1. 胃の構造1. 復習 胃体部 胃の構造と役割 胃底部 ペプシン 胃酸 粘液 幽門部 噴門 タンパク質を分解 病原菌の殺菌やペプシノーゲンの活性化
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胃癌診断のための高感受性血清腫瘍マーカー
広島大学 大学院医歯薬学総合研究科 分子病理
講師 大上 直秀教授 安井 弥
8/20 大阪広島大学「新技術説明会」
Department of Molecular PathologyHiroshima University Graduate School of Biomedical Sciences
研究背景
胃癌は近年減少してきているとはいえ、尚、最も頻度の高い癌の一つであり、この克服は現代社会の最大の課題である。
分子病理学研究室では、胃癌の発生・進展のメカニズムを解析し、胃癌の病態解明を行っている。さらに、そこから得られた知見をもとに、胃癌の診断・治療に有用な標的分子を同定し、実際の診断・治療への有用性について検討している。
Department of Molecular PathologyHiroshima University Graduate School of Biomedical Sciences
従来技術とその問題点
現在、癌の確定診断には主として病理形態学的診断が用いられいる。しかし、多数の検体に対して病理形態学的診断を行うことは困難であり、血液検査等の簡便な方法で癌の存在を調べる検査が必要とされている。既に実用化されている胃癌の血清腫瘍マーカーとして、CEA、CA19-9があげられるが、陽性率は10-20%程度で、早期の癌を検出するのに不適切である。さらに偽陽性も多いことが問題点として指摘されている。
従って、感受性の高い血清腫瘍マーカーの開発が必要とされている。
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Serial Analysis ofGene Expression
Velculescu et al. Science 270:484, 1995
cDNAマイクロアレイとともに代表的な網羅的遺伝子発現解析法(1995年 Kinzlerらが考案)
CATG 下 流 の 10-12bp の tag をsequenceすることによりその出現頻度と種類を解析し、NCBIのdatabaseにより対応する遺伝子を知ることができる
定量性・再現性に優れる未知の遺伝子の解析が可能
現在までに約300種類の組織あるいは細胞のSAGE libraryが登録されており、それらのデータとdirectに比較することができる
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Sample Histology clone tag
W226T tub1 (Early cancer) 2,592 43,908W246T tub1 (Advanced cancer) 2,867 32,174P208T por1 (Primary tumor) 2,701 11,582P208L por1 (LN metastasis) 1,034 15,382S219T por2 (Scirrhous type) 2,441 34,660
Total 5 samples 11,635 137,70638,903 unique tags
NCBI Gene Expression Omnibus: GEO accession: GSE545 (SAGE Hiroshima gastric cancer tissue)
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Invasion
Lymph node metastasis
Frequently overexpressed genes (tumor/normal ratio>2)
Stage
COL1A1 (78.3%), CDH17 (73.9%), APOC1 (67.4%), COL1A2 (58.7%), YF13H12 (52.2%), CEACAM6 (50.0%), APOE (50.0%), REGIV (47.8%), S100A11 (41.3%), FUS (41.3%)
CDH17 (P=0.0060), APOE (P =0.0139)
FUS (P =0.0416), APOE (P =0.0006)
FUS (P =0.0414), COL1A1 (P =0.0156), COL1A2 (P =0.0395), APOE (P =0.0125)
Real time RT-PCR analysis in 46 GC samples
YF13H12 >10
1
32
456789
0
T/N
ratio
1 1 12 1 3 1 4 151 610
1 7 1 81 9 20 212 2
23 24 2 5 262 7
2 82 9
3 0 3 1 32 3 3 3 4 3 5 3 6 3 7 3 8 3 9 4 0 4 1 4 2 4 3 4 4 4 5 4 61 32
45
67 8
9
YF13H12 protein expressed in thyroid CDH17
>10
1
32
456789
0 7 8 9 3 1 4 71 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 61 0 1 1 1 2 0 2 1 2 2 2 2 4 2 5 2 6 2 7 2 8 2 9 3 0 3 3 2 3 3 3 3 5 3 6 3 3 8 3 9 4 0 4 1 4 2 4 3 4 4 4 5 461 32 4 5 6 7 8 9
T/N
ratio
W226T
P208T
胃癌関連遺伝子の同定W246T
P208L
S219T
Oue N, Yasui W, et al. Cancer Res, 2004.
