ＤＲ－ＣＡＬＵＸ法によるＤＲ－ＣＡＬＵＸ法によるダイオキシン類簡易測定ダイオキシン類簡易測定

第6回 ｅ-シンポジウム(2004年10月8日)

ダイオキシン類の公定法分析O

O

Clx Cly

Clx Cly

ポリ塩化ジベンゾ-p-ジオキシン

ＰＣＤＤｓ

ClyClx

O

ポリ塩化ジベンゾフラン

ＰＣＤＦｓ

ポリ塩化ビフェニル

ＰＣＢｓ

測定対象

７種

１０種

１２種

異性体 ７５種

異性体 １３５種

異性体 ２０９種

ＷＨＯで指定されている毒性の強い2,3,7,8体PCDD/DFsとコプラナーPCBの計29物質がダイオキシン類としての測定対象

公定法は、個々の物質の濃度をＨＲＧＣ／ＨＲＭＳ測定し、毒性等価係数（TEF)を乗じて加算した毒性当量（TEQ)として評価

Co-ＰＣＢｓ

ラット肝臓ガン細胞にルシフェラーゼ

遺伝子を組み込んだH4IIE-luc細胞

生物細胞でダイオキシン類の分析

直接毒性当量（ＴＥＱ）を測定する方法である

簡易分析が必要とされる事例

・　廃棄物処理施設の日常管理

・　土地、河川･港湾等における汚染度評価

・　汚染箇所の範囲や汚染源の特定

・　ダイオキシン対策のための技術検討

・　緊急時の環境汚染状況の把握

↓（需要）

低コストで多数の試料を短期間で分析

ダイオキシン類の簡易分析法

簡易機器分析

・　四重極GC/MS・　特定異性体分析・　GC/MS/MS　　etc.

生物検定法

・　イムノアッセイ、ELISA法　　

・　レポータージーンアッセイ

　　　DR-CALUX　etc．

ダイオキシン類の公定分析法

複雑な前処理精製工程高価な高分解能ガスクロマトグラフ質量分析計(ＨＲＧＣ／ＨＲＭＳ） 等

前処理の簡素化

公定法を補完する安価で短納期の分析法

高い分析費用

長い分析期間

ＤＲ－ＣＡＬＵＸ法

・DR-CALUX法（Dioxin Responsive Chemically Activated

Luciferase eXpression）はBioDetection Systems社（オランダ）で開発されたバイオアッセイであり、ダイオキシン様物質の簡易分析法である。

・本法はダイオキシン類が細胞内に取り込まれた時に、Ahレセプターを介して薬物代謝酵素を誘導し、その度合いが生体での毒性の強さと高い相関を示すという原理に基づいている。

・遺伝子組替え技術を応用してダイオキシンに対する感受性及び簡便性を高めている。

測定の原理

DR-CALUX

0.1 1 10 100 1000

[TCDD] pM in well

0

20

40

60

80

100

(Tho

usan

ds)

Rea

ltive

Ligh

ts U

nits

, Sam

ple

-Rea

ltive

Ligh

ts U

nits

, DM

SO TCDD : H4IIE; DC108 plate3; 24h [CIL1983;EC50=8.5]

2,3,7,8-TCDD標準物質における検量線

全てのプレートに検量線用TCDD（７水準×3well／水準＝21well)を設置

試料液は、５～６段階に希釈して幅広い濃度で最適濃度になるように測定

ＬＯＤ：0.02pg/well

ＬＯＱ：0.06pg/well

ダイオキシン類標準品の相対力価（REP）（WHO-TEFとの比較）

● DR-CALUX-REPはWHO-TEFとほぼ相関しており、生物・ヒトへの影響予測に有用

※ REPはEC５ baseの値を示す

WHO-TEF WHO-TEF

(1998) (1998)

2,3,7,8-TeCDD (1) (1) 1,2,3,4,7,8,9-HpCDF 0.048 0.01

1,2,3,7,8-PeCDD 0.75 1 OCDF 0.011 0.0001

1,2,3,4,7,8-HxCDD 0.43 0.1 PCB-#77 0.0015 0.0001

1,2,3,6,7,8-HxCDD 0.23 0.1 PCB-#81 0.0043 0.0001

1,2,3,7,8,9-HxCDD 0.14 0.1 PCB-#126 0.079 0.1

1,2,3,4,6,7,8-HpCDD 0.15 0.01 PCB-#169 0.0025 0.01

OCDD 0.0013 0.0001 PCB-#105 0.000025 0.0001

2,3,7,8-TeCDF 0.49 0.1 PCB-#114 0.00011 0.0005

1,2,3,7,8-PeCDF 0.40 0.05 PCB-#118 0.0000073 0.0001

2,3,4,7,8-PeCDF 0.93 0.5 PCB-#123 0.000086 0.0001

1,2,3,4,7,8-HxCDF 0.22 0.1 PCB-#156 0.00015 0.0005

1,2,3,6,7,8-HxCDF 0.059 0.1 PCB-#157 0.000077 0.0005

1,2,3,7,8,9-HxCDF 0.17 0.1 PCB-#167 0.0000054 0.00001

2,3,4,6,7,8-HxCDF 0.33 0.1 PCB-#189 0.0000032 0.0001

1,2,3,4,6,7,8-HpCDF 0.040 0.01

標準物質 REP 標準物質 REP

P. A. Behnisch et al：Environment International 28(2003)861-877

各種化学物質の相対力価（REP)

