ŐKNÉL DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS - PTE...

TIM-3 ÉS GALECTIN-9 MOLEKULÁK VIZSGÁLATA EGÉSZSÉGES ÉS

PATHOLÓGIÁS TERHES, VALAMINT INFERTILIS N ŐKNÉL

DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS

MEGGYES MÁTYÁS

Pécsi Tudományegyetem Klinikai Központ

Orvosi Mikrobiológiai és Immunitástani Intézet

Témavezető: Dr. Szereday László, egyetemi docens

Programvezető: Prof. Dr. Szekeres-Barthó Júlia, egyetemi tanár

Doktori Iskola vezetője: Prof. Dr. Szekeres-Barthó Júlia, egyetemi tanár

2015

2

Tartalomjegyzék

Rövidítések jegyzéke ........................................................................................................ 5

I. Bevezetés ....................................................................................................................... 7

1.1. Immunológiai háttér ............................................................................................... 7

1.2. Az anyai immuntolerancia kialakulása .................................................................. 8

1.3. A TIM-3 ............................................................................................................... 11

1.4. A Galectin-9 (Gal-9) ............................................................................................ 14

1.5. A TIM-3/Gal-9 interakció .................................................................................... 15

1.6. A TIM-3/Gal-9 interakció vizsgálata transzplantációs kísérletekben .................. 16

1.7. A TIM-3 molekula vizsgálata humán kísérletekben ............................................ 17

II. Általános célkitűzések ................................................................................................ 19

III. Anyagok és módszerek ............................................................................................. 20

3.1. Mintalvétel ........................................................................................................... 20

3.2. PBMC (mononukleáris sejtek) szeparálás perifériás vérből Ficoll grádiensen ... 20

3.3. Szeparált sejtek fagyasztása és felolvasztása ....................................................... 20

3.4. A sejtek fenotípusos jelölése flow cytometriás méréshez ................................... 21

3.5. A kísérlet során használt ellenanyagok ................................................................ 21

3.6. Intracelluláris jelölés anti-perforinnal .................................................................. 21

3.7. FoxP3-at expresszáló sejtek fenotípus jelölése flow cytometriás méréshez ........ 22

3.8. CD107a aktivációs marker mérése ...................................................................... 22

3.9. Flow cytometria ................................................................................................... 22

3.10. TIM-3+/TIM-3- NK és CD8 szubpopulációk szeparálása ................................ 24

3.10.1. Mágneshez kötött sejtszeparálás (MACS) .................................................. 24

3.10.2. Fluoreszcens sejtszortolás ........................................................................... 25

3.11. PMA/Ionomycin kezelés .................................................................................... 25

3.12. Termelt cytokinek meghatározása ..................................................................... 26

3.13. Szolubilis Galectin-9 meghatározása ................................................................. 26

3.14. Statisztikai analízis ............................................................................................ 27

IV. TIM-3 és Galectin-9 molekulák expressziójának vizsgálata különböző immunsejt

szubpopulációkon egészséges terhesség három trimesztere alatt ................................... 28

4.1. Irodalmi háttér ...................................................................................................... 28

4.2. Célkitűzések ......................................................................................................... 30

4.3. Donorok, mintavétel ............................................................................................ 31

4.4. Eredmények ......................................................................................................... 31

3

4.4.1. Egészséges terhesség három trimeszteréből származó, illetve nem terhes

kontroll nők mononukleáris sejtjeinek fenotípusos analízise ................................. 31

4.4.2. CD3+ T, CD4+ Th, CD8+ Tc, NKT, NK és NK sejt szubpopulációk TIM-3

molekula expressziójának meghatározása flow cytometriás analízissel ................. 33

4.4.3. TIM-3 receptort expresszáló, illetve nem expresszáló perifériás CD8+ Tc,

NKdim és NKbright sejtek cytokin termelésének összehasonlítása ............................ 35

4.4.4. TIM-3 receptort exprersszáló CD8+ Tc, NK és NK sejt szubpopulációk

cytotoxikus aktivitásának meghatározása a terhességi trimeszterekben és nem

terhes kontroll mintákban ....................................................................................... 36

4.4.5. Szérum szolubilis Gal-9 molekula összehasonlítása a terhesség három

trimeszterében és nem terhes mintákban ................................................................ 39

4.5. Megbeszélés ......................................................................................................... 40

V. TIM-3 és Galectin-9 molekulák összehasonlító vizsgálata egészséges terhességben és

early-onset pre-eclampsiában ......................................................................................... 43

5.1. Irodalmi háttér ...................................................................................................... 43

5.2. Célkitűzések ......................................................................................................... 44


5.4. Eredmények ......................................................................................................... 46

5.4.1. Egészséges terhes és early onset pre-eclampsiás terhes mintákból izolált

mononukleáris sejtek fenotípusos analízise ............................................................ 46

5.4.2. TIM-3 receptor expresszió összehasonlító vizsgálata egészséges terhes és

early-onset pre-eclampsiás minták mononukleáris sejtjein .................................... 47

5.4.3. Gal-9 expresszió összehasonlítása egészséges terhes és early-onset pre-

eclampsiás minták mononukleáris sejtjein ............................................................. 48

5.4.4. Egészséges terhes és early-onset pre-eclampsiás nők CD8+ Tc és NK

sejteinek cytotoxikus aktivitása .............................................................................. 49

5.5. Megbeszélés ......................................................................................................... 51

VI. NK sejtek összehasonlító vizsgálata sikeres és sikertelen mesterséges

megtermékenyítésen átesett nőkben ............................................................................... 54

6.1. Irodalmi háttér ...................................................................................................... 54

6.2. In vitro fertilizáció (IVF) ..................................................................................... 56

6.3. Célkitűzések ......................................................................................................... 57


6.5. Eredmények ......................................................................................................... 59

4

6.5.1. Sikeres és sikertelen mesterséges megtermékenyítésen átesett nők NK és NK

sejt szubpopulációinak fenotípusos analízise, illetve aktiváló-gátló receptorainak

expressziója ............................................................................................................. 59

6.5.2. Sikeres, illetve sikertelen IVF eljáráson átesett nők NK és NK

szubpopulációinak cytotoxikus aktivitása és perforin expressziója ....................... 62

6.5.3. Sikeres, illetve sikertelen IVF procedúrán átesett nők NKT sejtjeinek

fenotípusos analízise, receptor és perforin expressziója ......................................... 63

6.6. Megbeszélés ......................................................................................................... 64

VII. Összegzés ................................................................................................................ 66

VIII. Új eredmények, következtetések ........................................................................... 68

IX. Az értekezés alapjául szolgáló eredeti közlemények ............................................... 69

X. Egyéb közlemények ................................................................................................... 69

XI. Irodalomjegyzék ....................................................................................................... 70

XII. Köszönetnyilvánítás ................................................................................................ 79

XIII. Mellékletek ............................................................................................................ 80

5

Rövidítések jegyzéke

ART : asszisztált reprodukciós kezelések

ANOVA : variancia-analízis

APC: allophycocyanin

At : antitest

CBA: Cytometric Bead Array

CRD: szénhidrát-felismerő domén

DC: dendritikus sejt

DMSO: dimetil-szulfoxid

EAE: kísérletes allergiás enkefalitisz

ELISA : enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálat

EVCT: extravillosus cytotrophoblast

FCS: borjú szérum

FSC: előre irányuló fényszórás

FITC : fluorescein isothiocyanate

Gal-9: Galectin-9

GBM : Glioblastoma Multiforme

GM-CSF: granulocyta-makrophág kolónia stimuláló faktor

HLA : human leukocyta antigén

Ig: immunglobulin

IFN- γγγγ: interferon gamma

IL : interleukin

iNKT : invariáns NKT sejt

IVF : in vitro fertilizáció

KIR : Killing Inhibitory Receptors

mAt: monoklonális ellenanyag

MACS: mágneshez kötött sejtszeparálás

MHC : klasszikus hisztokompatibilitási antigének

NK : Natural Killer (természetes ölősejt)

NKT : Natural Killer T sejt

NS: nem szignifikáns

NT: nem terhes

PBMC: perifériás vér mononukleáris sejtek

PBS: foszfát puffer

6

PE: phycoerythrin

PFA: paraformaldehid

PIBF: Progeszteron Indukálta Blokkoló Faktor

PMA : phorbol-12-myristate-13-acetate

RA: Reumatoid Arthritisz

RPMI : Roswell Park Memorial Institute-féle tápfolyadék

RT-PCR: real time PCR

SM: Sclerosis Multiplex

SSC: oldalra irányuló fényszórás

STBM: syncytiotrophoblast mikrovezikula

Tc: cytotoxikus T lymphocyta

TCR: T-sejt receptor

Th: T helper lymphocyta

TIM-3 : T-sejt Immunglobulin és Mucin domén-3

TNF-αααα: tumor necrosis factor alfa

TNFR: TNF-α receptor

Treg: regulatorikus T sejt

7

I. Bevezetés

1.1. Immunológiai háttér

A terhesség egy „immunológiai rejtély”, ugyanis a petesejt és a hímivarsejt

találkozásakor a fejlődésnek induló új egyed genetikai állományának felét az anyától felét az

apától örökli, így a magzat fele részben apai, az anyai immunrendszer számára idegen

antigéneket hordoz. Az allograftok kilökődéséért immunrendszerünk tehető felelőssé tehát a

terhesség ilyen szempontból immunológiailag paradoxonnak minősül, mivel a semi-allograft

magzat zavartalanul fejlődik a terhesség ideje alatt. Logikus lenne a magzat túlélése

szempontjából, hogy a rá jellemző antigének az anyai immunrendszer számára rejtve

maradjanak, és így felismerésük gátolt legyen. Jelenlegi ismereteink szerint azonban a magzat

jelenlétének immunológiai felismerése kifejezetten szükséges ahhoz, hogy elindítsa azokat a

mechanizmusokat, melyek a továbbiakban a védelmét szolgálják az anya immunrendszerével

szemben. Az a tény, hogy egészséges terhesség során az anyai immunrendszer nem támadja

meg a magzatot, olyan megváltozott immunológiai hátteret feltételez, amely bizonyos fokú

toleranciát biztosít a félig idegen antigenitású magzati szervezettel szemben a terhesség

sikeres kihordása érdekében. Ezzel szemben, az anya immunrendszerének az esetlegesen

fellépő fertőzések elleni védelmet is biztosítania kell, ami pedig pro-inflammatorikus

immunválaszokat igényel.

