Dr. Szendi Katalin - PTE...

KÖRNYEZETI RÉSZECSKEEXPOZÍCIÓK GENOTOXIKUS HATÁSA IN VIVO ÉS IN VITRO

Doktori (PhD) értekezés

Dr. Szendi Katalin

Doktori Iskola vezetője: Prof. Dr. Komoly Sámuel Programvezető: Prof. Dr. Ember István

Témavezető: Dr. Varga Csaba

Pécsi Tudományegyetem Általános Orvostudományi Kar

Pécs, 2012

TARTALOMJEGYZÉK

1 Rövidítések jegyzéke _________________________________________________ 4

2 Bevezetés __________________________________________________________ 6

2.1 Általános bevezetés _______________________________________________ 6

2.2 Az 1-nitropirén in vivo mutagenitásvizsgálata, ill. az erre épülő krónikus, azbesztexpozíciós modell ___________________________________________ 7

2.3 Szénnanocsövek potenciális genotoxicitásának és mezoteliómaindukciójának vizsgálata ______________________________________________________ 11

2.4 Peloidok mutagén aktivitásának vizsgálata bakteriális mutagenitási tesztben __ 15

3 Célkitűzések ______________________________________________________ 17

4 Anyag és módszer __________________________________________________ 18

4.1 Általános leírás __________________________________________________ 18

4.1.1 Salmonella Ames mutagenitási vizsgálatok _______________________ 18

4.1.1.1 Klasszikus, lemezöntéses módszer _______________________ 18

4.1.1.2 Előinkubációs Ames-teszt ______________________________ 20

4.1.1.3 Vizeletmutagenitás Ames-tesztben _______________________ 20

4.1.2 Citogenetikai vizsgálatok _____________________________________ 22

4.1.2.1 Mikronukleusz teszt ___________________________________ 22

4.1.2.2 Testvérkromatid-csere (SCE) analízis _____________________ 23

4.1.3 Krónikus, kontaktexpozíciós modell rostszerkezetű anyagokhoz köthető mutagenitás és komutagenitás vizsgálatára _________________ 26

4.1.4 Peloidok ___________________________________________________ 29

4.1.4.1 Hévízi és kolopi gyógyiszapok, fizikai, kémiai, biológiai adatok 29

4.1.4.2 Előkezelés nélküli peloidok _____________________________ 31

4.1.4.3 Peloidkivonatok ______________________________________ 32

4.1.5 Statisztikai módszerek Salmonella Ames-teszt értékeléséhez _________ 34

4.2 Részletező (az egyes módszereknél alkalmazott) leírás ___________________ 36

4.2.1 Kísérleti elrendezés (2.2) ______________________________________ 36


4.2.1.2 Krónikus, kontaktexpozíciós modell ______________________ 36


4.2.2.1 Salmonella Ames mutagenitási vizsgálatok ________________ 37

4.2.2.1.1 Klasszikus, lemezöntéses módszer _______________ 37

4.2.2.1.2 Előinkubációs Ames-teszt ______________________ 37

4.2.2.1.3 Vizeletmutagenitás Ames-tesztben _______________ 38

4.2.2.2 Citogenetikai vizsgálatok ______________________________ 38

4.2.2.3 Krónikus, kontaktexpozíciós modell ______________________ 39


5 Eredmények _______________________________________________________ 41

5.1 Az 1-nitropirén in vivo mutagenitásvizsgálata, ill. az erre épülő krónikus, azbesztexpozíciós modell __________________________________________ 41

5.1.1 Vizeletmutagenitás Ames-tesztben ______________________________ 41

5.1.2 Krónikus, kontaktexpozíciós modell _____________________________ 43

5.2 Szénnanocsövek potenciális genotoxicitásának és mezoteliómaindukciójának vizsgálata ______________________________________________________ 45

5.2.1 Salmonella Ames mutagenitási vizsgálatok _______________________ 45

5.2.1.1 Klasszikus, lemezöntéses módszer _______________________ 45

5.2.1.2 Előinkubációs Ames-teszt ______________________________ 46


5.2.2 Citogenetikai vizsgálatok _____________________________________ 48

5.2.2.1 Mikronukleusz teszt ___________________________________ 48

5.2.2.2 SCE-analízis ________________________________________ 49

5.2.3 Krónikus, kontaktexpozíciós modell _____________________________ 51

5.3 Peloidok mutagén aktivitásának vizsgálata bakteriális mutagenitási tesztben __ 54

5.3.1 Előkezelés nélküli peloidok ___________________________________ 54

5.3.2 Peloidkivonatok _____________________________________________ 56

5.3.2.1 1. sorozat ___________________________________________ 56

5.3.2.2 2. sorozat ___________________________________________ 59

6 Megbeszélés és következtetések _______________________________________ 63

7 Új eredmények összefoglalása ________________________________________ 75

8 Tudományos közlemények és a kongresszusi prezentációk (előadások és poszterek) jegyzéke _________________________________________________ 76

9 Köszönetnyilvánítás ________________________________________________ 86

10 Irodalomjegyzék ___________________________________________________ 87

1 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE

ALT: analitikai tisztaságú

AR: analytical reagent

B(a)P: benz(a)pirén

CAS: Chemical Abstracts Service

CNT: carbon nanotube

DE: dekonjugációs enzimek

DMSO: dimetil szulfoxid

F-344: Fischer-344 patkánytörzs

FBS: fetal bovine serum

f/p: percenkénti fordulatszám

IARC: International Agency for Research on Cancer

LD: letális dózis

LLL: left lateral lobe = lobus hepatis sinister lateralis

M1: 1. metafázis

M2: 2. metafázis

M3: 3. metafázis

MGM: minimal glucose medium

MN: mikronukleusz

MWCNT: multi-walled carbon nanotube

NOAEL: no observed adverse effect level

NP: nitropirén

OGYFI: Országos Gyógyhelyi és Gyógyfürdőügyi Főigazgatóság

OTH: Országos Tisztifőorvosi Hivatal

PBS: phosphate-buffered saline (foszfát puffer)

ROS: reactive oxygen species (reaktív oxigénfajták)

RPMI: Roswell Park Memorial Institute

S9 mix: patkánymájból preparált metabolizáló enzimek, 9000 x g szupernatáns

frakció

SCE: sister chromatid exchange (testvérkromatid-csere)

SD: standard deviation (standard deviáció)

SPSS: Statistical Package for the Social Sciences

SSC: saline-sodium citrate (NaCl + Na-citrát)

SWCNT: single-walled carbon nanotube

UICC: Union Internationale Centre le Cancer

VB só: Vogel-Bonner só

6

2 BEVEZETÉS

2.1 ÁLTALÁNOS BEVEZETÉS

A részecske ill. rosttoxikológia a tudomány régóta kutatott területei közé

tartozik. Már a 16. század közepén több tudós észlelte a finomszemcsés anyagok

betegségeket okozó hatását. Az ipari forradalom következtében a populáció nagy része

exponálódott a gyárak által kibocsátott szennyezőanyagokkal. Mindemellett abban az

időben az ipari toxikológia még gyerekcipőben járt. A 20. században az azbeszt és a

szilícium toxikológiája került előtérbe, melyet a nanotechnológiai iparnak köszönhetően

a 21. században új anyagcsoportok, a nanorészecskék követtek [1]. A környezetünket

szennyező részecskék (rostos és nem rostos) expozíciójával számos helyen

találkozhatunk: pl. a gyártás, ipari termékek használata, a bányászat, illetve az emberi

tevékenységet követő, véletlenszerű expozíciók során is, melynek hatására különböző

betegségcsoportokkal kell szembesülnünk, mint az asztma, krónikus obstruktív

tüdőbetegségek, kardiovaszkuláris megbetegedések, vagy akár fibrózis illetve a

különböző ráktípusok. Napjainkban is számos részecsketípus képezi a kutatások alapját.

A század egyik új kihívása a szilárd halmazállapotú, finomszemcsés anyagok (mint pl.

elemi szálak, nanotechnológiai termékek) széles spektrumának feltérképezése.

Dolgozatomban rostos (rostszerkezetű por: hossz-átmérő arány: ≥ 3:1 [2]) és

nem rostos (szemcsés szerkezetű por: hossz-átmérő arány: < 3:1 [2]; talajtani

szempontból vett részecskék, szemcseméret megközelítőleg: < 200 µm) részecskék

specifikus genotoxicitását vizsgáltam. A kísérletek 3 anyagcsoporton történtek. Az

ismerten karcinogén (IARC 1) azbesztrostokat, a méretükben, alakjukban az

azbesztrostokhoz nagyon hasonló, de eltérő biológiai aktivitást mutató

szénnanocsöveket, és mind a balneoterápiában, mind a wellness területén előszeretettel

alkalmazott gyógyiszapokat vizsgáltuk.

A genotoxikológiai tesztelés és a rákkockázatbecslés szempontjából a rostos és

nem rostos részecskék a „klasszikus toxikus” anyagokhoz (gáz vagy folyadék fázisú

kémiai karcinogének) képest egy speciális csoportot képeznek. A rostos és nem rostos

részecskék fizikai-kémiai viselkedése különbözik a már „hagyományos” kémiai

karcinogénekétől [3]. A vegyi anyagok számos expozíciós útvonalon juthatnak a

szervezetbe, ahol közvetlenül vagy indirekt módon – a metabolizáció során –

7

kölcsönhatásba léphetnek a DNS-sel. Bár a többnyire inhalációval a szervezetbe jutó

részecskék metabolizációs folyamatokon nem mennek keresztül, azonban a rostsejt-

kölcsönhatás vizsgálata során figyelembe kell venni az internalizációt és fagocitózist,

továbbá a részecskék transzcitózissal történő sejtekbe bejutását, melyek meghatározó

szerepet játszanak a citotoxicitásban, a fibrogén hatásokban és a genotoxicitásban is. A

rostos és nem rostos részecskék felületi tulajdonságaiknál fogva indirekt úton,

gyulladásos folyamatokon keresztül (ROS: reaktív oxigénfajták) okozhatnak

genotoxicitást és következményes tumorképződést. Míg a vegyi anyagok a klasszikus

toxikokinetika szabályait követik (eloszlás, biotranszformáció, elimináció), addig a

részecskék teljesen más módon fejthetik ki hatásukat (jellemző kinetika: pl. a lerakódás,

clearance, elhúzódó elimináció).

Nem lehet eléggé hangsúlyozni legjelentősebb közös tulajdonságukat, melyet a

felszínükhöz kötött szerves anyagok potenciális jelenléte képezi. A rostos szerkezetű

anyagok a nagy fajlagos felületük miatt számos lehetséges mutagént képesek megkötni,

de a nem rostos részecske típusú anyagok is hordozhatnak policiklusos aromás

szénhidrogéneket és egyéb mutagén komponenseket [4].

2.2 AZ 1-NITROPIRÉN IN VIVO MUTAGENITÁSVIZSGÁLATA, ILL.

AZ ERRE ÉPÜLŐ KRÓNIKUS, AZBESZTEXPOZÍCIÓS MODELL

Az 1-nitropirén (1-NP) (1. ábra) elsősorban közlekedési eredetű, valamint

fosszilis tüzelőanyagok tökéletlen égéskor keletkező, továbbá a dohányfüstben

előforduló, nitrocsoporttal rendelkező policiklusos aromás szénhidrogén [5]. Egy másik

lényeges légszennyező anyag az azbeszt, melynek rostjai felületükön megköthetik és

akkumulálhatják pl. az 1-NP molekulákat is.

Az azbeszt természetes előfordulású rostos, hidratált szilikátásványok

összefoglaló neve. Nagy szakítószilárdságú, hőnek és a legtöbb vegyi anyagnak ellenáll.

Keletkezés és kristályszerkezet alapján két osztályba sorolhatók: szerpentinek és

amfibolok. A magyar 12/2006. (III. 23.) EüM rendelet szerint azbesztnek 6 különböző

szilikátfajta minősül (2. ábra).

8

1. ábra

Az 1-nitropirén (1-NP) szerkezete

2. ábra

Az azbesztek osztályozása és típusai

Két legelterjedtebb típusa a krokidolit (kék azbeszt, amfibol-csoport) és a

krizotil (fehér azbeszt, szerpentinek) (3. ábra).

AZBESZT

AMFIBOL OSZTÁLY SZERPENTIN OSZTÁLY

krizotil (fehér azbeszt)

krokidolit (kék azbeszt)

amozit

tremolit

antofillit

aktinolit

9

3. ábra

Krokidolit (27 000x-es nagyítás) és krizotil (50 000x-es nagyítás) rostok jellegzetes

transzmissziós elektronmikroszkópos felvétele [6]

Az amfibolazbesztek (pl. krokidolit) rostjai egyenesek, tűszerűek, szövetük érdesebb,

merevebb, a rostok savállóak. A szerpentinazbeszt (pl. krizotil) rostjai hajlékonyak és

görbültek, lágy szövetet alkotnak, lúgrezisztensek. Széleskörű elterjedésüket e fenti

tulajdonságok tették lehetővé.

A termékekből ill. anyagokból a különböző kötöttségi állapotú azbesztszálak

felszabadulhatnak, és a környezetből a mikroszkópikus méretű szálak a különböző

expozíciós utakon a szervezetbe jutva deponálódhatnak, kumulálódhatnak, és általában

néhány évtizedes latenciaidőt követően megbetegedéseket okozhatnak (azbesztózis,

bronchiális karcinóma, pleurális vagy peritoneális mezotelióma) [7]. A legnagyobb

egészségügyi kockázatot a kék azbeszt jelenti, melynek alkalmazása 1992-től tiltott

Magyarországon [8].

Az azbesztet, kedvező tulajdonságai miatt, (hajlékonyság, ellenálló képesség)

széles körben használták. Habár 2005. január 1-től a 41/2000. (XII. 20.) EüM-KöM

együttes rendelet értelmében Magyarországon tilos minden azbesztet tartalmazó termék

forgalmazása és felhasználása, a belélegezhető rostok továbbra is jelen vannak az

emberi környezetben, mely több emittáló forrás működésének következménye. Ilyen az

10

azbesztbányászat (egyes országokban) és feldolgozóipar, vagy a rostok felszabadulása

azbesztcement anyagú tetőfedő palákból, építő- ill. szigetelőanyagokból, nyomó- és

lefolyócsövekből vagy tűzálló burkolatokból. További forrás lehet, különösen a

posztkommunista országokban és a harmadik világban, a közlekedés és szállítás, a

korszerűtlen azbeszt fékbetétekkel felszerelt veterán buszok és tehergépkocsik irreálisan

hosszú használata. Alkalmanként az azbesztmentesítő programok és az épületbontások

szintén hozzájárulnak a sokáig immobilis rostok környezetbe jutásához [7, 9, 10].

További lehetőség az ivóvíz szennyezése azbesztrostokkal, melyek az azbesztcementből

készült vízvezetékek falából szabadulhatnak fel. Ezek a rostok különböző, az ivóvízben

előforduló szerves anyagokat köthetnek meg – pl. klórozási melléktermékek – melyek

közt jól ismert mutagének és karcinogének is találhatók [11, 12].

Több korábbi vizsgálat is jelezte, hogy a benz[a]pirén és más policiklusos

aromás vegyületek mind vizes, mind apoláros közegből hatékonyan kötődnek az

azbesztrostok viszonylag nagy felszínéhez [13, 14, 15, 16]. Humán toxikológiai,

foglalkozás-egészségügyi és munkahigiénés szempontból a belégzést tekintik a fő

expozíciós útnak. Azonban nem munkahelyi, hanem elsősorban közlekedési eredetű,

vagy más, nem ellenőrzött tevékenység (lakásfelújítás, otthoni munkaruházat mosás

stb.) során keletkező rostokhoz kötött molekulák gyakran kerülnek a gasztrointesztinális

rendszerbe. A tüdőbe kerülő rostok egy részét felköhöghetjük, miközben a rostkötegek

kisebb átmérőjű kötegekké, vagy elemi rostokká esnek szét. A laboratóriumok közötti

eredmények összehasonlíthatósága miatt a vizsgálatokban egységesített, respirábilis

rostokat használnak [17], míg a környezeti és munkahelyi expozíció során főként

inkább nagyobb méretű, nem respirábilis rostszerkezetű porokat inhalálunk, melyek

később lenyelésre kerülnek. Így a teljes populáció vonatkozásában az orális expozíció

jelentősnek tekinthető [11, 12]. Elektronmikroszkópos vizsgálatok szerint a

gasztrointesztinális traktusba került rostok átjuthatnak a bélfalon [18, 19]. A

policiklusos aromás vegyületek metabolitjai a széklettel és a vizelettel választódnak ki.

Előzetes kísérletünkben a korábbi tanulmányokban [20, 21] a génexpressziók

szintjén hatékonynak bizonyult egyszeri 1-NP dózissal po. (per os) és ip.

(intraperitoneálisan) kezelt állatok vizeletének mutagenitását vizsgáltuk. Mind a hatás

mechanizmusának megismerése, mind a kockázatbecslés lehetőségét tekintve lényeges

a komutagenitás (vagyis két anyag együttes hatása), vagy egyéb lehetséges kémiai ill.

fizikai interakciók tanulmányozása. Ez pedig lehetetlen az orális expozícióval bejutó

11

azbesztrosthoz kötött 1-NP, és/vagy metabolitjai – mint potenciális mutagének –

toxikokinetikájának megismerése nélkül.

Állatkísérletekben a lenyelt azbesztrostok felhalmozódását több szervben is

kimutatták, főként a csepleszben, de a vesében, májban, lépben, agyban, tüdőben ill. a

vérben és vizeletben is megfigyelhető volt a szálak jelenléte [22, 23]. Emberi boncolási

adatok is alátámasztják a cseplesz rendkívül magas akkumulációs hajlamát, mely

minden bizonnyal összefüggésben áll a hashártya daganatainak előfordulásával [24]. A

rostok okozta oxidatív károsodást kimutatták különböző kombinált in vivo/in vitro

genotoxicitási tesztekben (üstökös elektroforézis, bakteriális mutagenitási teszt,

citogenetikai vizsgálatok) [14, 15, 25]. Azonban az azbesztexpozíció végpontjának, a

mezoteliómának, vizsgálata in vitro rendszerekben nehézségekbe ütközik. A humán

peritoneum mezotélsejt-kultúrái nagyon rövid proliferatív élettartammal rendelkeznek,

öregedésük során egyre több reaktív oxigéngyököt képeznek, mely a DNS növekvő

oxidatív károsodásához vezet. Éppen ezért hosszú időtartamú kísérletekben hasonló

jellegű hatások vizsgálatára nem alkalmasak [26]. Ebből kifolyólag egy egyszerű

sebészi eljárásból álló specifikus in vivo krónikus, kontaktexpozíciós modellt

fejlesztettünk ki rostos szerkezetű anyagok számára [27]. A kísérlet célja az

azbesztrostok és a mezotélsejtek közötti hosszútávú, direkt kontaktus vizsgálata volt. Az

állatokat nagy tisztaságú amfibollal (krokidolit) és szerpentinnel (rodéziai krizotil)

exponáltuk. A környezeti expozíció modellezésére 1-nitropirénnel (1-NP) előkezelt

rostokat használtunk, mely az IARC szerinti 2B csoportba tartozó, lehetséges humán

karcinogén, és genotoxikus anyag [5, 28].

2.3 SZÉNNANOCSÖVEK POTENCIÁLIS GENOTOXICITÁSÁNAK ÉS

MEZOTELIÓMAINDUKCIÓJÁNAK VIZSGÁLATA

Az elmúlt évtized folyamán egyre nagyobb érdeklődés mutatkozik egy

forradalmian új anyagcsoport, a nanotechnológiai termékek iránt. Az egyik

leggyorsabban fejlődő irány a szénnanocsövek (CNT) felhasználása. A szénnanocsövek

a szén allotróp módosulatainak új tagjai, melyek a fullerénekhez és a grafithoz

hasonlatosak, legismertebb formáik az egyfalú- (SWCNT) és többfalú szénnanocsövek

12

(MWCNT) (4. ábra). Az egyelen atomvastagságú grafitréteg neve grafén, mely

feltekerve, két fél fullerénsapkával alkotják az egyfalú szénnanocsöveket.

4. ábra

A szén allotróp módosulatai [29]

Méreteiket tekintve, míg átmérőjük a nanométer tört része is lehet, addig

hosszuk elérheti a több tíz mikrométert (hossz-átmérő arány ≥ 3:1). Egyedülálló

elektromos, mechanikai és termikus tulajdonságai miatt a szénnanocsövek igen fontossá

válnak az elektronika, az űrkutatás és a számítógépipar újabb területein [29, 30]. Ma

még csak évente néhány száz tonnát gyártanak belőlük, de termelésük volumene

exponenciálisan növekszik [31], ugyanakkor a környezetre és az emberek egészségére

gyakorolt hatásukról rendelkezésre álló információk nem kielégítőek [32, 33, 34, 35, 36,

37, 38, 39, 40, 41, 42, 43]. Nincs megfelelő mennyiségű adat (főként orális expozíció

esetében) sem az általános toxicitásról (pl. közepes halálos dózis, LD50-érték; nem

észlelt ártalmas hatás szintje, no observed adverse effect level, NOAEL), sem specifikus

toxikológiai tulajdonságaikról (pl. genotoxicitás és karcinogenitás) [39, 44].

A nanorészecskék különösen fontos környezeti és munkahigiénés veszélyeit két

tényező jelentheti. Egyrészt már maga a mérettartomány is kockázati tényezőnek

tekinthető, másrészt nagy adszorpciós felülettel rendelkeznek, melyre különböző

toxikus anyagok kötődhetnek, íly módon bekerülhetnek az emberi szervezetbe. A

13

nanorészecskék a három legismertebb expozíciós úton juthatnak be az emberi

szervezetbe: inhalációval, bőrön keresztül és a gasztrointesztinális rendszeren át.

Tulajdonságaikban nagyon hasonlítanak egyes, bizonyított környezeti és toxikológiai

kockázatot jelentő ásványok elemi rostjaihoz, elsősorban az azbeszthez [7].

