Espectrometria de massas - Princípios e Aplicações
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ESPECTROMETRIA DE
MASSAS
- PRINCÍPIOS E APLICAÇÕES
Lhaís Leal
Márcia Vieira
Mass Spectrometry -MS
Técnica analítica de identificação, quantificação e
caracterização molecular e estrutural de amostras,
com base na sua composição elementar.
Princípio
Ionização - formação de íons livres
Fragmentação e detecção desses íons com base
na sua relação de massa/carga(m/z)
Registro do número de íons formando um
espectro de massas
Espectrômetro de massas
• Identificar compostos desconhecidos.
• Quantificar materiais conhecidos.
• Elucidar as propriedades químicas e estruturais das
moléculas
• Medir a massa molecular de alguns compostos.
• Determinar modificações pós-traducionais de proteínas.
Aplicações
• Análise de proteínas, peptídeos e oligonucleotídeos.
• Na indústria farmacêutica.
• Aplicabilidade clínica: análise de hemoglobina, teste de
drogas, “screening” neonatal.
Primeiros MS
• 1897, descoberta do
elétron por J.J. Thomson• Tubo de raios catódicos
• e- como partícula subatômica
que circunda o núcleo atômico
das moléculas.
• 1907, “Espectrógrafo de
massa” rudimentar.
• 1909, descoberta de isótopos
estáveis do gás Neon.
• 1919, Aston aprimorou o
espectrômetro de massa.
J J. Thomson
Fonte das imagens:http://www.mundofisico.joinville.udesc.br
F. W. Aston
Componentes básicos
Como uma amostra é analisada?
Introdução
da amostra
IONIZAÇÃO
Formação
de íonsAnalisador de
massa (m/z)
SEPARAÇÃO
Detector
DETECÇÃO
Ions detectados
ANÁLISE DOS DADOS
ESPECTRO DE MASSAS
•Líquida
•Gasosa
•Sólida
Introdução da amostra
• Amostras: • Sólidas
• Líquidas
• Gasosas
• Técnicas cromatográficas acopladas ao MS.
Ex.: LC/MS e GC/MS
• Eletroforese
• Inserção direta.
Métodos de ionização
• O método escolhido depende da complexidade
da amostra:
• Ionização em fase gasosa.
• Por dessorção.
• Por evaporação.
Ionização
química a pressão
atmosférica(APcI)
[M+H]+=M+ou M-
Impacto de elétrons (EI):
M+
Ionização em fase gasosa
(Phase-gas)
Dessorção
Dessorção em campo(FD)Emissor de metal com
microagulhas de carbono
Bombardeamento
rápido de átomos
(FAB)Feixes de argônio ou xenônio
Dessorção
de plasma
(PDMS)Fissão de Californio 252
Dessorção a Laser
Matriz-assistida
(MALDI)
Dessorção: a transferência de átomos, moléculas ou agregados de um sólido para a fase gasosa.
Por evaporação
Electrospray (ESI)Formação de aerossol
ThermosprayIonização por
aquecimento
Análise de proteínas por MS
2DE
Recorte dos
spots de interesseDigestão com tripsina
Com ou sem cromatografia
MS
MALDI
Fonte: http://www.chm.bris.ac.uk/ms/newversion/maldi-ionisation.htm
Electrospray (ES)
Fonte: http://www.magnet.fsu.edu
Analisador de massa
• Tem por objetivo separar os íons que são
produzidos na fonte de ionização de
acordo com as diferentes relações de
massa-carga;
• Principais características : o limite de
massa, a transmissão iônica e o poder
de resolução em massa.
Tipos de analisadores
Analisador de setor magnético
Quadrupolo
Quadrupolo
Quadrupolo x Instrumento de setor
magnético Vantagens
• Alta sensibilidade;
• Opera mais eficientemente sobre íons de baixa velocidade;
• Ideal para interface para LC e electrospray.
Desvantagem
• Inferior com relação a resolução e ao tamanho da massa;
TOF (Time of flight)
• O princípio de operação do TOF-MS
envolve a medida do tempo que um íon
leva para viajar da fonte de íons até o
detector.
• Após ionizada, a amostra entra no tubo e a
separação é feita baseado na diferença de
velocidade entre as partículas.
TOF
Tandem mass spectrometer
• Combinação de mais de um analisador para obter análise
em tandem no espaço;
• Os analisadores acoplados podem ser do mesmo tipo
(triplo quadrupolo) ou com equipamentos híbridos;
• Confere maiores informações estruturais e aumento da
seletividade para espectrometria de massa.
Interpretação de espectrometria de
massa• EI mass spectra
Feixe de
elétrons de
70 Ev.
Remove
um
elétron da
amostra.
Espectrometria de massa é a apresentação de
fragmentos carregados positivamente versus suas
concentrações relativas.
Padrão de fragmentação
• O padrão de fragmentação interfere no reconhecimento dopico;
• Envolve a quebra das ligações entre os elementos quecompõe a substância;
• Cada substância apresenta um padrão de fragmentaçãoespecífico;
• A intensidade do pico do íon molecular depende daestabilidade do íon molecular.
Padrão de fragmentação
• A quebra de uma ligação está favorecida nos pontos deramificação das moléculas no sentido de formarcarbocátions mais estáveis;
• Grupos de composto capazes de gerar picos de íonmolecular prominentes:
Aromáticos > Alcenos conjugados> Componentes cíclicos > Sulfeto orgânico > alcanos curtos > Mercaptanos
• Íons moleculares produzidos pelos componentes acima:
Cetonas > aminas > ésteres > éteres > ácidos carboxílicos > amida
Fragmentação do benzeno
• Proteases: grupo de enzimas hidrolíticas que desempenha um
papel importante em muitos processos regulatórios;
• Coagulação e a fibrinólise são proteolíticos associados a
cicatrização de feridas ;
• Coagulação: Fibrinogênio Fibrina
• Fibrinólise: Trombos Fibrina
Trombina
Plasmina
• RAJESH,R. et al. tem apresentado o envolvimento das
proteases do látex de Calotropis gigantea na coagulação e
fibrinólise;
• Menon et al. isolaram e caracterizaram duas proteases serina
• a partir de S. extracto de látex grantii;
• Objetivo do estudo purificar e caracterizar uma glicoproteína
fibrinogenolítica do látex de Synadenium grantii.
Referências
• RAJESHA, R; NATARAJUA,A.; GOWDAA, C.D.R.;
FREYB, B.M; FREYB, F.J.; VISHWANATH, B.S.
Purification and characterization of a 34-kDa, heat stable
glycoprotein from Synadenium grantii latex: action on
human fibrinogen and fibrin clot .Biochimie 88 ,1313 –
1322,2006.
• SILVERSTEIN, R. M.; WEBSTER, X. F.; KIEMLE, J.D.
Spectrometric Identification of Organic Compound. 7
ed. 1, 8-17.1963;