global pelo sexto ano consecutivo. O
Brasil mais uma vez liderou a produção e transferência de embriões PIV já que, sozinho,
2
foi responsável por 79% (349.171) das transferências PIV mundiais no período(GEORGE
PERRY, 2013).
Apesar destes números, vários anos de pesquisa se passaram desde o início das
técnicas de PIV e, mesmo assim, os índices se mostram aquém dos desejáveis para
sistemas de produção. A proporção de oócitos que chegam à fase de blastocisto
transferível é raramente superior a 40% e os que chegam, muitas vezes, estão
comprometidos em termos de qualidade e competência (BAYARD et al., 2007;
LONERGAN; FAIR, 2008). Desta forma, para o aumento da eficiência da PIV faz-se
necessário o desenvolvimento de tecnologias que apontem para o aperfeiçoamento e
simplificação das condições de cultivo durante as diferentes etapas do processo. Assim,
ainda hoje, as pesquisa visando o incremento dos meios e sistemas de cultivo
permanecem de fundamental importância. Paralelamente a isso, a identificação de
embriões com maior potencial de desenvolvimento in vitro, bem como a maior
capacidade de estabelecer gestação, ainda permanece um desafio. Neste sentido,
avaliações complementares aos dados de morfologia e clivagem embrionárias vêm sendo
desenvolvidas e o metabolismo energético tem se tornado um potencial candidato como
identificador de embriões de melhor qualidade. Entre as avaliações surgidas relacionadas
ao metabolismo energético podemos citar níveis de glicose, lactato, piruvato e
aminoácidos no meio de cultura de embriões PIV; o consumo de oxigênio pelo embrião,
o padrão genômico, transcriptômico, proteômico e metabolômico (BERMEJO-
ALVAREZ et al., 2011; GARCIA-HERREROS et al., 2012; HEMMINGS; LEESE;
PICTON, 2012; LEESE, 2012; MUÑOZ et al., 2013; STURMEY et al., 2010).
3
Metabolismo energético embrionário
É sabido que embriões utilizam duas vias principais para geração de ATP
essenciais para o metabolismo celular: a glicólise anaeróbica e a glicose aeróbica, sendo a
primeira delas encontrada predominante nos embriões em fase inicial de pré-implantação
(LEESE, 2012; TAKAHASHI; FIRST, 1992). Como a maioria das células de mamíferos,
este ATP é obtido predominantemente pela fosforilação oxidativa, inicialmente a partir
de piruvato, lactato e aminoácidos e posteriormente há uma maior contribuição glicose
pela glicólise durante a compactação e blastulação (LONERGAN; FAIR, 2014).
Além da via glicolitica a glicose pode ser direcionada para a via das pentoses
fosfato (PPP) que tem como objetivo a geração de NADPH e ribose-5-fosfato para a
síntese de nucleotídeos (GARCIA-HERREROS et al., 2012; RIEGER, 1992; TIFFIN et
al., 1991). Outro direcionamento para a glicose pode ser a síntese de glicogênio que
servirá de reserva podendo ser rapidamente mobilizado para atender a necessidade de
glicose em caso de necessidades energéticas (GARCIA-HERREROS et al., 2012;
NELSON; COX, 2008).
A figura 1 representa o modelo esquemático da via do metabolismo energético
em embriões bovinos. Em destaque estão aquelas consideradas principais marcadores do
potencial de desenvolvimento embrionário que serão descritas detalhadamente a seguir.
4
Figura 1 – Representação esquemática da via do metabolismo energético em embriões bovinos. O modelo proposto envolve a GSK-3 e G6PDH regulando passos das vias do metabolismo energético. A glicose pode ser direcionada a via glicolítica, a via da pentose fosfato ou a via glicogênica. Em verde estão as moléculas e em vermelho os genes que são analisados neste trabalho.
Glicose
A glicose é o monossacarídeo mais importante na biologia, sendo utilizada como
fonte de energia e intermediário metabólico. Ela se apresenta como um cristal sólido de
formula molecular C6H12O6, que pode estar ligada a uma cadeia de carboidratos mais
complexa formando frutose, galactose, sacarose, maltose e celulose entre outros
(NELSON; COX, 2008). A glicose é o metabolito central do metabolismo energético e
tanto piruvato quanto lactato tem relação direta com suas taxas de consumo pelas vias
glicoliticas embrionárias (NELSON; COX, 2008).
De modo geral, depois de entrar nas células embrionárias através de
transportadores específicos (GLUTs), a glicose pode ser metabolizada pela via glicolítica
5
ou pode entrar na via da pentose fosfato. Uma vez dentro do citoplasma, e sendo
direcionada para a glicólise, ela gera piruvato, o qual pode ser transformado em lactato ou
a acetil-CoA, que por sua vez podem ser ainda metabolizados pela ciclo de ácido
tricarboxilico e a via de fosforilação oxidativa (HUMPHERSON; LEESE; STURMEY,
2005; RIEGER; LOSKUTOFF; BETTERIDGE, 1992; RIEGER, 1992).
Apesar da glicose ser um importante metabólito para o desenvolvimento
embrionário, seu consumo varia de acordo com estágio de desenvolvimento e o sexo do
embrião. Em relação ao estágio de desenvolvimento, sabe-se que embriões de
camundongos em estágios anteriores a 8 células não são capazes de utilizar glicose como
fonte de energia principal, desta forma a produção de energia durante o desenvolvimento
embrionário inicial fica a cargo do uso de lactato e piruvato (BIGGERS;
WHITTINGHAN; DONAHUE, 1967; LANE; GARDNER, 2000; LEESE, 2012). Assim
a via glicolítica contribui pouco para a produção de ATP já que a maior parte desta
glicose é convertida em lactato que é uma fonte ineficaz da produção de ATP, tendo a
glicólise uma contribuição de apenas 15% na sua geração em bovinos até o estágio de
mórula (LEESE, 2012; LOPES et al., 2007). Embriões bovinos cultivados em meio de
cultura definido podem apresentar menores taxas de glicólise em comparação com
aqueles cultivados com soro fetal bovino e os eventos que ocorrem entre as primeiras
clivagens e o estágio de blastocisto podem determinar a qualidade do blastocisto
(KRISHER; LANE; BAVISTER, 1999; RIZOS et al., 2002) Em relação ao sexo, em
bovinos, embriões do sexo masculino parecem clivar mais rapidamente quando
cultivados em meio contendo glicose e o metabolismo total da glicose se mostra o dobro
em machos por conta deste desenvolvimento (RHEINGANTZ et al., 2004).
6
Na transição de mórula para blastocisto a capacidade de metabolizar glicose
aumenta tornando-se esta a principal fonte de energia e de carbono para o embrião,
inclusive em humanos, e este consumo parece refletir de maneira mais específica a
viabilidade e o potencial de desenvolvimento dos embriões (CONAGHAN et al., 1993a;
DEVREKER; ENGLERT, 2000). Foi descrito que embriões de camundongo que
apresentavam maior consumo de glicose avaliado no meio de cultivo apresentavam maior
potencial de estabelecerem prenhez após a transferência embrionária. Da mesma forma, o
maior consumo de glicose em embriões de humanos foi relatado naqueles que chegaram a
blastocisto com melhor morfologia (GARDNER et al., 2001).
Assim, as concentrações de glicose no meio de cultivo podem influenciar
diversas respostas embrionárias como por exemplo a proporção entre os sexos, a
qualidade dos blastocistos e produção de lactato que pode sofrer alterações em meios com
baixa concentração de glicose (CONAGHAN et al., 1993a, 1993b; ECKERT et al.,
1998).
Lactato
Lactato é uma molécula orgânica de função mista (ácido carboxílico e álcool)
que apresenta fórmula molecular C3H6O3. Ele é produzido naturalmente em tecidos
animais e pode ser encontrado no tecido muscular, no sangue e em vários órgãos pois é
utilizado como fonte de energia. Por conta de seu caráter energético, seus níveis estão
sempre relacionado ao “status” do metabolismo energético, porem em situações
patológicas severas os níveis deste metabolito podem sofrer grandes alterações
(NELSON; COX, 2008).
