EKSPRESIJA GENOV ZA EVOLUCIJO ETILENA TER ABSCIZIJA ... · Kolarič J. Ekspresija genov za...
Transcript of EKSPRESIJA GENOV ZA EVOLUCIJO ETILENA TER ABSCIZIJA ... · Kolarič J. Ekspresija genov za...
UNIVERZA V MARIBORU
FAKULTETA ZA KMETIJSTVO IN BIOSISTEMSKE VEDE
EKSPRESIJA GENOV ZA EVOLUCIJO ETILENA TER
ABSCIZIJA PLODIČEV JABLANE (Malus domestica
Borkh.) PO TRETIRANJU Z RASTNIMI REGULATORJI
IN SENČENJEM
DOKTORSKA DISERTACIJA
Oktober 2011 Jure KOLARIČ
UNIVERZA V MARIBORU FAKULTETA ZA KMETIJSTVO IN BIOSISTEMSKE VEDE
AGRONOMIJA
UNIVERSITY OF MARIBOR FACULTY OF AGRICULTURE AND LIFE SCIENCES
AGRONOMY
Doktorska disertacija
EKSPRESIJA GENOV ZA EVOLUCIJO ETILENA TER ABSCIZIJA PLODIČEV JABLANE (Malus domestica
Borkh.) PO TRETIRANJU Z RASTNIMI REGULATORJI IN SENČENJEM
Ph. D. THESIS
EXPRESSION OF GENES ASSOCIATED WITH ETHYLENE EVOLUTION AND ABSCISSION OF
APPLE (Malus domestica Borkh.) FRUITLETS AFTER PLANT GROWTH REGULATORS AND SHADING
TREATMENTS
Oktober 2011 Jure KOLARIČ
Mentor: doc. dr. Stanislav TOJNKO UDK: 634.11:631.631.543.5:631.811.98(043)=863
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. III Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
Komisija za oceno doktorske disertacije:
Predsednik: red. prof. dr. Anton IVANČIČ
Mentor: doc. dr. Stanislav TOJNKO
Članica: doc. dr. Tatjana UNUK
Član: red. prof. dr. Zlatko ČMELIK
Komisija za zagovor doktorske disertacije:
Predsednik: red. prof. dr. Branko KRAMBERGER
Mentor: doc. dr. Stanislav TOJNKO
Član: red. prof. dr. Zlatko ČMELIK
Član: red. prof. dr. Anton IVANČIČ
Članica: doc. dr. Tatjana UNUK
Član: dr. Matej STOPAR
Lektorirala: Jožica MEGLA, prof. slov. j.
Datum zagovora: 13. oktober 2011
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. IV Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
EKSPRESIJA GENOV ZA EVOLUCIJO ETILENA TER ABSCIZIJA PLODIČEV JABLANE (Malus domestica Borkh.) PO TRETIRANJU Z RASTNIMI REGULATORJI IN SENČENJEM
Uporaba nekaterih rastnih regulatorjev z namenom redčenja plodičev pri jablani (Malus domestica Borkh.) je splošno sprejet tehnološki ukrep, čeprav način delovanja teh sredstev ni popolnoma jasen. Prav tako ni dorečena vloga etilena v procesu abscizije plodičev, čeprav se upravičeno domneva, da ta rastlinski hormon pomembno vpliva na razvoj abscizije plodičev. V dvoletnem poskusu, ki je bil zastavljen v poskusnem nasadu na Brdu pri Lukovici, smo na drevesih sorte 'Zlati delišes' spremljali evolucijo etilena ter izraženost genov, odgovornih za sintezo etilena (MdACO1, MdACS5A in MdACS5B) po tretiranju z naftil ocetno kislino (NAA), benziladeninom (BA), etefonom (ETEF) in senčenjem (SEN). Tretiranje z rastnimi regulatorji oz. senčenje je vplivalo na večjo ekspresijo genov odgovornih za sintezo etilena. Lateralni plodiči (LP) so bili veliko bolj dovzetni na aplikacijo rastnih regulatorjev oz. SEN v primerjavi s centralnimi plodiči (CP), kar se je odrazilo tako na genetskem nivoju, kakor tudi pri dejanskem spremljanju abscizije. Pokazalo se je, da je izraženost MdACO1 dober indikator kasnejše abscizije, medtem ko se MdACS5A in MdACS5B izražata na veliko nižjem nivoju. V primeru LP so obravnavanja NAA, BA, ETEF in SEN povzročila močno povišano izraženost MdACO1, medtem ko je v primeru CP samo aplikacija ETEF vplivala na izraženost MdACO1. Posledično se je abscizija CP izvršila samo v primeru obravnavanja ETEF, medtem ko je bilo odpadanje LP prisotno tudi pri obravnavanjih NAA, BA in SEN. Višja izraženost opazovanih genov v tkivu AZ je bila zabeležena samo v primeru obravnavanja ETEF. Kljub temu da izraženost MdACO1 nakazuje prisotnost abscizijskih procesov, pa količina tarčnega gena relativne kvantifikacije ni sovpadala z deležem plodičev, ki so bili podvrženi absciziji. Močnejša je povezava med frekvenco odpadanja plodičev in količino etilena oz. izraženostjo gena MdACO1, kjer smo ugotovili, precejšnje razlike v intenzivnosti odpadanja med obravnavanji. Dober pokazatelj začetka abscizijskih procesov je tudi inhibicija rasti plodičev, kjer smo ugotovili, da vsi uporabljeni rastni regulatorji in SEN zaviranjo rast plodičev, ki so kasneje podvrženi absciziji, vendar z različno intenziteto. Glede na naše rezultate lahko domnevamo, da aplikacija rastnih regulatorjev in senčenje vplivajo na višjo ekspresijo genov, povezanih s sintezo etilena v plodičih, ki bodo podvrženi absciziji, kar je poleg inhibicije rasti možen vzrok za začetek abscizijskih procesov. Ključne besede: abscizija, evolucija etilena, redčenje, rastni regulatorji, genetska
ekspresija, qPCR
OP: XIII, 110 s., 5 pregl., 3 slike, 30 graf., 118 ref.
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. V Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
EXPRESSION OF GENES ASSOCIATED WITH ETHYLENE EVOLUTION AND ABSCISSION OF APPLE (Malus domestica Borkh.) FRUITLETS AFTER PLANT GROWTH REGULATORS AND SHADING TREATMENTS
The use of plant growth regulators for thinning of apple (Malus domestica Borkh.) fruitlets is a well established measure, although its physiological basis is still not fully explained. Also, it is not clear what the role of ethylene in the young fruit abscission is, although there is reason to believe that this gaseous plant hormone has an important role in the development of abscission. Our two years long investigation, which took place in the experimental plantation situated at Brdo near Lukovica, involved the variety 'Golden Delicious'. The main objective was to observe ethylene evolution and expression of genes responsible for ethylene biosynthesis (MdACO1, MdACS5A in MdACS5B) after the application of naphthaleneacetic acid (NAA), benzyladenine (BA), ethephon (ETEF), or shading (SEN). The application of plant growth regulators and shading resulted in higher expression of genes responsible for ethylene biosynthesis. Lateral fruitlets (LF) were more susceptible to application with plant growth regulators and shading, and this was reflected on the genetic level as well as on the actual fruitlet abscission. It was found that the expression of MdACO1 could be considered as a good indicator of abscission while MdACS5A and MdACS5B were expressed at a much lower level. In the case of LF, the expression of MdACO1 was significantly increased by NAA, BA, ETEF and shading treatment while in the case of king fruitlets (KF), only the ETEF application increased the MdACO1 expression. Consequently, the abscission of KF was present only in the ETEF treatment while LF also abscised after the treatment with NAA, BA and shading. Higher expression of studied genes in the abscission zone tissue was also recorded only after the ETEF treatment. Although the MdACO1 indicate the presence of abscission processes, the expression of target gene does not correspond with the actual number of abscised fruitlets. We found a close relationship between ethylene evolution and expression of MdACO1 and abscission dynamics. In the case of abscission dynamics, differences between treatments were recorded. Plant growth regulators and shading had a differently strong effect on the inhibition of fruit growth, although the growth of fruitlets subjected to abscission was inhibited by all treatments. Our results suggest that the application of growth regulators and shading have positive effect on the expression of genes associated with the synthesis of ethylene in fruitlets which will be affected by abscission process.
Key words: abscission, ethylene evolution, thinning, growth regulators, gene expression,
qPCR
NO: XIII, 110 p., 5 tab., 3 pic., 30 graph., 118 ref.
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. VI Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
Kazalo vsebine
1 UVOD ............................................................................................................................ 1
1.1 Opredelitev problema ........................................................................................... 1
1.2 Cilji naloge ............................................................................................................. 2
1.3 Delovne hipoteze .................................................................................................... 3
2 PREGLED OBJAV ...................................................................................................... 4
2.1 Regulacija obremenitve dreves s pridelkom ....................................................... 4
2.2 Fiziološke osnove abscizije plodičev .................................................................... 8
2.3 Sredstva za regulacijo abscizije plodičev .......................................................... 13
2.3.1 Mehanizem delovanja sredstev za redčenje ................................................... 14
2.3.2 Redčenje plodičev .......................................................................................... 16
2.3.3 Sredstva za redčenje cvetov/plodičev jablane................................................ 17
2.3.4 1-naftil ocetna kislina ali NAA ...................................................................... 18
2.3.5 1-naftilacetamid ali NAD ............................................................................... 19
2.3.6 6-benziladenin ali BA .................................................................................... 19
2.3.7 Etefon ............................................................................................................. 20
2.3.8 Karbaril .......................................................................................................... 21
2.4 Vpliv zunanjih dejavnikov na učinkovitost redčenja ...................................... 22
2.5 Vloga etilena pri absciziji plodičev .................................................................... 25
2.6 Vloga posameznih genov ..................................................................................... 29
3 MATERIALI IN METODE ...................................................................................... 34
3.1 Zasnova poljskega poskusa ................................................................................ 34
3.2 Meritve evolucije etilena ..................................................................................... 40
3.3 Genetske analize .................................................................................................. 41
3.3.1 Vzorčenje ....................................................................................................... 41
3.3.2 Izolacija RNA ................................................................................................ 42
3.3.3 Razgradnja genomske DNA .......................................................................... 43
3.3.4 Reverzna transkripcija ................................................................................... 43
3.3.5 Kvantitativna PCR v realnem času (qPCR) ................................................... 44
3.3.6 Relativna kvantifikacija ................................................................................. 46
3.3.7 Oligonukleotidni začetniki ............................................................................. 47
3.4 Statistična obdelava podatkov ........................................................................... 48
4 REZULTATI............................................................................................................... 49
4.1 Pridelek ................................................................................................................ 49
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. VII Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
4.2 Frekvenca odpadanja plodičev .......................................................................... 55
4.3 Evolucija etilena .................................................................................................. 60
4.4 Ekspresija MdACS5A, MdACS5B in MdACO1 ................................................. 62
4.4.1 Poskus 2008 ................................................................................................... 62
4.4.2 Poskus 2009 ................................................................................................... 66
4.5 Prirast plodičev .................................................................................................... 77
5 RAZPRAVA ................................................................................................................ 84
6 SKLEPI ....................................................................................................................... 94
7 POVZETEK ................................................................................................................ 96
8 SUMMARY ................................................................................................................. 99
9 LITERATURA ......................................................................................................... 101
ZAHVALA
PRILOGE
Delovni življenjepis
Osebna bibliografija
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. VIII Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
Kazalo preglednic
Preglednica 1: Najnižje, najvišje in povprečne temperature ozračja ter količina
padavin med 1.5. in 31.5. v letu 2008 na opazovalni postaji
Brdo pri Lukovici. ...................................................................................... 38
Preglednica 2: Najnižje, najvišje in povprečne temperature ozračja ter količina
padavin med 1.5. in 31.5. v letu 2009 na opazovalni postaji
Brdo pri Lukovici. ...................................................................................... 39
Preglednica 3: Zaporedja vseh začetnih oligonukleotidnih začetnikov (F) in
končnih oligonukleotidnih začetnikov (R) uporabljenih v qPCR
pri tej raziskavi ........................................................................................... 48
Preglednica 4: Vpliv NAA, BA, etefona in senčenja na količino in velikost dozorelih
plodov v letu 2008……………………..…………………………………50
Preglednica 5: Vpliv NAA, BA, etefona in senčenja na količino in velikost dozorelih
plodov v letu 2009..………………………………………………………50
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. IX Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
Kazalo slik
Slika 1: Socvetje jablane. Številke ob plodičih kažejo hierarhično razvrstitev
plodov glede na jakost dominance (Bangerth 2000). ............................................ 12
Slika 2: Shema sintetske poti etilena. V začetni stopnji se iz metionina s pomočjo
S-adenozil metionin sintaze sintetizira S-adenozil metionin. V naslednjih
stopnji se s pomočjo encima ACS sintetizira 1-amino-ciklopropan
karbonska kislina, kot stranski produkt pa nastaja MTA, ki vstopa v
metioninski cikel katerega končni produkt je nastanek metionina. V končni
fazi se pod vplivom ACO sintetizira etilen, medtem ko kot stranski produkt
nastaneta ogljikov dioksid in vodikov cianid (Hedden in Thomas 2006,
str. 127). ................................................................................................................. 28
Slika 3: Izvedba senčenja s pomočjo polipropilenske prekrivke, ki je bila nameščena
na leseno armaturo. ................................................................................................ 36
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. X Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
Kazalo grafikonov
Grafikon 1: Povprečno število plodov na drevo ob obiranju pri sorti 'Zlati delišes' v
letih 2008 in 2009. .......................................................................................... 52
Grafikon 2: Povprečno število plodov na drevo ob obiranju na vsakih 100 socvetij pri
sorti 'Zlati delišes' v letih 2008 in 2009. ......................................................... 53
Grafikon 3: Povprečen pridelek na drevo v letih 2008 in 2009
pri sorti 'Zlati delišes'. ..................................................................................... 54
Grafikon 4: Povprečna masa plodov ob obiranju pri sorti 'Zlati delišes' v letih 2008
(A) in 2009 (B). .............................................................................................. 55
Grafikon 5: Dinamika odpadanja centralnih plodičev (CP) v letu 2008 po tretiranju z
NAA, BA, ETEF in SEN. ............................................................................... 56
Grafikon 6: Dinamika odpadanja lateralnih plodičev (LP) v letu 2008 po tretiranju z
NAA, BA, ETEF in SEN………………………………………………... ….57
Grafikon 7: Dinamika odpadanja centralnih plodičev (CP) v letu 2009 po tretiranju z
NAA, BA, ETEF in SEN. ............................................................................... 58
Grafikon 8: Dinamika odpadanja lateralnih plodičev (LP) v letu 2009 po tretiranju z
NAA, BA, ETEF in SEN. ............................................................................... 59
Grafikon 9: Evolucija etilena iz centralnih plodičev (CP) v terminih 0, 2, 5 in 8 DAT
z rastnimi regulatorji oz. SEN v letu 2008. .................................................... 60
Grafikon 10: Evolucija etilena iz lateralnih plodičev (LP) v terminih 0, 2, 5 in 8 DAT
z rastnimi regulatorji oz. SEN v letu 2008. .................................................... 61
Grafikon 11: Ekspresija MdACS5A v centralnih plodičih (A), lateralnih plodičih (B),
abscizijski coni centralnih plodičev (C) in abscizijski coni lateralnih
plodičev (D), 8 dni po aplikaciji NAA, BA, ETEF in SEN
v letu 2008. ..................................................................................................... 63
Grafikon 12: Ekspresija MdACS5B v centralnih plodičih (A), lateralnih plodičih (B),
abscizijski coni centralnih plodičev (C) in abscizijski coni lateralnih
plodičev (D), 8 dni po aplikaciji NAA, BA, ETEF in SEN v letu 2008. ....... 64
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. XI Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
Grafikon 13: Ekspresija MdACO1 v centralnih plodičih (A), lateralnih plodičih (B),
abscizijski coni centralnih plodičev (C) in abscizijski coni lateralnih
plodičev (D), 8 dni po aplikaciji NAA, BA, ETEF in SEN v letu 2008. ....... 65
Grafikon 14: Ekspresija MdACS5A v tkivu abscizijske cone centralnih plodičev (AC)
v terminih 0, 1, 4 in 7 DAT z NAA, BA, ETEF in SEN
v letu 2009. ..................................................................................................... 66
Grafikon 15: Ekspresija MdACS5A v tkivu abscizijske cone lateralnih plodičev (AL)
v terminih 0, 1, 4 in 7 DAT z NAA, BA, ETEF in SEN
v letu 2009. ..................................................................................................... 67
Grafikon 16: Ekspresija MdACS5A v tkivu centralnih plodičev (CP) v terminih 0, 1,
4 in 7 DAT z NAA, BA, ETEF in SEN v letu 2009. ...................................... 68
Grafikon 17: Ekspresija MdACS5A v tkivu lateralnih plodičev (LP) v terminih 0, 1, 4
in 7 DAT z NAA, BA, ETEF in SEN v letu 2009. ......................................... 69
Grafikon 18: Ekspresija MdACS5B v tkivu abscizijske cone centralnih plodičev (AC)
v terminih 0, 1, 4 in 7 DAT z NAA, BA, ETEF in SEN
v letu 2009. ..................................................................................................... 70
Grafikon 19: Ekspresija MdACS5B v tkivu abscizijske cone lateralnih plodičev (AL)
v terminih 0, 1, 4 in 7 DAT z NAA, BA, ETEF in SEN
v letu 2009. ..................................................................................................... 71
Grafikon 20: Ekspresija MdACS5B v tkivu centralnih plodičev (CP) v terminih 0, 1,
4 in 7 DAT z NAA, BA, ETEF in SEN v letu 2009. ...................................... 72
Grafikon 21: Ekspresija MdACS5B v tkivu lateralnih plodičev (LP) v terminih 0, 1, 4
in 7 DAT z NAA, BA, ETEF in SEN v letu 2009. ......................................... 73
Grafikon 22: Ekspresija MdACO1 v tkivu abscizijske cone centralnih plodičev (AC)
v terminih 0, 1, 4 in 7 DAT z NAA, BA, ETEF in SEN
v letu 2009. ..................................................................................................... 74
Grafikon 23: Ekspresija MdACO1 v tkivu abscizijske cone lateralnih plodičev (AL) v
terminih 0, 1, 4 in 7 DAT z NAA, BA, ETEF in SEN
v letu 2009. ..................................................................................................... 75
Grafikon 24: Ekspresija MdACO1 v tkivu centralnih plodičev (CP) v terminih 0, 1, 4
in 7 DAT z NAA, BA, ETEF in SEN v letu 2009. ......................................... 76
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. XII Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
Grafikon 25: Ekspresija MdACO1 v tkivu lateralnih plodičev (LP) v terminih 0, 1, 4
in 7 DAT z NAA, BA, ETEF in SEN v letu 2009. ......................................... 77
Grafikon 26: Premer lateralnih (A) in centralnih (B) plodičev, ki so bili podvrženi
absciziji (črni kvadrat) in tistih, ki niso odpadli (rdeči krog)
pri K obravnavanju. ........................................................................................ 78
Grafikon 27: Prirast lateralnih (A) in centralnih (B) plodičev, ki so bili podvrženi
absciziji (črni kvadrat) in tistih, ki niso odpadli (rdeči krog)
pri obravnavanju NAA. .................................................................................. 79
Grafikon 28: Prirast lateralnih (A) in centralnih (B) plodičev, ki so bili podvrženi
absciziji (črni kvadrat) in tistih, ki niso odpadli (rdeči krog)
pri obravnavanju BA. ..................................................................................... 80
Grafikon 29: Prirast lateralnih (A) in centralnih (B) plodičev, ki so bili podvrženi
absciziji (črni kvadrat) in tistih, ki niso odpadli (rdeči krog)
pri obravnavanju ETEF. ................................................................................. 82
Grafikon 30: Prirast lateralnih (A) in centralnih (B) plodičev, ki so bili podvrženi
absciziji (črni kvadrat) in tistih, ki niso odpadli (rdeči krog)
pri obravnavanju SEN. ................................................................................... 83
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. XIII Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
Okrajšave in simboli
1-MCP 1-metil-ciklopropan
ACC 1-amino-ciklopropan karbonska kislina
ACO 1-amino-ciklopropran oksidaza
ACS 1-amino-ciklopropan sintaza
AVG amino-etoksi-vinil-glicin
AZ abscizijska cona
BA benziladenin
cDNA komplementarna DNA
CP centralni plodič
CS socvetje s centralnim plodičem
DAT dni po tretiranju
DNA deoksiribonukleinska kislina
ETEF etefon
FC tkivo plodičev
GA4 giberelinska kislina 4
IAA indol ocetna kislina
K kontrola
LP lateralni plodič
LS socvetje z lateralnimi plodiči
NAA naftil ocetna kislina
PAR fotosintetsko aktivno sevanje
PCR verižna reakcija s polimarazo
RNA ribonukleinska kislina
SEN senčenje
qPCR kvantitativna verižna reakcija s polimerazo
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 1 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
1 UVOD
1.1 Opredelitev problema
V sadjarstvu se pri nekaterih gospodarsko pomembnih sadnih vrstah srečujemo s pojavom
neredne rodnosti in relativno nizkim deležem plodov 1. kakovostnega razreda. Vzrok za
pojav omenjenih težav je v prevelikem številu plodov na drevesu, kar negativno vpliva na
kakovost plodov. Prav tako veliko število plodov z večjim izločanjem hormonov, ki
nastajajo v semenu plodičev, negativno vpliva na začetek diferenciacije cvetnih brstov, ki
so pomembni za razvoj cvetov v prihodnji vegetaciji. Večina pomembnejših sadnih vrst je
razvila regulacijske mehanizme, s katerimi uravnavajo število plodov na drevesih. To so
obdobja, v katerih plodovi množično odpadajo (npr. »junijsko« trebljenje). Pojav
naravnega trebljenja plodičev je pri jablanah in hruškah sicer močno izražen, vendar je za
doseganje redne rodnosti in visoke kvalitete plodov še vedno potrebno dodatno redčenje.
V sodobnem sadjarstvu se redčenje plodičev jablane izvaja s pomočjo kemičnih
pripravkov, kot so naftil ocetna kislina (NAA), naftilacetamid (NAAm), benziladenin
(BA), etefon, karbaril in drugi (Wertheim 2000). Za vse te pripravke je znano, da poudarijo
učinek trebljenja, vendar način delovanja teh pripravkov še ni popolnoma pojasnjen.
Ugotovljeno je bilo tudi, da je učinkovitost delovanja teh pripravkov zelo variabilna in je
precej odvisna od okoljskih dejavnikov (temperatura, zračna vlaga, svetloba) in stanja
drevesa (genotip, prehranjenost s hranili, podlaga) (Byers 2003). V zadnjih letih prevladuje
mnenje, da je odpadanje plodičev povezano s spremembami v hormonskem stanju rastline.
Iz tega vidika je pomembna predvsem vloga rastlinskega hormona etilena kot pospeševalca
abscizijskih procesov ter avksinov oz. indol ocetne kisline (IAA), za katero se predvideva,
da deluje kot inhibitor abscizije. Za etilen je znano, da spodbuja odpadanje plodičev,
vendar še ni jasno, ali sodeluje tudi pri indukciji samega procesa. Prav tako obstajajo
različna mnenja, ali je etilen esencialni faktor pri odpadanju plodičev.
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 2 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
V zadnjem obdobju na pomenu pridobivajo raziskave o vlogi genov, ki so povezani s
procesom abscizije. V ospredju so predvsem geni, ki so povezani s sintezo etilena, ter geni,
za katere se predvideva, da vplivajo na sintezo hidrolitskih encimov, poleg tega pa se išče
gene, ki bi bili povezani s tvorbo IAA. V plodičih, ki so podvrženi absciziji, je bila v
nekaterih primerih dokazana višja stopnja ekspresije genov, za katere se domneva, da
sodelujejo v sintetski poti etilena. Kljub temu ni jasno, ali je ekspresija genov, povezanih s
sintezo etilena, razlog za pričetek abscizije ali pa gre zgolj za posledico pričetka
abscizijskih procesov. Prav tako je na genetskem nivoju zelo malo znanega o vplivu
različnih rastnih regulatorjev na terminsko izražanje genov. Za boljše poznavanje abscizije
plodičev bi bilo ključnega pomena odkriti dejavnike, ki sprožijo začetek abscizije.
1.2 Cilji naloge
S svojim raziskovanjem želim doprinesti k razumevanju procesa abscizije plodičev pri
jablani. Sama iniciacija procesa, ki aktivira tvorbo abscizijskega tkiva in korelacije med
dejavniki, ki vplivajo na tvorbo abscizijskega tkiva, so za enkrat slabo poznani. Kljub
predhodnim raziskavam še ni popolnoma jasna vloga etilena pri procesu abscizije plodičev.
Z našo raziskavo želimo ugotoviti, ali je etilen tisti dejavnik, ki je prisoten v procesu
abscizije ne glede na to, s čim spodbudimo plodiče k odpadanju (rastni regulatorji ali
redukcija svetlobe). Znano je namreč, da etefon kot sredstvo za redčenje plodičev vpliva na
pospešeno tvorbo etilena (Stopar 1998). Nas pa zanima, ali pripravka NAA in BA ter
redukcija svetlobe prav tako vplivajo na ekspresijo genov, odgovornih za sintezo etilena,
ali pa je njihov mehanizem delovanja drugačen od procesa, ki ga izzove aplikacija etefona.
Predvidevamo, da se bodo različni pripravki odražali v povezavi z ekspresijo različnih
genov oz. različno intenziteto. Glede na to, da se proces abscizije začne, preden so vidni
zunanji znaki na tkivu AZ, ki je posledica delovanja hidrolitskih encimov, nas zanima, ali
je mogoče s pomočjo sodobnih genetskih metod na podlagi ekspresije določenih genov
ugotoviti spremembe, ki se zgodijo v plodičih, ki bodo odpadli. Na ta način bi lahko že v
zgodnji fazi ocenili, kolikšen delež plodov bo podvržen odpadanju. V preteklosti je bilo
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 3 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
potrjeno, da so centralni plodiči (CP) manj podvrženi absciziji v primerjavi z lateralnimi
plodiči (LP). Zaradi tega bomo s pomočjo natančnega spremljanja fizioloških procesov v
obeh tipih plodičev skušali ugotoviti, ali se LP tudi na genetskem nivoju drugače odzivajo
na aplikacijo kemičnih sredstev ali redukcijo svetlobe v primerjavi s CP.
1.3 Delovne hipoteze
Etilen je ključni dejavnik v procesu abscizije plodičev jablane.
Redukcija svetlobe ali aplikacija NAA, BA oz. ETEF v fazi premera plodičev 10 mm
povzroči njihovo odpadanje.
Centralni in lateralni plodiči se bodo različno odzvali na aplikacijo kemičnih sredstev za
redčenje oz. senčenje.
Aplikacija ETEF bo povzročila močan in nedvoumen vpliv na ekspresijo genov, povezanih
s sintezo etilena.
Redukcija svetlobe vpliva na ekspresijo genov, ki so odgovorni za sintezo etilena.
NAA in BA vplivata na ekspresijo genov, odgovornih za sintezo etilena, vendar ne tako
intenzivno kot ETEF.
Gen MdACO1 je dober indikator začetka abscizije plodičev.
Na podlagi ekspresije genov je možno ugotoviti učinkovitost sredstva za redčenje v
zgodnji fazi po aplikaciji.
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 4 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
2 PREGLED OBJAV
2.1 Regulacija obremenitve dreves s pridelkom
Večina sadnih vrst v optimalnih pogojih ter ob ustrezni oskrbi in prehranjenosti s hranili
močno zacveti. Posledično zasnuje veliko število plodov, običajno več kot je potrebno za
optimalno obremenitev drevesa in s tem povezan kakovosten pridelek. Med takšne sadne
vrste sodi tudi jablana (Malus domestica Borkh.).
Brez uporabe tehnoloških ukrepov, s katerimi reguliramo število plodov na določenem
drevesu, smo v jeseni priča obilnemu pridelku nekvalitetnih in majhnih plodov, ki na trgu
nimajo vrednosti. Obenem s takšnim (ne)ukrepanjem vzpodbudimo še dodatno težavo, ki
je izrazita pri nekaterih gospodarsko pomembnih sadnih vrstah (med katere sodi tudi
jablana) in se imenuje izmenična rodnost ali alternanca. Pri alternanci gre za pojav, ko letu
z izredno močnim cvetenjem (´on year´) sledi leto z izrazito slabim cvetenjem (´off year´)
(Byers 2003). Vzroki za alternanco so v slabi diferenciaciji cvetnih brstov v letu z obilnim
cvetenjem. Obilnemu cvetenju ob normalnih pogojih sledi tudi velik nastavek plodov, ki
negativno vpliva na iniciacijo diferenciacije cvetnih brstov, ki je pomembna za cvetni
nastavek v prihodnji vegetaciji. Ugotovili so, da v semenskih zasnovah mladih plodičev
nastajajo razmeroma velike količine giberelinov, ki so inhibitorji začetka diferenciacije
cvetnih zasnov (Faust 1989). Da je možno izmenično rodnost kontrolirati z
odstranjevanjem plodov takoj po cvetenju, sta leta 1919 prva opazila Russel in Pickering
(Faust 1989). Podobno ugotovitev je mnogo let pozneje, na podlagi številnih raziskav,
podal Greene (2002), ki meni, da je preprečitev alternance in zagotavljanje rednega
pridelka možno le z regulacijo nastavka plodov. Z redčenjem plodičev, kot tehnološkim
ukrepom, torej pozitivno vplivamo na več parametrov, kot so: velikost zrelih plodov,
obarvanost plodov, notranja kakovost plodov, preprečimo lomljenje vej ter ugodno
vplivamo na zasnovo cvetnih brstov za naslednje leto (Westwood 1992 in Arteca 1995).
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 5 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
Z analizo velikosti plodov treh jablanovih sort ('Jonagold', 'Elstar' in 'Zlati delišes') se je
izkazalo, da delež majhnih (<60 mm) in srednje velikih (60-70 mm) plodov eksponentno
narašča z obremenitvijo drevesa (Link 2000). Isti avtor ugotavlja tudi, da je možno z
redčenjem plodov zvišati delež debelih plodov za med 7-45 %, odvisno od kultivarja in
metode redčenja. Pri tem je treba omeniti, da je najzanesljivejši način, s katerim se vpliva
na večjo povprečno maso dozorelih plodov, še vedno ročno redčenje, ki pa je zaradi
pomanjkanja delovne sile in visokega stroška med pridelovalci nepriljubljeno. Prav tako z
redčenjem vplivamo na trdoto plodov, ki se zviša za 2-18 % ter ugodno vplivamo na
intenzivnost obarvanosti plodov (Link 2000).
Eden izmed pogojev za dobro kakovost plodov je tudi zadostno število listov na plod
(Wertheim 2000). V eni izmed svojih raziskav Westwood (1992) omenja, da je za
normalen razvoj plodov potrebno med 20-40 listov na plod. Z redčenjem torej vplivamo
tudi na večje razmerje med listi in plodovi, kar ugodno vpliva na kakovost in razvoj
plodov.