A magzat és az anya immunológiai kapcsolata tehát egy olyan kétoldalú folyamat,

melyet magzati részről az arra jellemző antigének prezentálása, anyai részről azok felismerése

és reagálva rá az immunválasz mértéke határoz meg. Terhesség során az említett anyai

immunválasz immunszupresszív jellegű, így például a cytokin termelés egyensúlya T helper

2-es (Th2) irányba tolódik el, illetve alacsony perifériás NK aktivitás figyelhető meg [1]. A

terhesség alatt az anyai immunválaszokat szabályozó immunregulációs folyamatok megfelelő

működése rendkívül fontos az előbb említett két ellentétes folyamat közötti egyensúly

kialakításában. Ennek az egyensúlynak a megléte biztosítja a magzat fejlődését, megbomlása

azonban koraszüléssel, pre-eclampsia kialakulásával vagy akár a magzat elvesztésével is

járhat.

8

1.2. Az anyai immuntolerancia kialakulása

Az anyai immuntolerancia kialakításában számos mechanizmus vesz részt, melyek

együttes jelenléte és összehangolt működése biztosítja a magzat zavartalan fejlődését.

Egyik ilyen tényező a magzat anatómiai elhelyezkedése az anyai szervezeten belül,

valamint az anyától elválasztó, illetve összekötő szövetek speciális tulajdonságai, melyek

részletes magyarázatot adnak az anyai immunrendszerrel való különleges kapcsolatra. A

placentában az anyai részt a terhes méh nyálkahártyája, a decidua vagy hullóhártya alkotja.

Az embrionális eredetű trophoblast sejtek képezik az anya és a magzati felszínek közötti

érintkezési felületet. A placenta bolyhos struktúráját adó cytotrophoblast és

syncyciotrophoblast rétegek mellett az extravillosus cytotrophoblast (EVCT) sejtek alkotják a

méhlepény invazív szubpopulációját, melyek az anyai szövetekbe hatolva képesek közvetlen,

sejt-sejt szintű kapcsolatot teremteni az anyai sejtekkel, így itt van elsősorban lehetőség a

magzati antigének anyai lymphocyták általi felismerésére, illetve az EVCT lehet az anyai

immunválaszok támadásának célpontja (1. ábra).

1. ábra. Az anya-magzat határfelület és az immunológiailag kiemeltem fontos magzati

trophoblast [2].

Az EVCT-ról ugyanis részben hiányoznak az egyén immunológiai ujjlenyomatának tekinthető

klasszikus hisztokompatibilitási antigének (HLA), melyeknek egyezése vagy különbözősége

határozza meg a beültetett szerv sorsát. Ha a beültetett szerv HLA antigénjei megegyeznek a

beteg HLA antigénjeivel, akkor a graft életben maradási esélyei jónak mondhatóak, azonban

ha a recipiens HLA antigénjei nagyban eltérnek a donorétól, a transzplantátum nagy

valószínűséggel kilökődik. Az EVTC-n a klasszikus polimorf HLA-A, illetve HLA-B

9

antigének nem fejeződnek ki [3], de kis mennyiségben a HLA-C igen [4]. Kimutathatóak rajta

továbbá trophoblast szövetspecifikus antigének és I. osztályú korlátozott polimorfizmusú

HLA antigének is (HLA-E, illetve HLA-G) [5] [6]. Ezek az antigének alacsonyabb

molekulasúlyúak, mint a klasszikus HLA antigének és hiányoznak róluk az apai

alléldeterminánsok, melyek a graft kilökődési reakciójának targetjei. A cytotoxikus T-

lymphocyták (Tc) aktiválódásának feltétele a klasszikus, polimorf HLA antigének jelenléte,

míg az NK sejtek aktiválódását éppen ezen antigének hiánya idézi elő. Az EVCT-n

nagymértékben expresszálódó HLA-G tehát nem képes antigént prezentálni a Tc sejteknek,

ezzel védve a trophoblast sejteket az eliminációtól, ugyanakkor képes az NK sejt gátló

receptorához is kapcsolódni, ami negatív szignált közvetít az ölő sejteknek, következésképpen

a HLA-G jelenléte védheti a trophoblastot a Tc-, illetve az NK sejt mediálta lízissel szemben

(2. ábra). Ezzel párhuzamosan az EVCT-n kis mennyiségben kifejeződő apai eredetű HLA-C

molekulák klasszikus gyulladásos reakciót váltanak ki lokálisan, ami a deciduális szöveti

struktúra oldásával és fellazításával megkönnyíti ezen sejtek invázióját.

2. ábra. A magzati trophoblaston expresszálódó HLA-G és interakciója az anyai immunrendszerrel [7].

Nagy szerepe van a deciduában hormonális hatásokra a perifériás vérhez képest

megváltozó lymphocyták arányának. Emelkedik például a deciduális lymphocyták mintegy

80%-át alkotó úgynevezett deciduális NK sejtek száma. Ezek az NK sejtek különböznek az

érett perifériás vérben keringő NK sejtektől, annak egy kis csoportjára, a CD56bright/CD16-

/CD3- emlékeztetnek és alacsony cytotoxicitással rendelkeznek [8]. Szintén emelkedik a

γ/δ T-sejtek száma is a perifériához képest, aminek a lehetséges oka a nem klasszikus HLA

molekulák antigén prezentáló szerepével hozható összefüggésbe. Ugyanis a klasszikus HLA

antigének hiányában valószínűtlen a trophoblaston kifejeződő antigének α/β T-sejtek általi

10

felismerése, de ősibb antigénfelismerő receptorral rendelkező γ/δ T-sejtek azonban képesek a

típusos MHC antigének, illetve az MHC nélküli antigének felismerésére is. A trophoblaston

lévő nem klasszikus HLA molekulák tehát antigént prezentálnak a γ/δ T-sejtek számára, és

egyidejűleg védik a trophoblastot az anyai immunrendszer támadásaitól. A regulatorikus T-

(Treg) sejtek számát illetően is emelkedés figyelhető meg, melyek elsődleges funkciója mind

a T helper 1 (Th1), mind pedig a Th2-es immunválaszok regulálása. A sejtek a periférián

válnak éretté, ahol kapcsolatba kerülnek a folyamatosan felszabaduló apai antigénekkel. A

szubpopuláció klonális osztódását követően a sejtek a feto-maternális határra vándorolnak és

ott egy toleráns mikrokörnyezet kialakítását indukálják az általuk termelt cytokinekkel [9].

Szintén lényeges feltétel a cytokin egyensúly eltolódása Th2-es irányba. A cytokinek

alacsony molekulasúlyú proteinek, glikoproteinek, melyek fontos szerepet játszanak a sejtek

közötti kommunikációban, illetve a sejtek differenciálódásának és proliferációjának

szabályozásában. A Th1-es cytokinek, mint az interferon gamma (IFN-γ), az interleukin-2

(IL-2) vagy a tumor necrosis alfa (TNF-α) celluláris immunválaszt indukálnak, míg a Th2-es

cytokinnek számító IL-4 vagy IL-10 termelődése humorális immunválasz során fokozódik. A

Th1 és Th2-es cytokinek aránya egyensúlyban van, de bizonyos esetekben eltolódhat

valamely irányába. Klinikai megfigyelések és kísérleti adatok egyaránt alátámasztják azt a

megfigyelést, hogy a terhességet Th2-es cytokin dominancia jellemzi (3. ábra), azaz

egészséges terhesség során a Th2-es szubpopulációba tartozó sejtek működése kerül túlsúlyba

és ezáltal a Th2-es típusú cytokinek irányába tolódik el az immunológiai egyensúly [10].

3. ábra. Th1 és Th2 cytokinek megoszlása a terhesség alatt

Th1

IFN γγγγTNFααααIL-2IL-12IL-15IL-18

Th2

IL-3IL-4IL-5IL-6IL-10IL-13

11

A terhesség alatt a megnövekedett Th1-es aktivitással járó krónikus autoimmun

betegségek tünetei enyhülnek, míg a terhesség után újabb relapszusok következnek be [11]. A

foetoplacentáris egység két oldala cytokinek termelésével hat egymásra, így például az anya

által termelt cytokinek befolyásolják a placenta méretét, ezzel szemben a placenta

antigénexpressziója pedig az anya által termelt cytokinekre van hatással. Egészséges

terhességből származó trophoblast sejtekkel stimulált lymphocyták Th2-es cytokineket

termeltek, míg vetélésből származó placenták sejtjei ugyanilyen körülmények között Th1-es

típusú cytokineket és immunválaszt indukáltak [12]. A cytokineket a terhesség sikeressége

szempontjából is két csoportba oszthatjuk. A Th1-es típusú cytokinek (IL-2, IFN-γ, TNF-α)

gyulladáskeltő hatásuk révén a terhesség megszakadásához vezethetnek ugyanis az IFN-γ Tc-

és NK sejteket aktivál, melyek károsíthatják a trophoblastot, illetve csökkenthetik a

trophoblast növekedését elősegítő Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor (GM-

CSF) produkciót. Gátolják továbbá a Th2-sejtek proliferációját, ezáltal a Th2-sejtek által

indukált B-sejt érést és immunglobulin termelést, továbbá kis dózisban korlátozza az

intrauterin növekedést, nagyobb dózisban pedig vetélést okozhat [12]. Ezzel ellentétben a

Th2-es cytokinek (IL-4, IL-5, IL-6, IL-10) az erős celluláris válasz gátlása révén előnyös

hatásúak a terhesség zavartalan lefolyása szempontjából.

