BIOCHIMIE, 1973, 55, 245-251.

Enzymes du mdtabolisme des polyphosphates dans la levure. III. Purification et propri~t~s de la polyphosphate-ADP-phosphotransf~rase.

S. FELTER et A. J. C. STAHL.

Laboratoire de Biochimie, UER des Sciences pharmaceutiques, Universit~ Louis Pasteur, 3, rue de l'Argonne - - 67083 Strasbourg Cedex.

(17/7/1979).

• ~ummar U. - - Yeast soluble polyphosphate-ADP-phosphotransferase has been purified 120 fold by a three step procedure. The obtained enzyme fraction moves as a single band in polyaerylamide gel electrophoresis. The apparent molecular weight of the enzyme is 44,000. The enzyme activity has an optimal pH at 6.75. Optimal temperature is a.-40°C. Electrolytes at the concentration of 0,10 M already inhibit the enzyme. Orthophosphate ions are competitive inhibitors of the transferase. Mg +~ ions are required for activity. The apparent Km values for the enzyme towards ADP and polyphosphates are 2.0 X 10-'i M and 1.3 × 10-4 M respectively. The yeast soluble polyphosphate-ADP-phosphotransferase seems to work essentialy as a breakdown enzyme of the intracellular polyphosphates.

Dans un t ravai l ant6r ieur [11, nous avons montr6 que la levure Saccharomyces cerevisiae, lorsqu'el le est r6coll6e en fin de phase logarith- mique de croissance, renferme un taux max i mum de polyphosphate-ADP-phosphotransf6rase. Cette enzyme catalyse la r6act ion suivante :

(POaNa)n -4- ADP ~ _ (POsNa)n_l -4- ATP Darts la pr6sente 6tude nous d6crivons les m6- tbodes de pur i f icat ion de cette enzyme, a insi que quelques-unes de ses propri6t6s physico-chimi- ques et catalytiques.

I. MATERIEL ET METHODES.

1) La levure de boulanger ie nous a 6t6 fournie gracieusement par la Soci6t6 Indust r ie l le de levure de Strasbourg ; elle est eultiv6e en a6robiose sur un mi l ieu fi base de glucose et de Bacto-Yeast Extract, t amponn6 h pH 5,6 [1].

2) Le polgphosphate de sodium marqu~ an ~2p est pr6par6 selon la technique d6erite pr6c6- demment [1].

3) Autres rdactifs.

DEAE-cellulose /i grosses fibres, capacit6 d '6change 0,88 mVal /g (Schleicher et Schiill). S6phadex G 25 med ium et G 100 (Pharmacia , Uppsala).

ADP et poly~thylbneimine-cel lulose, (P.E.I. cel- lulose) fine, capaci ty 0,3 meq /g (Sigma).

4) Prdparalion de la polyphosphate-cellulose : Le processus utilis6 est vois in de celui d6crit par

Randera th et coll. [2]. 10 g de PEI-cellulose sont mis en suspension h 4°C darts une solut ion aqueuse ~ 20 p. cent (P/V) de polyphosphate de sodium (sel de Graham, moyenne de 20 groupe- merits phosphate par chaine), puts agit6s pe nda n t 5 minutes . La cellulose est filtr6e sur un verre fritt6 et lav6e avec HC1 0,25 p. cent (V/V) + 4°C, puts h l 'eau distill6e froide. Le polyphos- phate est a ins i fix6 par l ' in te rm6dia i re d 'une liai- son ionique tr6s forte au groupement imine basi- que de la PEI-cellulose [3]. La polyphosphate- cellulose est raise en suspension darts l 'eau distil- 16e et in t rodui te sous cetle forme daus une colonne. I1 est impor tan t de ma i n t e n i r du ran t toutes ces op6rations la temp6rature au-dessous de +4°C.

