ENZIMIKemijska priroda i djelovanje enzima

Kolegij: BIOKEMIJATIHANA ANI GRUBII i KARMELA BARII

Farmaceutsko-biokemijski fakultet

Enzimi su moni i vrlo specifini katalizatori

enzimi ubrzavaju reakcije za faktor 106 108

CO2 + H2O H2CO3enzim : karboanhidraza ubrzava reakciju 107 puta

107 sec = 2777 sati = 116 dana116 dana enzimska kataliza 1 sec

Svaka enzimska molekula hidrira 105 molekula substrata u sekundi - prometni broj je 105 sec-1

enzimi NE mijenjaju poloaj ravnotee reakcije

Keq = [[[[P]]]]/[[[[S]]]]

enzimi poveavaju brzinu reakcije samo za termodinamiki povoljne reakcije

G = GP - GS < 0

Temeljne karakteristike enzimske katalize

ENZIMI ne mijenjaju slobodnu energijureakcije G

enzimi ne mijenjaju polone mijenjaju poloaj ravnoteaj ravnoteee u reakciji

enzimi ubrzavajuubrzavaju reakciju u oba dva smjera reakciju u oba dva smjera

enzimi olakolakavajuavaju nastajanje prijelaznog stanjaprijelaznog stanja

enzimi su strukturno komplementarni strukturno komplementarni prijelaznom stanju prijelaznom stanju molekularna konfiguracija prijelazne strukture izmeu supstrata i produkta (L. Pauling, 1948.)

Enzimi ubrzavaju kemijske reakcije jer SMANJUJU ENERGIJU AKTIVACIJE

Prednosti enzimske katalize pred kemijskom katalizom

Vee poveanje brzine reakcije

Blai uvjeti reakcije* kemijska kataliza esto zahtjeva visoku temperaturu, tlak, ekstremne pH vrijednosti

* enzimska kataliza je uinkovita u fiziolokim uvjetima

Prednosti enzimske katalize pred kemijskom katalizom

Vea specifinost i selektivnost

specifinost prema supstratima i produktima apsolutna stereospecifinost nema toksinih nusprodukata aktivnost se moe regulirati

alosterikom regulacijomkovalentnim modifikacijama

Reakcija enzima i supstrata je vrlo specifina

Model kljua ikljuanice za vezivanje enzima i supstrata

Aktivni centarenzima ima oblik komplementaranstrukturi supstrata

Reakcija enzima i supstrata je vrlo specifina (b)

Model INDUCIRANOG PRISTAJANJA za vezivanje enzima i supstrata

KOMPLEMENTARNI oblik aktivnog centra stvara se tek NAKONvezanja supstrata na enzim

ENZIMI su PROTEINI - osjetljivi na uvjete u kojima se reakcija odvija

ENZIMI su aktivni kada su u NATIVNOJ konformaciji

ENZIMI gube aktivnost u uvjetimaekstrmnih temperatura, pH, ionske jakosti i prisutnosti detergenata koji denaturiraju proteine

DENATURACIJA naruava strukturu AKTIVNOG CENTRA

Neke RNA molekule pokazuju katalitiku aktivnost

Do 1980. se pretpostavljalo da sposobnost katalize pokazuju jedino proteini

RIBOZIMI RNA molekule koje imaju katalitiku aktivnost

Kataliziraju samo ogranieni broj reakcijapovezanih s kidanjem veza u RNA molekulanma

Mehanizam djelovanja ribozima vaan za razumjevanje evolucije

RNA molekule starije i od proteina i od DNA molekula

Proteolitiki enzimi imaju razliituspecifinost za supstrate

Specifinost tripsina

Specifinost trombina

Odreene aminokiselinske skupine osiguravaju specifinost proteazama

Karboksipeptidaza i kimotripsin imaju reaktivni Ser u aktivnom centru

Kimotripsin kida peptidnu vezu s karboksi strane Trp, Phe, Tyr

Struktura enzim-supstrat kompleksa cisteinske proteaze

Kljuna AK u aktivnom centru je CISTEIN

Struktura enzim-supstrat kompleksa

Zn 2+ igra kljunu ulogu u aktivnom centru enzima

Karakteristike enzima enzimska specifinost temelji se na strukturnom podudaranju AKTIVNOG CENTRA enzima i supstrata

AKTIVNI CENTAR - mjesto interakcije enzima i supstrata (vezno i katalitiko mjesto)

KATALITIKO MJESTO - osigurava stvaranje enzim-supstrat kompleksa - stabilizacija prijelaznog stanja i smanjenje energije aktivacije