1.3. A TIM-3

A TIM-3 (T-sejt Immunglobulin és Mucin domén-3) a TIM fehérje család tagja,

melyek az I-es típusú transzmembrán proteinekhez tartoznak, N-terminális végükön egy V-ös

típusú Immunglobulin (Ig) domén található, melyet egy változó hosszúságú mucin domén

követ, amelyen különböző számú O-glikoziláció található. Az N-glikolizáció a

transzmembrán domén előtt lévő, úgynevezett „stalk” doménen található, míg a receptorok

cytoplazmába nyúló része 38 és 65 aminosav között változik (4. ábra) [13]. Az egér genom 8

tim gént tartalmaz, ebből 4 kódol funkcionális fehérjét (tim-1-tim-4), míg a humán genomban

3 tim gén található, (tim-1, tim-3 és a tim-4), de homológ szekvenciáit megtalálták már majom

és patkány genomban is [14].

12

4. ábra. A TIM-3 receptor.

A TIM-3 receptort elsőként kísérletes allergiás enkefalitisz (EAE) egérmodellben (Th-

1 mediálta autoimmun betegség) kezdték vizsgálni, amelyet párhuzamba lehet állítani a

humán sclerosis multiplex-xel (SM) [15]. Az állatokat in vivo TIM-3 monoklonális

antitestekkel (mAt) kezelve súlyosabb klinikai megbetegedést, illetve az agyban sokkal

erősebb gyulladásos reakciót figyeltek meg. Nem volt azonban egyértelmű, hogy ezeket a

folyamatokat az anti-TIM-3 mAt kezelés hatására az emelkedett számú aktivált macrophágok

okozzák-e, elősegítve a Th1-es sejteknek az agyba való vándorlását vagy, hogy az ellenanyag

blokkolja-e a receptor és a ligandja közti kapcsolat létrejöttét, ami pedig a Th1-es sejtek

apoptózisát gátolja. A kísérleti eredmények alapján arra következtettek, hogy a TIM-3

szövetroncsoló gyulladásos immunválaszokban, EAE esetén egy negatív szabályzó molekula

és úgy azonosították, mint egy a CD4+ Th1-es sejteken igen, de a Th2-es sejteken nem

expresszálódó receptor fehérjét [16].

Ez a felvetés összhangban volt egy későbbi kutatás eredményeivel, melyek szerint

TIM-3-Ig fúziós protein alkalmazása a T-sejtek hyperproliferációját eredményezte továbbá

elősegítette cytokin termelésüket, gátolva ezzel a perifériás tolerancia mechanizmusok

kialakulását [17]. Ugyanezen TIM-3-Ig alkalmazása genetikailag TIM-3 deficiens egereknél

szintén a tolerancia mechanizmusok elmaradását eredményezte [17]. Hasonló következtetést

vont le egy a témával foglalkozó másik kutatócsoport is, mely szerint autoimmun diabetes

egérmodell vizsgálatakor, mikor is az egyedeken TIM-3 antitest, illetve TIM-3-Ig fúziós

protein kezelést alkalmaztak és mindkét esetben a betegség súlyosbodását tapasztalták [18].

13

Ebben a tanulmányban szerepel továbbá, hogy a TIM-3 receptor és a valószínűsíthető ligandja

közti kapcsolat blokkolása szintén a tolerancia kialakulásának elmaradását idézi elő, tehát a

TIM-3 és ligandja közti interakció létrejöttének gátlása ezen autoimmun betegség

súlyosbodásához vezetett. Kapcsolódóan ehhez a publikációhoz Kearley és mtsai. írták le,

hogy a TIM-3 receptor blokkolása a Th1-es immunválaszok up-regulációjával jár, amit pedig

a Th2-es immunválaszok intenzitásának csökkenése kísér [19]. Az utóbbi évek kísérleteiből

tehát egyértelműnek tűnik, hogy a TIM-3 a Th1-es immunválaszok negatív regulátora, de

újabban azt is valószínűsítik, hogy a T-sejtes válaszokban bizonyos körülmények, illetve

feltételek mellett pozitív szabályzó szerepe is lehet. Ugyanis a TIM-3 folyamatos

expresszióját figyelték meg monocytákon, dendritikus- (DC) és mikroglia sejteken, illetve a

TIM-3 ligand kötése egyaránt növelte ezen sejtek kostimulációs receptorainak expresszióját

és cytokin termelését [20]. Az antigén prezentáló sejtek folyamatos, illetve az effektor T-

sejtek kései, up-regulált TIM-3 expressziója lehetővé teszi, hogy a TIM-3 elősegítse egyrészt

a T-sejt aktivációt és differenciációt az immunválasz korai szakaszában, másrészt pedig hogy

az immunválasz kései szakaszban annak terminációjában is szerepet játsszon. Az azonban

még nem teljesen világos, hogy ezek a pozitív és negatív szabályozó folyamatok milyen

egyensúlyban vannak in vivo.

A legtöbb TIM-3-mal foglalkozó tanulmány a T-sejtekre illetve azok funkciójára

fókuszál, pedig szabályzó szerepet töltenek be egyes myeloid eredetű sejtek működésében is,

például hízósejtek esetében. Egér csontvelői sejtekből képzett hízósejteken kimutatták a TIM-

3 expressziót, illetve ezen hízósejtek poliklonális TIM-3 antitesttel való kezelése emelkedett

Th2-es cytokin illetve IgE produkciót mutatott [21]. Abból adódóan, hogy a TIM-3 a

veleszületett, illetve az adaptív immunrendszer sejtjein különbözőképpen expresszálódhat

képes elindítani vagy terminálni a Th1-es immunválaszokat, illetve befolyásolni számos

gyulladásos folyamat kimenetelét.

14

1.4. A Galectin-9 (Gal-9)

A galektinek az állati lektinek családjába tartozó molekulák, amelyek egy 130-140

aminosavnyi szénhidrát-felismerő doménen (CRD) keresztül képesek kapcsolódni a β-

galaktozidhoz [22]. Szerkezetük alapján a galektin molekulákat három csoportra oszthatjuk.

Az egyértékű galektineknek két azonos CRD-je van, ezáltal homológ CRD ligandok

keresztkötésére képes, míg a kiméra galektinek egy CDR-vel rendelkeznek, továbbá található

rajtuk egy nem- szénhidrát kötő domén is (5. ábra) [23]. A Gal-9 a kétértékű tandem repeat-et

tartalmazó galektinek csoportjába sorolható, melynek van két homológ, de különböző CRD-

je, amelyek egy linker fehérjén keresztül kapcsolódnak össze (5. ábra). A tandem repeat-et

tartalmazó galektinek N- és C-terminális régiójánál általában különböző a cukrot kötő

specificitás [24].

5. ábra. A galektinek csoportosítása.

A humán Gal-9 volt az első klónozott galektin molekula, melyet egy non-Hodgkin

lymphómában szenvedő betegből izoláltak [25]. Gal-9 expressziót már az adaptív

immunválasz alatt a különböző, T-sejt által átjárt szövetek sejtjein is kimutattak, mint például

endothélium, fibroblast vagy a tüdő epitheliális sejtjein [26], amelyből arra lehet

következtetni, hogy a Gal-9 egyaránt fontos szerepet játszik veleszületett- és a szerzett

immunválaszokban.

A Gal-9-et először eozinofil kemoattraktánsként azonosították, ami elősegíti a

szuperoxid produkciót és megnöveli a sejtek túlélését [27], ugyanakkor számos egyéb

biológiai folyamatban is nagy jelentőséggel bír, úgy mint sejtadhézió, proliferáció [28],

apoptózis [29], illetve a sejtciklus [30]. Bizonyítottan elősegíti a humán éretlen DC-k érését,

ezáltal stimulálja a természetes immunsejteket, illetve a veleszületett immunválaszokat [31].

Nemrég megjelent publikációkban leírták, miszerint anti-metasztatikus hatással is bír

bizonyos rákbetegségnél, úgy mint az emlőrák vagy az orális laphámkarcinóma [32]. Frissebb

15

eredmények szerint a Gal-9 kezelés pozitívan hatott egy indukált arthritis modellben [33],

továbbá Th17-sejtek szupresszióját és a Treg sejtek up-regulációját figyelték meg EAE

modellben [34]. Az eredményekből arra lehet következtetni, hogy a Gal-9 immuntoleranciát

idéz elő olyan esetekben, ahol az immunválaszok túlzott mértékűek, mint pl. az autoimmun

betegségeket is. Szintén bizonyítást nyert, miszerint a Gal-9 apoptózist indukál az aktivált

CD4+ Th sejtekben, ami a nyugvó sejtek esetében elmarad [35]. Hasonlóan a Th1-es sejtek

apoptózisát idézte elő EAE esetében is, ahol ezáltal lassult a betegség progressziója [36].

