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DR-CALUX法による DR-CALUX法による ダイオキシン類簡易測定 ダイオキシン類簡易測定 6回e-シンポジウム(2004108)

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DR-CALUX法によるDR-CALUX法によるダイオキシン類簡易測定ダイオキシン類簡易測定

第6回 e-シンポジウム(2004年10月8日)

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ダイオキシン類の公定法分析O

O

Clx Cly

Clx Cly

ポリ塩化ジベンゾ-p-ジオキシン

PCDDs

ClyClx

O

ポリ塩化ジベンゾフラン

PCDFs

ポリ塩化ビフェニル

PCBs

測定対象

7種

10種

12種

異性体 75種

異性体 135種

異性体 209種

WHOで指定されている毒性の強い2,3,7,8体PCDD/DFsとコプラナーPCBの計29物質がダイオキシン類としての測定対象

公定法は、個々の物質の濃度をHRGC/HRMS測定し、毒性等価係数(TEF)を乗じて加算した毒性当量(TEQ)として評価

Co-PCBs

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ラット肝臓ガン細胞にルシフェラーゼ

遺伝子を組み込んだH4IIE-luc細胞

生物細胞でダイオキシン類の分析

直接毒性当量(TEQ)を測定する方法である

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簡易分析が必要とされる事例

・ 廃棄物処理施設の日常管理

・ 土地、河川・港湾等における汚染度評価

・ 汚染箇所の範囲や汚染源の特定

・ ダイオキシン対策のための技術検討

・ 緊急時の環境汚染状況の把握

↓(需要)

低コストで多数の試料を短期間で分析

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ダイオキシン類の簡易分析法

簡易機器分析

・ 四重極GC/MS・ 特定異性体分析・ GC/MS/MS  etc.

生物検定法

・ イムノアッセイ、ELISA法  

・ レポータージーンアッセイ

   DR-CALUX etc.

ダイオキシン類の公定分析法

複雑な前処理精製工程高価な高分解能ガスクロマトグラフ質量分析計(HRGC/HRMS) 等

前処理の簡素化

公定法を補完する安価で短納期の分析法

高い分析費用

長い分析期間

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DR-CALUX法

・DR-CALUX法(Dioxin Responsive Chemically Activated

Luciferase eXpression)はBioDetection Systems社(オランダ)で開発されたバイオアッセイであり、ダイオキシン様物質の簡易分析法である。

・本法はダイオキシン類が細胞内に取り込まれた時に、Ahレセプターを介して薬物代謝酵素を誘導し、その度合いが生体での毒性の強さと高い相関を示すという原理に基づいている。

・遺伝子組替え技術を応用してダイオキシンに対する感受性及び簡便性を高めている。

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測定の原理

DR-CALUX

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0.1 1 10 100 1000

[TCDD] pM in well

0

20

40

60

80

100

(Tho

usan

ds)

Rea

ltive

Ligh

ts U

nits

, Sam

ple

-Rea

ltive

Ligh

ts U

nits

, DM

SO TCDD : H4IIE; DC108 plate3; 24h [CIL1983;EC50=8.5]

2,3,7,8-TCDD標準物質における検量線

全てのプレートに検量線用TCDD(7水準×3well/水準=21well)を設置

試料液は、5~6段階に希釈して幅広い濃度で最適濃度になるように測定

LOD:0.02pg/well

LOQ:0.06pg/well

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ダイオキシン類標準品の相対力価(REP)(WHO-TEFとの比較)

● DR-CALUX-REPはWHO-TEFとほぼ相関しており、生物・ヒトへの影響予測に有用

※ REPはEC5 baseの値を示す

WHO-TEF WHO-TEF

(1998) (1998)

2,3,7,8-TeCDD (1) (1) 1,2,3,4,7,8,9-HpCDF 0.048 0.01

1,2,3,7,8-PeCDD 0.75 1 OCDF 0.011 0.0001

1,2,3,4,7,8-HxCDD 0.43 0.1 PCB-#77 0.0015 0.0001

1,2,3,6,7,8-HxCDD 0.23 0.1 PCB-#81 0.0043 0.0001

1,2,3,7,8,9-HxCDD 0.14 0.1 PCB-#126 0.079 0.1

1,2,3,4,6,7,8-HpCDD 0.15 0.01 PCB-#169 0.0025 0.01

OCDD 0.0013 0.0001 PCB-#105 0.000025 0.0001

2,3,7,8-TeCDF 0.49 0.1 PCB-#114 0.00011 0.0005

1,2,3,7,8-PeCDF 0.40 0.05 PCB-#118 0.0000073 0.0001

2,3,4,7,8-PeCDF 0.93 0.5 PCB-#123 0.000086 0.0001

1,2,3,4,7,8-HxCDF 0.22 0.1 PCB-#156 0.00015 0.0005

1,2,3,6,7,8-HxCDF 0.059 0.1 PCB-#157 0.000077 0.0005

1,2,3,7,8,9-HxCDF 0.17 0.1 PCB-#167 0.0000054 0.00001

2,3,4,6,7,8-HxCDF 0.33 0.1 PCB-#189 0.0000032 0.0001

1,2,3,4,6,7,8-HpCDF 0.040 0.01

標準物質 REP 標準物質 REP

P. A. Behnisch et al:Environment International 28(2003)861-877

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各種化学物質の相対力価(REP)