Redčenje plodov nedvomno izboljša kvaliteto plodov (velikost, obarvanost, trdota), vendar
s premočnim redčenjem dobimo višji delež zelo debelih plodov, ki se slabo skladiščijo.
Tovrsten problem nastaja predvsem pri debelo plodnih sortah, kjer se z močnim redčenjem
zviša delež plodov, debelejših od 75 mm, za katere je ugotovljeno, da imajo slabšo
skladiščno sposobnost ter več fizioloških nepravilnosti (grenka pegavost). Prav tako imajo
takšni plodovi višjo vsebnost kalija in nižjo vsebnost kalcija v primerjavi z drobnejšimi
plodovi (Byers 2003).
Poleg tega s premočnim redčenjem (pre-)več izgubimo na količini skupnega pridelka.
Zaradi tega je danes eno izmed glavnih vprašanj, kako močno je potrebno redčiti (Link
2000). Skupen pridelek je namreč v pozitivni korelaciji s številom plodov. Tako nekatere
raziskave dokazujejo, da je v določenih primerih povečanje pridelka na račun debelejših
plodov nižje v primerjavi z zmanjšanjem pridelka na račun števila plodov (Byers 2003). Na
tem mestu si moramo odgovoriti na vprašanje, kolikšno količinsko zmanjšanje pridelka je
za nas sprejemljivo. Seveda je eden izmed ciljev uspešnega redčenja tudi izničenje
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 6 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
ekstremnega nihanja med pridelki. Kljub temu da se z redčenjem skupni pridelek v
posameznih letih (´on year´) zmanjša, pa lahko ugotovimo, da je ekonomski učinek
redčenja dosežen s povečanjem pridelka najkakovostnejših plodov, ki imajo najboljšo
ceno. Ne glede na to, da se z redčenjem pridelek v posameznem letu zmanjša, sta
povprečni pridelek in ekonomski rezultat na daljše časovno obdobje boljša (Byers 2003).
Iz vidika preprečevanja alternance je potrebno redčiti čimbolj zgodaj, da čim prej
odstranimo izvor giberelinov, ki negativno vplivajo na iniciacijo diferenciacije cvetnih
brstov. Večina raziskovalcev se strinja glede trditve, da čim zgodnejše je redčenje, večji je
pozitivni učinek na povratno cvetenje ter na velikost plodov (Wertheim 2000). Vendar
moramo biti predvsem pri debeloplodnih sortah z zgodnjim redčenjem nekoliko bolj
previdni, saj lahko le-to neugodno vpliva na delež predebelih plodov, katerih slabosti smo
že omenili. V takšnih primerih običajno redčenje nekoliko »zavlečemo«, da ne dobimo
predebelih plodov, vendar se s tem pozitiven učinek na povratno cvetenje zmanjša (Byers
2003).
Glede časa redčenja in metode redčenja je uveljavljenih več pristopov. Glede na čas
redčenja ločimo redčenje cvetov in redčenje plodičev (Wertheim 2000). Kot lahko
razberemo že iz imena, redčenje cvetov opravimo v fazi cvetenja, redčenje plodičev pa v
zgodnjih fazah razvoja ploda vse do premera plodov 30 mm. Oba pristopa imata svoje
prednosti in slabosti, vendar je med pridelovalci nekako bolj zaživelo redčenje plodičev.
Glavni razlogi, da se pridelovalci odločajo za redčenje plodičev, so spomladanske pozebe
in nezmožnost predvidevanja uspešnosti oploditve v času cvetenja. V času, ko so plodiči
debeline 10-12 mm in so primerni za redčenje, lahko pridelovalec že vizualno oceni,
kakšen je nastavek plodov in kako močno je potrebno redčiti za dosego optimalne
obremenitve drevesa. Druga slabost redčenja v času cvetenja je, da nas po izvedenem
redčenju lahko preseneti pozna spomladanska pozeba, ki nam še dodatno razredči cvetove
in soočimo se s težavo, da je obremenitev drevesa premajhna, kar povzroči dodatne
nevšečnosti.
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 7 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
Glede na metodo redčenja poznamo poleg naravnega trebljenja plodov, ki je pri sadnih
vrstah kot je jablana močno izraženo, tri tehnološke načine, in sicer ročno redčenje,
mehansko redčenje in kemično redčenje. Pri ročnem redčenju gre za enostavno
odstranjevanje cvetov ali plodičev (običajno manjših oz. slabše razvitih). Pri mehanskem
redčenju imamo na voljo več pristopov. Ob ali tik po cvetenju lahko uspešno redčimo z
razpršenim curkom vode, ki je pod določenim pritiskom. Drugi način je z uporabo strojev,
ki stresajo drevesa. Takšni stroji se uporabljajo tudi za mehansko obiranje plodov. Vendar
ta način ni optimalen, ker odpadejo večinoma debelejši plodiči, prav tako je veliko
poškodb na drevesih (Westwood 1992). Tretji način mehanskega redčenja je s pomočjo
naprave, ki deluje po principu vertikalno vrtečih se sintetičnih vrvic, ki odstranijo določen
delež cvetov (Blanke 2008). Pri slednjem gre po avtorjevem mnenju za dokaj dodelano
tehniko, kjer lahko z različnim kotom vrtenja teh vrvic in uravnavanjem obodne hitrosti
posameznega dela naprave uspešno prilagajamo jakost redčenja. Vendar naprava povzroča
tudi poškodbe na listih, ki so nato potencialna vstopna mesta za okužbe, prav tako se na ta
način lahko prenašajo bolezni, katerih okužba se vrši preko celičnega soka (virusi,
fitoplazme).
Tretji način pa je redčenje s pomočjo kemičnih sredstev oz. rastnih regulatorjev in je med
pridelovalci najbolj razširjen. V tem primeru gre za aplikacijo različnih (običajno)
sintetičnih snovi, ki poudarijo/inducirajo odpadanje večjega/manjšega deleža
cvetov/plodov na drevesu. Sodobno intenzivno sadjarstvo, ki zaradi močne konkurence na
trgu teži k optimiranju stroškov v današnjem času več ne prenese dodatnega stroška, ki bi
ga predstavljalo ročno redčenje plodičev. Zato se današnji sadjarji največkrat poslužujejo
redčenja s kemijskimi sredstvi. Težava, s katero se srečujejo pridelovalci kot tudi
raziskovalci pri redčenju s kemijskimi sredstvi, je predvsem v preslabi zmožnosti
predvidevanja delovanja. Na učinek delovanja vpliva veliko število dejavnikov od
kultivarja, koncentracije aktivne snovi, časa aplikacije, načina aplikacije do vrste okoljskih
faktorjev. Glede na število dejavnikov, ki vplivajo na učinkovitost delovanja teh sredstev
Wertheim (2000) meni, da obstaja dvom, ali bo učinkovitost teh sredstev sploh kdaj možno
popolnoma predvideti.
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 8 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
2.2 Fiziološke osnove abscizije plodičev
Abscizija je proces, ki se pri rastlini lahko pojavi v različnih razvojnih fazah v času rastne
dobe. Samo abscizijo lahko definiramo kot ločitev organa ali dela rastline od starševske
rastline (Arteca 1995). V sklopu raziskav doktorske disertacije smo se podrobneje
osredotočili na abscizijo plodičev jablane. Abscizija plodov ali odpadanje plodov se lahko
ob določenih razmerah izvrši od oplodnje pa vse do zrelosti. Za sadjarstvo so pomembna
predvsem obdobja, ko je odpadanje plodov bolj poudarjeno. Nekako velja, da so pri sadnih
vrstah tri obdobja močnejšega odpadanja plodov, in sicer odpadanje plodičev kmalu po
oplodnji (1-2 tedna po koncu cvetenja), drugo naravno trebljenje plodov oz. »junijsko
trebljenje« (4-6 tednov po cvetenju) in odpadanje že skoraj dozorelih plodov tik pred
obiranjem. Z nekaterimi ukrepi lahko vzpodbudimo ali zavremo abscizijo in s tem
vplivamo na dejavnike, ki so pomembni za kvaliteto pridelka, redno rodnost. Vendar je za
izvajanje takšnih ukrepov najprej potrebno poznavanje naravnega procesa abscizije.
Fiziološko gledano abscizija zajema dva pomembna procesa, in sicer: ločitev (separacijo)
in zaščito ranjenega dela. V večini primerov se oba procesa odvijata hkrati, čeprav
obstajajo tudi izjeme (Arteca 1995). Predpogoj za izvedbo abscizije je nastanek oz.
definiranje mesta, kjer bo prišlo do ločitve celic. Odpadanje organov (plodov, cvetov) se
izvrši na določenem, predhodno definiranem mestu, ki ga imenujemo abscizijska cona
(AZ) (Roberts in sod. 2002). AZ je običajno zgrajena iz enega ali več plasti tankih
parenhimskih celic, ki so razporejene okrog peclja in tvorijo nekakšen omot (Arteca 1995).
Na mestu AZ lahko že pred začetkom vidimo sloj sploščenih manjših celic. Do
diferenciacije AZ pride že mnogo prej, preden se začne abscizija. Sama formacija je prav
tako pod vplivom rastnih regulatorjev, pri tem podatki iz raziskav nakazujejo, da etilen
verjetno sproži začetek tvorbe AZ, medtem ko indol ocetna kislina (IAA) »določi« mesto
formiranja cone (Roberts in sod. 2002). Primarna dejavnika, ki vplivata na aktivacijo
abscizije na nivoju AZ, sta etilen ter avksin IAA oz. razmerje med njima (Taylor in
Whitelaw 2001). Dokler je bazipolarni tok IAA skozi AZ dovolj močan, je le-ta
neobčutljiva na etilen in abscizija se ne izvrši, ko pa pade pretok avksinov pod določen
nivo, postanejo celice AZ občutljive na etilen, ki vzpodbudi sintezo hidrolitskih encimov
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 9 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
(Bonghi in sod. 2000). Če poenostavimo, je abscizija proces, zaviran s strani avksina in
stimuliran s strani etilena (Wertheim 2000). Sama vloga IAA je, da vzdržuje AZ
neobčutljivo na etilen. Vendar vloge etilena in IAA le niso tako enostavne. V prvi fazi IAA
preprečuje začetek abscizije, ko pa je le-ta inducirana, pa ima pozitiven učinek na potek
abscizije. Prav aplikacija etilena v fazi, ko je AZ neobčutljiva na etilen, ne vzpodbudi
abscizije, medtem ko aplikacija v fazi, ko se je abscizija že začela, močno pospeši razvoj
(Arteca 1995). Vzrokov za padec oz. zmanjšanje t.i. bazipolarnega transporta IAA je lahko
več in jih bomo omenjali v nadaljevanju, vendar ko je dosežen tako nizek nivo IAA na
mestu AZ, da so izpolnjeni pogoji za začetek abscizije, se najprej razgradi osrednja lamela
celic, ki ležijo na distalni strani AZ (so bolj oddaljene od stebla). To se zgodi pod vplivom
hidrolitskih encimov (pektinaze, celulaze), ki se v celične stene izločijo iz citoplazme.
Obenem se z razgradnjo teh celic v celicah, ki ležijo bližje steblu (proksimalni del), začne
povečana sinteza etilena. Nato se celice, ki ležijo na proksimalni strani AZ, začnejo večati,
medtem ko rast celic na distalni strani AZ stagnira. Kombinacija razgradnje osrednjih
lamel in mehanskih sil, ki jih povzroča različna rast celic, privede do ločitve dveh plasti -
separacije (Arteca 1995). Kljub tej dokaj razumljivi razlagi abscizije se pojavi vprašanje,
zakaj nekateri plodovi odpadejo, drugi pa ne? Kateri so tisti dejavniki, ki določijo, kateri
plodovi se bodo obdržali na drevesu? Odgovor je poskušal podati Bangerth (2000), ki
govori o absciziji kot posledici rezultata več korelativnih dejavnikov.
V zadnjem obdobju kot vzroka oz. razlagi za odpadanje mladih plodičev prevladujeta dve
hipotezi: a) nezadostna oskrba plodov z asimilati, kot posledica omejene produkcije
asimilatov ali omejenega transporta amimilatov do plodičev (t.i. asimilatna teorija), b)
hormonsko reguliran mehanizem.
V začetku vegetacije jablana za rast in razvoj porablja večinoma rezervne hranilne snovi,
nakopičene ob koncu prejšnje vegetacije, saj je asmimilacijska sposobnost manjša, kot so
dejanske potrebe rastline (Dickson 1991). Ta negativna bilanca ogljikovih asimilatov bi naj
bila na najnižji točki 2-4 tedne po cvetenju (Lakso in sod. 1999), kar sovpada s časom, ko
na drevesu začnejo intenziven razvoj in rast mladi plodiči, ki pa so zelo dovzetni za
pomanjkanje ogljikovih asimilatov (Byers in sod. 1985), kar bi posledično lahko sprožilo
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 10 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
začetek abscizije. Aplikacija sredstev, ki inhibirajo fotosintezo, kot je npr. terbacil, vpliva
na večjo abscizijo plodičev. Prav tako uporaba NAA vpliva na zmanjšanje fotosinteze za
do 25 % (Stopar in sod. 1997). Nižjo fotosintetsko aktivnost pa lahko dosežemo tudi s
senčenjem (Zibordi in sod. 2009, Morandi in sod. 2011). Na genetskem nivoju so
ugotovili, da se je po senčenju ekspresija genov, ki so povezani z metabolizmom
ogljikovih spojin, najbolj povečala (Zhou in sod. 2008). Prav tako pomanjkanje asimilatov
močno poveča kompeticijo med plodovi. Kompeticija je eden izmed pomembnih
dejavnikov abscizije (Black in sod. 1995). Plodovi brez kompeticije v socvetju so namreč
mnogo manj dovzetni za abscizijo v primerjavi s plodovi, ki so znotraj socvetja podvrženi
konkurenčnosti. V primeru kompeticije znotraj socvetja ima pomembno vlogo tudi pozicija
v socvetju, kajti LP so vedno v podrejenem položaju v primerjavi z CP (Bangerth 2000) in
zaradi tega bolj podvrženi absciziji.
Za razumevanje hormonsko regulirane abscizije je potrebno poznavanje dveh fizioloških
procesov: 1. aktivacija abscizijske cone (AZ) določenega plodiča, kar je ključen dogodek
za začetek abscizije in 2. hormonsko kontroliran pojav dominance med plodiči ter med
plodičem in vegetativnim poganjkom. V splošnem velja, da je aktivacija AZ pod vplivom
dveh regulatorjev, in sicer etilena ter avksinov (predvsem indol ocetne kisline-IAA)
(Bangerth 2000).
Medtem ko je zadnja stopnja delovanja etilena dokaj dobro raziskana, pa je proces
desenzibiliziranja AZ kot posledica zmanjšanja koncentracije IAA zelo slabo proučevan.
IAA se smatra kot glavni dejavnik, ki vpliva na (ne-)občutljivost celic AZ na etilen, vendar
ni nujno, da je to edini dejavnik. Obstajajo obdobja, ko AZ ni občutljiva na etilen, čeprav
je transport IAA nizek. V preteklosti so abscizijo plodičev razlagali na podlagi dognanj z
abscizijo listov in zorečih plodov. Abscizija starajočih listov ali zorečih plodov je vodena
preko etilena na način, da se ob staranju v plodu ali listu začne tvorba etilena, ki nato
negativno vpliva na pretok avksinov do AZ, kar posledično povzroči občutljivost AZ na
etilen, ki sproži začetek abscizije. Bangerth (2000) meni, da teorija o odpadanju zorečih
plodov ne more vzdržati v primeru, ko gre za odpadanje mladih plodičev, zato je sam
razvil novo različico hormonsko vodene abscizije. Tudi Dennis (2002) meni, da abscizije
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 11 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
plodičev ne moremo primerjati z abscizijo listov, saj kemična sredstva, ki jih uporabljamo
za redčenje plodičev, nimajo vpliva na odpadanje listov. To potrjuje dejstvo, da s sredstvi
za kemično redčenje samo vzpodbudimo oz. povečamo delež plodov, ki odpadejo ob
naravnem »junijskem trebljenju«.
Pri mladih plodičih se staranje prične takrat, ko so ti predhodno že določeni, da bodo
odpadli. To pomeni, da etilen ne more biti tisti, ki bi neposredno vplival na pretok
avksinov. Prav tako povišanje etilena ni značilno za zelo zgodnje faze abscizije. Ugotovili
so, da se v kratkem po nastavku plodov zviša koncentracija IAA, medtem ko se sinteza
etilena zmanjša.
Vsa ta dejstva nakazujejo, da etilen ni primarni dejavnik, ki sproži abscizijo plodičev, kot
to velja za abscizijo listov. Verjetno obstaja nek drug mehanizem, ki povzroči negativno
regulacijo IAA in s tem občutljivost AZ. Bangerth (2000) meni, da gre za korelativen
dominanten učinek več dejavnikov, v prvi vrsti za učinek med plodovi v socvetju in
sosednjimi vegetativnimi poganjki. Po tej teoriji je odločitev, kateri plodiči v socvetju bodo
odpadli, odvisna od jakosti bazipolarnega toka IAA. Avtor predvideva, da dominantni
plodiči s svojim močnim bazipolarnim tokom inhibirajo bazipolarni tok recesivnih
plodičev. Na jakost dominance vpliva več dejavnikov:
- razlika (ure ali dnevi) v času oploditve,
- število semen v plodu,
- neposredna bližina in bujnost bližnjih poganjkov,
- število plodov v socvetju.
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 12 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
Slika 1: Socvetje jablane. Številke ob plodičih kažejo hierarhično razvrstitev plodov glede
na jakost dominance (Bangerth 2000, str. 47).
Znano je, da centralni cvet zacveti prvi in je v razvoju pred lateralnimi cvetovi, zaradi tega
je tudi njegov bazipolaren tok dominanten nad ostalimi. Število semen v plodu prav tako
vpliva na jakost bazipolarnega toka, in sicer večje je število semen, višja je moč
dominance. Tudi bližina vegetativnih poganjkov lahko zavira bazipolarni tok iz cvetov. Ko
se vsi ti dejavniki kumulativno seštejejo, pade jakost bazipolarnega toka IAA nekega
plodiča pod neko kritično mejo in AZ teh plodičev ni več neobčutljiva na etilen in s tem so
omogočeni pogoji za delovanje etilena, ki povzroči abscizijo. Vendar so pri nekaterih
plodovih, ki pozneje odpadejo, ugotovili tudi povišanje koncentracije IAA na bazi peclja.
Takšen rezultat je možna posledica prekinitve ali inhibicije transporta IAA na stiku z vejo
pri čemer bi nato prišlo do kopičenja IAA na bazi peclja. Zaradi takšnih in podobnih
rezultatov se postavlja tudi vprašanje, ali je za desenzibiliziranje AZ odločilna
koncentracija IAA v predelu AZ ali pretok IAA skozi AZ (Bangerth 2000). Glede na to, da
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 13 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
delovanje oz. mehanizem delovanja sredstev za redčenje še ni popolnoma jasen, so
ugotavljali tudi učinek nekaterih sredstev na IAA, pri čemer je bilo ugotovljeno, da se je
transport IAA po tretiranju z NAA, Ethrelom in Karbarilom nekoliko zmanjšal (Bangerth
2000).
2.3 Sredstva za regulacijo abscizije plodičev
Prvi načrtni poskusi redčenja s kemijskimi sredstvi segajo v 30. leta prejšnjega stoletja
(Faust 1989). Prve kemične spojine, ki povzročijo odpadanje cvetov oz. plodov je odkril
Bagenal (1925 V: Dennis 2000), ki je testiral različne pripravke na jablanov škrlup
(Venturia inaequalis) in ugotovil, da sredstva, ki vsebujejo »apneno žveplo«, povzročijo
nenormalno odpadanje plodov. Pozneje se je pričelo preizkušanje različnih snovi, kot so
kalcijev polisulfid, cinkov sulfid, bakrov sulfid, natrijev nitrat ter razne oljne emulzije,
vendar nobeno sredstvo ni dalo zadovoljivih rezultatov. Ta sredstva, ki so sicer uspešno
redčila cvetove, so obenem povzročala veliko poškodb na vejah in listih. Na koncu so prišli
do ugotovitve, da so najboljši rezultati z uporabo tarovega olja, čeprav je v določenih
pogojih delovalo toksično in povzročalo mrežavost plodov (Dennis 2000). Nato sta leta
1940 MacDaniels in Hildenbrand ugotovila, da sredstvo dinitro-orto-krezol (DNOC ali
Elgetol), ki ga apliciramo na brazdo pestiča, preprečuje kalitev peloda. Uporaba DNOC se
je precej razširila v ZDA, vendar se je leta 1989 uporaba prekinila predvsem zaradi velikih
stroškov ponovne registracije in oporečnosti zaradi težkih kovin, ki jih je vsebovalo
sredstvo.
V današnjem času sredstva za redčenje razdelimo v dve skupini, in sicer v prvo skupino
sodijo sredstva za zaščito rastlin s stranskim učinkom na odpadanje plodov (karbaril,
metiokarb). V drugo skupino pa pripravki, ki delujejo na hormonski osnovi, to pa so:
etefon, naftil ocetna kislina (NAA), naftilacetamid (NAAm) in benziladenin (BA) (Stopar
1998). Sredstva iz prve skupine so v bistvu insekticidi in zaradi tega ekološko manj
primerni. Čeprav je bilo redčenje s karbarilom (pripravek Sevin) zadovoljivo, se ravno
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 14 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
zaradi toksičnosti na opraševalce (čebele) ni uveljavilo. Skupina t.i. hormonskih
pripravkov je iz ekološkega vidika veliko manj oporečna. Problem teh sredstev pa je v
nekonsistentnosti delovanja. V nekaterih letih sploh ne redčijo, medtem ko v nekaterih
letih ob enaki uporabljeni dozi povzročijo preobilno odpadanje plodičev (Stopar 1998).
2.3.1 Mehanizem delovanja sredstev za redčenje
Sredstva, ki se uporabljajo za t.i. kemično redčenje, delujejo po dveh principih. Z njimi
lahko preprečimo velik nastavek cvetov/plodov, pri tem gre za redčenje cvetov. Lahko pa s
pomočjo kemičnih sredstev povečamo delež plodov, ki bodo odpadli ob »junijskem
trebljenju« (Dennis 2002).
Pri principu delovanja redčenja cvetov gre za mehanizme, ki preprečijo oprašitev, kalitev
peloda in oploditev na način, da poškodujejo prašnike, pestič ali pelodno cev (Fallahi in
Willemsen 2002). Znano je namreč, da plodovi, ki niso oplojeni, odpadejo (Wertheim
2000). Nekatera sredstva pa povzročijo poškodbe na cvetovih, zaradi katerih le-ti odpadejo
(Dennis 2002). Prednost redčenja cvetov je v ugodnem vplivu na nastavek cvetnih brstov
za prihodnje leto ter ugodnem vplivu na velikost plodov. Pri raziskavi, ki jo je opravil Link
(2000), so ugotovili, da se je povprečna velikost plodov pri obravnavanju, ki je bilo rečeno
v času pred polnim cvetenjem, povišala za 30 % v primerjavi s povprečjem plodov, ki so
bili redčeni po »junijskem trebljenju«. Vendar pa je, kljub tem ugodnim rezultatom
redčenje cvetov med pridelovalci manj priljubljeno, saj se v času cvetenja ne da točno
predvideti, kolikšno število cvetov se bo uspešno oplodilo. Oplodnja je predvsem odvisna
od vremenskih pogojev v času cvetenja in s tem pogojene aktivnosti opraševalcev.
Nekatera izmed teh sredstev v določenih pogojih delujejo fitotoksično ter povzročajo
mrežavost plodov. Poleg koncentracije je zelo pomemben dejavnik tudi čas aplikacije, ki
pa je lahko pri redčenju cvetov precej težaven. Začetek cvetenja med posameznimi drevesi
v sadovnjaku je običajno različen, prav tako obstaja tudi variabilnost med posameznimi
deli drevesa. Pozabiti pa ne smemo na naknadno nevarnost pozebe, ki nam lahko še
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 15 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
dodatno »razredči« pridelek. Predvsem zaradi zadnjega dejavnika Fallahi in Willhelmsen
(2002) zaključujeta, da je redčenje cvetov primerno le v območjih, kjer je nizka verjetnost
pozebe.
Mehanizem delovanja sredstev, ki se uporabljajo za redčenje plodičev, pa je bolj
kompleksen. Fiziologi, ki se ukvarjajo s to tematiko, še niso izoblikovali enotnega mnenja
glede vpliva teh sredstev na pomembne fiziološke dejavnike, kot so: floemski tok, vsebnost
rastlinskih hormonov, biosinteza hormonov, razvoj semen in drugi (Dennis 2002).
Raziskovalci so skozi proces eksperimentiranja dobili različne rezultate, ki potrjujejo ali
negirajo določene mehanizme delovanja. Tako Dennis (2002) v svojem članku, ki
povzema pomembnejše raziskave iz preteklosti, navaja sedem potencialnih poti oz.
mehanizmov preko, katerih delujejo sredstva za redčenje plodičev. Po njegovih podatkih
so potencialni mehanizmi delovanja naslednji:
1. zaviranje razvoja semen,
2. poznejša abscizija (močno se poveča kompeticija med plodiči),
3. blokada transporta hranil iz listov v plodove,
4. zmanjšana sinteza avksinov v semenih,
5. zmanjšan transport avksinov iz plodov,
6. pospešena biosinteza etilena,
7. zaviranje fotosinteze.
Posamezne izmed naštetih hipotez so bile različno sprejete v strokovnih krogih. V zadnjem
obdobju sta nekako najbolj uveljavljeni in najbolj raziskani t.i. »hormonska« teorija
abscizije in t.i. »asimilatna« teorija abscizije (Stopar 1998). Če pregledamo samo nekaj
pomembnejših rezultatov različnih raziskav, lahko pridemo do kontradiktornih zaključkov.
Prvi rezultati proučevanja vpliva sredstva za redčenje NAA na razvoj semen v plodičih so
nakazali, da NAA vpliva na manjše število semen v plodovih. Plodovi z manjšim številom
semen pa niso tako konkurenčni za hranila. Pri dokazovanju tega mehanizma so naleteli
tudi na nekatera nasprotja, in sicer vpliva NAA na manjše število semen v plodovih ni
uspelo dokazati pri vseh kultivarjih, prav tako je Denis (1970 V: Dennis 2002) ugotovil, da
NAA redči tudi plodiče, ki nimajo semen. Pozitivne rezultate o redčenju brez semenskih
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 16 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
plodov z NAA navaja tudi Byers (2003). Podatkov, s katerimi bi lahko potrdili ali ovrgli
hipotezo, da sredstva za redčenje blokirajo oz. prekinejo dotok hranil iz listov v plodove, je
malo. Z večjo gotovostjo lahko trdimo, da aplikacija NAA vpliva na zmanjšanje sinteze
avksinov v plodovih ter zmanjšan transport avksinov proti AZ, kar sta s poskusi dokazala
Ebert in Bangerth (1981 in 1982). Povezanost etilena z odpadanjem plodičev je prvi opazil
Murneek (1954 V: Dennis 2002), vendar dejanske korelacije ni mogel dokazati. Korelacijo
med abscizijo in etilenom je uspelo dokazati šele 25 let kasneje Walshu in Williamsu, ki
sta v poskusih opazovala vpliv etefona in NAA na koncentracijo etilena. Nasprotno pa
Ebert in Bangerth (1981) ugotavljata močno zvišanje etilena samo ob aplikaciji etefona,
medtem ko ima NAA majhen učinek na sintezo etilena. Pozneje je bil tudi dokazan majhen
vpliv NAA in BA na biosintezo etilena (Greene in sod. 1992). Tudi Byers (2003) in
Greene s sod. (1992) sta ugotovila pozitivno korelacijo med BA in etilenom, vendar
navajata, da povečanje etilena, ki ga je sprožila BA, ni bilo tako močno, da bi lahko trdili,
da je etilen bil glavni promotor abscizije. Na podlagi teh rezultatov bi lahko zaključili, da
etilen ni primarni dejavnik, ki kontrolira odpadanje plodičev. O mehanizmu delovanja
preko zaviranja fotosinteze obstajajo prav tako rezultati, ki to potrjujejo. Ugotovili so, da
senčenje ali pa aplikacija kemičnih sredstev, ki zavirajo fotosintezo (terbacil), močno
vpliva na odpadanje plodičev (Dennis 2002). Tudi aplikacija NAA zavre asimilacijo
ogljika do 25 %, medtem ko BA nima vpliva na fotosintezo (Stopar s sod. 1997). Na
podlagi zbranih podatkov Dennis (2002) zaključuje, da v bistvu nobena hipoteza ne ustreza
vsem sredstvom, ki se uporabljajo.
2.3.2 Redčenje plodičev
Kot smo že omenili, se je v praksi bolj uveljavilo redčenje plodičev, zaradi tega se bomo v
nadaljevanju nekoliko bolj osredotočili na to metodo, vendar bomo vmes podali tudi
nekatere podatke, ki se nanašajo na redčenje cvetov. Za redčenje plodičev se uporabljajo
sredstva, ki temeljijo na hormonskem delovanju (Stopar 1998), in sicer: naftil ocetna
kislina (NAA), naftilacetamid (NAAm), etefon ter benziladenin (BA) (Wertheim 2000).
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 17 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
Ena izmed slabosti pri redčenju s temi pripravki je nekonsistentno delovanje. Do tega pride
predvsem zaradi velikega števila dejavnikov, ki imajo vpliv na učinkovitost določenega
sredstva. Na učinkovitost nekega sredstva lahko vplivajo zunanji dejavniki, kot so
temperatura, vlažnost (Wertheim 2000), kultivar, lokacija, »kondicija« dreves oz. nasada
(Byers 2003) ter koncentracija in čas aplikacije (Jones s sod. 1997). Predvsem zadnja dva
dejavnika sta popolnoma pod vplivom človeka in ju je mogoče prilagajati vsem ostalim
dejavnikom, na katere nimamo direktnega vpliva. Optimalen čas aplikacije se v praksi
določa glede na število dni po polnem cvetenje ali pa glede na debelino oz. premer CP. Pri
aplikaciji NAA so ugotovili, da je bolj primerno čas izvedbe določiti na podlagi debeline
CP, in sicer je to v času, ko je CP premera med 10-12 mm (Black in sod. 1995). Precej
nejasen je tudi vpliv svetlobe oz. intenzitete osvetlitve na učinek redčenja, ki ima sicer
indirekten vpliv, vendar očitno zelo pomemben. Wertheim (2000) zato pravi, da bi bilo
potrebno raziskati predvsem vpliv interakcij med temperaturo, zračno vlago in svetlobo.