De modo geral, lactato utilizado pelas células embrionárias pode ser adquirido
diretamente do meio de cultivo por transportadores de membrana MCT1 que mantem sua
7
expressão na presença de glicose e transportam lactato para o citosol através da
membrana plasmática por um processo reversível (HALESTRAP; PRICE, 1999;
JANSEN et al., 2006; NELSON; COX, 2008). Outro fator que pode disponibilizar lactato
para as células é a interconversão promovida pela lactato desidrogenase entre piruvato e
lactato fazendo seus níveis aumentarem no citosol (NELSON; COX, 2008). Diferenças
encontradas na utilização de piruvato ou lactato nos diferentes estágios do
desenvolvimento se devem a diferenças na regulação de lactato desidrogenase (LANE;
GARDNER, 2000). Esse fato faz com que lactato e piruvato tenham uma relação estreita
fazendo com que o consumo de lactato varie o longo do desenvolvimento do embrião,
sendo requerido principalmente até o estágio de mórula, onde há a ativação do genoma
embrionário e a glicose passa a ter um papel maior na geração de energia (LEESE, 2012;
THOMPSON, 2000; THOMPSON et al., 2000). Em embriões bovinos PIV pode-se
encontrar uma produção de até o dobro de lactato em relação a embriões produzidos in
vivo em resposta ao estresse das condições de cultura (KHURANA; NIEMANN, 2000a).
Em estudos com embriões de rato foi observada uma correlação entre piruvato e lactato,
ocorrendo uma diminuição da oxidação do piruvato na presença de lactato no meio de
cultura nos estágios iniciais de desenvolvimento embrionário (LANE; GARDNER,
2000).
Piruvato
O piruvato é um α-cetoácido que apresenta formula molecular C3H4O3,
originado ao fim da glicólise, pela interconversão de lactato a piruvato ou pela
degradação dos aminoácidos alanina, cisteína, glicina, serina, treonina e triptofano. Em
mamíferos ele pode seguir duas vias carbólicas para geração de energia, a via aeróbia e a
via anaeróbica (NELSON; COX, 2008).
8
O piruvato como metabolito energético na célula embrionária pode ser fornecido
do meio de cultivo ou ser metabolizado a partir da glicólise. A via de Embden Meyerhof
da glicólise anaeróbia resumidamente converte glicose a glicose-6-fosfato que é
convertida a frutose-6-fosfato que subsequentemente é dividida em duas moléculas. Uma
destas moléculas é o gliceraldeido-3-fosfato que passa por uma cascata de reações
bioquímicas até finalmente produzir 2 moléculas de piruvato (NELSON; COX, 2008;
RIEGER, 1992). Essas moléculas são então convertidas em acetil-CoA e entram no ciclo
do ácido tricarboxílico, no interior da mitocôndria, dando origem a moléculas de ATP
através do fosforilação oxidativa (LEESE, 2012; THOMPSON, 2000; THOMPSON et
al., 2000).
De modo geral, o piruvato pode entrar na célula embrionária através de
transportadores de membrana MCT2 específicos para piruvato (HALESTRAP; PRICE,
1999; JANSEN et al., 2006; NELSON; COX, 2008). Uma vez dentro do citoplasma, ele é
direcionado ao ciclo do ácido tricarboxilico e posteriormente a fosforilação oxidativa.
Desta forma, embriões ao longo do desenvolvimento pré-implantação são dependentes da
fosforilação oxidativa através da oxidação de ácidos aminados de piruvato para a geração
de ATP. De fato o piruvato é a principal fonte de energia nos embriões mamíferos até a
ativação embrionária (GARDNER et al., 2011a, 2011b; LONERGAN; FAIR, 2014;
TAKAHASHI; FIRST, 1992).
O consumo de piruvato pode ser um alvo para predizer a qualidade embrionária
em mamíferos pois o maior consumo pode estar diretamente relacionado ao
desenvolvimento a blastocisto podendo haver também relação entre o consumo de
piruvato durante as primeiras clivagens, viabilidade embrionária e o potencial de
estabelecimento de prenhez (CONAGHAN et al., 1993a, 1993b; GARDNER et al.,
9
2001). No entanto, apesar de ser o substrato energético central durante as primeiras
clivagens na maioria dos mamíferos em que os requisitos de fonte de energia já foram
examinados, ele não é obrigatório para todas as espécies, como por exemplo em suínos
(LEESE, 2012; STURMEY; LEESE, 2003). Desta forma ainda permanece inconclusivo
se piruvato pode ser um biomarcador de viabilidade embrionária em bovinos PIV.
Glutamato
O glutamato ou ácido glutâmico é um aminoácido não essencial que possui
grupo R carregado negativamente. Apesar de ser um monômero constituinte de proteínas
ele pode ser também um neurotransmissor que tem ação no sistema nervoso central
(NELSON; COX, 2008). Outro papel importante do glutamato se deve ao metabolismo
energético, pois além do piruvato, o glutamato pode ser transportado para o citosol e em
seguida, através da glutamato desidrogenase, pode ser convertido a α-cetoglutarato
entrando diretamente no ciclo do ácido tricarboxilico podendo então gerar energia a partir
da fosforilação oxidativa (HUMPHERSON; LEESE; STURMEY, 2005).
O glutamato na célula embrionária pode ser fornecido do meio de cultivo, porem
autores relatam que até o estágio de mórula o consumo de glutamina é alto e envolve a
transferência de um grupo amina (transaminação) de glutamina a frutose, para formar a
glucosamina-6-fosfato e glutamato podendo, desta forma, aumentar seus níveis
intracelulares (RIEGER; LOSKUTOFF; BETTERIDGE, 1992; RIEGER, 1992).
O consumo de glutamato também varia o longo do desenvolvimento do embrião
e até o estágio de 8 células. Em embriões bovinos PIV foi relatado um perfil de secreção
para 21 aminoácidos incluindo o glutamato. A partir do estágio de mórula eles
10
apresentam perfil de absorção para 15 aminoácidos incluindo glutamato (LI et al., 2006).
Quando cultivados in vitro, os embriões femininos podem consumir mais arginina,
metionina e glutamato enquanto embriões macho apresentaram maior consumo de
fenilalanina, tirosina e valina. Estas diferenças tendem a desaparecer quando observadas
no estágio de blastocisto expandido (STURMEY et al., 2010). Já embriões de rato que
foram coletados por lavagem uterina e cultivados em meio contendo aminoácidos
apresentam no dia 4, sete aminoácidos esgotados a taxas significativamente maiores que
zero (aspartato , arginina , glicina , alanina , isoleucina , leucina e lisina). Porem, no dia 5
nove aminoácidos são esgotadas em taxas significativas (aspartato, glutamato,
asparagina, tirosina, metionina, valina, fenilalanina, isoleucina e leucina). Desta forma
aspartato, glutamato, arginina, isoleucina e leucina parecem ser os aminoácidos mais
importantes procurados pelos embriões em ambos os dias testados (LAMB; LEESE,
1994).
Em embriões bovinos PIV foi observado um pico de produção de glutamato no
dia 14 após a inseminação e nos dias 15 e 16 este pico de produção diminui (MORRIS et
al., 2002). Apesar de toda a relação entre o glutamato e o metabolismo energético ainda
parece inconclusivo se suas concentrações podem indicar uma maior viabilidade
embrionária e por isso ainda não se pode dizer se as concentrações de glutamato em meio
de cultura em determinados estágios embrionários poderiam ser um biomarcador em
embriões bovinos PIV.
Glicogênio
O glicogênio é um polissacaridio que é a principal reserva energética da células
animais sendo formado por subunidades de glicose ligadas por meio de ligações α1 → 4
11
com α1→6 nas ramificações (NELSON; COX, 2008). Desta forma, posteriormente a
glicose como fonte de energia, o glicogênio é o substrato metabólico mais importante,
funcionando para o armazenamento de energia de longo prazo podendo ser rapidamente
mobilizado para atender a uma súbita necessidade de glicose em caso de necessidades
energéticas celulares (GARCIA-HERREROS et al., 2012; NELSON; COX, 2008). Os
estoques celulares de glicogênio e sua regulação são feitos em conjunto pelas glicogênio
sintase quinase 3 (GSK3) e glicogênio sintetase que é fosforilada pela GSK3 (FORDE;
DALE, 2007; NELSON; COX, 2008).
Em embriões de rato no quinto dia o glicogênio encontra-se em grânulos
confinados ao trofoblasto. Quando a implantação começa, no entanto, a quantidade deste
metabolito aumenta consideravelmente, até que seja encontrado nas células da massa
celular interna (CHRISTIE, 1966). Neste mesmo tipo de embrião foi relatado que, após a
fase de blastocisto, os níveis de glicogênio tendem a cair como forma de manter os niveis
necessários de glicose para o período (HOUGHTON et al., 1996).
Apesar dos trabalhos em embriões de rato observarem relações do glicogênio no
desenvolvimento embrionário ainda existe muito pouca informação atualmente sobre as
vias de transdução de glicogênio durante o desenvolvimento de embriões e praticamente
nenhuma informação é encontrada sobre os estoques celulares nos diferentes estágios
embrionários em bovinos PIV (GARCIA-HERREROS et al., 2012).