A fullerének erősen lipofilek, ebből következően sejtmembránban dúsulnak,

redox-aktívak, a keletkező reaktív oxigéngyökök lipid- és protein peroxidációt

okozhatnak [36].

SWCNT esetében ismert annak oxidatív stresszt, apoptózist, egyéb citotoxikus

választ és pulmonális toxicitás okozó hatása [32, 34, 37, 38]. Egerekben a

szénnanocsövek (0,5 mg/állat) szuszpenziójának intratracheális instillációval történő

tüdőbe juttatása granulómákat okozott [32], míg patkányok tüdejében az immunsejtek

az 1 vagy 5 mg/ttkg dózisban bejuttatott SWCNT összecsapzódások körül gyülekeztek.

A tüdő SWCNT expozíciója után nem-dózisfüggő, súlyos multifokális granulómák

alakultak ki, amelyek bizonyítékul szolgálnak az idegentest-típusú reakcióra. A

garnulómák makrofágszerű multinukleális óriássejteket tartalmaztak [38].

A tüdő szénnanocső-expozíciója és az érrendszer oxidatív státusza közötti

összefüggést is vizsgálták. A szénnanocsövek intrafaringeális instillációja (10 és 40

μg/egér) az érrendszerben oxidatív válaszokat hozott létre, mely szerepet játszhat az

aterogenezisben. Az SWCNT ismételt expozíciója (20 μg/egér minden második héten

egy alkalommal, 8 héten át) stimulálta az ateroszklerózis progresszióját. Az in vivo és in

vitro elvégzett kísérletek azt bizonyítják, hogy a szénnanocsövek tényleges direkt és

indirekt oxidatív hatással rendelkeznek, amely feltehetőleg prediszponáló tényezőként

jelenik meg az aterogenezisben [34, 45, 46].

Shvedova az SWCNT citotoxikus és genotoxikus hatásait vizsgálta humán

keratinocita és bronhiális epiteliális sejteken, in vitro. Az SWCNT ultrastrukturális és

morfológiai elváltozásokat, a sejt integritásának elvesztését, apoptózist és oxidatív

stresszt okozott. A kapott adatok az sugallják, hogy az SWCNT expozíció dermális és

pulmonális toxicitást okozhat, az oxidatív stressz pedig az egyik legfontosabb

sejtkárosító mechanizmus [37]. Ahol felmerül az oxidatív stressz létrejöttének

lehetősége, ott a genotoxicitás lehetőségét sem hagyhatjuk figyelmen kívül [47].

Poland és mtsai kimutatták, hogy in vivo, az MWCNT-k – intraperitoneális

beadást követően (50 µg/egér) – az azbesztre jellemző gyulladásos választ és

granulomatózus elváltozások létrejöttét indukálják [48]. Más, hosszabb távú, in vivo

14

kísérletek az MWCNT-k egyszeri intraszkrotális (1 mg/ttkg) vagy intraperitoneális (3

mg/egér) dózisait követően mezotelióma kialakulását mutatták [49, 50].

Tehát a fenti kutatások az MWCNT-k potenciális karcinogén hatását

bizonyítják, azonban a mechanizmus alapjai nem ismeretesek [51].

A nanotechnológia számos ígérete ellenére a velejáró kockázati tényezőket is

figyelembe kell venni. Számos epidemiológiai bizonyíték gyűlt már össze az emberi

egészség és a különböző típusú – munkahelyi, beltéri, kültéri – részecskeexpozíciókat

illetően. Ilyen pl. az azbeszttel és egyéb rostokkal történő munkahelyi expozíciók és a

többlet daganatos halálozás (tüdőrák, mezotelióma) valamint az egyéb légzőszervi

megbetegedések közötti bizonyított összefüggés. A nanorészecskékkel kapcsolatban

még nincsenek ilyen vizsgálati eredmények, azok megszületéséhez nagyságrendileg

legalább egy évtized szükséges. Feltétlenül fontos tehát az expozíció mérését

megoldani, valamint az alapvető toxikológiai történéseket megérteni annak

eldöntéséhez, hogy szükségesek-e epidemiológiai vizsgálatok. Ma még az exponáltak

száma alacsony és a veszély bizonytalan, azonban az exponáltak száma előreláthatóan

emelkedni fog és a veszélyek analizálásával sem várhatunk [52]. Fontos lépés a

nanotermékek környezeti és egészségügyi hatásainak nyomon követése, hogy

kontrollálni tudjuk az előrehaladott technika és az ezzel járó károsító tényezők

egyensúlyát. Kutatómunkánkkal e sürgető problémának megoldására törekszünk.

Kutatásunk célja, hogy adatokat gyűjtsünk a szénnanocsövek lehetséges specifikus

toxikus hatásairól. Ehhez egyrészt klasszikus genotoxicitási vizsgálatokat alkalmaztunk,

melyekben a kémiai tisztaságú egy- és többfalú szénnanocsövek in vitro és in vivo

genotoxicitási tesztelését végeztük. Másrészt rostszerkezetű anyagok vizsgálatára

kifejlesztett in vivo krónikus, kontaktexpozíciós modellünkben [27] a potenciális

mezoteliómaindukáló hatást kutattuk. A modell in vivo vizsgálja a minta és a

mezotélsejtek közötti krónikusan fennálló direkt kontaktust. Alkalmazását a

szénnanocsövek azbeszthez hasonló rostos szerkezete és mérettartománya indokolta. A

kísérletek alatt további kihívást, technikai problémát jelentett a szénnanocsövek pontos

dozírozásának megoldása, mivel azok az oldószerben nem alkottak stabil, homogén

szuszpenziót, ezzel megakadályozva a megfelelő mérési eljárást.

15

2.4 PELOIDOK MUTAGÉN AKTIVITÁSÁNAK VIZSGÁLATA

BAKTERIÁLIS MUTAGENITÁSI TESZTBEN

A balneoterápia és balneoprevenció nagy népszerűségnek örvendő ága az

iszapkezelés. A gyógyiszapok (peloidok, pelos: sár, görög szó) a természetben

előforduló, ásványi és növényi eredetű anyagok, melyek finom szemcsézettségük,

vízkötő és hőtároló képességük folytán alkalmasak forró göngyölések készítésére vagy

hosszú ideig melegen maradó fürdők előállítására. Az iszapokat elsősorban

gyógyvizekkel keverve, iszappakolás, iszapfürdő stb. formájában szokták felhasználni

[53]. Az iszapkezelés indikációi igen sokoldalúak. Legelterjedtebben a reumás

mozgásszervi betegségek kezelésében használják [54, 55]. Számos európai országban a

balneoterápia a klinikai medicina része.

Bár a gyógyvizeket, gyógyiszapokat terápiás vagy prevenciós célból régóta

alkalmazzák, lehetséges mellékhatásaik ismeretlenek. Kevés információ áll

rendelkezésünkre gyógyító hatásuk bizonyítására is. A peloidterápia hatásosságának

megítélése elsősorban klinikai megfigyelésekre és tapasztalatokra épül, azonban az

irodalomban fellelhető vizsgálatok nagy része szinte teljes egészében leíró jellegű,

valamint módszertani hiányosságokkal küzd [56].

A peloidok humán szervezetre gyakorolt hatásai összetettek, fizikai, fiziko-

kémiai és kémiai sajátságokból eredeztethetők. Mindezidáig legtöbbet a peloidok

termofizikai hatásait vizsgálták. Sok kutató a peloidok terápiás hatásosságát majdnem

kizárólag termofizikai sajátosságainak tulajdonítja. Azonban jól ismert, hogy a

gyógyiszapok kialakulásában a magas hőmérsékletnek és a nagy nyomásnak

kulcsfontosságú szerepe van, amely nemcsak a terápiás szempontból kedvező

komponensek, hanem az esetlegesen toxikus, egészségre potenciálisan káros

alkotórészek kialakulásához is vezethet. Gyógyvizekben az utóbbi 10-20 évben számos

szerves molekulát találtak gázkromatográfia, nagynyomású folyadékkromatográfia,

valamint az ezekhez kapcsolt tömegspektrometria segítségével. Gyógyiszapokban való

jelenlétükről viszont kevés adat áll rendelkezésünkre, sem interakcióikat, sem pedig

pontos biológiai aktivitásukat nem ismerjük. Előfordulhatnak köztük genotoxikus és

egyéb toxikus anyagok is [57].

Az egészségügyről szóló 1997. évi CLIV. törvény 247. §-a (2) bekezdésének x)

pontja alapján az Országos Tisztifőorvosi Hivatal (OTH) engedélyezi a természetes

16

gyógyiszap megnevezést. „Természetes gyógyiszap az a természetes iszap, amelynek

összetétele ismert, az emberi egészségre ártalmas anyagot nem tartalmaz,

kitermelésének körülményei a közegészségügyi előírásoknak megfelelnek, és eredeti

összetételének minden megváltoztatása nélkül az adott felhasználási formában

tudományosan elismert gyógyhatással rendelkezik” [58]. Az engedélyeztetés során

csatolni kell többek között az iszapvizsgálat mikrobiológiai és teljes körű kémiai

vizsgálatát, valamint a gyógyhatás elbírálásához szükséges, emberen végzett

orvostudományi kutatások eredményeit, melyek igazolják, hogy az iszap az emberi

szervezet életműködésének javítására, vagy valamely betegség gyógyítására alkalmas

[59, 60]. Magyarországon – az ÁNTSZ 2012-es minősítése alapján – mindössze négy

helyen lelhető fel gyógyhatású iszap: Makón, Tiszasülynél („Kolopi iszap”),

Hajdúszoboszlón, és Alsópáhokon („Georgikon”) [61]. A 2007-es jelentés alapján még

a Hévízi tó iszapja is ide tartozott [62]. A 4.1.4.1 fejezetben táblázatokba fogalt adatok

az Országos Gyógyhelyi és Gyógyfürdőügyi Főigazgatóság archívumából származnak.

Azonban az ott fellelhető, avagy az interneten elérhető adatok minősége és mennyisége

nem elégíti ki a fenti rendeletben leírtakat. Hiányos mennyiségű információ áll

rendelkezésre pl. a gyógyiszapok mikrobiológiai tulajdonságairól, a szerves

komponensekről (a teljes körű kémiai vizsgálatról) vagy az orvosi vizsgálatokról. Az

ÁNTSZ 2012-es minősítése alapján Magyarországon az országos törzskönyvi

nyilvántartásba bekerült egy 5. iszap is, az ún. Neydharting gyógyiszap (Ausztria) [63].

A hivatalos magyar nyelvű honlapon [64] széles körű analitikai vizsgálatok és orvos-

balneológiai szakvélemény is található.

Munkánkban hazai gyógyiszapok (Hévíz, Kolop) lehetséges toxikus és

genotoxikus hatásait vizsgáltuk [65], amely kísérletsorozat hozzájárul a balneológia és

balneoterápia bizonyítékokon alapuló szintre emeléséhez. Célunk, hogy adatokat

gyűjtsünk a terápiás és preventív célra használt iszapok egészségi kockázatainak

becsléséhez, és új kísérleti módszert fejlesszünk az előkezelés nélküli peloidminták

lehetséges genotoxikus hatásának vizsgálatához.

17

3 CÉLKITŰZÉSEK

Az alábbi célkitűzéseket fogalmaztuk meg:

AZ 1-NITROPIRÉN IN VIVO MUTAGENITÁSVIZSGÁLATA, ILL. AZ ERRE ÉPÜLŐ KRÓNIKUS,

AZBESZTEXPOZÍCIÓS MODELL

o Hatásmechanizmus, potenciálisan mutagén metabolitok kiválasztási kinetikájának

megismerése és kockázatbecslés

o Új állatkísérletes modell kifejlesztése annak eldöntésére, hogy az azbesztrostok és a

mezotélsejtek között krónikusan fennálló, direkt kontaktus okoz-e mezoteliómát

o Környezeti expozíció modellezése 1-NP-vel előkezelt azbesztrostokkal,

komutagenitás és egyéb lehetséges kémiai ill. fizikai interakciók tanulmányozása

SZÉNNANOCSÖVEK POTENCIÁLIS GENOTOXICITÁSÁNAK ÉS


o Elsődleges adatok megszerzése a szénnanocsövek potenciális toxikus és genotoxikus

hatásairól, vagy azok kizárása

o Szénnanocsövek potenciális mezoteliómaindukáló hatásának kimutatása, ill.

környezeti expozíció modellezése 1-NP-vel előkezelt szénnanocsövekkel rostos

anyagok számára kifejlesztett in vivo krónikus, kontaktexpozíciós modellünkben

PELOIDOK MUTAGÉN AKTIVITÁSÁNAK VIZSGÁLATA BAKTERIÁLIS MUTAGENITÁSI

TESZTBEN

o Hazai gyógyiszapok (Hévíz, Kolop) lehetséges toxikus és genotoxikus hatásainak

vizsgálata, adatgyűjtés, kockázatbecslés

o Új kísérleti módszerek kifejlesztése az előkezelés nélküli peloid minták lehetséges

komplex genotoxikus hatásainak vizsgálatához

18

4 ANYAG ÉS MÓDSZER

4.1 ÁLTALÁNOS LEÍRÁS

4.1.1 SALMONELLA AMES MUTAGENITÁSI VIZSGÁLATOK

4.1.1.1 KLASSZIKUS, LEMEZÖNTÉSES MÓDSZER

Munkánkban számos minta vizsgálatát végeztük Salmonella Ames-teszttel [66].

Az egyik leggyakrabban alkalmazott bakteriális pontmutációk reverziójára épülő

rendszert világszerte alkalmazzák új kémiai anyagok és gyógyszerek mutagén

potenciáljának első vonalbeli meghatározására. Ezen kívül számos vegyi anyag

elfogadtatásához, nyilvántartásba vételéhez is használják.

Genetikailag módosított, hisztidin szintézisben gátolt mutáns Salmonella

typhimurium TA törzseit használtuk, mellyel kémiai anyagok, fizikai hatások, komplex

környezeti és biológiai minták mutagenitását lehet vizsgálni. (Ha a minta mutagén, a

minimális hisztidin tartalmú táptalajon a reverz mutációt szenvedett baktériumok ún.

„revertáns” telepeket hoznak létre 48 óra alatt, a telepszámok pedig a mutagenitás

erősségével növekszenek.)1 A konvencionális Ames-teszt [66] során kétféle Salmonella

typhimurium törzset használtunk a bakteriális pontmutációk vizsgálatára, melyek

ampicillin rezisztenciáért felelős plazmidot is tartalmaznak: a frame-shift mutációk

kimutatására TA98-as és a bázispárszubsztitúcióra érzékeny TA100-as törzset. A

baktériumtörzseket B.N. Ames (University of California, Berkley) biztosította.

A kísérlet során táplevesben (Oxoid nutrient broth) (25 g/dm3) történő szaporítás

után 100 µl baktériumtenyészetet (108 baktérium), a tesztanyagot, 0,4 ml pH 7,4

foszfátpuffert és 2 ml topagart rétegzünk minimál-glükózagar táptalajra, 3-3

párhuzamos lemezt öntünk. A topagar összetétele: 10 rész lágy agar (5 g NaCl, 6 g agar,

1 Minden egyes Salmonella typhimurium törzs különböző típusú mutációt hordoz a hisztidin operonban.

A DNS károsodást okozó mutagének számára ezek a mutációk különböző mechanizmusokon keresztül

ún. érzékenyített régióként („hot spot”) működnek. Ezen kívül a törzseket egyéb mutációk is jellemzik,

melyek elősegítik a mutagének detektálását (pl. rfa mutáció hatására nő a baktériumsejtfal permeabilitása;

uvrB-deléció következtében a DNS excíziós reparációs rendszert kódoló gén sérül, így számos mutagén

iránti szenzitivitás megnő; az R-faktor plazmid jelenlétekor a gyengén detektálható mutagének is

kimutathatók).

19

1000 ml desztillált víz és 1 rész hisztidin-biotin oldat (0,5/0,5 mM). A minimálagar

összetétele: 15 g agar, 20 ml 50X Vogel-Bonner médium E, 50 ml 40%-os glükóz és

930 ml desztillált víz. A Vogel-Bonner médium E (50X) összetétele: 10 g MgSO4 ·

7H2O, 100 g citromsavas monohidrát, 500 g K2HPO4, 175 g NaHNH4PO4 · 4H2O és

670 ml 45 °C-os desztillált víz. A lemezeket 48 óráig 37 °C-on inkubáljuk, majd

manuális módszerrel leolvassuk.

Sok vegyület csak enzimatikus aktiválás után válik mutagénné, ezért az in vitro

Ames-tesztben el kell végezni a vizsgált anyag metabolikus aktivációját is. Ehhez

patkánymájból preparált, aktiváló enzimeket tartalmazó, homogenizált májmikroszóma

– S9 – frakciót (9000 x g szupernatáns frakció) alkalmazunk, mely tartalmazza a máj

citoszolhoz vagy membránhoz kötött enzimjeit. Így a tesztet metabolikus aktivációval

(Aroclor 1254-el indukált Sprague-Dawley patkányok májából preparált metabolizáló

enzimekkel2) (4%-os töménységben) és anélkül is elvégezzük. (50 ml S9 mix

összetétele: 2 ml (4%) patkány máj S9 frakció, 1 ml MgCl2-KCl só, 0,25 ml 1 M

glükóz-6-foszfát, 2 ml 0,1 M NADP, 25 ml 0,2 M foszfát puffer, pH 7,4, 19,75 ml steril

desztillált víz.) Felhasználás előtt az S9 mix aktivitását B(a)P-nel (Sigma-Aldrich) (1

µg/lemez), mint indirekt mutagénnel teszteltük.

A vizsgálatoknál negatív- (ill. a megfelelő oldószeres és/vagy S9 mixet

tartalmazó kontrollokat) és pozitív kontrollokat is beállítunk. A baktériumtörzsek

mutagének iránti érzékenységét minden alkalommal a megfelelő diagnosztikus

mutagénekkel ellenőrizzük (TA98: 4-nitro-o-feniléndiamin [200%, DMSO-ban oldva],

TA100: nátriumazid [10%]). A törzsek ampicillin rezisztenciáját is ellenőrizzük. (Az

ampicillines lemez összetétele (1 dm3-re): 15 g agar, 910 ml desztillált víz, 20 ml 50X

VB só, 50 ml 40% glükóz, 10 ml steril hisztidin · HCl · H2O (2 g per 400 ml H2O), 6 ml

steril 0,5 mM biotin, 3,15 ml steril ampicillin oldat (8 mg/ml 0,02 N NaOH).)

A kezelt minták revertáns telepszámait a kontroll csoport revertáns

telepszámaival hasonlítottuk össze a normalitásvizsgálat függvényében Student-féle

kétmintás t-próba vagy Mann-Whitney próba segítségével, ahol a kezelt csoportban a

revertáns telepszámok kontrollhoz viszonyított statisztikailag szignifikáns pozitív irányú

eltérését tekintettük a mutagén hatás jelenlétének. A statisztikai szignifikancia

kritériuma: p<0,05.

2 Az állatkísérletek a Munkahelyi Állatkísérleti Bizottság működési szabályzatával összhangban történtek.

A hatósági engedély nyilvántartási száma: BA02/2000-23/2001 ill. BA02/2000-24/2006.

20

4.1.1.2 ELŐINKUBÁCIÓS AMES-TESZT

Ismét a fentiekben említett Salmonella typhimurium törzseket használtuk: a

frame-shift mutációk kimutatására alkalmas TA98-as és a bázispárszubsztitúcióra

érzékeny TA100-as törzset. Mivel számos mutagén anyag, főként a környezeti minták, a

konvencionális Salmonella Ames-tesztben nehezen detektálhatók, a standard eljárás egy

változatát, az érzékenyebb előinkubációs Ames-tesztet is alkalmazzuk [66]. Az

előinkubációs Ames-teszt során a tesztanyagok és a S. typhimurium baktériumok együtt

magasabb koncentrációban inkubálódnak, mielőtt a minimál-glükózagar lemezekre

kerülnének, szemben a hagyományos eljárással. A baktériumtenyészetből 100 µl-t, 0,4

ml pH 7,4 foszfátpuffert (vagy 0,5 ml S9 mixet) és a vizsgálandó mintát Eppendorf

csövekbe pipettázzuk. Az előinkubáció során a mintákat 37 °C-on 30-120 percig

inkubáljuk. Ezután hozzáadjuk a 2 ml topagarhoz és rárétegezzük a minimálagar

lemezre. 37 °C-on, 48 óráig inkubáljuk.

Minden esetben három párhuzamos lemezt készítünk. Az Ames-teszt megfelelő

pozitív és negatív kontrolljait alkalmazzuk (4.1.1.1 fejezet).

4.1.1.3 VIZELETMUTAGENITÁS AMES-TESZTBEN

Kezelt állatok vizeletmintái potenciális mutagén hatásainak vizsgálatára a

konvencionális lemezinkorporációs Salmonella Ames-tesztet alkalmaztuk [66].

Beltenyésztett (PTE-ÁOK, nem akkreditált, konvencionális, C-szintű állatház)

hím/nőstény F-344, 3 hónapos, kb. 100 g tömegű patkányokat hatosával a vizsgálat

paramétereinek megfelelő számú csoportba rendeztük (lásd Részletező leírás). Az

állatokat egyenként vizeletgyűjtésre alkalmas metabolikus ketrecekben helyeztük el. A

kezelendő állatcsoportok – előzetes 24 órás éhezés után – a tesztanyag adott dózisait

gyomorszondán (po.) át és/vagy intraperitoneálisan (ip.) kapták2. A kontroll csoportot

po. és/vagy ip. a megfelelő oldószerrel kezeltük. Az állatok tápot a metabolikus

ketrecben való tartózkodás alatt nem, csapvizet azonban ad libitum fogyaszthattak. Az

egyes állatok vizeletmintáit hűtés mellett (+ 4 °C), elkülönítve, steril vizeletgyűjtő

pohárban gyűjtöttük az első (/és a második) 24 óra során, majd csoportonként és

mintavételi idő szerint egyesítettük az oszlopkromatográfiás technikához szükséges

nagyobb térfogat eléréséhez. Meghatároztuk az egyes vizeletcsoportok

21

kreatininkoncentrációját, majd a hűtött és szűrt mintákat makroretikuláris műgyantával

töltött oszlopokon töményítettük (Sigma Amberlite XAD-4 és XAD-7, 1:1 v/v, Sigma-

Aldrich Kft., Budapest) [28, 67]. A preparálás eredményeként 10x-es töménységű,

dimetil-szulfoxidos eluátumokat kaptunk 1 mmol/l kreatininkoncentrációhoz

standardizálva.