Nagahara és mtsai leírták, hogy a Gal-9 képes elősegíteni a TIM-3+ CD8+ Tc-sejtek

perforin, granzyme-B, illetve IFN-γ produkcióját [37]. Tumor indukálta immunszupresszív

állapotban a TIM-3/Gal-9 útvonalon keresztül antitumor aktivitása van, ugyanakkor

hyperimmun feltételek mellett apoptózist idéz elő TIM-3+ Th1-es, Th17-es és CD8+ Tc-

sejteken [34].

Egy nemrégen megjelent publikációban Oomizu és mtsai. olyan Gal-9+ sejtpopulációt

azonosítottak (Gal-9+ Th sejtek), amely összefüggésbe hozható a keringő Gal-9 molekula

koncentrációjával [38].

Egyre valószínűbb, hogy a Gal-9-nek egy „termosztát” szerű, kulcsfontosságú szerepe

lehet az immunológiai homeosztázis fenntartásában, ugyanis az immunrendszer túlzott

működése esetén immunszupresszív, míg immunhiányos állapotban az immunológiai

válaszképességet növelő hatása is bizonyított.

1.5. A TIM-3/Gal-9 interakció

A Th prekurzor sejtek differenciációja T effektor sejtekké és ezek klonális expanziója

rendkívül fontos az adaptív immunválaszokban, ami biztosítja a különböző pathogének és

intracelluláris vírusok elleni védelmet. Viszont a Th effektor sejtek korlátlan aktivációja sok

gyulladásos rendellenességhez vezet. Ilyen lehet például a reumatoid arthritis (RA), a belek

gyulladásos megbetegedései (Crohn-betegség), és egyéb autoimmun rendellenességek, mint

az I. típusú diabetes, a SM [39] de az allograft kilökődés is [40]. Ezzel ellentétben a Th2-es

sejtek aktivációja nélkülözhetetlen az allergiás asthma pathogenezisében [41] és a

transzplantációs tolerancia megszerzésében [40]. A T-sejt aktiváció mértéke és a

differenciáció módja a T-sejt receptor (TCR) mediálta stimuláció erőssége és időtartama által

meghatározott. Ráadásul sok egyéb molekula szabályozza a klonális expanzió és deléció

mértékét, valamint az anergiát, mint például a TNF-α receptor (TNFR) az immunglobulinok

(Ig), és a cytokinek közül az IL-2. Habár számos celluláris és molekuláris mechanizmus

16

ismert, melyek szabályozzák az éretlen T-sejtek aktivációját, azok a molekulák melyek

meghatározhatják egy effektor T-sejt szubpopuláció sorsát, továbbra is ismeretlenek.

Mint az immunglobulin szuperfamília tagja, a TIM-3 egy transzmembrán protein,

melynek expresszióját elsősorban a differenciált Th1-es sejteken írták le [16]. A Gal-9-et a

TIM-3 ligandjaként azonosították, melynek folyamatos expressziója T-sejtek felszínén kívül

egyéb szövetekben is megfigyelhető, így a thymus, lép, máj, vese, tüdő és különböző izmokon

is. Továbbá néhány gyulladáskeltő cytokin, úgy mint az IFN-γ vagy az IL-1β képesek

indukálni a Gal-9 expresszióját endotheliális illetve fibroblast sejteken [42].

Úgy tűnik, hogy a Gal-9 a Th1-es lymphocytákon sejthalált idéz elő, ha a TIM-3-mal

kölcsönhatásba lép, ami mind apoptózist mind nekrózist is jelenthet a kálcium-kalpain-

kaszpáz útvonalon keresztül (6. ábra) [36].

6. ábra. A TIM-3/Gal-9 kapcsolódás és hatásmechanizmusa [43].

1.6. A TIM-3/Gal-9 interakció vizsgálata transzplantációs kísérletekben

Szervtranszplantáció során a befogadó szervezet immunrendszere az átültetett szervet

idegenként ismeri fel és reagál rá [44]. Ez a graft ellen kialakuló immunválasz egy dinamikus

folyamat, melyben mind citopatikus, mind toleráns aktivitások megfigyelhetőek [45].

Egyértelmű tény, hogy az akut kilökődési fázis az immunválaszok eme két ellentétes

hatásának az eredménye [46], azonban ennek a mechanizmusnak a pontos folyamata még nem

teljesen tisztázott.

Wang és mtsai. egér bőr transzplantációs kísérletben vizsgálták a két molekula

kapcsolódásának következményeit. Eredményeik azt mutatták, hogy a TIM-3/Gal-9 kapcsolat

szignifikánsan gátolja az allograft kilökődését és meghosszabbítja a transzplantátum túlélését

17

in vivo. További megfigyelésük, hogy a Gal-9 kezelés dózisfüggően gátolhatja a TCR-kat in

vitro, ezáltal a T-sejtek proliferációját, illetve hogy a TIM-3/Gal-9 kölcsönhatás szelektíven

csökkenti a TIM-3+ Th1-es-sejtek működését, ezáltal gátolja a Th1-es immunválaszokat és

így növeli a bőrtranszplantátum túlélését. Eredményeik között szerepel továbbá, hogy a Gal-9

szignifikánsan csökkenti az IFN-γ produkciót in vitro és in vivo egyaránt, a CD8+ Tc sejtek

pedig jelentős alulműködést produkáltak, ha a transzplantációt követően Gal-9 kezelést

alkalmaztak [47].

Egy másik kísérletben a TIM-3 és a Gal-9 jelenlétét, illetve egyéb pro-

inflammatorikus hatást közvetítő molekula (IFN-γ, IFN-α, granzyme-B és perforin)

expresszióját vizsgálták vese allograft akut kilökődési fázisában. Eredményeik alapján az akut

kilökődési fázis alatt a Gal-9 kimutatható az allograft nefrektómiai mintáiból. Továbbá pozitív

korrelációt találtak a Gal-9 szint és a kilökődés súlyosságával. A TIM-3 és a Gal-9

expressziós szintje szintén pozitívan korrelál, ami Gal-9 szint növekedést feltételez a

cytotoxikus Th1-es immunválasz kialakulása során [48].

Jelenleg sok kutatás folyik a TIM-3/Gal-9 kölcsönhatásnak, mint szabályozó

mechanizmusnak a tisztázása érdekében, beleértve a szabályozás különböző szintjeinek

megértését, de még fontosabb az akut kilökődésért felelős cytotoxikus válaszok

ellensúlyozása. Ezek ismeretében olyan, eddig feltérképezetlen immunológiai

mechanizmusok megértése lenne lehetséges, amelyek ismerete hozzájárulhat az allograftok

sikeresebb túléléséhez.

1.7. A TIM-3 molekula vizsgálata humán kísérletekben

A TIM-3, illetve a Gal-9 molekulák expressziós mintázatát autoimmun betegségeknél

elsősorban SM-nél kutatják intenzíven. Az SM a központi idegrendszer egy definitív

autoimmun betegsége, mely különböző aktív és inaktív klinikai fázisokkal, illetve a betegség

lefolyása során változó Th1-es és Th2-es cytokinek termelődésével jellemezhető [49]. A TIM-

3 lényeges szerepet játszik a Th1-es immunválasz és a humán autoimmun betegségek

szabályozásában. Anderson és mtsai. SM-ben szenvedő betegek lépéből izolált természetes és

adaptív immunsejtek TIM-3 expresszióját vizsgálták. Eredményeik szerint a TIM-3 nyugalmi

állapotban elsősorban a DC-ken expresszálódik, ami elősegíti a sejtek TNF-α szekrécióját.

Th1-es immunválaszok során, a differenciálódott Th1-es sejteken a TIM-3 receptor nagyobb

arányban expresszálódik, mint a DC-ken, ami a Gal-9 mediálta jelátviteli útvonal up-

regulációját eredményezi, ez pedig megnövekedett IFN-γ produkcióhoz vezet. Végül a Gal-9

TIM-3 expressziót idéz elő a Th-1-es sejteken, ami megszünteti a Th1-es immunválaszt [20].

18

A kísérlet további részében megvizsgálták az átszűrődő monocyta és a központi

idegrendszeri fehérállomány mikroglia sejtjeinek TIM-3 expresszióját, illetve hatását a sejtek

cytokin termelésére SM-ban és Glioblastoma Multiforme-ban (GBM) szenvedő betegeknél. A

két esetben a cytokin termelés lényegesen különbözött ugyanis, míg az IFN-γ és a TNF-α,

mint a monocyták által termelt Th1-es cytokinek az SM-nél megjelentek, a GBM-nél nem.

Ebből arra következtettek, hogy a központi idegrendszerben lévő mikroglia és az átszűrődő

monocyták hozzájárulnak a központi idegrendszerben keletkező gyulladáshoz. Ezzel

ellentétben a TIM-3 expresszió a monocytákban és a mikrogliákban szignifikánsan

alacsonyabbnak bizonyult a GBM szövetben [20].

Egy másik kísérletben a TIM-3 receptor mRNS expresszióját vizsgálták SM-ben

szenvedő betegek Th1-es sejtjein in vitro. A kvantitatív real-time PCR (RT-PCR) eredmények

azt mutatják, hogy a humán Th1/Th0 sejtvonalak TIM-3 mRNS mennyisége magasabb, mint

a Th2-es sejtvonalaké alátámasztva, hogy a humán Th1 és Th2-es sejtek különböző mértékben

expresszálják a molekulát. A Th0 sejtek alacsonyabb TIM-3 expressziót mutattak, mint az

érett Th1-es sejtek, ami fontos szerepét támasztja alá ezen sejteknek a Th1-es

differenciációban. Leírták továbbá az agy-gerincvelői folyadékból izolált sejtek TIM-3

expressziója jól korrelál a különböző gyulladásos cytokinek az IFN-γ és a TNF-α

termelődésével [50].