● 臭素系ダイオキシン類、難燃剤等もDR-CALUX活性を示す● 臭素系ダイオキシン類は塩素化ダイオキシンと同様のDR-CALUX-REPを示し、

生体に対する有害作用の可能性を示唆している。

P. A. Behnisch et al：Environment International 28(2003)861-877

※ REPはEC５ baseの値を示す

物質名 REP 物質名 REP

2,3,7-TriCDD 0.0049 3,3',4,4',5-PeBB(PBB-#126) 0.12

2,3,8-TriCDF 0.00010 3,3',4,4',5,5'-HxBB(PBB-#169) 0.0031

2-Br-3,7,8-TriCDD 0.23 TBBP-A 0.0000025

2,3-DiBr-7,8-DiCDD 1.05 PeBDE(PBDE-#126) 0.000093

3-Br-2,7,8-TriCDF 1.28 DeBDE(PBDE-#209) 0.000016

2,3,7,8-TeBDD 0.73 1,2,3,6,7-PeCN 0.0018

1,2,3,7,8-PeBDD 0.26 1,2,3,4,6,7-Hx CN 0.0014

1,2,3,7,8,9-HxBDD 0.041 1,2,3,6,7,8-Hx CN 0.0097

2,3,7-TriBDD 0.081 Dibenzo(a,h)anthracene 0.0049

2,3,7,8-TeBDF 0.97 Benzo(k)fluoranthene 0.0041

2,3,4,7,8-PeBDF 0.12 Benzo(b)fluoranthene 0.0042

1,2,3,4,7,8-HxBDF 0.017 Indeno[1,2,3]pyrene 0.0041

1,2,3,4,6,7,8-HpBDF 0.0019 Benzo(a)pyrene 0.00058

8-I-2,3,4-TriCDF 0.0014 Benzo(a)anthracene 0.00017

抽出〔公　定　法〕

多層ｼﾘｶｹﾞﾙｶﾗﾑ処理

活性炭分散ｼﾘｶｹﾞﾙｶﾗﾑ処理

ＨＲＧＣ／ＨＲＭＳ分析

ｱﾙﾐﾅｶﾗﾑ処理

クリーンアップ工程の比較

硫酸ｼﾘｶｹﾞﾙ処理

ＤＲ－ＣＡＬＵＸ分析

〔DR-CALUX法〕

O

O

Clx Cly

ClyClx

O

Clx Cly

ダイオキシン類

Ａｈレセプターに結合

ベンゾ〔ｂ〕フルオランテン

ベンゾ〔ａ〕ピレン

Etc.

多環芳香族炭化水素（ＰＡＨｓ）

クリーンアップの目的

臭素化ダイオキシン類

難燃剤

未知の毒性物質

前処理の違いによる測定値への影響

４４，０００

（３．７）

３８，０００

（３．２）

１１０，０００

（９．２）

１１，０００

（１）

測定値

硫酸シリカゲルカラム法

公定法抽出濃縮のみ公定法前処理法

DR-CALUX法HRGC/HRMS測定法

土壌試料の例

pg-TEQ/g ｄｒｙ

環境試料分析例

DR-CALUXと公定法分析値の相関

0.1

1

10

100

1000

10000

100000

1000000

0.1 1 10 100 1000 10000 100000

公定法 TEQ

DR-C

ALUX T

EQ

排ガス（ｐｇ-ＴＥＱ/Ｎｍ3）

灰（ｐg-TEQ/g）

土壌（ｐg-TEQ/g）

水（ｐg-TEQ/ L）

底質（ｐｇ-TEQ/ｇ）

ｙ＝ｘ

直線回帰式：ｙ＝３．２５ｘ－０．０２４ Ｒ２＝０．９９７

ng-TEQ/Nm3

排ガス試料：DR-CALUXと公定法の比較(n=61)