Karakteristike AKTIVNOG CENTRA ENZIMA

Trodimenzionalna udubina koju ine AK koje mogu biti udaljene u primarnoj strukturi enzima

Zauzima relativno mali dio enzima

Regija koja vee supstrate i kofaktore brojnim slabim interakcijama

Sadri katalitiki vane AK koje sudjeluju u nastajanju i kidanju kemijskih veza

Stimulira stvaranje prijelaznog stanja

Specifinost vezanja ovisi o precizno postavljenim atomima aktivnog centra

Aktivni centar ukljuuje AK koje su meusobno udaljene u primarnoj strukturi

vrpasti dijagram lizozima

Specifine AK u aktivnom centru imajukomplementarne domene samo za odgovarjui supstrat

Stvaranje ENZIM-SUPSTRAT kompleksa je kljuni korak u katalizi

Katalitika mo enzima proizlazi iz olakavanja stvaranja prijelaznog stanja ES kompleksa

ES kompleks pribliava supstrate te ih povoljno orijentia za reakciju

ES kompleks tvore slabe nekovalentne interakcije :

Elektrostatske interakcije H vezeVan der Waalsove sile Hidrofobne interakcije

Reverzibilne interakcije u ES kompleksu

Elektrostske interakcije (6 kJ/mol)ovise o elektrinom naboju ioniziranih skupinana molekulama enzima i supstrata

Polarnost molekula H2OH2O moe biti H-donor i H-acceptorH2O smanjuje jakost elektrostatskih interakcijaH2O pojaava jakost hidrofobnih interakcija

H veze u ENZIM-SUPSTRAT kompleksu

enzim ribonukleazastvara H-veze sa supstratom uridinom

van der Waalsove interakcije (2-4 kJ/mol)

Interakcije rezultiraju iz asimetrinosti elektronskog oblaka oko atoma

Asimetrinost naboja oko jednog atoma inducira asimetrinost oko susjednog atoma

Privlaenje je najvee kad atomi dosegnu van der Waalsovu kontaktnu udaljenost

Hidrofobne interakcije

Molekule H2O stvaraju organizirane ljuske oko nepolarnih molekula

Nepolarne molekule se meusobno agregiraju i oslobaaju molekule H2O uzrokujui poveanje entropije H2O to stvaraHIDROFOBNI EFEKT

Kinetika enzimske katalize moe se opisati modelom Michaelis-Menten

E + S E S E + Pk 1k

-1

k 2

Uvjeti ustaljenog stanja

[ES] = konst., [S] konst.>> [E], [P] 0

[E]ukup = [ES] + [E]slobodan

Stvaranje enzim-supstrat kompleksa je prva stepenica u enzimskoj katalizi

Ovisnost brzine vreakcije o koncentraciji supstrata S

Kinetika reakcije pokazuje zasienje postie se maksimalna brzina Vmax

Michaelis Menten model kinetike

Vmax i KM mogu se odrediti iz dijagrama po Lineweaver-Burku

Znaenje vrijednosti Vmax i KM

Enzimska aktivnost ovisi o:

Koncentraciji supstrata

Prisutnosti aktivatora i inhibitora

pH

Ionskoj jakosti

Temperaturi

Kofaktorima

PROMJENA BROJA ENZIMSKIH MOLEKULA* brzina sinteze* brzina razgradnje

PROMJENA AKTIVNOSTI ENZIMA* aktivacija inaktivnog prekursora* kovalentna modifikacija* inhibicija povratnom spregom* djelovanjem regulatornih molekula

Naini regulacije enzimske aktivnosti

Kovalentna modifikacija

Inhibicija povratnom spregom

Aktivacija prekursora

Mehanizmi regulacije aktivnosti enzima

ALOSTERIKI ENZIMI SE NE POKORAVAJU MICHAELIS-MENTENOVOJ KINETICI

ALOSTERIKI ENZIMIse sastoje od vie podjedinica

Mogu postojati u dva oblika

T-napeti oblik

R- relaksirani oblik

SEKVENCIJSKI MODEL ALOSTERIKIHINTERAKCIJA

Vezanje PRVE molekule supstrata izaziva promjenu konformacije jedne podjedinice enzima

DRUGA molekula supstrata mijenja konformaciju cjelovite enzimske molekule iz NAPETE u RELAKSIRANU

napeta

relaksirana

USKLAENI MODEL ALOSTERIKIH INTERAKCIJA

Razliiti izoenzimi kataliziraju istu reakciju

Razliiti izoenzimi potjeu iz razliitih staninih organela mitohondriji i citosol

Mnogi regulatorni enzimi imaju vie izoenzimskih formi zbog bolje regulacije specifine za odreene organele

Razliiti organizmi mogu imati razliite enzime za iste reakcije

Razliiti izoenzimi kataliziraju istu reakciju

Kataliziraju istu kemijsku reakciju

Imaju razliite fizikalno-kemijske osobine

(izozimi, izoforme, varijante enzima, subfrakcije, podtipovi, podoblici...)