19

II. Általános célkitűzések

A Pécsi Tudományegyetem Klinikai Központjának Orvosi Mikrobiológiai és

Immunitástani Intézetében működő Reproduktív Immunológiai kutatócsoport fő kutatási

területe a terhesség során a magzattal szemben kialakuló anyai immuntolerancia

mechanizmusok kialakulásának, szabályozásának és pathológiás megjelenési formáinak

vizsgálata.

Kutatásaim célja a feto-maternális tolerancia kialakításában részt vevő komplex

immun-regulatorikus mechanizmusok felderítése, funkcionális jellemzése volt.

Kutatómunkám során az említett toleranciát szabályzó folyamatokat egy új oldaláról

tanulmányoztuk; egy a közelmúltban azonosított és leírt ligand-receptor páros jelenlétét és

annak lehetséges funkcionális következményeit vizsgáltuk a terhesség során. A TIM-3 és a

Galectin-9 molekulák immunológiai toleranciában betöltött szerepére számos nemzetközi

publikáció hívja fel a figyelmet, terhességben betöltött szerepükről azonban igen kevés

információval rendelkezünk.

Ebből kifolyólag az alábbi kérdésekre kerestünk választ:

1. A TIM-3/Gal-9 útvonal szerepe egészséges terhességben

A terhesség előremenetelével hogyan változik a TIM-3 receptor és a Gal-9 ligand

sejtfelszíni kifejeződése az egyes lymphocyta szubpopulációkon terhes nők perifériás

vérében? Mik a funkcionális jellemzői az egyes TIM-3+ lymphocyta szubpopulációknak:

eltér-e cytotoxikus aktivitásuk, cytokintermelésük a TIM-3 negatív sejtekétől? Mutat-e

időfüggő változást a szérum szolubilis Gal-9 koncentrációja a terhesség előrehaladtával?

2. A TIM-3/Gal-9 útvonal lehetséges szerepe pathológiás terhességben

Mutat-e eltérést a TIM-3 és Gal-9 molekulák megoszlása, expressziója, az

immunológiai eredetű pre-eclampsiás betegek perifériás vérében egészséges terhesekhez

képest? Járnak-e az esetleges változások funkcionális következménnyel is?

3. TIM-3/Gal-9 útvonal prognosztikai szerepe mesterséges megtermékenyítés során

Elsősorban arra kerestünk válasz, hogy változik-e az NK sejtek aránya, receptor

expressziós mintázata, illetve funkciói az IVF beavatkozást követően, és ha igen, a

változásoknak van-e valamilyen hatása az eljárás sikeres kimenetelére.

20

III. Anyagok és módszerek

3.1. Mintavétel

Kísérleteink során perifériás vénából nyert, minimum 20 ml heparinizált vérmintából

indultunk ki, melyek a betegek hozzájárulásával, a Pécsi Tudományegyetem Orvostudományi

és Egészségtudományi Centrum Regionális Kutatásetikai Bizottság, illetve az Egészségügyi

Tudományos Tanács Tudományos Kutatásetikai Bizottságának engedélyével (8-289/2009-

1018 EKU) történtek.

3.2. PBMC (mononukleáris sejtek) szeparálás perifériás vérből Ficoll grádiensen

A perifériás vérmintát 1:2 arányban foszfát pufferrel (PBS) felhígítottuk majd a

szeparáláshoz használt Ficoll-Paque grádiens (GE Healtcare) fölé pipettáztuk. Ezt követően a

mintákat 20 percen keresztül 2000 rpm-en centrifugáltuk majd a Ficoll réteg felszínén

kialakult lymphocytákat és monocytákat tartalmazó gyűrűt leszívtuk és 10 percig 2000 rpm-

en centrifugálva mostuk. A felülúszó leöntését követően a sejteket 1 ml 10% FCS-t tartalmazó

RPMI1640 (Gibco) tápfolyadékban felszuszpendáltuk majd meghatároztuk a sejtszámot.

7. ábra. PBMC szeparálása perifériás vérmintából Ficoll grádiensen.

3.3. Szeparált sejtek fagyasztása és felolvasztása

A fagyasztás során a szeparált fehérvérsejteket 10 percig 2000 rpm-en centrifugáltuk,

majd 500 µl hő-inaktivált humán-szérumban (BioWest) vettük fel. Ezt követően 500 µl 20%-

os DMSO (dimetil-szulfoxid, Sigma-Aldrich) oldatot készítettünk a humán szérummal, amit

lassan cseppenként hozzáadtunk a humán-szérumban felszuszpendált lymphocytákhoz 1:1

21

arányban. A cseppenkénti hozzáadás az ozmotikus sokk és a felmelegedés okozta

hőkárosodás elkerülése végett szükséges, mely a DMSO vízzel való érintkezése során

következik be. A 10%-os DMSO oldatot tartalmazó humán savóban lévő sejteket 1 ml-es

fagyasztó kapszulákba osztottuk szét, és felhasználásukig –80°C-on tároltuk.

A minták felolvasztásakor a fagyasztókapszulát vízfürdőbe helyeztük, majd

felolvadása után tartalmát azonnal a felolvasztó médiumhoz adtuk. Ezt követően a

szuszpenzióból a DMSO-t kétszeri 10 perces 1500 rpm-en, tápfolyadékban történő mosással

távolítottuk el.

3.4. A sejtek fenotípusos jelölése flow cytometriás méréshez

A minták felolvasztását és DMSO mentesítését követően a sejteket fluorochrommal

konjugáltatott monoklonális ellenanyagokkal 30 percig, sötétben jelöltük. A nem kötődött

ellenanyagok és apoptotizáló sejtek eltávolítása érdekében a mintákat 2 ml PBS-ben, 5 percig,

2000 rpm-en mostuk és 1%-os paraformaldehyde (PFA)-ben fixáltuk. A mintákat +4°C-os

fokos hűtőben, sötétben tároltuk a flow cytometriás analízisig. A jelölt sejteket BD

FACSCalibur (BD Biosciences), illetve BD FACSCanto (BD Biosciences) flow

cytométerekkel mértük, melyhez CellQuest (BD Biosciences), illetve FACSDiva V6. (BD

Biosciences) szoftverek voltak rendelve, továbbá az eredmények kiértékeléséhez FCS express

V3. szoftver programot használtuk.

3.5. A kísérlet során használt ellenanyagok

A felszíni és intracelluláris jelölésekhez használt monoklonális ellenanyagok:

fluorescein isothiocyanate (FITC)-konjugált anti-humán CD3 (BD Biosciences) FITC-

konjugált anti-humán CD4 (BD Biosciences), FITC-konjugált anti-humán CD8 (BD

Biosciences), FITC-konjugált anti-humán CD107a (BD Biosciences), phycoerythrin (PE)-

konjugált anti-humán CD160 (BD Biosciences), PE-konjugált anti-humán TIM-3 (R and D

Systems), PE-konjugált anti-humán Galectin-9 (Biolegend), PE-konjugált anti-humán

NKG2D (BD Biosciences), PE-konjugált anti-humán CD69 (BD Biosciences), PE-konjugált

anti-humán perforin (BD Biosciences), allophycocyanin (APC)- konjugált anti-humán CD56

(BD Biosciences), APC-konjugált anti-humán CD8 (BD Biosciences), APC-konjugált anti-

humán TIM-3 (R and D Systems) APC-konjugált anti-humán FoxP3 (eBioscience).

3.6. Intracelluláris jelölés anti-perforinnal

A felszíni jelölés és az utána lévő mosást követően a sejteket 1:10 arányban Q vízben

higított BD FACSTM permeabilizáló oldatba (BD Biosciences) pipettáztuk és 10 percig

22

szobahőmérsékleten permeabilizáltuk. Az 5 perces, 2000 rpm-es mosást követően a sejteket

PE-el jelölt anti-humán perforinnal jelöltük. A 30 perces sötétben való inkubálás után a

sejteket 5 percig, 2000 rpm-en mostuk majd 300 µl 1% PFA-val fixáltuk és a flow

cytometriás mérésig +4°C-os fokos hűtőben tároltuk.

3.7. FoxP3-at expresszáló sejtek fenotípus jelölése flow cytometriás méréshez

A felszíni jelölést és az utána lévő mosást követően a sejteket a gyári diluensben 1:4

arányban higított permeabilizáló oldatban 1 órán át 4°C-on inkubáltuk. Ezt követően a

sejteket kétszer 2 ml, a PBS-el 1:10 arányban higított permeabilizáló pufferrel mostuk 5

percig, 2000 rpm-en. Ezután a mintáinkat APC-el jelölt anti-humán FoxP3 antitesttel

inkubáltuk, 1 órán át 4°C-on. Az inkubációt követően ismételten kétszer 5 perces mosás

végeztünk 2000 rpm-en a permeabilizáló pufferrel majd a sejteket 300 µl 1% PFA-val

fixáltuk és a flow cytometriás mérésig 4°C-on hűtőben tároltuk.

3.8. CD107a aktivációs marker mérése

A sejtek aktivációs potenciáljának meghatározásához a CD107a receptor expresszió

mérését használtuk, melyhez elsőként a sejteket 10% FCS-t, 50 µg/ml ionomycin-t (Sigma-

Aldrich), 1 µg/ml phorbol-12-myristate-13-acetate-ot (PMA) (Sigma–Aldrich) tartalmazó

tápfolyadékban szuszpendáltunk fel és 4 óráig, 37°C-on inkubáltuk anti-humán CD107a

ellenanyag jelenlétében. Ezt követően a mintákat 2 ml PBS-ben, 5 percig, 2000 rpm-en

centrifugáltuk majd elvégeztük a CD8+ Tc és NK sejtek fenotípusos jelölését. A mintákat

+4°C-os fokos hűtőben, sötétben tároltuk a flow cytometriás analízisig.