GLUT1 e GLUT3
Em 1985 o primeiro transportador de glicose, o GLUT1, foi caracterizado por
clonagem molecular (MUECKLER et al., 1985). Já em 1988 foi clonado a terceira
12
proteína da família de transportadores de glicose da membrana celular, a GLUT3
(KAYANOS et al., 1988). Essas proteínas pertencem a família das GLUTs, com 14
membros, que são responsáveis pelo transporte facilitado de hexoses através das
membranas plasmáticas indo na direção imposta pelo gradiente eletroquímico. A
característica estrutural comum dessas proteínas é a presença de 12 domínios
transmembranares, com grupos amino e carboxi-terminal voltados ao citosol (ULDRY;
THORENS, 2004). Outra característica importante para as GLUTs é que sua expressão é
relatada em diversos tipos celulares, com GLUT1 expresso em quase todos os tecidos
com diferentes níveis de expressão em diferentes tipos de células (ULDRY; THORENS,
2004).
Apesar de serem da mesma família as diversas GLUTs tem características que as
diferenciam sendo que entre GLUT1 e GLUT3 essa diferenciação parece residir em suas
afinidades pelo substrato, já que GLUT1 possui Km [20.162.9 mM for 3-OMG (10)] e
GLUT3 Km [10.661.3 mM for 3-OMG (10)]. Desta forma, GLUT3 pode transportar
glicose com maior velocidade se comparado com GLUT1 (PANTALEON et al., 1997).
Este fato foi o que impulsionou a descoberta da expressão de GLUT3 em embriões
murinos feita por Pantaleon et al em 1997 verificando que a expressão de seus mRNAs se
dá no estágio de 4 células e a expressão de proteína no estágio de 8 células
correlacionando essa expressão com a compactação e a mudança de preferência
metabólica a favor da glicose ao invés do piruvato. Além disso, a distribuição de GLUT3
em membranas do trofectoderma é responsável pela absorção de glicose do meio externo
que, em combinação com o expressão basolateral de GLUT1 fornece glicose para o
desenvolvimento embrionário (PANTALEON; KAYE, 1998).
13
Em embriões bovinos, a expressão de GLUT1 e G6PD foi correlacionada com as
taxas de respiração dos blastocistos indicando que, naqueles metabolicamente ativos, a
captação de oxigênio e glicose são aumentadas de forma conjunta sugerindo que a
expressão dos genes está envolvida na captação do oxigênio exigida para a produção de
ATP nesta fase (LOPES et al., 2007).
G6PD
O gene que codifica a Glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD) está ligado ao
cromossomo X e codifica a enzima que limitará a taxa da via PPP, que está diretamente
ligada ao metabolismo da glicose-6-fosfato. A PPP é ativada durante o desenvolvimento
celular para gerar o NADPH para a biossíntese de esteroides e ácidos graxos além de
fornecer ribose-5-fosfato para a síntese de nucleotídeos e ácidos nucléicos (GARCIA-
HERREROS et al., 2012; RIEGER, 1992; TIFFIN et al., 1991). Este gene é descrito
como o condutor da geração de NADPH para a manutenção do estado redox celular (
HARVEY; KIND; THOMPSON, 2002; NICOL et al., 2000).
Em geral os estudos relacionados ao gene G6PD em embriões sempre se
relacionam a fatores ligados ao sexo e pouco literatura é encontrada fora deste foco. A
expressão de G6PD em embriões bovinos PIV não difere entre machos e fêmeas no
momento da clivagem, porem na fase de blastocisto fêmeas tem expressão superior em
relação aos machos. Além disso, a quantidade relativa de G6PD, em embriões com
tempos de clivagem diferentes, mostrou que embriões clivados em 27 horas e blastocistos
provenientes desses embriões tem maior expressão desse gene quando comparados com o
grupo clivado em 33 horas (LONERGAN et al., 2000). Em outro estudo comparando
embriões bovinos PIV, in vivo e partenogenéticos os níveis de transcritos para G6PD
14
foram significativamente aumentados em blastocistos PIV em comparação com os outros
grupos (WRENZYCKI et al., 2002).
GSK3
A glicogênio sintase quinase 3 regula um conjunto diversificado de funções
celulares, incluindo a síntese de proteínas, a proliferação celular, a diferenciação celular,
a apoptose, a dinâmica dos microtúbulos e motilidade celular (FRAME; COHEN, 2001).
Ela é altamente conservada evolutivamente tendo duas isoformas, GSK-3α e GSK-3β,
expressas em tecidos de mamíferos. Estas isoformas partilham 97% de semelhança de
sequências dentro do seu domínio catalítico de quinase, mas diferem significativamente
fora desta região (WOODGETT, 1990). Em oocitos e células do cúmulos de bovinos foi
descrita a presença de GSK3 antes da ativação genômica possivelmente de origem
materna como regulador da meiose, em particular a transição entre metáfase I e metáfase
II (UZBEKOVA et al., 2009)
A GSK3 foi originalmente identificada pelo seu papel como regulador negativo
da síntese de glicogênio. Na ausência de insulina, o metabolismo da enzima glicogênio
sintase é inibido pela GSK3 que fosforila resíduos da caseína-quinase II que por sua vez
inibe a glicogênio sintase (FORDE; DALE, 2007). Outra proteína que pode ser
fosforilada por GSK3 é a b-catenina que após ser fosforilada é ubiquitinada e levada a
degradação por proteosomos (ABERLE et al., 1997). Porem, quando GSK3 é fosforilada
a b-catenina se transloca para o núcleo e estimula a transcrição dos genes da via Wnt
existindo uma correlação entre uma regulação correta desta via e desenvolvimento
normal do embrião (FORDE; DALE, 2007). Assim, embriões que se desenvolvem após o
estágio de 16 células mostram uma distribuição adequada de b-catenina em todos os
blastômeros e morfologia adequada (MODINA et al., 2007).
15
O metabolismo energético e a cinética de desenvolvimento
Embriocinética é a área de estudo que compreende a cinética do desenvolvimento
embrionário de diversas espécies. Atualmente, a morfocinética embrionária tem proposto
que o tempo de divisões das células embrionárias podem predizer inclusive o potencial de
desenvolvimento e a probabilidade de um embrião ser competente no estabelecimento da
prenhez. De fato, em humanos foi descrito que embriões que clivam primeiro (2 células a
25 - 27h pós inseminação ou ICSI) apresentam maior taxa de gestação após a
transferência do que aqueles que não clivaram neste período(FENWICK et al., 2002;
SALUMETS, 2003). Em estudos de time-lapse também se correlacionou a capacidade de
um embrião em gerar gravidez com alguns intervalos específicos do ciclo celular e
morfologia blastômeros (Dr. David Gardner, comunicação pessoal).
Estudos tem sugerido a morfocinética também como marcador metabólico em
diversas espécies como rato, búfalo, bovinos e (ISOM et al., 2012; LEESE, 2012).
Baummann e colaboradores (2007) propuseram que um embrião metabolicamente mais
ativo pode ser um sinal de danos no DNA que levam a ativação prematura do genoma e
diminuição de qualidade do embrião. Além disso, Leese e colaboradores (2002) também
propuseram que os embriões mais viáveis são os que apresentam menor metabolismo,
menor índice glicolítico, menor turnover de aminoácidos e altos níveis de enzimas anti-
oxidantes. Estas características são sugeridas como sendo derivadas do oócito, uma vez
que durante as primeiras divisões (usadas para a classificação da cinética) o embrião
utiliza principalmente o estoque materno de mRNAs e proteínas (ZENG; SCHULTZ,
2005).
Com base no exposto, foi formulada a seguinte hipótese para embriões bovinos
PIV:
16
Embriões de desenvolvimento rápido e lento apresentam características
diferencias em relação ao metabolismo energético, o que se reflete na viabilidade
embrionária. Além disso, por se desenvolverem diferencialmente e apresentarem
características metabólicas diferentes, esses embriões também secretarão e consumirão
diferencialmente moléculas no meio de cultivo que poderão servir como biomarcadores
da viabilidade embrionária.
Objetivos
Objetivo geral
O objetivo principal deste projeto é a identificação de biomarcadores relacionados
ao metabolismo energético e sua possível relação com a qualidade embrionária.
Objetivos específicos
- Caracterizar os padrões de consumo de glicose, lactato, piruvato e glutamato ao
longo do cultivo de embriões bovino PIV.
- Quantificar o estoque de glicogênio celular ao longo do cultivo de embriões
bovino PIV.
- Quantificar os transcritos de genes ligados ao metabolismo energético
embrionário em bovinos.
- Correlacionar estes padrões com a cinética de desenvolvimento embrionário.
17
Materiais e métodos
Delineamento experimental
Os experimentos foram desenvolvidos no Laboratório de Biologia Celular e
Molecular do Centro de Ciências Naturais e Humanas da Universidade Federal do ABC e
seguiram o seguinte delineamento experimental (Figura 2).