Vplive različnih dejavnikov nekako najbolje povzema Hull (neobjavljeno), ki pravi da
moramo pri redčenju z rastnimi regulatorji posvetiti pozornost naslednjim dejavnikom: 1.
koncentracija - zelo ozek razpon, kjer je delovanje optimalno; 2. čas aplikacije - optimalen
čas je običajno le nekaj ur; 3. sorta - variabilna odzivnost kultivarjev; 4. listna masa - nanos
sredstva mora biti po celi krošnji drevesa; 5. okolje - vpliv okolja je zelo močan in
nepredvidljiv; 6) drevesna bujnost ter stres - drevesa s slabo bujnostjo in izpostavljenostjo
stresu se ponavadi (pre)močno odzovejo.
2.3.3 Sredstva za redčenje cvetov/plodičev jablane
V primeru, ko se odločimo za redčenje s kemičnimi pripravki, ima lahko pridelovalec
težave pri izboru pripravkov. Pridelovalcem največ težav povzroča dejstvo, da je na trgu
premalo registriranih pripravkov ali pa jih sploh ni. Poraba sredstev za redčenje je relativno
majhna v primerjavi s porabo ostalih fitofarmacevtskih sredstev. Zaradi tega velike
farmacevtske družbe nimajo interesa za registracijo teh sredstev, ki običajno stanejo precej
denarja. V Sloveniji je trenutno stanje glede registracije sredstev za redčenje zelo ugodno,
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 18 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
saj so bila v letu 2007 tri sredstva registrirana na novo. Tako smo imeli v letu 2008 za
redčenje na voljo 3 rastne regulatorje (Stopar in sod. 2008):
- AMID THIN W (a.s.: 1-naftilacetamid oz. NAD),
- DIRAGER (a.s.: 1-naftil ocetna kislina oz. NAA),
- MAXCEL (a.s.: 6-benziladenin oz. BA).
Na podlagi tega lahko sklepamo, da imamo v Sloveniji dovolj pripravkov za uspešno
redčenje. Če primerjamo z ostalimi evropskimi državami, ugotovimo, da je v Sloveniji
registriranih več sredstev kot v nekaterih ostalih evropskih državah.
2.3.4 1-naftil ocetna kislina ali NAA
NAA spada med avksine in jo nekako štejemo kot sintetično »različico« indol ocetne
kisline (IAA). Za avksine je značilno, da sodelujejo pri veliko procesih, kot so: apikalna
dominanca, rast plodov, nastavek plodov, zorenje plodov, abscizija listov in plodov
(Greene 2003).
NAA je bilo prvo sredstvo, ki so ga uporabljali za redčenje plodičev (Wertheim 2000).
Njegova jesenska aplikacija pa tudi preprečuje predčasno odpadanje zorečih plodov (Hull,
neobjavljeno). NAA učinkovito deluje na odpadanje plodičev od konca cvetenja do
debeline plodičev 15 mm (Byers 2003), najboljšo učinkovitost pa dosežemo, če aplikacijo
izvedemo, ko je centralni plodič premera 9-12 mm (Hull, neobjavljeno). Sredstvo je
primerno predvsem za kultivarje, ki se težje redčijo. V praksi se najpogosteje uporabljajo
koncentracije 5-12 mg/l (Greene 2002), lahko pa tudi do 20 mg/l (Wertheim 2000). Vendar
je treba opozoriti, da prevelike koncentracije povzročijo večji delež pritlikavih plodov
(Greene 2002), predvsem pri višjih temperaturah (Wertheim 2000). Učinek delovanja je
viden po 7-10 dneh, ter se odrazi v tem, da nekateri plodiči zastanejo v rasti (Hull,
neobjavljeno). Glede načina aplikacije sta Schneider in Lasheen (1973) ugotovila, da ima
aplikacija NAA samo na liste ali pa samo na plodove enak učinek. NAA vpliva na
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 19 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
zmanjšanje pretoka avksinov, predvsem pri slabše razvitih plodovih, kar vpliva direktno na
pritok asimilatov ali pa indirektno z zmanjšanjem fotosintetske aktivnosti listov (Wertheim
2000). Takoj po aplikaciji je lahko tudi za kratek čas prekinjena rast plodičev (Link 2000).
Stopar s sod. (1997) je ugotovil, da je tretiranje z NAA vplivalo na zmanjšanje
fotosintetske aktivnosti med 10-24 %, odvisno od koncentracije. Hull je nekatere
pomembnejše sorte jablan razdelil v dve skupini, glede na odzivnost redčenja z NAA:
1. sorte, ki se lažje redčijo (McIntosh, Delišes, Empire, Jonatan, Jonagold, Gala); 2. sorte,
ki se težje redčijo ('Wealty', 'Fuji', 'Zlati delišes'). Pri sortah, ki se lažje redčijo, zadošča
koncentracija okrog 10 mg/l, medtem ko je pri sortah, ki se težje redčijo, potrebna višja
koncentracija ( 20 mg/l).
2.3.5 1-naftilacetamid ali NAD
NAD je po učinku blažje sredstvo v primerjavi z NAA. Uporablja se lahko v
koncentracijah do 100 mg/l, vendar običajno med 35-50 mg/l. Za NAD so ugotovili, da ni
primeren za redčenje sorte 'Zlati delišes', ker močno zviša delež pritlikavih plodov
(Williams in Edgeerton 1981). Redčenje z NAD se uporablja predvsem pri sortah, ki
zgodaj zorijo, potrebna je koncentracija okrog 50 mg/l, ki jo apliciramo ob odpadanju
venčnih listov.
2.3.6 6-benziladenin ali BA
Citokinini v osnovi stimulirajo delitev celic (citokineza), predvsem v začetnih razvojnih
fazah. Najpomembnejši citokinin je snov zeatin, pri zunanjih aplikacijah pa uporabljamo
sintetično obliko citokinina, ki je v obliki benziladenina (Greene 2003). BA se je začel
uporabljati pozneje kot NAA in je sprva kazal zelo obetavne rezultate. Benziladenin (BA)
sodi med novejše pripravke. Poleg tega, da redči plodiče, ima tudi pozitiven učinek na
velikost plodov ter na povratno cvetenje (McLaughlin and Greene 1984 V: Greene 2002).
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 20 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
Uporablja se v koncentracijah med 50-150 mg/l, lahko tudi do 200 mg/l (Link 2000). BA
ima pozitiven vpliv na velikost plodov s tem, da stimulira delitev celic in na ta način vpliva
na večje število celic v plodu, nima pa vpliva na velikost samih celic (Byers 2003). Na
povečanje plodov vpliva tudi takrat, ko ne sproži abscizije (Link 2000). Učinkovitost BA
je najboljša, če jo apliciramo ob debelini CP 10 mm. Za optimalen učinek je potrebno
sredstvo enakomerno nanesti na celotno krošnjo (Hull, neobjavljeno). Pri sortah, ki se lažje
redčijo, zadostuje koncentracija 50-75 mg/l, medtem ko pri sortah, ki se težje redčijo,
uporabimo koncentracijo 75-150 mg/l BA. Opozoriti je potrebno tudi, da imajo prevelike
koncentracije za posledico večjo mrežavost plodov, slabšo obarvanost plodov, večjo
vegetativno rast (Wertheim 2000). Za BA so tudi ugotovili, da ima aplikacija samo na liste
boljši učinek v primerjavi z aplikacijo samo na plodove (Greene in sod. 1992). Vendar do
pozitivnega učinka BA na povečanje plodov pride le v primeru, ko je aplikacija izvedena
tudi na plodove (Greene in sod. 1992).
Zaenkrat še ni znan mehanizem delovanja BA, vendar se predvideva, da pospeši
vegetativno rast, kar negativno vpliva na pretok avksinov iz plodov (Wertheim 2000).
Stopar (1997) je ugotovil, da BA nima vpliva na neto fotosintezo, medtem ko sta Yuan in
Greene (2000) ugotovila, da bi naj BA vplival na večjo respiracijo v temotni fazi, kar bi
lahko imelo negativen vpliv na neto asimilacijski pridobitek rastline.
Kljub temu da BA v določenih okoljskih pogojih kaže spremenljivo delovanje, lahko
rečemo, da je učinkovitost delovanja manj nekonsistentna v primerjavi z NAA.
2.3.7 Etefon
Etefon smatramo kot sredstvo, katerega delovanje je zelo odvisno od koncentracije in
temperature, na učinkovitost pa močno vpliva tudi količina škropilne brozge. Je edino
sredstvo, ki redči v fenološkem stadiju od cvetenja do premera plodov 25-30 mm (Byers
2003). Vendar je učinkovitost redčenja z etefonom precej odvisna od razvojne faze jablane
(Greene 2002). Učinkovito deluje, če izvedemo aplikacijo v času cvetenja, vendar je
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 21 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
aplikacija 7 dni pozneje lahko že neučinkovita (Bound in sod. 1993). Občutljivost plodičev
se nato zopet poveča, ko ti dosežejo debelino 16-22 mm (Marini 1996). Če etefon
uporabljamo za redčenje cvetov, je potrebno aplikacijo izvesti v fazi »rdečih brstov«
(Wertheim 2000). Delovanje etefona je v primerjavi z ostalimi sredstvi jasno, saj je
nesporno, da aplikacija etefona močno zviša koncentracijo etilena. Razlage glede vloge
etilena pri procesu abscizije pa so si še vedno kontradiktorne (Dennis 2000). Prav zaradi
lastnosti, ker je etefon učinkovit še v poznejših fazah napram ostalim sredstvom, se ga
pogosto uporablja za korekcijsko redčenje. Ugotovili so tudi, da etefon ugodno vpliva na
povratno cvetenje, po aplikaciji pa tudi nekoliko zavre rast vegetativnih poganjkov
(Wertheim 2000). Pri delu z etefonom so potrebne tudi določene izkušnje oz. previdnost,
saj lahko ob nepravilni uporabi povzroči popolno abscizijo (Byers 2003).
2.3.8 Karbaril
Karbaril je najbolj vsestransko sredstvo za redčenje plodičev pri jablani. Učinkovito deluje
od odpadanja venčnih listov pa do debeline plodov 18 mm (Greene 2002). Najučinkoviteje
deluje, če aplikacijo izvedemo, ko so plodovi debeline 12 mm. Zadostuje koncentracija
750 mg/l. Dobra lastnost karbarila je, da nima negativnih vplivov na drevo, prav tako je
delovanje manj odvisno od okoljskih dejavnikov (Wertheim 2000). Karbaril je v bistvu
akaricid, ki ga poznamo pod komercialnim imenom Sevin. Zaradi svojega toksičnega
delovanja na roparske pršice in čebele je njegova uporaba sporna. Prav tako od leta 2003
dalje v Sloveniji nima registracije, zato njegova uporaba ni dovoljena, tako kot v večini
držav EU.
V zadnjem času se za redčenje sadnih vrst preizkušajo tudi nove aktivne snovi, ki kažejo
potencialno ugoden vpliv na redčenje. Takšne snovi so: pelargonska kislina,
monokarbamid dihidrogen sulfat, endotalska kislina, amonijev tiosulfat, urea, idr.
(Wertheim 2000).
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 22 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
2.4 Vpliv zunanjih dejavnikov na učinkovitost redčenja
Nekonsistentno delovanje sredstev za redčenje plodičev je najverjetneje v veliki meri
posledica zunanjih dejavnikov, ki vplivajo na učinkovitost delovanja določenega sredstva.
Pri nadzorovanju zunanjih dejavnikov smo bolj ali manj omejeni, poleg tega je v določenih
primerih težko predvideti, v kolikšni meri bodo zunanji dejavniki vplivali na samo
učinkovitost sredstva. Na podlagi predhodno opravljenih raziskav lahko zaključimo, da
imata glede vpliva na učinkovitost redčenja nezanemarljivo vlogo temperatura in osvetlitev
oz. vzajemen učinek teh dveh dejavnikov. Vendar poleg tega, da vplivata na učinkovitost
kemičnih sredstev za redčenje, imata tudi vpliv na samo abscizijo plodičev brez uporabe
sredstev za redčenje.
Zmanjšanje sončnega obsevanja oz. fotosintetsko aktivnega obsevanja (PAR-
photosynthetic active radiation) vpliva na abscizijo plodičev (Greene 2002, Byers in sod.
1990, Zibordi in sod. 2009). S poskusi je bilo ugotovljeno, da 2-3 dnevno zmanjšanje
osvetlitve oz. PAR občutno vpliva na povečano abscizijo plodov, če se redukcija svetlobe
izvrši v času med 14-28 dni po cvetenju (Byers in sod. 1991). Do takšne redukcije
sončnega obsevanja lahko pride v naravi ob oblačnem vremenu. Umetno take pogoje
vzpostavimo z uporabo polipropilenskih prekrivk. Nekateri podatki govorijo celo o 100 %
absciziji, če senčenje traja 5 dni, čeprav pa senčenje v obdobju po končanem junijskem
trebljenju ne vpliva na abscizijo plodov (Berueter in Droz 1991). To pomeni, da se drevesa
v različnih fenoloških fazah različno odzivajo na iste okoljske dejavnike. Običajno je tudi
naravno junijsko trebljenje plodov inducirano s pomočjo 2-3 dnevnega obdobja nekoliko
slabše osvetlitve. Slabša osvetlitev vpliva predvsem na manjšo fotosintezo (Morandi in
sod. 2011), kar privede do vse večjega pomanjkanja ogljikovih snovi in rastlina več ni
sposobna zagotoviti dovolj asimilatov za vse plodove, kar je lahko potencialen vzrok za
indukcijo abscizije (Corelli Grappadelli in sod. 1994). Zaradi kompeticije znotraj socvetja
zato najprej odpadejo slabši oz. manj razviti plodovi. Poleg tega da je redukcija svetlobe
lahko potencialen iniciator abscizije, ima količina osvetlitve po tretiranju s kemičnimi
sredstvi vpliv na učinkovitost oz. jakost odpadanja plodičev.
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 23 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
Poleg temperature, ki velja za najpomembnejši okoljski dejavnik, ki vpliva na odzivnost
plodičev po tretiranju s sredstvi za redčenje (Jones in Koen 1985) in svetlobe kot
samostojnih dejavnikov, obstaja tudi nezanemarljiv dejavnik korelacije med temperaturo in
osvetlitvijo/senčenjem. V primeru, ko so bila drevesa 3 dni senčena pri temperaturi 4,4 °C,
ni bilo povečanega odpadanja plodov, medtem ko je z dreves, ki so bila enako obdobje na
temperaturi 21,1 °C odpadlo več kot 50 % plodov (Byers 2003). Podobne rezultate so
ugotovili tudi pri naslednjem poskusu, vendar so dodali še en dodaten podatek. Dokazali
so, da predvsem temperatura ponoči močno vpliva na abscizijo. To so dokazali s
poskusom, ko so drevesa izpostavili visokim nočnim temperaturam ( > 15 °C) in nizkim
nočnim temperaturam (< 10 °C). Ugotovili so, da so plodovi dreves, izpostavljenih višjim
temperaturam, bili bolj dovzetni na odpadanje v primerjavi s plodovi dreves, izpostavljenih
nižjim temperaturam (Kondo in Takahashi 1987). Višje temperature ponoči imajo tudi
ugoden učinek na rast plodov. V istem poskusu so tudi ugotovili, da imajo višje
temperature močan negativen vpliv na transport IAA pri sorti 'Zlati delišes' in pa pozitiven
učinek na sintezo etilena (Kondo in Takahashi 1987). Ker je učinek visokih nočnih
temperatur vezan predvsem na temotno fazo fotosinteze, ne gre izključiti mehanizma
delovanja abscizije preko pomanjkanja asimilatov do katerega pride zaradi višje porabe
ogljikovih hidratov v nočnem času. Zanimiv podatek je tudi, da trikratna aplikacija GA4 v
času senčenja za 95 % izniči abscizijo, ki bi jo povzročilo senčenje. Ker je malo verjetno,
da bi aplikacija GA4 vplivala na dostopnost ogljikovih hidratov, lahko učinek GA4
razložimo preko pozitivnega vpliva na transport IAA iz plodičev (Callejas in Bangerth
1997).
Temperatura pa posredno vpliva tudi na samo učinkovitost določenih sredstev, ki se
uporabljajo za redčenje plodov. Za dobro učinkovitost sredstva je zelo pomembno, da se
aktivna snov čim bolje absorbira v rastlinska tkiva (Hull, neobjavljeno). Absorbcijo
zvišujejo faktorji, kot so: višja temperatura, počasno sušenje sredstva, zdravo listje,
medtem ko negativno na absorbcijo sredstev vplivajo hitro sušenje, nizke temperature in
poškodovana listna masa (Hull, neobjavljeno). Absorbcija NAA preko listov se povečuje
sorazmerno z višjo temperaturo, v razponu od 12-24 °C, in je boljša v pogojih s slabšo
osvetlitvijo, medtem ko je vpliv vlažnosti zraka sporen (Wertheim 2000). Poleg
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 24 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
temperature je drugi zelo pomemben dejavnik, ki vpliva na absorbcijo v rastlino, čas
sušenja kapljic (Greene 2002). Dalj časa se kapljice sušijo, večja je penetracija aktivnih
snovi v tkiva. Aktivne snovi, ki se ne absorbirajo v rastlinska tkiva in ostanejo na listni
površini, hitro izgubijo svojo učinkovitost, saj je bilo ugotovljeno, da je 4 dni po aplikaciji
NAA 80 % aktivne snovi uničene (zaradi vpliva ultravijoličnih žarkov), 10 % se je
absorbiralo v rastlino in 10 % aktivne snovi se je nahajalo na površini listov ter plodov
(Byers 2003). Boljšo penetracijo aktivne snovi se lahko doseže tudi z različnimi dodatki,
kot so močila, sredstva za boljši oprijem, sredstva za boljšo absorbcijo (Byers 2003). Z
uporabo omenjenih dodatkov se namreč podaljša čas sušenja kapljic, kar pozitivno vpliva
na količino absorbirane aktivne snovi. Do zanimivega rezultata je v svoji raziskavi prišel
tudi Jones s sod. (1988), ki je ugotovil, da učinkovitost redčenja z NAA linearno pada
glede na čas aplikacije od 8. ure zjutraj do 20. ure zvečer. Možna razlaga takšnih rezultatov
je, da je jutranja aplikacija učinkovitejša, ker je izvedena na moker list, prav tako pa je
temperatura nižja kar posledično vpliva na počasnejše sušenje kapljic.
Na podlagi različnih poskusov, osebnih opažanj in opazovanj pri pridelovalcih Byers
(2003) ugotavlja, da kombinacija kemičnega redčenja + slaba osvetlitev + tople noči
pogosto privede do (pre)močnega redčenja, medtem ko kemično redčenje ob dobri
osvetlitvi in nizki temperaturi povzroči slabši učinek redčenja. Podobnega mnenja je tudi
Greene (2002), ki ugotavlja, da so v letih, ko je pred redčenjem oblačno, hladno in mokro
so drevesa bolj odzivna, medtem ko so ob toplem suhem vremenu manj odzivna in je
redčenje plodičev težje izvedljivo oz. so le-ti manj podvrženi absciziji. V praksi se
velikokrat za izogibanje nekonsistentnosti poslužujejo kombiniranja različnih sredstev za
redčenje, kar kaže dobre rezultate (Wertheim 2000).
Če omenimo še dva tehnična dejavnika, ki imata prav tako nezanemarljiv vpliv na
učinkovitost redčenja: poraba vode in nanos škropilne brozge. Veliko poskusov je bilo
opravljenih glede optimalne porabe vode ob aplikaciji sredstev za redčenje. Glede na
različne podatke nekako še vedno prevladuje mnenje, da so najboljši rezultati ob porabi
1000 litrov škropilne brozge na hektar (Wertheim 2000). Kot drugi tehnični dejavnik, ki je
ključnega pomena za uspešno oz. enakomerno redčenje pa je enakomeren nanos škropilne
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 25 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
brozge. Najpogostejša napaka, ki se dogaja je premočno redčenje na delih krošnje, ki so
bližje šobam pršilnika in majhen učinek redčenja na delih krošnje, ki so bolj oddaljena
(Unrath 2002). Iz tega vidika je optimalen nanos škropilne brozge zelo pomemben
dejavnik za dosego želenih rezultatov.
Na podlagi omenjenih dejstev lahko zaključimo, da redčenje še zdaleč ni enostaven
tehnološki postopek saj zahteva od pridelovalca:
- dobro poznavanje sredstev, ki jih bo uporabil,
- poznavanje odziva sorte na posamezno sredstvo,
- poznavanje nasada,
- izkušnje z redčenjem,
- dobro opazovanje in predvidevanje vpliva okoljskih dejavnikov,
- brezhibno tehniko nanosa.
2.5 Vloga etilena pri absciziji plodičev
Etilen je edini rastni regulator, ki se v rastlini nahaja v plinasti obliki. Prav zaradi te
lastnosti so raziskovalci dolgo dvomili, ali gre za rastni regulator (Vandenbussche in sod.
2006). Etilen je najbolj znan kot rastni regulator zorenja, vendar poleg tega sodeluje oz.
vpliva na razvoj mnogih drugih fizioloških procesov v rastlini in nastaja v skorajda vseh
rastlinskih celicah ob procesih staranja, abscizije, kalitve semen, elongacije celic, razvoja
cvetov itd. (Abeles in sod. 1992, Ruperti in sod. 2002). Etilen se prav tako sintetizira v
skoraj vseh tkivih zaradi posledic stresa na rastlino, ki nastanejo zaradi biotskih ali
abiotskih dejavnikov (Davies 2004). Etilen ali kemijsko eten je najenostavnejši nenasičeni
aciklični ogljikovodik in je sestavljen iz dveh molekul ogljika in štirih molekul vodika
(C2H4).
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 26 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
Etilen se v rastlini sintetizira iz amino kisline metionin. V prvi fazi se metionin s pomočjo
S-adenozil-metionin sintaze pretvori v S-adenozil-metionin (AdoMet). Dalje poteka
sinteza etilena v dveh korakih, in sicer se v prvem koraku sintetizira 1-amino-ciklopropan
karbonska kislina (ACC), ki nastane iz AdoMet s pomočjo ACC sintaze (ACS). V drugem
koraku se ACC s pomočjo ACC oksidaze (ACO) oksidira v etilen, ogljikov dioksid in
vodikov cianid (Yang in Hoffman 1984, Kende 1993). Pri reakciji se iz AdoMet s pomočjo
ACS sintetizira tudi 5'-metilthioadenozin (MTA), ki se dalje pretvori v metionin in na ta
način predstavlja stalno zalogo metionina, ki je potreben za ponovni »krog« sinteze etilena
(Wang in sod. 2002, Blecker in Kende 2000). Količina sintetiziranega etilena je odvisna od
encimov ACS in ACO. Sprva je veljalo, da je omejitveni dejavnik sinteze etilena samo
encim ACS, medtem ko bi naj ACO imel manjšo vlogo, vendar je pozneje postalo jasno,
da tudi ACO igra pomembno vlogo (Alexander in Grierson 2002). Za zadnjo fazo sinteze
etilena, ki poteka s pomočjo encima ACO je potrebna prisotnost kisika, saj je v anaerobnih
pogojih reakcija popolnoma zaustavljena (Lin in sod. 2009).
Povečana sinteza etilena je običajno posledica biotskih ali abiotskih dejavnikov kakor tudi
spremljajoč proces raznih fizioloških procesov v rastlini, vendar lahko na sintezo etilena
vplivamo tudi z aplikacijo rastnih regulatorjev (Addicott 1982, Reid 1985). Zorenje
nekaterih sadnih vrst, med katere spada tudi jablana, je povezano z močnim porastom
sinteze etilena (Alexander in Grierson 2002), ki v zadnji fazi zorenja stimulira sintezo
hidrolitskih encimov, ki so odgovorni za tvorbo abscizijskega tkiva in posledično
odpadanje plodov (Bonghi in sod. 2000). Vendar pa je etilen prisoten tudi v primeru
abscizije mladih plodičev v času junijskega trebljenja, kar je bilo dokazano v več
raziskavah. Povišana sinteza etilena je bila izmerjena v plodičih jablane po tretiranju z
NAA (McArtney 2002, Zhu in sod. 2008, Walsh in sod. 1979), BA (Dal Cin in sod. 2005,
Dal Cin in sod. 2007, McArtney 2002) in etefonom (McArtney 2002, Yuan 2007). Kljub
ugotovitvam, da omenjeni rastni regulatorji stimulirajo sintezo etilena in vplivajo na večjo
abscizijo plodičev, pa ni enotnega odgovora na vprašanje, ali izključno povečana sinteza
etilena povzroči abscizijo plodičev. Načeloma je sprejeto mnenje, da se etilen vključi v
proces abscizije mladih plodičev v sklepni fazi, medtem ko njegova vloga v sami iniciaciji
abscizije ni jasna (Bangerth 2000). K temu dejstvu pričajo tudi podatki, da se v določenih
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 27 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
primerih abscizija izvrši kljub temu, da ni bilo povečane sinteze etilena v odpadlih tkivih
(Abeles 1973, Davenport in sod. 1976). Vendar ne glede na dvome, ki se nanašajo na samo
delovanje etilena v procesu abscizije plodičev, je nesporno, da zunanja aplikacija sredstev,
ki stimulirajo sintezo etilena, prav tako stimulira abscizijo plodičev, medtem ko aplikacija
sredstev, ki zavirajo sintezo etilena, hkrati zavira tudi abscizijo (Bonghi in sod. 2000).
Aplikacija sredstev, ki zavirajo sintezo etilena, kot je npr. amino etoksi vinil glicin (AVG),
vpliva tudi na večjo retencijo plodov (Dal Cin in sod. 2008, Bangerth 1978).
Vendar kljub temu ni jasno, ali je retencija plodov po tretiranju z AVG večja zaradi nižje
sinteze etilena, ali pa AVG na večjo retencijo vpliva preko kakšnega drugega, doslej
neznanega mehanizma (Fukui in sod. 1984, Rahemi in sod. 1997).
Poleg rastnih regulatorjev pa večjo sintezo etilena pospešuje tudi slabša osvetlitev (Taylor
in Whitelaw 2001), kar je še posebej izrazito, če se istočasno s slabšo osvetlitvijo poviša
temperatura (Kondo in Takahashi 1987). O učinku svetlobe na razvoj abscizije je prav tako
več teorij. Poleg tega, da vpliva na sintezo etilena, povzroči tudi manjšo fotosintezo, kar
privede do pomanjkanja asimilatov (Morandi in sod. 2011), prav tako vpliva tudi na rast
plodičev. Na podlagi omenjenih dejstev se tudi v primeru abscizije, sprožene s pomočjo
redukcije osvetlitve, upravičeno vprašamo, ali je višja sinteza etilena direktna posledica
senčenja, preko katerega posledično pride do začetka procesa abscizije ali pa je tudi v tem
primeru višja sinteza etilena zgolj posledica abscizije, ki je bila sprožena preko drugega
(zaenkrat neznanega) mehanizma.
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 28 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
Slika 2: Shema sintetske poti etilena. V začetni stopnji se iz metionina s pomočjo S-
adenozil metionin sintaze sintetizira S-adenozil metionin. V naslednji stopnji se s
pomočjo encima ACS sintetizira 1-amino-ciklopropan karbonska kislina, kot
stranski produkt pa nastaja MTA, ki vstopa v metioninski cikel, katerega končni
produkt je nastanek metionina. V končni fazi se pod vplivom ACO sintetizira
etilen, medtem ko kot stranski produkt nastaneta ogljikov dioksid in vodikov cianid
(Hedden in Thomas 2006, str. 127).
Ne glede na nekatere nasprotujoče si podatke o vlogi etilena v procesu abscizije plodičev
lahko ugotovimo, da je rastlinski hormon etilen pomemben člen v procesu abscizije. Kljub
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 29 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
temu, da je etilen največkrat opazovan rastlinski hormon pri procesu abscizije ter da
obstaja o vlogi etilena največ podatkov (tudi kontradiktornih) še vedno ni enotnega mnenja
o njegovi vlogi pri iniciaciji abscizije. Vsekakor pa obstajajo dovolj močni argumenti, na
podlagi katerih lahko trdimo, da je etilen vključen v proces abscizije kot »pospeševalec«
(promoter) ter da je v neugodnih pogojih za sintezo etilena prav tako inhibiran oz.
upočasnjen sam proces abscizije.
2.6 Vloga posameznih genov
Hiter razvoj genetskih metod v zadnjem obdobju, kakor tudi večja dostopnost modernih
aparatur sta povzročila velik porast v spremljanju različnih fizioloških procesov na
genetskem nivoju. Tako so raziskovalci v primeru opazovanja abscizije listov, plodov,
zorenja, pričeli uporabljati tudi genetske metode. Najpogosteje gre za odkrivanje sekvenc
genov v genotipu rastline, ki so odgovorni za sintezo določenih spojin. V zadnjem obdobju
se kar precej skupin raziskovalcev ukvarja s proučevanjem celotnega genoma posamezne
rastlinske ali živalske vrste, med katerimi so uspeli analizirati tudi sekvenco genoma
jablane pri sorti 'Zlati delišes' (Velasco in sod. 2010). Ko uspemo »izolirati« nek gen in mu
določiti njegovo vlogo v rastlini, lahko dalje spremljamo njegovo časovno izražanje skozi
vegetacijsko dobo oz. t.i. ekspresijo gena ter na ta način spremljamo razvoj različnih
fizioloških procesov skozi vegetacijo.
V primeru abscizije plodičev, ki smo se ji posvetili v tej nalogi, je največ novejših raziskav
povezanih z ekspresijo genov, ki so odgovorni za sintezo etilena. Glede na dejstvo, da pri
sintezi etilena najpomembnejšo vlogo igrata encima ACS in ACO, so geni, ki so odgovorni
za sintezo omenjenih encimov, najprimernejše »tarče« za opazovanje ekspresije. V tkivih
jablane so že v devetdestetih letih odkrili gene, ki so odgovorni za sintezo ACS, in sicer:
ACS1 (Lay-Yee in Knighton 1995), ACS2 in ACS3 (Rosenfield in sod. 1996) ter ACS5A in
ACS5B (Sunako in sod. 2000). Prav tako so pri jablani izolirali gene, odgovorne za sintezo
ACO, in sicer: ACO1 (Dong in sod. 1992, Ross in sod. 1992), ACO2, ACO3 in ACO4
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 30 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
(Wiersma in sod. 2007). Na podlagi raziskav je bilo ugotovljeno, da je ekspresija
omenjenih genov v pozitivni korelaciji s sintezo etilena. Vendar se posamezni izmed
omenjenih genov različno močno izražajo v posameznih obdobjih. Pri določenih sadnih
vrstah, tudi pri jablani, je povečana sinteza etilena v plodovih značilna za dve obdobji.
Prvič se to zgodi v začetni fazi rasti plodičev in drugič v času mehčanja plodov (Tonutti in
sod. 1997). Prvo obdobje tako sovpada s časom povečanega odpadanja plodičev, medtem
ko je drugo obdobje povezano z zorenjem plodov. Poleg povečane sinteze etilena je v
omenjenih obdobjih zabeležena močnejša ekspresija genov, odgovornih za sintezo etilena.
V mladih plodičih so tako zabeležili predvsem povečano ekspresijo MdACS5A, MdACS5B
in MdACO1 (Dal Cin in sod. 2005, Zhu in sod. 2008) medtem ko je za drugo obdobje
povečane sinteze etilena značilna ekspresija MdACS1, MdACS3 in MdACO1 (Wiersma in
sod. 2007, Li in Yuan 2008, Li in sod. 2010).