A megfelelő vizeletkoncentrátumokból 100 µl-t adtunk a TA98-as és 100-as

törzsekhez. Három párhuzamos lemezzel dolgoztunk. A tesztet elvégeztük a ß-

glükuronidázt (250 U/lemez) és szulfatázt (100 U/lemez) tartalmazó standard

dekonjugációs enzimek jelenlétében (+DE), mely a genotoxicitást esetleg elfedő

kötésből felszabadítja a metabolitokat, ill. annak hiányában (-DE) is.

22

4.1.2 CITOGENETIKAI VIZSGÁLATOK

4.1.2.1 MIKRONUKLEUSZ TESZT3

5. ábra

Binukleált sejt mikronukleusszal, mikroszkópos felvétel (nagyítás: 400x)

Az in vitro mikronukleusz (MN) tesztet citokalazin-B módszerrel binukleált

(kétmagvú) sejteken, humán limfocita sejttenyészetben végezzük [68]. Vénapunkcióval

steril heparinos vérvételi csövekbe (BD Vacutainer) vett teljes vér 0,7 ml-éhez a 9 ml

tápfolyadék (RPMI 1640, összetétele: 500 ml RPMI-hez 125 µl penicillin, 25 mg

streptomycin, 75 ml FBS) bemérésekor a rendszerhez hozzáadjuk a vizsgálandó anyagot

és 200 µl fitohemagglutinint (növényi lektin), mely a sejtciklus G0 fázisába került

limfocitákat blasztos transzformációra, azaz osztódásra serkenti, ezáltal a limfociták

visszatérnek a sejtciklusba. Ezután 37 °C-on, nedves kamrában, 5% CO2-termosztátban

inkubáljuk. A fitohemagglutinin stimulációt követő 44. órában a limfocitatenyészethez

3 Mutáció során beszélhetünk pontmutációról, mely csupán egyetlen bázist érint, vagy több bázis

inszerciójáról, deléciójáról, mint ahogyan nagyobb méretű deléciókról, kromoszómatörésekről illetve

teljes kromoszómák elvesztéséről vagy többletéről is. A mikronukleusz teszt is annak a tesztrendszernek a

része, mely az új kémiai anyagok, fizikai tényezők genotoxikus hatásának tesztelésére hivatott. Olyan

kémiai anyagok mutagén hatásának kimutatására alkalmas, melyek interfázisban lévő sejtek

citoplazmájában megjelenő kromoszóma fragmentumok képződését okozzák. Ezek a DNS fragmentumok

számfeletti kromoszómából vagy kromoszómális törtvégekből (acentrikus fragmentumok) származó,

sejtmagként festődő ún. mikronukleuszok, melyek átmérője a mag átmérőjének kb. 1/5-1/20-ada, az

osztódás során egyik utódsejtmagba sem képesek integrálódni, a sejtmag mellett elkülönülten

helyezkednek el (5. ábra). Kromoszómatörést okozó (klasztogén) vagy extra kromoszómát eredményező

(aneugén) hatásra gyakoriságuk megsokszorozódik. A mutagén hatás vizsgálatához limfocitákat,

epiteliális sejteket használhatnak.

23

100 µl citokalazin-B-t adunk, mely a teljes magosztódás után blokkolja a sejtosztódást.

A 72. órában az interfázisba került sejtek nagy része kétmagvú. A centrifugálás és a

felülúszó eltávolítása után 0,56% KCl-dal 10 percig szobahőmérsékleten (20-25 °C)

hipotonizálunk, majd metanol:ecetsav 3:1 arányú keverékét cseppenként adagolva, 4-5

alkalommal fixálást végzünk. Minden alkalom után centrifugálunk, és a felülúszót

eltávolítjuk. 80 µl sejtszuszpenziót tárgylemezre cseppentünk, majd száradás után 3%-

os Giemsa-val 15 percig festjük. Megszámláljuk a citokinézisben blokkolt kétmagvú

sejteket. 1000 leszámolt sejtből adjuk meg a mikronukleuszok előfordulási arányát

(MN/1000 sejt, függetlenül a sejtekben található mikronukleuszok számától). Pozitív

kontrollként bleomycint használunk, negatív kontrollként a mintával nem-exponált

illetve az adott oldószerrel kezelt kultúrát. A statisztikai vizsgálatokat

normalitásvizsgálat után Student-féle páros t-próbával végeztük. A statisztikai

szignifikancia kritériuma p<0,05 volt.

4.1.2.2 TESTVÉRKROMATID-CSERE (SCE) ANALÍZIS4

Teljesen eltérő genetikai végpont vizsgálható a szintén a citogenetikai

módszerek közé tartozó, testvérkromatidok kicserélődésével (SCE) járó jelenséggel.

SCE-analízist bróm-dezoxiuridin (BrdU) + fluoreszcencia + Giemsa módszerrel

végzünk, 72 órás humán limfocita sejttenyészetben [69].

SCE kimutatása csak osztódó sejtekben lehetséges. Vénapunkcióval steril

heparinos vérvételi csövekbe (BD Vacutainer) vett teljes vér 0,7 ml-éhez 9 ml

tápfolyadék (RPMI 1640, összetétele: 500 ml RPMI-hez 125 µl penicillin, 25 mg

streptomycin, 75 ml FBS) és 100 µl BrdU bemérésekor a rendszerhez hozzáadjuk a

vizsgálandó anyagot és 200 µl fitohemagglutinint (növényi lektin). Ezután 37 °C-on,

nedves kamrában, 5% CO2-termosztátban inkubáljuk. A fitohemagglutinin-stimulációt

követő 70. órában a limfocitatenyészethez 20 µl kolhicint adunk, mely a mitózist

metafázisban leállítja (M2 fázis).

4 A perifériás limfociták in vitro tenyésztése során nukleozid-analóg (bróm-dezoxiuridin) beépülését

lehetővé téve, a szemikonzervatív replikáció következtében a második metafázisban (M2 fázis) a

testvérkromatidok differenciális festődését érhetjük el. Genotoxikus hatásra megnő a testvérkromatidok

homológ szakaszai közötti kicserélődés gyakorisága (6. ábra). A módszer igen érzékeny a hatásukat az S-

fázisban kifejtő anyagokra. Ismert, hogy a DNS-léziók csaknem mindegyike vezethet SCE

keletkezéséhez.

24

6. ábra

M2 fázis, testvérkromatidok differenciális festődése; SCE-k, mikroszkópos felvétel

(nagyítás: 1000x)

A 72. órában centrifugálással kezdünk, a felülúszó eltávolítása után 0,56% KCl-dal 40

percig szobahőmérsékleten (20-25 °C) hipotonizálunk, majd metanol:ecetsav 3:1 arányú

keverékét cseppenként adagolva, 4-5 alkalommal fixálást végzünk. Minden alkalom

után centrifugálunk, és a felülúszót eltávolítjuk. 80 µl sejtszuszpenziót tárgylemezre

cseppentünk, majd száradás után a kromoszóma-preparátumokon az SCE-ket módosított

fluoreszcens+Giemsa eljárással [70] tesszük láthatóvá. A lemezeket PBS-sel (8,76 g

NaCl, 0,095 g KH2PO4, 0,748 g K2HPO4, bidesztvízzel 1 l-re kiegészítve) 5 percig

kezeljük, 1 ml Hoechst 33258 (0,5 mg/ml) + 99 ml PBS-sel 10 percig festjük, majd

PBS-ben történő öblítés után fedőlemezzel fedjük. Kvarclámpával 60 perces UV-

besugárzást (13 cm távolságból) követően a fedőlemezt eltávolítjuk és a lemezeket 90

percig 60 °C-os tömény sóoldat (2x SSC: 0,3 M NaCl + 0,03 M Na-citrát) hatásának

tesszük ki, majd 3%-os Giemsával (foszfát pufferben) 10 percig festjük. Egy

tárgylemezen 25 teljes kromoszómaszámú (2n=46), M2 fázisban lévő sejtet értékeltünk.

Ezen kívül számláltuk az M1 és M3 fázisú sejtek előfordulási arányát is. Mindkét

csoportban 1000x-es nagyítással, fénymikroszkóposan vizsgáltuk a szétterült

kromoszómák testvérkromatidjai között történt terminális (=1 SCE) és intersticiális (=2

SCE) cseréket. Ezek gyakoriságát SCE/sejt egységben számoltuk, majd átlagoltuk.

Pozitív kontrollként etilmetán-szulfonátot használtunk, negatív kontrollként a mintával

nem-exponált illetve az adott oldószerrel kezelt kultúrát. A statisztikai vizsgálatokat

25

normalitásvizsgálat után Student-féle páros t-próbával végeztük. A statisztikai

szignifikancia kritériuma p<0,05 volt.

26

4.1.3 KRÓNIKUS, KONTAKTEXPOZÍCIÓS MODELL ROSTSZERKEZETŰ

ANYAGOKHOZ KÖTHETŐ MUTAGENITÁS ÉS KOMUTAGENITÁS

VIZSGÁLATÁRA

Egy specifikus in vivo krónikus, kontaktexpozíciós modellt fejlesztettünk ki

rostos szerkezetű anyagok (pl. azbeszt, szén nanocső) számára [27]. A modell lényege,

hogy a rostos szerkezetű anyagok és a mezotélsejtek közötti krónikusan fennálló, direkt

kontaktust vizsgáljuk potenciális mezoteliómaindukáló hatás kutatása érdekében. A

kísérlet kisszámú állatot igénylő egyszerű sebészi eljárásból áll. Az állatokat a

vizsgálandó, előkezelés nélküli rostmintával is exponáltuk, illetve a környezeti

expozíció modellezésére 1-nitropirénnel (1-NP) (Sigma-Aldrich) előkezelt rostokat

használtunk, mely az IARC szerinti 2B csoportba tartozó, lehetséges humán karcinogén,

és genotoxikus anyag [5, 28]. Az előkezelés során 10 mg rostmintát 1-NP telített vizes

oldatával 24 órán keresztül szobahőmérsékleten (20-25 °C) 300 percenkénti

fordulatszámmal (f/p) rázattunk. A rázatott mintákat nagy sebességgel addig

centrifugáltuk (6000 f/p), míg a rostok teljesen kiülepedtek. A felülúszót leszívtuk, és a

nedves rostot kiszáradásig 37 °C-os termosztátba helyeztük.

Beltenyésztett (PTE-ÁOK, nem akkreditált, konvencionális, C-szintű állatház)

hím/nőstény, 1 éves, kb. 400 g tömegű Wistar/Fischer 344 patkányokat hatosával öt

csoportba (előkezelés nélküli és előkezelt 2-féle rosttípus, negatív kontroll) rendeztünk.

Az expozícióhoz az ún. Kertai-féle zsebet („Kertai’s fold”; lig. hepatogastricum)

készítettük elő, mely a kiscseplesz egy ligamentuma, amely a nagy májlebeny (LLL: left

lateral lobe = lobus hepatis sinister lateralis) homorú felszínéhez csatlakozik.

Éternarkózist követően az állatot hátára fektetve rögzítettük. A mellkas alatt, középen,

hosszanti bemetszéssel megnyitottuk a hasüreget. A hasfalra gyakorolt enyhe nyomással

előtűnt a nagy májlebeny és annak belső oldalán preparáltuk a Kertai-féle zsebet. A

vizsgált előkezelés nélküli ill. 1-NP-vel előkezelt rostminták 10 mg-jait (10 mg/állat; 25

mg/ttkg) kemény zselatin kapszulába helyeztük, és a peritoneum kettőzetéből álló

zsebbe ültettük (7, 8. ábra). Két rétegben zártuk a hasüreget. Az állatokat

konvencionális állatházi körülmények között tartottuk, csapvizet és félszintetikus

táplálékot (CRLT/N rágcsálótáp; Szindbád Kft. keverőüzem, Gödöllő) kaptak ad

libitum. Negatív kontrollként a kozmetikai- és gyógyszeriparban ismert inert

cinkoxidport (PTE Egyetemi Gyógyszertár, Pécs) használtuk, melynek nincs

27

mezoteliómaindukáló hatása. 12 hónap elteltével a túlélő állatokat leöltük2 és boncoltuk,

és a májból ill. az elváltozásra gyanús szervekből (peritoneum, cseplesz) rutin

hisztopatológiai módszerek szerinti vizsgálatot végeztünk.

7. ábra

Kertai-féle zseb preparálása a nagy májlebeny belső felszínén. Az eszköz hegye a

képen a Kertai-féle zsebben helyezkedik el

28

8. ábra

Azbesztet tartalmazó keményzselatin-kapszula elhelyezése a Kertai-féle zsebben

29

4.1.4 PELOIDOK

4.1.4.1 HÉVÍZI ÉS KOLOPI GYÓGYISZAPOK, FIZIKAI, KÉMIAI, BIOLÓGIAI ADATOK

Hévízi5 [71, 72, 73] és kolopi6 gyógyiszapokat vizsgáltunk in toto, illetve

klasszikus talajkémiai eljárással [74].

A peloidminták fizikai, kémiai [75, 76, 77] és biológiai adatait az I-IV. táblázat

tartalmazza.

I. táblázat: A peloid minták publikált fizikai és kémiai adatai

Komponensek Komponensek aránya (m/m%)

Hévíz Vízoldható szervetlen frakció 14,44

Vízoldható szerves frakció 0,903

Kjeldahl nitrogén 3800 mg/kg

Hamu 23,9

Huminsav (össz) 50,3

Kolop Szervetlen frakció 93,04

Szerves frakció 1,53

5 A hévízi tó Európa legnagyobb felületű, meleg vizű gyógytava, az első világháború óta Magyarország

egyik legnépszerűbb gyógyhelye. A hévízi iszap a kevert peloidok csoportjába tartozik, mert jelentős

mennyiségben (20-25%) tartalmaz szerves anyagot (tőzeg) a szervetlen komponensek mellett. Az iszapot

eredetileg a tó medréből termelték ki, melynek alját 6-8 m vastagságban tőzeg béleli, és ezen a rétegen tör

felszínre a vulkanikus eredetű szervetlen iszap, mely keveredve a tőzeggel létrehozza a hévízi iszapot. Ma

már természetvédelmi okokból a kezelésre használt anyagot a tó elvezető csatornájából gyűjtik a

kezelésre használt anyagot.

Származási hely: Hévízgyógyfürdő és Szent András Reumakórház (minősítés száma: 34/Gyf/1972.,

nyilvántartási szám: VIII/3 [2007]) 6 A kolopi iszapot Tiszasüly település mellett a Tisza egykori medréből termelik ki. Ez a peloid minimális

szerves anyag tartalma miatt a szervetlen iszapok közé tartozik. Mintánkat a Harkányi Gyógyfürdő Rt.-től

kaptuk, ahol a kiszárított iszapot saját gyógyvizükkel keverve alkalmazzák.

Származási hely: Harkányi Gyógyfürdő (minősítés száma: OTH-GYÓGYF 187-2/2011, nyilvántartási

szám: VIII/2)

30

II. táblázat: A hévízi peloid minta kémiai komponensei és szemcsenagysága

Szervetlen (anorganikus) komponensek a hévízi iszapban

használatra kész állapotban

Vízoldható

(m/m%)

Sósavban oldható

(m/m%)

Sósavban nem

oldható

(m/m%)

Szemcsenagyság és

%-os megoszlása

SiO2 0,002 SiO2 0,94 SiO2 5,46 >1 mm 1,1%

CaO 0,21 CaO 20,25 CaO 0,04

MgO 0,03 MgO 1,29 MgO 0,01 1-0,63 mm 2,4%

Na2O 0,03 Na2O 0,004 Na2O 0,04

SO3 0,27 SO3 0,93 TiO2 0,04 0,63-0,32 mm 3,9%

CO2 0,18 CO2 14,5 Fe2O3 0,06

TiO2 0,002 Al2O3 0,17 0,32-0,20 mm 5,5%

Fe2O3 0,49 K2O 0,06

Al2O3 0,78 <0,20 mm 87,1%

K2O 0,09

Szerves anyag

Szárazanyagban

(m/m%)

Használatra készen

(m/m%)

Extraktbitumen 0,42 0,25

Vízoldható organikus anyagok 0,36 0,22

Könnyen hidrolizálható fehérje 0,64 0,38

Nehezen hidrolizálható fehérje 0,74 0,44

Hemicellulóz 2,25 1,35

Cellulóz 0,62 0,37

Huminsavak 7,82 4,68

Humuszkísérő anyagok 1,37 0,82

Humin + Lignin 11,84 7,08

Nem hidrolizálható nitrogén 0,4 0,24

Hexánkivonat 0,34 0,2

31

III. táblázat: A kolopi peloid minta kémiai komponensei és szemcsenagysága

Szárazanyag tartalom (m/m%) használatra kész állapotban

Szemcsenagyság és %-os megoszlása

SiO2 58,88 CaO 2,66 >0,02 mm 13,8%

MnO2 0,03 MgO 2,2 0,02-0,002 mm 18,1%

Al2O3 17 CaCO3 2,3 <0,002 mm 60%

Fe2O3 7,8 SO3 1,24 veszteség 8,1%

IV. táblázat: Iszapminták biológiai komponensei

hévízi (telep/g) kolopi (telep/g)

Össztelepszám 37 °C-on

Clostridium

Enterococcus

Coliform

2794

800

0

0

372

0

0

0

4.1.4.2 ELŐKEZELÉS NÉLKÜLI PELOIDOK

A sensu stricto előkezelés nélküli peloidok genotoxikológiai vizsgálatára az

érzékenyebb előinkubációs Ames-tesztet alkalmaztuk [66] (4.1.1.2 fejezet).

A hévízi és kolopi peloidokat használatra szánt állapotukban tároltuk, a kísérlet

előtt szárítószekrényben (Heraeus T 5042) 105 °C-on tömegállandóságig szárítottuk,

majd autoklávban sterileztük (120 °C, 20 perc, 105 Pa). (A sterilezés eredményessége

ellenőrzött.) A steril peloidokat a S. typhimurium baktériumtörzsekkel 30-60-120 percig

inkubáltuk 37 °C-on. A peloidok három dózisával dolgoztunk: 20-40-80 mg/108

baktérium. Az előinkubációs periódus végén a mintákat 800/perc fordulaton 8 percig

centrifugáltuk, majd a 108 baktériumot tartalmazó felülúszót a topagarhoz adtuk.

Három párhuzamos lemezt készítettünk. Az Ames-teszt megfelelő pozitív és

negatív kontrolljait alkalmaztuk (4.1.1.1 fejezet).

32

4.1.4.3 PELOIDKIVONATOK

Az in toto vizsgálatok negatív eredményei után kivonatokat is készítettünk. A

gyógyiszapok kivonatainak vizsgálatára a konvencionális Salmonella Ames-tesztben

TA98 és TA100-as törzseket használtunk (4.1.1.1 fejezet). A tesztet metabolikus

aktivációval (Aroclor 1254-el indukált Sprague-Dawley patkányok májából preparált

metabolizáló enzimekkel [S9 mix]) és anélkül is elvégeztük (S9+/-) [66].

A peloidokat szárítószekrényben (Heraeus T 5042) 105 °C-on

tömegállandóságig szárítottuk. A négyféle peloidkivonat elkészítéséhez rendre

desztillált vizet, 0,1N-os sósavat, metanolt (AR: analytical reagent, Sigma-Aldrich),

illetve toluolt (ALT: analitikai tisztaságú, Interkémia Zrt., Budapest) használtunk. A 20

grammnyi iszapmintákat 1 órán keresztül 100 ml oldószerrel rázattuk, majd leszűrtük

(pórusátmérő: 0,45 µm) [74]. Az extraktumokat három dózisban teszteltük: 100, 66, 33

μl/lemez (108 baktérium). Negatív kontrollnak a megfelelő oldószereket használtuk. Az

Ames-teszt megfelelő pozitív kontrolljait alkalmaztuk (4.1.1.1 fejezet). Három

párhuzamos lemezt készítettünk.

A kísérletet három hónap elteltével megismételtük. Az iszapmintákat

hermetikusan lezárt tartályokban, szobahőmérsékleten (20-25 °C) tároltuk.