Figura 2 – Delineamento experimental. Embriões bovinos foram produzidos in vitro e cultivados individualmente. Às 40hpi foram classificados em rápidos (4 células) e lentos (2 ou 3 células), gerando dois grupos que foram avaliados nos seguintes estádios: clivagem (40hpi), mórula (96hpi) e blastocisto (168hpi). Em cada momento de análise os grupos foram avaliados em relação a: quantidade de glicose, piruvato, lactato e glutamato no meio de cultivo, quantidade de glicogenio intracelular e expressão dos genes candidatos GLUT1, GLUT3, G6PD e GSK3.
18
Procedimento experimental para PIV de embriões bovinos
Colheita e maturação in vitro de oócitos
Os oócitos foram colhidos de ovários obtidos em abatedouro comercial por
aspiração folicular com auxílio de seringa e agulha. No laboratório, os complexos
cumulus oócito foram recuperados e selecionados para posterior maturação in vitro
(MIV). Para a MIV, após a seleção, os oócitos foram lavados três vezes no meio Pré-MIV
(Anexo A) e três vezes no meio MIV(Anexo A), sendo em seguida colocados para MIV
em gotas de 90 µL do meio de maturação, sob óleo mineral. A maturação foi realizada
em incubadora a 38,5°C; 5% de CO2 em ar e alta umidade por 24 horas.
Obtenção dos espermatozóides
Palhetas de sêmen de, no mínimo, três touros foram descongeladas em banho-
maria a 37ºC, durante 30 segundos e seu conteúdo centrifugado em gradiente Percoll
(45% e 90% - Percolzinho – Anexo A) para separar os espermatozóides móveis, remoção
do diluidor e do plasma seminal, além da separação de células não espermáticas. O
sobrenadante foi descartado e foi feita avaliação da motilidade e concentração
espermática por microscopia ótica, assim os espermatozóides vivos foram diluídos em
meio TL Sêmen (Anexo A) na concentração de 1x106 espermatozóides/mL.
Fecundação e cultivo in vitro
Os oócitos maturados foram fecundados in vitro em microgotas de 90 µL do
meio FIV gota (Anexo A) (PARRISH et al., 1988). Para a inseminação, 4µL do sêmen
preparado foram adicionados às gotas (30 oócitos/gota) que foram cobertas com óleo
mineral, onde permaneceram em atmosfera com 5% de CO2 em ar, 38,5°C e alta umidade
19
por 18 horas. Após este período, os embriões foram desnudados com auxílio de
micropipeta e transferidos individualmente para microgotas de 20µL de meio de cultivo
Meio 1 (Anexo A) em sistema individual well of the well (WOW) (Anexo B). Apos 21h
de cultivo, o meio foi trocado para meio de cultivo Meio 2 (Anexo A) e cultivados em
estufa a 38,5°C, 5% de CO2 em ar e alta umidade onde permanecem até o momento da
coleta das amostras.
Avaliação do grupo “clivado”
Para a determinação dos grupos, a clivagem embrionária foi avaliada 22 horas
após o início da CIV (40hpi). Neste momento foram definidos os embriões dos grupos
“clivado rápido” (4 ou mais células) e “clivado lento” (2 ou 3 células). Embriões com
uma célula foram posteriormente avaliados para comporem o índice total de clivagem, no
entanto não foram usados para avaliações. Dessa forma, foram obtidos os dados de
clivagem total (numero total de clivados/ numero total de oócitos), clivados lento
(numero de clivados lento/ numero total de oócitos) e clivados rápido (numero de
clivados rápido/ numero total de oócitos). Neste momento, parte dos embriões de cada
grupo foi retirada do cultivo e armazenada a -80 ºC para quantificação de glicogênio. Os
meios de cultivos referentes aos embriões retirados dos cultivos foram identificados e
transferidos para criotubos, permanecendo congelados a -80 ºC até o momento das
análises bioquímicas. O restante dos embriões permaneceu em cultivo para retiradas
amostrais dos próximos estágios.
20
Avaliação do grupo “mórula”
Para a esta fase do experimento, após 96 horas do início do CIV (96hpi) os
embriões que permaneceram no cultivo foram novamente avaliados. Aqueles que
atingiram o estágio de mórula “mórula rápido” (mórulas derivadas do grupo “clivado
rápido”)e “mórula lento” (mórulas derivadas do grupo “clivado lento”). Neste momento,
parte dos embriões de cada novo grupo foi retirada do cultivo e armazenada a -80 ºC para
quantificação de glicogênio. Os meios de cultivos referentes aos embriões retirados dos
cultivos foram identificados e transferidos para criotubos, permanecendo congelados a -
80 ºC até o momento das análises bioquímicas. O restante dos embriões permaneceu em
cultivo para retiradas amostrais do próximo estágio avaliado.
Avaliação do grupo “blastocisto”
Para esta fase do experimento, após 168 horas do início do CIV (168hpi – dia 7)
os embriões que permaneceram no cultivo foram novamente avaliados. Aqueles que
estavam no estágio de blastocisto inicial ou posterior foram classificados como
“blastocisto rápido” (blastocistos derivados do grupo de clivagem rápida) e “blastocisto
lento” (blastocistos derivados do grupo de clivagem lenta). Neste momento, parte dos
embriões de cada novo grupo foi retirada do cultivo e armazenada a -80 ºC para
quantificação de glicogênio. Os meios de cultivos referentes aos embriões retirados dos
cultivos foram identificados e transferidos para criotubos, permanecendo congelados a -
80 ºC até o momento das análises bioquímicas. Para as avaliações moleculares neste
estágio foi adicionado um grupo de embriões in vivo adiquiridos de uma central
comercial.
21
Avaliações bioquímicas
O concentração no meio cultivo de glicose, piruvato, lactato e glutamato, além
da concentração do glicogênio dos embriões foi avaliada individualmente por kits
comerciais. As avaliações são baseadas em reações enzimáticas com detecção realizada
por fluorimetria. Para o metabolismo da glicose e glutamato foram usados os kits
Amplex® Red Glucose/Glucose Oxidase Assay Kit e Amplex® Red Glutamic
Acid/Glutamate Oxidase Assay Kit (Invitrogen, Califórnia, EUA) cujo produto final
gerado é uma molécula vermelho fluorescente, com excitação e emissão máxima a
571/585 nm, podendo ser avaliado de modo bastante sensível por fluorimetria. No caso
da determinação da concentração de piruvato, lactato e glicogênio foram usados os kits
comerciais EnzyChrom™ Pyruvate Assay Kit, EnzyChrom™ Lactate Assay Kit e
EnzyChrom™ Glycogen Assay Kit (Bioassay systems, Califórnia, EUA) que também se
baseiam numa reação enzimática para geração de um produto final fluorescente, com
excitação e emissão máxima a 530/585 nm, também detectável por fluorimetria.
Todos os kits seguiram os protocolos propostos por seus respectivos fabricantes
com pequenas modificações que são descritas a seguir para melhor se adaptarem aos
experimentos.
Padronização dos kits de avaliação bioquímica.
Protocolo padrão para todas as análises
Cada amostra coletada foi descongelada a temperatura ambiente sendo
posteriormente colocada em poços de uma placa de 96 poços fundo arredondado preta.
Após foi seguido o protocolo do fabricante, para cada kit, que no geral consiste em
confecionar um mix com molecula fluorescente, enzimas e tampão para tamponar a
22
reação. Este mix então é transferido para cada poço contendo as amostras e incuba-se ,
em média por 30 minutos, as amostras a 37°C para que a reação enzimática possa
acontecer e a fluorescencia possa ser então detectata. Depois do tempo de incubação a
placa contendo todo o material foi levada para o leitor fluorimétrico Synergy HT (BioTek
Instruments, Inc). A aquisição e processamento dos dados foi feita pelo software Gen5
Data Analysis (BioTek Instruments, Inc) obtendo dados brutos levando em conta cada
diluição utilizada.
Avaliação de glicose - Amplex® Red Glucose/Glucose Oxidase Assay Kit
Para a padronização do kit de detecção da glicose foi definida uma curva padrão
com 5 pontos (3,125 µM, 6,25 µM, 12,5 µM, 25 µM e 50 µM). Os meios de cultivo
foram diluídos 20 vezes para que se pudesse utilizar apenas 2,5 µL do volume
provenientes das amostras coletadas já que total de meio de cultura por embrião era de 20
µL e este deveria ser dividido entre quatro analises (glicose, glutamato, piruvato e
lactato). Para as padronizações do AmplexRex Glucose foram utilizados meios de cultura
que não tiveram contato com embriões. A curva padrão para glicose foi obtida de uma
regressão polinomial até que R2 fosse igual ou muito próximo 1 mostrando a adequação
da curva aos dados obtidos (Figura 3).
