Ekspresija gena

Ekspresija gena

Krajnji produkti ekspresije gena su proteini.Ekspresija gena nastaje da bi se informacije sa DNK mogla prevesti u protein.Da bi došlo do ekspresije gena, neophodno je prvo da se genetičke informacije prepišu na molekul iRNK procesom koji se naziva – transkripcija. Kada se formira prepis (transkript), on služi kao matrica za sintezu proteina u procesu koji se naziva – translacija Transkripcija i translacija su odvojeni procesi zbog ograničenosti ćelijskih struktura vlastitim membranama (u jedru - transkripcija; u citoplazmi - translacija)

Većina gena se eksprimira u specifičnim tkivima u određenom periodu vremena → u većini ćelija je aktivna transkripcija samo malog broja gena (npr. Globin u eritrocitima;receptor za low density lipoprotein u ćelijama jetre)• HOUSE KEEPING GENI – eksprimirani su u svim ćelijama i njihovi

produkti su neophodni za metabolizam ćelije

Regulacija genske ekspresije

Regulacija ekspresije gena je složeni sistem u kome različiti elementi ulaze u međusobne interakcije, te zbog interakcija sa ćelijskim okruženjem omogućavaju sintezu odrđenih količina genskih produkata za funkcioniranje ćelijeRegulacija ekspresije gena odvija se u nekoliko faza.Prva faza regulacije odnosi se na strukturu hromatina i njegovo remodeliranje u jedru,a zatim sledi transkripciona kontrola,RNK procesiranje,RNk transport,degradacija iRNK,kontrola translacije i aktiviranje proteina.

Transkripcija

Transkripcija je proces prepisivanja genetičke informacije i sastoji se u sintezi RNK na matrici DNK. Predstavlja važan korak u prenošenju informacije sa DNK do proteina.Transkripcijom gena nastaje neki od tipova RNK( informaciona, transportna, ribozomalna). Najveći broje gena se prepisuje u informacionu RNK (iRNK) i ti geni su označeni kao stukturni geni. Proces transkripcije počinje kada je ćeliji potreban određeni protein.

Genetička informacija je zapisana u genima kao redosled deoksiribonukleotida molekule DNK,koji se prepisuje u redosled ribonukleotida molekula RNKKatalizuje ga enzim RNK-polimeraza koja razmotava dvolančanu DNK i prepisuje jedan lanac (lanac-kalup), krećući se duž DNK produžava rastući lanac RNK.

RNK-polimeraza

• Za aktivnost RNK-polimeraze, slično kao i za DNK-polimerazu, potrebno je prisustvo DNK lanca-matrice.

• Enzim RNK polimeraza se sastoji od sebi svojstvene sekvence nukleotida.

• Da bi transkripcija počela, enzim RNK polimeraza mora da prepozna tu istu sekvencu na molekulu DNK, koja se nalazi u regionu nazvanom promotor.

• Promotor čini sekvenca dužine 10-30 nukleotidnih parova

RNK polimeraza

RNK polimeraza je enzim koji se kod prokariota sastoji iz 6 polipeptidnih lanaca;• α,• α΄, • β,• β‘• δ • ω. Jedro enzima predstavljaju 5 subjedinice (α, α΄, β, β‘, ω), a kada se jedru pridruži sigma subjedinica, nastaje holoenzim. Sigma subjedinica ima ulogu u prepoznavanju promotorskog regiona

Mehanizam dejstva RNK-polimeraze

U početnoj fazi transkripcije, RNK polimeraza i regulatorni proteini se vezuju za protomor gradeći početni transkripcioni kompleks.•  RNK polimeraza je enzim koji katalizuje reakciju dodavanja sledećeg

nukleotida na 3’- kraj rastućeg polipeptidnog lanca. • Nakon aktivacije tog kompleksa, DNK se raspliće u dužini od 17

nukleotidnih parova i tako nastaje transkripcioni mehur.

Transkripcioni mehur

Mehanizam dejstva RNK-polimerazeSinteza RNK odvija se tako što se RNK polimeraza kreće duž jednog od dva lanca Dnk, dodajući po jedan ribonukleotid na 3’-kraj rastućeg lanca RNK. • Kao kalup za sintezu RNK može se koristiti bilo koja od raspletenih niti

DNK, ali postoje kontrolni mehanizmi koji obezbeđuju da se u oblasti jednog gena prepisuje samo jedan, i to uvek isti lanca DNK ( koristi se ona nit u kojoj fosfodiestarske veze imaju pravac oružanja 3’5’).

• Ugrađujući nukleotuida vrši se po principu komplementarnosti.