V. t

áblá

zat:

A d

olgo

zatb

an is

mer

tete

tt vi

zsgá

lato

k ös

szef

ogla

ló tá

bláz

ata

Vi

zsgá

lati

típus

ok

Alka

lmaz

ott m

ódsz

erek

An

yagc

sopo

rtok

Se

jtkul

túrá

k,

biol

ógia

i re

ndsz

erek

Kísé

rlet t

arta

ma

Keze

lési

mód

in v

itro

Stan

dard

Sal

mon

ella

Am

es-te

szt

MW

CNT,

SW

CNT

S. ty

phim

uriu

m

TA98

, TA1

00

48 h

100,

50,

25

µl/le

mez

cc

. 0,0

1 m

g/µl

M

WCN

T cc

. 0,0

02 m

g/µl

SW

CNT

pelo

idki

vona

tok

48 h

10

0, 6

6, 3

3 μ

l/le

me

z

Elő

inku

bác

iós

Am

es-te

szt

MW

CNT

1 h

elő

inku

b. +

48

h

5, 1

0 m

g/le

mez

pelo

idok

30

-60-

120

perc

e

lőin

kub

. + 4

8 h

20

, 40,

80

mg/

lem

ez

Cito

gene

tikai

vi

zsgá

lato

k

MN

MW

CNT,

SW

CNT

hu

mán

lim

foci

ták

72 h

10

m

g/sz

öve

tte

nyé

sztő

cs

ő

cc. 1

mg/

ml

SCE

72 h

kom

bin

ált

in

vitr

o/in

viv

o V

izel

etm

uta

gen

itás

Am

es-te

sztb

en

1-N

P p

atká

ny

n=6

álla

t/cs

op

ort

vi

zele

tmin

ta

S. ty

phim

uriu

m

TA98

, TA1

00

24 h

, 48

h po

., ip

. 30

µm

ol/t

tkg

MW

CNT,

SW

CNT

24 h

po

. 50

mg/

ttkg

in v

ivo

Kró

nik

us,

ko

nta

ktex

po

zíci

ós

mod

ell

krok

idol

it, k

rizot

il,

+/- 1

-NP

pat

kán

y n

=6 á

llat/

cso

po

rt

12

hó

nap

25

mg/

ttkg

M

WCN

T, S

WCN

T,

+/-

1-N

P

33

34

4.1.5 STATISZTIKAI MÓDSZEREK SALMONELLA AMES-TESZT

ÉRTÉKELÉSÉHEZ

Az Ames-teszt eredményeinek értékelése során több statisztikai és nem

statisztikai módszert is figyelembe vettünk, mivel egyetlen egy, kizárólagosan jól

működő rendszer nincsen. A Salmonella Ames-teszt segítségével végzett mutagenitási

vizsgálatok értékelésében számos statisztikai lehetőséget használnak az egyes kutatók is

[78]. Az eltérő statisztikai elemzések alkalmazásának oka a mind pontosabb

információnyerés igénye. A klasszikus értékelési módszer – a kontroll átlagához

viszonyított kétszeres telepszám módszere, a „kétszeres” szabály – nem sugall szilárd

tudományos megalapozottságot, hiszen matematikai értelmezésben több csoport

számtani átlagának összevetéséről van szó. A középértékek összehasonlítására számos

statisztikai módszer áll rendelkezésre, melyek biológiai rendszerek értékelésében is jól

használhatók más mérési területeken, így jogos az igény e módszerek felhasználására az

Ames-teszt esetében is.

Egy 1995-96-ban végzett felmérés [78] eredményeként az említett két év során

publikált kutatások 40%-ban alkalmazták a kétszeres szabályt, 3%-ában a t-próbát, 9%-

ában ANOVA módszert, a legkisebb négyzetek módszerét (alapszintű lineáris

regressziós modell) a kutatások 11%-ában, 20%-ában egyéb lineáris regressziós modellt

és 17%-ában egyéb, nem besorolható módszereket használtak.

A választott elemzések sokfélesége a statisztikai módszerek matematikai

előfeltételeinek megléte mellett arra enged következtetni, hogy az egyes mutagenitási

vizsgálatok során kapott revertáns telepszámok matematikai eloszlásai eltérnek, nem

mutatnak egyezőséget a különböző kutatások során. Ennek hátterében a biológiai

rendszerek sokszínűsége is állhat, így joggal vetődik fel, hogy a kapott eredmények

értékelésében nem jelenthető ki csakis egyetlen módszer megalapozottsága. A

statisztikai módszerekkel történő összehasonlítások során az egyes módszerek

matematikai hátterének megléte esetén jó eséllyel kapunk megbízható eredményt a

módszerek alkalmazási feltételeinek szigorú követésével.

A számos statisztikai számítási módszer erősségeit egyesítve több számítógépen

futtatható alkalmazás készült (AMESFIT, SALM stb.) ezzel is egyszerűsítve a kutatók

munkáját. A tapasztalat azonban azt mutatja, hogy még e programok sem tekinthetők

minden szempontból, minden vizsgálat esetén teljesen megbízható módszernek.

35

Az a tény azonban igazolható, hogy számos esetben a kétszeres szabály [79]

alkalmazásával (mely egyes Salmonella törzsek esetében az alacsony spontán mutációs

ráta miatt háromszoros szabályra módosul) nem mutatható ki a mutagén hatás olyan

esetekben, ahol a statisztikai szoftverek illetve más elemzési módszerek szignifikáns

különbséget jeleznek.

Több kutató elengedhetetlennek tartja a dózis-hatás összefüggés igazolását is a

mutagenitási vizsgálatok alkalmazásával [80, 81, 82]. Ez részben megvalósítható a

kétszeres szabály alkalmazásával is, ugyanakkor szerencsésebb választás lehet a lineáris

regressziós modellek vagy egyéb statisztikai próbák alkalmazása. Az Ames-teszt

esetében alkalmazott párhuzamos kísérleti elrendezések gyakran alacsony száma

nehezíti az értékelés pontosságát és megbízhatóságát. A három párhuzamos lemezzel

végzett tesztek esetében a biológiai rendszer sajátosságából adódóan egyes törzseknél az

elemszámok szórása olyan nagymértékű lehet, hogy a statisztikai elemzés

eredményeként nem mutatható ki szignifikáns összefüggés olyan esetben sem, ahol a

kísérleti elrendezés és hipotéziseink alapján azt várnánk.

A megválasztott – legtöbbször 5%-os – szignifikancia határ is tartalmazza a

hibás értelmezés, a nullhipotézis téves elvetésének valószínűségét éppen az esetek 5%-

ában. A körülmények figyelembe vételével – például egy várt dózis-hatás összefüggés

csak részleges megléte, vagy a mutagenitás dózistól független jelentkezése illetve nem a

hatáserősségnek megfelelően csak egyes dózisok esetében történő megléte – a teszt

értékelhetőségének egyéb feltételeinek betartása mellett (pl. háttérhomogenitás

vizsgálata, pozitív és negatív kontrollok megléte) az álpozitív vagy éppen az álnegatív

eredmény kiszűrését teszi lehetővé. Felvetődik persze annak a lehetősége is, hogy az

adott elemszámok és eloszlások mellett más statisztikai próba alkalmazása megfelelőbb

eredménnyel járhat, ugyanakkor a statisztikai kritériumoknak megfelelő, a megfelelő

paraméterekkel rendelkező minták esetében lényegi eltérés nem várható más statisztikai

próba alkalmazásától sem.

36

4.2 RÉSZLETEZŐ (AZ EGYES MÓDSZEREKNÉL ALKALMAZOTT)

LEÍRÁS

4.2.1 KÍSÉRLETI ELRENDEZÉS (2.2)


Beltenyésztett nőstény, 3 hónapos, kb. 100 g tömegű F-344 patkányokat

hatosával négy csoportba rendeztünk (po. és ip. 1-NP, po. és ip. oldószeres kontroll). Az

állatokat egyenként helyeztük el vizeletgyűjtésre alkalmas metabolikus ketrecekben. Az

egyik kezelendő csoport egyszeri 30 µmol/ttkg 1-NP-t (CAS No. 5522-43-0, Sigma-

Aldrich, tisztaság: 99%) kapott kukoricacsíra-olajban (corn-oil, Sigma-Aldrich),

gyomorszondán keresztül (po.), míg a másik kezelt csoport ugyanezt a dózist

intraperitoneálisan (ip.) kapta. A két kontroll csoportot csak az oldószerrel kezeltük po.

illetve ip. A vizeletmintákat hűtés mellett, elkülönítve gyűjtöttük az első és a második

24 óra során külön-külön. A továbbiakban a 4.1.1.3 fejezetben leírtak szerint jártunk el.

A konvencionális lemezinkorporációs Ames-tesztet alkalmaztuk a vizeletminták

mutagenitásának vizsgálatára [66] (4.1.1.1 fejezet). A vizelet-koncentrátumokból

100 μl-t adagoltuk a Salmonella TA98 ill. 100-as törzset tartalmazó két-két lemezhez

[67].

4.2.1.2 KRÓNIKUS, KONTAKTEXPOZÍCIÓS MODELL

Az UICC azbesztmintákat (krokidolit és rodéziai krizotil) Rendall és Timbrell

(SPI Supplies, Glamorgan, UK) biztosította [17]. Kémiai tisztaságú és 1-NP-vel

(Sigma-Aldrich) előkezelt mintákat használtunk. Az azbesztrostokkal történt

kutatásaink során korábbi HPLC eredmények igazolják a felülethez kötött anyagok

jelenlétét [25]. Beltenyésztett hím, 1 éves, kb. 400 g tömegű Wistar patkányokat

rendeztük hatosával öt csoportba (továbbiakban lásd 4.1.3 fejezet).

37


Az egyfalú- (SWCNT) és a többfalú szénnanocső (MWCNT) minták az MTA

Központi Kémiai Kutatóintézetéből származnak (Gyártó: Shenzhen Nanotech. Port Co.,

Ltd. Kína). Az SWCNT átmérője <2 nm, hossza 5-15 µm, tisztasága: 90 vol%; az

MWCNT hossza 1-2 µm, átmérője, 10-30 nm, tisztasági foka: 95-98 vol%.

4.2.2.1 SALMONELLA AMES MUTAGENITÁSI VIZSGÁLATOK

4.2.2.1.1 Klasszikus, lemezöntéses módszer

Mutagén hatásra vonatkozó kísérleteink egy részében a klasszikus, lemezöntéses

eljárást alkalmaztuk [66] (4.1.1.1 fejezet).

A topagarba különböző koncentrációjú szénnanocsöveket mértünk, majd MGM

táptalajra öntve 37°C-on 48 óráig inkubáltuk. Törzsoldatunkban 1 ml toluolban

diszpergáltunk 10 mg MWCNT-t. Ebből háromféle koncentrációt mértünk be, 100 µl,

50 µl és 25 µl-t. Mindegyik esetben 3-3 párhuzamost használtunk. Ugyanezt tettük az

SWCNT-vel is azzal a különbséggel, hogy a törzsoldatban, ebben az esetben 5 ml

toluolban sikerült felvenni 10 mg SWCNT-t. A toluolra is készítettünk egy 9 táptalajból

álló hígítási sort az előbb említett koncentrációknak megfelelően azzal a céllal, hogy

összevessük a toluol önmagában adott mutagenitási értékeit a toluolban oldott

szénnanocsövek eredményeivel.

4.2.2.1.2 Előinkubációs Ames-teszt

A standard eljárás egy változatát, az érzékenyebb előinkubációs Ames-tesztet

alkalmaztuk [66] (4.1.1.2 fejezet) a szükségesnek vélt változtatásokkal.

A toluolt kihagytuk a további kísérletekből. Eppendorf csövekbe mértük az

MWCNT-t (5 mg illetve 10 mg mennyiségben) a baktériumtenyészetet és a puffert,

azután 1 órán keresztül inkubáltuk. Az így kapott elegyünket hozzáadtuk a topagarhoz,

majd a minimál-glükózagar lemezekre öntöttük. 37 °C-on 48 óráig inkubáltuk. Minden

esetben három párhuzamos lemezt készítettünk.

38

4.2.2.1.3 Vizeletmutagenitás Ames-tesztben

A szénnanocsöveket félfolyékony Carbopol-gélben, mágneses keverő

segítségével diszpergáltuk [83]. Beltenyésztett hím, kb. 100 g tömegű Fischer-344

patkányokat hatosával három csoportba rendeztünk. Az állatokat egyenként helyeztük el

vizeletgyűjtésre alkalmas metabolikus ketrecekben. Gyomorszondán át két csoportot

SWCNT és MWCNT 50 mg/ttkg egyszeri dózisával kezeltük. A harmadik, kontroll

csoport csak carbopol-gélt kapott. A vizeletmintákat hűtés mellett (4 °C), elkülönítve

gyűjtöttük az első 24 óra során. A további lépések a 4.1.1.3 fejezetben.

4.2.2.2 CITOGENETIKAI VIZSGÁLATOK

40 ml félfolyékony Carbopol-gélben diszpergáltunk 400-400 mg-ot mindkét

típusú szénnanocsőből (MWCNT, SWCNT). A szénnanocsövek gélben való egyenletes

eloszlatásához mágneses keverőt alkalmaztunk. Mikroszkópos homogenitásvizsgálatot

végeztünk. A vérmintákat három egészséges donorból vettük lítium–heparint

tartalmazó, steril, zárt vérvételi rendszerbe (BD Vacutainer). Mindegyik esetben 3

kontroll és 3 exponált mintát elemeztünk. A kísérletekben – az előkísérleteknél

szokásos módon – a praktikusan (kitapadás, homogenitás, átlátszóság, kiülepedés)

bemérhető legnagyobb dózist alkalmaztuk, mivel LD50 érték stb. nem álltak

rendelkezésre.

Az in vitro mikronukleusz (MN) tesztben (4.1.2.1 fejezet) a vizsgált

sejtkultúrákhoz a tápfolyadék bemérésekor 10 mg MWCNT-t illetve SWCNT-t 1 ml

gélben diszpergálva adtunk (a végkoncentráció: 1 mg/ml).

A testvérkromatid-csere (SCE) tesztben (4.1.2.2 fejezet) ismételten 10-10 mg

MWCNT-t, ill. SWCNT-t adtunk hozzá a vizsgált sejtkultúrákhoz (végkoncentráció: 1

mg/ml).

39

4.2.2.3 KRÓNIKUS, KONTAKTEXPOZÍCIÓS MODELL

10 mg előkezelés nélküli ill. 1-NP-vel előkezelt SW- és MWCNT-vel

exponáltuk saját tenyésztésű F-344 nőstény patkányok hattagú csoportjait (előkezelés

nélküli SW- és MWCNT, előkezelt SW- és MWCNT, ZnO-os kontroll) (4.1.3 fejezet).

40


Megegyezik a 4.1.4.2 és 4.1.4.3 fejezetekben leírtakkal.

41

5 EREDMÉNYEK

5.1 AZ 1-NITROPIRÉN IN VIVO MUTAGENITÁSVIZSGÁLATA, ILL.

AZ ERRE ÉPÜLŐ KRÓNIKUS, AZBESZTEXPOZÍCIÓS MODELL

5.1.1 VIZELETMUTAGENITÁS AMES-TESZTBEN

Szignifikanciavizsgálat történt a kezelt (po. és ip. 1-NP) és a kontroll (po. és ip.

kukoricaolaj) csoport mintái, valamint a kezelt csoportok enzimes (+DE) és enzim

nélküli (-DE) mintái között. Statisztikailag szignifikáns (p<0,05) mutagenitást a TA98-

as törzsben az ip. és a po. kezelt csoport első 24 órában begyűjtött vizeletmintáiban

tudtunk kimutatni. Azonban, míg az ip. csoportban az enzimatikus bontás

(dekonjugáció) nem befolyásolta az eredményt, addig a po. kezelt csoportnál csak a

dekonjugáló enzimek jelenlétében jelentkezett szignifikáns mutagenitás (p=0,031). A

TA100-as törzsben viszont csak az ip. kezelés okozott erősen szignifikáns (p=0,002;

0,010) mutagén hatást az első 24 órás vizeletmintáknál. Ez a mutagenitás mind az

enzimek jelenlétében, mind hiányában jelentkezett (+DE vs. -DE), de a dekonjugáció

szignifikánsan tovább fokozta a megjelenő mutagenitás erősségét (p=0,003). Viszont

sem a 48 órás ip. minta, sem a 24- és 48 órás po. minták nem mutattak pozitivitást a

TA100-as törzsben (VI. és VII. táblázat).

42

VI. táblázat: 1-NP-vel intraperitoneálisan vagy per os kezelt F-344 patkányok

vizeletmintáinak mutagenitási vizsgálatai Salmonella Ames-tesztben TA98-as

törzsben

Kez

elés

i mód

Viz

elet

gyűj

tés

(h)

Csoportok

TA98

(-DE),

revertáns

telepszám

(átlag ±SD)

p

(kontroll vs.

kezelt)

TA98

(+DE),

revertáns

telepszám

(átlag ±SD)

p

(kontroll

vs. kezelt)

p

-DE vs.

+DE)

ip. 0-

24 1-NP 155,9±29,9 0,024 * 219,4±38,4 0,024 * 0,080

Kontroll 18,9±7,1 17,9±3,9

24-4

8 1-NP 25,6±10,1 0,295 79,2±56,0 0,383 0,321

Kontroll 15±3,5 35±7,0

po.

0-24

1-NP 41,6±8,0 0,120 35,9±2,7 0,031 * 0,443

Kontroll 72,5±14,6 16,3±4,2

24-4

8 1-NP 63,9±11,6 0,194 618,0±291,3 0,195 0,115

Kontroll 99,6±23,4 154,0±178

*szignifikáns különbség (p<0,05)

VII. táblázat: 1-NP-vel intraperitoneálisan vagy per os kezelt F-344 patkányok

vizeletmintáinak mutagenitási vizsgálatai Salmonella Ames-tesztben TA100-as

törzsben

Kez

elés

i mód

Viz

elet

gyűj

tés

(h)

Csoportok

TA100

(-DE),

revertáns

telepszám

(átlag ±SD)

p

(kontroll vs.

kezelt)

TA100

(+DE),

revertáns

telepszám

(átlag ±SD)

p

(kontroll

vs. kezelt)

p

-DE vs.

+DE)

ip.

0-24

1-NP 808,5±27,2 0,002 * 1168,5±2,7 0,010 * 0,003 *

Kontroll 325,3±4,1 677,0±74,9

24-4

8 1-NP 471,6±91,6 0,282 1011,2±418 0,335 0,212

Kontroll 362,5±53,0 640,5±59,4

po.

0-24

1-NP 359,5±13,4 0,364 269,4±28,0 0,829 0,055

Kontroll 317,5±49,2 236,3±108,6

24-4

8 1-NP 377,0±61,2 0,397 302,8±20,4 0,071 0,245

Kontroll 310,5±57,3 492,5±72,8

*szignifikáns különbség (p<0,05)

43

5.1.2 KRÓNIKUS, KONTAKTEXPOZÍCIÓS MODELL

A kémiai tisztaságú és 1-NP-vel előkezelt azbesztmintákkal exponált

állatcsoportok boncolása során makroszkóposan kékesszürke azbesztfelhalmozódás

látható a hasüregben: a Kertai-féle zsebben és a környező szervek felszínén, az

omentumon és a peritoneumon. A különböző azbesztmintákkal exponált állatcsoportok

valamennyi tagjának májából készített szövetminták hisztológiai vizsgálata csupán

megtartott szerkezetű májállományt, idegentest típusú granulomatózus reakciót és

többmagvú óriássejteket mutatott ki (9, 10. ábra). Az exponált ill. a ZnO-dal kezelt

negatív kontroll csoportban mezoteliómára utaló jeleket sem makroszkóposan, sem

mikroszkópos vizsgálattal nem detektáltunk. A ZnO-dal kezelt kontroll csoport

májszövetében idegentest típusú granulomatózus reakciót nem észleltünk. A kísérlet

vége előtt elhullott vagy moribund patkányokat felboncoltuk. (Az elhullás: egy kontroll

és egy a kezeletlen krizotil csoportból.) A hasűri szervek az eltávolítást követően

patológiai vizsgálatra kerültek (PTE-ÁOK Pathologiai Intézet), mezoteliómára utaló

szövettani elváltozásokat nem észleltünk.

9. ábra

Idegentest típusú granulomatózus reakció (fehér nyilak) a patkány májszövetében,

mikroszkópos felvétel (nagyítás: 200x)

44

10. ábra

A májszövet heges állományában, kikapcsolt kondenzor mellett jól láthatóak az

azbesztrostok (fekete nyíl), és idegentest típusú, többmagvú óriássejtek (sárga

háromszög). A fekete szemcsék formalinpigmentnek felelnek meg (fehér nyíl).

Fáziskontraszt-mikroszkópos felvétel (nagyítás: 400x)

45

5.2 SZÉNNANOCSÖVEK POTENCIÁLIS GENOTOXICITÁSÁNAK ÉS


5.2.1 SALMONELLA AMES MUTAGENITÁSI VIZSGÁLATOK

5.2.1.1 KLASSZIKUS, LEMEZÖNTÉSES MÓDSZER

Az alkalmazott bakteriális mutagenitási tesztben (Ames-teszt) első megoldandó

problémáink közt szerepelt a szénnanocsövek homogén diszpergálása. Kísérleteinkhez

diszpergáló közegként a toluolt használtuk. A rendszerből a szénnanocsövek gyakran

kitapadtak az eszközökhöz és edényekhez, pontos adagolásuk így lehetetlenné vált.

Másrészt a toluol megzavarta a biológiai rendszert, a vártnál nagyobb mutagenitási

értékeket produkált, ezért a nanocsövekkel együtt történő használatra alkalmatlannak

bizonyult. Gyakorlatilag a toluol hatását mértük, függetlenül attól, hogy mennyi és

milyen típusú szénnanocső volt még jelen a rendszerben. Példaként közöljük a TA98-as

törzzsel kapott eredményeinket (11. ábra). A diagramon fel nem tüntetett koncentrációk

esetében a háttérhomogenitás hiánya miatt a telepszámok értékelhetetlenek voltak.

11. ábra

Klasszikus, lemezöntéses Ames-teszt eredményei (átlagos telepszám +SD)

Salmonella typhimurium TA98-as törzsön, kétféle szénnanocső (A: MWCNT; B:

SWCNT), kétféle dózis: 25 ill. 50 µl/lemez

15,33

26,0028,33

22,00

26,00

0

5

10

15

20

25

30

35

40

Neg.kontroll

A/25 A/50 B/25 Toluol/25

Átl

ago

s te

lep

szám

46

5.2.1.2 ELŐINKUBÁCIÓS AMES-TESZT

Szignifikáns eltérést a toluol elhagyásával az előinkubációs tesztben sem

tapasztaltunk Az előinkubáció általában előhívja a lemezöntéses technikával nem

detektálható enyhe mutagén hatásokat. Esetünkben azonban a módszer nem juttatott

plusz információhoz, kivéve, hogy toluol elhagyásával sem tapasztaltunk mutagenitást.

Példának a TA100-as törzs eredményeit mutatjuk be a többfalú csövek esetében (12.

ábra).