● 臭素系ダイオキシン類、難燃剤等もDR-CALUX活性を示す● 臭素系ダイオキシン類は塩素化ダイオキシンと同様のDR-CALUX-REPを示し、

生体に対する有害作用の可能性を示唆している。

P. A. Behnisch et al:Environment International 28(2003)861-877

※ REPはEC5 baseの値を示す

物質名 REP 物質名 REP

2,3,7-TriCDD 0.0049 3,3',4,4',5-PeBB(PBB-#126) 0.12

2,3,8-TriCDF 0.00010 3,3',4,4',5,5'-HxBB(PBB-#169) 0.0031

2-Br-3,7,8-TriCDD 0.23 TBBP-A 0.0000025

2,3-DiBr-7,8-DiCDD 1.05 PeBDE(PBDE-#126) 0.000093

3-Br-2,7,8-TriCDF 1.28 DeBDE(PBDE-#209) 0.000016

2,3,7,8-TeBDD 0.73 1,2,3,6,7-PeCN 0.0018

1,2,3,7,8-PeBDD 0.26 1,2,3,4,6,7-Hx CN 0.0014

1,2,3,7,8,9-HxBDD 0.041 1,2,3,6,7,8-Hx CN 0.0097

2,3,7-TriBDD 0.081 Dibenzo(a,h)anthracene 0.0049

2,3,7,8-TeBDF 0.97 Benzo(k)fluoranthene 0.0041

2,3,4,7,8-PeBDF 0.12 Benzo(b)fluoranthene 0.0042

1,2,3,4,7,8-HxBDF 0.017 Indeno[1,2,3]pyrene 0.0041

1,2,3,4,6,7,8-HpBDF 0.0019 Benzo(a)pyrene 0.00058

8-I-2,3,4-TriCDF 0.0014 Benzo(a)anthracene 0.00017

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抽出〔公 定 法〕

多層シリカゲルカラム処理

活性炭分散シリカゲルカラム処理

HRGC/HRMS分析

アルミナカラム処理

クリーンアップ工程の比較

硫酸シリカゲル処理

DR-CALUX分析

〔DR-CALUX法〕

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O

O

Clx Cly

ClyClx

O

Clx Cly

ダイオキシン類

Ahレセプターに結合

ベンゾ〔b〕フルオランテン

ベンゾ〔a〕ピレン

Etc.

多環芳香族炭化水素(PAHs)

クリーンアップの目的

臭素化ダイオキシン類

難燃剤

未知の毒性物質

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前処理の違いによる測定値への影響

44,000

(3.7)

38,000

(3.2)

110,000

(9.2)

11,000

(1)

測定値

硫酸シリカゲルカラム法

公定法抽出濃縮のみ公定法前処理法

DR-CALUX法HRGC/HRMS測定法

土壌試料の例

pg-TEQ/g dry

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環境試料分析例

DR-CALUXと公定法分析値の相関

0.1

1

10

100

1000

10000

100000

1000000

0.1 1 10 100 1000 10000 100000

公定法 TEQ

DR-C

ALUX T

EQ

排ガス(pg-TEQ/Nm3)

灰(pg-TEQ/g)

土壌(pg-TEQ/g)

水(pg-TEQ/ L)

底質(pg-TEQ/g)

y=x

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直線回帰式:y=3.25x-0.024 R2=0.997

ng-TEQ/Nm3

排ガス試料:DR-CALUXと公定法の比較(n=61)