Čeprav se je v začetnih fazah raziskovanja sinteze etilena domnevalo, da je encim ACS
omejitveni faktor pri sintezi, pa je kasneje postalo jasno, da je vloga encima ACO enako
pomembna. To se sedaj dokazuje tudi z opazovanjem na genetskem nivoju, kjer izstopa
aktivnost MdACO1. Ekspresija MdACO1 je značilna za tkiva, kjer poteka sinteza etilena in
je običajno mnogo višja v primerjavi z MdACS1 (Davies 2004).
V poskusu, ki so ga izvedli na zorečih plodovih jablane, so dokazali, da stopnja ekspresije
MdACS1 sovpada s količino etilena (Harada in sod. 2000). Spremljanje ekspresije
omenjenih genov v zadnjih štirih tednih zorenja jablane je pokazalo, da se je MdACS1 v
plodovih jablane sorte 'Zlati delišes' in 'Sunrise' zvišala za 1000-krat, medtem ko se je
akumulacija MdACO1 zvišala do 10000-krat, kar dokazuje povezanost ACS in ACO s
sintezo etilena v času zorenja plodov (Wiersma in sod. 2007). Tudi v plodovih breskve se v
času zorenja poveča ekspresija PpACO ter sinteza etilena. V primeru, da pa se plodovi
breskve izpostavijo propilenu (500 ml/l), ki velja za analog etilena za čas 48 ur, pa pride do
dvakratnega povečanja tako ekspresije PpACO kot tudi sinteze etilena, prav tako pa se
pospeši proces zorenja (Tonutti in sod. 1997). Nasprotno pa aplikacija inhibitorjev sinteze
etilena, kot sta amino-etoksi-vinil-glicin (AVG) in 1-metil ciklopropan (1-MCP) poleg
tega, da inhibirata sintezo etilena, zavreta tudi ekspresijo MdACS1, MdACO1 in MdPG1
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 31 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
(Li in Yuan 2008). Ekspresija genov, odgovornih za sintezo etilena, kakor tudi sama
sinteza etilena sta tesno povezani z dozorevanjem plodov in s predčasnim odpadanjem
zorečih plodov. Pri sorti 'Zlati delišes' se z dozorevanjem plodov povečuje sinteza etilena v
plodovih, ki se pričnejo mehčati, prične se predčasno odpadanje nedozorelih plodov prav
tako je povišana tudi ekspresija MdACS1, MdACS3 in MdACS5A. Nasprotno pa se
omenjeni procesi v istem terminu ne dogajajo pri sorti 'Fuji' (Li in sod. 2010). Trdota
plodov, kot eden izmed pokazateljev zrelosti se je s časom zniževala v obeh primerih,
vendar veliko bolj intenzivno pri sorti 'Zlati delišes' v primerjavi s sorto 'Fuji' (Li in sod.
2010). Domnevamo lahko, da je vzrok za počasnejše dozorevanje sorte 'Fuji' in s tem
povezane dobre skladiščne lastnosti v nižji oz. počasnejši evoluciji etilena. Ekspresija
MdACO1 v plodovih se je v času dozorevanja povišala pri obeh kultivarjih, vendar se je
samo pri sorti 'Zlati delišes' ekspresija povišala tudi v AZ. Prav tako so bili plodovi te sorte
podvrženi predčasnemu odpadanju, medtem ko le-tega ni bilo opaziti pri sorti 'Fuji' (Li in
sod. 2010). Na sintezo etilena v času dozorevanja in predčasno odpadanje zorečih plodov
pa lahko vliva tudi alelotip MdACS1 gena. Ugotovili so, da plodovi na rastlinah, ki imajo
MdACS1-2/2, sintetizirajo manjše količine etilena v primerjavi s plodovi rastlin, ki imajo
alelotip MdACS1-1/2 ali MdACS1-1/1. Prav tako pa so plodovi iz teh rastlin manj nagnjeni
k predčasnemu odpadanju (Sato in sod. 2004).
Ugotovljeno je, da aktivnost etilena korelira z ekspresijo ACS- in ACO-genov, vendar je
odzivnost večja v primeru ACO-genov, zaradi tega tudi več rezultatov temelji na
opazovanju tega gena. Ekspresija ACO-genov je specifična za različna tkiva in je
regulirana preko okoljskih in hormonskih faktorjev, vključno z etilenom. Pri nekaterih
sadnih vrstah se aktivnost ACO mRNA zviša v času zorenja, prav takrat, ko je tudi najvišja
vsebnost etilena (Tonutti in sod. 1997). V času zorenja so pri breskvi ugotovili povišanje
koncentracije transkriptov ACS in ACO v mezokarpu, še preden je bila vsebnost etilena v
mejah detekcije. Vendar v zgodnji fazi razvoja (≈27 dni po cvetenju) pri sorti Redhaven
niso uspeli dokazati prisotnosti transkripta ACO, medtem ko so pri sorti Springcrest v
istem obdobju ugotovili prisotnost (Tonutti in sod. 1997). Takšen rezultat potrjuje
domnevo, da na ekspresijo različnih genov vpliva tudi genotip. Podobno navaja tudi Dal
Cin in sod. (2007), ki je spremljal ekspresijo MdACO1 pri jablanah sorte 'Zlati delišes' in
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 32 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
'Rdeči delišes'. Opazil je manjšo aktivnost omenjenega gena pri sorti 'Rdeči delišes' v
primerjavi s sorto 'Zlati delišes'.
Povezanost etilena z ACS- in ACO-geni so dokazovali tudi s pomočjo dovajanja plina
propilena (analog etilena). V plodovih breskve, ki so jih 27. dan po cvetenju za 48 ur
izpostavili propilenu, so ugotovili 2-kratno povišanje etilena (Tonutti in sod. 1997). Prav
tako so ob tretiranju s propilenom ugotovili precejšnje povečanje ekspresije ACO genov.
Do zaključka, da akumulacija ACO in sorodnih transktiptov sovpada z evolucijo etilena je
prišel tudi Ruperti (1998). Geni ACS in ACO so v času zorenja vzpodbujeni preko etilena
in nato sodelujejo v avtokatalitični sintezi etilena (Dal Cin in sod. 2006).
Kakor smo ugotovili, da je evolucija etilena in ekspresija z njim povezanih genov lahko
vzpodbujena k večji aktivnosti, lahko ob določenih pogojih opazimo tudi znižanje.
Aplikacija metil ciklo propana (1-MCP), ki je inhibitor sinteze etilena, saj se veže na
etilenske receptorje, na zoreče plodove jabolk močno vpliva na nižjo produkcijo etilena, s
tem se je znižala tudi ekspresija ACS- in ACO-genov (Dal Cin in sod. 2006). Prav tako so
v istem poskusu ugotovili negativen vpliv 1-MCP na ekspresijo receptorjev MdERS in
MdETR. Lahko zaključimo, da 1-MCP kot inhibitor etilena zavira razvoj vseh parametrov,
ki so povezani s sintezo etilena (Dal Cin in sod. 2006).
Poleg časa dozorevanja plodov je povišana sinteza etilena in z njo povezani geni prisotna
tudi v začetni fazi razvoja mladih plodičev. Podobno kot v fazi dozorevanja plodov prihaja
tudi v tej fazi do abscizije plodičev. Na primeru jablane obstaja le nekaj raziskav, ki
spremljajo razvoj etilena na genetskem nivoju in vpliv rastnih regulatorjev ter senčenja na
ekspresijo MdACO1, MdACS5A in MdACS5B v razvijajočih se plodičih in AZ.
V poskusu, ki so ga izvedli na jablani sorte 'Zlati delišes', so oblikovali dve populaciji
plodičev z različnim abscizijskim potencialom (visok abscizijski potencial – AF > 90 % in
nizek abscizijski potencial – NAF < 10 %). Analiza ekspresije genov se je izvajala v času
med 17-24 dni po odpadanju venčnih listov, saj so predhodne raziskave pokazale, da se v
tem obdobju dogajajo največje spremembe genov, ki so povezani z abscizijo plodičev (Dal
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 33 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
Cin in sod. 2005). Akumulacija transkriptov genov, vezanih na sintezo etilena (MdACS5B
in MdACO) in receptorjev (MdETR1, MdERS1 in MdCTR1) je bila opazovana v semenu,
mezokarpu, peclju in AZ. Ugotovili so, da je bila ekspresija MdACO1 v semenih 3 dni po
tretiranju z BA 10 krat višja pri obravnavanju AF v primerjavi z obravnavanjem NAF, nato
je razlika strmo naraščala do 7 dneva po tretiranju, ko je znašala 1000-krat več. Do
podobnega razmerja, vendar z manjšimi razlikami, je prišlo tudi v vzorcih mezokarpa
plodov (Dal Cin in sod. 2005). Prav so v plodičih AF izmerili signifikantno povečanje
sinteze etilena, medtem ko je raven etilena v NAF plodičih ostala nespremenjena.
Poskus, ki so ga izvajali na dveh sortah jablane, in sicer 'Zlati delišes' in 'Rdeči delišes' je
pokazal, da je bila aktivnost etilena višja v LP v primerjavi s CP. Prav tako je bila
ekspresija MdACO1 povečana v LP in je pri sorti 'Zlati delišes' bila sorazmerna z dejansko
abscizijo, medtem ko so pri sorti 'Rdeči delišes' povečano ekspresijo MdACO1 zabeležili
tako v LP kot tudi v CP (Dal Cin in sod. 2007). Pri ZD je tretiranje z BA povzročilo 3-
kratno povečanje sinteze etilena v LF (3-5 dni po tretiranju), vendar se je delež odpadlih
plodov zvišal le za 15 % (Dal Cin in sod. 2007). Ker so merili aktivnost v različnih tkivih,
so ugotovili tudi višjo ekspresijo MdACO1-gena v mezokarpu plodov in semenih v
primerjavi s pecljem. Poleg BA na sintezo etilena in z njo povezanih genov vpliva tudi
NAA. Aplikacija NAA v fazi premera CP 10 mm je vplivala na ekspresijo MdACO1,
MdACS5A in MdACS5B. Posledično sta se povišala sinteza etilena ter delež plodov, ki so
bili podvrženi absciziji (Zhu in sod. 2010).
Pri spremljanju ekspresije genov v plodičih pa v nasprotju s pričakovanji ni povečane
ekspresije MdACS1 gena (Li in sod. 2010). Na podlagi dosedanjih objav lahko
domnevamo, da je sinteza etilena v plodičih ter abscizija plodičev povezana predvsem z
ekspresijo MdACO1, MdACS5A in MdACS5B. Predvsem za MdACO1 velja, da je njegova
ekspresija dober indikator abscizije plodičev (Zhu in sod. 2010, Dal Cin in sod. 2005, Dal
Cin in sod. 2009).
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 34 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
3 MATERIALI IN METODE
Za potrebe opazovanja ekspresije genov, odgovornih za sintezo etilena, ter samo evolucijo
etilena smo v letih 2008 in 2009 zastavili poljski poskus v poskusnem nasadu Kmetijskega
inštituta Slovenije na Brdu pri Lukovici. Za izvajanje poskusa smo izbrali 10 let stara
drevesa sorte 'Zlati delišes', cepljena na podlago 'M9', katerih vzgojna oblika je bila vitko
vreteno. V zimskem času je bila na drevesih opravljena zimska rez, značilna za vzgojno
obliko vitko vreteno. Skozi celotno dobo vegetacije se je v nasadu izvajalo varstvo rastlin
pred boleznimi in škodljivci v skladu s tehnološkimi navodili za integrirano pridelavo sadja
za leto 2008 (Džuban in sod. 2008). Za sorto 'Zlati delišes' smo se odločili zaradi tega, ker
gre za najbolj razširjeno sorto v evropskem prostoru, poleg tega je bilo tudi veliko raziskav
glede redčenja in drugih lastnosti opravljenih na sorti 'Zlati delišes', na podlagi česar lahko
sklepamo, da je sorta primeren objekt opazovanja. Poleg meritev, ki smo jih opravljali v
nasadu (prirast plodičev, abscizija plodičev, ovrednotenje pridelka po posameznem
drevesu), smo na poljskem poskusu tudi odvzeli vzorce za laboratorijski del eksperimenta
oz. meritve, in sicer za merjenje evolucije etilena na plinskem kromatografu ter analizo
ekspresije genov povezanih s sintezo etilena (MdACO1, MdACS5A in MdACS5B).
3.1 Zasnova poljskega poskusa
Za poskus smo v dveh sosednjih vrstah nasada, na podlagi števila socvetij, izbrali 80
izenačenih dreves. Pogoj za izbor v eksperiment je bil, da ima drevo v tem letu velik cvetni
nastavek, med 180-230 socvetij. V letu 2008 smo štetje opravili 23. aprila, v letu 2009 pa
15. aprila. Poleg tega smo želeli, da so drevesa primerljiva po habitusu, zato smo izločili
vsa drevesa, ki so na podlagi vizualne presoje odstopala od povprečja. Izbranih 80 dreves
smo razdelili v dve skupini, in sicer skupino 'A' in skupino 'B'. Iz obeh skupin smo nato
oblikovali naključni bločni poskus s 5 obravnavanji in 8 bloki.
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 35 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
Obravnavanja so bila:
1. KONTROLA (netretirano)
2. NAA 15 mg/l
3. BA 150 mg/l
4. ETEFON 500 mg/l
5. SENČENJE (3-dni, 96 % redukcija fotosintetsko aktivnega sevanja)
Skupina kontrolnih dreves ni bila tretirana z rastnimi regulatorji, medtem ko smo za ostala
obravnavanja uporabili naslednje komercialne pripravke: NAA-Dirager (L.Gobbi, Genoa,
Italija), BA-MaxCel (Valent BioSciences, Libertyville, IL), etefon-Flordimex 420 (Bayer
CropScience, Dunaj, Avstrija) in SEN-PP SB črn (Filc Mengeš, Slovenija). Drevesa v
skupini 'A' so bila namenjena spremljanju evolucije etilena, medtem ko smo na drevesih
skupine 'B' spremljali prirast plodičev, frekvenco odpadanja plodičev ter odvzeli vzorce
tkiva za genetske analize. Razlog za razdelitev poskusa na dva dela je v destruktivni
metodi. V primeru, da bi vse meritve in hkrati vsa vzorčenja opravljali na istih drevesih, bi
s takim posegom najverjetneje premočno vplivali na fiziološko stanje drevesa, saj bi
zmanjševali kompeticijo znotraj plodičev, kar bi lahko bil vzrok za nerelevantne rezultate.
Zaradi tega smo meritve ter vzorčenja smiselno razdelili na dva dela, s čimer smo skušali
zmanjšati vpliv destruktivne metodike na odzivnost dreves. Vsi ostali ukrepi so se enako in
istočasno izvajali na drevesih skupine 'A' in 'B'.
Dva dni po odpadanju venčnih listov smo na drevesih skupine 'A' naključno izbrali 10
optimalno razvitih socvetij. Nato smo 5 izmed njih naključno označili z modrim trakcem,
preostalih 5 pa z rdečim trakcem. Modro označenim socvetjem smo s skalpelom odstranili
vse LP, da smo ustvarili t.i. socvetje s centralnim plodičem (CS), medtem ko smo rdeče
označenim socvetjem s skalpelom odstranili CP in na ta način dobili socvetje z lateralnimi
plodiči (LS). S socvetji na drevesih skupine 'B' smo ravnali enako z razliko, da je bilo
naključno izbranih 28 socvetij iz katerih smo ustvarili 14 CS in 14 LS. Ob tem naj
pojasnim, da so v skupini 'B' 4 CS in 4 LS bila namenjena za genetske analize, medtem ko
so ostala socvetja služila za spremljanje frekvence odpadanja in merjenje prirasta plodičev.
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 36 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
Ko je povprečni premer CP dosegel 10 mm, smo z ročno škropilnico izvedli aplikacijo
rastnih regulatorjev v zgoraj navedenih koncentracijah do »točke kapljanja«. Prav tako smo
na isti dan izvedli senčenje dreves pri obravnavanju SEN. Dan, ko smo izvedli aplikacijo
rastnih regulatorjev in pričeli s senčenjem, smo določili kot izhodiščni termin (0 DAT), ki
je bil v letu 2008 19. maj in v letu 2009 11. maj. Senčenje smo izvedli tako, da smo okrog
vsakega posameznega drevesa postavili armaturo iz lesenih palic, na katere smo namestili
polipropilensko prekrivko (PP SB 100 ČRN, Filc Mengeš, SLO), ki je zmanjšala količino
fotosintetsko aktivnega sončnega obsevanja za približno 96 %, kar smo izmerili s
ceptometrom (Sunfleck, Decagon, Pullman, WA). Drevesa so bila senčena 72 ur, nato pa
smo prekrivko odstranili.
Slika 3: Izvedba senčenja s pomočjo polipropilenske prekrivke, ki je bila nameščena na
leseno armaturo.
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 37 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
Prirast plodičev smo spremljali tako, da smo z digitalnim kljunastim merilom v dva- do tri
dnevnih intervalih izmerili premer označenih plodičev. Premer plodičev smo merili v letu
2008 v terminih -5, -3, -2, 0, 2, 5, 8, 10, 15 DAT, medtem ko v letu 2009 prirasta plodičev
nismo spremljali. Plodiči, na katerih smo merili premer, so bili še dodatno označeni na
način, da je bilo možno posamezen plodič spremljati od izbora pa vse do zadnjega
merjenja. Hkrati smo na istih plodičih spremljali frekvenco odpadanja oz. abscizijo. Na ta
način smo lahko na koncu analizirali prirast plodičev, ki so odpadli, ter posebej prirast
plodičev, ki niso bili podvrženi absciziji. Frekvenco odpadanja oz. abscizijo smo merili na
način, da smo v posameznem terminu na opazovanem drevesu prešteli število plodičev na
označenih CS in LS. V letu 2008 in 2009 smo štetje izvedli v terminih 0, 2, 5, 8, 10, 15, 22
DAT.
V času tehnološke zrelosti plodov v letu 2008 je bilo to 16. septembra in v letu 2009 15.
septembra, smo ovrednotili celoten pridelek na vsakem drevesu. Na podlagi kriterija
premera smo plodove razdelili v skupino večji od 70 mm (debeli plodovi) in manjši od 70
mm (drobni plodovi). Nato smo prešteli število debelih in drobnih plodov ter posebej
stehtali maso debelih in drobnih plodov. Po končanem obiranju smo izmerili obseg debla
posameznega drevesa približno 15 cm nad cepljenim mestom.
Pomembno vlogo pri učinkovitosti rastnih regulatorjev oz. senčenja na razvoj abscizije
imajo tudi okoljski dejavniki, med katerimi še posebej izstopa temperatura. Zaradi tega
smo v obeh letih v času tretiranja spremljali temperaturo ozračja v nasadu in količino
padavin. Povprečna temperatura na določen datum je izračunana na podlagi 24-urnih
meritev v 15-minutnem intervalu, medtem ko maksimalna in minimalna temperatura
predstavljata najvišjo oz. najnižjo vrednost na določen datum. Podrobnejše vrednosti
gibanja temperatur in padavine so predstavljene v Preglednicah 1 in 2.
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 38 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
Preglednica 1: Najnižje, najvišje in povprečne temperature ozračja ter količina padavin
med 1. 5. in 31. 5. v letu 2008 na opazovalni postaji Brdo pri Lukovici.
Datum Padavine (mm) Tpovprečna* Tmin Tmax
1.5. 3,2 12,1 8,2 16,9 2.5. 0 13 6,7 21,2 3.5. 0 13,5 7,1 20,8 4.5. 0,8 14 8,6 20 5.5. 12,6 9,3 7,1 13,3 6.5. 1,2 12,2 7,1 19,6 7.5. 0 12,9 5,9 19,6 8.5. 0 14,2 5,5 22,7 9.5. 0 15,7 7,8 23,5 10.5. 0 15,9 9,8 22,4 11.5. 0 15,1 7,5 21,2 12.5. 0 14,1 5,5 22 13.5. 0 15,1 5,9 23,9 14.5. 0 16,6 7,5 25,9 15.5. 0 17 8,2 24,7 16.5. 0,4 16,6 11,8 23,1 17.5. 0 17 13,7 21,6 18.5. 11,4 15 12,9 20,8 19.5. 8,2 16,2 13,3 23,5 20.5. 19,8 11,8 10,2 13,7 21.5. 0,2 12,5 10,2 14,5 22.5. 0 14 10,6 18,4 23.5. 0 14,5 11,8 17,3 24.5. 0 16,3 12,2 21,6 25.5. 0 17,8 11 24,7 26.5. 0 19,2 12,2 27,5 27.5. 0 22,1 12,5 32,2 28.5. 0 22,7 14,5 31,4 29.5. 0 22,7 15,7 30,2 30.5. 2,2 20,2 14,9 28,6 31.5. 0,2 18,2 12,2 24,7
*povprečna temperatura je izračunana na podlagi 24-urnih meritev v 15-minutnem
intervalu
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 39 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
Preglednica 2: Najnižje, najvišje in povprečne temperature ozračja, ter količina padavin
med 1. 5. in 31. 5. v letu 2009 na opazovalni postaji Brdo pri Lukovici.
Datum Padavine (mm) Tpovprečna* Tmin Tmax
1.5. 0,6 13,5 6,3 24,7 2.5. 0,4 12,4 7,1 19,2 3.5. 1,2 12 7,5 18,8 4.5. 0 12,6 4,7 19,6 5.5. 0 12,7 9,4 16,5 6.5. 0 13,2 6,3 21,6 7.5. 0 17,8 11 25,1 8.5. 0 18,6 10,2 24,7 9.5. 0 17,5 10,2 23,9 10.5. 0 20,9 14,1 26,7 11.5. 0 18,7 11 26,7 12.5. 0,4 18,8 11,8 25,5 13.5. 1 15 12,9 21,2 14.5. 0 17,5 12,5 24,7 15.5. 0,6 15,2 9,4 22 16.5. 0 17,7 11,4 24,7 17.5. 0 19,6 11 27,8 18.5. 0 20,6 12,5 29,4 19.5. 22,2 19,8 13,7 26,7 20.5. 0 18,8 13,3 24,3 21.5. 0 19,9 11,4 27,8 22.5. 0 21,1 13,7 28,6 23.5. 0 21,5 13,3 29,4 24.5. 0 21,1 16,1 27,5 25.5. 4,2 21,7 14,1 31,8 26.5. 0 22,7 14,1 31,8 27.5. 23 15,1 11,4 21,2 28.5. 0 15,9 9 22 29.5. 0,2 14,1 10,2 20,8 30.5. 1,2 11,4 5,5 18,4 31.5. 2 12,8 7,8 18,8
* povprečna temperatura je izračunana na podlagi 24-urnih meritev v 15-minutnem
intervalu
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 40 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
3.2 Meritve evolucije etilena
Količino etilena, ki ga sintetizirajo plodiči oz. posamezna socvetja smo spremljali s
pomočjo plinske kromatografije. Za merjenje koncentracije etilena v vzorcih smo uporabili
plinski kromatograf Hewlett-Packard 6890 s plamensko ionizacijskim detektorjem (FID),
ki je bil opremljen s HP-5 (Agilent, Santa Clara, CA) kapilarno kolono (30 m x 0,32 mm x
0,25 µm). Temperatura na injektorju je bila 120 °C, na detektorju 300 °C in na koloni 60
°C. Za nosilni plin smo uporabili dušik (N2) s pretokom čez kolono 2,9 ml/min. Za
standardno vsebnost etilena smo določili primerjalno površino pika, za kar smo imeli na
voljo dva standarda v koncentraciji 1 ml/l in 10 ml/l (C2H4 v čistem dušiku) (Messer
Schweiz AG, Lenzburg, Švica). Izmerjene površine pikov naših vzorcev je integrator
primerjal s površino pika standarda ter določil koncentracijo etilena v vzorcih. Iz
koncentracij etilena in volumna zraka smo izračunali količino razvitega etilena iz plodičev.
Razvoj etilena iz plodičev smo predstavili v nl C2H4 / gram sveže mase plodičev.
Evolucijo etilena iz plodičev smo merili v štirih terminih glede na število dni po aplikaciji
rastnih regulatorjev oz. začetka senčenja (DAT). Prvi termin je bil na dan tretiranja, vendar
pred samo izvedbo, kar se šteje kot 0 DAT, nato pa smo meritve opravili še 2, 5 in 8 DAT.
V vsakem terminu smo na posameznem drevesu v skupini 'A' izmed označenih socvetij
naključno izbrali eno CS in eno LS. Nato smo na izbrano socvetje namestili 245 ml
plastični lonček in ga zaprli s pokrovčkom ter odprtine zatesnili s tesnilom Enoplastico
special (Esseco, S. Martino Trecate, Italy). Postopek zaprtja socvetja je podoben, kot ga je
uporabil Burns s sod. (1999) z manjšimi modifikacijami. Po 3 urah inkubiranja smo skozi
luknjico na pokrovčku, ki je bila med inkubacijo zatesnjena z gumijasto prelepko, z brizgo
odvzeli 1 ml vzorca zraka ter brizgo označili, zatesnili in dali v hladilno torbo. Po odvzemu
vzorcev smo odstranili lončke in porezali plodiče ter jih stehtali. Nato smo vzorce v
hladilni torbi prenesli v laboratorij Kmetijskega inštituta Slovenije, kjer smo v plinski
kromatograf ročno injicirali 1 ml zraka posameznega vzorca ob zgoraj navedenih pogojih.
Poleg vzorcev zraka smo injicirali tudi t.i. »slepe« vzorce, ki smo jih na enak način kot
ostale odvzeli iz atmosfere v nasadu med drevesi. Za kontrolo metode in delovanja
plinskega kromatografa smo na vsakih šest vzorcev injicirali 1 ml standarda etilena
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 41 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
(izmenično 1 ml/l in 10 ml/l C2H4). Po končanih meritvah smo po zgoraj navedenem
postopku preračunali sintezo etilena iz plodičev v nl/g sveže mase/uro.
3.3 Genetske analize
3.3.1 Vzorčenje
Vzorčenje tkiva plodičev in AZ za potrebe spremljanja ekspresije genov smo opravili v
štirih terminih glede na tretiranje z rastnimi regulatorji in začetek senčenja (0 DAT). V letu
2008 so bili termini vzorčenja 0 in 8 DAT, medtem ko smo v letu 2009 vzorčenje razširili
na dva dodatna termina, tako da smo vzorce za ekspresijo odvzeli 0, 1, 4 in 7 DAT. V
posameznem terminu smo na vsakem drevesu skupine 'B' naključno izbrali eno CS in eno
LS. Najprej smo odrezali posamezno socvetje, nato pa s skalpelom plodiče prečno
prerezali na kolobarje. Kolobarje smo nato razrezali še na štiri dele, ter iz sredinskih treh
kolobarjev odvzeli po dva nasproti ležeča dela. Izbrano tkivo smo takoj dali v 2 ml
označeno mikrocentrifugirko in nemudoma potopili v posodo s tekočim dušikom. Na ta
način smo skušali čim bolj preprečiti oksidacijo in degradacijo vzorčenega tkiva. Vzorec
AZ smo odvzeli na podoben način s to razliko, da smo odrezali 1 mm tkiva na vsako stran
predhodno formirane AZ ter tkivo takoj dali v označeno centrifugirko in potopili v posodo
s tekočim dušikom. Za preprečevanje kontaminacije med vzorci smo med vsakim
posameznim odvzemom vzorca zamenjali sterilne rokavice, sterilno rezilo skalpela in
tehtalno posodico, na kateri smo izvajali rezanje tkiva. Zbrane vzorce posameznega
termina smo v tekočem dušiku odnesli v genetski laboratorij Kmetijskega inštituta
Slovenije, kjer smo jih prestavili v hladilne omare na temperaturo -80 °C, kjer so vzorci
počakali na nadaljnjo obravnavo.
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 42 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
3.3.2 Izolacija RNA
Za izolacijo RNA iz tkiva plodičev (FC) in tkiva AZ smo uporabili RNeasy Plant Mini Kit
(Qiagen, Hilden, Nemčija). Najprej smo vzorce izenačili glede na maso izhodiščnega
materiala, in sicer smo tkivo FC izenačili na približno 50 mg, tkivo AZ pa na 25 mg.
Preden smo začeli s samim postopkom izolacije smo RLT pufru dodali ß-merkapto etanol
in sicer 10 µl na 1 ml pufra. Nato smo RLT pufru dodali še 2 % (w/v) polivinilpirolidona
(PVP) (Sigma-Aldrich, Stenheim, Nemčija). Preliminarne raziskave so namreč pokazale
višjo učinkovitost ekstrakcije RNA iz tkiva FC in AZ jablane ob dodatku 2 % PVP.
Postopek izolacije je bil sledeč:
• vzorcu tkiva smo v digestoriju dodali 450 µl RLT pufra (RNeasy Plant Mini Kit),
• dodali smo keramično kroglico in stresali 2 minuti 30 tresljajev na sekundo na
aparaturi Tissue Lyser Qiagen (Retsch, Haan, Nemčija),
• nato smo lizat odpipetirali direktno na vijolično kolono (RNeasy Plant Mini Kit) in
centrifugirali 2 minuti pri hitrosti 15.000 g,
• filtrat smo pazljivo prenesli v novo mikrocentrifugirko, pri tem pa smo pazili, da
nismo premešali peleta na dnu centrifugirke,
• dodali smo 225 µl 96 % etanola in takoj premešali s pipetiranjem ter celoten vzorec
prenesli na roza kolono,
• nato smo centrifugirali 15 sekund pri hitrosti 10.000 g ter zavrgli filtrat,
• na membrano roza kolone smo odpipetirali 700 µl pufra RW1 (RNeasy Plant Mini
Kit) ter centrifugirali 15 sekund pri hitrosti 10.000 g, ter zavrgli filtrat in zbiralno
tubico,
• roza kolono smo prestavili na novo zbiralno tubico, odpipetirali na membrano
kolone 500 µl RPE pufra (RNeasy Plant Mini Kit) ter centrifugirali 15 sekund pri
hitrosti 10.000 g, ter zavrgli filtrat,
• ponovno smo na membrano roza kolone odpipetirali 500 µl RPE pufra ter
centrifugirali 2 minuti pri hitrosti 10.000 g. Zavrgli smo filtrat in zbiralno tubico,
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 43 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
• roza kolono smo prestavili na novo sterilno mikrocentrifugirko in direktno na
membrano odpipetirali 40 µl RNaz-proste vode in centrifugirali 1 minuto pri hitrost
10.000 g,
• filtrat smo ponovno odpipetirali na membrano kolonice in ponovili centrifugiranje,
s tem je bila koncentracija RNA višja saj smo eluirali več RNA.
• izolirano RNA smo shranili na -80°C.
3.3.3 Razgradnja genomske DNA
Izolirano RNA smo pred nadaljnjo obravnavo še tretirali z encimom deoksiribonukleaza I
(DNaza I). Pri izolaciji RNA namreč poleg le-te kot stranski produkt izoliramo tudi dele
genomske DNA molekule, ki v nadaljnjem procesu moti analizo RNA pri qPCR reakcijah.