5) Extract ion de l 'enzyme : Les cellules, r6col- t6es /~ la fin de la p6riode exponent iel le de crois- sauce (environ 120 g en poids humide) sont lav6es h l 'eau /~ +4°C, broy6es en pr6sence de billes de verre et d 'un tampon Tris-HC1 0,05 M pH 7,0, EDTA 5 × 10 -4 M, MgC1._, 10-~ M (tampon S). Le d6tail des op6rat ions est d6crit ail leurs [1]. I , 'homog6nat est centrifug6 pendan t 30 minutes 10 000 × g. Le culot est 61imin6. Le surnageant const i tue l 'extrai t enzymat ique brut , r en fe rman t envi ron 10 g de prot6ines solubles.

6) Dosage de l'activil~ de la polgphosphate- ADP-phosphotransf ~rase.

Les condi t ions du dosage sont ident iques /~ celles utilis6es lors de t ravaux pr6c6dents [1, 4]. Le mil ieu d ' incuba t ion renferme : 12,5 t~mole de Tris-HCl pH 7,0; 0,50 ~mole d'ADP ; 0,50 ttmole

246 S. Fel ler et A. J. C. Slahl.

MgC12 ; 1,1 .~mole de 32p-po lyphospha te de s o d i u m e x p r i m 6 en p h o s p h o r e ; 1,2 h 2,0 C i / m o l e de P ; 5-100 .~g de p r o t 6 i n e s enzynaa t iques dans un vo-

A.s'.

10

5

- E . brut

20 40 55 70 1~0 )" p cent sat tmtat ion (NH4)2S04

Fro. 1. --- Precipi tat ion fractionn6e de l 'extra i t brut avec (NH~)~SO4.

A.S. : activit6 sp6cifiquc de la polyphosphate-ADP- phosphotransfdrase ---- activit6 enzymatique en m amoles de P transf~r6es par minute et par mg de prot6ines enzymatiques.

fume final de 0,25 ml. Un excbs d ' A D P s u p 6 r i e u r h 0,50 i~mole c o n d u i t / t u n e i n h i b i t i o n de la r6ac- t ion , ph6nonabne d6j~ s ignal6 p o u r l ' e n z y m e d 'E. coli p a r K o r n b e r g [9].

II. R E S U L T A T S .

1) Puri[ication de la polyphosphate-ADP-phosphotrans[~rase.

P o u r la p u r i f i c a t i o n de l ' e x t r a i t e n z y m a t i q u e nous avons ut i l i s6 q u a t r e p roc6d6s .

a) Precipitation [ractionn~e avec le (NH4) z SO/. L ' e x t r a i t b r u t (10 g de p ro t~ ines est s o u m i s

0°C ~ nne p r 6 c i p i t a t i o n f r a c t i o n n 6 e p a r le (NH4)o SO~ en t re 0 et 100 p. cen t de s a tu r a t i on ~ p H 7,0. Les r6sul ta t s ob t enus son t r ep r6sen t6 s sur la f igure 1 et m o n t r e n t que la f r a c t i o n p r o t 6 i q u e p r6c ip i t 6e en t r e 55 et 70 p. cen t est la p lus r i c h e en t r ans f6 rase . C 'es t ce t te f r a c t i o n que nous avons u t i l i s6e dans la sui te du t rava i l . E l le r e n f e r m e e n v i r o n 1,9 g de p ro t6 ines . Cet te o p 6 r a t i o n con- du i t ~ nn en r i ch i s s enaen t de l ' a c t iv i t6 t r ans f6 ra - s i que de l ' o r d r e de 3 lo is : F r a c t i o n << 55-70 ~>.

b) Colonne de DEAE-cellulose.