23
Curve Name Curve Formula A B C R2
StdGliPol Y=C*X̂ 2+B*X+A 1,77E+03 195 2,1 1
StdGliPol
<Concentrations/Dilutions>
RE
D:5
30/2
5,59
0/35
-10,000 0,000 10,000 20,000 30,000 40,000 50,000 60,000
-5000
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
Figura 3 – Curva padrão para glicose proveniente de uma regressão polinomial. R2 igual a 1 representa a adequação da curva aos dados obtidos.
Avaliação de glutamato - Amplex® Red Glutamic Acid/Glutamate Oxidase
Assay Kit
Para a padronização do kit de detecção de glutamato foi definida uma curva
padrão com 5 pontos (3,125 µM, 6,25 µM, 12,5 µM, 25 µM e 50 µM). Os meios de
cultivo foram diluídos 25 vezes para que se pudesse utilizar apenas 2 µL de meio de
cultura provenientes das amostras coletadas, já que total de meio de cultura era de 20 µL
por embrião e este deveria ser dividido entre quatro analises (glicose, glutamato, piruvato
e lactato). Para as padronizações do Amplex® Red Glutamic Acid/Glutamate Oxidase
Assay Kit foi utilizado meio de cultura que não teve contato com embriões. A curva
padrão para glutamato foi obtida de uma regressão polinomial até que R2 fosse igual ou
muito próximo 1 mostrando a adequação da curva aos dados obtidos (Figura 4).
24
Curve Name Curve Formula A B C R2
StdGluPol Y=C*X^2+B*X+A 1,77E+03 143 -1,17 0,999
StdGluPol
<Concentrations/Dilutions>
Glu
tam
ato:
530/
25,5
90/3
5
0,000 10,000 20,000 30,000 40,000 50,000 60,000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
5000
5500
6000
6500
Figura 4 – Curva padrão para glutamato proveniente de uma regressão polinomial. R2 igual a 0,999 representa a adequação da curva aos dados obtidos.
Avaliação de lactato - EnzyChrom™ Lactate Assay Kit
Para a padronização do kit de detecção do lactato foi definida uma curva padrão
com 5 pontos (2,5 µM, 5 µM, 10 µM, 20 µM e 40 µM). Foi utilizada uma diluição de 310
vezes para que se pudesse utilizar apenas 1 µL de meio de cultura provenientes das
amostras coletadas, já que total de meio de cultura era 20 µL por embrião e este deveria
ser dividido entre quatro analises (glicose, glutamato, piruvato e lactato). Para as
padronizações do EnzyChrom™ Lactate Assay Kit foi utilizado meio de cultura que não
teve contato com embriões. A curva padrão para o lactato foi obtida de uma regressão
polinomial até que R2 fosse igual ou muito próximo 1 mostrando a adequação da curva
aos dados obtidos (Figura 5).
25
Curve Name Curve FormµLa A B C R2
StdLacNL Y = (A-D)/(1+(X/C)^B) + D 561 1,38 39,2 0,999
StdGliNL
<Concentrations/Dilutions>
RE
D:5
30/2
5,59
0/35
0,000 5,000 10,000 15,000 20,000 25,000 30,000 35,000 40,000 45,000
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
Figura 5 – Curva padrão para lactato proveniente de uma regressão não linear. R2 igual a 0,999 representa a adequação da curva aos dados obtidos.
Avaliação de piruvato - EnzyChrom™ Pyruvate Assay Kit
Para a padronização do kit de detecção do piruvato foi definida uma curva
padrão com 7 pontos (3,9 µM, 7,8 µM, 15,62 µM, 31,25 µM , 62,5 µM, 125 µM e 250
µM). Foi utilizada uma diluição de 25 vezes para que se pudesse utilizar apenas 2 µL de
meio de cultura provenientes das amostras coletadas, já que total de meio de cultura era
20 µL por embrião e este deveria ser dividido entre quatro analises (glicose, glutamato,
piruvato e lactato). Para as padronizações do EnzyChrom™ Pyruvate Assay Kit foram
utilizados meios de cultura Meio1 e Meio2 que não tiveram contato com embriões. A
curva padrão para o piruvato foi obtida de uma regressão polinomial até que R2 fosse
igual ou muito próximo 1 mostrando a adequação perfeita da curva aos dados obtidos
(Figura 6).
26
Curve Name Curve FormµLa A B C R2
StdPirPol Y=C*X^2+B*X+A 1,03E+03 160 -0,148 1
StdPirPol
<Concentrations/Dilutions>
RE
D:5
30/2
5,59
0/35
-50,000 0,000 50,000 100,000 150,000 200,000 250,000 300,000
-5000
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
Figura 6 – Curva padrão para piruvato proveniente de uma regressão polinomial. R2 igual a 1 representa a adequação da curva aos dados obtidos.
Avaliação de glicogênio - EnzyChrom™ Glycogen Assay Kit
Para a padronização do kit de detecção de glicogênio foi definida uma curva
padrão com 5 pontos (1,56 µM 3,125 µM, 6,25 µM, 12,5 µM e 25 µM ). Para as
padronizações do EnzyChrom™ Glycogen Assay Kit foi necessário romper a membrana
plasmática dos embriões previamente coletados por congelamento e descongelamento
sequencial em nitrogênio liquido para que o glicogênio pudesse ser observado no meio
aquoso (PBS com 5% PVA). Adicionalmente os embriões passaram por digestão com
proteinase k o que melhorou a detecção do estoque de glicogênio celular. A curva padrão
para glicogênio foi obtida de uma regressão polinomial até que R2 fosse igual ou muito
próximo 1 mostrando a adequação da curva aos dados obtidos (Figura 7).
27
Curve Name Curve Formula A B C R2
StdGliPol Y=C*X^2+B*X+A 671 83,9 1,03 1
StdGliPol
<Concentrations/Dilutions>
RE
D:5
30/2
5,59
0/35
0,000 5,000 10,000 15,000 20,000 25,000 30,000
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
Figura 7 – Curva padrão para glicogênio proveniente de uma regressão polinomial. R2 igual a 1 representa a adequação da curva aos dados obtidos.
Avaliações moleculares por RT-PCR
Extração de RNA total
O RNA total dos embriões coletados (10 estruturas por grupo) nas diferentes
fases do CIV foi extraído com o RNeasy Protect Mini Kit (Qiagen, Califórnia, EUA),
seguindo instruções do fabricante. Resumidamente, as estruturas foram descongeladas e
incubadas com tampão de estabilização para RNA e posteriormente com solução de lise.
A solução foi acrescida de Etanol e aplicada à coluna contendo membrana para separação
do RNA. Contaminantes foram removidos por sucessivas centrifugações com solução de
lavagem e o RNA eluído da membrana. As amostras foram imediatamente submetidas à
quantificação do RNA total e congeladas em freezer a -80ºC até a análise.
28
Sintese de cDNA
Ao RNA total obtido foi adicionado 1µL de oligo dT e a mistura incubada por
70°C por 5 minutos e resfriada até 4ºC. Para a reação de síntese da primeira fita de cDNA
adicionou-se 4µL 5x First strand buffer, 2µL de 0,1 M DTT, 2µL de 10mM dNTP e água
DEPC q.s.p. 19µL (Invitrogen, Califórnia, EUA). Procedeu-se a incubação a 42°C em
termociclador, seguida de adição de 1µL de Superscript III (Invitrogen, Califórnia, EUA)
e incubação por 1 hora a 42°C, 15 minutos a 70ºC e resfriamento até 4ºC.
PCR em tempo real
Os cDNAs foram submetidos a reação de PCR em tempo real pelo sistema
TaqMan® (Life Technologies, Inc.) dos seguintes genes candidatos (Tabela 1).
Tabela1: Genes avaliados e seus respectivos códigos no fabricante e no GenBank.
Nome Cod (Life Technologies, Inc.) Gene ID GLUT-1 Bt03215314_m1 282356 GLUT-3 Bt03259514_g1 282358 GSK-3 Bt03273695_m1 536561 G6PD Bt03649181_m1 281176
Os sistemas (primer + sonda) usados foram adquiridos já padronizados para
espécie bovina. O desenho dos primers e das sondas podem se encontrados no site do
fabricante (www.lifetechnologies.com).
29
Análise dos resultados
Dados fluorimétricos foram processados como mostra o Anexo C deste trabalho.
Para dados acerca da concentração de cada metabolito analisado e para verificação do
efeito da cinética de desenvolvimento sobre alterações bioquímicas em cada um dos
estágios embrionários descritos no delineamento experimental foi realizado o teste t de
Student no ambiente Prism® 5.01 (Graphpad Software. San Diego,CA) com nível de
significância de 5%.