Princip transkripcije

Da bi se izvršila transkripcija lanci DNK moraju da se iz spiralno uvijenih prebace u linearni oblik ,zatim se lanci razdvoje, gde jedan od njih služi kao kalup prema kome se ređaju komplementarni nukleotidi RNK: naspram adenina DNK postavlja se uracil RNK, a naspram guanina DNK – citozin RNK:

Smer transkripcijeTranskripcija se uvek odvija u pravcu 5-3, tako da se prvo sintetiše 5 kraj RNK transkripta na koji se vezuju ribozomi i započinju sa sintezom NH2 kraja polipeptidnog lanca

Faze – Inicijacija: RNK polimeraza se vezuje za promotor na DNK; mesto početka transkripcije – Elongacija: RNK polimeraza odvija jedan zavoj DNK, a zatim povezuje prva dva ribonukleozid trifosfata 3’-5’ fosfodiestarskom vezom; transkripcija u smeru 5’-3’ – Terminacija: terminacioni signal, zaustavlja se transkripcija, RNK se oslobađa sa matrice

Faze

• Tokom elongacije, enzimi idu duž lanca i vrše popravke nastale tokom transkripcije koja je veoma brz proces

• Ređanje nukleotida RNK vrši se sve dok RNK polimeraza ne stigne do niza nukleotida, odnosno specifične sekvence,koje se nazivaju

 terminacioni (stop) signal .• Na tom mestu se transkripcija zaustavlja, a novonastali molekul RNK

se oslobađa sa matrice ( do tada je bio za matricu vezan samo svojim 3' krajem) . To predstavlja poslednju fazu terminacije.

Faze transkripcije

Kada se sekvenca prepiše formira se delimično dvostruka RNK u vidu ukosnice, što je znak za završetak sinteze iRNK tj. faza terimnacije (ro nezavisna transkripcijaDrugi tip završetka sinteze podrazumeva vezivanje proteina – ro faktora, za specifičnu sekvencu na iRNK, nakon čega se RNK polimeraza i iRNK odvajaju od DNK (ro zavisna transkripcija). Sintetisani lanac iRNK naziva se transkript.

Obrada transkripta

• Transkripti se moraju u jedru dodatno obraditi da bi postale zrele RNK sposobne da otpočnu sintezu proteina. Ovaj proces označava se kao obrada primarnog transkripta.

• Tek tako obrađene šalju se u citoplazmu gde će se obaviti sinteza proteina. Dodatna obrada prepisanih RNK sastoji se u modifikaciji njihovih krajeva (5' i 3' kraja) i u isecanju introna i spajanju egzona.

• Mehanizam iskrajanja introna mora biti takav da obezbedi maksimalnu preciznost, jer bi greška u samo jednom nukleotidu potpuno promenila sve kodone u i-RNK od tog mesta nadalje i proizvela pogrešnu informaciju za sintezu proteina.

Procesovanje primarnog transkripta iRNK (GENE SPLICING)

Primarni transkript iRNK je komplementaran sekvenci DNK.

INTRONI – nekodirajuće sekvenceEKSONI – kodirajuće sekvence

Isecanje introna, obrađeni transkript napušta jedro i odlazi u citoplazmu

Mesta alternativnog splajsovanja – omogućavaju da isti primarni transkript bude obrađen na različite načine (različiti proteinski produkti na osnovu iste DNK MATRICE)

Greške u splajsovanju se smatraju mutacijom i uzrokom bolesti sa genetičkom osnovom.

Kategorije RNK

Tri glavne kategorije RNK se razlikuju po baznom sastavu, sekundarnoj strukturi i veličini: – iRNK– tRNK – rRNK • Obradi primarnog transkripta podležu sve tri kategorije RNK kod

eukariota i rRNK i tRNK kod prokariota. • Jedina RNK koja se ne obrađuje je iRNK prokariota.

Vrste RNKVrste RNK: • iRNK • tRNK • rRNK • snRNK – male nuklearne RNK (za splajsovanje primarnog transkripta,

formiranje ribozoma) • ncRNK - male nekodirajuće RNK: miRNK – mikro RNK (kodirane

intronima); siRNK - male interferentne RNK (dvolančane RNK)..... Procesi RNK interferencije (RNAi) koriste nekodirajuće male RNK da bi se regulisali procesi transkripcije, splajsovanja i translacije.

Promotor – nukleotidna sekvenca koja se nalazi „uzvodno“ (u 5’ smeru) od ciljnog genaPromotorska sekvenca usmerava RNK polimerazu u specifičnom pravcu duž DNK lanca

Transkripcija se nastavlja dok RNK polimeraza ne dođe do terminalne sekvence. Na 3’ kraj iRNK se dodaje poli –A rep (niz 30-200 A) – stabilizuje molekul iRNK

Transkripcioni faktori

OPŠTI – neophodni za transkripciju svih strukturnih proteina;SPECIFIČNI – imaju specijalizovanu ulogu i aktiviraju samo određene gene na određenom stadijumu razvića

Efektivna transkripcija uključuje interakciju oko 50 različitih proteina.

Transkripcioni faktoriZa inicijaciju transkripcije većine strukturnih gena neophodno je sedam opštih transkripcionih faktora: . TFIIA,• TFIIB,• TFIID, • TFIIE, • TFIIF, • TFIIH i • TFIIJ (zajedno sa RNK polimerazom II se vezuju za promotorski region

u blizini mesta inicijacije).