La f r a c t i o n << 55-70 ~> (300 nag de p ro t6 ines ) a 6t6 d ia lys6e p e n d a n t une nu i t h + 4 ° C c o n t r e du t a m p o n S, p u i s d6pos6e au s o m m e t d ' u n e c o l o n n e de D E A E - c e l l u l o s e (280 × 20 m m ) 6qu i l ib r6e avec le m 6 m e t a m p o n S. La c o l o n n e est d ' a b o r d lav6e a v e c 100 nal de t a m p o n S. L'61ution est r6al is6e p a r un g r a d i e n t de NaC1 en t re 0,1 et 0,3 M dans le t a m p o n S (fig. 2). Dans ces c o n d i t i o n s la t ransf6- rase est 61u6e avec une c o n c e n t r a t i o n de NaCI 0,2 M. Les f r a c t i o n s ac t ives son t ensu i t e r a s sem-

. _ _ , m R ' p r o t 6 i n e s

'A S . - - .

300

20O

100

50

--ig.tIm, __J,

l&vales

'\. / I /

/ "\

/ \

Fit;. 2. - - Chromatographie de la fraction enzvmat ique active, prdcipitdc entre 55 et 70 p. cent de saturat ion e'n (NHI)_oSO~, sur colonne de DEAE-cellulose.

E. t6m. : fraction enzymatiquc traitde duns les m~mes conditions sans passage sur la colonne chromatographique.

BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 3.

Polyphospha te -ADP-phospho t rans fdrase de leoure. 247

bl6es, lyophil is6es puis dialys6es contre le tam- pon S. Cette op6rat ion a permis d 'ob ten i r une f ract ion enzymat ique enr ich ie 20 fois par r appor t h l ' enzyme brute. Cette pr6para t ion est stable pendan t plusieurs mois h - - 2 0 ° C [4].

p ~ d e p r o t b l n e t

100

50

D P M t r a n s f g r ~ s p a r 6 10 m l de f r a e t l o n ~ 10

"1,7

°

0,5

5 2 10 I a v a g e p H 6,0 10 M

./: \"--:,. . . . . . . . . 15 20 25 f r a c t i o n s 10 m t

o l u t i o n p H 7,0 0,15 M

FI~. 3. - - Chromatographie sur eolonne de poly- phosphate-cellulose des fractions enzymatiques actives dlu6es de la colonne de DEAE-cellulose.

c) Chromatographie d'affinit~ sur colonne de polgphosphate-celhdose.

Darts une 6tude pr61iminaire, nous avons r6alis6 un ensemble d 'exp6r iences pour d6terminer les

ciat ion, l 'act ivi t6 enzymat ique est 61u6e en m6me temps que le p ie de radioac t iv i t6 po lyphospho- r ique. Dans les condi t ions favorables h la disso- ciat ion, l 'act ivi t6 enzymat ique est 61u6e en pre- mier , le pic de radioact iv i t6 po lyphosphor ique 6tant retard6. I1 s 'est av6r6 qu'h pH 6,0 et h faible molar i t6 (0,01 M) d 'un tampon Tris-ma16ate de sodium ren fe rman t de I 'EDTA 5 × 10 -4 M et MgC1 e 10-~ M, le complexe enzyme-substrat pr6- sente le plus de stabilit6. Avec un tampon analo- gue, mais h pH 7,0 ou au delh et h une molar i t6 de 0,1 M ou au delh, le complexe se dissocie faci- lement.

En vue de la ch romatograph ie sur colonne de polyphosphate-ce l lu lose la f ract ion enzymat ique act ive 61u6e de la colonne de DEAE-cel lulose est dialys6e h + 4 ° C pendan t 2 heures contre le tam- pon Tris-mal6ate 0,01 M EDTA 5 × 10 -4 M, MgC½ 10 ~z M pH 6,0. L 'ex t ra i t dialys6 est d6pos6 au sommet d 'une eolonne de polyphosphate-ee l lu- lose (2,00 × 18 mm) pr6alablement lav6e et 6quili- br6e avec le m6me tampon h +4°C. La colonne est d ' abord lav6e avec ce tampon. Puis l '6lution est r6alis6e avec un tampon Tris-HC1 0,15 M, EDTA 5 × 10 -4 M, MgC12 10 -~ M pH 7,0 ~ +, t°C. Les fract ions act ives (deuxi6me pic de la figure 3) sont rassembl6es, lyophil is6es puis dialys6es con- tre le tampon S. Cette t echnique permet d ' i so ler une pr6para t ion enzymat ique enr ich ic 120 fois par r appor t h l ' ex t ra i t brut de d6part.