A análise estatística da diferença de expressão dos genes nas diferentes fases
analisadas foi avaliada mediante a estimativa da eficiência de amplificação e a variação
da expressão. As reações foram normalizadas pela frequência de expressão do controle
endógeno (PFAFFL, 2001). Desta forma os valores de expressão relativa obtidos para
cada gene foram direcionados a analise estatística no ambiente Prism® 5.01 (Graphpad
Software. San Diego,CA) se utilizando do teste t de Student para avaliações entre 2
grupos ou ANOVA com posterior teste de Tukey para avaliações entre 3 grupos. O nível
de significância adotado foi 5%.
30
Resultados
Avaliações bioquímicas
Os resultados das avaliações bioquímicas apresentados a seguir estão
apresentados de acordo com o metabólito analisado. As concentrações de todos os
metabolitos foram avaliadas comparando cada um dos grupos (rápido x lento) em três
momentos do cultivo (“clivado”, “mórula” e “blastocisto”). Por essa abordagem foi
avaliado se o consumo do metabolito era afetado pela cinética de desenvolvimento.
Concentração de Glicose.
Não houve diferença para os embriões nos grupos clivado e blastocisto em
relação a concentração de glicose no meio de cultivo. Porem no grupo mórula a
concentração de glicose no meio obtido dos embriões provenientes do grupo lento
mostrou ser menor do que os embriões do grupo rápido (Figura 8).
Figura 8 – Concentração absoluta de glicose em meio de cultura nos três estágio embrionários avaliados. Barras azuis mostram o erro padrão; Pontilhado verde mediana do meio de cultura Meio1; pontilhado preto mediana do meio de cultura Meio2; * valor de p < 0,05.
31
Concentração de Piruvato.
Não houve diferença para os embriões do grupo mórula e blastocisto em relação
a concentração deste metabólito. Porem, no grupo clivado a concentração de piruvato no
meio de cultivo foi menor para os embriões provenientes do grupo rápido do que os
embriões do grupo lento (Figura 9).
Figura 9 – Concentração absoluta de piruvato em meio de cultura nos três estágio embrionários avaliados. Barras azuis mostram o erro padrão; Pontilhado verde mediana do meio de cultura Meio1; pontilhado preto mediana do meio de cultura Meio2; * valor de p < 0,07.
32
Concentração de Lactato.
Não houve diferença entre as concentrações deste metabolito entre os embriões
de desenvolvimento rápido e lento em nenhum dos grupos avaliados (Figura 10).
Figura 10 – Concentração absoluta de lactato em meio de cultura nos três estágio embrionários avaliados. Barras azuis mostram o erro padrão; Pontilhado verde mediana do meio de cultura Meio1; pontilhado preto mediana do meio de cultura Meio2.
33
Concentração de Glutamato.
Não houve diferença para os embriões do grupo mórula e blastocistos em
relação a concentração deste metabólito. Porem, no grupo clivado a concentração deste
metabólito no meio de cultivo foi menor para o grupo rápido do que o grupo lento (Figura
11).
Figura 11 – Concentração absoluta de glutamato em meio de cultura nos três estágio embrionários avaliados. Barras azuis mostram o erro padrão; Pontilhado verde mediana do meio de cultura Meio1; pontilhado preto mediana do meio de cultura Meio2; * valor de p < 0,05.
34
Concentração de Glicogênio.
Não houve diferença para os embriões do grupo clivado e mórula em relação ao
estoque celular deste metabólito. Porem, no grupo blastocisto o estoque celular de
glicogênio dos embriões do grupo rápido se mostrou nulo enquanto os embriões do grupo
lento apresentam estoque quase três vezes superior as estoques presentes na fase de
mórula (Figura 12).
Figura 12 – Concentração absoluta de glicogênio em meio de cultura nos três estágio embrionários avaliados. Barras azuis mostram o erro padrão; Pontilhado verde mediana do meio de cultura Meio1; pontilhado preto mediana do meio de cultura Meio2; * valor de p < 0,05.
35
Avaliações moleculares por RT-PCR
Os resultados da quantificação de transcritos por RT-PCR estão apresentados de
acordo com gene alvo avaliado em termos da expressão relativa observada. Os dados
foram avaliados comparando a expressão de cada um dos grupos (rápido x lento) para
dois estágios embrionários observados (clivado e mórula). Já em blastocisto, além dos
grupos rápido e lento, um grupo de embriões produzidos in vivo foi adicionado a
avaliação.
Expressão de GLUT1
A expressão de GLUT1 do grupo rápido foi maior que a expressão do grupo
lento nos estágios de clivagem e mórula. No entanto, no estágio de blastocisto a
expressão de GLUT1 para embriões lentos foi maior do que para embriões rápidos e os
dois grupos in vitro apresentam maior expressão que o grupo in vivo (Figura 13).
Figura 13 – Expressão relativa de GLUT1 em três estágio embrionários avaliados. No estágio de blastocisto é adicionado um grupo de embriões produzidos in vivo para comparação com o grupo rápido e lento produzido in vitro. Barras azuis mostram o erro padrão e * p<0,05.
36
Expressão de GLUT3
A expressão de GLUT3 do grupo rápido é menor que a expressão do grupo lento
no estágio de clivagem. No entanto nos estágios de mórula e blastocisto a expressão de
GLUT3 não difere entre embriões rápidos e lentos, porem os dois grupos in vitro
apresentam maior expressão que o grupo in vivo na fase de blastocisto (Figura 14).
Figura 14 – Expressão relativa de GLUT3 em três estágio embrionários avaliados. No estágio de blastocisto é adicionado um grupo de embriões produzidos in vivo para comparação com o grupo rápido e lento produzido in vitro. Barras azuis mostram o erro padrão e * p<0,05.
37
Expressão de GSK3
A expressão de GSK3 não diferiu em nenhum dos estágios entre o grupo rápido
e o grupo lento. No entanto os dois grupos in vitro apresentam maior expressão que o
grupo in vivo na fase de blastocisto (Figura 15).
Figura 15 – Expressão relativa de GSK3 em três estágio embrionários avaliados. No estágio de blastocisto é adicionado um grupo de embriões produzidos in vivo para comparação com o grupo rápido e lento produzido in vitro. Barras azuis mostram o erro padrão.
38
Expressão de G6PD
A expressão de G6PD não diferiu no estágio de clivagem, porem no estágio de
mórula e blastocisto os embriões lentos apresentam expressão de G6PD mais baixa que a
expressão do grupo rápido. Quanto a comparação com os embriões in vivo o grupo rápido
tem expressão igual e o grupo lento expressão menor que o grupo in vivo (Figura 16).
Figura 16 – Expressão relativa de G6PD em três estágio embrionários avaliados. No estágio de blastocisto é adicionado um grupo de embriões produzidos in vivo para comparação com o grupo rápido e lento produzido in vitro. Barras azuis mostram o erro padrão e * p<0,05.
39
Discussão
Se pensarmos que o embrião se desenvolve a partir de uma única célula até
chegar a um blastocisto multicelular não é difícil imaginar que o embrião bovino, assim
como qualquer mamífero, durante este processo passa por mudanças morfológicas e
metabólicas marcantes. Neste trabalho foram avaliados embriões em três fases
consideradas críticas para o desenvolvimento in vitro: o momento das primeiras clivagens
(40hpi), a fase de ativação do genoma embrionário (96hpi) e a fase de blastocisto
(168hpi) que coincide com o momento da transferência para a receptora.
Já durante as primeiras clivagens foi possível observar diferenças em relação ao
metabolismo energético entre os grupos. Apesar de ambos os grupos terem usado
piruvato como substrato energético, embriões do grupo rápido apresentaram maior
consumo dessa biomolécula do que os embriões lentos. Além disso, embriões do grupo
rápido parecem consumir glutamato enquanto embriões do grupo lento apresentaram uma
pequena secreção dessa molécula. De fato, embriões mamiferos pré-implantação utilizam
para a geração de ATP a fosforilação oxidativa do piruvato e aminoácidos nas fase de
clivagem inicial, obtendo a energia necessária para progredir no desenvolvimento
embrionário (LEESE, 2012; THOMPSON, 2000; THOMPSON et al., 2000). O piruvato,
no citoplasma é direcionado ao ciclo do ácido tricarboxilico e posteriormente a
fosforilação oxidativa. (GARDNER et al., 2011a, 2011b; LONERGAN; FAIR, 2014;
TAKAHASHI; FIRST, 1992). Já o glutamato é transportado para o citosol e em seguida,
através da glutamato desidrogenase, é convertido a α-cetoglutarato que também entra no
ciclo do TCA (HUMPHERSON; LEESE; STURMEY, 2005).
