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Estabilización de enzimas mediante
métodos de inmovilización
Procesos de Química Sostenible utilizando enzimas como catalizadores
Curso Posgrado Ciencias y Tecnologías Químicas
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MECANISMOS DE INACTIVACIÓN DE ENZIMAS
+ + +
Alta temperatura Disolventes pHs extremos
M. acuoso pH neutro 4º C
ESTABILIZACIÓN DE ENZIMAS MEDIANTE PROCESOS DE INMOVILIZACIÓN
Rigidificación de la estructura 3-D Estabilización de la estructura cuaternaria
Curso Posgrado 2012
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+
RIGIDIFICACIÓN DE LA ESTRUCTURA 3D
ESTABILIZACIÓN DE LA ESTRUCTURA CUATERNARIA
MECANISMOS DE ESTABILIZACIÓN POR INMOVILIZACIÓN
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Muchos residuos de la enzima Brazos espaciadores muy cortos Soporte rígido
Posiciones relativas invariables durante cualquier cambio conformacional inducido por cualquier agente distorsionarte
ESTRATEGIA GENERAL DE ESTABILIZACIÓN DE ENZIMAS POR INMOVILIZACIÓN COVALENTE MULTIPUNTUAL
ESTABILIZACIÓN 3-D
COMO CONSEGUIR ESTE TIPO DE INMOVILIZACIONES
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Inmovilización – estabilización enzimas multiméricas
- inmovilización intensa multisubunidades - entrecruzamiento con polialdehidos
Curso Posgrado 2012
CHO CHO CHO CHO
CHO CHO CHO
entrecruzamiento con polialdehidos
J. Mol. Catal. B- Enzym.1999. 7, 181-189.
inmovilización intensa multisubunidades
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94000
67000
43000
30000
1 2 3 4 5
Desorción de sub-unidades de derivados inmovilizados de extractos crudos de E. coli sobre Sepabeads epóxido
2.- Extracto crudo
3.- Desorción después de
inmovilización a pH 7.0
4.- Desorción después de
incubación a pH alcalino
5.- Desorción después de
tratamiento con polialdehidos
Estabilización de “todas” las proteínas multiméricas
+ SDS – 100 º C
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0
25
50
75
100
0 10 20 30 40 50
Tiempo, (h)
% a
cti
vid
ad
Estabilización de acilasa de A. turbidans
Condiciones: pH 6.5 25º C
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RESULTADOS PREVIOS
+
+
J. Mol. Catal. B- Enzym. 2001. 11, 633-638
Biomacromolecules. 2001. 2, 95-104
Biotechnol. Progr. 2001. 17,537-542
J. Mol. Catal. B- Enzym. 1999. 7, 173-179.
0
25
50
75
100
0 1 2 3 4 5
Tiempo
Acti
vid
ad
rem
an
en
te
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INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS A TRAVÉS DE DIFERENTES ORIENTACIONES
Soportes glioxil
Inmovilización de las dos subunidades a través de la región más rica en lisinas Inmovilización a pH 10
Guisán. Enzyme Microb. Technol. 1988 10, 375-82
O CH2 C
O
H
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+
Inmovilización de solo una subunidad por la región más rica en lisinas
INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS A TRAVÉS DE DIFERENTES ORIENTACIONES
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Objetivo planteado: máxima estabilización posible de todas las enzimas multiméricas
Desarrollo de una nuevo tipo de soportes heterofuncionales a medida y protocolos de inmovilización en varias etapas
Grupos capaces de adsorber multiméricas involucrando el máximo numero de subunidades a pH 7…….orientación correcta
Grupos CHO …………………Unión Covalente Multipuntual muy intensa, a través de los grupos aminos, a pH 10
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ESTUDIO DEL PROCESO DE ADSORCIÓN
Adsorción multipuntual involucrando varios
residuos en la superficie de la proteína
N+
COO
COO
Me +2
-
-
NH3
+
COO-
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J. Chromatogr. A. 1059, 89-94.