T A B L E A U I .

Tableau r~eapitulati[ des diffdrentes ~tapes de purification.

Etapes de purilication

Extrait b.rut . . . . . . . . . . . . . . . 55-70 p. cent de (NH4):SO4.. DEA E-cellulose . . . . . . . . . . . . . Polyphosphate-cellulose . . . . . .

I Activit6s i sp~eifiques

Prot~ines tota|es !de la trans|6rase: e l i [ f i g unit6s/mg J

I de prot6ines

10 200 I 3 ,8 1 964 I 13,5

96 82,0 15 456,0

Unit6s enzymatiques

totales

37 700 26 500

7 800 6 850

Coefficient d'enrichissemenl

1 3

22 120

Rendement en p. cent

100 70 21 18

condi t ions opt imales de pH et de molari t6 du tampon favorables d 'une par t h l 'associa t ion de la t ransf6rase et du polyphosphate , d 'aut re par t p ropices h leur dissociat ion. Pour eela nous avons fair passer un m61ange comprenan t l ' ext ra i t enzy- mat ique DEAE (5 mg de prot6ines) et du poly- phosphate de sodium marqu6 au 32p (0,5 mg de P-po lyphosphor ique , 300 000 DPM de 32p) sur une colonne de S6phadex G 25 med ium (37.0 × 15 mm) h +4°C. Dans les condi t ions favorables h l'asso-

BtOCHIMIE, 1973, 55, n ° 3.

Le tableau I r6sume les r6sultats obtenus lors de diverses op6rat ions de pur i f ica t ion de la poly- phosphate-ADP-phosphotransf6rase .

e) Analyses des di[[~rentes prdparalions enzy- matiques par dlectrophorbse de zone dans un gel de polyaerglamide.

Les diff6rentes pr6para t ions enzymat iques ont 6t6 analys6es par la t echn ique 61ectrophor6tique sur gel de po lyac ry lamide h 7,5 p. cent h pH 8,3

248 S. Fel ter et A. J. C. Stahl.

dans les condi t ions d6crites pa r Davis [5]. Les r6sultats obtenus (fig. 4) mont ren t que la pr6pa- ra t ion obtenue apr6s t ra i tement par (NHa)2SO 4 entre 55 et 70 p. cent de saturat ion ren fe rme 11 f ract ions prot6iques dont 3 sont pr6sentes en forte p ropor t ion . La pr6para t ion purifi6e sur DEAE.cel lulose r en fe rme encore 9 bandes de pro- t6ines parrot lesquelles la bande n ° 6 est la plus impor tan te quant i ta t ivement . La contamina t ion

11 10 9 8 7 6 S 4 321

4- I ii i ii I I I I i l l I _ - . . . . . . . . . . . , . . . , . . o .

÷ [ L i - - .................... c e l l u l o s e

FIG. 4. - - Electrophor6se sur gel de polvacrylamide des diff~rentes preparations enzymatiques obtenues lors des diff~rentes ~tapes de purification.

b) Temperature optimale. Les activit6s enzymat iques ont 6t6 test6es fi

diff6rentes temp6ratures compr ises entre +20 et 50°C. La temp6rature opt imale est situ6e h 40°C.

c) Poids moldcuIaire.

Le poids mo16culaire de l ' enzyme a 6t6 bvalu6 par la m6thode d 'Andrews [7] sur une colonne de S6phadex G 100 6talonn6e au pr6alable avec diff6- rentes prot6ines de r6f6rence : la s6rulnalbumine bovine, l 'ovalbumine, le t rypsinog6ne et le cyto- ch rome C (fig. 5). La transf6rase a un poids mol6- cula i re apparen t de 44 000.

d) Action de divers ~lectrolytes et mdtanx sur I' activitd enzymatiqne.