Zaradi tega smo vzorce izolirane RNA pred nadaljnjo obravnavo tretirali z encimom
DNaza I, ki razgrajuje eno- in dvoverižno genomsko DNA.
Za tretiranje smo uporabili deoksiribonukleazo I (Invitrogen by Life Technologies,
Carlsbad, CA), po protokolu proizvajalca. Namesto 1 µl vzorca RNA smo za izhodišče
vzeli 2 µl RNA, ki smo mu dodali 1 µl 10X DNase I Reaction Buffer, 1 µl DNase I, Amp
Grade, 1 U/ µl in razliko do skupnega volumna 10 µl dopolnili z deionizirano in destilirano
vodo. Ostali pogoji so bili v skladu z navodili proizvajalca. Po končanem postopku smo z
DNase I tretirano RNA shranili na -80 °C.
3.3.4 Reverzna transkripcija
V postopku reverzne transkripcije smo celokupno RNA prepisali v komplementarno DNA
(cDNA). Za izvedbo reakcije smo uporabljali komplet High-Capacity cDNA Reverse
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 44 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
Transcription Kit (Applied Biosystems by life Technologies, Carlsbad, CA). Reakcijska
mešanica je bila sestavljena iz:
- 10X RT Buffer 2,5 µl
- 25X dNTP Mix (100 mM) 1,0 µl
- Oligo-d(T) 16 Primers 2,5 µl
- RNase Inhibitor 1,25 µl
- MultiScribe Reverse Transcriptase 1,25 µl
- Deionizirana in destilirana voda 14,5 µl
- Z DNazo I tretirana izolirana RNA 2,0 µl
Vse komponente smo odpipetirali v 0,5 ml mikrocentrifugirko, na kratko centrifugirali in
prenesli v termoblok GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems by life
Technologies, Carlsbad, CA) kjer smo napravo nastavili na inkubacijske pogoje, ki jih
priporoča proizvajalec (Applied Biosystems By Life Technologies, Carlsbad, CA):
1. stopnja 10 minut 25 °C
2. stopnja 120 minut 37 °C
3. stopnja 5 minut 85 °C
4. stopnja nedefinirano 4 °C
Vzorce cDNA smo do nadaljnjega postopka shranili na temperaturi -20 °C, kratkoročno pa
je možno vzorce cDNA hraniti tudi na temperaturi 4 °C.
3.3.5 Kvantitativna PCR v realnem času (qPCR)
S pomočjo kvantitativne verižne reakcije s polimerazo (qPCR) smo merili ekspresijo
genov MdACS5A, MdACS5B in MdACO1. Za spremljanje omenjenih genov smo
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 45 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
uporabljali nespecifično SYBR Green I metodo, pri kateri se merjenje nastalega PCR
produkta v času reakcije meri na podlagi količine fluorescence, ki jo barvilo oddaja, ko se
veže na dvoverižno DNA. Pomanjkljivost metode s SYBR Green I barvilom je v tem, da se
barvilo veže tudi na nespecifične produkte, zaradi česar je lahko svetlobni signal močnejši
od dejanske količine, ki jo oddaja barvilo, vezano na tarčni produkt. Zaradi omenjene
slabosti je potrebna dobra optimizacija metode, s katero se prepričamo, da nam v reakciji
ne nastajajo nespecifični produkti, ki bi bili razlog za napačne rezultate.
Končni volumen qPCR reakcij je bil 25 µl. Mešanica je bila sestavljena iz naslednjih
reagentov:
- Power SYBR® Green PCR Master Mix (2x)* 12,5 µl
- začetni oligonukleotidni začetnik (100 pmol / µl) 0,15 µl
- končni oligonukleotidni začetnik (100 pmol / µl) 0,15 µl
- deionizirana in destilirana voda 10,2 µl
- vzorec cDNA 2,0 µl
*(Applied Biosystems by Life Technologies, Carlsbad, CA)
Reakcijsko mešanico z ustreznimi oligonukleotidnimi začetniki smo si pripravili posebej,
nato pa smo na optično ploščico formata 96-luknjic najprej nanesli 23 µl reakcijske
mešanice, nato pa še 2 µl ustreznega vzorca cDNA. Vsak vzorec smo nanesli v dveh
ponovitvah. V zadnji dve koloni optične ploščice smo namesto vzorca k reakcijski
mešanici dodali 2 µl deionizirane in destilirane vode, kar nam je služilo kot kontrola
kontaminacije (NTC – »no template control«). Ploščico smo prekrili z lepljivo prozorno
folijo Abi Prism (Applied Biosystems By Life Technologies, Carlbad, CA) ter
centrifugirali 2 minuti pri hitrosti 1000 g. Zatem smo optično ploščico vstavili v ciklični
termostat ABI 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems by Life Technologies,
Carlsbad, CA), kjer je pomnoževanje specifičnega odseka nukleotidnega zaporedja
potekalo ob sledečih pogojih:
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 46 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
1. korak 2 minuti 50 °C
2. korak 10 minut 95 °C
3. korak 40 ciklov:
30 sekund 94 °C
30 sekund 62 °C
40 sekund 72 °C
4. korak Disociacijski protokol:
15 sekund 95 °C
60 sekund 60 °C
15 sekund 95 °C
3.3.6 Relativna kvantifikacija
Rezultate pridobljene s qPCR smo analizirali z računalniškim programom Sequence
Detection Software (SDS) v1.3 (Applied Biosystems By Life Technologies, Carlbad, CA).
Najprej smo ročno nastavili vrednost praga in bazne linije, nato pa smo Ct-vrednosti
izvozili v Microsoft Excell dokument, kjer smo opravili nadaljnje izračune ekspresije
tarčnih genov.
Za relativno kvantifikacijo PCR je pomemben tudi izbor natančnega postopka spremljanja
učinkovitosti pomnoževanja tarčnega odseka (Foley in sod. 1993). Zaradi tega je potrebno
za relativno kvantifikacijo poleg tarčnih genov spremljati tudi referenčne gene (Libault in
sod. 2008). Za referenčne gene so primerni tisti geni, za katere so na podlagi testiranj
ugotovili, da se bolj ali manj enakomerno izražajo v določenih tkivih. Kot pogost
referenčni gen v rastlinskih tkivih se uporablja aktin (Li in sod. 2005, Williams in sod.
2005, Domoki in sod. 2006), ki smo ga kot referenčni gen v letu 2008 uporabili tudi v naši
kvantifikaciji. Poleg aktina smo v letu 2009 kot referenčne gene uporabili tudi r18S, F-
BOX in GAPDH. Rezultati leta 2008 se nanašajo na kvantifikacijo glede na aktin, medtem
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 47 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
ko so rezultati leta 2009 kvantificirani na geometrijsko povprečje vseh štirih referenčnih
genov.
Poleg izbora referenčnega gena je za relativno kvantifikacijo pomembna učinkovitost
pomnoževanja PCR produkta. Za relevantno relativno kvantifikacijo je pomembno, da je
učinkovitost pomnoževanja tarčnega gena in referenčnega gena približno enaka (Livak in
Schmittgen 2001). Učinkovitost pomnoževanja posameznega gena smo preverili s pomočjo
redčenja vzorcev 1 : 102 : 103 : 104 : 105 : 106. Nato smo učinkovitost preračunali po enačbi
E (%) = ((10(1/-S))-1)x 100 (Pfaffl, 2004, Rutledge in Côté, 2003). Z izračunom smo
ugotovili, da je učinkovitost pomnoževanja tarčnih in referenčnih genov na približno
enakem nivoju (med 92-96 %), kar je osnova za nadaljnjo relativno kvantifikacijo, ki smo
jo izvedli po 2-∆∆Ct metodi (Livak in Schmittgen 2001). Za kalibrator smo v letu 2008
izbrali kontrolo, medtem ko je v letu 2009 kot kalibrator služila kontrola v terminu
vzorčenja 0 DAT.
3.3.7 Oligonukleotidni začetniki
V qPCR smo uporabili nekatere že preverjene oligonukleotidne začetnike, in sicer za
MdACO1 (Dal Cin in sod. 2005), MdActin (Li in Yuan 2008, Espley in sod. 2007), Mdr18s
(Dal Cin in sod. 2005, Dal Cin in sod. 2009) in MdGAPDH (Tacken in sod. 2010). V
primeru MdACS5A, MdACS5B in MdF-BOX smo oligonukleotidne začetnike načrtovali z
iskanjem sekvenc po spletni bazi NCBI Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), nato
smo naredili poravnavo sekvenc s programom BioEdit v7.0.9.0. in izdelali začetne in
končne oligonukleotidne začetnike s spletnim orodjem Primer-BLAST
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome).
Zaporedja vseh uporabljenih oligonukleotidnih začetnikov so podana v Preglednici 3.
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 48 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
Preglednica 3: Zaporedja vseh začetnih oligonukleotidnih začetnikov (F) in končnih
oligonukleotidnih začetnikov (R), uporabljenih v qPCR pri tej raziskavi.
Gen Oligonukleotidni začetnik 5’→3’ Vir
MdACO1 F CAGTCGGATGGGACCAGAA Dal Cin in sod. 2005
MdACO1 R GCTTGGAATTTCAGGCCAGA Dal Cin in sod. 2005
MdACS5A F GCCAGCCAAGTTTCATAAGC Lastno načrtovanje
MdACS5A R CAACTCTGAAGCCAGGGAAC Lastno načrtovanje
MdACS5B F GAGCAACAGGTTATGGCACA Lastno načrtovanje
MdACS5B R GGTATCGGCGTATGAGGAGA Lastno načrtovanje
MdActin F TGACCGAATGAGCAAGGAAATTACT Espley in sod. 2007
MdActin
MdF-BOX
MdF-BOX
MdR18s
MdR18s
MdGAPDH
MdGAPDH
R
F
R
F
R
F
R
TACTCAGCTTTGGCAATCCACATC
CTGAGACAGCTCATCGGTCA
GATGATGGCGGAGTAGAGGA
GTTACTTTTAGGACTCCGCC
TTCCTTTAAGTTTCAGCCTTG
TCATTCTCTGCCCCCAGTAAGGAT
CCAGGGGAGCAAGACAGTTGGT
Espley in sod. 2007
Lastno načrtovanje
Lastno načrtovanje
Dal Cin in sod. 2005
Dal Cin in sod. 2005
Tacken in sod. 2010
Tacken in sod. 2010
3.4 Statistična obdelava podatkov
Pridobljene rezultate različnih meritev smo v končni fazi statistično obdelali z
računalniškim programom Statgraphics Centurion XVI v16.0.09 (StatPoint Tecnologies,
Warrenton, Virginia, ZDA). Za ugotavljanje statističnih razlik med obravnavanji smo
uporabljali analizo variance (ANOVA) in Duncanov razvrstitevni test (p ≤ 0,05). Za
predstavitev rezultatov smo izdelali preglednice v programu Excell in Word (Microsoft
Office 2007, ZDA) ter grafikone s programom OriginPro v7.5 (OriginLab Corp.,
Northampton, MA, ZDA).
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 49 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
4 REZULTATI
4.1 Pridelek
Za ugotavljanje učinkovitosti redčenja smo poleg spremljanja frekvence odpadanja
plodičev po tretiranju ovrednotili tudi pridelek plodov po posameznem drevesu ob
obiranju. Vrednotenje pridelka po posameznem drevesu na podlagi različnih tretiranj nam
pokaže dejanski učinek redčenja z določenim sredstvom na količino in kakovost pridelka.
V letu 2008 je bilo pri obravnavanju K in SEN statistično značilno več plodov po
posameznem drevesu v primerjavi z obravnavanji NAA, BA in ETEF. Na drevesih
obravnavanja K so bili povprečno 204 plodovi, medtem ko pri obravnavanju SEN 205
plodov. Za razliko od teh dveh obravnavanj je bilo pri ostalih statistično značilno manj
plodov, in sicer pri NAA 128 plodov, BA 110 plodov in ETEF 146 plodov (Preglednica 4).
Podobno razmerje med obravnavanji smo ugotovili tudi pri izračunu parametra števila
plodov na 100 socvetij. Povprečen pridelek na drevo je bil prav tako najvišji pri
obravnavanju K (24,59 kg) in obravnavanju SEN (25,49 kg), medtem ko je bil povprečen
pridelek pri ostalih obravnavanjih nižji in sicer 21,08 kg pri obravnavanju NAA, 21,03 kg
pri obravnavanju BA in 19,53 kg pri obravnavanju ETEF. Delež debelejših plodov (>70
mm premera) je bil obratno sorazmeren s številom plodov na drevo in sicer je bil najvišji
pri obravnavanju BA (89,5 %), sledi obravnavanje NAA (82,8 %), ETEF (62,3 %). Pri
obravnavanju SEN (37,4 %) in K (26,9 %) pa je bil delež debelih plodov statistično
značilno nižji v primerjavi z ostalimi obravnavanji, medtem ko med K in SEN ni bilo
statistično značilne razlike. Povprečna masa plodov je bila najvišja pri obravnavanju BA
(196 g) in NAA (166 g). V primeru ostalih obravnavanj je bila povprečna masa statistično
značilno nižja, in sicer 141 g pri ETEF, 129 g pri SEN in 119 g pri K-obravnavanju.
Pomembno je opozoriti tudi na podatek, da so bila drevesa v začetku vegetacije oz.
izvajanja poskusa izenačena, kar vidimo iz podatka števila socvetij na drevo, ki je bilo
statistično nesignifikantno med obravnavanji.
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 50 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 51 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
V letu 2009 vidimo, da je za razliko od leta 2008, samo v primeru K število plodov na
drevo statistično značilno večje od ostalih obravnavanj, medtem ko med obravnavanji
NAA, BA, ETEF in SEN ni statistično značilnih razlik. Podobno razmerje je tudi pri
parametru števila plodov na 100 socvetij. Povprečen pridelek na drevo je bil najvišji pri K-
obravnavanju, vendar je bila kot posledica tega pri tem obravnavanju najnižja povprečna
masa plodov, in sicer 153 g. Najnižji pridelek na drevo smo ugotovili pri obravnavanju
ETEF, kjer pa je bila tudi povprečna masa plodov (164 g) relativno nizka v primerjavi z
ostalimi obravnavanji. Delež debelih plodov je bil v letu 2009 v vseh primerih višji v
primerjavi z letom 2008. V primeru NAA in BA smo ugotovili, da je bilo celo 97 oz. 98
odstotkov plodov debelejših kot 70 mm. Nekoliko nižji odstotek debelejših plodov smo
ugotovili le pri obravnavanju K, in sicer 74 %.
Na podlagi primerjave določenih parametrov med letoma 2008 in 2009 lahko ugotovimo,
da je bilo povprečno število plodov na drevo v letu 2008 statistično značilno nižje pri
obravnavanjih NAA, BA in ETEF. V letu 2009 pa je bilo v primerjavi s K-obravnavanjem
statistično značilno nižje število plodov tudi pri obravnavanju SEN. Podoben rezultat smo
ugotovili tudi pri parametru števila plodov na 100 socvetij (Grafikon 1 in 2).
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 52 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
Grafikon 1: Povprečno število plodov na drevo ob obiranju pri sorti 'Zlati delišes' v letih
2008 in 2009.
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 53 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
Grafikon 2: Povprečno število plodov na drevo ob obiranju na vsakih 100 socvetij pri sorti
'Zlati delišes' v letih 2008 in 2009.
V skladu s prejšnjimi rezultati je bil povprečen pridelek na drevo v letu 2008 najvišji pri K-
in SEN-obravnavanju. Povprečen pridelek pri obravnavanjih NAA, BA in SEN se med
seboj statistično ni razlikoval, medtem ko je bil statistično značilno nižji v primerjavi s K
in SEN. V letu 2009 pa so bili povprečni pridelki na drevo v primerjavi s K-
obravnavanjem statistično značilno nižji pri vseh ostalih obravnavanjih.
Na podlagi prikazanih rezultatov lahko ugotovimo, da je v letu 2008 tretiranje z NAA, BA
in ETEF učinkovito vplivalo na večjo abscizijo plodičev, kar se je pri končnem
vrednotenju izrazilo v obliki manjšega števila plodov na drevo oz. manjšega skupnega
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 54 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
pridelka (Grafikon 3). Obravnavanje SEN pa v tem letu ni imelo vpliva na abscizijo
plodičev v primerjavi s K. V letu 2009 pa je poleg obravnavanj NAA, BA in ETEF tudi
obravnavanje SEN vplivalo na močnejšo abscizijo plodičev v primerjavi s K. Prav tako je
bil povprečen pridelek SEN-dreves manjši v primerjavi s K-drevesi. Pozitiven učinek se je
seveda odrazil v povprečni masi plodov, ki je bila v obeh letih največja pri obravnavanju
BA nato sledi NAA. Za razliko od leta 2008 je v letu 2009 SEN vplivalo na statistično
značilno večjo maso plodov v primerjavi s K plodovi, medtem ko v letu 2009 med tema
dvema obravnavanjema ni bilo razlik glede povprečne mase plodov (Grafikon 4).
Grafikon 3: Povprečen pridelek na drevo v letih 2008 in 2009 pri sorti 'Zlati delišes'.
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 55 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
Grafikon 4: Povprečna masa plodov ob obiranju pri sorti 'Zlati delišes' v letih 2008 (A) in
2009 (B).
4.2 Frekvenca odpadanja plodičev
Frekvenco odpadanja plodičev smo merili v 2-3 dnevnih intervalih po aplikaciji rastnih
regulatorjev in senčenju. Zaradi pričakovanih razlik, glede poteka abscizije, smo posebej
spremljali frekvenco odpadanja pri CP in LP. V letu 2008 so CP pričeli aktivno odpadati
nekje 8 dni po tretiranju (DAT), vendar le pri obravnavanju ETEF. Odpadanje CP pri
obravnavanju ETEF se je izvršilo v zelo kratkem času, saj je večina plodičev odpadla med
8 in 10 DAT. Pri ostalih obravnavanjih smo beležili le manjši delež odpadlih CP. Končno
štetje neodpadlih CP, ki smo ga izvedli 22 DAT je pokazalo, da je odstotek odpadlih CP
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 56 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
pri obravnavanju ETEF bil statistično značilno večji v primerjavi z ostalimi obravnavanji.
Med K, NAA, BA in SEN pa 22 DAT ni bilo statističnih razlik glede števila odpadlih CP,
ki je bilo pri omenjenih obravnavanjih nizeko (Grafikon 5). Odpadanje LP se je v letu 2008
pričelo nekoliko hitreje v primerjavi s CP. Plodiči so pričeli odpadati po 5 DAT, in sicer
najbolj intenzivno pri obravnavanju ETEF, kjer je do 8 DAT odpadla večina plodičev, ki
so bili podvrženi absciziji. Za razliko od CP so LP z različno intenziteto odpadali tudi pri
ostalih obravnavanjih. Obravnavanju ETEF, kjer je bilo odpadanje najbolj intenzivno je
sledilo obravnavanje SEN, medtem ko je bila intenziteta odpadanja LP pri obravnavanjih
NAA, BA in K bolj zmerna. Najbolj počasna je bila frekvenca odpadanja pri obravnavanju
NAA, vendar kot smo ugotovili na podlagi končnega štetja 22 DAT intenziteta oz.
frekvenca odpadanja ne vpliva na odstotek končno odpadlih plodičev (Grafikon 6).
Grafikon 5: Dinamika odpadanja centralnih plodičev (CP) v letu 2008 po tretiranju z NAA,
BA, ETEF in SEN.
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 57 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
Grafikon 6: Dinamika odpadanja lateralnih plodičev (LP) v letu 2008 po tretiranju z NAA,
BA, ETEF in SEN.
V ponovitvi spremljanja frekvence odpadanja plodičev v letu 2009 smo dobili rezultate, ki
so zelo primerljivi z rezultati iz leta 2008. Odpadanje CP se je podobno kot predhodno leto
pričelo 8 DAT in je bilo najbolj izrazito pri obravnavanju ETEF, vendar odpadanje v tem
letu ni bilo tako intenzivno, saj so CP enakomerno odpadali med 8 in 15 DAT. Prav tako je
bil končni delež odpadlih plodov 22 DAT po tretiranju z ETEF mnogo nižji v primerjavi s
predhodnim letom. V primerjavi z letom 2008 je v letu 2009 tudi SEN vplivalo na
odpadanje CP, ki se je pričelo 10 DAT. Obravnavanja NAA, BA in K pa podobno kot v
letu 2008 niso pomembno vplivala na frekvenco odpadanja CP (Grafikon 7). Frekvenca
odpadanja LP je bila v letu 2009 podobna, kot v letu 2008, in sicer so LP najintenzivneje
odpadali med 5 in 15 DAT. Kljub temu da je tretiranje z ETEF povzročilo močno
odpadanje LP med 5 in 8 DAT, pa le-to ni bilo tako izrazito kot v letu 2008. Nekoliko
manj intenzivno so odpadali LP obravnavanja SEN, medtem ko je bila frekvenca
odpadanja LP pri obravnavanjih NAA, BA in ETEF bolj zmerna, podobno kot v
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 58 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
predhodnem letu. Prav tako smo na podlagi končnega štetja 22 DAT ponovno ugotovili, da
intenziteta odpadanja ne vpliva na končni odstotek odpadlih plodičev.
Grafikon 7: Dinamika odpadanja centralnih plodičev (CP) v letu 2009 po tretiranju z NAA,
BA, ETEF in SEN.
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 59 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
Grafikon 8: Dinamika odpadanja lateralnih plodičev (LP) v letu 2009 po tretiranju z NAA,
BA, ETEF in SEN.
Na podlagi dvoletnih rezultatov spremljanja frekvence odpadanja CP in LP lahko
ugotovimo, da aplikacija sredstev za kemično redčenje in senčenje vpliva na frekvenco
odpadanja plodičev. V obeh letih smo ugotovili, da so LP bolj podvrženi absciziji v
primerjavi s CP, saj je abscizijo slednjih povzročila le aplikacija ETEF, medtem ko so bili
LP podvrženi absciziji pri vseh obravnavanjih. Pri spremljanju odpadanja LP smo
ugotovili, da ETEF povzroči kratkotrajno intenzivno odpadanje, medtem ko je odpadanje
pri ostalih obravnavanjih nekoliko počasnejše in terminsko traja dalj časa. Vendar pa, kot
je bilo dokazano v obeh letih, končni delež odpadlih plodov ni odvisen od intenzivnosti
odpadanja plodičev.
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 60 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
4.3 Evolucija etilena
Evolucija etilena iz CP se med 0 in 2 DAT ni bistveno spremenila. Nato se je med 2 in 5
DAT sinteza etilena pri obravnavanju ETEF povečala iz 4,8 nl g-1 h-1 na 8 nl g-1 h-1, čemur
je sledilo še dodatno povišanje, in sicer na 22 nl g-1 h-1 8 DAT (Grafikon 9). Pri ostalih
obravnavanjih se sinteza etilena iz CP med 0 in 8 DAT ni povečala, ampak smo beležili
rahel trend zmanjšanja sinteze etilena. Vendar se je med 5 in 8 DAT tudi pri vseh ostalih
obravnavanjih vsebnost etilena povišala. V terminih 5 in 8 DAT smo pri obravnavanju
ETEF izmerili statistično značilno višjo vsebnost etilena v primerjavi z ostalimi
obravnavanji, med katerimi ni bilo statističnih razlik.
Grafikon 9: Evolucija etilena iz centralnih plodičev (CP) v terminih 0, 2, 5 in 8 DAT z
rastnimi regulatorji oz. SEN v letu 2008.
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 61 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
Pri LP med 0 in 2 DAT nismo izmerili povečane sinteze etilena. Med 2 in 5 DAT pa smo
izmerili ≈2-krat večjo vsebnost etilena v vzorcih LP obravnavanja ETEF. Med 5 in 8 DAT
se je sinteza etilena iz LP obravnavanja ETEF še dodatno povečala na 14,6 nl g-1 h-1.
Povečano vsebnost etilena med 5 in 8 DAT smo izmerili tudi pri ostalih obravnavanjih,
vključno s K (Grafikon 10). Največjo vsebnost etilena iz LP smo 8 DAT izmerili pri
obravnavanju ETEF (14,6 nl g-1 h-1), sledi obravnavanje SEN (10,7 nl g-1 h-1), K (7,9 nl g-1
h-1), NAA (4,1 nl g-1 h-1) in BA (2,7 nl g-1 h-1).
Grafikon 10: Evolucija etilena iz lateralnih plodičev (LP) v terminih 0, 2, 5 in 8 DAT z
rastnimi regulatorji oz. SEN v letu 2008.
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 62 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
4.4 Ekspresija MdACS5A, MdACS5B in MdACO1
4.4.1 Poskus 2008
Vzorce za ekspresijo genov smo v letu 2008 odvzeli na dan tretiranja (pred tretiranjem) in
8 DAT. Pri vrednotenju rezultatov smo ugotovili, da se količina tarčnega transkripta med
vzorci odvzetimi 0 DAT in K obravnavanjem 8 DAT ni statistično značilno razlikovala. Na
podlagi tega smo se odločili, da bomo kot »kalibrator« za predstavitev rezultatov
ekspresije MdACS5A, MdACS5B in MdACO1 uporabili K-obravnavanje 8 DAT. Se pravi,
da so predstavljeni rezultati ekspresije posameznega gena v določenem vzorcu relativni
glede na K-obravnavanje v terminu 8 DAT. V primeru, da bi se ekspresija vzorcev
obravnavanja K med 0 in 8 DAT spremenila, bi bilo smiselno prikazati tudi rezultate
termina 0 DAT. Ker pa se v našem primeru to ni zgodilo, pa je za boljšo preglednost
rezultatov bolj smiselno uporabiti zgoraj omenjen način izračuna.
V letu 2008 je bila ekspresija MdACS5A v CP relativno nizka pri vseh obravnavanjih. Pri
obravnavanjih NAA, BA in SEN smo zabeležili celo zmanjšanje ekspresije tarčnega gena
v primerjavi s K-obravnavanjem (Grafikon 11A). Pri LP smo ugotovili povečano
ekspresijo MdACS5A pri obravnavanjih NAA, BA in ETEF, medtem ko se SEN ni
statistično razlikovalo od K (Grafikon 11B). Kljub nekaterim statistično značilnim
razlikam med obravnavanji pa zaradi precej velike variabilnosti težko povežemo omenjene
rezultate z vplivom na evolucijo etilena oz. abscizijo. Ekspresija MdACS5A v tkivu AZ je
bila povišana samo v primeru obravnavanja SEN. Tako smo pri AC zabeležili ≈31-krat
večjo ekspresijo tarčnega gena, medtem ko je bila ekspresija v AL ≈7,8-krat višja v
primerjavi s K (Grafikon 11C in D). Ekspresija omenjenega gena je bila v primeru AC kot
tudi v primeru AL statistično značilno višja od vseh ostalih obravnavanj, medtem ko med
njimi ni bilo statističnih razlik.
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 63 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
Ekspresija MdACS5B je bila v primeru CP in LP relativno nizka. V primeru CP sta NAA
in SEN povzročila zmanjšanje ekspresije tarčnega gena 8 DAT, medtem ko sta BA in
ETEF vplivala na večjo ekspresijo MdACS5B (Grafikon 12A). Pri LP so vsa obravnavanja
vplivala na večjo ekspresijo MdACS5B, ki je bila najvišja pri obravnavanju BA (2,9-krat)
in NAA (2,4-krat), nato sledita obravnavanji ETEF (1,6-krat) in SEN (1,5-krat) (Grafikon
12B). Rezultati ekspresije v tkivu AZ so podobni kot v primeru MdACS5A. Povečano
ekspresijo MdACS5B je povzročila samo aplikacija ETEF, in sicer v primeru AC za 40,1-
krat in v AL za 12-krat (Grafikon 12C in D). Ekspresija obeh genov v plodičih je bila
relativno nizka, ne glede na obravnavanje. Nekoliko drugače je v primeru AZ, kjer je
aplikacija ETEF nedvomno vplivala na večjo ekspresijo MdACS5A in MdACS5B ne glede
na tip socvetja oz. plodiča.
Grafikon 11: Ekspresija MdACS5A v centralnih plodičih (A), lateralnih plodičih (B),
abscizijski coni centralnih plodičev (C) in abscizijski coni lateralnih plodičev
(D), 8 dni po aplikaciji NAA, BA, ETEF in SEN v letu 2008.
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 64 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
Grafikon 12: Ekspresija MdACS5B v centralnih plodičih (A), lateralnih plodičih (B),
abscizijski coni centralnih plodičev (C) in abscizijski coni lateralnih plodičev
(D), 8 dni po aplikaciji NAA, BA, ETEF in SEN v letu 2008.
Na ekspresijo MdACO1 v CP je najbolj vplivalo obravnavanje ETEF, ki je povzročilo
6774-kratno povečanje. Ostala obravnavanja pa niso vplivala na ekspresijo MdACO1 oz.
smo zabeležili celo manjše znižanje ekspresije tarčnega gena (Grafikon 13A). V LP so vsa
obravnavanja vplivala na višjo ekspresijo MdACO1 gena, ki je bila najvišja v primeru
ETEF (8370-krat), nato sta sledili obravnavanji BA in SEN z 1233-kratnim oz. 1256-
kratnim povečanjem in obravnavanje NAA, kjer smo zabeležili 270-kratno povečanje
ekspresije MdACO1. Vsa obravnavanja so statistično značilno vplivala na ekspresijo
MdACO1 v primerjavi s K-obravnavanjem, prav tako so statistično značilne razlike med
obravnavanji, razen v primeru BA in SEN, med katerima ni statističnih razlik. Ekspresija
MdACO1 v tkivu AZ pa je bila veliko manjša v primerjavi s tkivom plodičev (Grafikon
13). V tkivu AC je samo ETEF vplival na višjo ekspresijo MdACO1, ki pa ni bila
sorazmerna z ekspresijo, ki smo jo ugotovili v tkivu CP. Ostala obravnavanja pa niso imela
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 65 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
vidnega vpliva na izraženost gena v AC, kakor tudi ne v primeru AL. Podobno kot v AC je
tudi v primeru AL samo obravnavanje ETEF povzročilo statistično značilno višjo
izraženost MdACO1.
Na podlagi genetskih rezultatov v letu 2008 vidimo, da v primeru AZ samo ETEF vpliva
na občutno povečanje ekspresije opazovanih genov, medtem ko ostala obravnavanja niso
imela večjega vpliva. Kar se tiče plodičev pa lahko zaključimo, da so obravnavanja NAA,
BA, ETEF in SEN vplivala predvsem na ekspresijo MdACO1 gena v LP, ki so najbolj
dovzetni za abscizijo. Prav tako smo ugotovili, da je bila ekspresija MdACS5A in
MdACS5B v tkivu plodičev občutno nižja v primerjavi z MdACO1. Tudi razlike med
obravnavanji so bile v primeru MdACS5A in MdACS5B relativno majhne.
Grafikon 13: Ekspresija MdACO1 v centralnih plodičih (A), lateralnih plodičih (B),
abscizijski coni centralnih plodičev (C) in abscizijski coni lateralnih plodičev
(D), 8 dni po aplikaciji NAA, BA, ETEF in SEN v letu 2008.