Razliiti oblici istog enzima

Izoenzimi (pravi) mono-ili ee multimerni izoenzimi nastali pod kontrolom gena

Multipli enzimski oblici nastali posttranslacijskim mehanizmima in vivo ili in vitro

Kovalentne/nekovalentne modifikacije (u organizmu, tijekom proiavanja, izolacije, pohranjivanja..)

Deamidacija Djelomino cijepanje polipeptidnog lanca Promjenjena fosforilacija Acilacija Promjene u ugljikohidratnom dijelu lanca Agregacija Povezivanje s drugim biomolekulama (makroenzimi) .....

Metode analize izoenzima

Elektroforeza Kromatografija Imunoinhibicija Temperaturna stabilnost Katalitika inhibicija Specifinost prema supstratu

Alkalna fosfataza izoenzimi izoE genetska kontrola Mr___________________________________________________Placenta odvojeni gen 74000

intestinalna odvojeni gen 92000

kotana/ 94000jetrena/ 92400bubrena zajedniki gen 95800_____________________________________________________

Samo u sluaju placentarnog i intestinalnog izoE- alelne varijacije;

kod ostalih, heterogenost je posljedica posttranslacijskih modifikacija enzimske molekule

Alkalna fosfataza izoenzimiStarost ALP izoenzimi (%)

kost jetra ostali (intestinalni)___________________________________________________________

Djeca 85 5 < 10

Odrasli 45 45 < 10

Starije osobe 30 60 < 10___________________________________________________________

Znaenje razliitih oblika istog enzima

Bez obzira na mehanizam nastanka izoenzima - oni pomau u diferencijalnoj

dijagnostici razliitih bolesti !!!

Enzimska aktivnost se moe inhibirati

HIV PROTEAZA

s inhibitorom vezanim u aktivnom centru

IREVERZIBILNA INHIBICIJA ENZIMA

Enzim (AchE) i inhibitor tvore kovalentni kompleks

KOMPETICIJSKA I NEKOMPETICIJSKA INHIBICIJA- reverzibilna inhibicija

Kompetitivni inhibitor

Mehanizam kompeticijske inhibicije

Vmax = Vmax i Km = Km i

LIJEENJE OTROVANJA ETILENGLIKOLOM KOMPETICIJSKOM INHIBICIJOM

Mehanizam nekompeticijske inhibicije

Vmax = Vmax i Km = Km i

Enzimska aktivnost ovisi o pH medija

Stupanj ionizacije AK u aktivnom centru enzima i supstrata utjee na uspjenost stvaranja ES kompleksa

Veina enzima ima pH optimum u fiziolokom podruju

ENZIM pH optimumTripsin 7,7Pepsin 1,5Kolinesteraza 7,0Lizozim (suze) 4,5Arginaza 9,7Ribonukleaza 7,8

No. KLASA TIP REAKCIJE

1. OKSIDOREDUKTAZE PRIJENOS ELEKTRONA

2. TRANSFERAZE PRIJENOS SKUPINA

3. HIDROLAZE HIDROLIZA

4. LIAZE ADICIJA SKUPINE NADVOSTRUKU VEZU

5. IZOMERAZE INTRAMOLEKULARNOPREMJETANJE SKUPINA

6. LIGAZE STVARANJE C-C, C-S, C-O, C-NVEZA UZ HIDROLIZU ATP

ENZIMSKA NOMENKLATURA1956. Meunarodna komisija za enzime

E.C. 1.(klasa) 1.(podklasa) 1.(skupina) 1.(redni broj)

1 katal = 1 mol produkta/1 sec

1U/l = 1IJ/l = koncentracija katalitike aktivnostikoja odgovara promjeni 1 mikromola supstrata u 1 min u 1L

PROMETNI BROJ ENZIMA:

broj molekula supstrata pretvorenih u molekuleprodukta u jedinici vremena kada je enzim potpunozasien supstratom

JEDINICE ENZIMSKE AKTIVNOSTI