• Inhibi teurs .

- - Les ~lectrolytes tels que NaC1, KCI, (NH4)2SOr aux molari t6s compr ises entre 0,10 et 0,33 M

majeure est constitu6e par la bande n ~ 7, les autres ne repr6sentent que de tr6s faibles quan- tit6s de prot6ines. La pr6para t ion obtenue apr6s ch romatograph ic d'affinit6 sur polyphosphate- cellulose ne renfe rme plus qu 'une seule bande pro- t6ique : la bande n ° 6.

2) Propridt~s de la polyphosphate-ADP-phosphotrans[~rase

purifi~e.

a) pH optimum.

Les d~terminat ions d 'act ivi t6 enzymat ique ont 6t6 r6alis6es en pr6sence de solution tampon Tris- mal6ate de sod ium 0,05 M ; EDTA 5 × 10 -4 M ; MgC1 10-.3 M, aux pH compr is entre 5,5 et 8,5. Le pH op t imum se situe h 6,75.

Kav~

0,~

~ o o y t o ~ b r o m Q

~ etrypsinof6ne

e-~u malbumlne

4,5 5 IogPM FIG. 5. - - D6termination du poids m ol6eulaire a p p a -

r e n t de la transf6rase par chromatographie sur colonne de S6phadex G 100 (890 X 32 mrn).

A.S.

3 • a c t i v l t e e n z y m a t l q o e

" ~ ' , . s a n s b l e c t r o l y t e

2 ",

t ~-.e t

o,5

Fro. 6 . - - Inhibition de la transf~rase par des ~lectrolytes.

inh ibent l 'act ivi t6 enzymat ique de 60 h 85 p. cent (fig. 6). Les forces ioniques 61ev6es stabil isent la s t ruc ture seconda i re du polyphosphate , qui pour- ra i t alors deven i r moins sensible fi l 'a t taque de la transf6rase.

- - La pr6sence d'orthophosphate h la concen- t ra t ion 5 X 10-~ M provoque une inh ib i t ion de 77 p. cent. L 'o r thophospha te se compor te comme un inh ib i t eur eomp6ti t i f de la t ransf6rase (fig. 7).

Une pr6 ineubat ion de l ' enzyme pendan t 15 rain h 37°C en pr6senee de cette concent ra t ion d 'or tho-

BIOCHIM1E, 1973, 55, n ° 3.

2 4 9

p h o s p h a t e m ~ n e a u n e i n h i b i t i o n p o u v a n t a t t e i n - d r e 90 p. c e n t de l ' a c t i v i t 6 enzymatique, l i n e

~/v • 103 u

30

2. /

10

Polyphosphate-ADP-phosphotransf~rase de levure.

- ~ z s t a tl$~o3m ~

FIG. 7. - - I n h i b i t i o n de la t ransf~rase pa r l ' o r thophospha te de sodium 5 × 10-3 M.

1 1 M~taux lourds et r~acti[s a groupements --SH libres.

Les i o n s de m ~ t a u x l o u r d s i n h i b e n t la t r a n s f ~ - r a s e h de s c o n c e n t r a t i o n s 10 -a M. Le m a n g a n b s e , le fer , et le z i n c c o n d u i s e n t h des i n h i b i t i o n s de

1~ x~os I

I

0 ,5

/ . . . . )

$ 10 2S $0 t /$~ 103M

Fro. 8. - - D~te rmina t ion du Km appa ren t de ]a t ransff irase vis-h-vis du polyphosphate . Concent ra t ion en ADP 1,0 mM, concent ra t ion du P polyphosphor ique de 0 h 1,5 raM.

d i a l y s e de l ' e n z y m e p r ~ i n c u b ~ e c o n t r e le t a m - p o n S p e n d a n t 20 h h + 4 ° C p e r m e t de r ~ c u p ~ r e r 70 p. c e n t de l ' a c t i v i t ~ i n i t i a l e .