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 66 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
4.4.2 Poskus 2009
V letu 2009 smo vzorčenje za genetske analize razširili na štiri termine, in sicer prvič na
dan tretiranja oz. začetka senčenja (0 DAT), nato pa še 1, 4 in 7 DAT. Pri kvantifikaciji
smo kot kalibrator izbrali vzorčenje pred tretiranjem, se pravi 0 DAT. To pomeni, da so
predstavljeni rezultati ekspresije posameznega gena v določenem tkivu relativni, glede na
izraženost istega gena v terminu 0 DAT.
Grafikon 14: Ekspresija MdACS5A v tkivu abscizijske cone centralnih plodičev (AC) v
terminih 0, 1, 4 in 7 DAT z NAA, BA, ETEF in SEN v letu 2009.
Ekspresija MdACS5A se v vzorcih AC med 0 in 4 DAT ni bistveno spremenila pri
nobenem obravnavanju. Smo pa med 4 in 7 DAT zabeležili 16,9-kratno povečanje pri
obravnavanju ETEF v primerjavi z ekspresijo 0 DAT (Grafikon 14). V vzorcih AL prav
tako ni bilo med 0 in 4 DAT pri nobenem obravnavanju nihanj v izraženosti MdACS5A,
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 67 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
nato pa se je ekspresija med 4 in 7 DAT povečala pri obravnavanju ETEF. 7 DAT je bila
ekspresija pri obravnavanju ETEF (5,1-krat) statistično značilno višja od ostalih
obravnavanj, pri katerih je bila izraženost gena skozi vse termine na začetnem nivoju
(Grafikon 15).
Grafikon 15: Ekspresija MdACS5A v tkivu abscizijske cone lateralnih plodičev (AL) v
terminih 0, 1, 4 in 7 DAT z NAA, BA, ETEF in SEN v letu 2009.
Aplikacija ETEF je na CP povzročila povečanje ekspresije MdACS5A v terminu 1 DAT za
2,6-krat v primerjavi z 0 DAT, nato pa se je ekspresija tarčnega gena do 4 DAT zmanjšala
in ni več statistično značilno odstopala od ostalih obravnavanj. V primeru K, NAA, BA in
SEN smo ugotovili rahlo povečanje ekspresije MdACS5A med 1 in 4 DAT, nato pa se med
4 in 7 DAT vrednost pri K in NAA ni bistveno spremenila, medtem ko se je pri BA in SEN
nekoliko zmanjšala (Grafikon 16). Razpon, v katerem so se gibale izračunane vrednosti
ekspresije, pa je bil relativno majhen. Pri LP smo ugotovili nekoliko večjo aktivnost
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 68 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
MdACS5A v primerjavi s CP. Tako smo v primeru LP že v terminu 1 DAT opazili rahel
trend povečane ekspresije pri vseh obravnavanjih razen K. Podoben trend se je nadaljeval
do 4 DAT. V tem terminu je obravnavanje ETEF statistično značilno vplivalo na višjo
ekspresijo v primerjavi s K-obravnavanjem, medtem ko se obravnavanja NAA, BA in SEN
statistično niso razlikovala od K. Med 4 in 7 DAT smo pri vseh obravnavanjih beležili
rahlo zmanjšanje ekspresije tarčnega gena (Grafikon 17).
Grafikon 16: Ekspresija MdACS5A v tkivu centralnih plodičev (CP) v terminih 0, 1, 4 in 7
DAT z NAA, BA, ETEF in SEN v letu 2009.
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 69 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
Grafikon 17: Ekspresija MdACS5A v tkivu lateralnih plodičev (LP) v terminih 0, 1, 4 in 7
DAT z NAA, BA, ETEF in SEN v letu 2009.
Gen MdACS5B se je v vzorcih AC odzival s povečanim izražanjem samo v primeru
obravnavanja ETEF, kjer se je zvišal v terminu 7 DAT za ≈26-krat, medtem ko ostala
obravnavanja niso vplivala na izraženost gena v omenjenem tkivu. Tudi na izraženost
MdACS5B v tkivu AL je imelo največji vpliv obravnavanje ETEF, ki je povzročilo že v
terminu 1 DAT ≈2-kratno povečanje ekspresije, ki je nato stagnirala do 4 DAT, nato pa se
je do 7 DAT dodatno povečala na ≈9,2-krat v primerjavi z 0 DAT. Manjše povečanje
ekspresije tarčnega gena smo zabeležili tudi pri obravnavanju BA, in sicer med 1 in 4
DAT. Pomembnejši vpliv na ekspresijo gena MdACS5B v AZ obeh tipov socvetij je imelo
samo obravnavanje ETEF (Grafikon 18 in 19).
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 70 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
Grafikon 18: Ekspresija MdACS5B v tkivu abscizijske cone centralnih plodičev (AC) v
terminih 0, 1, 4 in 7 DAT z NAA, BA, ETEF in SEN v letu 2009.
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 71 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
Grafikon 19: Ekspresija MdACS5B v tkivu abscizijske cone lateralnih plodičev (AL) v
terminih 0, 1, 4 in 7 DAT z NAA, BA, ETEF in SEN v letu 2009.
V CP obravnavanja ETEF se je ekspresija MdACS5B v terminu 1 DAT zvišala za ≈4,3-
krat, nato pa se je do 4 DAT zmanjšala na 2,8-krat in nato še v terminu 7 DAT na ≈1,1-krat
v primerjavi z 0 DAT. Ekspresija je bila v terminih 1 in 4 DAT statistično značilno višja od
ostalih obravnavanj, medtem ko med ostalimi obravnavanji ni bilo statističnih razlik. V
terminu 7 DAT pa se obravnavanja med seboj niso statistično razlikovala (Grafikon 20).
Na višjo ekspresijo MdACS5B v LP sta najbolj vplivali obravnavanji NAA in ETEF
(Grafikon 21). V terminu 1 DAT se je pokazal trend naraščanja, ki se je nato močneje
izrazil 4 DAT, kjer sta NAA in BA statistično značilno vplivali na ekspresijo tarčnega
gena. Povečano ekspresijo tarčnega gena v primerjavi z 0 DAT smo 4 DAT zabeležili tudi
pri obravnavanjih K, BA in SEN, med katerimi pa ni bilo statističnih razlik.
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 72 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
Grafikon 20: Ekspresija MdACS5B v tkivu centralnih plodičev (CP) v terminih 0, 1, 4 in 7
DAT z NAA, BA, ETEF in SEN v letu 2009.
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 73 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
Grafikon 21: Ekspresija MdACS5B v tkivu lateralnih plodičev (LP) v terminih 0, 1, 4 in 7
DAT z NAA, BA, ETEF in SEN v letu 2009.
Podobno kot pri MdACS5A in MdACS5B je tudi v primeru MdACO1 ekspresija v tkivu AZ
povišana samo v primeru obravnavanja ETEF. V vzorcih AC v terminu 1 DAT in 4 DAT
ni bilo statistično značilnih razlik med obravnavanji, prav tako nismo beležili spremembe
ekspresije pri nobenem obravnavanju. Tudi v terminu 7 DAT nismo pri obravnavanjih K,
NAA, BA in SEN beležili sprememb glede ekspresije. Se pa je ekspresija tarčnega gena v
terminu 7 DAT statistično značilno povečala pri obravnavanju ETEF, in sicer za ≈3,9-krat.
V tkivu AL smo v terminih 4 DAT in 7 DAT zabeležili rahlo povečanje ekspresije
MdACO1 pri obravnavanju ETEF, medtem ko se je ekspresija tarčnega gena v teh terminih
pri ostalih obravnavanjih nekoliko zmanjšala.
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 74 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
Grafikon 22: Ekspresija MdACO1 v tkivu abscizijske cone centralnih plodičev (AC) v
terminih 0, 1, 4 in 7 DAT z NAA, BA, ETEF in SEN v letu 2009.
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 75 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
Grafikon 23: Ekspresija MdACO1 v tkivu abscizijske cone lateralnih plodičev (AL) v
terminih 0, 1, 4 in 7 DAT z NAA, BA, ETEF in SEN v letu 2009.
Aplikacija rastnih regulatorjev in senčenje so najbolj vplivali na ekspresijo MdACO1 v
tkivu plodičev. V vzorcih CP je obravnavanje ETEF povzročilo močno povečano
ekspresijo MdACO1 v terminih 4 in 7 DAT, in sicer 18,9 oz. 721-krat. V terminu 1 DAT
nismo zabeležili povečane ekspresije pri nobenem obravnavanju. Prav tako je bila
ekspresija pri obravnavanjih K, NAA, BA in SEN skozi vse štiri termine opazovanja na
bazalnem nivoju (Grafikon 24). Pri LP se ekspresija MdACO1 med terminoma 0 in 1 DAT
ni spremenila pri nobenem obravnavanju, nato pa se je ekspresija tarčnega gena pri vseh
obravnavanjih postopoma dvigala, razen pri obravnavanju K, kjer je bila skozi vse štiri
termine na bazalnem nivoju (Grafikon 25). V terminu 4 DAT je SEN povzročilo ≈125-krat
višjo ekspresijo MdACO1 v primerjavi z 0 DAT, medtem ko smo pri obravnavanju ETEF
zabeležili ≈111-krat večjo ekspresijo tarčnega gena. Še manjše je bilo povečanje pri
obravnavanju BA, in sicer za 53,2-krat, ter NAA, kjer se je ekspresija tarčnega gena
povečala za 19,2-krat. Tudi pri obravnavanju K smo v terminu 4 DAT zabeležili manjše
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 76 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
povečanje ekspresije MdACO1, ki je znašala 3,4-krat v primerjavi z 0 DAT. Med 4 in 7
DAT je pri obravnavanjih ETEF, NAA in BA sledilo še dodatno povečanje ekspresije,
medtem ko je pri K in SEN ekspresija tarčnega gena v tem obdobju stagnirala. Tako je bila
izraženost MdACO1 7 DAT najvišja v tkivu LP obravnavanja ETEF, kjer je bila ≈460-krat
povečana v primerjavi z 0 DAT. Nekoliko nižje povečanje smo izmerili pri obravnavanju
BA, in sicer ≈234-krat. Nato sta sledili obravnavanji SEN z ≈123-krat in NAA z ≈104-krat
povečano ekspresijo MdACO1. Tudi v primeru K se je ekspresija tarčnega gena povečala
za 11,2-krat.
Na podlagi naših rezultatov lahko ugotovimo, da se je ekspresija MdACO1 močneje
povišala v LP v primerjavi s CP. V primeru CP je le obravnavanje ETEF sprožilo izražanje
opazovanega gena, medtem ko so v primeru LP vsa obravnavanja vplivala na ekspresijo
tarčnega gena, ki pa je bila različna med posameznimi obravnavanji.
Grafikon 24: Ekspresija MdACO1 v tkivu centralnih plodičev (CP) v terminih 0, 1, 4 in 7
DAT z NAA, BA, ETEF in SEN v letu 2009.
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 77 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
Grafikon 25: Ekspresija MdACO1 v tkivu lateralnih plodičev (LP) v terminih 0, 1, 4 in 7
DAT z NAA, BA, ETEF in SEN v letu 2009.
4.5 Prirast plodičev
V letu 2008 smo spremljali tudi prirast plodičev pred in po aplikaciji rastnih regulatorjev in
senčenju. Ugotovili smo, da so manjši plodiči bolj nagnjeni k absciziji v primerjavi z
večjimi plodiči. Prav tako je prirast plodičev, ki bodo po aplikaciji rastnih regulatorjev oz.
senčenju odpadli, manjši v primerjavi s tistimi plodiči, ki ne bodo odpadli. V določenih
primerih se prirast plodičev, ki bodo podvrženi absciziji, celo zaustavi. Vpliv na prirast
plodičev pa imajo tudi različni rastni regulatorji in senčenje.
Pri K-obravnavanju (Grafikon 26) vidimo, da so tako CP kakor tudi LP, ki so bili
podvrženi absciziji, slabše priraščali. Prav tako lahko opazimo, da so tudi v začetku
spremljanja premera plodičev -5 DAT bili plodiči, ki so pozneje odpadli, nekoliko
drobnejši. V terminih od -5 do nekje 5 DAT so plodiči priraščali enakomerno, nato pa je
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 78 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
bil v terminih 8, 10 in 15 DAT premer plodičev, ki so bili podvrženi absciziji, statistično
značilno manjši v primerjavi s plodiči, ki niso odpadli. V primeru CP smo ugotovili, da se
je rast plodičev podvrženim absciziji med terminoma 8 in 15 DAT skorajda zaustavila.
Grafikon 26: Premer lateralnih (A) in centralnih (B) plodičev, ki so bili podvrženi absciziji
(črni kvadrat) in tistih, ki niso odpadli (rdeči krog) pri K obravnavanju.
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 79 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
Pri obravnavanju NAA so LP, ki so bili podvrženi poznejši absciziji, priraščali z enako
stopnjo kot tisti, ki pozneje niso odpadli. Manjše priraščanje LP, ki so bili podvrženi
absciziji, je bilo opazno komaj v terminih 10 in 15 DAT. Nekoliko večji vpliv je imela
aplikacija NAA na prirast CP, kjer so razlike v stopnji priraščanja opazne že 5 DAT in se
nato povečujejo do 15 DAT (Grafikon 27).
Grafikon 27: Prirast lateralnih (A) in centralnih (B) plodičev, ki so bili podvrženi absciziji
(črni kvadrat) in tistih, ki niso odpadli (rdeči krog) pri obravnavanju NAA.
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 80 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
Pri obravnavanju BA vidimo, da tretiranje ni povzročilo odpadanja opazovanih CP
(Grafikon 28B), ter da so CP enakomerno priraščali skozi celotno dobo spremljanja. Pri LP
obravnavanja NAA vidimo trend, da so bili plodiči podvrženi poznejši absciziji že v osnovi
nekoliko manjšega premera (Grafikon 28A), vendar razlika v terminih -5, -3, 0, 2, 5 in 8 ni
bila statistično značilna. Kljub temu je obravnavanje BA vplivalo na statistično značilno
manjši premer LP v terminih 10 in 15 DAT.
Grafikon 28: Prirast lateralnih (A) in centralnih (B) plodičev, ki so bili podvrženi absciziji
(črni kvadrat) in tistih, ki niso odpadli (rdeči krog) pri obravnavanju BA.
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 81 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
Aplikacija ETEF je že v terminu 2 DAT vplivala na prirast LP (Grafikon 29A), ki so bili
kasneje podvrženi absciziji. V primeru LP se je priraščanje plodičev, ki so pozneje odpadli,
skorajda ustavilo, saj se je premer med 2 in 10 DAT le malenkost povečal. Prav tako se je
abscizija pri vseh LP, ki so bili le-tej podvrženi pri obravnavanju ETEF, izvršila do termina
10 DAT. Kot lahko razberemo iz Grafikona 29A, so tudi LP, ki pozneje niso odpadli, med
terminoma 2 in 5 DAT nekoliko zastali v rasti, kar je verjetno posledica močnega
delovanja ETEF. Tudi CP obravnavanja ETEF so priraščali s podobnim trendom kot LP.
Med terminoma -5 in 0 DAT ni bilo razlik v premeru plodičev, nato se je 2 DAT nakazal
padec priraščanja plodičev, ki so bili kasneje podvrženi absciziji (Grafikon 29B). V
terminu 5 DAT pa smo že opazili statistično značilno manjši premer plodičev, ki so bili
podvrženi absciziji v primerjavi s CP, ki pozneje niso odpadli. Podobno kot v primeru LP
se je tudi v primeru CP abscizija pri vseh plodičih izvršila pred 15 DAT. Med terminoma 2
in 5 DAT pa je opazen tudi trend manjšega priraščanja plodičev, ki niso podlegli absciziji.
Rezultati obravnavanja ETEF nakazujejo, da sredstvo močno vpliva na priraščanje
plodičev tudi v primeru, ko se abscizija ne izvrši.
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 82 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
Grafikon 29: Prirast lateralnih (A) in centralnih (B) plodičev, ki so bili podvrženi absciziji
(črni kvadrat) in tistih, ki niso odpadli (rdeči krog) pri obravnavanju ETEF.
Tridnevno SEN ni vplivalo na abscizijo CP, saj nobeden izmed opazovanih plodičev ni
odpadel (Grafikon 30B). Priraščanje CP obravnavanja SEN je bilo v opazovanem obdobju
skorajda linearno, kar pomeni, da SEN ni vplivalo na priraščanje. V prvih treh meritvah na
LP obravnavanja SEN nismo opazili razlik v premeru plodičev, nato pa je SEN v terminu 2
DAT vplivalo na manjši premer LP, ki so bili podvrženi absciziji. Statistično značilne
razlike so bile izmerjene tudi v poznejših terminih, in sicer 5, 8, 10, in 15 DAT. Kot lahko
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 83 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
razberemo iz Grafikona 30A, je bilo priraščanje LP, ki niso bili podvrženi absciziji,
linearno in se tudi v času SEN ni spremenilo. V primeru LP, ki so bili podvrženi absciziji,
pa se je v času SEN oz. med terminoma 2 in 5 DAT pokazalo, da je bilo priraščanje
nekoliko inhibirano. Nato se je po 5 DAT prirast ponovno nekoliko povečal, vendar kot
nakazujejo rezultati, je inhibicija priraščanja v času SEN pomembno pripomogla k poznejši
absciziji.
Grafikon 30: Prirast lateralnih (A) in centralnih (B) plodičev, ki so bili podvrženi absciziji
(črni kvadrat) in tistih, ki niso odpadli (rdeči krog) pri obravnavanju SEN.
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 84 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
5 RAZPRAVA
Na podlagi rezultatov vrednotenja pridelka po posameznem drevesu v času obiranja lahko
sklepamo, da je imela aplikacija NAA, BA in ETEF v letu 2008 vpliv na abscizijo
plodičev. Učinkovitost rastnih regulatorjev se je pokazala v manjšem številu plodov na
drevo, ki pa so imeli zaradi tega večjo maso. Prav tako se je povečal delež debelejših
plodov, čeprav se je skupni pridelek po posameznem drevesu nekoliko zmanjšal. V letu
2009 pa je poleg omenjenih rastnih regulatorjev tudi SEN vplivalo na večjo abscizijo
plodičev, kar se je rezultiralo v manjšem številu dozorelih plodov na drevo in večji
povprečni masi plodov obravnavanja SEN. Prav tako se je povečal tudi delež debelejših
plodov pri obravnavanju SEN. Rezultati potrjujejo predhodne objave, ki govorijo o
pozitivnem učinku redčenja na velikost oz. maso dozorelih plodov (Link 2000, Stopar in
Lokar 2003, Westwood in sod. 1967). Z učinkovitim redčenjem sicer nekoliko zmanjšamo
skupni pridelek, vendar se občutno poveča delež kakovostnejših plodov, ki imajo na trgu
višjo vrednost. Na podlagi analize pridelka smo ugotovili, da je aplikacija BA najbolj
vplivala na maso plodov ob obiranju, saj je bila povprečna masa dozorelih plodov tako v
letu 2008, kot tudi v letu 2009 pri obravnavanju BA največja v primerjavi z ostalimi
obravnavanji. Pozitiven učinek BA na velikost oz. maso plodov je že bil dokazan pri več
sadnih vrstah, med drugimi tudi pri hruški (Stern in Flaishman 2003) in jablani (Wismer in
sod. 1995). Vendar večja masa plodov, tretiranih z BA, ni samo posledica učinkovitega
redčenja plodičev, ampak predvsem pozitivnega učinka na delitev celic v plodiču v zgodnji
fazi rasti oz. razvoja. Rast plodov je pri jablani sestavljena iz dveh obdobij, in sicer je v
prvi fazi, ki traja do približno 35-45 dni po oploditvi, rast oz. večanje ploda predvsem
posledica eksponentne delitve celic. Nato se delitev celic zaustavi in nastopi druga faza,
kjer se plod povečuje predvsem zaradi povečevanja oz. rasti samih celic (Warrington in
sod. 1999, Blanpied in Wilde 1968). Ker je končna masa oz. velikost ploda v pozitivni
korelaciji s številom celic ploda, ima aplikacija BA posredno preko stimulacije delitve
celic pozitiven vpliv na končno maso dozorelih plodov. Nasprotno pa lahko ugotovimo pri
obravnavanju ETEF. Kljub temu da je aplikacija ETEF tako v letu 2008, kakor tudi v letu
2009 učinkovito vplivala na abscizijo plodičev, se povprečna masa plodov statistično ni
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 85 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
razlikovala od povprečne mase plodov pri K-obravnavanju, kjer je bila le-ta najnižja. Na
podlagi tega lahko domnevamo, da ETEF nima tako močnega pozitivnega učinka na maso
dozorelih plodov kot NAA in BA, kljub temu da je učinkovitost redčenja podobna. Pri
opazovanju priraščanja plodičev je bilo razvidno, da aplikacija ETEF zavira debeljenje
plodičev tudi v primeru, ko ti ne odpadejo.
Glavna razlika med učinkovitostjo redčenja v letih 2008 in 2009 je bila pri obravnavanju
SEN. Ugotovili smo, da v letu 2008 SEN ni imelo vpliva na močnejšo abscizijo plodičev,
saj se nobeden od parametrov, ki smo jih ovrednotili ob obiranju in odražajo učinkovitost
redčenja, ni statistično razlikoval od K-obravnavanja. Medtem ko je v letu 2009 tudi
tridnevno senčenje vplivalo na povečano odpadanje plodičev, podobno kot rastni
regulatorji NAA, BA in ETEF. Glede na to, da je bila metoda dela oz. način senčenja v
obeh letih enak, je najverjetnejši razlog za različen odziv dreves oz. plodičev v okoljskih
dejavnikih. Dva- do tridnevno senčenje dreves učinkovito vpliva na abscizijo plodičev, če
se ukrep izvede v terminu med 14. in 28. dnevom po polnem cvetenju (Byers in sod. 1991).
Poznejše ali zgodnejše SEN pa nima tako močnega vpliva na abscizijo. Pomemben
okoljski dejavnik, ki vpliva na učinkovitost redčenja z rastnimi regulatorji in tudi
senčenjem je temperatura (Yuan in Burns 2004, Jones in Koen 1985). Senčenje nima
vpliva na abscizijo plodičev v primeru, da je temperatura okolja ob senčenju relativno
nizka (Byers 2003). V našem primeru je bilo leta 2008 vreme v času, ki je optimalen za
aplikacijo rastnih regulatorjev oz. izvedbo senčenja spremenljivo. V času, ko smo se
odločili za SEN dreves in aplikacijo rastnih regulatorjev, je sledilo obdobje hladnejšega
vremena, ko najvišja dnevna temperatura dva dni ni presegla 14,5 °C, medtem ko se je
ponoči temperatura spustila tudi pod 10,5 °C, tudi tretji in četrti dan po tretiranju je bila
povprečna temperatura pod 14,5 °C. Prav tako je občasno deževalo in bilo večinoma
pretežno oblačno. Zato upravičeno domnevamo, da je bila ravno temperatura tisti dejavnik,
ki je v primeru obravnavanja SEN povzročila razliko glede učinka SEN na abscizijo
plodičev. Kljub temu da SEN v večini primerov vpliva na odpadanje plodičev in so v
preteklosti bile izvedene tudi preliminarne študije glede vpeljave senčenja kot
tehnološkega ukrepa v pridelavi jabolk (Zibordi in sod. 2009), lahko ugotovimo, da tudi ta
ukrep v določenih pogojih ne zagotavlja povečanega odpadanja plodičev. Za razliko od
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 86 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
leta 2008 so bile temperature okolja v letu 2009 v času senčenja in aplikacije rastnih
regulatorjev ter nekaj naslednjih dni, precej višje v primerjavi z letom 2008, saj so vsak
dan presegale 22 °C (Preglednica 1 in 2). Na podlagi tega upravičeno domnevamo, da ima
v primeru senčenja temperatura okolice pomembno vlogo.
Motnje v rasti plodičev oz. v priraščanju plodičev so eden izmed osnovnih indikatorjev
abscizije. Plodiči, ki so podvrženi procesu abscizije, najprej zastanejo v rasti, šele nato tudi
fizično odpadejo (Magein 1989, Byers in sod. 1991). Rezultati, ki smo jih pridobili z
merjenjem premera plodičev v času pred in po aplikaciji rastnih regulatorjev in senčenja,
prikazujejo različen trend priraščanja odpadlih in neodpadlih plodičev. Tudi v primeru K-
obravnavanja se nakazuje različen trend priraščanja plodičev, ki bodo odpadli v primerjavi
s tistimi, ki ne bodo podvrženi absciziji. Pri nobenem obravnavanju ni bilo statistične
razlike v premeru plodičev ob izboru (-5 DAT) glede na to, ali bodo plodiči pozneje
podvrženi absciziji. Pri nadaljnjem opazovanju priraščanja CP in LP smo pri vseh
obravnavanjih ugotovili počasnejše debeljenje plodičev, ki so kasneje odpadli. Plodiči, ki
so bili podvrženi absciziji, so v začetku nekoliko slabše priraščali, nato pa se je razlika v
premeru čedalje bolj povečevala v prid tistih, ki niso odpadli. Najbolj izrazit učinek na
priraščanje plodičev je imela aplikacija ETEF, kjer je že 2 DAT vidno, da je bila rast
plodičev močno inhibirana oz. skorajda zaustavljena. Podobni negativni učinek na rast
plodičev se lahko doseže tudi z aplikacijo kombinacije etefon + karbaril (Ward in Marini
1999). Tretiranje z ETEF je začasno (med 2 in 5 DAT) vplivalo tudi na rast plodičev, ki
niso bili podvrženi absciziji. Tovrstnega učinka nismo opazili pri obravnavanjih NAA, BA
in SEN. Poleg ETEF je tudi SEN v terminu med 0 in 5 DAT inhibiralo rast LP, vendar
samo tistih, ki so bili pozneje podvrženi absciziji. Predvideva se, da SEN povzroči
inhibicijo rasti preko redukcije fotosintetske aktivnosti drevesa (Morandi in sod. 2011).
Negativno delovanje ETEF na prirast plodičev je opazno tudi pri vrednotenju količine in
kakovosti pridelka, kjer smo ugotovili, da so imeli plodovi, tretirani z ETEF, povprečno
statistično značilno nižjo maso v primerjavi s plodovi pri obravnavanjih NAA, BA in SEN.
V primerjavi z ETEF imata NAA in BA ter tudi SEN nekoliko manj izrazit učinek na rast
plodičev, vendar je nesporno dejstvo, da se prirast plodičev, podvrženih absciziji, najprej
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 87 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
zmanjša in nato zaustavi, dokler ne pride do fizične ločitve absczijskega tkiva. Glede na
naše rezultate lahko domnevamo, da je takoj po aplikaciji ETEF rast plodičev močno
inhibirana, medtem ko se rast plodičev, podvrženih absciziji, pri ostalih obravnavanjih
postopoma zmanjšuje in nato zaustavi. Očitno je, da se abscizija v primeru uporabe ETEF
izvrši v krajšem času kot po aplikaciji NAA oz. BA. V prid temu govori tudi podatek, da
so vsi CP in LP, ki so bili podvrženi absciziji, odpadli pred 15 DAT (večinoma med 5 in 10
DAT), medtem ko je bilo odpadanje plodičev pri obravnavanjih NAA, BA in SEN bolj
zmerno oz. je terminsko potekalo dalj časa. Vendar dinamika odpadanja plodičev nima
neposrednega vpliva na končni delež plodičev, ki bodo odpadli, saj je bilo redčenje v letih
2008 in 2009 pri obravnavanjih NAA, BA in ETEF skoraj enako učinkovito.
Na podlagi spremljanja prirasta plodičev je možno tudi predvideti, v kolikšni meri bodo
plodiči podvrženi absciziji (Greene in sod. 2004). Model za izračun verjetnosti je še v fazi
testiranja, vendar bi bilo zelo dobrodošlo, če bi lahko s pomočjo enostavnih meritev
spremljanja premera plodičev ocenili, kakšen delež plodičev bo podvržen absciziji.
Optimalen čas za izvedbo aplikacije je zelo kratek, zato je hitra informacija o učinkovitosti
določenega sredstva v praksi še kako dobrodošla. V primeru, da bi se na podlagi
modelnega izračuna izkazalo, da neko sredstvo v določenem letu ni oz. ne bo v zadostni
meri vplivalo na abscizijo plodičev, bi bil še čas za ponovno aplikacijo. Fizično plodiči
običajno odpadejo med 10-15 DAT, kar pomeni, da ponovna aplikacija ne bi bila več
učinkovita, ker so plodiči prerasli fazo, v kateri so občutljivi na aplikacijo rastnih
regulatorjev. Redčenje z rastnimi regulatorji je učinkovito, če jih uporabimo v fazi premera
plodičev ≈5-16 mm za NAA in BA (Byers 2003, Marini 1996), medtem ko ETEF
učinkovito redči tudi do premera plodičev 30 mm (Jones in sod. 1983, Marini 1996).
Rezultati evolucije etilena, ki smo jo merili na CP in LP v letu 2008, so pokazali, da imajo
rastni regulatorji in SEN vpliv na količino etilena, ki se sintetizira. Najvišje razlike v
količini etilena smo zabeležili predvsem v terminu 8 DAT, čeprav se je višja sinteza etilena
nakazovala že 5 DAT. V primeru CP je apliakcija ETEF povzročila signifikantno višjo
sintezo etilena v terminu 5 DAT, ki je nato do termina 8 DAT strmo naraščala. V primeru
obravnavanj K, NAA, BA in SEN pa se evolucija etilena skozi celotno obdobje opazovanja
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 88 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
ni bistveno spremenila. Tudi pri LP smo nekoliko višje količine etilena izmerili pri
vzorcih obravnavanja ETEF v terminu 5 DAT, medtem ko ostala obravnavanja v tem času
še niso vplivala na sintezo etilena. Nato se je evolucija etilena med 5 in 8 DAT močno
povišala pri obravnavanju ETEF, nekoliko manjše povišanje je bilo opaziti pri
obravnavanju SEN, ki mu sledi K. Najmanjši vpliv na količino izmerjenega etilena v
terminu 8 DAT pa sta imeli obravnavanji NAA in BA.
Rezultati spremljanja evolucije etilena so v nekaterih delih nekoliko v nasprotju s
pričakovanji. Učinek ETEF je seveda bil pričakovan, glede na domnevo, da aplikacija tega
rastnega regulatorja močno vzpodbudi sintezo etilena (Yuan 2007) in da je abscizija, ki jo
povzroči ETEF posledica močnega zvišanja sinteze etilena (Dennis 2000). Prav tako se
omenja, da senčenje stimulira sintezo etilena (Taylor in Whitelaw 2001). Nekoliko
preseneča neznaten vpliv aplikacije NAA in BA na sintezo etilena, glede na dejstvo, da so
nekateri raziskovalci predhodno ugotovili povišano evolucijo etilena po tretiranju s tema
dvema rastnima regulatorjema (Curry 1991, Kondo in Mizuno 1989, Walsh in sod. 1979).