3.9. Flow cytometria

Az flow cytometria egy olyan eljárás, amely alkalmas vegyes sejtpopulációkban az

egyes sejtcsoportok elkülönítésére azok nagysága és a sejtalkotók granularitása alapján,

valamint sejtszinten több hullámhosszon azok fluoreszcens jeleinek detektálására.

23

8. ábra. Flow cytométer és működési elve.

Fluoreszcens festékkel jelölt sejtszuszpenziót a készülékben a köpenyfolyadék egy

kapillárisban áramoltatja (8. ábra). A kapillárisban haladó sejteket, mint részecskéket a

készülék nagyságtól függetlenül számlálja. Ezzel párhuzamosan hagyományos fényforrással

megvilágítva a sejteket, kétféle jelet detektálunk: 1. A fény előrefelé szóródása (FSC=

forward scatter): a sejtek nagyságáról ad információt. 2. A fénysugár oldalirányú szóródása

(SSC= side scatter): a sejtek granularitásával arányos. Ezen jeleket két detektor érzékeli, és

digitális jellé alakítja, amit egy számítógép program (BD FACS Diva V6. Software) ábrákon

(dot plot) jelenít meg. Minden részecske, egy pontként (dot) jelenik meg az ábrán nagyság és

granularitás szerint. Ezzel kevert sejtcsoportok (pl. perifériás vér) egyes sejttípusai külön

populációkat alkotva elkülöníthetők és számuk, százalékos arányuk meghatározható. Az

egyes sejtalkotók fluoreszcens jelét egyszerre több hullámhosszon mérhetjük. A készülékben

elhelyezett lézerek alkalmasak adott fluoreszcens festékmolekulák gerjesztésére. A

fluoreszcens festékek fényemisszióját detektorok mérik adott hullámhosszakon (FL-1, FL-2

24

FL-3, FL-4 csatornákon). A jelet átalakítva és ábrázolva lehetőség nyílik egy-sejt szinten

egyszerre több molekula fluoreszcens jelének detektálására.

Összefoglalásként elmondhatjuk, hogy szuszpenzióban lévő sejtek egyesével

áramlanak egy megvilágított térfogatban. A megvilágítás hatására azon sejtek, melyek

fluorochrommal vannak jelölve, a fény szórásán kívül még fluoreszkálnak is. Ezen optikai

jeleket megszűrve és összegyűjtve számokká alakíthatjuk, kiértékelhetjük, illetve

számítógépen tárolhatjuk. A jelölt sejteket olyan BD FACSCanto és BD FACSCalibur flow

cytométerrel analizáltuk, melyhez BD FACSDiva V6. és CellQuest software program volt

rendelve, így az eredmények elmentése és analizálása is akár rövid időn belül megoldható

volt.

3.10. TIM-3+/TIM-3- NK és CD8 szubpopulációk szeparálása

3.10.1. Mágneshez kötött sejtszeparálás (MACS)

A Ficoll kimosását követően a sejteket 2 ml, 4°C-os MACS pufferben (PBS 5% FCS-

sel kiegészítve) vettük fel és 1500 rpm-en 10 percig centrifugáltuk. A felülúszó leöntését

követően a sejteket ismét 2 ml, 4°C-os MACS pufferben felvettük majd a sejt aggregátumok

elkerülése végett egy előszeparáló szűrőn átszűrtük. A 10 perces, 1500 rpm-en történő mosást

követően a felülúszót leöntöttük majd a sejteket mágnessel konjugáltatott anti-humán CD56

ellenanyaggal (Milteny Biotech), 20 µl/107 sejt koncentrációban, 15 percig, jégen jelöltük. Ezt

követően a mintákat 2 ml, hideg MACS pufferben 10 percig, 1200 rpm-en centrifugáltuk

majd 500 µl, hideg MACS pufferben szuszpendáltuk fel és pipettáztuk a pozitív szeparációs

mágnes oszlopra (Milteny Biotech). A pozitív szeparáció elve alapján az antitesttel nem

jelölődött CD56 negatív sejtek kötődés nélkül áthaladnak az oszlopon, míg a jelölt CD56

pozitív sejtek az ellenanyaghoz kapcsolt mágneses gyöngy segítségével mágnesoszlophoz

kötődnek (9. ábra). Az oszlop háromszori átmosását követően a CD56 pozitív sejt frakciót egy

erőteljes mozdulattal az oszlophoz tartozó dugattyúval oldottuk le és számoltuk meg. A

visszamaradt CD56 negatív sejteket mágnessel konjugáltatott anti-humán CD8 ellenanyaggal

(Milteny Biotech), 20 µl/107 sejt koncentrációban jelöltük majd az előzőekhez hasonlóan

szeparáltuk a CD8 pozitív sejtpopulációt (9. ábra).

25

9. ábra. Mágneshez kötött sejt szeparálás (pozitív szeparációs elv).

A PBS-sel történő mosást követően az így kapott tiszta CD56+ szubpopulációt FITC

konjugált anti-humán CD3, PE konjugált anti-humán TIM-3 és APC konjugált anti-humán

CD56, míg a tiszta CD8+ sejtfrakciót PE konjugált anti-humán TIM-3 és APC konjugált anti-

humán CD8 antitestekkel jelöltük sötétben, szobahőmérsékleten, 30 percig. Az ezt követő

mosás után a sejteket 400 µl PBS-ben vettük fel további szeparációs eljárásokhoz.

3.10.2. Fluoreszcens sejtszortolás

A mágnessel szeparált majd fluoreszcensen jelölt sejteket BD FACS ARIA III (BD

Biosciences) sejtsorterrel válogattuk szét TIM-3 pozitivitásuk alapján. A BD FACS Diva V6.

software segítségével lehetőségünk nyílt a CD3- CD56dim TIM-3-, CD3- CD56dim TIM-3+

CD3- CD56bright TIM-3-, CD3- CD56bright TIM-3+, CD8+TIM-3- és CD8+TIM-3+

szubpopulációk különválasztására, melyeknek tisztasága minden esetben 95% felett volt.

3.11. PMA/Ionomycin kezelés

A szeparált sejteket 10% FCS-t tartalmazó RPMI 1640 tápfolyadékba gyűjtöttük majd

1500 rpm-en, 10 percig mostuk. A felülúszó eltávolítását követően a sejteket a sejtszámnak

megfelelően 50 µg/ml ionomycin, 1 µg/ml PMA valamint 10 % FCS-sel kiegészített RPMI

1640 tápfolyadékban szuszpendáltuk fel és overnight inkubáltuk 37°C-on. Másnap a 10

perces, 2000 rpm-en történő centrifugálás után a felülúszót összegyűjtöttük és további cytokin

vizsgálat céljából -80°C-on tároltuk.

26

3.12. Termelt cytokinek meghatározása

A felülúszók felolvasztását követően a jelenlévő cytokinek mennyiségét Human

Th1/Th2/Th17 Cytometric Bead Array (CBA) (BD Biosciences) kittel határoztuk meg. A

módszer nagy előnye, hogy minden mintából egyszerre tudtuk detektálni az IL-2, IL-4, IL-6,

IL-10, TNF-α, IFN-γ és IL-17A cytokineket. A CBA assay hétféle fluoreszcens festékekkel

megjelölt 2-10 mikrométer átmérőjű mikrogyöngyök keverékét tartalmazza, melyek

fluoreszcencia intenzitásuk alapján azonosíthatók flow cytométerben. A gyöngyök felszínére

más-más cytokinre érzékeny befogó antitest van kovalensen kötve, melyek képesek detektálni

a biológiai mintákban az antigént, ami jelen esetben a felülúszóban található cytokin. A

detektáló antitest PE-nel konjugált, ami a keresett antigénnel immunkomplexet képez (10.

ábra). Az egyes cytokinek koncentrációját a detektáló antitest gerjesztése által kiváltott

fluoreszcencia intenzitása alapján BD FACSCanto flow cytométerrel határoztuk meg.

10. ábra. Cytometric Bead Array technika [51].

3.13. Szolubilis Galectin-9 meghatározása

A perifériás vérből származó szérum Gal-9 szintjét szendvics enzimhez kapcsolt

immunszorbens módszerrel (ELISA) határoztuk meg, melynek lényege hogy a szilárd

felülethez kötött egyik komponens (ellenanyag) és az oldatban lévő másik komponens (jelen

esetben a fehérje) kapcsolódását az oldott komponenshez kovalensen kötött enzim működése

jelzi. Fontos, hogy a felületen több fehérje-kötőhely legyen, mint amennyi fehérje a mintában

van, így minden fehérje megkötésére adott a lehetőség. Az ellenanyag és a fehérje specifikus

kötésének kialakulásához meghatározott ideig inkubáltuk az elegyet, majd a rögzítetlen

anyagokat kimostuk. Ezt követően egy második, specifikus enzimmel konjugáltott ellenanyag

27

hozzáadása következett, így a vizsgálandó fehérjét egy „szendvics”-komplexbe zártuk. Az

antigén-fehérje kapcsolódás kimutatásához olyan kromogénre van szükség, amely az

enzimreakció következtében színváltozáson megy át. Így az átalakított kromogén intenzitását

megfelelő hullámhosszon ELISA plate reader spektrofotométerrel (BMG Biotech) mértük

majd a kapott abszorbancia értékeket kalibrációs görbe alapján koncentrációkra számítottuk

át. Ebben az esetben a mért abszorbancia a vizsgálandó fehérje (minta, antigén)

koncentrációjával egyenesen arányos lesz.