0.001

0.01

0.1

1

10

100

1000

0.001 0.01 0.1 1 10 100

公定法(GC/MS) TEQ

DR-C

ALU

X法

陽性

24

偽陽性

14

偽陰性

陰性

23

廃棄物焼却炉 4t/Hr以上の排出基準値

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DR-CALUX法REPを用いた理論TEQの試算

試料名 公定法実測濃度

○ ○ ○ ng/g TEF TEQ REP TEQ

2,3,7,8-T4CDD 0.19 1 0.19 1 0.19

1,2,3,7,8-P5CDD 5.5 1 5.5 0.75 4.1

1,2,3,4,7,8-H6CDD 14 0.1 1.4 0.43 6.0

1,2,3,6,7,8-H6CDD 27 0.1 2.7 0.23 6.2

1,2,3,7,8,9-H6CDD 19 0.1 1.9 0.14 2.7

1,2,3,4,6,7,8-H7CDD 190 0.01 1.90 0.15 29

O8CDD 140 0.0001 0.0140 0.0013 0.18

2,3,7,8-T4CDF 0.78 0.1 0.1 0.49 0.38

1,2,3,7,8-P5CDF 3.0 0.05 0.15 0.40 1.2

2,3,4,7,8-P5CDF 4.5 0.5 2.2 0.93 4.2

1,2,3,4,7,8-H6CDF 11 0.1 1.1 0.22 2.4

1,2,3,6,7,8-H6CDF 10 0.1 1.0 0.059 0.59

1,2,3,7,8,9-H6CDF 1.8 0.1 0.18 0.17 0.31

2,3,4,6,7,8-H6CDF 16 0.1 1.6 0.33 5.3

1,2,3,4,6,7,8-H7CDF 40 0.01 0.40 0.040 1.6

1,2,3,4,7,8,9-H7CDF 11 0.01 0.11 0.048 0.53

O8CDF 34 0.0001 0.0034 0.011 0.37

DR-CALUX

ジベンゾフラン

ダイオキシン

WHO

公定法TEQ DR-CALUXTheoretical TEQ

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公定法TEQとDR-CALUX TEQ実測値、試算値の比較

公定法 DR-CALUX 法 DR-CALUX REP 公定法TEQとの比較 Sample

TEQ(C) 実測 TEQ(B) 試算値 TEQ(T)実測値

(B)/(C) Ratio

試算値

(T)/(C)Ratio

1 16 25 19 1.6 1.2

2 3.9 14 17 3.6 4.3

3 2.5 7.0 5.8 2.8 2.3

4 19 69 45 3.6 2.4

5 53 108 136 2.0 2.6

6 30 80 70 2.7 2.3

単位:ng-TEQ/g

公定法TEQに対してDR-CALUX測定値が2~3倍程度であれば、DR-CALUXの

REPから試算されるTEQとほぼ同じであり、WHO指定29物質以外のAhレセプターと結合するダイオキシン様毒性物質の存在は少ないと考えられる。

包括的な毒性評価が可能

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DR-CALUX測定に必要な試料量

環境基準 <150pg-TEQ/g3~5g1 pg-TEQ/g底 質

水質:年平均値 <1 pg-TEQ/L排水基準:<10 pg-TEQ/L

3~5L1pg-TEQ/L排 水

<1000 pg-TEQ/g3~5g1 pg-TEQ/g土 壌

最終処分場搬入基準   <3ng-TEQ/g3~5g1 pg-TEQ/g飛 灰

廃棄物焼却炉:能力>4t/hr<0.1 ng-TEQ/ Nm33~5 Nm31 pg-TEQ/Nm3排 ガ ス

排出基準/環境基準試料量定量濃度レベル試 料

HRGC/HRMSと同等レベル以上の感度を有す

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DR-CALUX法の測定フロー

サンプリング

抽出

前処理

細胞反応

発光量の測定

データ解析

細胞培養 1日

1日

1日納期 約1週間

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試料受取から報告まで

日土金木水火月

抽出/精製

精製

抽出/精製

抽出/精製

抽出/精製

抽出

細胞培養/反応/測定/解析

細胞培養/反応/測定/解析

細胞培養/反応/測定/解析

受注状況にもよるが、月・火・水の朝に受領した試料は、水・木・金に中間報告可能

木・金に受領した試料は、翌週の水曜日に中間報告

中間報告

中間報告後、再測定を実施し最終報告値としているが、中間報告値と大きく変化することは無い。

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1.簡単な前処理と測定により多検体試料を短時間に分析出来る

2.公定法と同等以上の感度を有し、少量の試料で測定可能。

3.測定は1点濃度ではなく、5~6水準の濃度を同時測定するため、細胞毒等による異常値が常にチェック出来る。

4.公定法で定められている29物質以外の毒性物質も評価できるので、試料の毒性を包括的に把握出来る。

5.安全キャビネット・発光光度計等の安価な設備・機器類で測定が可能である

DR-CALUX法の特徴のまとめ

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・ 排出ガス、排出水等のモニタリング

・ 土壌の汚染度評価のスクリーニング

・ 焼却施設解体の事前調査、モニタリング

・ 廃棄物処理実験結果の迅速なフィードバック

・ 日常管理等における簡易評価

・ 環境汚染へのリスク評価(包括的毒性評価)

              ↓

今後は、食品・化学物質等の毒性評価への展開も

分析の適用について

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簡易分析としての位置づけ

公定法分析

(HRGC/HRMS)

+(補完)

簡易分析

(DR-CALUX)

ダイオキシン対策・環境リスク評価への有益な情報の提供