Enzimas grandes adsorbidas por regiones muy grandes
- - -
-
ADSORCIÓN DE ENZIMAS GRANDES SOBRE SOPORTES POCO ACTIVADOS
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HIPÓTESIS
Adsorción multipuntual y multisubunidades
Adsorción multipuntual de una sola subunidad
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DISEÑO DE NUEVOS SOPORTES HETEROFUNCIONALES PARA LA INMOVILIZACIÓN MULTIPUNTUAL Y MULTISUBUNIDADES DE ENZIMAS MULTIMÉRICAS
Mínimo de grupos que permite adsorción a pH 7: Garantía de mayor superficie Muchos grupos CHO que no unen a pH 7 y unen a pH 10 para UCM
N+
COO
COO
Me +2
-
-
NH3
+
COO-
CHO
CHO
CHO
CHO
CHO
CHO
CHO
CHO
CHO
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CHO
CHO
CHO
CHO
CHO
CHO
CHO
Incubación a pH alcalino Union covalente suave
pH neutro Adsorción a pH neutro
CHO
CHO
CHO
CHO
CHO
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INGENIERÍA GENÉTICA DE ENZIMAS DE ESTRUCTURA 3-D CONOCIDA
SH
SH
SH
SH
HS
HS
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SH
S S
UCM amino-glioxil a pH alcalino
SH
S S
CHO
CHO
CHO
CHO
CHO
CHO
S SR
CHO
CHO
CHO
CHO
CHO
CHO
SH
S H
Inmovilización a pH neutro por intercambio tiol disulfuro
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S S
Orientación deseada + Unión Covalente Multipuntual
S S S S
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VALIDEZ PARA OTRAS ENZIMAS MÁS COMPLEJAS
Enzimas más complicadas… tratamiento con polímeros
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ESTABILIZACIÓN DE ENZIMAS MULTIMÉRICAS DE MICROORGANISMOS TERMÓFILOS
Mesófilo Vs termófilo Unión unisubunidad Vs multisubunidades
Unión unipuntual Vs multipuntual
DERIVADOS MÁS ESTABLES
Enzima de mesófilo
Enzima de termófilo
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Unión de enzimas con varios aminos terminales a soportes activados con grupos glioxil pH 7
Hipótesis multiméricas:
NH2
NH2
pH 8
NH2
Si hubiera varios aminos terminales en un mismo plano de la proteína esta se podría inmovilizar multipuntualmente sobre glioxil a pH 7-8
Ésta inmovilización debería involucrar a muchas subunidades
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CLEAs
PREPARACIÓN DE CLEAs
Agente entrecruzante
precipitante PEG
sales, disolventes
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CLEA: Disociación de subunidades no es posible
Inmovilización convencional de enzimas: Disociación de subunidades es posible
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3 4 5 6 7
Clea1/10
Clea1/100
soluble1/10
soluble1/200
Efecto de la dilución en la estabilidad térmica de CLEA catalasa de M. lysodeiktycus
Tiempo (h)
Act
ividad r
esidua
l (%
)
Condiciones experimentales: 60ºC , pH 7, 10000 IU/ml
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BIOTRANSFORMACIONES ENZIMÁTICAS EN PRESENCIA DE DISOLVENTES
Aumentar la concentración de sustratos poco solubles. Evitar etapas de cristalización, realizando la biotransformación en presencia de agua saturada de disolvente. Desplazar equilibrios hacia la síntesis. Modificar la selectividad de las enzimas al inducir cambios en la conformación y en el mecanismo de reacción.
PROBLEMA: INESTABILIDAD DE LAS ENZIMAS EN PRESENCIA DE DISOLVENTES
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INACTIVACIÓN DE ENZIMAS INMOVILIZADAS EN PRESENCIA DE MEZCLAS AGUA-DISOLVENTE ORGÁNICO (pH neutro y baja Tª)
No se produce modificación química No es posible agregación (enzima inmovilizada) No existe inactivación por interfase hidrofóbicas CAUSA DE INACTIVACIÓN: Cambios conformacionales inducidos por el disolvente.
Enzima desnaturalizada
Enzima hidratada
Enzima interacciona
con disolvente
Codisolvente
Medio acuoso
pH 7 4’C
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ESTABILIZACIÓN DE ENZIMAS FRENTE A DISOLVENTES ORGÁNICOS
AUMENTO DE LA ESTABILIDAD DERIVADO ENZIMÁTICO
GENERACIÓN DE MICRO-AMBIENTES HIPER-HIDROFÍLICOS
Presencia de disolventes en el entorno enzimático
REDUCCIÓN DE:
Cambios conformacionales en la estructura enzimática
RIGIDIFICACIÓN
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Estabilización de la enzima por UNIÓN COVALENTE MULTIPUNTUAL
Rigidificación 3D
Reduce los cambios conformacionales inducidos
por cualquier agente distorsionante
A través de:
varios residuos de la enzima
unidos por brazos espaciadores cortos al soporte
A/ REDUCCIÓN DE LOS CAMBIOS CONFORMACIONALES EN LA ESTRUCTURA ENZIMÁTICA
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B/ REDUCCIÓN DE LA PRESENCIA DE DISOLVENTES EN EL ENTORNO ENZIMÁTICO
Generación capas hidrofílicas protegiendo a cada molécula de enzima:
Estructuras muy abiertas (permitan paso S y P) polímeros no estructurados Capa altamente hidrofílica (fenómenos de “reparto” = disminución % disolvente en el entorno de la enzima)