Em relação a quantidade consumida (maior para o grupo rápido), embriões do
grupo rápido parecem ser metabolicamente mais ativos que os lentos. Em trabalho
40
realizado pelo nosso grupo foi demonstrado por RNA Seq que blastocistos derivados do
grupo de clivagem rápida apresentam super regulação de diversas vias relacionadas ao
metabolismo energético e geração de energia que podem decorrer de alterações
metabólicas já no início do desenvolvimento (MILAZZOTTO et al., 2014). Mais ainda,
até o estágio de 8 células embriões bovinos cultivados in vitro apresentam perfil de
secreção para 21 aminoácidos incluindo o glutamato (LI et al., 2006). Nossos dados
mostram que embriões rápidos, na clivagem, parecem consumir glutamato enquanto
embriões lentos apresentam o padrão de secreção e essa diferença entre eles pode estar
relacionada com o já mencionado perfil super expresso para os transcritos do
metabolismo energético em embriões rápidos. A partir do estágio de mórula embriões
bovinos apresentam perfil de absorção para 15 aminoácidos incluindo glutamato e este
fato corrobora com o observado em nosso dados sem distinção entre rápidos e lentos (LI
et al., 2006).
Em relação as outras biomoléculas analisadas, em ambos os grupos houve pouco
uso de glicose como substrato energético e houve secreção de lactato, além de
concentrações semelhantes de glicogênio intracelular. A produção de lactato nesta fase
está associado a glicólise anaeróbica que cliva a glicose até lactato aumentando seus
níveis (CONAGHAN et al., 1993a, 1993b; ECKERT et al., 1998; KHURANA;
NIEMANN, 2000b).
Na fase de ativação do genoma embrionário há uma mudança fisiológica para
uma maior contribuição da glicose na via da glicólise na qual espera-se que o embrião
passe a consumir mais glicose para a geração de ATP (LEESE, 2012; TELFORD;
WATSON; SCHULTZ, 1990; THOMPSON, 2000; THOMPSON et al., 2000). Nossos
dados demonstram que maior quantidade de glicose foi encontrada em meio de cultivo de
41
embriões de desenvolvimento rápido, sugerindo o maior consumo pelos embriões lentos.
O consumo de glicose em cultivo individual de embriões humanos tem sido evidenciado
como marcador de viabilidade embrionária após a transferência. GARDNER e
colaboradores (2011) relataram que embriões que geraram prenhez após transferência
apresentavam maior consumo de glicose na fase de mórula do que aqueles com menor
consumo. Esses dados sugerem que em nosso estudo os embriões lentos seriam aqueles
com maior potencial em gerar prenhez se transferidos. Mais uma vez estes dados estão de
acordo com os dados de RNA Seq produzidos pelo nosso grupo que mostraram que
embriões de desenvolvimento lento são aqueles que mais se assemelham a embriões in
vivo (MILAZZOTTO et al., 2014).
Essa diferença no padrão de consumo de glicose pode ser explicada pela
diferença nos níveis de expressão dos seus transportadores. Os níveis de expressão de
GLUT1 se apresentam superiores em embriões do grupo rápido enquanto os embriões
lentos apresentam um aumento na expressão de GLUT3 na fase de clivagem, sugerindo
uma maior quantidade de receptores de GLUT3 ativos em embriões do grupo lento na
fase de mórula. De fato GLUT1 e GLUT3 tem uma grande diferença em suas afinidades
por substrato, já que GLUT1 possui Km [20.162.9 mM for 3-OMG (10)] e GLUT3 Km
[10.661.3 mM for 3-OMG (10)], desta forma GLUT3 pode transportar glicose com maior
velocidade se comparado com GLUT1 (PANTALEON et al., 1997).
Independentemente da glicose, as concentrações de lactato não se alteraram o
que pode estar relacionado com o fato de que embriões cultivados em meios com baixa
concentração de glicose apresentam uma produção relativamente grande de lactato
(CONAGHAN et al., 1993a, 1993b; ECKERT et al., 1998). Em nossos experimentos
utilizamos Meio1, até o estágio de clivagem, que apresenta o dobro da concentração de
42
glicose em comparação com o Meio2 que utilizamos nos estágios de mórula e blastocisto.
Além do lactato, foi possível evidenciar para ambos os grupos um alto consumo de
glutamato que corrobora com absorção já observada no estágio de mórula em embriões
bovinos (LI et al., 2006).
Interessantemente, na fase de blastocisto não houve diferença em relação ao
padrão de consumo de nenhum dos metabólitos avaliado. No entanto, dados de acúmulo
de glicogênio somados aos dados de expressão gênica sugerem que as célula
embrionárias estão metabolizando estes substratos de maneira distinta. Depois de entrar
nas células embrionárias via GLUTs a glicose pode ser metabolizada pela via glicolitica,
entrar na via das pentoses-fosfato (PPP) ou ser direcionada a síntese de glicogênio
(HUMPHERSON; LEESE; STURMEY, 2005; RIEGER; LOSKUTOFF; BETTERIDGE,
1992; RIEGER, 1992). Assim, a célula pode acumular glicogênio quando tem glicose
disponível e precisa manter uma reserva energética a longo prazo e para isso se utiliza da
enzima glicogênio sintetase que será fosforilada pela GSK3 (FORDE; DALE, 2007).
Em nosso experimento, na fase de blastocisto os embriões do grupo lento
apresentaram um acumulo de glicogênio celular que não é visto nos embriões rápidos
sugerindo que apenas este grupo de embriões está acumulando reserva energética dessa
forma. No entanto, se observamos os dados de expressão relativa para a GSK3,
originalmente identificada pelo seu papel como regulador da síntese de glicogênio,
podemos observar que não há alteração entre o grupo rápido e lento (FORDE; DALE,
2007). Porem, a GSK3, além da via de síntese do glicogênio regula um conjunto
diversificado de funções celulares, incluindo a síntese de proteínas, a proliferação celular,
a diferenciação celular, a apoptose, a dinâmica dos microtúbulos e a motilidade celular
(FRAME; COHEN, 2001). Apesar disso, dados do nosso grupo mostram que em
43
embriões lentos há maior expressão de glicogênio sintetase, observada por RNAseq
(MILAZZOTTO et al., 2014). Assim, de maneira geral, essa parece ser a via preferencial
dos blastocistos lentos.
O grupo rápido, no entanto, apresentou maior expressão de G6PD na fase de
mórula que permaneceu até a fase de blastocisto. A via PPP é ativada durante o
desenvolvimento celular e tem como objetivo fornecer ribose-5-fosfato para a síntese de
nucleotídeos e ácidos nucleicos, assim como para reparação do material genético além da
geração de NADPH para a biossíntese de esteroides e ácidos graxos (GARCIA-
HERREROS et al., 2012; RIEGER, 1992; TIFFIN et al., 1991). Seu primeiro passo é
irreversível e catalisado pela G6PD que é utilizada como um indicadora do potencial da
atividade de PPP. Além disso, o gene que codifica a G6PD é ligado ao cromossomo X e
codifica a enzima que limitará a taxa da via PPP, que está diretamente ligada ao
metabolismo da glicose-6-fosfato. Este gene é descrito como o condutor da geração de
NADPH para a manutenção do estado redox celular (GARCIA-HERREROS et al., 2012;
HARVEY; KIND; THOMPSON, 2002; NICOL et al., 2000). Este mesmo NADPH está
diretamente correlacionado com a síntese de lipídios já que é ele o doador de elétrons
utilizados em todas as vias biossintéticas redutivas (DUMOLLARD et al., 2009;
GARCIA-HERREROS et al., 2012; RIEGER, 1992). Resultados de nosso grupo mostram
que blastocistos rápidos acumulam mais gotas lipídicas do que blastocistos
lentos(ANNES et al., 2014). Nossos dados em relação aos embriões rápidos parecem
seguir esse padrão que culmina no acumulo de gotas lipídicas, porem contrariam o
pressuposto de que o acúmulo de lipídios é um efeito do excesso de glicólise causando
aumento das concentrações celulares de precursores de síntese de lipídios já que o
consumo de glicose nessa fase é o mesmo para ambos os grupos (RIEGER, 1992).
44
Em resumo, parece existir uma resposta distinta que cada grupo dá ao cultivo
individual in vitro. Enquanto embriões do grupo rápido parecem estar mais voltados ao
alto metabolismo energético e acumulo de lipídios, embriões lentos parecem estar menos
ativos e comprometidos com acumulo de glicogênio. Em relação a expressão gênica,
tanto embriões rápidos quanto embriões lentos obtiveram valores superexpressos dos
genes estudados em relação aos embriões in vivo. Isso pode ser entendido como uma
forma de adaptação do embrião a um sistema não otimizado, já que o sistema de
produção in vitro tenta mimetizar os aspectos encontrados in vivo porem ainda não detêm
o controle ou conhecimento de todas as variáveis necessárias. Assim, apesar dos avanços
alcançados na reprodução animal, ainda são necessário estudos que consigam identificar
as reais necessidades dos embriões pré-implantação para a otimização do sistema de PIV.