12. ábra

Az előinkubációs Ames-teszt eredményei (átlagos telepszám +SD) MWCNT-vel

Salmonella typhimurium TA100-as törzsön, kétféle dózis: 5 ill. 10 mg/lemez


Statisztikailag szignifikáns mutagenitást (p<0,05) nem észleltünk sem a TA98-

as, sem a 100-as törzs esetén. A nanocsövek típusától az eredmények függetlenek

voltak, és a vizeletminták enzimatikus dekonjugálása sem befolyásolta azokat (13, 14.

ábra).

139,33

176,00164,33

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Neg. kontroll 5mg MWCNT 10mg MWCNT

Átl

ago

s te

lep

szám

47

A bakteriális mutagenitási vizsgálatok tehát negatív eredménnyel zárultak, azaz

sem bázispárszubsztitúciós, sem pedig kereteltolódásos mutációkat nem sikerült

kimutatnunk a Salmonella rendszerben.

13. ábra

SW- és MWCNT-vel kezelt és kontroll (po. carbopol-gélt kapott) csoportok

vizeletmintáinak standardizált mutagenitása (átlagos telepszám +SD) TA98-as

Salmonella törzsben

48

14. ábra

SW- és MWCNT-vel kezelt és kontroll (po. carbopol-gélt kapott) csoportok

vizeletmintáinak standardizált mutagenitása (átlagos telepszám +SD) TA100-as

Salmonella törzsben

5.2.2 CITOGENETIKAI VIZSGÁLATOK

5.2.2.1 MIKRONUKLEUSZ TESZT

A mikronukleusz (MN) tesztben MWCNT-kezeléssel kapott eredményeinket a

15. ábra szemlélteti. A binukleált sejtek gyakoriságát a kezelés nem befolyásolta, mely

annyit jelent, hogy a tesztanyagnak nem volt a citogenetikai értékelést befolyásoló

toxikus hatása a tenyészetekre, (mivel a sejtkultúrákban a vizsgált anyag potenciális

citotoxikus hatása is kimutatható). Ilyen esetben a toxikus anyag megakadályozza, hogy

a mitogén által osztódásra serkentett sejtek a sejtciklus G0 fázisából G1 fázisba

kerüljenek [84]. Az adatokból páros t-próbával statisztikailag szignifikáns különbséget

(p<0,05) nem találtunk a kezelt és a negatív kontroll (carbopol-géles) eredmények

összehasonlítása során. Mivel a mikronukleuszok számfeletti kromoszómából vagy

kromoszómális törtvégekből származhatnak, eredményeink alapján klasztogén és

aneugén hatás sem igazolható a vizsgált magas MWCNT-koncentrációnál. Az azonos

dózisú SWCNT-kezelés azonban határozott mitózisgátlást jelzett, amely a kétmagvú

sejtszám nagyfokú csökkenése miatt lehetetlenné tette a számlálást.

49

15. ábra

A párosított negatív kontroll és MWCNT-exponált minták átlagai között nincs

statisztikailag szignifikáns (p<0,05) eltérés

5.2.2.2 SCE-ANALÍZIS

Az SCE-analízist megelőzően először az osztódási kinetikát hasonlítottuk össze

a negatív kontroll (carbopol-géles) és a kezelt tenyészetekben, a BrdU-beépülés alapján

(16. ábra). Az MWCNT esetében szignifikáns eltérést nem találtunk, az SCE-analízis

elvégezhető volt. Azonban az SWCNT-vel kezelt esetekben az osztódási kinetika teljes

M1 irányú eltolódását tapasztaltuk, mely az értékelést nem tette lehetővé.

Eredményeinket a 17. ábra szemlélteti: az adatok alapján páros t-próbával igazolható

SCE-gyakoriság emelkedését nem tapasztaltunk.

50

16. ábra

M1:M2:≥M3 fázisú sejtek megoszlása a negatív kontroll és az MWCNT-vel kezelt

tenyészetekben a BrdU-beépülés alapján (átlag +SD)

(M1: 1. metafázis, M2: 2. metafázis, M3: 3. metafázis)

17. ábra

Kontroll és kezelt minták SCE átlagai +SD (MWCNT)

≥

51

5.2.3 KRÓNIKUS, KONTAKTEXPOZÍCIÓS MODELL

Mezoteliómára utaló elváltozásokat sem makroszkóposan, sem mikroszkóposan, a

kezelt és a kontroll csoportban sem észleltünk. A patkányokat – abban az esetben, ha

betegnek látszottak vagy elhullottak, ill. a 12 hónap elteltével a túlélőket – felboncoltuk. (A

beültetést követő 23. napon egy MWCNT+NP, a 6. hónapban egy MWCNT, a 10.

hónapban egy SWCNT+NP implantált patkány hullott el. Egy MWCNT+NP beültetett

patkányt pedig moribund státusza miatt a 10. hónapban leöltünk.) A szervek az eltávolítást

követően patológiai vizgálatra kerültek (PTE-ÁOK Pathologiai Intézet). Az elhullások

okaként természtes halál került megállapításra.

A 12. hónapban történt boncolások során minden esetben makroszkóposan a

beültetés helye körüli szervekre (nagycseplesz, peritoneum, vékonybél serosa)

szétszóródott szénkonglomerátumokat (18. ábra) és a máj peritoneum borítéka alatti nagy

mennyiségű széndepozitumokat észleltünk. Egyéb makroszkópos eltérést, mint pl. hasűri

folyadékgyülem (ascites), nekrózis, nem detektáltunk. A talált elváltozások (pl. ciszták,

lipóma) hisztológiai vizsgálata megtörtént. A májmetszeten idegentest típusú

granulomatózus reakciót, többmagvú óriássejteket, szénszemcséket bekebelező

makrofágokat láttunk, melyeket kötőszövetes sövények határoltak el az ép szövettől.

Mindkét szénnanocső kezelés hasonló elváltozásokat eredményezett (19. ábra). A ZnO-dal

kezelt kontroll csoport májállománya ép volt.

52

18. ábra

Szénkonglomerátumok a patkány peritoneumán (fehér nyíl)

53

19. ábra

A kép felső részén megtartott szerkezetű májállományt lehet megfigyelni, míg az

alsó részen a szénpor (hosszú nyíl) indukálta idegentest-típusú granulomatózus

reakció (epitheloid sejtek, óriássejtek [rövid nyíl]) látható (mikroszkópos felvétel,

nagyítás: 400x)

54

5.3 PELOIDOK MUTAGÉN AKTIVITÁSÁNAK VIZSGÁLATA

BAKTERIÁLIS MUTAGENITÁSI TESZTBEN

5.3.1 ELŐKEZELÉS NÉLKÜLI PELOIDOK

Statisztikailag szignifikáns mutagenitást nem észleltünk sem a hévízi, sem a

kolopi peloid mintáknál (20.a-d ábra).

20.a ábra

Frame-shift mutagenitás (átlagos telepszám +SD) a hévízi peloid mintában TA98-

as törzsben

55

20.b ábra

Bázispárszubsztitúciós mutagenitás (átlagos telepszám +SD) a hévízi peloid

mintában TA100-as törzsben

20.c ábra

Frame-shift mutagenitás (átlagos telepszám +SD) a kolopi peloid mintában TA98-

as törzsben

56

20.d ábra

Bázispárszubsztitúciós mutagenitás (átlagos telepszám +SD) a kolopi peloid

mintában TA100-as törzsben

5.3.2 PELOIDKIVONATOK

5.3.2.1 1. SOROZAT

A hévízi iszap főleg szervetlen oldószeres oldatai: sósavas kivonat TA98-as

törzsben (21.a ábra), illetve vizes és sósavas kivonatok TA100-as törzsben (21.b ábra)

metabolikus aktiváció után statisztikailag szignifikáns mutagenitást mutattak.

57

21.a ábra

Hévízi kivonatok a kereteltolásos mutációra érzékeny törzsnél

* statisztikailag szignifikáns (p<0,05) mutagenitás

21.b ábra

Hévízi kivonatok a bázispárszubsztitúcióra érzékeny törzsnél


A hévízi iszap főleg szerves oldószeres kivonatai közül: a toluolos extraktum

TA98-as törzsben, metabolikus aktiváció után (21.a ábra), illetve a metanolos extraktum

0,041 0,034

0,027 0,019 0,035

0,009

0,018

58

TA100-as törzsben, metabolikus aktivációval és anélkül is (21.b ábra) mutagénnek

bizonyult (p<0,05).

A kolopi iszap vizes és sósavas kivonatai esetében a TA98-as törzsnél nem

észleltünk eltérést (21.c ábra). Azonban ezek a kivonatok a TA100-as törzsnél

szignifikáns mutagenitást mutattak metabolikus aktiváció után (21.d ábra).

21.c ábra

Kolopi kivonatok a kereteltolásos mutációra érzékeny törzsnél

59

21.d ábra

Kolopi kivonatok a bázispárszubsztitúcióra érzékeny törzsnél


A kolopi iszap metanolos és toluolos oldatai enzimatikus aktiváció után

mutagénnek bizonyultak a TA100-as törzs esetében (21.d ábra). A TA98-as törzs

alkalmazásakor a szerves anyagokat tartalmazó kivonatokban nem tapasztaltunk eltérést

(21.c ábra).

5.3.2.2 2. SOROZAT

A hévízi peloid kivonatai közül TA98-as törzsnél a sósavas oldat metabolikus

aktiváció nélkül (S9-) szignifikáns mutagenitást mutatott (p<0,05) (22.a ábra). A

TA100-as törzsnél szignifikáns eltérést nem tapasztaltunk (22.b ábra).

0,017

0,003

0,0040,021

0,025

0,014

60

22.a ábra

Frame-shift mutagenitás a hévízi peloid mintánál


22.b ábra

Bázispárszubsztitúciós mutagenitás a hévízi peloid mintánál

A kolopi iszap esetén a TA98-as törzsnél, metabolikus aktiváció nélkül (S9-) a

vizes és metabolikus aktiváció után (S9+) a metanolos kivonat, míg a TA100-as

0,008 0,027

61

törzsnél, metabolikus aktiváció után (S9+) a sósavas kivonat mutatott statisztikailag

szignifikáns különbséget a megfelelő oldószeres kontrollhoz képest (22.c,d ábra).

A második kísérletsorozatban a toluolos kivonatok minden koncentrációban

toxikusnak minősültek, melynek lehetséges oka a mikrobiális aktivitás.

22.c ábra

Frame-shift mutagenitás a kolopi peloid mintánál


0,002

0,031

62

22.d ábra

Bázispárszubsztitúciós mutagenitás a kolopi peloid mintánál


0,026

63

6 MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉSEK

Szilárd (rostos és nem rostos) részecskék expozíciójával számos helyen

találkozhatunk melynek hatására különböző krónikus, nem fertőző

betegségcsoportokkal kell szembesülnünk, mint az asztma, krónikus obstruktív

tüdőbetegségek, kardiovaszkuláris megbetegedések, vagy akár fibrózis illetve a

különböző ráktípusok. Napjainkban is számos részecsketípus képezi a kutatások alapját.

A század új kihívása a szilárd halmazállapotú, finomszemcsés anyagok (mint pl. elemi

szálak, nanotechnológiai termékek) széles spektrumának feltérképezése.

Dolgozatomban 3 teljesen eltérő szilárd részecske specifikus genotoxicitását

vizsgáltam növekvő mérettartományban. A nanométeres nagyságrendű, méretükben,

alakjukban az azbesztrostokhoz nagyon hasonló, de eltérő biológiai aktivitást mutató

szénnanocsöveket, az elektronmikroszkópos mérettartományban lévő, ismerten

karcinogén azbesztrostokat, és a 200 µm-nél kisebb szemcseméretű gyógyiszapokat. A

genotoxikológiai tesztelés és a rákkockázatbecslés szempontjából a rostos és nem rostos

részecskék a „klasszikus toxikus” anyagokhoz képest egy speciális csoportot képeznek,

fizikai-kémiai tulajdonságaik különböznek a már „hagyományos” kémiai

karcinogénekétől. A legnagyobb hansúlyt legjelentősebb közös tulajdonságukra kell

fektetni, a felszínükhöz kötött szerves anyagok potenciális jelenlétére! A rostos

szerkezetű anyagok nagy fajlagos felületük miatt számos lehetséges mutagént képesek

megkötni, de a nem rostos részecske típusú anyagok is hordozhatnak policiklusos

aromás szénhidrogéneket és egyéb mutagén komponenseket.

Amennyiben környezeti mintákat vizsgálunk, abban az esetben a megfigyelt

következmény a felszínen hordozott anyagokkal állhat kapcsolatban. Az

azbesztrostokkal történt kutatásaink során korábbi HPLC eredmények [15, 25] igazolják

a felülethez kötött anyagok jelenlétét, mellyel párhuzamosan alakultak a genotoxicitási

vizsgálatok eredményei is. E tapasztalatokat a szénnanocsövek kutatása során is

felhasználtuk. A gyógyiszapok felszínéhez kötődő kémiai anyagok kivonatainak

frakcionálását követő eredményeink is ezt az elméletet támasztják alá.

Vizsgálatainkat a karcinogén 1-nitropirén in vivo mutagenitási vizsgálatával

kezdtük, mellyel egy potenciális azbesztexpozíció modelljét készítettük el.

64

Az 1-NP genotoxikus aktivitását már számos módszerrel bizonyították [5, 85]. A

TA98 és 100-as Salmonella-törzsek nem igényeltek metabolikus aktiválást a

mutagenitás kimutatásához [86], míg nitroreduktáz-deficiens sejteket felhasználva in

vitro mutagenitási tesztekben csak metabolikus aktiválás után lehetett pozitivitást

kimutatni [87]. Ez utóbbi tény a nitro-csoport fontosságára hívja fel a figyelmet. Élő

állatok kezelésekor eltérő viselkedést tapasztalhatunk különböző expozíciós

körülmények között. Az in vivo vizsgálatok szerint pl. a bélflóra játszik jelentős szerepet

az 1-NP 1-aminopirénné történő átalakításában, melynek már nincs mutagén hatása

[85]. A patkánymáj aerob viszonyok között kimutatható mértékben gyűrűoxidációs

termékeket is termel, továbbá DNS-adduktumok megjelenését is előidézi [85]. Az ip.

kezelt patkányok vizelete szintén mutagénnek bizonyult Salmonellában [88]. In vivo

citogenetikai vizsgálattal pedig genommutációt (aneuploidiát) egyszeri 30 mmol/ttkg

dózissal ip. kezelt CBA/Ca egerekből sikerült leírni [89].

Az állatkísérletek során összegyűlt bizonyítékok alapján az 1-NP IARC szerinti

2B csoportba tartozó, lehetséges humán karcinogénnek tekinthető [5]. A tüdőtumoron

kívül egyéb malignus elváltozásokat is okoz, pl. emlő-, gyomor-bélrendszeri tumorokat

vagy leukémiát [5, 85, 90]. Mind a rövid-, mind a hosszútávú állatkísérletek bizonyos

gének (Ha-ras, c-myc, p53) expressziójának megemelkedését is jelezték a

legkülönbözőbb szövetekben [20, 21, 91].

A jelen kísérletek során, ugyanazzal a kezelési protokollal, amelyet korábban

citogenetikai és génexpressziós vizsgálatokban is alkalmaztak [20, 21, 91], a

kiválasztott vizelet mutagenitását igazoltuk. A TA100-as törzs használatával, mely

bázispárszubsztitúcióra érzékeny, a mutagenitás csak az első 24 órában jelentkezett az

ip. kezelést követően. Az 1-NP mutagén metabolit(ok) mindenképpen konjugált

formában is jelen volt(ak) ebben a vizeletmintában, hiszen a dekonjugáció a

mutagenitás újabb szignifikáns növekedésével járt. A po. kezelés kizárólag a TA98 által

kimutatható frame-shift mutagén(ek) megjelenéséhez vezetett a vizeletben, mely(ek)et

dekonjugáció mellett tudtunk kimutatni az első 24 órában. A második 24 órában a

vizeletminták már nem mutattak mutagén hatást, vagyis a mutagén 1-NP metabolitok 24

óra alatt kiürültek.

Ezek az eredmények azt bizonyítják, hogy a biotranszformáció jellegét

nagymértékben befolyásolja az expozíció módja. A po. kezelés a kockázatbecslés

szempontjából fontos, mivel ez a környezeti 1-NP-expozíció lehetséges formáját

modellezi. A szituáció nagyban hasonlít tehát a karcinogén azbesztrostok esetéhez, mely

65

esetben a rostokhoz kötött molekulák bekerülhetnek a gasztrointesztinális rendszerbe

[11].

Minthogy a „kereskedelmi méretű” belégzett azbesztrostok jelentős része végül

lenyelésre kerül és a rostok felületén policiklusos aromás molekulák nagy számban

lehetnek jelen, mindkét anyagcsoport kockázatbecslésekor figyelembe kell venni a

lehetséges interakciókat. A vizelet mutagenitási mintázatának előzetes

meghatározásával egy használható modellt dolgoztunk ki. Az állatmodell alkalmazható

a genotoxikus kölcsönhatások vizsgálatára (a) rosthoz kötött nitroarén orális expozíciója

esetén; (b) akut, 24 órás kísérletben. Minthogy az átlagpopuláció főleg orálisan, a

gasztrointesztinális traktuson keresztül exponálódik a különböző típusú részecskékhez

kötött nitroarénekkel, az itt ismertetett, orális kezelési mód hatékonyabbá teheti a

kockázatbecslés folyamatát az ilyen jellegű karcinogén légszennyezők esetében.

Az 1-nitropirén in vivo mutagenitási vizsgálatában kapott eredményeket

felhasználtuk az újonnan kifejlesztett in vivo krónikus, kontaktexpozíciós

modellünkhöz, melyben előkezelés nélküli, illetve a környezeti expozíció modellezésére

1-nitropirénnel előkezelt azbesztrostokat használtunk.

Az amfibolok által szállított aktív vasionok folyamatosan képződő reaktív

oxigénfajtákat hoznak létre, amelyek kapcsolatban állnak a rosttoxicitással és hatással

vannak a DNS-re és a fehérjékre [92]. A ferroionok helyettesíthetik a magnéziumot a

krizotil rostokon. Az azbeszt karcinogén hatásának alapját a DNS-károsodások, a

célsejtek proliferációjának és differenciálódásának változásai képezhetik. Több

mezoteliómában is kromoszómatöréseket és tumorszupresszor gének elvesztését

mutatták ki. Azbeszt expozíció hatására számos jelátviteli út (NK-κB, PKC és MAPK-

ERK 1/2) aktiválódik [93, 94, 95].

Humán mezotél sejttenyészeteket az azbesztrostok nem transzformáltak,

melynek lehetséges magyarázata citotoxikus hatásukban keresendő. Az in vivo

transzformációt a mezotélsejtek krokidolit expozíciót követő TNF-α kibocsátása

magyarázhatja. A TNF-alfa mediálja az NK-kappaB aktivitást, csökkentve a rostok

citotoxicitását, és elősegíti a károsodott mezotélsejtek proliferációját [93]. Korábbi

kísérletekben Varga és mtsai patkányokban arénszármazékkal előkezelt 50 mg/ttkg

krokidolit és antofillit rostok citogenetikus aktivitását mutatták ki, a csontvelősejtek

testvérkromatid-kicserélődés gyakoriságának szignifikáns növekedését állapították meg.

A tesztben a kémiai tisztaságú rostok nem bizonyultak genotoxikusnak [14, 25]. Orális

66

expozíció során patkányok csepleszből és vékonybélből izolált mezotélsejtjeinek

nagymértékű DNS-száltörései mutatkoztak. Ezt a hatást a rostok előkezelése

szignifikánsan emelte [16].

Jelen in vivo vizsgálatunkban azonban még az azbesztrostok mezotélsejtekre

közvetlenül ható, krónikusan fennálló expozíciója sem indukált peritoneális

mezoteliómát. Mivel független tanulmányokban [14, 16, 25] az előkezelt rostok

(krokidolit, antofillit + benz[a]pirén) kogenotoxicitást mutattak, saját in vivo

kísérleteinkben nem erre az eredményre számítottunk. Ez a megfigyelés arra enged

következtetni, hogy a mezotelióma kialakulásának mechanizmusa független lehet a

rostok és a mezotélsejtek fizikai kontaktusától.

Ezt követően különböző módszerekkel a nanométeres tartományba eső, az

azbesztrostokhoz igen hasonlatos, újnak mondható anyagcsoport, a szénnanocsövek

potenciális genotoxicitását és mezoteliómaindukcióját vizsgáluk az azbesztrostok

kutatása során megszerzett ismeretanyag felhasználásával és összevetésével.

A rostszerű anyagok biológiai hatását három fontos tényező befolyásolja:

hosszuk, átmérőjük és perzisztenciájuk. A rendelkezésre álló irodalmi adatok szerint a

nanorészecskék néhány fajtájának fokozottabb gyulladáskeltő hatása van, mint az

azonos anyagból álló nagyobb mérettartományba sorolható részecskéknek. Általánosan

elfogadott, hogy az oxidatív stressz vezet gyulladáshoz, mely gyakran együtt jár a

genotoxicitással. A nagy felület, a rajta megkötött fémek és szerves anyagok mind

szerepet játszhatnak ezekben a folyamatokban [32].

Előkísérleteink során a vizsgált nanocsövek esetében pontmutációt előidéző

hatást bakteriális rendszerben nem észleltünk. Az irodalomban található adatok alapján

SWCNT- és MWCNT-k vizsgálatát Ames-tesztben mindezidáig csak néhányan

végeztek, mutagén hatást egyik esetben sem mutattak ki [96, 97, 98]. Vizsgálataink

során klasztogén, aneugén illetve SCE-gyakoriságot befolyásoló hatás emberi sejtek

tenyészetében nem volt kimutatható. Az SWCNT típusú csövek sejttoxikusnak

bizonyultak a tenyészetekben, legalábbis végpontként a mitózisgátlást vizsgálva. Annak

ellenére, hogy a szénnanocsövek Ames-tesztben nem mutattak mutagenitást, a

citogenetikai vizsgálatok közül a mikronukleusz tesztben, illetve az üstökös

elektroforézis vizsgálattal is többen pozitív eredményt kaptak. (Ez főként a strukturális

defektussal rendelkező, vagy fémmel szennyezett szénnanocsövekre igaz.) [96, 99, 100,

101, 102]. Ugyanakkor – főként a nagy tisztaságú nanocsövek tesztelésekor – ezeknek

67

ellentmondó eredmények is születtek kromoszóma aberrációs-, mikronukleusz tesztben

és üstökös elektroforézis vizsgálatban [96, 98, 103]. Az eltérések és ellentmondások

magyarázatául szolgálhat az eltérő módszertan illetve az különböző tulajdonságú és

tisztaságú szénnanocsövek alkalmazása. Az irodalomban egyelőre nincsenek teljes

mértékben egyező módszertanú és ezáltal összehasonlítható vizsgálatok. Éppen ezért

nagy szükség lenne egy olyan egységes vizsgálati modellre, mint amilyet már az azbeszt

esetén kidolgoztak (UICC standard azbesztek) [17].