3.14. Statisztika analízis

Az eredmények kiértékelését, illetve a statisztikai összehasonlítást parametrikus

Student t-próbával, párosított t-próbával és ANOVA teszttel, valamint non parametrikus

Mann-Whitney-U teszttel végeztük SPSS V20. szoftver segítségével. A különbségeket

szignifikánsnak tekintettük, ha a p-érték kisebb vagy egyenlő volt, mint 0,05.

28

IV. TIM-3 és Galectin-9 molekulák expressziójának vizsgálata különböző immunsejt

szubpopulációkon egészséges terhesség három trimesztere alatt

A “Peripheral Blood TIM-3 Positive NK and CD8+ T Cells throughout Pregnancy: TIM-

3/Galectin-9 Interaction and Its Possible Role during Pregnancy” című közlemény alapján

(lásd mellékletek).

4.1. Irodalmi háttér

Az NK sejtek alkotják a T- és B sejtek mellett a harmadik legnagyobb lymphocyta

populációt. Ezekben a lymphocytákban nem történik meg sem az Ig-gének, sem a TCR

antigénfelismerő láncait kódoló gének átrendeződése és kifejeződése, tehát a T és B

lymphocytákéhoz hasonló antigénreceptoruk sincs. Az NK sejtek a veleszületett immunitás

fontos effektor sejtjei, az elpusztítandó célsejtet a T és B lypmphocytáktól eltérő

mechanizmusokkal ismerik fel. Egyrészt részt vesznek bizonyos típusú (elsősorban daganatos,

illetve vírussal fertőzött) sejtek közvetlen elpusztításában, másrészt immunválaszt moduláló

cytokineket termelnek. A humán NK sejtek a perifériás vér lymphocytáinak mintegy 10 %-át

alkotják, fenotípusosan a CD56 antigén jelenléte és a CD3 antigén hiánya jellemzi őket

[52],[53].

Az NK sejtek az elpusztítandó célsejtek között azok MHC-I molekulái alapján is

különbséget tudnak tenni. Az NK sejtek felszínén található receptorok között vannak olyanok

is, amelyek a partner-sejt MHC-I molekuláit ismerik fel. Az így létrejövő kölcsönhatás

azonban nem aktiváló, hanem gátló jeleket továbbít, ezért ezeket a receptorokat killing

inhibitory receptors (KIR) nevezik. A vírussal fertőzött sejtek és a daganatsejtek egyik

sajátsága, hogy teljesen vagy jelentős mértékben megszűnik az MHC molekulák megjelenése

e sejtek membránján. Ennek következtében a KIR „nem talál” ligandumot a partnersejt

felszínén, tehát nem tud gátló jeleket továbbítani, és így a sejtpusztítást eredményező

aktivációs folyamatok érvénysülnek és az NK sejt elpusztítja a vírussal fertőzött vagy

daganatsejtet.

A CD56 sejtfelszíni receptor denzitásától függően két további csoportra oszthatók,

mely felosztás úgy tűnik, egyúttal funkcióbeli különbséget is jelent. A humán NK sejtek

mintegy 90%-a kisebb mennyiségben hordoz a felszínén CD56 antigént (NKdim sejtek), mint a

többi 10% (NKbright sejtek). Több megfigyelés is támogatja azt az elképzelést, mely szerint a

NKdim sejtek végzik elsősorban a cytotoxikus sejtfunkciókat. Ezek a NKdim sejtek

cytotoxikusabbak NK érzékeny target sejtekkel szemben, mint a NKbright sejtek. Továbbá

konjugációs képességük is a megfelelő target sejttel szemben kétszerese a NKbright sejtekének,

29

ezen kívül mintegy tízszer annyi cytotoxikus enzimet tartalmaznak granulumaikban, ami

sokkal hatékonyabb cytolízist tesz lehetővé. Ugyanakkor viszont a NKbright sejtek különböző

stimulusokra szignifikánsan nagyobb arányban termelnek cytokineket [54]. Valószínűsíthető,

hogy a NKbright sejtek specializálódott NK sejtek, melyek az immunológiai mechanizmusokat

inkább a cytokin termelésükkel, mint cytotoxikus potenciáljukkal befolyásolják.

Az NK sejtek nemcsak a daganatos sejtek és különböző kórokozók elleni harcban

játszanak fontos szerepet, hanem meghatározó jelentőségük van a terhesség alatt is. A

bevezetőben részletes bemutatásra került a deciduális NK sejtek és az immunológiailag

kiemelten fontos trophoblast továbbá a trophoblaston expresszálódó HLA-G és HLA-E

molekulák közötti kapcsolat, illetve szerepük a terhesség szempontjából fontos intrauterinális

immunológiai mikrokörnyezet kialakításában.

Korábban a bevezetőben említésre került, hogy a TIM-3 és a Gal-9 interakciója a

receptort expresszáló CD4+ Th sejt apoptózisát idézi elő [36]. Ezek alapján azt

feltételezhetjük, hogy a TIM-3 képes módosítani a Th1/Th2-es egyensúlyt, továbbá az a tény,

hogy a TIM-3 expresszióját sikerült kimutatni DC-ken, valószínűsíti szerepüket a természetes

immunválaszok kialakulásában [55].

A TIM-3 receptor sok jellemzője párhuzamba állítható a terhesség során létrejövő

Th1/Th2-es cytokin eltolódással, illetve a veleszületett immunrendszer aktiválódásával. Ebből

a nézőpontból lehetséges, hogy a TIM-3 szerepet játszhat a szisztémás immunológiai védelmi

válaszokban a terhesség alatt, úgy, hogy mind a veleszületett, mind a szerzett immunrendszert

szabályozni képes.

Nagyon kevés kísérlet vizsgálta eddig a TIM-3-nak, illetve ligandjának, a Gal-9-nek a

kifejeződését, illetve interakciójuk funkcionális következményeinek hatását a terhesség során.

Egy nemrég publikált tanulmány syngén és allogén vemhes egérmodelleket hasonlított össze,

a veleszületett immunrendszer sejtjeinek TIM-3 receptor expressziója alapján. Kísérletük

során kimutatták a TIM-3 molekulát a 10,5 napos allogén vemhes állat uterusában, továbbá

összehasonlították az uterinális DC és makrophágok TIM-3 expresszióját különböző

terhességi korokban. TIM-3 blokkoló antitestet használva vizsgálták a molekula szerepét az

anyai immuntolerancia kialakulásában. Eredményeik szerint allogén terhesség esetén a TIM-3

receptor blokkolása szignifikánsan csökkentette az alom egyedeinek számát továbbá ezzel

párhuzamosan pedig növelte a foetalis resorpciók arányát [56].

Egy másik a TIM-3 receptort a terhesség során vizsgáló tanulmányban szintén a

természetes immunrendszer sejtjeinek TIM-3 expresszióját, illetve hatását elemezték humán

terhesség alatt. A publikált eredmények szerint a TIM-3 molekula up-regulációja figyelhető

30

meg a terhes anya veleszületett immunsejtjein, elsősorban a DC-ken, ami elősegítheti a

természetes és az adaptív immunrendszer válaszreakcióit, továbbá feltételezik, hogy a

terhesség során fellépő megváltozott TIM-3 szint károsan hathat a terhességre [57]. Ezen

eredmények alapján azt mondhatjuk, hogy a TIM-3 egy potenciális jelzőmolekula lehet,

mellyel talán előre megjósolható egyes, a terhesség során fellépő pathológiás elváltozások

bekövetkezése.

Érdekes eredményeket hozott a Gal-9 génexpresszió összehasonlító vizsgálata

egészséges vemhes és spontán vetélés egérmodelljei között különböző terhességi korokban.

Huesschen és mtsai. igazolták, hogy a 7,5 napos egér decidua Gal-9 mRNS szintje

megemelkedik a terhesség 13,5 napjára a vizsgált állatmodelleken. Immunhisztokémiai

módszerrel kimutatták továbbá, hogy a Gal-9-et expresszáló sejtek szignifikánsan nagyobb

arányban vannak jelen a spontán vetélő állat deciduájában mint az egészséges terhes állatéban

[58].

A fenti irodalmi adatokból egyértelműen látszik, hogy a receptor ligand kapcsolat

lényeges szerepet tölthet be a terhesség során megváltozott immunológiai folyamatokban.

Jelenleg egy olyan tanulmány sem készült, amely egy kontextusban vizsgálná TIM-3

receptort és a Gal-9 ligandot a terhesség viszonylatában.

4.2. Célkitűzések

Tekintve, hogy az irodalom rendkívül kevés adattal rendelkezik a TIM-3 és a Gal-9

terhességben betöltött szerepéről, jelen kutatásunk céljául tűztük ki ezen molekulák

vizsgálatát egészséges humán terhesség ideje alatt. Perifériás vérből izolált mononukleáris

sejtek fenotípusos elemzését, valamint az egyes sejtpopulációk TIM-3 és Gal-9

expressziójának összehasonlítását terveztük a különböző terhességi trimeszterek alatt, illetve

nem terhes kontroll mintákban. Funkcionális tesztekkel elemeztük az egyes szubpopulációk

terhesség alatti cytotoxikus aktivitását és cytokin termelését, továbbá ELISA módszerrel a

szérumok Gal-9 szintjét vizsgáltuk.

31

4.3. Donorok, mintavétel

Kísérletünkbe 87 nőt vontunk be, melyből 16 a terhesség első trimeszteri, 19 a

második trimeszteri és 22 a terhesség harmadik trimeszteri fázisában volt. A kontroll

csoportot 30 egészséges, nem terhes nő alkotta.