S
P 90% CODISOLVENTE 30%
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GENERACIÓN DE MICRO-AMBIENTES HIDROFÍLICOS ALREDEDOR DE LAS ENZIMAS INMOVILIZADAS
Unión covalente multipuntual Generación de micro-ambientes
+ =
Derivado PGA-glioxil-agarosa (estabilizado)
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COINMOVILIZACIÓN DE LA ENZIMA CON POLÍMEROS HIDROFÍLICOS POLIFUNCIONALES NO ESTRUCTURADOS
Características generales: altamente hidrofílicos estructuras abiertas y flexibles contienen gran cantidad de grupos funcionales capaces de generar microambientes hidrofílicos en torno a cada molécula de enzima
Tipos: A/ Polietilenimina (PEI) B/ Dextrano aldehído C/ Dextrano sulfato
Condiciones de inactivación: Alta concentración de disolvente orgánico (80,90%,…) Baja temperatura (4º C) pH neutro
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A/ POLIETILENIMINA (PEI)
2/Los grupos amino ionizados pueden adsorberse sobre:
Polímeros poli-aniónicos Proteínas
NH3+ NH
2+ NH +
1/Los grupos amino primarios pueden reaccionar con:
Grupos aldehído en el soporte Grupos aldehído de polímeros + + + + +
+ +
+ + +
+ +
+ - NH2 - NH2
- NH2 - NH2
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B/ DEXTRANO - ALDEHÍDO
Reaccionan con grupos amino primarios de:
Soportes Polímeros con aminos primarios (PEI) Proteínas
CHO
CHO CHO
CHO
CHO
CHO
CHO
CHO
CHO
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C/ DEXTRANO- SULFATO
Se adsorben a: • Proteínas • Polímeros policatiónicos (PEI)
“sal polimérica” extremadamente hidrofílica
-O-SO3-
-O-SO3-
-O-SO3- -O-SO3
-
-O-SO3-
-O-SO3-
-O-SO3-
-O-SO3-
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OPTIMIZACIÓN DEL DERIVADO ENZIMÁTICOS CON MICROAMBIENTES HIDROFÍLICOS
Coinmovilización de PGA y Polietilenimina de distinto tamaño: NO ESTABILIZACIÓN
PGA no interacciona con soportes modificados con PEI
DISOLVENTE ORGÁNICO
PGA
Polietilenimina
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Modificación de derivados de PGA con PEI- dextrano sulfato:
ESTABILIZACIÓN MUY MODERADA
La capa hidrofílica es muy fina y no cubre completamente todas y cada una de las moléculas de PGA
DISOLVENTE ORGÁNICO
PGA
Dextrano sulfato
Polietilenimina
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Modificación de derivados de PGA con PEI-dextrano aldehído: ESTABILIZACÓN ELEVADA
INACTIVACIÓN EN 90 % Dioxano, 4ºC, pH 7.0
PEI 60 KD
PEI 25 KD
PEI 1000 KD
0
20
40
60
80
100
0 50 100 150 200
Tiempo (horas)
Act
ivid
ad e
nzi
mát
ica
resi
du
al (
%)
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DISOLVENTE ORGÁNICO
PGA
Dextrano aldehido
Polietilenimina
La capa hidrofílica cubre completamente todas y cada una de las moléculas de PGA Curso Posgrado 2012
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PROTOCOLO OPTIMIZADO
1º- Inmovilización covalente multipuntual
2º- Coinmovilización con PEI 3º- Reacción entre PEI y dextrano-aldehído (varias capas)
4º- Formación de sales poliméricas con dextrano sulfato
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DERIVADO FINAL ÓPTIMO
0
20
40
60
80
100
0 100 200 300 400 500
Tiempo (horas)
Act
ividad e
nzim
ática
residua
l, (%)
INACTIVACIÓN EN 90 % Dioxano, 4ºC, pH 7.0
3 capas + Dextrano sulfato (75% actividad recuperada)
Glioxil-PGA
Eupergit-PGA comercial
1 capa
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Estrategia de estabilización válida para varias enzimas (PGA, esterasas,...) y varios soportes (p.e. Sepabeads, agarosa,...) RIGIDEZ + HIDROFILIZACIÓN = DERIVADO CON ALTA ESTABILIDAD FRENTE A DISOLVENTES ORGÁNICOS (6 órdenes de magnitud mayor con respecto al derivado Eupergit-PGA comercial)
PGA
Dextrano sulfato
Polietilenimina
Dextrano aldehido
DISOLVENTE ORGÁNICO
DERIVADO HIDROFILIZADO
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INACTIVACION DE ENZIMAS EN CONDICIONES QUMICAMENTE INERTES, disolventes, pH y temperaturas suaves.
Distorsión de la estructura 3D: estructura primaria inalterada
Uso de disolvente industrial
Desplegamiento Urea
Guanidina
Replegamiento pH 7.0 25ºC Agua
REACTIVACIÓN DE ENZIMAS INACTIVADAS
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0
25
50
75
100
0 10 20 30
8M Guanidine
Water
Completa 24 h reactivación. 30 min reactivación
Desplagamiento-replegamiento
Time (days)
Re
sid
ual
act
ivit
y, (
%)
REACTIVACIÓN DE ENZIMAS INMOVILIZADAS-ESTABILIZADAS TRAS INACTIVACIÓN EN DISOLVENTE
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0
20
40
60
80
100
120
0 20 40 60 80 100 120
INACTIVATION BY HEAT
8 M guanidine
No guanidine
Reactivación del derivado glioxil de la BTL
Tiempo (h)
% a
ctiv
idad
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