A kombinált in vivo/in vitro vizeletmutagenitási tesztünkben a patkányok

csoportjait p.o. SWCNT és MWCNT 50 mg/ttkg egyszeri dózisával kezeltük. Ez a dózis

tízszerese volt az irodalomban fellelhető intratracheális instillációval adagolt

legnagyobb mennyiségnek. A jelenlegi legmagasabb orális dózis (Swiss) egerekben

>1000 mg/ttkg [104]. Mint ahogyan korábbi vizsgálatunkban, az in vitro Ames-tesztben

is [47], ez utóbbi esetben is negatív eredményeket kaptunk.

A szénnanocsövek által okozott genotoxikus hatás lehet elsődleges, ha

közvetlenül hat a DNS-re, illetve másodlagos, mely pl. gyulladás vagy

szabadgyökképződés során jöhet létre. A szénnanocsövek által okozott citotoxicitás

egyik legfontosabb mechanizmusának az oxidatív stressz tekinthető. Számos kísérletben

vizsgálták a CNT-k direkt mutagén képességét, azonban jelenleg az eredmények nem

meggyőzőek [42].

Bár in vitro előkísérleteinkben MWCNT okozta citogenetikus hatást (klasztogén,

aneugén, SCE-indukáló hatás) nem detektáltunk, SWCNT azonos dózisainál specifikus

citotoxikus hatást és mitotikus gátlást figyeltünk meg. Mivel az előkísérletben

dózisfüggést nem vizsgáltunk, csupán annyit állíthatunk, hogy a rendszerbe vitt dózis

citotoxikus hatást eredményezett, mely gátolta a genotoxicitásvizsgálatot. Oxidatív

stressz vagy szabadgyökképző hatások kimutatására az itt alkalmazott tesztek

feltehetőleg nem elég érzékenyek. Éppen ezért nagyobb felbontású citogenetikai és

egyéb vizsgálatok (mint pl. célszövetek in vivo sejtszintű DNS-mikrogélelektroforézise

(Comet assay) [16], vagy a Salmonella typhimurium mást törzseivel való tesztelés) több

információt nyújthatnak.

A széles skálán mozgó méretbeli eltérések, a nagy felület:tömeg arány és a

jelentős mértékű adszorpciós kapacitás a szénnanocsövek értékelésében döntő

fontosságú. Ebből kifolyólag a vegytiszta nanocsövek vizsgálata nem feltétlenül

elégséges ahhoz, hogy a kockázatbecsléshez a valósághoz közelebbi, megfelelő

adatokat kapjunk. Így nem szabad elhanyagolni azokat a problémákat sem, amelyekkel

68

az azbesztrostok kockázatbecslése során már szembesültünk: a méret:fajlagos felület

megoszlása és a rostok által megkötött anyagok szoros összefüggést mutathatnak a

kialakuló végső egészségügyi hatásokkal.

Egy speciális tumorféleség, a mezotelióma kialakulását in vivo karcinogenitási

vizsgálatunkban sem kémiai tisztaságú, sem NP-nel előkezelt csövek esetében nem

észleltük. Módszerünkkel a zselatinkapszula felszívódása után a mezotélsejtek

közvetlen közelébe juttattuk a csöveket, miként más esetben az azbesztrostokat vagy a

cinkoxidot. (A szénnanocsöveket fölöslegben kell adni. A bevitt anyagmennyiséget csak

a kapszula térfogata korlátozza.) Tehát ha fizikai karaktere és a közvetlen kontaktus

következtében az anyag mezoteliómát lenne képes indukálni, akkor ezt észleltük volna.

(Az ásványi rostok – bronchus-karcinómától független – pleurális és peritoneális

mezoteliómaindukáló hatása jól ismert.)

A szénnanocsövek potenciális egészségkárosító hatása ma is vitatott [44, 105,

106]. Az irodalomban megtalálható karcinogenitási vizsgálatokat illetve ezek saját

kísérleteinkre vonatkozó összefüggéseit a következőkben ismertetjük.

Poland és munkatársai [48] egerek hasüregébe ip. injekcióval szénnanocsöveket

juttattak. Rövid távú, 7 napig tartó kísérletben megfigyeléseik során arra a

következtetésre jutottak, hogy a gyulladásos proteinek, a sikertelen („frustrated”)

fagocitózis következtében termelődő, fagolizoszómából származó toxikus anyagok és

granulómák jelenléte bizonyíték mezotelióma típusú daganat kialakulására. Ez a

feltételezés azonban bizonytalan alapokon áll. A granulómaképződést úgy értelmezni,

mint a mezotelióma kialakulásának korai biomarkerét, koncepciójában helytelen.

Hiszen számos xenobiotikum és idegen test képes granulomatózus elváltozásokat

indukálni későbbi mezotelióma kifejlődése nélkül is, amely egyébiránt egy igen ritka és

specifikus tumorféleség. Tekintetbe véve a kísérletet végzők megfigyeléseit

elmondhatjuk, hogy a rendkívül rövid távú granulóma indukció nem egyértelműen

támasztja alá a szénnanocsövek mezoteliómát okozó hatását vagy az azbesztszerű

patogenitást. A p53 génkiütött („knock-out”) egerekben MWCNT-vel okozott

mezotelióma [50] szintén kevés bizonyítékul szolgál, mivel az azbeszt által okozott

daganatkeltés kulcslépése a szupresszorgén inaktivációja [11], illetve ebben a

kísérletben így eleve nagyobb a rák kialakulásának veszélye is. Saját munkánkban az

előzőeket figyelembe véve azonban genetikailag intakt (genetikailag nem módosított)

állatokat használtunk; az SW- és MWCNT-k magasabb dózisait alkalmaztuk (10

mg/állat = 25 mg/ttkg); mind kémia tisztaságú, mind pedig 1-NP-vel előkezelt CNT-kel

69

dolgoztunk; a nanocsövek olyan mérettartományait választottuk, melynek karcinogén

potenciálja inkább valószínűsíthető; ezen kívül hosszútávú megfigyelési időszak (12

hónap) és a mezotélsejtekkel való jól definiált, direkt és folyamatos kontaktus

jellemezte a kísérleteket. Azonban még e szigorú körülmények között sem észleltük

mezotelióma kialakulását, csupán idegentest típusú granulomatózus reakciót, epiteloid-

és többmagvú óriássejteket detektáltunk.

Eredményeink Sakamoto és munkatársai megfigyeléseivel sincsenek

összhangban [49]. A szerzők egyszeri intraszkrotális 1 mg/ttkg dózisú MWCNT

injekció beadását követően extrém magas (85,7%) mezotelióma előfordulást detektáltak

az 52 hetes vizsgálati periódus alatt. Azonban a krokidolit azbeszt, mely a mezotelióma

legpotensebb előidézője, azonos körülmények között vizsgálva egyáltalán nem okozott

mezoteliómát.

Muller és munkatársai (2009) MWCNT-vel végzett korábbi vizsgálataik során

[99, 107] tüdőben gyulladásos, granulomatózus, fibrotikus elváltozásokat detektáltak;

illetve ugyanaz az MWCNT epiteliális sejtekben in vitro és in vivo is mutációt okozott.

Azt tapasztalták, hogy a strukturális defektusokat tartalmazó szénnanocsövek

jelenlétéhez kapcsolódik az észlelt gyulladásos válasz és genotoxicitási aktivitás is. A

gyulladás, a mutáció és a rák közötti már ismert, szoros kapcsolat hatására ezt követő

tanulmányukban [108] patkányok hasüregébe juttatták a strukturális defektusokkal

rendelkező szénnanocsöveket, hogy megvizsgálják azok karcinogén potenciálját. 24

hónap elteltével sem észleltek mezoteliómaindukciót. Azonban a pozitív kontrollként

használt krokidolit esetében az állatok 34,6%-nál alakult ki mezotelióma.

Egyre több adat érhető el a szénnanocsövek potenciális káros hatásainak

vizsgálatáról. Egymás után jelennek meg különböző tanulmányok, összefoglaló

közlemények a nanotermékek tulajdonságait taglalva [39, 44, 109, 110, 111, 112]. A

változatos paraméterek miatt azonban nem egyszerű az információk megfelelő

interpretálása. Esetünkben a karcinogenitást tekintve az eredmények helytelen

értelmezése nem kevés veszélyt is hordozhat magában, főként a kockázatbecslés

jelenlegi, korainak mondható stádiumában. A csekély számú rendelkezésre álló,

azonban talán félreértelmezett eredmények [48] alapján a szénnanocsövek környezeti és

népegészségügyi kockázatait nem lehet megfelelő módon felbecsülni. In vivo

tanulmányunkban még a szénnanocsövek mezotélsejtekre ható, hosszútávú, direkt

expozíciója sem indukált peritoneális mezoteliómát. Ebből kifolyólag eredményeink

nem jeleznek számottevő kockázatot, főként az azbesztrostokhoz képest. Azonban a

70

szénnanocsövek daganatot okozó hatását nem zárhatjuk ki. Az eddigi kutatások között

emberre vonatkozó, élettanilag releváns expozíciós utat értékelő, karcinogén hatásokat

vizsgáló tanulmány egyelőre még nem elérhető. A pontosabb expozíció és

kockázatbecslés érdekében még több adatra van szükség.

A még nagyobb mérettartományba tartozó peloidoknál is – környezeti mintákról

lévén szó – a felületükhöz potenciálisan kötődő kémiai anyagok jelenlétéből, illetve a

lehetséges kogenotoxikus hatásból indultunk ki.

Kísérleti módszereink fejlesztésének célja az volt, hogy peloidmintákat

előkezelés nélkül (in toto) tudjuk vizsgálni, hogy ebben a formában okoznak-e mutációt

a baktériumtörzsekben. Annak ellenére, hogy a Salmonella Ames-teszt érzékenyebb

formáját, az előinkubációs Ames-tesztet alkalmaztuk, a peloidminták egy dózisa

esetében sem kaptunk statisztikailag szignifikáns eredményt. Ennek oka lehet, hogy a

módszer korlátozza a rendszerbe vihető mintamennyiséget. A probléma kiküszöbölésére

a gyógyiszapok szerves és szervetlen kivonatait készítettük el.

A két egymást követő kísérletsorozatban klasszikus talajkémiai eljárással

frakcionáltuk a kivonatokat. Mind a szerves, mind a szervetlen kivonatok számos

frakciója mutatott statisztikailag szignifikáns mutagenitást metabolikus aktivációval és

anélkül is.

Mindkét peloidkivonatos kísérletben több statisztikailag szignifikáns eltérést

tapasztaltunk metabolikus aktiváció (S9+) alkalmazása mellett (14), mint anélkül (4).

Tehát az indirekt mutagének jelenléte mindkét iszapmintában jelentős.

Szervetlen oldószerek (desztillált víz, sósav) használata esetén kétszer több (12)

statisztikailag szignifikáns eredményt kaptunk, mint a szerves oldószereknél (metanol,

toluol) (6), mindkét kísérletben és peloidmintánál. (A szervetlen oldószerek ugyanis

hidrofil szerves anyagokat is oldhatnak.)

A Hévízi tóból származó gyógyiszap szerves anyag tartalma jelentős (20%) [73],

emiatt magasabb mutagén aktivitást vártunk.

A kolopi gyógyiszap a szervetlen iszapok csoportjába tartozik, rendkívül kevés

szerves anyagot tartalmaz [76]. Azonban mindkét gyógyiszap esetén azonos számban

fordultak elő mutagén frakciók.

A TA100-as törzsnél metabolikus aktiváció után (S9+) több statisztikailag

szignifikáns mutagenitást figyelhettünk meg mindkét peloidnál. Így feltételezzük, hogy

71

a peloidminták főként bázispárszubsztitúciót okozó indirekt mutagéneket

tartalmazhatnak.

Magyarországon – ahogyan már fentebb említettük – a hévízi gyógyiszap

szervesanyag-tartalma jelentős (20%), azonban országunkban a szerves iszapok

jelenléte többnyire nem jellemző. Ezáltal egy speciális probléma is felmerült, mivel

Veniale és munkatársai [113] szerint a nagy szervesanyag-tartalmú iszapokban magas

mikrobiológiai aktivitás várható. (Bár a hévízi iszap baktériumflórája enyhén

antibiotikumtermelő, és emiatt patogén baktériumok előfordulása csekély [114], amint

az iszapot kemelik eredeti környezetéből, benne a kórokozók el tudnak szaporodni.)

Intézetünkben a tömegállandóságig szárított iszapokból tárolás és autoklávozás előtt

mikrobiológiai vizsgálatokat végeztünk (4.1.4.1 fejezet, IV. táblázat). Gyógyiszapokra

vonatkozó határértékek nincsenek rendeletben rögzítve.

Az iszapkivonatos vizsgálataink ismételt eredményeiben fluktuációt

tapasztaltunk: első esetben több mutagén frakciót kaptunk, mint másodszorra, és a

második kísérletsorozatban a mutagén mintázat szinte teljes mértékben különbözött az

előzőtől, csupán minimális átfedés volt megfigyelhető. Az iszapban élő, biológiai-

metabolikus aktivitással rendelkező mikroorganizmusok magyarázhatják a fenti

eredményeket [113].

Az iszapokban előfordulhatnak potenciálisan veszélyt jelentő kémiai anyagok is

(As, Hg, Cd, Pb, Se stb.), valamint az esetenként jelen lévő radioaktivitás is további

kérdéseket vethet fel [113]. Intézetünkben tájékozódási jelleggel radioaktivitási

méréseket végeztünk. Egyik mintán sem volt jellemző az α-sugárzás megemelkedett

szintje. A mérésekből alacsony radonaktivitásra következtethetünk.

További kísérleteinkben [77, 115, 116, 117] elvégeztük a gyógyiszapok

öxotoxikológiai és ökogenotoxikológiai vizsgálatait is, melyek szintén a peloidok

potenciálisan káros hatásaira hívják fel a figyelmet. Az ökotoxikológiai minősítést

trágyagiliszta (Eisenia-teszt) [118, 119, 120] ill. fehér mustár gyökérnövekedési teszttel

[74, 121, 122] (in toto) végezve a peloidok akut toxikus hatást nem mutattak, azonban

eltérések mindkét esetben mutatkoztak, így feltételezhető, hogy a gyökér képződésére és

fejlődésére a mintákban jelenlévő komponenesek negatív hatással bírnak.

Ökogenotoxikológiai vizsgálatunkban pedig egér és patkány limfociták üstökös-

elektroforézise mellett trágyagiliszta-sejteket (Eisenia) is vizsgáltunk. A férgekből

cölomasejteket preparáltunk és ezeken is vizsgáltuk a genotoxikus hatást. Eisenia

cölomasejteken igazoltuk a hévízi iszap feltételezett DNS-károsító hatását.

72

Mindazonáltal a gyógyvizek, ásványvizek adott esetben a gyógyiszapok kevésbé

koncentrált változatainak is tekinthetők. A kezelések során gyakran a gyógyiszapokat

gyógyvízzel keverve alkalmazzák. A fürdőkúrák alkalmával a gyógyvizek illékony

szerves komponensei is hatással lehetnek a gyógyhatás kiteljesedésében. Így az

inhaláció is egy lehetséges expozíciós út. Ebből kifolyólag – a gyógyvizek

szervesanyag-koncentrátumainak vizsgálata mellett – további kísérleti elgondolásaink

között szerepel a különféle gyógyvizek illékony szerves komponenseinek vizsgálata is

exikátorban kivitelezve, bakteriális mutagenitási teszttel.

Statisztikailag szignifikáns eredményeink ugyan nem mutatnak dózis-hatás

összefüggést, azonban ennek oka az alkalmazott statisztikai módszerekben keresendő

(4.1.5 fejezet).

Az elemzések során a kérdés a mérsékelten mutagén hatással rendelkező

anyagok esetében merül fel. Más szerzők [66, 78] tanulmányai alapján is kijelenthető,

hogy a módszer jól azonosít egyértelmű mutagén hatással rendelkező anyagokat, éppen

ezért kiemelkedően fontos a mutagenitási vizsgálatok sorában. A kérdéses, nehezen

értelmezhető esetekben a kutató előtt több lehetőség is nyílik: a statisztikai módszerek

első és másodfajú hibalehetőségeinek csökkentésére nagyobb elemszámú kísérleti

elrendezéssel megismételt kísérletek, vagy más mutagenitási vizsgálatok alkalmazása az

Ames-teszt eredményeinek pontosítására, megerősítésére. Azonban a talajkivonatok

készítésének módszertana nem enged további hígítást, vagy koncentrálást, ezáltal

többszörös koncentrálási sor kialakítását. Az alkalmazott eljárás volt az egyetlen

lehetőségünk annak érdekében, hogy a rendszerből ne veszítsünk szerves anyagot.

Következtetéseink szerint a két vizsgált peloidminta genotoxicitása előkezelés

nélkül, in toto, Ames-tesztben nem mérhető a korlátozottan bevihető

koncentrációmennyiség miatt.

Veniale és munkatársai szerint [113] az iszapokban élő mikroorganizmusok érési

folyamatokat indukálnak, melyek befolyásolhatják az iszapok szerves anyagainak

biológiai-metabolikus aktivitását. (Eredeti peloid mintáinkat az ismételt kísérlet előtt 3

hónapig tároltuk szobahőmérsékleten (20-25 °C).) Következésképpen további

vizsgálatok szükségesek a mikrobiológiai aktivitás mutagenezisben betöltött szerepének

megfigyelésére. Ehhez a jövőben széleskörű radioaktivitási méréseket is tervezünk a

gyógyiszapokban potenciálisan jelenlévő radioaktív elemek biológiai rendszerben

észlelhető mutagén hatásának kimutatása érdekében.

73

Az említett körülmények tekintetében a kapott mutagén frakciók további kémiai

analízise, a komponensek elkülönítése és a toxikus összetevők azonosítása szükséges.

A dolgozatban vizsgált rostos és nem rostos részecske típusú anyagok egyike

sem mutatott fizikai tulajdonságaikból eredő hatásokat, a kapott eredmények csak

kémiai hatásokon alapultak.

A kísérletek humán relevanciáját a következőkben foglalom össze:

A kiváló fizikai tulajdonságai miatt igen széles körben elterjedt, és a mai napig a

környezetünkben megtalálható, IARC szerinti 1. csoportba tartozó, humán karcinogén

azbesztrostok emberi szervezetben történő expozíciójának modellezése kapcsán

hozzájárultunk a hatásmechanizmus jobb megismeréséhez. Eredményeink alapján arra a

következtetésre jutottunk, hogy a mezotelióma kialakulásának mechanizmusa független

lehet a rostok és a mezotélsejtek fizikai kontaktusától.

A szénnanocsövek humán szervezetre gyakorolt potenciális egészségkárosító

hatása ma is vitatott. A számos átfogó tanulmányban megjelenő változatos paraméterek

nehezítik az eredmények megfelelő értelmezését. Hiányoznak a humán, élettanilag

releváns expozíciós utat értékelő, karcinogén hatásokat vizsgáló epidemiológiai

tanulmányok is. Ezek alapján a szénnanocsövek környezeti és népegészségügyi

kockázatait nem lehet megfelelő módon felbecsülni. In vivo tanulmányunkban kapott

eredményeink cáfolják azt a feltételezést, hogy a szénnanocsövek mezoteliómát

váltanának ki, a továbbiakban a humán kockázatbecslés más vonalaira szükséges

összpontosítanunk.

A peloidkivonatok esetében számos frakcióban statisztikailag szignifikáns

mutagenitás figyelhető meg, tehát megfontolandó annak lehetősége, hogy a

gyógyiszapok tartalmazhatnak az egészségre potenciálisan káros anyagokat. A

kockázatbecslés szempontjából, mivel bakteriális rendszerben dolgoztunk, az így kapott

eredmények humán viszonyokra közvetlenül nem extrapolálhatók. Ezen kívül

peloidkivonatos kísérleteinkben a gyógyiszapok szerves és szervetlen komponenseit

magasabb koncentrációban alkalmaztuk, mint amennyivel az emberi szervezet

érintkezhet egyszeri iszapkezelés alkalmával. A metabolikus aktivációval kapott

eredményeink potenciális, indirekt kockázatot jelentenek, mivel az emberi bőr

metabolizmusban betöltött szerepe elhanyagolható a májenzimekkel szemben, azonban

a felszívódó indirekt mutagének már könnyen elérhetik a metabolizáló szerveket.

Ismereteink korlátozottak a hámszövet metabolikus aktivitását illetően [123, 124].

74

Napjainkban a széleskörű népszerűségnek örvendő, gyógyiszapokból készült

kozmetikai, illetve a gyógyászatban is alkalmazott termékek otthoni felhasználása újabb

problémák felmerüléséhez vezet. A háztartásokban használatba kerülő eredeti peloid

készítmények – amelyek feltehetően nagyszámú mikroorganizmust tartalmaznak – a

kezelést megelőzően, vízzel keverve lehetőséget biztosítanak a mikrobiológiai érési

folyamatokhoz [113]. E körülmények fontos szerepet játszhatnak a toxicitásban. A

gyógyiszapok otthoni használatát megelőző minőségi, aktuális toxicitást felmérő

vizsgálatok, gyorstesztek alkalmazása alapvető fontosságú a nem kívánatos toxikus

mellékhatások elkerülése érdekében.

