酒粕に含まれるヒトに優しいチロシナーゼ阻害物質

広島大学大学院医歯薬学総合研究科

教授 杉山 政則准教授 的場 康幸

本成果は文部科学省・知的クラスター創成事業(広島バイオクラスター)の杉山プロジェクト研究を通じて得られたものである

HONH3+COO-

ONH3+COO-O

HO N

HO

HHO N COO-

HO

HO

O

NH

HONH3+COO-HO

L-チロシン L-ドーパ L-ドーパキノンチロシナーゼ チロシナーゼ

ロイコドーパクロム

O

O

N COO-H

ドーパクロム5,6-ジヒドロキシインドール

インドール-5,6-キノン

メラニン色素重合

チロシナーゼ阻害剤は美白用化粧品の素材となる

チロシナーゼ阻害剤として長く使用されてきたコウジ酸は, 発ガン性の疑いがあるため, 製造と使用が中止となった

O

O

HO

CH2OH

酒粕由来チロシナーゼ阻害物質の13C-NMR

-(CH2)n-, -CH3 (acyl groups)14.0-34.2

-CH2OCOR (1 and 3 carbons of the glyceryl groups)62.1

>CHOCOR (2 carbon of the glycerylgroups)

68.8

-CH=CH- (olefinic groups)127.8-130.2

-CH2OCOR (carbonyl groups)172.8-173.2

Functional groupChemical shift (ppm)

-CH=CH- (olefinic groups) 5.28-5.44

>CHOCOR (on 2 carbon of the glyceryl groups)5.23-5.28

-CH2OCOR (on 1 and 3 carbons of the glycerylgroups)

4.10-4.35

=HC-CH2-CH= (in position α in relation to two double bonds)2.73-2.84

-OCO-CH2- (in position α in relation to the carbonyl groups)2.26-2.36

-CH2-CH=CH- (in position α in relation to a single double bond)1.97-2.13

-OCO-CH2-CH2- (in position β in relation to the carbonyl groups)1.55-1.67

-(CH2)n- (in position β or further from double bonds, in position γ or further from carbonyl groups)

1.22-1.42

-CH3 (linolenic acyl groups)0.95-1.00-CH3 (saturated, oleic and linoleic acyl groups)0.86-0.91

Functional groupChemical shift (ppm)

酒粕由来チロシナーゼ阻害物質の1H-NMR

18 : 218 : 218 : 244.0089643.8387817

18 : 318 : 21843.7389843.5388016

18 : 218 : 118 : 143.3690043.2088215

18 : 318 : 116 : 142.5687042.3785214

18 : 218 : 21642.5987242.2385413

18 : 218 : 11642.1387441.7485612

18 : 118 : 11641.5787641.2185811

18 : 218 : 11440.3784640.2382810

18 : 2161640.2184840.108309

18 : 218 : 21238.7981638.787988

18 : 2161438.3682038.368027

18 : 218 : 21037.4078837.407706

18 : 2161236.9679236.967745

18 : 2161035.5576435.547464

18 : 2141033.8073633.807183

16161033.3474033.347222

16141031.5971231.596941

Retention time (min)

[M+NH4]+Retention time (min)

[M]+ Acyl chains CIEI

No.

酒粕由来チロシナーゼ阻害物質のGC-MS

醸造副産物(酒粕)に含まれるメラニン生成酵素(チロシナーゼ)阻害剤

コウジ酸には発癌性のあることわかり2003年に製造・販売が禁止された

チロシナーゼの一次構造

高等動物

糸状菌

放線菌

(ヒトなど)

(マッシュルームなど)

CuA CuB

チロシナーゼ阻害剤のスクリーニングには, これまでマッシュルーム由来のものが使用されてきた

on Mushroom tyrosinase on Streptomyces tyrosinase

IC50

トリオレイン > 50 μMトリリノレイン 22.1 μMコウジ酸 14.1 μM

IC50

トリオレイン 30 μMトリリノレイン 2.9 μMコウジ酸 7.8 μM

チロシナーゼに対する阻害活性

トリリノレインのマッシュルームチロシナーゼに対する阻害様式

Lineweaver-burk plots Dixon plots

Lineweaver-burk plots Dixon plots

トリリノレインの放線菌チロシナーゼに対する阻害様式

チロシナーゼ遺伝子を導入した大腸菌のメラニン生成能はトリリノレインにより阻害される

(B) 16 μM トリリノレイン

(C) 32 μM トリリノレイン

(A) 無添加

酒粕にはトリアシルグリセロールが豊富に含まれている

トリリノレインはチロシナーゼの起源に関係なく非競合阻害剤として働く

その阻害能力は不飽和度と関係がある

トリリノレインは, コウジ酸に比べ放線菌チロシナーゼを強く阻害する

CadCad

CadCad

Cu2+ Cu2+

Cad

Ty

Cu2+ Cu2+

Ty

Ty

Cad

チロシナーゼ/キャディー複合体

活性型チロシナーゼ キャディー凝集体

放線菌チロシナーゼは活性化のため銅輸送タンパク質(Caddie)を必要とする

+

チロシナーゼはⅢ型銅タンパク質ファミリーに属している

III型銅タンパク質= 二核銅の活性中心をもつ

チロシナーゼ; モノフェノール => ジフェノールジフェノール => キノン

カテコールオキシダーゼ; ジフェノール => キノンヘモシアニン; 酸素運搬

格子定数a=65.0, b=97.1, c=54.5(Å)α=β=γ= 90°

空間群: P21212

沈殿剤20% PEG33500.2 M NaNO30.1 M Na-MES (pH6.5)

チロシナーゼ/キャディ複合体の結晶

チロシナーゼ/キャディー複合体の構造

赤; チロシナーゼ, 青; キャディー

チロシナーゼ => おもにαキャディー => α/β

キャディーはチロシナーゼの基質結合部位を覆うように位置している

Cu(II)結合型複合体の構造

隣接して２つの銅(II)イオンが存在

Cu(II)が結合しても立体構造は変化なし

複合体タンパク質に, 3つのCu(II)イオンが含まれている

赤; チロシナーゼ, 青; キャディー

キャディーはCu(II)輸送体として働く

Cu(II)非結合型 Cu(II)結合型

Cu(II)輸送の阻害剤は新たなチロシナーゼの阻害剤となりえる。

活性部位の比較

チロシナーゼ/キャディー

カテコールオキシダーゼ/阻害剤 (PTU)

ヘモシアニン

キャディーのTyr98は, カテコールオキシダーゼ分子の阻害剤の収容位置に存在する

=>Tyr98の配置は基質の配置と同じところ=>反応機構の推定に役立つ

基質結合領域の大きさ

チロシナーゼ ＞ カテコールオキシダーゼ ＞ ヘモシアニン

=>ヘモシアニンでは基質が結合できない=>カテコールオキシダーゼでは基質がCuAの真上に結合できない

発明の名称： チロシナーゼ阻害剤

出 願 番 号： 特願2006-197355

出 願 人 ： 国立大学法人広島大学

発 明 者 ： 杉山 政則

本技術に関する知的財産権

実用化が想定される分野

コスメトロジー分野： 美白化粧品素材

食品分野： 果物・野菜の着色(褐色・黒)防止

医薬品分野： シミ・そばかすの予防改善剤

新規チロシナーゼ阻害物質としての観点から

お問い合わせ先

広島大学 医療社会連携センターコーディネーター 山田一徳

〒735-8551 広島市南区霞1丁目2番3号Tel : 082-257-5427Fax : 082-257-5757e-mail: kazuyama@hiroshima-u.ac.jp

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