69, 97 et 98 p. c e n t r e s p e c t i v e m e n t . La p l u p a r t des e n z y m e s c a t a l y s a n t des r 6 a c t i o n s d a n s les- que l l e s i n t e r v i e n n e n t des g r o u p e m e n t s p h o s p h o - r i q u e s c o n t i e n n e n t d u z i n c d a n s l e u r c e n t r e ac t i f .

i{v x ?0 3 M

/ - /

/ /

J j J

/

S j

f

- 4

- s s lO I~ I s~ Io 3M

Fro. 9. - - D6te rmina t ion du Km appa ren t de la t ransf~rase vis-h-vis de I'ADP : concen t ra t ion en P polyphosphor ique 1,0 m M , concent ra t ion en ADP de 0 h 1,8 mM.

BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 3.

250 S. Fe l l e r el A. J. C. S tahl .

Le zinc, le cobalt et te cuivre ajoutGs /i des con- centra t ions de 10-~ ~ 10 -4 M n 'on t pas condui t une act ivat ion de la polyphosphate-ADP-phospho- transfGrase [6].

Les r~acti[s d groupement - - S H fibres tots que la eystGine ou le mercaptoGthanol ~ la concentra- t ion de 10 -3 M inh iben t to ta lement l 'activit6 trans- fGrasique. Ce rGsultat suggGre que des ponts disul- fures sont nGcessaires au main t i en de la configu- rat ion spatiale active de l 'enzyme.

• Activatenrs.

Les dGterminations d'activit6 enzymatique, effec- tuGes en prGsence de MgC½ aux concent ra t ions comprises entre 0,5 et 28 × 10-~ M, mont ren t que les ions Mg ++ sont act ivateurs de la rGaction. L 'act ivat ion est optimale pour un rappor t des con- centra t ions molaires Mg++/ADP 6gal fi 1. I1 n 'y a p ra t iquement pas d 'activit6 en l 'absence de Mg ÷÷ [6].

e) D~termination des Km de la r~action.

Les Km apparents ont 6t6 dGterminGs vis-h-vis de I'ADP et vis-~-vis du polyphosphate de sodium (sel de Graham, moyenne de 20 groupements phos- phor iques par chaine) . Le Km apparen t pour le polyphosphate est de 2,0 × 10-4 M (fig. 8). Le Km apparen t pour I'ADP est de 1,3 )< 10 -4 M (fig. 9).

f) Rdversibilit~ de la r~action.

Nous avons 6tudi6 la catalyse de la rGaction de synthGse des polyphosphates fi pa r t i r de I 'ATP par la polyphosphate-ADP-phosphotransfGrase. L'ATP-,/ ~ P a 6t6 prGpar6 juste avant les essais selon une technique mise au point au labora- toire [8J et prGsentait une radioactivi t6 spGcifique de 1 Ci/mole. Le mil ieu d ' incuba t ion est vois in de celui de Kornberg [9] et renferme pour 0,25 ml : MgC12 4 ~mole ; tampon glycylglycine 12,5 .~mole pH 7,0 ; phosphoGnolpyruvate 0,70 ,~mole : pyru- vatekinase 5 t~g, enzyme 100 ~g, ATP-v 32p de 0 5 l~mole. La foible radioact ivi t6 rGcupGrGe dons les fract ions polyphosphor iques (aprbs sGparation de I 'ATP adsorb6 sur Norit, et du Pi non prGcipite par le BaCL "~ pH 2) ne nous a pas permis de caleuler avec une prGcision suffisante le Km de l 'enzyme vis-fi-vis de I'ATP. L 'addi t ion de pyro- phosphate ou d 'autres polyphosphates de courte chaine, utilisGs comme amorce, n ' augmente pas l 'activit6 enzymatique. Dans les condi t ions opti- males, le r endemen t de la rGaction est au maxi- mum de 4 p. cent (1 .~mole d 'ATP donne 40 umoles de P polyphosphor ique) . La rGaction rGversible a lieu /~ condi t ion d'61iminer cont inue l lement I'ADP form6 dans le mil ieu d ' ineubat ion .