75

7 ÚJ EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA

A rostos és nem rostos szerkezetű részecskék specifikus genotoxicitása témájában

elvégzett kísérletek az alábbi új megállapításokra vezettek:

o Igazoltuk az 1-NP-vel különböző módon kezelt állatok vizeletének mutagenitását

o Po. ill. ip. kezelést követően szignifikáns vizeletmutagenitás csak az első 24 órában

jelentkezik, vagyis a mutagén metabolitok 24 óra alatt kiürülnek

o Használható modellt dolgoztunk ki az orális expozíciós úton ható szilárd fázison

megkötött kémiai anyagok kockázatbecsléséhez

o Kifejlesztettünk egy in vivo krónikus, kontaktexpozíciós modellt szilárd fázisú

anyagok vizsgálatára, és bizonyítottuk, hogy a kezeletlen ill. 1-NP-vel kezelt

azbesztrostok mezotélsejtekre közvetlenül ható krónikus expozíciója nem indukált

peritoneális mezoteliómát

o A szénnanocsövek többféle altípusát vizsgálva nem találtunk mutagén és egyéb

genotoxikus, csak citotoxikus és mitózisgátló hatást (SWCNT-nél)

o A mezotélsejtekre közvetlenül ható kezelt és kezeletlen szénnanocsövek hosszútávú

expozíciója során mezotelióma kialakulását nem észleltük, azonban idegentest típusú

granulomatózus reakciót, epiteloid- és többmagvú óriássejteket detektáltunk

o A hévízi és a kolopi iszapminta Ames-tesztben in toto nem okoz bakteriális

pontmutációt

o Csak bizonyos kémiai frakciók tekinthetők mutagéneknek, a mutagenitás időben

változó

o Az iszapminta-frakciók szignifikáns mutagenitásának jellemző mintázata az indirekt-

és bázispárszubsztitúció típusú mutagenezis

76

8 TUDOMÁNYOS KÖZLEMÉNYEK ÉS A KONGRESSZUSI

PREZENTÁCIÓK (ELŐADÁSOK ÉS POSZTEREK) JEGYZÉKE

PHD TÉZIS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ EREDETI KÖZLEMÉNYEK

Szendi K, Gerencsér G, Murányi E, Varga Cs. Mutagenic activity of peloids in the

Salmonella Ames test. Appl. Clay Sci. 2012; 55:70-74. (IF2011: 2,474)

Szendi K, Gerencsér G. Balneoprevenció: Gyógyiszapok genotoxikológiai vizsgálata

üstökös-elektroforézissel. Magyar Epid. 2011; 8(4):207-212.

Szendi K, Gerencsér G, Murányi E, Varga Cs. A balneoterápia lehetséges kockázatai:

peloidok mutagén aktivitásának vizsgálata bakteriális mutagenitási tesztben. Magyar

Epid. 2011; 8(2):109-121.

Gerencsér G, Szendi K, Varga Cs. Gyógyiszapok ökogenotoxikológiai vizsgálata.

Magyar Epid. 2011; 8(2):123-127.

Gerencsér G, Murányi E, Szendi K, Varga Cs. Ecotoxicological studies on Hungarian

peloids (medicinal muds). Appl. Clay Sci. 2010; 50:47-50. (IF: 2,303)

Varga Cs, Szendi K. Carbon nanotubes induce granulomas but not mesotheliomas. In

Vivo 2010; 24:153-156. (IF: 1,159)

Szendi K, Murányi E, Gerencsér G, Varga Cs. Gyógyiszapokból készült kivonatok

mutagenitásának vizsgálata Salmonella Ames-tesztben. Balneológia Gyógyf. Gyógyid.

2009; 28(1):72-78.

Szendi K, Varga Cs. Lack of genotoxicity of carbon nanotubes in a pilot study.

Anticancer Res. 2008; 28:349-352. (IF: 1,390)

Varga Cs, Szendi K. Mesothelioma and environmental exposure. A newly developed

animal model for fiber exposure. Ann. NY. Acad. Sci. 2008; 1138:73-76. (IF: 2,303)

77

Szendi K, Varga Cs. Előkísérletek a szén nanocsövek potenciális genotoxicitásának és

mesothelioma-indukciójának vizsgálatára. Egészségtud. 2006; 50:73-82.

Szendi K, Varga Cs. Nanotechnológia: Egy új kihívás a környezethigiéne számára. Szén

nanocsövek. Magyar Epid. 2006; 3:59-66.

Varga Cs, Szendi K. A karcinogén 1-nitropirén in vivo mutagenitása, egy potenciális

azbesztexpozíció modellje. Magyar Onkol. 2006; 50:337-340.

Varga Cs, Szendi K, Ember I. An in vivo model for testing genotoxicity of

environmental fibre-associated nitroarenes. In Vivo 2006; 20:539-542. (IF: 1,273)

EGYÉB KÖZLEMÉNYEK

Gerencsér G, Szendi K, Kovács A, Ember I. Biodízel gyártása során keletkező

melléktermékekkel kezelt talajok ökotoxikológiai vizsgálata. Magyar Epid. 2012;

9(3):209-214.

Szendi K, Gerencsér G, Kovács A, Ember I. Talajjavító és szelektív növényvédőszer

komponensek genotoxikológiai és ökotoxikológiai vizsgálata. Magyar Epid. 2012;

9(3):215-224.

Gerencsér G, Szendi K, Varga Cs. Biodízel gyártása során keletkező glicerines

mellékfázis vizsgálata szubkrónikus toxicitási tesztben. Magyar Epid. 2011; 8(1):27-31.

Szendi K, Gerencsér G, Kovács A, Varga Cs. Biodízel előállításakor képződött glicerin

fázis melléktermék vizsgálata in vivo genotoxikológiai tesztekben. Magyar Epid. 2011;

8(1):21-26.

78

KÖNYVFEJEZET

Ember I, Fehér K, Murányi E, Németh K, Prantner I, Stefler D, Szendi K, Tibold A.

Biomarkerek. In: Ember István (eds.) Népegészségügyi Orvostan. Budapest-Pécs:

Dialóg Campus; 2007. pp.195-203.

PHD TÉZISHEZ KAPCSOLÓDÓ KONGRESSZUSI PREZENTÁCIÓK

(ELŐADÁSOK ÉS POSZTEREK)

UV-sugárzás elleni védelem termálvizekkel?

Varga Cs, László M, Gerencsér G, Szendi K

[ea] Magyar Balneológiai Egyesület Nagygyűlése, Hajdúszoboszló, 2012. nov. 23-25.

Hazai termál- és gyógyvízminták illékony- és szervesanyag-kivonatainak vizsgálata

bakteriális mutagenitási tesztben

Szendi K, Gerencsér G, Varga Cs

[ea] Magyar Epidemiológiai Társaság VI. Kongresszusa, Pécs, 2011. nov. 25-26.

Hazai termál- és gyógyvízminták illékony- és szervesanyag-kivonatainak vizsgálata



[ea] Magyar Balneológiai Egyesület Nagygyűlése, Harkány, 2011. nov. 18-20.

Gyógyiszapok frakcionálása toxicitási és hatástani vizsgálatokhoz

Szabó I, Gerencsér G, Szendi K, Varga Cs

[ea] Magyar Balneológiai Egyesület Nagygyűlése, Harkány, 2011. nov. 18-20.

Natív és extrahált gyógyiszapok genotoxicitásának vizsgálata bakteriális mutagenitási

tesztben

Szendi K, Gerencsér G, Murányi E, Varga Cs

[ea] Magyar Balneológiai Egyesület Jubileumi Nagygyűlése, Gyula, 2010. nov. 19-21.

Gyógyiszapok genotoxikológiai vizsgálata

79

Gerencsér G, Szendi K, Murányi E, Varga Cs

[ea] Magyar Balneológiai Egyesület Jubileumi Nagygyűlése, Gyula, 2010. nov. 19-21.

Further methodological development of genotoxicity studies comparing contaminated

environmental samples (soil, peloid etc.) using bacterial mutagenicity test


[ea] The 63° General Assembly and International Scientific Congress of the World

Federation of Hydrotherapy and Climatotherapy (FEMTEC), Tunisia, 2010. nov. 1-2.

New experimental methods for studying different soils and medical muds

Gerencsér G, Szendi K, Varga Cs

[poszter] The 63° General Assembly and International Scientific Congress of the World

Federation of Hydrotherapy and Climatotherapy (FEMTEC), Tunisia, 2010. nov. 1-2.

Methodological development of genotoxicity studies comparing peloids and

contaminated soil samples using Ames test


[poszter] 37th World Congress of the International Society of Medical Hydrology and

Climatology, Paris, 2010. jún. 23-26.

New experimental methods for studying potential toxicity of peloids


[poszter] 37th World Congress of the International Society of Medical Hydrology and

Climatology, Paris, 2010. jún. 23-26.

Gyógyiszapokból és szennyezett talajmintából készült kivonatok mutagenitásának

összehasonlító vizsgálata Salmonella Ames tesztben, módszertani fejlesztés


[ea] Népegészségügyi Tudományos Társaság XVIII. Nemzetközi Kongresszusa,

Orosháza-Gyopárosfürdő, 2010. máj. 13-15.

Új vizsgálati módszerek a gyógyiszapok tanulmányozásához




80

Gyógyiszapok mutagenitásának vizsgálata Ames teszt és üstökös elektroforézis

alkalmazásával


[ea] Magyar Balneológiai Egyesület 2009. Évi Nagygyűlése, Hévíz, 2009. nov. 20-22.

Új vizsgálati módszerek a gyógyiszapok tanulmányozásához



Genotoxicity studies on Hungarian peloids using Ames test and comet assay


[ea] Scientific Congress of The World Federation of Hydrotherapy and Climatotherapy

(FEMTEC), Yokohama, Japan, 2009. nov. 8-12.

New experimental methods for studying medical muds samples


[poszter] Scientific Congress of The World Federation of Hydrotherapy and

Climatotherapy (FEMTEC), Yokohama, Japan, 2009. nov. 8-12.

Magyarországi gyógyiszapok értékelése ökotoxikológiai tesztekkel


[ea] 8. Magyar Ökológus Kongresszus, Szeged, 2009. aug. 27-29.

Gyógyiszapok mikrobiológiai vizsgálata

Gerencsér G, Murányi E, Szendi K, Varga Cs

[poszter] Magyar Epidemiológiai Társaság IV. Nemzetközi Kongresszusa, Pécs, 2008.

nov. 28-29.

Gyógyiszapokból készült kivonatok mutagenitásának vizsgálata Salmonella Ames

tesztben

Szendi K, Murányi E, Gerencsér G, Varga Cs

[poszter] Fiatal Higiénikusok Fóruma, Az MHT Ifjúsági Tagozatának IV. Fóruma,

Győr, 2008. máj. 29-31.

81

A gyógyiszapok lehetséges egészségi kockázatai

Murányi E, Szendi K, Gerencsér G, Varga Cs

[poszter] Fiatal Higiénikusok Fóruma, Az MHT Ifjúsági Tagozatának IV. Fóruma,

Győr, 2008. máj. 29-31.

A karcinogén 1-nitropirén in vivo mutagenitása, egy potenciális azbesztexpozíció

modellje

Szendi K, Varga Cs

[poszter] Népegészségügyi Tudományos Társaság XVI. Nagygyűlése, Pécs, 2008. ápr.

17-19.

A gyógyiszapok lehetséges egészségi kockázatai


[poszter] Népegészségügyi Tudományos Társaság XVI. Nagygyűlése, Pécs, 2008. ápr.

17-19.


tesztben


[poszter] Magyar Balneológiai Egyesület 2007. évi Nagygyűlése, Esztergom, 2007.

nov. 16-18.


tesztben


[poszter] A Pécsi Tudományegyetem Orvostudományi és Egészségtudományi

Koordinációs Központjának, Orvostudományi és Egészségtudományi Szakosztályának

Rendkívüli Jubileumi Tudományos Ülése, Pécs, 2007. jún. 9.

Environmental exposure and mesothelioma

Varga Cs, Szendi K, Ember I

[poszter] International Oncology Congress, Al Ain, Egyesült Arab Emirátusok, 2007.

febr. 17-22.

Relevance of the in vitro and in vivo studies in genotoxicological research on fibres

82

Szendi K, Varga Cs

[poszter] Nanobiológia mini-szimpózium, MTA PAB Székház, Pécs, 2006. nov. 10.

In vitro és in vivo vizsgálatok jelentősége a rostok genotoxikológiai értékelésében

Szendi K, Varga Cs

[poszter] Magyar Molekuláris és Prediktív Epidemiológiai Társaság III. Nemzetközi

Kongresszusa, Pécs, 2006. nov. 3-4.

Genotoxicity studies on fibres and nanotubes

Varga Cs, Szendi K

[ea] Bregenz Summer School on Endocrinology, Bregenz, Austria, 2006. júl. 30-aug. 3.

Relevance of the in vitro and in vivo studies in genotoxicological research on fibres

Varga Cs, Szendi K

[poszter] Congress Linz 2006, Alternatives to Animal Experimentation (ALTEX), 2006.

jún. 2-4.

A nanotechnológia környezet-egészségügyi kockázatai: Szén nanocsövek potenciális

genotoxicitásának és mesothelioma-indukciójának vizsgálata

Szendi K, Varga Cs

[ea] Népegészségügyi Tudományos Társaság XV. Nagygyűlése, Siófok, 2006. ápr. 26-

28.

Összehasonlító környezet-genotoxikológiai vizsgálatok rostszerű anyagokkal

Varga Cs, Szendi K, Varjas T

[ea] Népegészségügyi Tudományos Társaság XV. Nagygyűlése, Siófok, 2006. ápr. 26-

28.

Nanotechnológia: új kihívások a környezethigiéne számára. Szén nanocsövek

Szendi K, Varga Cs

[ea] Magyar Molekuláris és Prediktív Epidemiológiai Társaság II. Nemzetközi

Kongresszusa, Pécs, 2005. ápr. 1-2.

83

PHD TÉZISHEZ NEM KAPCSOLÓDÓ KONGRESSZUSI PREZENTÁCIÓK

(ELŐADÁSOK ÉS POSZTEREK)

Talajjavító és szelektív növényvédőszerek genotoxikológiai és ökotoxikológiai

vizsgálata

Gerencsér G, Szendi K, Kovács A, Ember I

[ea] Magyar Epidemiológiai Társaság VI. Kongresszusa, Pécs, 2011. nov. 25-26.

Combined genotoxicity studies on biodiesel related technical glycerol

Szendi K, Gerencsér G, Kovács A, Varga Cs

[poszter] The 4th Conference of PhD Students and the First Conference of Postdoctoral

Researchers in Medicine and Pharmacy, Targu Mures, Romania, 2011. júl. 6-8.

(Acta Medica Marisiensis, Vol 57, Suppl 3, 2011, ISSN 2068-3324)

Combined genotoxicity studies on technical glycerol from biodiesel


[ea] International Conference of Preventive Medicine and Public Health, Pécs, Hungary,

2010. nov. 19-20.

Biodízel gyártása során keletkező glicerines fázis vizsgálata szubkrónikus toxicitási

tesztben

Gerencsér G, Szendi K, Varga Cs


2010. nov. 19-20.

Marketing communication in Public Health – Promotion of health conscious behaviour

Berényi K, Szendi K, Budán F


2010. nov. 19-20.

Orvoslátogatók a közvélemény kereszttüzében

Berényi K, Szabó I, Szendi K, Budán F

84

[ea] Fiatal Higiénikusok Fóruma, Az MHT Ifjúsági Tagozatának VI. Fóruma, Debrecen,

2010. máj. 27-29.

Orvoslátogatók a közvélemény kereszttüzében

Berényi K, Szabó I, Szendi K, Budán F



Epidemiológiai módszerek balneológiai vizsgálatokban

Horváth-Sarródi A, Murányi E, Szendi K, Gerencsér G, Varga Cs


Biomarker vizsgálatok ionizáló sugárzás- és citosztatikumexpozícióban – esettanulmány


[ea] Népegészségügyi Tudományos Társaság XVII. Nagygyűlése, Marosvásárhely,

2009. ápr. 17-19.

Magyarországi gyógyiszapok értékelése ökotoxikológiai tesztekkel


[ea] Népegészségügyi Tudományos Társaság XVII. Nagygyűlése, Marosvásárhely,

2009. ápr. 17-19.

Biodízel előállításakor képződött glicerin fázis melléktermékek vizsgálata in vitro



[poszter] Magyar Epidemiológiai Társaság IV. Nemzetközi Kongresszusa, Pécs, 2008.

nov. 28-29.

Biomarker studies in ionizing radiation and cytostatic exposure


[poszter] International Conference and Central and Eastern European Chapter Meeting

of International Society for Environmental Epidemiology, Čeladná, Czech Republic,

2007. nov. 26-29.

85

Biomarker vizsgálatok ionizáló sugárzás és citosztatikus expozícióban


[poszter] A Pécsi Tudományegyetem Orvostudományi és Egészségtudományi

Koordinációs Központjának, Orvostudományi és Egészségtudományi Szakosztályának

Rendkívüli Jubileumi Tudományos Ülése, Pécs, 2007. jún. 9.

86

9 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Szeretnék köszönetet mondani programvezetőmnek, Prof. Dr. Ember Istvánnak a

lehetőségért, tanításért, támogatásért.

Szeretném köszönetemet kifejezni témavezetőmnek, Dr. Varga Csaba egyetemi

docensnek, aki már medikus korom óta ötleteivel, tanácsaival és támogatásával

segítséget nyújtott minden munkámmal kapcsolatban.

A vizsgálatok során nyújtott segítséget Harth Csabánénak, Pest Károlynénak, Dr.

Murányi Editnek és Gerencsér Gellértnek köszönöm.

Továbbá köszönöm a segítséget minden egyes munkatársamnak, akik a munkánk

elvégzésében segítségünkre voltak.

Köszönettel tartozom Prof. Kertai Pálnak (DE) önzetlen szakmai segítségéért, Prof.

B.A. Amesnek (Univ. California) a Salmonella törzsekért, H. Kármán Franciskának

(MTA-KKKI) a szénnanocsőmintákért, Semjén Dávidnak (PTE) a szövettani

értékelésért, valamint Nardai Ilonának (Harkányi Gyógyfürdő) és Bergmann

Annamáriának (Hévíz gyógyfürdő és Szent András Reumakórház) a peloidmintákért.

Végül, de nem utolsó sorban köszönöm a családomnak a támogatást, mellyel a munka

során végig mellettem álltak.

87

10 IRODALOMJEGYZÉK

1 Donaldson K, Borm P. Particle and Fibre Toxicology, a new journal to meet a real

need. Part Fibre Toxicol. 2004; 1:1.

2 25/2000. (IX. 30.) EüM-SzCsM együttes rendelet a munkahelyek kémiai

biztonságáról

3 Schins RP. Mechanisms of genotoxicity of particles and fibers. Inhal Toxicol.

2002; 14(1):57-78.

4 Varga C. Solid-phase Environmental Genotoxicity: In Vivo Veritas!

WebmedCentral, Toxicology 2011; 2(8):WMC002134.

5 IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risk to Humans. Vol 46:

Diesel and Gasoline Engine Exhausts and Some Nitroarenes, IARC, Lyon, 1989,

pp. 1-458.

6 Varga C. Azbesztrostok az ivóvízben: elektronmikroszkópos vizsgálatok.

Hidrológiai Közlöny 1990; 70(2):108-113.

7 IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risk to Chemicals on Man.

Vol 14: Asbestos, IARC, Lyon, 1977, pp. 1-106.

8 Kovács B, Mátyás L, Simon G. Azbeszt – a felméréstől a mentesítésig. Levegő

Munkacsoport, Környezetvédelmi és Vízügyi Minisztérium.

http://www.orszagoszoldhatosag.gov.hu/letoltes.php?filename=Azbeszt_2.pdf

9 Varga C, Kiss I, Ember I. The lack of environmental justice in Central and

Eastern Europe. Environ Health Persp 2002; 110A:662-663.

10 Varga C. A genotoxikológiai kockázatbecslés nehézségei: környezeti

azbesztexpozíció. Magyar Epidemiol 2005; 2:147-150.

11 Varga C. Can one access genotoxic and carcinogenic risk of asbestos without

mentioning ingested fibres? Mutat Res 2005; 572:173-174.

12 Varga C. Asbestos fibres in drinking water: are they carcinogenic or not? Medical

Hypotheses 2000; 55(3):225-226.

13 Szyba K, Lange A. Presentation of benzo(a)pyrene to microsomal enzymes by

asbestos fibres in the Salmonella/mammalian microsome mutagenicity test.

Environ. Health Perspect. 1983; 51:337-341.

14 Varga C, Horváth G, Timbrell V. In vivo studies on genotoxicity and

cogenotoxicity of ingested UICC anthophyllite asbestos. Cancer Lett. 1996;

105:181-185.

88

15 Varga C, Horváth G, Pocsai Zs, Timbrell V. On the mechanism of cogenotoxic

action between ingested amphibole asbestos fibres and benzo[a]pyrene: I. Urinary

and serum mutagenicity studies with rats. Cancer Lett. 1998; 128:165-169.

16 Varga C, Horváth G, Timbrell V. On the mechanism of cogenotoxic action

between ingested amphibole asbestos fibres and benzo[a]pyrene: II. Tissue

specificity studies using comet assay. Cancer Lett. 1999; 139:173-176.

17 Timbrell V, Rendall REG. Preparation of UICC standard reference samples of

asbestos. Powder Technol. 1972; 5:279-287.

18 Truhaut R, Chouroulinkov I. Effect of long-term ingestion of asbestos fibres in

rats. IARC Sci Publ. 1989; 90:127-133.

19 Chouroulinkov I. Experimental studies on ingested fibres. IARC Sci Publ. 1989;

90:112-126.

20 Ember I, Pusztai Z, Gyöngyi Z, Kiss I. 1-Nitropyrene induces elevated expression

of oncogenes and tumor suppressor genes 24 hours after treatment in CBA/Ca

mice. Anticancer Res. 2000; 20:1563-1566.