Čeprav je Greene s sod. (1992) podvomil, da je višja sinteza etilena, ki jo povzročita NAA
in BA razlog za začetek abscizije plodičev, saj je povečanje sinteze etilena, ki jo povzroči
aplikacija omenjenih rastnih regulatorjev, relativno majhno. Prav tako so v primeru NAA
in BA veliko verjetnejši drugi mehanizmi delovanja (Byers 2003).
Glede na terminski razpored merjenja evolucije etilena smo na podlagi predhodnih
raziskav pričakovali povečane vrednosti že v terminu 2 DAT, kar pa se v našem primeru ni
zgodilo. Najverjetnejši razlog za »zakasnelo« evolucijo etilena je v okoljskih dejavnikih.
Temperatura v času in nekaj dni po aplikaciji rastnih regulatorjev je najpomembnejši
okoljski dejavnik, ki vpliva na učinkovitost sredstva (Flore in Bukovac 1982, Olien in
Bukovac 1978, Jones in Kohen 1985). Prav tako je evolucija etilena močno odvisna od
temperature okolja, kar še posebej velja v primeru tretiranja z ETEF (Yuan 2007). V
primeru nižjih temperatur poteka sinteza etilena mnogo počasneje kot takrat ko so
temperature višje, zaradi tega se v našem primeru vrh evolucije etilena ni zgodil 2 DAT,
kot smo pričakovali, ampak se je evolucija etilena strmo povečala šele 8 DAT. Kot smo že
omenili, je v našem primeru v letu 2008 tretiranju z rastnimi regulatorji oz. senčenju
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 89 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
sledilo obdobje hladnejšega vremena. Zato upravičeno domnevamo, da so nižje
temperature okolice vplivale na počasnejšo sintezo etilena.
Samostojni podatki evolucije etilena nam ne povejo veliko o pomembnosti etilena v
procesu abscizije. V primeru, da rezultate evolucije etilena v letu 2008 povežemo z
rezultati spremljanja dinamike odpadanja plodičev v istem letu, pa postane vloga etilena
nekoliko bolj jasna. Abscizija CP se je v letu 2008 močneje pojavila samo pri
obravnavanju ETEF, medtem ko ostala obravnavanja skorajda niso povzročila odpadanja
CP. Večina CP obravnavanja ETEF, ki so bili podvrženi absciziji, je odpadla med 8 in 10
DAT. Domnevamo lahko, da je bilo intenzivno odpadanje CP obravnavanja ETEF
povezano z višjo evolucijo etilena, ki je bila opazna že 5 DAT in se je nato povečevala do
8 DAT. Pri obravnavanjih K, NAA, BA in SEN pa v CP nismo zabeležili močnejšega
povečanja evolucije etilena, prav tako pa je bila abscizija CP zelo majhna.
V primeru LP so plodiči pričeli odpadati že 5 DAT, in sicer najbolj intenzivno pri
obravnavanju ETEF, kjer je med 5 in 8 DAT odpadla velika večina LP, ki so bili podvrženi
absciziji. Podobno kot v primeru CP je bila tudi pri LP najvišja evolucija etilena izmerjena
pri obravnavanju ETEF. Dinamika odpadanja LP pri ostalih obravnavanjih je bila v
primerjavi z ETEF mnogo bolj zmerna, vendar se je izmed ostalih obravnavanj najbolj
intenzivno izrazila pri obravnavanju SEN. Če pogledamo evolucijo etilena iz LP, lahko
vidimo, da je SEN poleg ETEF najbolj vplivalo na višjo evolucijo etilena. Pri
obravnavanjih K, NAA in BA so LP konstantno odpadali med 8 in 22 DAT, prav tako pa
je bila evolucija etilena pri teh obravnavanjih najnižja oz. v primeru NAA in BA skorajda
ni bilo povišane sinteze etilena. Domnevamo lahko, da je dinamika odpadanja plodičev
povezana s količino etilena, ki se sintetizira v plodičih, čeprav količina etilena in sama
dinamika odpadanja nimata neposrednega vpliva na delež plodov, ki bodo podvrženi
absciziji oz. na jakost redčenja. Višja evolucija etilena torej pozitivno vpliva na sam potek
procesa abscizije, ki se v tem primeru odvija hitreje kot v primeru nizke sinteze etilena,
vendar količina sintetiziranega etilena ni v povezavi s končnim deležem plodičev, ki bodo
odpadli. Ta trditev se sklada z domnevo, da je etilen pomemben dejavnik, ki lahko pospeši
razvoj abscizijskih procesov (Brown 1997, Sexton in Roberts 1982). Vendar se tudi v
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 90 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
primeru nizke evolucije etilena abscizija izvrši, vendar sam proces očitno poteka
počasneje.
Spremljanje dinamike odpadanja plodičev v letu 2009 je pokazalo precej primerljive
rezultate glede na poskus v predhodnem letu. Tudi v letu 2009 so LP pričeli odpadati ≈3
dni prej kot CP. Prav tako so bili CP najbolj podvrženi absiziji pri obravnavanju ETEF,
nekoliko manj pa je na odpadanje CP vplivalo SEN. Pri K, NAA in BA pa skorajda ni bilo
odpadanja CP. Tudi v primeru LP je bila dinamika odpadanja močno podobna rezultatom
iz leta 2008. Ugotovili smo, da je tretiranje z ETEF povzročilo intenzivno odpadanje LP
med 5 in 10 DAT, prav tako so relativno intenzivno odpadali tudi LP obravnavanja SEN.
Pri obravnavanjih K, NAA in BA pa je večina LP odpadla šele med 10 in 15 DAT. Tudi v
tem letu smo ugotovili, da dinamika odpadanja nima vpliva na končni delež plodov, ki
odpadejo v tem obdobju.
Kljub obsežnemu pregledu literature nisem uspel zaslediti podobnih znanstvenih objav,
kjer bi se primerjala dinamika odpadanja plodičev po tretiranju z rastnimi regulatorji oz.
senčenju, saj se običajno spremlja oz. ovrednoti le končni učinek posameznega sredstva na
abscizijo plodičev. Predstavljeni rezultati prikazujejo, kako pomembno vlogo ima
evolucija etilena pri razvoju abscizije, vendar kljub temu ni možno potrditi, ali je etilen
ključni faktor za potek abscizije, saj se ta izvede tudi, če je sinteza etilena zelo nizka.
Glede na močno povečanje evolucije etilena, ki ga povzroči aplikacija ETEF, ter na
posledično kratkotrajno intenzivno odpadanje plodičev, se postavlja vprašanje ali se v
primeru aplikacije ETEF abscizija izvrši zaradi velike količine sintetiziranega etilena ali
kot posledica inhibicije rasti plodičev, ki smo jo ugotovili na podlagi spremljanja prirasta
plodičev. Ali je torej inhibicija rasti plodičev hkrati posledica visoke evolucije etilena in
vzrok za začetek ascizijskih procesov? Glede na terminski razvoj visoka evolucija etilena
ne vpliva na prirast plodičev, saj se je količina etilena v vzorcih plodičev značilno povečala
šele v terminih 5 in 8 DAT, medtem ko je bila inhibicija rasti plodičev opazna že 2 DAT, v
terminu 5 DAT pa se je rast plodičev že skorajda zaustavila. Zaviralni učinek na rast
plodičev po tretiranju z ETEF je bil opazen zelo zgodaj v raziskovanju tega rastnega
regulatorja (Ebert in Bender 1986), zaradi tega se je predvidevalo, da ETEF vsaj delno
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 91 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
vpliva na abscizjio preko inhibicije rasti plodičev. Glede na to lahko na podlagi naših
rezultatov domnevamo, da je aplikacija ETEF v prvi fazi povzročila inhibicijo rasti
plodičev, šele nato je visoka evolucija etilena, ki je bila najverjetneje prav tako posledica
delovanja ETEF, povzročila hiter razvoj abscizijskih procesov, ki so privedli do
intenzivnega odpadanja plodičev. Če je naša domneva pravilna, bi lahko rekli, da tudi v
primeru ETEF začetek abscizije ni sprožen preko stimulirane sinteze etilena, ampak se
proces abscizije prične kot posledica inhibicije rasti plodičev.
S spremljanjem ekspresije genov MdACO1, MdACS5A in MdACS5B, za katere se
domneva, da sodelujejo v procesu sinteze etilena v plodičih (Li in Yuan 2008), smo želeli
podrobneje spremljati razvoj etilena po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenju. Večina
dosedanjih raziskav je spremljala ekspresijo omenjenih genov po aplikaciji rastnih
regulatorjev, ki so znani kot promotorji ali inhibitorji sinteze etilena (Ruperti in sod. 2002,
Tonutti in sod. 1997). Glede na dejstvo, da so LP mnogo bolj podvrženi absciziji v
primerjavi s CP (Bangerth 2000), je bil naš poskus zasnovan z namenom spremljanja razlik
v izraženosti omenjenih genov med dvema tipoma plodičev z različnim abscizijskim
potencialom. Kot kažejo rezultati, je bila takšna zasnova smiselna, saj smo med LP in CP
ugotovili nekatere pomembne razlike tako v izraženosti genov, kot tudi pri merjenju ostalih
parametrov.
Aplikacija rastnih regulatorjev oz. SEN je mnogo bolj vplivalo na ekspresijo MdACO1 v
primerjavi z MdACS5A in MdACS5B, kar se je pokazalo tudi že v nekaterih predhodnih
raziskavah (Zhu in sod. 2008, Zhu in sod. 2010). Medtem ko smo v letu 2008 8 DAT v
plodičih izmerili tudi do nekaj tisočkratno povečanje ekspresije MdACO1, pa so bile
razlike med obravnavanji v primeru MdACS5A in MdACS5B veliko manjše. Kljub temu
pomembnosti teh dveh genov ne gre izključevati, saj je Wang s sod. (2002) domneval, da
imajo, geni odgovorni za sintezo ACS, vlogo regulatorja in so limitirajoči dejavnik pri
sintezi etilena. Tudi v letu 2009 se je ekspresija MdACO1 odvijala na mnogo višjem nivoju
v primerjavi z MdACS5A in MdACS5B. Kot smo predvidevali, pa so se tudi v tem letu
pokazale pomembne razlike med ekspresijo genov, povezanih s sintezo etilena v CP v
primerjavi z LP. Ugotovili smo, da ima samo aplikacija z ETEF vpliv na višjo ekspresijo
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 92 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
MdACO1 v CP, medtem ko se je v LP ekspresija MdACO1 povečala tudi pri obravnavanjih
NAA, BA in SEN. Tak rezultat sovpada z dejanskim odpadanjem plodičev, ki je bilo v
primeru CP prisotno samo pri obravnavanju ETEF. Na podlagi tega rezultata lahko
potrdimo, da je ekspresija MdACO1 dober indikator abscizije oz. prisotnosti abscizijskih
procesov (Dal Cin in sod. 2007, Dal Cin in sod. 2009). Višja ekspresija MdACO1 je bila v
LP prisotna pri vseh obravnavanjih z izjemo K. Signifikantno je izstopala ekspresija
tarčnega gena po tretiranju z ETEF, vendar so tudi NAA, BA in SEN statistično značilno
vplivali na ekspresijo tarčnega gena v primerjavi s K-obravnavanjem. Če pa povežemo
rezultate ekspresije z ostalimi meritvami, ki smo jih izvajali lahko ugotovimo, da
ekspresija MdACO1 ni v korelaciji z deležem plodičev, ki dejansko odpadejo. Veliko bolj
se ekspresija MdACO1 v LP ujema z dinamiko odpadanja plodičev. Kot smo že ugotovili
je intenzivnejša dinamika odpadanja plodičev povezana z višjo sintezo etilena za katero pa
je najverjetneje odgovorna povečana ekspresija MdACO1 (Bonghi in sod. 2000, Dal Cin in
sod. 2005). Višja ekspresija tega gena v terminu 4 DAT pri obravnavanjih ETEF in SEN je
možen vzrok za intenzivno odpadanje LP, ki je sledilo med 5 in 10 DAT. Nasprotno pa so
LP obravnavanja NAA pričeli množično odpadati šele med 10 in 15 DAT. Prav pri
obravnavanju NAA smo večjo ekspresijo MdACO1 zabeležili šele 7 DAT.
Predpostavljamo lahko, da ima MdACO1 preko vpliva na sintezo etilena pomembno vlogo
v razvoju abscizije, vendar še vedno ostaja odprto vprašanje glede njegove vloge v
začetnih stopnjah abscizije.
Čeprav so se spremembe ekspresije MdACS5A in MdACS5B v vzorcih plodičev dogajale
na precej nižjem nivoju, jih ne smemo spregledati. Kljub temu, da se domneva, da imata
MdACS5A in MdACS5B pomembno vlogo pri sintezi etilena v plodičih jablane pa jima na
podlagi naših rezultatov ne moremo pripisati ključne vloge. Dal Cin s sod. (2005) je po
aplikaciji BA opazil samo aktivnost MdACS5B, medtem ko je Zhu s sod. (2008) 4 DAT z
NAA ugotovil močno povečanje ekspresije MdACS5A in MdACS5B. Isti avtor pa je v
nekem drugem eksperimentu v opazovanju omenjenih dveh genov skozi 7 dnevno obdobje
zabeležil le manjše povečanje aktivnosti (Zhu in sod. 2010). Takšni podatki nam vlivajo
sum, da sta MdACS5A in MdACS5B pomembna dejavnika v procesu abscizije, vendar
njuno izražanje ni tako nedvoumno, kot v primeru MdACO1. V skladu s predhodnimi
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 93 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
objavami tudi naši rezultati namigujejo na vključenost MdACS5A in MdACS5B v sintezo
etilena v plodičih. V primeru CP je bilo nekaj višjo aktivnost obeh genov opaziti pri
obravnavanju ETEF takoj po aplikaciji (1 DAT), ki pa se je nato zmanjševala. Nekoliko
večji vpliv na ekspresijo obeh genov so imela obravnavanja NAA, BA, ETEF in SEN v
primeru LP za katere vemo, da so bili bolj podvrženi absciziji. V obeh opazovanih letih je
bila ekspresija tako MdACS5A, kakor tudi MdACS5B pri obravnavanjih, ki so vplivala na
močnejše odpadanje plodičev, nekoliko povišana v primerjavi s K-obravnavanjem.
Podobno kot v primeru MdACO1 se tudi ekspresija MdACS5A in MdACS5B ni odvila takoj
po aplikaciji, ampak šele 4 DAT oz. pozneje.
Spremljanje ekspresije s sintezo etilena povezanih genov na AZ je pokazalo, da samo
ETEF vpliva na višjo ekspresijo MdACO1, MdACS5A in MdACS5B. V letu 2008 je bila
ekspresija vseh treh opazovanih genov 8 DAT povišana v vzorcih AC in AL. Tudi v letu
2009 smo zabeležili podobne rezultate, saj se je ekspresija vseh opazovanih genov v
vzorcih AZ povišala šele v terminu 7 DAT, medtem ko so bile ekspresije tarčnega gena v
terminih 0, 1 in 4 DAT pri vseh obravnavanjih na začetnem nivoju. Zanimiva je tudi
ugotovitev, da nismo opazili bistvenih razlik med ekspresijo v tkivu AL v primerjavi z AC.
Edina manjša razlika, ki smo jo opazili, je bila, da so se pri obravnavanju ETEF vsi
opazovani geni v obeh letih izrazili na višjem nivoju v vzorcih AC v primerjavi z AL. V
našem poskusu nismo uspeli potrditi rezultatov Dal Cina s sod. (2005) in Zhu s sod.
(2008), ki sta dokazala povečano ekspresijo MdACO1, MdACS5A in MdACS5B v tkivu AZ
po tretiranju z NAA, čeprav je treba poudariti, da je v obeh primerih šlo za zelo majhno
povečanje ekspresije tarčnih genov. Razlog za to, da je samo ETEF vplival na ekspresijo
opazovanih genov v AZ, je lahko hiter razvoj abscizijskih procesov pri tem obravnavanju,
saj večja aktivnost genov sovpada s pričetkom odpadanja plodičev, ki se je pri
obravnavanju ETEF pričelo ≈5 dni prej kot pri ostalih obravnavanjih. Drugi dejavnik, ki je
lahko sprožil ekspresijo na AZ, pa je močno povečanje MdACO1 v plodičih, kar bi lahko
bil vzrok za večjo aktivnost tudi v tkivu AZ.
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 94 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
6 SKLEPI
Etilen ima ključno vlogo v procesu abscizije plodičev predvsem iz vidika intenzivnosti
razvoja abscizije. Rezultati so pokazali, da je razvoj procesov, povezanih z abscizijo
mnogo hitrejši v primeru višje sinteze etilena oz. višje ekspresije genov MdACO1 in
MdACS5A. S povečano ekspresijo genov, odgovornih za sintezo etilena, je povezana
intenziteta odpadanja plodičev. Domnevamo lahko, da je vloga etilena ključna v smislu
vodenja procesa abscizije, medtem ko je njegova vloga pri sprožitvi procesa, ki velja za
ključen dejavnik, še vedno nejasna.
S pomočjo poskusov v letih 2008 in 2009 smo potrdili, da aplikacija NAA, BA in ETEF v
fazi premera plodičev ≈10 mm vpliva na povečano abscizijo plodičev, kar pozitivno vpliva
na kakovost dozorelih plodov in zmanjša možnost pojava alternance. Učinkovitost
omenjenih rastnih regulatorjev se je v obeh letih pokazala v večjem številu plodičev, ki so
odpadli iz posameznih dreves v primerjavi s K-drevesi. Podoben učinek je možno doseči
tudi z redukcijo svetlobe (3-dnevno senčenje), vendar je učinkovitost odvisna od zunanjih
dejavnikov. Domnevamo lahko, da imajo višje temperature v času SEN pozitiven vpliv na
abscizijo, medtem ko nizke temperature izničijo učinek, ki ga dosežemo z redukcijo
svetlobe. V skladu z našo hipotezo so se CP in LP različno odzvali na aplikacijo rastnih
regulatorjev oz. SEN. Nedvoumno je, da so LP veliko bolj podvrženi absciziji, ki jo
izzovemo s pomočjo rastnih regulatorjev oz. SEN. To trditev smo uspeli potrditi z več
meritvami, in sicer je bila izraženost genov, odgovornih za sintezo etilena v LP povišana v
primerih obravnavanj NAA, BA, ETEF in SEN, medtem ko je v primeru CP samo ETEF
vplival na večjo ekspresijo omenjenih genov. Skladno s tem so CP v večjem obsegu
odpadali samo pri obravnavanju ETEF, medtem ko so LP bili podvrženi absciziji v primeru
vseh obravnavanj. Glede na pretekle objave so bile razlike v odzivnosti CP in LP
pričakovane, ob tem pa nam je uspelo dokazati, da so razlike prisotne tudi na genetskem
nivoju.
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 95 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
Glede vpliva rastnih regulatorjev oz. SEN na izraženost genov, odgovornih za sintezo
etilena, smo ugotovili, da ima ETEF nedvomno največji vpliv na ekspresijo MdACO1,
MdACS5A in MdACS5B. Za ETEF je znano, da vpliva na višjo evolucijo etilena in prav
zaradi te lastnosti smo ga uvrstili v naš poskus, saj smo na ta način dokazali povezavo med
etilenom in opazovanimi geni. Tretiranje z ETEF je povzročilo močno ekspresijo MdACO1
gena v plodičih, poleg tega pa je edino aplikacija ETEF vplivala na večjo izraženost genov
v tkivu AZ. Prav tako smo samo v primeru obravnavanja ETEF zabeležili večjo izraženost
MdACO1 v CP, medtem ko ostala obravnavanja niso vplivala na ekspresijo omenjenega
gena v CP. Domnevamo lahko, da je abscizija plodičev po tretiranju z ETEF posledica
močno povišane sinteze etilena, čeprav ne smemo zanemariti vpliva na inhibicijo rasti
plodičev, ki smo jo prav tako dokazali in bi tudi lahko bila potencialen vzrok za začetek
abscizijskih procesov.
Redukcija svetlobe oz. SEN je vplivalo na višjo izraženost MdACO1 v vzorcih LP,
medtem ko na izraženost v CP in MdACS5A ter MdACS5B SEN ni imelo vpliva. Podobno
lahko zaključimo tudi pri obravnavanjih NAA in BA, kjer je večja ekspresija MdACO1 bila
zabeležena le v tkivu LP. Prav tako sta NAA in BA vplivala še na nekoliko povečano
ekspresijo MdACS5A in MdACS5B v tkivu LP, medtem ko sta imela zanemarljiv vpliv na
izraženost opazovanih genov v tkivu AZ. Na podlagi rezultatov lahko ugotovimo, da sta
imela tako aplikacija rastnih regulatorjev, kakor tudi SEN vpliv na izraženost genov,
odgovornih za sintezo etilena. Izmed opazovanih genov so bile največje razlike opažene
pri MdACO1, čeprav to ne izključuje potencialne pomembnosti MdACS5A in MdACS5B.
Gen MdACO1 se je pokazal kot ustrezen indikator abscizije plodičev, saj je v večini
primerov večji izraženosti tega gena sledilo močnejše odpadanje plodičev. Vendar
relativna kvantifikacija, ki smo jo izvedli, ni ustrezen inštrument za napovedovanje jakosti
odpadanja plodičev. Izkazalo se je, da je ekspresija tarčnega gena povezana z
intenzivnostjo poteka abscizije, ki pa ne vpliva na končni delež plodičev, ki so bili
podvrženi absciziji. Torej delež plodov, podvrženih absciziji, ni sorazmeren ekspresiji
tarčnega gena, ki smo jo izračunali z relativno kvantifikacijo.
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 96 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
7 POVZETEK
Kljub temu da je naravni mehanizem junijskega odpadanja plodičev pri jablani (Malus
domestica Borkh.) dobro razvit, je potrebno za doseganje redne rodnosti in boljše
kakovosti plodov uporabljati tehnološke ukrepe, s katerimi dodatno vzpodbudimo
odpadanje plodičev. Uveljavljena metoda za redčenje plodičev je škropljenje dreves z
rastnimi regulatorji, čeprav mehanizem delovanja omenjenih sredstev še vedno ni jasen.
Pomemben dejavnik pri razvoju abscizijskih procesov je tudi rastlinski hormon etilen,
vendar zaenkrat njegova vloga še ni popolnoma raziskana. Podobno kot z rastnimi
regulatorji (NAA, BA in ETEF) lahko na abscizijo vplivamo tudi s senčenjem.
Namen raziskave je bil podrobneje proučiti vlogo etilena v procesu abscizije plodičev ter
ugotoviti, ali je prisotnost etilena neodvisna od dejavnika, s katerim sprožimo abscizijo
(rastni regulatorji, senčenje). Proučevali smo povezavo med ekspresijo genov, odgovornih
za evolucijo etilena (MdACO1, MdACS5A in MdACS5B), in dejansko frekvenco odpadanja
oz. deležem plodov, ki so bili podvrženi absciziji. Glede na dejstvo, da so lateralni plodiči
(LP) bolj podvrženi abscizijskim procesom v primerjavi s centralnimi plodiči (CP) smo
želeli ugotoviti, ali obstajajo razlike tudi pri izraženosti opazovanih genov.
Za izvedbo raziskave smo v jablanovem nasadu na sorti 'Zlati delišes' zasnovali dvoletni
poljski poskus v poskusnem nasadu Kmetijskega inštituta Slovenije na Brdu pri Lukovici.
Poskus je bil razdeljen na dva dela, od katerih je vsak zajemal 8 naključnih blokov s 5
obravnavanji. Tretiranje z rastnimi regulatorji in senčenje smo opravili, ko je bil povprečen
premer plodičev ≈10 mm. V obeh letih smo imeli sledeča obravnavanja: 1. K (netretirano),
2. NAA (15 mg l-1), 3. BA (150 mg l-1), 4. ETEF (500 mg l-1) in 5. SEN (3 dni, 96 %
redukcija fotosintetsko aktivnega sevanja). V času trajanja poskusa smo na drevesih oz.
plodičih opravljali različne meritve, in sicer: prirast plodičev, frekvenco odpadanja
plodičev, evolucijo etilena, vzorčenje tkiva za genetske analize in končno vrednotenje
pridelka po posameznem drevesu. Evolucijo etilena smo spremljali v terminih 0, 2, 5 in 8
dni po tretiranju (DAT), in sicer smo koncentracijo etilena v vzorcih določili s plinsko
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 97 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
kromatografijo (GC). V letu 2008 smo vzorce za genetske analize vzorčili 0 in 8 DAT,
medtem ko v letu 2009 v terminih 0, 1, 4 in 7 DAT. Za genetske analize, ki smo jih
opravili v laboratorijih Kmetijskega inštituta Slovenije, smo vzorčili tkivo CP in LP ter
tkivo abscizijske cone obeh tipov plodičev. Najprej smo iz vzorcev izolirali celokupno
RNA, nato pa smo za opazovanje izražanja genov MdACS5A, MdACS5B in MdACO1
uporabili kvantitativno verižno reakcijo s polimerazo (qPCR). V času tehnološke zrelosti
smo še ovrednotili pridelek po posameznem drevesu.
Nanos NAA, BA in ETEF je v letih 2008 in 2009 povzročil večjo abscizijo plodičev v
primerjavi s K. Podoben učinek smo v letu 2009 dosegli s SEN, medtem ko v letu 2008
SEN ni vplivalo na abscizijo plodičev. Potrdili smo, da so bili absciziji mnogo bolj
podvrženi LP pri vseh obravnavanjih, medtem ko je nekoliko večjo abscizijo CP
povzročila samo aplikacija ETEF.
Spremljanje priraščanja plodičev po aplikaciji rastnih regulatorjev in senčenju je pokazalo,
da ETEF najmočneje zavira rast plodičev, tudi v primeru ko ti niso podvrženi kasnejši
absciziji. Medtem pa NAA, BA, in SEN zavrejo predvsem rast plodičev, ki so pozneje
podvrženi absciziji. Neglede na obravnavanje pa smo ugotovili, da je rast plodičev pred
abscizijo v vseh primerih zavirana oz. zaustavljena. To pomeni, da je tudi rast plodičev oz.
njeno zaviranje pokazatelj abscizije.
Evolucija etilena iz plodičev je bila različna med posameznimi obravnavanji, prav tako pa
je imel vpliv tudi tip plodičev. Tako smo v primeru CP najmočnejšo evolucijo etilena
izmerili pri obravnavanju ETEF, ki se je povišala v terminu 5 in 8 DAT, medtem pa ostala
obravnavanja niso povzročila večje evolucije etilena v CP. Nasprotno pa smo pri LP, poleg
obravnavanja ETEF, povečano evolucijo etilena izmerili tudi pri ostalih obravnavanjih,
kjer je bila najvišja v terminu 8 DAT, medtem ko je bila evolucija etilena pri obravnavanju
ETEF povišana že v terminu 5 DAT. Rezultati spremljanja frekvence odpadanja plodičev
so pokazali, da se je v primeru večje sinteze etilena odpadanje plodičev začelo prej kot v
primerih, ko je bila evolucija etilena manjša. Tako so najhitreje in tudi najintenzivneje
odpadali LP obravnavanja ETEF, ki so mu sledili LP obravnavanja SEN, medtem ko je
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 98 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
bilo odpadanje pri obravnavanjih NAA, BA in K bolj zmerno in se je terminsko pričelo
nekoliko kasneje. Kljub temu pa višje evolucije etilena ne moremo povezati z večjim
deležem plodičev, ki so bili podvrženi absciziji, ampak velja pozitivna povezava samo
glede intenzivnosti odpadanja.
Največje razlike med termini in obravnavanji smo na genetskem nivoju ugotovili pri
izraženosti gena MdACO1, medtem ko so bile spremembe v primeru MdACS5A in
MdACS5B veliko manjše. Največje spremembe v ekspresiji opazovanih genov je
povzročilo tretiranje z ETEF, ki je edino vplivalo na večjo izraženost MdACO1 v tkivu CP,
prav tako pa je edino ETEF vplival na močnejšo ekspresijo vseh opazovanih genov v tkivu
AZ. V vzorcih LP so vsa obravnavanja povzročila večjo ekspresijo MdACO1 v primerjavi
z LP K-dreves. Izraženost MdACO1 v tkivu plodičev se je izkazala kot dober indikator
abscizijskih procesov, čeprav ekspresija tarčnega gena, ki smo jo izračunali pri relativni
kvantifikaciji, ni sovpadala z deležem plodov, ki so bili podvrženi absciziji. Veliko bolj je
povišana ekspresija MdACO1 sovpadala s frekvenco odpadanja plodičev, kar potrjuje
domnevo, da etilen pospešuje potek abscizijskih procesov.
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 99 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
8 SUMMARY
In spite of the fact that the natural mechanism of June drop is well developed in apple
(Malus domestica Borkh.), in order to obtain regular bearing and higher amount of the
most valuable fruit, thinning as a technological measure cannot be avoided. The use of
plant growth regulators is an established measure for fruit set regulation, although the
mode of action of regulators is unclear. An important factor in the development of
abscission process is the gaseous hormone ethylene, but until now its role has not been
fully explored yet. Similarly as with growth regulators, abscission can be induced by
shading.
The aim of our research was to analyze the role of ethylene in the fruitlet abscission
process and to find out if ethylene was involved in abscission regardless of factors which
induced the process (growth regulators, shading). We also studied the relation between the
expression of genes related to ethylene biosynthesis (MdACO1, MdACS5A and MdACS5B)
and actual abscission dynamics, and the amount of abscised fruitlets. Taking into account
that lateral fruitlets (LF) are more subjected to abscission in comparison with the king
fruitlets (KF) we wanted to find out if there were differences between LF and KF also in
the case of expression of observed genes.
In the experimental orchard of Agricultural Institute of Slovenia situated at Brdo near
Lukovica, a two-year field trial was designed involving the apple variety ‘Golden
Delicious’. The experiment was divided into two groups, and each group consisted of a
complete randomized block experiment with eight replications and five treatments (K,
NAA, BA, ETEF and SEN). During the experiment, different measurements were
performed on trees and fruitlets, namely: fruit growth, abscission dynamics, ethylene
evolution, sampling of tissue for molecular analysis and evaluation of yield per tree at
harvest. The ethylene evolution was observed 0, 2, 5 and 8 days after treatment (DAT) and
it was based on gas chromatography (GC). The samples for molecular analysis were
collected in 2008 at 0 and 8 DAT, but in 2009, sampling dates were 0, 1, 4, and 7 DAT.
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 100 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
The molecular analyses were performed in the laboratory of the Agricultural Institute of
Slovenia. In the first step, the total RNA was isolated from each sample and then, after
conducting quantitative polymerase chain reaction (qPCR), we assessed the expression of
MdACS5A, MdACS5B and MdACO1.
The application of NAA, BA and ETEF, in 2008 and 2009, effectively increased the
number of abscised young fruits. Similar effect was achieved in 2009 by shading, but not
in 2008. We believe that the most probable reason for ineffectiveness of shading in 2008
were relatively low temperatures when measurements took place. We also confirmed that
LF were more subjected to abscission while in the case of KF only the ETEF treatment
induced it.