Department of Molecular PathologyHiroshima University Graduate School of Biomedical Sciences
Liver Kidney Heart ColonBrain Bone marrow Skeletal muscleLung Small intestine SpleenSpinal cord Stomach Pancreas Leukocyte
DEF5
OLFM4 MIA DKK4REG4 MMP10
TRAG3
HORMAD1
ATE1 BRD4 ETS2
MLL4 CCT3 GPP34R LMO6
Gastric cancer
Normal tissue Candidate gastric cancer specific genes
胃癌特異的遺伝子の探索
胃癌のSAGEライブラリーと生命維持に重要な14の臓器(心臓、肝臓等)のSAGEライブラリーを比較し、胃癌のSAGEライブラリーのみで発現している遺伝子を抽出した。抽出された54遺伝子すべてについて、realtime RT-PCR法で遺伝子発現を測定した。正常臓器で最も発現が高かった遺伝子発現量と、胃癌で最も発現が高かった遺伝子発現量を比較し、胃癌で10倍以上高かった遺伝子を癌特異的遺伝子と定義した。
Aung PP, Oue N, Yasui W, et al. Oncogene, 2006.
全身臓器におけるReg IVの遺伝子発現解析
Real time RT-PCR analysis
全身正常組織
Stom
ach
Smal
l int
estin
e
Panc
reas
Col
on
胃癌 大腸癌 肺癌 乳癌
0
10
20
30
40
50
60
REG
IV m
RN
A e
xpre
ssio
n le
vel
TMK-1-Reg TMK-1-empty
Cel
l
Med
ium Western
blot
Cel
l
Med
ium
- β-actin
- V5-Reg IV
全身正常組織ではReg IVの発現はほとんどなかったが、胃癌、大腸癌において高いレベルのReg IVが検出された。
Reg IV培養液中に分泌される
Department of Molecular PathologyHiroshima University Graduate School of Biomedical Sciences Oue N, Yasui W, et al. J Pathol, 2005.
・ Reg IVは2001年に炎症性腸疾患にて発現が亢進している遺伝子としてクローニングされた。
・ EGFRを活性化し、アポトーシスを抑制することが知られている。
Reg IV (Regenerating islet-derived family, member 4)Reg IV (Regenerating islet-derived family, member 4)
胃癌組織におけるReg IVの免疫染色
30%の胃癌でReg IVの発現が認められた。
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胃癌患者の血清におけるReg IVの検出
n = 101
n = 36
n = 6
n = 10
n = 9
2
4
6
Seru
m R
eg IV
leve
lng/ml
0
Department of Molecular PathologyHiroshima University Graduate School of Biomedical Sciences
健常人 Stage I Stage II Stage III Stage IV
胃癌
特異性は99%、感受性は36%であった。
胃炎患者
n = 201
3
5
7
Mitani Y, Oue N, Yasui W, et al. Oncogene, 2007
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別名、GW112、hGC-1
・ 骨髄芽球からクローニングされた遺伝子である。分泌蛋白をコードする。510-amino acids
・ 正常では、骨髄、小腸、大腸、前立腺に発現する。
・ 潰瘍性大腸炎、大腸癌、肺癌、乳癌などにおける発現が確認されている。
・ GRIM-19、cadherin、lectinと結合し、アポトーシスや細胞接着を制御する。
Live
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GC
1G
C2
GC
3G
C4
GC
5G
C6
GC
7G
C8
GC
9C
RC
1C
RC
2C
RC
3C
RC
4C
RC
5C
RC
6C
RC
7C
RC
8C
RC
9
胃癌正常組織 大腸癌
0
2
4
6
8
>10
Fold
diff
eren
ce (T
umor
/Nor
mal
)Stage I Stage II Stage III Stage IV
-- P = 0.0070 --6/19 (32%) 23/31 (74%)T/N>2