IlI. DISCUSSION.

La polyphosphate-ADP-phosphotransfGrase a 6t~ mise en 6vidence pour la premiGre lois darts la ievure par Hoffmann-Ostenhof et coll. Des essais de puri f icat ion de l 'enzyme localisGe dans le cytosol avaient condui t tout d 'abord /t des prG- para t ions instables et de mauvaise conservat ion I l l ] . L 'ad jonct ion d 'EDTA dans le but de com- plexer les cations polyvalents lots de ] 'extraction de l 'enzyme nous avail permis de stabil iser l 'aeti- vit6 enzymat ique [11. En ma in t enan t par la suite la prGparation en presence de Mg *÷ 10 -.3 M, elle pouvai t sub i r diffGrentes 6tapes de purif icat ion sans perle d 'act ivi t6 [4]. L 'observat ion de cos condi t ions nous a permis clans le prGsent travail d 'amGliorer la pur i f icat ion de la polyphosphate- ADP-phosphotransfGrase soluble de la levure.

En trois 6tapes l 'extrai t enzymat ique brut a pu ~tre dGbarrass~ des protGines eontaminantes . Une ~tape de puri f icat ion par passage sur une co]onnc d 'exclusion-diffusion s'est rGvG16e inut i le e t a 6t6 supprimGe par la suite. C'est la chromatographic d'affinit6 sur la eolonne de polyphosphate-eel lu- lose qui permet d ' isoler l 'enzyme avec le plus d'effieacitG. Cette 6tape de puri f icat ion ne peut 6tre rGalisGe immGdiatement aprGs le f ract ionne- ment par le sulfate d ' ammonium, la prGparation 6rant encore trop r iehe en protGines contami- n a n t e s : en cour t -c i rcui tant l'Gtape de chromato- graphic sur la DEAE-cellulose nous n 'avons pu enr i eh i r notre prGparation plus de 60 lois par rappor t ~ l 'extrai t brut init ial . Appl iquant notre mGthode en 3 6tapes, nous avons pu gluer de la colonne de polyphosphate-cel lulose une fract ion protGique enr ichie 120 fois qui ~ l '6]ectrophorGse sur gel de po lyacry lamide h pH 8,3 migre sous forme d 'une seule bande protGique.

La polyphosphate-ADP-phosphotransfGrase puri- fiGe ~ un poids molGeulaire apparen t de 44 000, un p H i au voisinage de 6,7. L 'enzyme ne requier t pas de Zn ++ pour son activit6 mats prGsente une exigenee r igourense vis-/t-vis des ions Mg +÷. Los substances h groupement - - S H l ibre entravent l 'activit6 enzymatique, ee qui nous fail penser que des ponts disulfnres jouent un rGle impor tan t dons la s t ructure de la mol.Gcule protGique.

La polyphosphate-ADP-phosphotransfGrase in vitro a une plus forte affinit6 vis-h-vis du poly- phosphate et de I'ADP que vis-a-vis de I'ATP. Cos propriGtGs sont plutGt en faveur d 'un rSle d 'en- zyme d 'u t i l i sa t ion des polyphosphates , au dGtri- ment de la rGaction inverse de synthbse des poly- phosphates. Des expGriences compor tant le dosage de l 'activit6 de la transf~rase dans des cellu]es de levure dans diffGrentes condi t ions physiologiques

BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 3.

P o l y p h o s p h a t e - A D P - p h o s p h o t r a n s f d r a s e d e l e m t r e . 251

nous ava i en t , d a n s un t r ava i l p r d e 6 d e n t f l ] , a m e n 6 s h la m 6 m e c o n c l u s i o n .