The strongest nonselective inhibiting effect on fruit growth was recorded after the ETEF
application while NAA, BA and SEN inhibited mostly fruitlets which were later subjected
to abscission process. Results of ethylene evolution showed that, next to treatment, the type
of fruitlets (i.e. KF or LF) was an important factor. In the case of KF only ETEF enhanced
the ethylene evolution, since in the case of LF also NAA, BA, and SEN influenced the
ethylene biosynthesis.
The greatest differences between sampling dates and treatments were recorded in the
expression of MdACO1 while changes in the expression of MdACS5A and MdACS5B were
at a much lower level. The greatest influence on the expression of the observed genes was
caused by the ETEF treatment, which was the only treatment that increased MdACO1 in
the tissues of KF. Similarly, only the ETEF treatment increased the expression of all
observed genes in the abscission zone tissue. In the case of LF, all treatments, except the
K, enhanced the expression of MdACO1. The expression of MdACO1 in fruitlet tissue was
found to be a reliable indicator of abscission, although the amount of the target gene was
not related with the amount of the abscised fruitlets. The increased expression of MdACO1
was more coincidental with the abscission dynamic.
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 101 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
9 LITERATURA
1. Abeles FB. 1973. Ethylene in plant biology. New York, Academic Press.
2. Abeles FB, Morgan PW, Saltveit ME. 1992. Ethylene in plant biology, 2nd edn.
New York Academic Press.
3. Addicott FT. 1982. Abscission. Univ. California Press, Berkeley, USA.
4. Alexander L, Grierson D. 2002. Ethylene biosynthesis and action in tomato: a
model for climacteric fruit ripening. J. Expt. Bot., 53(377): 2039-2055.
5. Arteca NR. 1995. Plant growth substances. Chapman&Hall, New York, 45-222.
6. Bangerth F. 1978. The effect of a substituted amino acid on ethylene biosynthesis,
respiration, ripening and preharvest drop of apple fruits. J. Amer. Soc. Hort. Sci.,
103: 401-404.
7. Bangerth F. 2000. Abscission and thinning of young fruit and their regulation by
plant hormones and bioregulators. Plant Growth Regulat., 31: 43-59.
8. Beruter J, Droz P. 1991. Studies on locating the signal for fruit abscission in the
apple tree. Scientia Hortic., 46: 201-214.
9. Black BL, Bukovac MJ, Hull J. 1995. Effect of spray volume and time of NAA
application on fruit size and cropping of Redchief ‘Delicious’ apple. Sci. Hort., 64:
253-264.
10. Blanke MM. 2008. Source-sink relationships in apple trees. V: Hudina M. Zbornik
referatov 2.slovenskega sadjarskega kongresa z mednarodno udeležbo. Strokovno
sadjarsko društvo Slovenije, Ljubljana 2008: 27-29.
11. Blanpied GD, Wilde MH. 1968. A study of the cells in the outer flesh of
developing McIntosh apple fruits. Bot. Gaz., 129: 178-183.
12. Blecker AB, Kende H. 2000. Ethylene: a gaseous signal molecule in plants. Annu.
Rev. Cell Dev. Biol., 16: 1-18.
13. Bonghi C, Tonutti P, Ramina A. 2000. Biochemical and molecular aspects of
fruitlet abscission. Plant growth regulation, 31: 35-42.
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 102 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
14. Bound SA, Jones KM, Oakford MJ, Tichon M. 1993. Assesing interactive effects
between cytolin and ethephon on cropping red 'Delicious'. J. Hort. Sci., 68: 209-
213.
15. Brown KM. 1997. Ethylene and abscission. Physiol. Plant, 100: 567-576.
16. Burns JK, Hartmond U, Kender JW. 1999. Acetolactate synthase inhibitors increase
ethylene production and cause fruit drop in citrus. HortScience, 34(5): 908-910.
17. Byers ER. 2003. Flower and fruit thinning and vegetative fruit balance. V: Ferre
DC in Warrington IJ. Apples. Cabi publishing, Cambridge: 437-458.
18. Byers RE, Lyons CG, Yoder KS, Barden JA, Young RW. 1985. Peach and apple
thinning by shading and photosynthetic inhibition. J. Hort. Sci., 60: 465-472.
19. Byers RE, Barden JA, Polomski RF, Young RW, Carabaugh DH. 1990. Apple
thinning by photosynthetic inhibition. J. Amer. Soc. Hort. Sci., 115: 14-19.
20. Byers RE, Carabaugh DH, Presley CN, Wolf TK. 1991. The influence of low light
on apple fruit abscission. J. Hort. Sci., 66(1): 7-17.
21. Callejas R, Bangerth F. 1997. Is auxin export of apple fruit an alternative signal for
inhibition of flower bud induction? Acta Hort., 463: 271-277.
22. Corelli Grappadelli L, Lakso AN, Flore JA. 1994. Early season patterns of
carbohydrate partitioning in exposed and shaded apple branches. J. Amer. Soc.
Hortic. Sci., 119: 596-603.
23. Curry EA. 1991. NAA-induced ethylene and ACC in Delicious spur tissues -
changes with temperature and time. J. Amer. Soc. Hort. Sci., 116(5): 846-850.
24. Dal Cin V, Danesin M, Boscetti A, Ramina A. 2005. Ethylene biosynthesis and
perception in apple fruit abscission. J. of Exper. Botany, 56: 2995-3005.
25. Dal Cin V, Rizzini FM, Botton A, Tonutti P. 2006. The ethylene biosynthetic and
signal transduction pathways are differently affected by 1-MCP in apple and peach
fruit. Postharvest Biol. Technology, 42: 125-133.
26. Dal Cin V, Boscetti A, Dorigoni A, Ramina A. 2007. Benzylaminopurine
application on two different apple cultivars (Malus domestica) displays new and
unexpected fruitlet abscission features. Annals of Botany, 99: 1195-1202.
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 103 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
27. Dal Cin V, Danesin M, Botton A, Boscetti A, Dorigoni A, Ramina A. 2008.
Ethylene and preharvest drop: the effect of AVG and NAA on fruit abscission in
apple (Malus domestica Borkh.). Plant Growth Regul., 56(3): 317-325.
28. Dal Cin V, Velasco R, Ramina A. 2009. Dominance induction of fruitlet shedding
in Malus x domestica (L. Borkh): molecular changes associated with polar auxin
transport. BMC Plant Biol., 9: 139.
29. Davenport TL, Morgan PW, Jordan WR. 1976. Stress-induced foliar abscission: no
enhance ethylene production by leaf petioles. Plant Physiol., 57: 97.
30. Davies PJ. 2004. Plant hormones; Biosynthesis, Signal Transduction, Action!
Dordrecht, Cluwer Academic Publisher: 9.
31. Dennis FG. 2000. The history of fruit thinning. Plant growth regulation, 31: 1-16.
32. Dennis FG. 2002. Mechanisms of action of apple thinning chemicals. HortScience,
37(3): 471-474.
33. Dickson RE. 1991. Assimilate Distribution and Storage. V: Raghavendra AS.
Physiology of Trees. New York, John Wiley & sons: 51-85.
34. Domoki M, Gyorgyey J, Biro J, Pasternak TP, Zvara A, Bottka S, Puskas LG,
Dudits D, Feher A. 2006. Identification and characterization of genes associated
with the induction of embryogenic competence in leaf-protoplast-derived alfalfa
cells. Biochim. Biophys. Acta. 1759: 543-551.
35. Dong JB, Olson D, Silverstone A, Yang SF. 1992. Sequence of a cDNA coding for
a 1-aminocxclopropane-1-carboxylate oxidase homolog from apple fruit. Plant
Physiol., 98: 1530-1531.
36. Džuban T, Tojnko S, Lešnik M, Žežlina I, Kodrič I, Jančar M, Koron D, Solar A,
Berčič S, Hribar J, Korber V, Zadravec P, Vidovič S, Majcen HM, Vranac S,
Zidarič B. 2008. Tehnološka navodila za integrirano pridelavo sadja za leto 2008.
Ljubljana, MKGP, 58.
37. Ebert A, Bender RJ. 1986. Influence of an emulsifiable mineral oil on the thinning
effect of NAA, NAAM, Crabaryl and ethephon in the apple cultivar gala grown
under the conditions of Southern Brazil. Acta Hort., 179: 667-671.
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 104 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
38. Ebert A, Bangerth F. 1981. Relations between the concentration of diffusable and
extractable giberellin-like substances and the alternate-bearing behavior in apple as
affected by chemical fruit thinning. Scientia Hort., 15: 45-52.
39. Eberth A, Bangerth F. 1982. Possible hormonal modes of action of three apple
thinning agents. Scientia Hort., 16: 343-356.
40. Espley RV, Hellens RP, Putterill J, Stevenson DE, Kutty-Amma S, Allan AC.
2007. Red colouration in apple fruit is due to the activity of the MXB transcription
factor, MdMYB10. The Plant J., 49: 414-427.
41. Fallahi E, Willemsen KM. 2002. Blossom thinning of pome and stone fruit.
HortScience, 37(3): 474-477.
42. Faust M. 1989. Physiology of temperate zone fruit trees. John Wiley and sons, New
York, 338.
43. Flore JA, Bukovac MJ. 1982. Factors influencing absorption of 14C(2-chloroethyl)
phosphonic acid by leaves of cherry. J. Amer. Soc. Hort. Sci., 107: 965-968.
44. Foley KP, Leonard MW, Engel JD. 1993. Quantitation of RNA using the
polymerase chain reaction. Technical Focus, 9: 380-5.
45. Fukui H, Inakawa S, Tamura T. 1984. Relation between early drop of apple fruit,
ethylene evolution and formation of abscission layer. J. Jpn. Soc. Hort. Sci., 53:
303-307.
46. Greene DW, Autio WR, Erf JA, Mao ZY. 1992. Mode of action of benzyladenine
whwn used as a chemical thinner on apples. J. Amer. Soc. Hort. Sci., 117(5): 775-
779.
47. Greene DW. 2002. Chemicals, timing, and environmental factors involved in
thinner efficacy on apple. HortScience, 37(3): 477-481.
48. Greene DW. 2003. Endogenous hormones and bioregulators use in apples. V: Ferre
DC in Warrington IJ. Apples. Cabi publishing, Cambridge: 437-458.
49. Greene DW, Lakso AN, Robinson TL. 2004. Development and testing of a model
to rapidly predict apple thinner response. HortScience, 39(4): 793.
50. Harada T, Sunako T, Wakasa Y, Soejima J, Satoh T, Niizeki M. 2000. An allele oft
he 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase gene (Md-ACS1) accounts for the
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 105 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
low level of ethylene production in climacteric fruits of some apple cultivars.
Theor. Appl. Genet., 101: 742-746.
51. Hedden P, Thomas SG. 2006. Plant hormone signaling. Blackwell publishing,
Oxford, UK: 127.
52. Hull J. Plant Growth Regulators. Neobjavljeno interno gradivo.
53. Jones KM, Koen TB, Meridith RJ. 1983. Thinning Golden Delicious apples using
ethephon sprays. J. Hort. Sci., 58: 381-388.
54. Jones KM, Koen TB. 1985. Temperature effects on ethephon thinning of apples. J.
Hort. Sci., 60: 13-19.
55. Jones KM, Longley TB, Oakford MJ. 1988. Thinning `Golden delicious` apples
with naphthalene acetic acid in relation to spray concentration, volume and time of
day. J. Hort. Sci., 63: 27-30.
56. Jones KM, Bound SA, Gillard P, Oakford MJ. 1997. A working model of apple
thinning. Acta Hort., 463: 475-480.
57. Kende H. 1993. Ethylene biosynthesis. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.,
44: 283-307.
58. Kondo S, Takahashi Y. 1987. Effects of high temperature in night time and shading
in the daytime on the early drop of apple fruit 'Starking Delicious'. J. Jpn Soc. Hort.
Sci., 56: 142-150.
59. Kondo S, Mizuno N. 1989. Relation between early drop of apple fruit and
endogenous growth regulators and effects of MCLPB, GA3 plus GA4 and BA
sprays ob fruit abscission. J. Jpn. Soc. Hort. Sci., 58: 9-16.
60. Lakso AN, Wunsche JN, Palmer JW, Grappadelli LC. 1999. Measurement and
modeling of carbon balance of the apple tree. HortScience, 34: 1040-1047.
61. Lay-Yee M, Knighton ML. 1995. A full-lenght cDNA encoding 1-
aminocycloproprane-1-carboxylate synthase from apple. Plant Physiol., 107(3):
1017-1018.
62. Li L, Xu J, Xu ZH, Xue HW. 2005. Brassinosteroids stimulate plant tropisms
through modulation of polar auxin transport in Brassica and Arabidopsis. Plant
Cell, 17: 2738-2753.
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 106 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
63. Li J, Yuan R. 2008. NAA and ethylene regulate expression of genes related to
ethylene biosynthesis, perception, and cell wall degradation during fruit abscission
and ripening in 'Delicious' apples. J. Plant Growth Regul., 27(3): 283-295.
64. Li J, Zhu H, Yuan R. 2010. Profiling the expression of genes related to ethylene
biosynthesis, ethylene perception, and cell wall degradation during fruit abscission
and fruit ripening in apple. J. Amer. Soc. Hort. Sci., 135(5): 391-401.
65. Libault M, Thibivilliers S, Bilgin DD, Radwan O, Benitez M, Clough SJ, Stacey G.
2008. Identification of four soybean reference genes for gene expression
normalization. The Plant Genome, 1: 44-54.
66. Lin Z, Zhong S, Grierson D. 2009. Recent advances in ethylene research. J. Expt.
Bot., 60 (12): 3311-3336.
67. Link H. 2000. Significance of flower and fruit thinning on fruit quality. Plant
Growth Regulat. 31: 17-26.
68. Livak KJ, Schmittgen TD. 2001. Analysis of relative gene expression data using
real-time quantitative PCR and the 2-∆∆Ct method. Methods, 25: 402-408.
69. Magein H. 1989. Growth and abscission dynamics of 'Cox's Orange Pippin' and
'Golden Delicious' apple fruits. J. Hort. Sci., 64(3): 265-273.
70. Marini RP. 1996. Chemically thinning spur Delicious apples with carbaryl, NAA,
and ethephon at various stages of fruit development. Hort technology, 6: 241-246.
71. McArtney SJ. 2002. Ethylene evolution from detached apple spurs in response to
chemical thinners. HortScience, 37(4): 662-665.
72. Morandi B, Zibordi M, Losciale P, Manfrini L, Pierpaoli E, Grappadelli L. 2011.
Shading decreases the growth rate of young apple fruit by reducing their phloem
import. Scientia Hortic., 127: 347-352.
73. Olien WC, Bukovac MJ. 1978. The effect of temperature on rate of ethylene
evolution from ethephon and from ethephon-treated leaves of sour cherry. J. Amer.
Soc. Hort. Sci., 103: 199-202.
74. Pfaffl MW. 2004. Quantification strategies in real-time PCR. V: An A-Z manual of
quantitative PCR. Ca USA. IUL Press, 87-112.
75. Rahemi M, Dennis FG, Andersen RL, Ozga JO, Yia RX. 1997. The role of ethylene
in apple fruit set. J. Hort. Sci., 72: 67-75.
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 107 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
76. Reid MS. 1985. Ethylene and Abscission. HortScience, 20(1): 46-50.
77. Roberts JA, Elliot KA, Gonzalez-Carranza ZH. 2002. Abscission, dehiscence and
other cell separation processes. Annu. Rev. Plant Biol., 53: 131-158.
78. Rosenfiled CL, KissE, Hrazdina G. 1996. MdACS-2 (accession no. U73815) and
MdACS-3 (accession no. U73816): two new 1-aminocyclopropane-1-carboxylate
synthases in ripening apple fruit. Plant Physiol., 112(4): 1735.
79. Ross GS, Knighton ML, Lay-Yee M. 1992. An ethylene-related cDNA from
ripening apples. Plant Mol. Biol., 19: 231-238.
80. Ruperti B, Bonghi C, Tonutti P, Ramina A. 1998. Ethylene biosynthesis in peach
fruitlet abscission. Plant Cell and Environment, 21: 731-737.
81. Ruperti B, Cattiveli L, Pagni S, Ramina A. 2002. Ethylene responsive genes are
differentially regulated during abscission, organ senescence and wounding in
peach. J. of Expt. Botany, 53: 429-437.
82. Rutledge RG, Côté C. 2003. Mathematics of quantitative kinetic PCR and the
application of standard curves. Nucleic Acids Res., 31(16): e93.
83. Sato T, Kodo T, Akada T. 2004. Allelotype of a ripening-specific 1-
aminocyclopropane-1-carboxylate synthase gene defines the rate of fruit drop in
apple. J. Amer. Soc. Hort. Sci., 129(1): 32-36.
84. Schneider GW, Lasheen AM. 1973. NAA and Sevin on composition, development
and abscission of apple fruit. HortScience, 8: 103-104.
85. Sexton R, Roberts JA. 1982. Cell biology of abscission. Annu. Rev. Plant Physiol.,
33: 133-162.
86. Stern RA, Flaishman MA. 2003. Benzyladenine effects on fruit size, fruit thinning
and return yield of 'Spadona' and 'Coscia' pear. Scientia Horticulturae, 98(4): 499-
504.
87. Stopar M, Black BL, Bukovac MJ. 1997. The effect of NAA and BA on carbon
dioxide assimilation by shoot leaves of spur-type 'Delicious' and 'Empire' apple
trees. J. Amer. Soc. Hort. Sci., 122: 837-840.
88. Stopar M. 1998. Odvisnost odpadanja plodičev od asimilacijske sposobnosti
krošnje in plodičev jablane. Dokt. Disert., Ljubljana.
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 108 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
89. Stopar M, Lokar V. 2003. The effect of ethephon, NAA, BA and their
combinations on thinning intensity of 'Summerred' apples. J. Central European
Agr., 4.
90. Stopar M, Ambrožič TB, Brence A. 2008. Problematika količine in kakovosti
pridelave jabolk v Sloveniji. V: Hudina M. Zbornik referatov 2. Slovenskega
kongresa z mednarodno udeležbo. Ljubljana, Strokovno sadjarsko društvo
Slovenije: 151-157.
91. Sunako T, Ishikava R, Senda M, Akada S, Niizeki M, Harada T. 2000. Plant Gene
Register PGR 00-030. MdACS-5A (accession no. AB034992) and 5B (accession
no. AB034993), two wound-responsive genes encoding 1-aminocyclopropane-1-
carboxylate synthase in apple. Plant Physiol., 122(3): 620.
92. Tacken E, Ireland H, Gunaseelan K, Karunairetnam S, Wang D, Shultz K, Bowen
J, Atkinson RG, Johnston JW, Putterill J, Hellens RP, Schaffer RJ. 2010. The role
of ethylene and cold temperature in the regulation of the apple
POLYGALACTURONASE1 gene and fruit softening1[W][OA]. Plant Physiol., 153:
294-305.
93. Taylor JE, Whitelaw CA. 2001. Signals in abscission. New Phytologist, 151: 323-
339.
94. Tonutti P, Bonghi C, Ruperti B, Tornielli GB, Ramina A. 1997. Ethylene evolution
and 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase gene expression during early
development and ripening of peach fruit. J. Amer. Soc. Hort. Sci., 122: 642-647.
95. Unrath CR. 2002. Spray volume, canopy density, and other factors involved in
thinner efficacy. HortScience, 37(3): 481-483.
96. Vandenbussche F, Vriezen WH, Van Der Straeten D. 2006. Ethylene biosynthesis
and signaling: a puzzle yet to be completed. V: Hedden P in Thomas SG. Plant
hormone signaling. Oxford, UK, Blackwell Publishing: 125-146.
97. Velasco R, et al. 2010. The genome of the domesticated apple (Malus domestica
Borkh.). Nature Genetics, 42: 833-839.
98. Walsh CS, Swartz HJ, Edgerton LJ. 1979. Ethylene evolution in apple following
post-bloom thinning sprays. HortScience, 14: 704-706.
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 109 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
99. Wang KLC, Li H, Ecker JR. 2002. Ethylene biosynthesis and signaling networks.
Plant Cell, 14: 131-151.
100. Ward D, Marini RP. 1999. Growth and development of young apple fruits
following applications of ethephon plus carbaryl for thinning. HortScience, 34(6):
1057-1059.
101. Warrington IJ, Fulton TA, Halligan EA, de Silva HN. 1999. Apple fruit growth and
maturity are affected by early season temperatures. J. Amer. Soc. Hort. Sci.,
124(5): 468-477.
102. Wertheim SJ. 2000. Developments in the chemical thinning of apple and pear.
Plant growth regulation, 31: 85-100.
103. Westwood MN, Batjer LP, Billingsley HS. 1967. Cell size, number, and fruit
density of apples as related to fruit size position in cluster, and thinning method.
Proc. Amer. Soc. Hort. Sci., 91: 51-62.
104. Westwood MN. 1992. Temperate-Zone pomology. Timber press, Portland, 523.
105. Wismer PT, Proctor JTA, Elfving DC. 1995. Benzyladenine affects cell division
and cell size during apple fruit thinning. Amer. Soc. Hort. Sci., 120(6): 1096.
106. Williams MW, Edgerton LJ. 1981. Fruit thinning of apples and pears with
chemicals. U.S. Dept. Agr. Bul., Washington D.C., 289.
107. Williams ME, Torabinejad J, Cohick E, Parker K, Drake EJ, Thompson JE, Hortter
M, Dewald DB. 2005. Mutations in the Arabidopsis phospoinositide phosphatase
gene SAC9 lead to overaccumulation of PtdIns (4,5)P2 and constitutive expression
of the stress-response pathway. Plant Physiol., 138: 686-700.
108. Wiersma PA, Zhang H, Lu C, Quail A, Toivonen PMA. 2007. Survey of the
expression of genes for ethylene synthesis and perception during maturaton and
ripening of 'Sunrise' and 'Golden Delicious' apple fruit. Postharvest Biol.
Technology, 44: 204-211.
109. Zhou C, Lakso AN, Robinson TL, Gan S. 2008. Isolation and characterization of
genes associated with shade-induced apple abscission. Mol. Genet. Genomics, 280:
83-92.
110. Zhu H, Beers EP, Yuan R. 2008. Aminoethoxyvinylglycine inhibits fruit abscission
induced by naphthalene acetic acid and associated relationships with expression of
Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 110 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011
genes for ethylene biosynthesis, perception, and cell wall degradation in 'Delicious'
apples. J. Amer. Soc. Hort. Sci., 133(6): 727-734.
111. Zhu H, Yuan R, Greene DW, Beers EP. 2010. Effects of 1.methycyclopropene and
naphthalene acetic acid on fruit set and expression of genes related to ethylene
biosynthesis and perception and cell wall degradation in apple. J. Amer. Soc. Hort.
Sci., 135(5): 402-409.
112. Zibordi M, Domingos S, Grappadelli L. 2009. Thinning apples via shading: an
appraisal under field conditions. J. Hort. Sci. Biotechnol. ISAFRUIT special issue:
138-144.
113. Yang SF, Hoffman NE. 1984. Ethylene biosynthesis and its regulation in higher
plants. Annu. Rev. Plant Physiol., 35: 155-198.
114. Yuan R. 2007. Effects of temperature on fruit thinning with ethephon in 'Golden
Delicious' apples. Scientia Hort., 113: 8-12.
115. Yuan R in Burns JK. 2004. Temperature factors affecting the abscission response
of mature fruit and leaves to CMN-pyrazole and ethephon in 'Hamlin' oranges. J.
Amer. Soc. Hort. Sci., 129: 287-293.
116. Yuan R, Greene DW. 2000. Benzyladenine as a chemical thinner for 'McIntosh'
apples. J. Amer. Soc. Hort. Sci., 125: 169-176.
Elektronski viri:
117. http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (26.8.2011)
118. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome
(26.8.2011)
ZAHVALA
Najprej bi se želel zahvaliti Kmetijskemu inštitutu Slovenije, ki mi je omogočil, ter Javni agenciji za raziskovalno dejavnost Republike Slovenije, ki je financirala, izvedbo mojega podiplomskega študija. Največja zahvala gre mojemu raziskovalnemu mentorju Dr. Mateju Stoparju, ki me je vpeljal v znanstveno raziskovalno delo, ter mi pomagal z nasveti glede zasnove poskusov, pisanja člankov, obdelave podatkov in še marsikaj. Poleg tega pa mi je bil vedno v pomoč tudi pri izvedbi poskusov in vzorčenju, kar še posebej cenim. Hvala tudi mentorju doc. Dr. Stanislavu Tojnku, ki mi je bil v veliko pomoč pri študijskem delu in pripravi doktorske disertacije. Sodelovanje je bilo vedno zgledno in konstruktivno, kar mi je prihranilo marsikatero skrb. Genetski del poskusa vsekakor ne bi bil na takšnem nivoju, če mi ne bi na pomoč priskočila Dr. Irena Mavrič Pleško, ki je pozorno spremljala moje delo v genetskem laboratoriju in bila vedno pripravljena odgovarjati na moja vprašanja. Hvala tudi Tomažu Sketu za nasvete in pomoč pri delu s plinsko kromatografijo. Zahvaliti se želim tudi vsem sodelavcem Oddelka za sadjarstvo in vinogradništvo, vključno z zaposlenimi v poskusnem nasadu Brdo pri Lukovici, za pomoč pri postavitvi poskusov ter za prijetno vzdušje na oddelku. Vsem, ki ste presodili, da bi se morali prebrati v zgornjih vrsticah se še posebej zahvaljujem in hkrati opravičujem. Velika zahvala gre tudi staršema za podporo, razumevanje in vzpodbudo skozi celotno obdobje mojega izobraževanja. Ker najlepše pride na vrsto vedno na koncu je zadnja zahvala namenjena ženi Maji ter hčerki Teji in sinu Vidu za razumevanje, veselje, srečo, ljubezen …
PRILOGE
Delovni življenjepis kandidata
Rojen sem bil 29. marca 1982 v družini, ki se je od takrat pa vse do danes preživljala
izključno s kmetijsko dejavnostjo. Po končani osnovni šoli, ki sem jo obiskoval v Središču
ob Dravi, sem postal dijak Srednje kmetijske šole Rakičan. Srednješolsko izobraževanje
sem zaključil leta 2001 z uspešno opravljeno maturo. Še istega leta sem pričel s študijem
na Fakulteti za kmetijstvo v Mariboru, univerzitetna smer Kmetijstvo. Poleg redne
udeležbe organiziranih oblik študija in opravljanja izpitov, sem bil v času študija aktiven
kot kontrolor ekološkega kmetovanja in nekaterih drugih standardov. V sklopu Inštituta za
kontrolo in certifikacijo sem se udeležil mnogih izobraževanj, simpozijev ter sejmov s
tematiko ekološkega kmetovanja. Dodiplomski študij sem z zagovorom diplomske naloge,
pod mentorstvom dr. Martine Bavec, uspešno zaključil leta 2007. Nato me je pot še istega
leta vodila na Kmetijski inštitut Slovenije, kjer sem se kot mladi raziskovalec, pod
mentorstvom dr. Mateja Stoparja, zaposlil na Oddelku za sadjarstvo in vinogradništvo.
Sočasno z zaposlitvijo sem se vpisal na bolonjski podiplomski doktorski študij kmetijstva
na Fakulteti za kmetijstvo in biosistemske vede v Mariboru, kjer sem kot pedagoškega
mentorja izbral dr. Stanislava Tojnka. Tematika s katero sem se ukvarjal v času
podiplomskega študija je bila fiziologija odpadanja plodičev pri jablani na katero se nanaša
tudi doktorska disertacija.
Osebna bibliografija
JURE KOLARIČ [29499]
Osebna bibliografija za obdobje 2000-2011
ČLANKI IN DRUGI SESTAVNI DELI
1.01 Izvirni znanstveni članek
1. KOLARIČ, Jure, MAVRIČ PLEŠKO, Irena, TOJNKO, Stanislav, STOPAR, Matej.
Apple fruitlet ethylene evolution and MdACO1, MdACS5A, and MdACS5B expression
after application of naphthaleneacetic acid, 6-benzyladenine, Ethephon, or shading.
HortScience. [Tiskana izd.], 2011, vol. 46, no. 10, str. 1-6. [COBISS.SI-ID 3653736]
1.02 Pregledni znanstveni članek
2. KOLARIČ, Jure. Abscission of young apple fruits (Malus domestica Borkh.): a review.
Agricultura. [Print ed.], mar. 2010, letn. 7, št. 1, str. 31-36, ilustr. [COBISS.SI-ID
3283560]
1.04 Strokovni članek
3. KOLARIČ, Jure. Biofach - sejem ekološke pridelave. Marib. agron., maj 2005, letn. 10,
št. 2, str. 15-17. [COBISS.SI-ID 3318376]
4. KOLARIČ, Jure. Kako do pravilnega kolobarja? : povzeto po predavanju prof. dr. Jürgen K. Friedel. Marib. agron., jan. 2006, letn. 11, št. 1, str. 6-7. [COBISS.SI-ID 3318120]
1.09 Objavljeni strokovni prispevek na konferenci
5. KOLARIČ, Jure. Abscizija kot fiziološki proces ter vpliv rastnih regulatorjev. V:
UNUK, Tatjana (ur.). Sadjarski posvet 2009 : monografija : Grad Hompoš, 10. marec
2009. Maribor: Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2009, str. 22-26.
[COBISS.SI-ID 2924904]
MONOGRAFIJE IN DRUGA ZAKLJUČENA DELA
2.11 Diplomsko delo
6. KOLARIČ, Jure. Vpliv kontaminiranih tal na vsebnost težkih kovin v nekaterih
zelenjadnicah in poljščinah : diplomsko delo, (Diplomska dela študentov Fakultete za
kmetijstvo Univerze v Mariboru, Univerzitetne diplomske naloge). Maribor: [J. Kolarič],
2007. VIII, 75 f., ilustr. [COBISS.SI-ID 2537004]
IZVEDENA DELA (DOGODKI)
3.15 Prispevek na konferenci brez natisa
7. KOLARIČ, Jure. Posredne koristi ekološkega sadjarstva : predavanje na Strokovnem
posvetu za pridelovalce ekološkega sadja, Ljubljana, 4. dec. 2009. 2009. [COBISS.SI-ID
3178600]
8. KOLARIČ, Jure. Fiziološke osnove odpadanja plodičev jablane : predavanje na posvetu Uravnavanje rodnosti v sadjarstvu, Kmetijski inštitut Slovenije, Ljubljana, 18. mar. 2010. 2010. [COBISS.SI-ID 3263080]
9. KOLARIČ, Jure. Fiziološke osnove odpadanja plodičev jablane : predavanje na strokovnem srečanju ekoloških pridelovalcev jabolk, Šentjanž na Dolenjskem, 9. apr. 2010. 2010. [COBISS.SI-ID 3281768]
10. KOLARIČ, Jure. Pomen sadjarstva za razvoj podeželja : predavanje v organizaciji Sadjarskega društva Idrija-Cerkno, Ljubljana, 16. apr. 2010. 2010. [COBISS.SI-ID 3284072]