1. Jedna subjedinica TFIID se vezuje za TATA blok (nalazi se uzvodno od mesta početka transkripcije i ima ulogu da postavi preinicijalni kompleks).

2. Za subjedinicu TFIID se vezuje bar još osam proteina.

3. Vezuju se TFIIA i TFIIB.

4. TFIIF se vezuje za RNK polimerazu II i pozicionira je do promotora.

5. Posle vezivanja RNK polimeraze II vezuju se TFIIE, TFIIH i TFIIJ.

6. Sledi aktivacija kompleksa za koju je potrebna hidroliza ATP-a katalizovana faktorom TFIIH.

Enhancers i silencer

• POJAČIVAČI (ENHANCERS) – regulatorne DNK sekvence koje putem interakcija sa specifičnim transkripcionim faktorima povećavaju nivo genske transkripcije

• UTIŠIVAČI (SILENCERS) - regulatorne DNK sekvence koje putem interakcija sa specifičnim transkripcionim faktorima smanjuju ili dovode do represije genske aktivnosti

Enhancers i silencer

Mutacije u genima

Mutacije u enhenserima, sajlenserima, promotorskim regionima, kao i genima koji kodiraju transkripcione faktore mogu dovesti do poremećaja u ekspresiji gena, odnosno genetički uslovljenih bolesti.

MOTIV OPIS PRIMER OBOLJENJA

Heliks-turn-heliks

Dva α heliksa su spojena kratkim aminokiselinskim lancem koji formira zavoj. Karboksi-terminalni zavoj se vezuje za veliki žleb DNK.

HOXD13 i HOXA13 mutacije su uzrok sinpolidaktilije i hand-foot-genitalnog sindroma.

Heliks-loop-heliks

Dva α heliksa su povezana fleksibilnom petljom. Ovi proteini lako formiraju heterodimere tako da različite kombinacije između subjedinica mogu dati mnogo veću grupu različituh proteina.

Mutacije u TWIST genu akrocefalosindaktilija tipa III.

Zn-finger Molekul cinka stabilizuje aminokiselinsku strukturu (npr. α helikse ili β ploče), vezivanje za veliki žleb DNK.

BRCA1 gen (karcinom dojke), WT1 gen (Wilms-ov tumor), GL13 gen (Greig-ov sindrom), VDR gen

Leucin-zipper Dva leucinom bogata α heliksa se drže zajedno bočnim amino-kiselinskim lancima i formiraju Y strukturu čiji bočni lanci vezuju veliki žleb DNK.

RB1 (reinoblastom) gen, JUN i FOS onkogeni

β sheets Bočni lanci se nastavljaju sa dvostrane β ploče i formiraju kontakt sa DNK heliksom.

TBX genska familija: TBX-5 (Holt-Oram-ov sindrom), TBX3 (ulnar-mammary sindrom)

Osnovne klase DNK-vezujućih motiva u transkripcionim faktorima

Transkripciona aktivnost hromatina

Euhromatin– karakteriše ga acetilacija histona (vezivanje acetil grupe za lizinske ostatke u histonima) – acetilacija histona smanjuje njihovo vezivanje za DNK (dekondenzacija);EUHROMATIN je transkripciono aktivan!!

Heterohromatin– karakteriše ga manja acetilacija histona (kondenzovaniji);HETEROHROMATIN je transkripcino neaktivan!!

Struktura hromatina

HROMATIN – DNK + histini

METILACIJA DNK

Dodavanje metil (-CH3) grupe na baze nakon sinteze DNK, najčešće na citozin

Metilacija

• DNK se metilira na citozinskim ostacima koji prethode guaninima u polinukleotidnom lancu (CpG dinukleotidi).

•  Metiliranje inhibira transkripciju gena. • Geni koji su uvek aktivni nisu metilirani. Metilacija ne sprečava

replikaciju molekule DNK.Održavanje nekog uzorka metilacije iz jedne generacije ćelija u drugu rezultat je aktivnosti enzima metiltransferaze

• Metiliranje DNK važno je u kontroli ekspresije nekih gena aktivnih tokom embrionalnog razvitka.To se zove genomski imprinting

Slide 1Ekspresija genaSlide 3Regulacija genske ekspresijeSlide 5TranskripcijaSlide 7Slide 8RNK-polimerazaRNK polimerazaSlide 11Mehanizam dejstva RNK-polimerazeTranskripcioni mehurMehanizam dejstva RNK-polimerazePrincip transkripcijeSmer transkripcijeFazeFazeFaze transkripcijeSlide 20Obrada transkriptaProcesovanje primarnog transkripta iRNK (GENE SPLICING)Slide 23Kategorije RNKVrste RNKSlide 26Slide 27Transkripcioni faktoriTranskripcioni faktoriSlide 30Enhancers i silencerEnhancers i silencerMutacije u genimaSlide 34Transkripciona aktivnost hromatinaStruktura hromatinaMETILACIJA DNKMetilacija