Gastric cancer T/N>2: 29 / 50 (58%)T/N>2: 29 / 50 (58%)全身臓器におけるReg IVの遺伝子発現解析
Real time RT-PCR analysis
OLFM4 (Olfactomedin 4)OLFM4 (Olfactomedin 4)
全身正常組織ではOLFM4の発現はほとんどなかったが、胃癌において高いレベルのOLFM4が検出された。
OLFM4の局在・発現とその機能
小腸
胃癌
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59%の胃癌でOLFM4の発現を認めた。
胃癌
正常小腸においても一部に発現を認めた。
胃癌患者の血清におけるOLFM4の検出
健常人 Stage I Stage II Stage III Stage IV
胃癌
n = 101
n = 36
n = 6
n = 10
n = 9
50
100
Seru
m O
LFM
4 le
vel
ng/ml
0
Department of Molecular PathologyHiroshima University Graduate School of Biomedical Sciences
150
200
250
胃炎患者
n = 76
n = 60
n = 8
n = 15
n = 40
n = 20
特異性は95%、感受性は31%であった。
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OLFM4Reg IVCA19-9CEA
OLFM4+Reg IV
胃癌患者 123例、健常人 76例
OLFM4 OLFM4 OLFM4
Reg IV CA19-9 CEA
Specificity95%97%100%100%
95%
Sensitivity31%37%15%14%
57%
特願2008-005023「消化器癌検出用血清腫瘍マーカー、消化器癌検出キット、および消化器癌検出方法」
Reg IVとOLFM4の血清診断マーカーとしての有用性
Reg IVとOLFM4の組合わせは、胃癌の高感度の血清診断マーカーである。
Reg IV、OLFM4ともに、stage Iの胃癌症例でも30%以上が陽性である。
新技術の特徴・従来技術との比較
胃癌の血清マーカーであるCEA、CA19-9の陽性率はそれぞれ10%程度であったのに対し、Reg IVの陽性率は36%、OLFM4の陽性率は31%であり、従来のマーカーよりも検出感度が高かった。
さらに、Reg IVとOLFM4陽性例は一致しない傾向にあった。両者を組み合せると陽性率は57%であり、半数以上の胃癌を検出できた。
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想定される用途・業界
胃癌の新規血清マーカーであるReg IV、OLFM4、あるいは両者の組み合わせは陽性率が高いことから、胃癌のスクリーニングに使用すれば、簡便にこれらの癌を検出できる。血清を材料に用いるので、被検者への負担も少ない。
上記以外に、抗がん剤の効果判定にも使用できる可能性がある。
検査センター、病院において、これらの検出試薬が使用されるものと考えられる。尚、血清腫瘍マーカーの測定はELISA法であり、導入は容易である。
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実用化に向けた課題
Reg IV、OLFM4ともELISAの系は完成しており、胃癌患者の血清解析も終了している。
実用化に向けて標準化された方法を確立すると共に、多数の胃癌患者、健常人の血清を解析する必要がある。
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企業への期待
Reg IVとOLFM4の標準化されたELISAの系を開発する。
標準化されたELISAの系があれば、多数例の胃癌患者、健常人の血清を材料にReg IVとOLFM4の濃度を測定することができる。
抗体作成技術を持つ企業との共同研究を希望。
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本技術に関する知的財産権
発明の名称 :消化器癌検出用血清腫瘍マーカー、消化器癌検出キット、および消化器癌検出方法
出願番号 :特願2008-005023
出願人 :国立大学法人広島大学
発明者 :安井 弥、大上直秀
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Reg IV、OLFM4単独での知的財産権の申請はしていない。
お問い合わせ先
広島大学 大学院医歯薬学総合研究科分子病理学教室
講師 大上直秀(おおうえ なおひで)
TEL: 082-257-5147FAX: 082-257-5149e-mail: [email protected]
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