21 Gyöngyi Z, Nádasi E, Varga C, Kiss I, Ember I. “Long-term” effects of 1-

nitropyrene on oncogene and tumor suppressor gene expression. Anticancer Res.

2001; 21:3937-3940.

22 Milette JR, Boone RL, Rosenthal MT, McCabe LJ. The need to control asbestos

fibres in potable water supply systems. Sci. Total Environ. 1981; 18:91-102.

23 Kaczenski JH, Hallenbeck WH. Migration of ingested asbestos. Environ. Res.

1984; 35:531-551.

24 Pontefract RD, Cunningham HM. Penetration of asbestos through the digestive

tract of rats. Nature 1973; 243:352-353.

25 Varga C, Pocsai Z, Horváth G, Timbrell V. Studies on genotoxicity of orally

administered crocidolite asbestos in rats: implications for ingested asbestos

induced carcinogenesis. Anticancer Res. 1996; 16:811-814.

26 Varga C, Szendi K. Relevance of the in vitro and in vivo studies in

genotoxicological research on fibres. ALTEX 2006; 23:133.

27 Varga C, Szendi K. Mesothelioma and Environmental Exposure. A Newly

Developed Animal Model for Fibre Exposure. Ann. N.Y. Acad. Sci. 2008;

1138:73-76.

89

28 Varga C, Szendi K, Ember I. An in vivo modell for testing genotoxicity of

environmental fibre-associated nitroarenes. In Vivo 2006; 20:539-542.

29 Tapasztó L. Speciális anyagok és technológiák a XXI. században. Műszaki Fizikai

és Anyagtudományi Kutatóintézet, Magyar Tudományos Akadémia.

(http://www.nanotechnology.hu/magyarul/Specmattech.html, 2012.

30 Szendi K, Varga C. Nanotechnológia: Egy új kihívás a környezethigiéné számára.

Szén nanocsövek. Magyar Epidemiológia 2006; 3:59-66.

31 Foley M. The international nanotechnology business directory. How do carbon

nanotubes work: Carbon Nanotube 101. Available at

http://www.nanovip.com/node/2077, 2006.

32 Lam CW, James JT, McCluskey R. Pulmonary toxicity of single-wall carbon

nanotubes in mice 7 and 90 days after intratracheal instillation. Toxicol. Sci.

2004; 77:126-134.

33 Dhawan A, Taurozzi JS, Pandey AK, Shan W, Miller SM, Hashsham SA. Stable

colloidal dispersions of C60 fullerenes in water: Evidence for genotoxicity.

Environ. Sci. Technol. 2006; 40:7394-7401.

34 Li Z, Salmen L, Hulderman T, Kisin E, Shvedova A, Luster M, Simeonova P.

Pulmonary carbon nanotube exposure and oxidative status in the vascular system.

Free Radic. Biol. Med. 2004; 37(1):S142.

35 Niwa Y, Iwai N. Genotoxicity in cell lines induced by chronic exposure to water-

soluble fullerenes using micronucleus test. Env. Health Prev. Med. 2006; 11:292-

297.

36 Oberdorster E. Manufactured nanomaterials (fullerenes, C60) induce oxidative

stress in the brain of juvenile largemouth bass. Environ. Health Perspect. 2004;

112(10):1058-1062.

37 Shvedova AA, Kisin E, Keshava N, Murray AR, Gorelik O, Arepalli S,

Gandelsman VZ, Castranova V. Cytotoxic and genotoxic effects of single-wall

carbon nanotube exposure on human keratinocytes and bronchial epithelial cells.

(Abstract). In: 227th American Chemical Society National Meeting: 27 March-1

April 2004, Anaheim, CA. Washington, DC, American Chemical Society, IEC 20,

2004.

38 Warheit DB, Laurence BR, Reed KL. Comparative pulmonary toxicity assessment

of single-wall carbon nanotubes in rats. Toxicol. Sci. 2004; 77:117-125.

90

39 Aschberger K, Johnston HJ, Stone V, Aitken RJ, Hankin SM, Peters SAK, Tran

CL, Christensen FM. Review of carbon nanotubes toxicity and exposure

Appraisal of human health risk assessment based on open literature. Critical

Reviews in Toxicology 2010; 40(9):759-790.

40 Sathya TN, Vardhini NV, Balakrishnamurthy P. Revolution of ‘nano’ in in-vitro

genetic toxicology. Journal of Cell and Tissue Research 2010; 10(3):2389-2396.

41 Ng CT, Li JJ, Bay B-H, Yung LYL. Current Studies into the Genotoxic Effects of

Nanomaterials. Journal of Nucleic Acids 2010; Article ID 947859, 12 pages.

42 Stella GM. Carbon nanotubes and pleural damage: Perspectives of nanosafety in

the light of asbestos experience. Biointerphases 2011; 6(2) (17 pages).

43 Doak SH, Manshian B, Jenkins GJ, Singh N. In vitro genotoxicity testing strategy

for nanomaterials and the adaptation of current OECD guidelines. Mutat. Res.

2012; 745(1-2):104-111.

44 van der Zande M, Junker R, Walboomers XF, Jansen JA. Carbon Nanotubes in

Animal Models: A Systematic Review on Toxic Potential. Tissue Eng. Part B

Rev. 2011; 17(1):57-69.

45 Li Z, Hulderman T, Salmen R, Chapman R, Leonard SS, Young S-H, Shvedova

A, Luster MI, Simeonova PP. Cardiovascular Effects of Pulmonary Exposure to

Single-Wall Carbon Nanotubes. Environ Health Perspect. 2007; 115(3):377-382.

46 Xu YY, Yang J, Shen T, Zhou F, Xia Y, Fu JY, Meng J, Zhang J, Zheng YF,

Yang J, Xu LH, Zhu XQ. Intravenous Administration of Multi-walled Carbon

Nanotubes Affects the Formation of Atherosclerosis in Sprague-Dawley Rats. J

Occup Health. 2012 Aug 23. [Epub ahead of print]

47 Szendi K, Varga C. Előkísérletek a szén nanocsövek potenciális

genotoxicitásának és mesothelioma-indukciójának vizsgálatára.

Egészségtudomány 2006; 50:73-82.

48 Poland CA, Duffin R, Kinloch I, Maynard A, Wallace WAH, Seaton A, Stone V,

Brown S, MacNee W, Donaldson K. Carbon nanotubes’ introduced into the

abdominal cavity of mice show asbestos-like pathogenicity in a pilot study. Nat.

Nanotech. 2008; 3:423-428.

49 Sakamoto Y, Nakae D, Fukumori N, Tayama K, Maekawa A, Imai K, Hirose A,

Nishimura T, Ohashi N, Ogata A. Induction of mesothelioma by a single

91

intrascrotal administration of multi-walled carbon nanotube in intact male Fischer

344 rats. J. Toxicol. Sci. 2009; 34:65-76.

50 Takagi A, Hirose A, Nishimura T, Fukumori N, Ogata A, Ohashi N, Kitajima S,

Kanno J. Induction of mesothelioma in p53+/- mouse by intraperitoneal

application of multi-wall carbon nanotube. J. Toxicol. Sci. 2008; 33:105-116.

51 Singh N, Manshian B, Jenkins GJS, Griffiths SM, Williams PM, Maffeis TGG,

Wright CJ, Doak SH. Nanogenotoxicology: the DNA-damaging potential of

engineered nanomaterials. Biomaterials 2009; 30:3891-3914.

52 HM Government. Characterising the potential risks posed by engineered

nanoparticles. A first UK Government research report. 2005, pp. 1-55.

53 Gyarmati J. Iszapkezelések és iszapkutatások. Balneológia, Rehabilitáció,

Gyógyfürdőügy 1988; 8:14-26.

54 Bender T, Balint PV, Balint GP. A brief history of spa therapy. Ann. Rheum. Dis.

2002; 61:949-950.

55 Bender T, Karagülle Z, Bálint GP, Gutenbrunner C, Bálint PV, Sukenik S.

Hydrotherapy, balneotherapy, and spa treatment in pain management. Rheumatol.

Int. 2005; 25(3):220-224.

56 Verhagen AP, de Vet HC, de Bie RA, Kessels AG, Boers M, Knipschild PG.

Taking baths: the efficacy of balneotherapy in patients with arthritis. A systematic

review. J. Rheumatol. 1997; 24:1964-1971.

57 Varga C. Balneoprevention: new approaches. Int. J. Biometeorol. 2010;

56(1):195-197.

58 74/1999. (XII. 25.) EüM rendelet a természetes gyógytényezőkről 3. számú

melléklet

59 https://www.antsz.hu/felso_menu/ugyfeleknek/hatosagi_ugyintezes/engedelyek/

gyogyhely_gyogytenyezo_gyogyviz_asvanyviz/termeszetes.html?query=gy%C3

%B3gyiszap

60 74/1999. (XII. 25.) EüM rendelet a természetes gyógytényezőkről

61 https://www.antsz.hu/data/ cms33335/gyogyiszap.pdf

62 http://naturastart.shp.hu/hpc/web.php?a=naturastart&o=BHis2eyVUK

63 https://www.antsz.hu/data/cms33335/gyogyiszap.pdf

64 http://www.gyogyiszap-neydharting.hu/

92

65 Szendi K, Gerencsér G, Murányi E, Varga Cs. Mutagenic activity of peloids in the

Salmonella Ames test. Appl. Clay Sci. 2012; 55:70-74.

66 Maron DM, Ames BN. Revised methods for the Salmonella mutagenicity test.

Mutat. Res. 1983; 113:173-215.

67 Varga C, Pocsai Z, Kertai P. Urinary and serum mutagenicity studies with rats

bearing experimental tumours. Mutagenesis 1995; 10(1):43-45.

68 Vine MF. Micronuclei. In: Biological markers in epidemiology. Hulka BS,

Wilcosky TC, Griffith JD (eds.). New York, Oxford University Press, 1990; pp.

125-146.

69 Varga C. Genotoxicologic evaluation of ozonated/chlorinated drinking water:

Cytogenetic effects of XAD-fractions on cultured human cells. Environ Toxicol

Chem. 1991; 10:1029-1035.

70 Pap M, Varga C. Sister-chromatid exchanges in peripheral lymphocytes of

workers occupationally exposed to xylenes. Mutat. Res. 1987; 187:223-225.

71 http://www.spaheviz.hu/

72 http://www.heviz.net/heviz-2

73 http://www.heviz-info.hu/tofurdo.html

74 Lassu L. Környezetvédelmi vizsgálatok. Nemzeti Szakképzési Intézet, Budapest,

1998.

75 Wellness Centrum. Hévízgyógyfürdő [http://www.wellnesscentrum.hu/heviz.php]

Letöltve: 2010. szeptember.

76 Ansa Import-Export Bt. Kolopi gyógyiszap kompressz

[http://www.halinaansa.hu/termeszetes-es-osi-gyogymodok/kolopi-gyogyiszap-

kompressz.html] Letöltve: 2012. június

77 Gerencsér G, Murányi E, Szendi K, Varga Cs. Ecotoxicological studies on

Hungarian peloids (medicinal muds). Applied Clay Science 2010; 50:47-50.

78 Kim BS, Margolin BH. Statistical methods for the Ames Salmonella assay: a

review. Mutat. Res. 1999; 436:113-122.

79 Cariello NF, Piegorsch W. The Ames test: The two-fold rule revisited. Mutat.

Res. 1996; 369:23-32.

80 Margolin BH, Kaplan N, Zeiger E. Statistical analysis of the Ames

Salmonella/microsome test. Proc. Natl. Acad. Sci. 1981; 78:3779-3783.

93

81 Bernstein L, Kaldor J, McCaan J, Pike MC. An empirical approach to the

statistical analysis of mutagenesis data from the Salmonella test. Mutat. Res.

1982; 97:267-281.

82 Krewski D, Leroux BG, Bleuer SR, Broekhaven LH. Modelling the Ames

Salmonella/microsome assay. Biometrics 1993; 49:499-510.

83 Hosmani AH, Thorat YS, Kasture PV. Carbopol and its pharmaceutical

significance: A review. Pharmaceutical Reviews 2006; 4(1) DOAJ.

84 Dean BJ, Danford N. Assays for the Detection of Chemically induced

Chromosome Damage in Cultured Mammalian Cells. In: Mutagenicity Testing: a

Practical Approach. Venitt S and Parry JM (eds.) Oxford, IRL Press Limited,

1984, pp. 187-232.

85 Chan PC. NPT Toxicity Report Series No. 34: NTP Technical Report on Toxicity

Study of 1-Nitropyrene. Research Triangle Park, 1996, pp. 1-62.

86 Mermelstein R, Kiriazides DK, Butler M, McCoy EC, Rosenkranz HS. The

extraordinary mutagenicity of nitropyrenes in bacteria. Mutat. Res. 1981; 89:187-

196.

87 Heflich RH, Thornton-Manning JR, Kinouchi T, Beland FA. Mutagenicity of

oxidized microsomal metabolites of 1-nitropyrene in Chinese hamster ovary cells.

Mutagenesis 1990; 5:151-157.

88 Ball LM, Rafter JJ, Gustafsson JA, Gustafsson BE, Kohan MJ, Lewtas J.

Formation of mutagenic urinary metabolites from 1-nitropyrene in germ-free and

conventional rats: role of the gut flora. Carcinogenesis 1991; 12:1-5.

89 Pusztai Z, Selypes A, Ember I. Short-term effects of 1-nitropyrene on

chromosomes and on oncogene/tumor suppressor gene expression in vivo.

Anticancer Res. 1998; 18:4489-4492.

90 Imaida K, Lee MS, Land SJ, Wang CY, King CM. Carcinogenicity of

nitropyrenes in the newborn female rat. Carcinogenesis 1995; 16:3127-3030.

91 Ember I, Kiss I, Gyöngyi Z, Varga C. Comparison of early onco/suppressor gene

expressions in peripheral leukocytes and potential target organs of rats exposed to

the carcinogen 1-nitropyrene. Eur. J. Cancer Prev. 2000; 9:439-442.

92 Shulka A, Gulumian M, Hei TK, Kamp D, Rahman Q, Mossman BT. Multiple

roles of oxidants in the pathogenesis of asbestos-induced diseases. Free Rad. Biol.

Med. 2003; 34:1117-1129.

94

93 Mossman BT, Borm PJ, Castranova V, Costa DL, Donaldson K, Kleeberger SL.

Mechanisms of action of inhaled fibers, particles and nanoparticles in lung and

cardiovascular diseases. Particle Fiber Toxicol. 2007; 4:4.

94 Nádasi E, Ember I, Arany I. Extracellular signal-regulated kinase as biomarker in

the molecular epidemiology of human carcinogenesis. I. Molecular mechanisms.

Hung. Epidemiol. 2005; 2:297-304.

95 Nádasi E, Ember I, Arany I. Extracellular signal-regulated kinase as biomarker in

the molecular epidemiology of human carcinogenesis. II. Clinical implications.

Hung. Epidemiol. 2006; 3:53-58.

96 Kisin ER, Murray AR, Keane MJ, Shi XC, Schwegler-Berry D, Gorelik O,

Arepalli S, Castranova V, Wallace WE, Kagan VE, Shvedova AA. Single-walled

carbon nanotubes: geno- and cytotoxic effects in lung fibroblast V79 cells. J.

Toxicol. Environ. Health 2007; 70(24):2071-2079.

97 Di Sotto A, Chiaretti M, Carru GA, Bellucci S, Mazzanti G. Multi-walled carbon

nanotubes: lack of mutagenic activity in the bacterial reverse mutation assay.

Toxicol. Lett. 2009; 184:192-197.

98 Wirnitzer U, Herbold B, Voetz M, Ragot J. Studies on the in vitro genotoxicity of

baytubes, agglomerates of engineered multi-walled carbon-nanotubes (MWCNT).

Toxicol. Lett. 2009; 186:160-165.

99 Muller J, Decordier I, Hoet PH, Lombaert N, Thomassen L, Huaux F, Lison D,

Kirsch-Volders M. Clastogenic and aneugenic effects of multi-wall carbon

nanotubes in epithelial cells. Carcinogenesis 2008; 29:427-433.

100 Cveticanin J, Joksic G, Leskovac A, Petrovic S, Sobot AV, Neskovic O. Using

carbon nanotubes to induce micronuclei and double strand breaks of the DNA in

human cells. Nanotechnology 2010; 21:015102.

101 Migliore L, Saracino D, Bonelli A, Colognato R, D’Errico MR, Magrini A,

Bergamaschi A, Bergamaschi E. Carbon nanotubes induce oxidative DNA

damage in RAW 264.7 cells. Environ. Mol. Mutagen. 2010; 51:294-303.

102 Lindberg HK, Falck GC, Suhonen S, Vippola M, Vanhala E, Catalán J, Norppa H.

Genotoxicity of nanomaterials: DNA damage and micronuclei induced by carbon

nanotubes and graphite nanofibres in human bronchial epithelial cells in vitro.

Toxicol. Lett. 2009; 186:166-173.

95

103 Zeni O, Palumbo R, Bernini R, Zeni L, Sarti M, Scarfi MR. Cytotoxicity

investigation on cultured human blood cells treated with single-wall carbon

nanotubes. Sensors 2008; 8:488-499.

104 Kolosnjaj-Tabi J, Hartman KB, Boudjemaa S, Ananta JS, Morgant G, Szwarc H,

Wilson LJ, Moussa F. In vivo behaviour of large doses of ultrashort and full-

length single-walled carbon nanotubes after oral and intraperitoneal

administration to Swiss mice. ACS Nano 2010; 4:1481-1492.

105 Schipper ML, Nakayama-Ratchford N, Davis CR, Karn NWS, Chu P, Liu Z, Sun

X, Dai H, Gambhir SS. A pilot toxicology study of single-walled carbon

nanotubes in a small sample of mice. Nat. Nanotech. 2008; 3:216-221.

106 Zhao Y, Xing G, Chai Z. Nanotoxicology: Are carbon nanotubes safe? Nat.

Nanotech. 2008; 3:191-192.

107 Muller J, Huaux F, Fonseca A, Nagy JB, Moreau N, Delos M, Raymundo-Piñero

E, Béguin F, Kirsch-Volders M, Fenoglio I, Fubini B, Lison D. Structural Defects

Play a Major Role in the Acute Lung Toxicity of Multiwall Carbon Nanotubes:

Toxicological Aspects. Chem. Res. Toxicol. 2008; 21:1698-1705.

108 Muller J, Delos M, Panin N, Rabolli V, Huaux F, Lison D. Absence of

carcinogenic response to multiwall carbon nanotubes in a 2-year bioassay in the

peritoneal cavity of the rat. Toxicol. Sci. 2009; 110:442-448.

109 Boczkowski J, Hoet P. What's new in nanotoxicology? Implications for public

health from a brief review of the 2008 literature. Nanotoxicology 2010; 4(1):1-14.

110 Gernand J, Casman E. A meta-analysis of carbon nanotube pulmonary toxicity

studies – How physical dimensions and impurities affect the toxicity of carbon

nanotubes. This document is a currently unpublished chapter of the doctoral

dissertation of J.M. Gernand. It has been submitted for publication to a peer

reviewed journal and is currently under review.

http://www.andrew.cmu.edu/user/jgernand/carbon_nanotube_tox.pdf Letöltve:

2013. február.

111 Lam CW, James JT, McCluskey R, Arepalli S, Hunter RL. A review of carbon

nanotube toxicity and assessment of potential occupational and environmental

health risks. Crit Rev Toxicol. 2006; 36(3):189-217.

112 Donaldson K, Murphy FA, Duffin R, Poland CA. Asbestos, carbon nanotubes and

the pleural mesothelium: a review of the hypothesis regarding the role of long

96

fibre retention in the parietal pleura, inflammation and mesothelioma. Part Fibre

Toxicol. 2010; 7:5. doi: 10.1186/1743-8977-7-5.

113 Veniale F, Bettero A, Jobstraibizer PG, Setti M. Thermal muds: Perspectives of

innovations. Appl. Clay Sci. 2007; 36:141-147.

114 http://terapia-heviz.hu/hevizi-to/hevizi-iszap

115 Gerencsér G, Szendi K, Varga C. Gyógyiszapok ökogenotoxikológiai vizsgálata.

Magyar Epidemiológia 2011; 8(2):123-127.

116 Szendi K, Gerencsér G. Gyógyiszapok genotoxikológiai vizsgálata üstökös-

elektroforézissel. Magyar Epidemiológia 2011; 8(4):207-212.

117 Varga C. Vízhigiéne – víztoxikológia: Aktuális hazai kérdések és kutatási

irányok. Acta Biol. Debr. Oecol. Hung. 2012; 29:9-120.

118 Fischer E. Effects of atrazine and paraquat-containing herbicides on Eisenia fetida

(Annelida, Oligochaeta). Zool. Anz. 1989; 223:291-300.

119 Fischer E, Molnár L. Growth and reproduction of Eisenia fetida (Oligochaeta,

Lumbricidae) in semi-natural soil containing various metal chlorides. Soil Biol.

Biochem. 1997; 29:667-670.

120 OECD Guideline 207, 2003. Earthworm, Acute Toxicity Test.

121 Gruiz K, Horváth B, Molnár M. Környezettoxikológia. Budapest: Műegyetem

Kiadó; 2001.

122 OECD Guideline 208 for the Testing of Chemicals, 2003. Seedling Emergence

and Seedling Growth Test.

123 Matis EI, Reshetova GG, Novikova SV. Experimental validation of the

administration into the body of the lipids from therapeutic muds by means of

vibration. Vopr. Kurortol. Fizioter. Lech. Fiz. Kult. 1996; 4:22-24.

124 Tateo F, Ravaglioli A, Andreoli C, Bonina F, Coiro V, Degetto S, et al. The in-

vitro percutaneous migration of chemical elements from a thermal mud for

healing use. Appl. Clay Sci. 2009; 44:83-94.

Dr. Szendi Katalin - PTE...

Documents

Transcript of Dr. Szendi Katalin - PTE...