0.001

0.01

0.1

1

10

100

1000

0.001 0.01 0.1 1 10 100

公定法(GC/MS) TEQ

DR-C

ALU

X法

陽性

２４

偽陽性

１４

偽陰性

０

陰性

２３

廃棄物焼却炉 4t/Hr以上の排出基準値

ＤＲ-ＣＡＬＵＸ法ＲＥＰを用いた理論ＴＥＱの試算

試料名 公定法実測濃度

○　○　○ ng/g ＴＥＦ ＴＥＱ ＲＥＰ ＴＥＱ

2,3,7,8-T4CDD 0.19 1 0.19 1 0.19

1,2,3,7,8-P5CDD 5.5 1 5.5 0.75 4.1

1,2,3,4,7,8-H6CDD 14 0.1 1.4 0.43 6.0

1,2,3,6,7,8-H6CDD 27 0.1 2.7 0.23 6.2

1,2,3,7,8,9-H6CDD 19 0.1 1.9 0.14 2.7

1,2,3,4,6,7,8-H7CDD 190 0.01 1.90 0.15 29

O8CDD 140 0.0001 0.0140 0.0013 0.18

2,3,7,8-T4CDF 0.78 0.1 0.1 0.49 0.38

1,2,3,7,8-P5CDF 3.0 0.05 0.15 0.40 1.2

2,3,4,7,8-P5CDF 4.5 0.5 2.2 0.93 4.2

1,2,3,4,7,8-H6CDF 11 0.1 1.1 0.22 2.4

1,2,3,6,7,8-H6CDF 10 0.1 1.0 0.059 0.59

1,2,3,7,8,9-H6CDF 1.8 0.1 0.18 0.17 0.31

2,3,4,6,7,8-H6CDF 16 0.1 1.6 0.33 5.3

1,2,3,4,6,7,8-H7CDF 40 0.01 0.40 0.040 1.6

1,2,3,4,7,8,9-H7CDF 11 0.01 0.11 0.048 0.53

O8CDF 34 0.0001 0.0034 0.011 0.37

ＤＲ－ＣＡＬＵＸ

ジベンゾフラン

ダイオキシン

ＷＨＯ

公定法ＴＥＱ DR-CALUXTheoretical TEQ

公定法ＴＥＱとＤＲ－ＣＡＬＵＸ ＴＥＱ実測値、試算値の比較

公定法 DR-CALUX 法 DR-CALUX REP 公定法ＴＥＱとの比較 Sample

TEQ（Ｃ） 実測 TEQ（Ｂ） 試算値 TEQ（Ｔ）実測値

（B）/（Ｃ） Ratio

試算値

（Ｔ）/（Ｃ）Ratio

1 16 25 19 1.6 1.2

2 3.9 14 17 3.6 4.3

3 2.5 7.0 5.8 2.8 2.3

4 19 69 45 3.6 2.4

5 53 108 136 2.0 2.6

6 30 80 70 2.7 2.3

単位：ng-TEQ/g

公定法ＴＥＱに対してＤＲ－ＣＡＬＵＸ測定値が２~３倍程度であれば、ＤＲ－ＣＡＬＵＸの

ＲＥＰから試算されるＴＥＱとほぼ同じであり、ＷＨＯ指定２９物質以外のＡｈレセプターと結合するダイオキシン様毒性物質の存在は少ないと考えられる。

包括的な毒性評価が可能

DR-CALUX測定に必要な試料量

環境基準　＜150pg-TEQ/g３～５g1 pg-TEQ/g底　質

水質：年平均値 ＜1 pg-TEQ/L排水基準：＜１０ pg-TEQ/L

３～５Ｌ1pg-TEQ/Ｌ排 水

＜1000 pg-TEQ/g３～５g1 pg-TEQ/g土 壌

最終処分場搬入基準　　　＜3ng-TEQ/g３～５g1 pg-TEQ/g飛 灰

廃棄物焼却炉：能力＞４t/hr＜0.1 ng-TEQ/ Nｍ3３～５ Nｍ３1 pg-TEQ/Nｍ３排 ガ ス

排出基準／環境基準試料量定量濃度レベル試 料

HRGC/HRMSと同等レベル以上の感度を有す

ＤＲ－ＣＡＬＵＸ法の測定フロー

サンプリング

抽出

前処理

細胞反応

発光量の測定

データ解析

細胞培養 １日

１日

１日納期 約１週間

試料受取から報告まで

測

定

前

処

理

日土金木水火月

抽出／精製

精製

抽出／精製

抽出／精製

抽出／精製

抽出

細胞培養/反応/測定/解析

細胞培養/反応/測定/解析

細胞培養/反応/測定/解析

受注状況にもよるが、月・火・水の朝に受領した試料は、水・木・金に中間報告可能

木・金に受領した試料は、翌週の水曜日に中間報告

中間報告

中間報告後、再測定を実施し最終報告値としているが、中間報告値と大きく変化することは無い。

１．簡単な前処理と測定により多検体試料を短時間に分析出来る

２．公定法と同等以上の感度を有し、少量の試料で測定可能。

３．測定は１点濃度ではなく、５~６水準の濃度を同時測定するため、細胞毒等による異常値が常にチェック出来る。

４．公定法で定められている２９物質以外の毒性物質も評価できるので、試料の毒性を包括的に把握出来る。

５．安全キャビネット･発光光度計等の安価な設備・機器類で測定が可能である

ＤＲ－ＣＡＬＵＸ法の特徴のまとめ

・　排出ガス、排出水等のモニタリング

・　土壌の汚染度評価のスクリーニング

・　焼却施設解体の事前調査、モニタリング

・ 廃棄物処理実験結果の迅速なフィードバック

・ 日常管理等における簡易評価

・　環境汚染へのリスク評価（包括的毒性評価）

　　　　　　　　　　　　　　↓

今後は、食品・化学物質等の毒性評価への展開も

分析の適用について

簡易分析としての位置づけ

公定法分析

（HRGC／HRMS）

＋（補完）

簡易分析

（DR-CALUX）

ダイオキシン対策・環境リスク評価への有益な情報の提供