45
Conclusão
Objetivos específicos
- Caracterizar os padrões de consumo de glicose, lactato, piruvato e glutamato ao longo
do cultivo de embriões bovino PIV.
Embriões dos grupos rápido e lento variam em relação ao consumo e secreção de
metabólitos no meio de cultivo, sugerindo uma maior atividade metabólica dos embriões
do grupo rápido.
- Quantificar o estoque de glicogênio celular ao longo do cultivo de embriões bovino PIV.
O estoque de glicogênio é similar entre os grupos rápido e lento nas fases de
clivagem inicial e mórula. No entanto, apenas embriões do grupo lento apresentam
glicogênio na fase de blastocisto.
- Quantificar os transcritos de genes ligados ao metabolismo energético embrionário em
bovinos.
Embriões de desenvolvimento rápido e lento apresentam diferenças em relação
ao padrão de expressão de genes relacionados ao metabolismo energético sugerindo a
preferência de cada grupo a vias distintas de manutenção de reserva energética.
Objetivo geral
- O objetivo principal deste projeto é a identificação de biomarcadores relacionados ao
metabolismo energético e sua possível relação com a qualidade embrionária.
Apesar de obter os padrões de consumo dos metabolitos propostos nenhum deles
parece ser um biomarcador que reflita relação com a qualidade embrionária. No entanto,
os padrões encontrados associados com dados de expressão gênica obtidos pelo nosso
grupo sugerem que embriões lentos são mais próximos do que seria o padrão in vivo.
46
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51
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52
ANEXOS A
• Solução Fisiológica ou Salina 0,9%
Reagente Fabricante Catálogo Volume NaCl Sigma S-5886 9g Àgua destilada 1L
• Meio de lavagem MIV (Pré-MIV) Reagente Fabricante Catálogo Volume M-199 com HEPES Gibco 12380-028 4,5 ml Soro Fetal Bovino 10% Gibco 16140-014 0,5 ml Pyruvato 0,2mM Sigma P-4562 10 µl Gentamicina 50µg/ml Sigma G-1264 25 µl Filtrar em 0,22 µm
• Meio de maturação in vitro (MIV) Reagente Fabricante Catálogo Volume M-199 com bicarbonato Gibco 11150-026 4,5 ml
Soro Fetal Bovino 10% Gibco 16140-014 0,5 ml
Piruvato 0,2mM Sigma P-4562 10 µl
Gentamicina 50µg/ml Sigma G-1264 25 µl
FSH 0,5µg/ml Bioniche Folltropin-V 5 µl
hCG 7UI/ml Intervet Chorulon 50 µl *Filtrar em 0,22 mm
Estradiol 1µg/ml Sigma E-4389 5 µl
• Gradiente de percoll 90% (Percolzinho) Reagentes Volume Percoll 0,9mL Solução 10X 0,1mL CaCl2 2H2O 1M (0,7350g/5mL de água Milli Q) 2µL MgCl2 6H2O 0,1M (0,1015g/5mL de água Milli Q) 3,9µL Ácido Lático (Lactado de Na) 3,7µL NaHCO3 0,0021g *Para fazer o Percoll 45%, diluir 300ul de Percoll 90% em 300ul de TL sêmen.
53
• Soluções estoques para a FIV
Reagentes Fabricante Catálogo TL STOCK (50mL)
TL SÊMEN (50mL)
NaCl Sigma S-5886 0,3330g 0,2910g
KCl Sigma P-5405 0,0120g 0,0115g
MgCl2 Sigma M-2393 0,0050g 0,0040g
NaH2PO4 Sigma S-0876 0,00205g 0,00175g
NaHCO3 Sigma S-8875 0,1050g 0,1050g
CaCl2H2O Sigma C-5670 0,0150g 0,015g
Ác.Lactico syr. Sigma L-7900 71,5 ml 155 ml
Hepes Sigma H-0891 ********** 0,1190g
pH = 7,4 OSM=295 – 300
*Filtrar em 0,22µm
• Meio de fertilização in vitro (Meio - FIV) Reagente Fabricante Catálogo Volume
TL – Stock 10 ml
BSA – Livre de Ácidos Graxos Sigma A-7511 0,060 g
Piruvato 0,2mM Sigma P-4562 20 µl
Gentamicina 50µg/ml Sigma G-1264 50 µl
*Filtrar em 0,22 µm
• Meio de gotas de fertilização in vitro (FIV gota) Reagente Fabricante Catálogo Volume
Meio – FIV 3.640 ml
Heparina 140usp/mg Sigma H-9399 40 ml
PHE 160 ml
*Filtrar em 0,22 µm
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• KSOM suplementado (Meio1)
Reagentes Fabricante Catálogo Volume KSOM MilliPore MR-106-D 1,8 ml
Soro Fetal Bovino 10% Gibco 16140-014 180 µl Gentamicina 50µg/ml Sigma G-1264 0,45 µl
Aminoácidos não essenciais Sigma M-7145 9 µl *Filtrar em 0,22 µm
• Meio de cultivo in vitro solução SOF estoque (SOF estoque) Reagentes Fabricante Catálogo Volume (100ml)
NaCl Sigma S-5886 0,6294g KCl Sigma P-5405 0,0534g
KH2PO4 Sigma P-5655 0,0162g NaHCO3 Sigma S-5761 0,2106g
Na Lactato Sigma L-7900 0,0370g Ácido Pirúvico Sigma P-3662 0,0034g
L-glutamina Sigma G-8540 0,0146g MgCl2 7H2O Sigma M-2393 0,0098g
CaCl2 Sigma C-5670 0,0252g *Filtrar em 0,22 µm
• Meio SOFaa (Meio2)
Reagentes Fabricante Catálogo Volume SOF estoque 4,6ml
Aminoácidos essenciais Sigma M-5550 0,100ml Aminoácidos não essenciais Sigma M-7145 0,050ml
Soro Fetal Bovino Gibco 16140-014 0,250ml *Preparar na hora do uso
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ANEXO B
Well of the Well (WOW)
O sistema wow, embora tenha sido inicialmente desenvolvido para acomodar
embriões sem zona pelúcida, também se mostrou de grande valor para o cultivo de
embriões com zona intacta em embriões bovinos. No sistema wow convencional uma
cavidade é confeccionada na placa de cultivo e cada embrião é acomodado nesta cavidade
fazendo com que seu microambiente fica restrito, porem ainda há o intercambio entre os
embriões já que todos compartilham o mesmo meio de cultura (Figura 17a)(VAJTA et
al., 2000, 2008). No sistema wow individual, proposto por nosso grupo de pesquisa, os
embriões são colocados em cavidades confeccionados na placa de cultura (Figura18),
porem não partilham o mesmo meio de cultura, fazendo com que o meio e o
microambiente sejam individualizados (Figura 17b).
Figura17: Em “A” sistema wow convencional onde os embriões, em vermelho, compartilham o meio de cultura. Em “B” sistema wow individual onde os embriões não compartilham os meio de cultura.
A
B
56
Figura18 – Em “A” placa de cultura com 21 gotas de 20uL, sem compartilhar o meio de cultivo. Em cada gota existe uma cavidade, visualizada em “B” onde os embriões alocados durante todo o período de cultivo.
Apesar do cultivo wow individual ainda não ser usado na rotina dos laboratórios
de pesquisa em geral, nosso grupo testou primeiramente algumas condições de cultivo e o
sistema proposto não apresentou diferença em relação ao controle convencional (Figura
19). Desta forma o cultivo wow individual entrou para a rotina do nosso laboratório de
pesquisa possibilitando avaliações individuais de embriões bovinos PIV.
Figura19 – Índices de clivagem e blastocisto (D7) em 3 diferentes sistemas de cultivo: controle (25 embriões por gota), individual normal (cultivo individual em gotas de 20uL) e wow individual (cultivo individual em sistema well of the well com 20uL sem compartilhar o meio de cultivo). Não houve diferença entre os índices de clivagem entre todos os grupos. Não houve diferença entre o grupo controle e wow individual para índice de blastocisto. Total de 4 replicatas independentes.
A B
57
ANEXO C
Processamento dos dados
Dados brutos foram obtidos pelo software Gen5 Data Analysis (BioTek
Instruments, Inc.) e exportados para um editor de planilhas eletrônicas. Esses dados
foram cuidadosamente passados para as planilhas do ambiente Prism® 5.01 (Graphpad
Software. San Diego,CA). Desta forma foi possível obter gráficos de dispersão que
evidenciaram indivíduos outliers como no exemplo da Figura 20. Esses indivíduos foram
removidos da avaliação final já que o intuito era obter o padrão do grupo estudado.
Figura 20 – Exemplo de gráfico dispersão utilizado para evidenciar indivíduos outlier com grande afastamento do restante da amostra. Assim, individuo circulado em vermelho foi retirado da analise final.