A la su i te de ces r6sul ta ts , nous sugg6 rons que la p o l y p h o s p h a t e - A D P - p h o s p h o t r a n s f 6 r a s e so lub le de l e v u r e soi t r ang6e d a n s la c l a s s i f i c a t i on i n t e r - n a t i o n a l e des e n z y m e s sous le n u m d r o E.C.2.7.4.1., h c5t6 de la t r a n s f 6 r a s e de E. ca l l d6c r i t e p a r K o r n b e r g [93, et de s t r a n s f 6 r a s e s de C o r g n ~ b a c t d - r i u m x ~ r o s i s de Hugues et M u h a m m e d [123 et de S a l m o n e l l a m i n n e s o t a d6c r i t e p a r M u h l r a d t [18]. Ces d e u x d e r n i b r e s e n z y m e s c a t a l y s e n t n 6 a n m o i n s p r d f d r e n t i e l l e m e n t la r 6 a e t i o n d a n s le s ens de la s y n l h b s e des p o l y p h o s p h a t e s h p a r t i r de I 'ATP.

R~SUM~.

La polyphosphate-ADP-phosphotransfdrase soluble de levure a dtd purifide 120 fois par une mdthode com- por tant 3 dtapes. La fract ion enzymatique obtenue migre sous forme d 'une seule bande h l 'dleetrophor~se en gel de polyaerylamide. Le poids moldculaire appa- rent de l 'enzyme est 44 000. Le pH opt imum de l 'acti- vitd enzymat ique se situe h 6,75, la tempdrature opti- male h A-40°C. Les dlectrolytes inhibent l 'enzyme d~s la concentra t ion 0,10 molaire. Les ions or thophospho- riques sont des inhibi teurs eompdtit ifs de la t ransfd- rase. Les ions Mg ++ sont requis pour l 'aetivit6 enzy-

matique. Les Km apparents de l 'enzyme vis-h-vis de I'ADP et des polyphosphates sont respect ivement de 2,0 × 10 4 M e t 1,3 X 10-4 M. La polyphosphate-ADP- phosphotransfdrase soluble de levure sernble se cam- porter essent ie l lement comme une enzyme d 'ut i l isat ion des polyphosphates intracellulaires.

BIBLIOGRAPHIE.

1. Felter, S. & Stahl, A. J. C. (1970) Bull. Sac. Chim. Biol., 52, 75-87.

2. Randerath, E. & Randerath, K. (1963) J. Chromu- tog., 10, 509-510.

3. Randerath, K. (1962) Bioehim. Biophys. Acla, 61, 852-854.

4. Felter, S. & Stahl, A. J. C. (1970) Bull. Soc. Pharm. Strasbourg, 13, 79-88.

5. Davis, J. (1964) Ann. N. Y. Acad. Sci., 121, 404-406. 6. Stahl, A. J. C. a Felter, S. (1971) Absl. Commnn.

7th Meet. Eur. Biochim. Sac., 121. 7. Andrews, P. (1964) Biochim. J., 91, 222-233. 8. Felter, S. & Stahl, A. J. C. (1971) Bull. Sac. Pharm.

Strasbourg, 14, 75-80. 9. Kornberg, A., Kornberg, S. R. & Simms, E. S. (1956)

Biochim. Biophys. Acta, 20, 215-227. 10. Hoffmann-Ostenhof, O., Kenedy, J., Keck, K., Ga-

briel, O. a SctrSnfellinger, H. W. (1954) Biochim. Biophys. Acta, 14, 285.

11. Stahl, A. J. C. (1962) Th6se Etat Pharm. Strasbourg, 134-139.

12. Hughes, D. E. & Muhammed, A. (1961) Coll. Intern. du CNRS, 106, 590-602.

13. Miihlradt, P. F. (1971) J. of yen. Microbial., 68, 115-122.

BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 3.