A kísérlethez szükséges minták az első trimeszter esetében 11-16-ik hét között, a

második trimeszter esetében 24-28-ik hét között, illetve a harmadik trimeszter esetében a 35-

38-ik hét között lettek levéve.

Nem terhes 1 trimeszter 2 trimeszter 3 trimeszter

Betegek száma 30 16 19 22

Életkor (évek) 33 (19-44) 31 (27-35) 32 (26-45) 33 (28-43)

Szülési terhességi hét - 38,8 38,0 39,0

Graviditás 1,5 1,2 1,9 1,7

Paritás 1,0 0,4 0,7 0,5

1. táblázat. A kísérletben részt vevő nők demográfiai és nőgyógyászati adatai (átlag értékek).

4.4. Eredmények

4.4.1. Egészséges terhesség három trimeszteréből származó, illetve nem terhes kontroll nők

mononukleáris sejtjeinek fenotípusos analízise

Részletesen elemeztük a CD3+ T sejteket, ezen belül a CD4+ Th, CD8+ Tc

szubpopulációkat, az NK (CD3- CD56+) sejteket és azok NKdim- és NKbright szubpopulációit,

továbbá az NKT (CD3+ CD56+)- valamint a Gal-9+ Th sejtek megoszlását egészséges

terhesség három trimeszterében, illetve nem terhes kontroll mintákban (2. táblázat).

Összehasonlítva a CD3+ T-, CD4+ Th-, CD8+ Tc-, NKT-, valamint az NK sejteket és

szubpopulációinak megoszlását nem találtunk szignifikáns különbséget a három trimeszter,

illetve a kontroll minták között. Az NK sejtek azon belül is a NKdim populáció aránya

magasabb míg a NKbright populáció aránya alacsonyabb volt a kontroll csoport mintáiban

összehasonlítva a különböző trimeszter mintáival, a különbségek nem érték el a statisztikai

szintet (2. táblázat).

Elemezve az Oomizu és mtsai által leírt Gal-9+ Th sejtpopulációt kimutattuk, hogy a

nem terhes mintákban 0,97% ezen sejtek aránya, illetve, hogy a terhesség előrehaladtával a

32

sejtek száma emelkedő tendenciát mutat. A harmadik trimeszteri nőkben 2,39% a Gal-9+ Th

sejtek aránya, amely érték szignifikánsan magasabb, mint az első, illetve a második

trimeszterben és a nem terhes kontroll nőkben mért értékeknél (11. ábra).

Nem terhes

1. trimeszter

2. trimeszter

3. trimeszter p-érték

CD3+ T sejt 66,64±2,23 65,10±3,27 69,43±3,33 67,74±1,34 NS

CD4+ Th sejt 44,04±2,32 39,92±2,28 45,68±3,47 39,03±2,60 NS

CD8+ Tc sejt 32,02±1,51 35,25±1,53 28,98±2,67 34,31±2,41 NS

CD8+ TIM-3+ Tc sejt 5,59±0,83 6,0±0,89 4,36±0,88 5,97±0,50 NS

NK sejt 13,65±1,38 12,31±1,85 10,69±1,74 11,47±1,53 NS

NKdim sejt 12,72±1,31 10,56±1,75 9,29±1,69 9,74±1,39 NS

NKbright sejt 1,03±0,24 1,80±0,29 1,44±0,30 1,76±0,24 NS

TIM-3+ NK sejt 9,61±1,41 9,16±1,53 7,34±1,30 9,05±1,30 NS

TIM-3+ NK dim sejt 9,02±1,38 8,10±1,42 6,49±1,25 8,07±1,23 NS

TIM-3+ NK bright sejt 0,61±0,18 1,11±0,22 0,93±0,24 1,11±0,17 NS

NKT sejt 4,08±0,75 6,37±1,21 4,70±0,98 5,46±1,26 NS

2. táblázat. Mononukleáris sejtek fenotípusos analízise egészséges terhesség három

trimeszteri és nem terhes kontroll mintáiból. Átlag ± SEM, ANOVA teszt, szignifikáns a

különbség ha, p≤0,05. NS: nem szignifikáns. NT: nem terhes.

33

11. ábra. Gal-9+ Th sejtek fenotípusos analízise egészséges terhesség három trimeszteri és

nem terhes kontroll mintáiból. Medián + interkvartilis + alsó/felső kvartilis terjedelem.

ANOVA teszt, szignifikáns a különbség ha, p≤0,05.

4.4.2. CD3+ T, CD4+ Th, CD8+ Tc, NKT, NK és NK sejt szubpopulációk TIM-3 molekula

expressziójának meghatározása flow cytometriás analízissel

Eredményeink alapján egészséges terhesség alatt az NK sejtek és azon belül a NKdim

szubpopuláció expresszálja legnagyobb arányban a TIM-3-at míg az NKbright szubpopuláció, a

CD8+ Tc, és a CD4+ Th sejtek receptor expressziójának szintje alacsonyabbnak bizonyult.

Megvizsgálva a CD3+ T sejteket, a TIM-3 receptor kifejeződése a harmadik

trimeszteri mintákban szignifikánsan magasabb, mint a többi vizsgált csoportban (nincs

ábrázolva). A CD8+ Tc sejtek esetében egy receptor expresszió csökkenést mértünk a

második trimeszteri nőknél a többi vizsgált mintához képest, ez azonban nem érte el a

szignifikáns szintet (12/A. ábra). NK sejtek esetében a harmadik trimeszteri nők NK

sejtjeinek TIM-3 expressziója szignifikánsan magasabb volt a második trimeszteri csoporténál

(12/B. ábra). Elemezve az NK sejt szubpopulációkat a harmadik trimeszteri NKdim sejtek

szignifikánsan nagyobb arányban fejezik ki a receptort, mint az első és második trimeszterből

származó, illetve a kontroll minták NKdim sejtjei, míg a NKbright szubpopuláció esetében a

kontroll mintákhoz képest emelkedik a TIM-3 expressziója, ami az egész terhesség alatt

34

megfigyelhető (12/B ábra). Az NKT sejtek TIM-3 expressziójában nem találtunk szignifikáns

különbséget a vizsgált csoportok között (nincs ábrázolva).

12. ábra. CD8+ Tc, CD4+ Th, NK és NK sejt szubpopulációk TIM-3 expressziójának

összehasonlítása egészséges terhesség három trimesztere alatt és nem terhes kontroll

mintákban. Medián + interkvartilis + alsó/felső kvartilis terjedelem. ANOVA teszt,

szignifikáns a különbség ha, p≤0,05.

35

4.4.3. TIM-3 receptort expresszáló, illetve nem expresszáló perifériás CD8+ Tc, NKdim és

NKbright sejtek cytokin termelésének összehasonlítása

Th1, Th2 és Th17-es cytokineket CBA módszerrel analizáltuk, amely során az IL-4,

IL-6, IL-10- és az NK sejtek esetében az IL-17 cytokin koncentráció a kimutathatósági határ

alatt maradtak.

Méréseink során kimutattuk, hogy a TIM-3+ CD8+ Tc sejtek szignifikánsan kisebb

mennyiségben termeltek pro-inflammatorikus (IL-2, TNF-α és IFN-γ) és Th17-es cytokineket

összehasonlítva a TIM-3 negatív CD8+ Tc sejtekkel az első és a harmadik trimeszterben,

valamint a nem terhes kontroll mintákban (3. táblázat).

Szintén szignifikáns csökkenést tapasztaltunk az TIM-3+ NKdim sejtek esetében az IL-

2 termelést illetően összehasonlítva a TIM-3 negatív NKdim sejtekkel az első és második

trimeszter mintáiban (3. táblázat).

Érdekes eredményeket mértünk a NKbright sejtek cytokin termelését analizálva ugyanis

a TIM-3+ NKbright szubpopuláció szignifikánsan nagyobb mennyiségű IFN-γ cytokint termelt

a terhesség második trimeszterében, mint a TIM-3 negatív NKbright szubpopuláció (3.

táblázat).

pg/ml Nem terhes 1. trimeszter 2. trimeszter 3. trimeszter

TIM-3+ TIM-3- p TIM-3+ TIM-3- p TIM-3+ TIM-3- p TIM-3+ TIM-3- p

NK dim

sejtek

IL-2 9,18 117,18 NS 9,53 62,95 <0,04 9,25 17,17 <0,01 9,23 80,71 NS

TNF-α 1625,01 2157,81 NS 1820,63 2278,48 NS 104,75** 793,57 NS 439,75** 403,62 NS

IFN-γ 2010,29 2172,1 NS 3095,85 3516,78 NS 218,03** 1095,87 NS 816,23*** 696,77$ NS

IL-17 <min <min NS <min <min NS <min <min NS <min <min NS

NK bright sejtek

IL-2 20,97 114,27 NS 13,25 39,99 NS 14 12,78 NS 12,93 50,89 NS

TNF-α 1211,37 1786,06 NS 1036,76 1315,13 NS 641,82 461,83 NS 1188,97 1046,67 NS

IFN-γ 1961,81 3513,19 NS 2656,23 2543,13 NS 1632,29 979,18 <0,04 1894,9 2136,18 NS

IL-17 <min <min NS <min <min NS <min <min NS <min <min NS

CD8 T

sejtek

IL-2 3076,06 6400,32 <0,05 2463,73 7812,88 <0,01 687,87 1276,9* NS 2587,58 7471,57 <0,03

TNF-α 1385,92 6064,46 <0,01 1217,89 6654,4 <0,01 356,7 1468,89$ NS 861,61 3427,65 <0,01

IFN-γ 3455,09 5750,34 NS 4223,87 6306,06 <0,05 908,5$$$ 2093$$ NS 2364,49 4851,96 <0,04

IL-17 17,33 345,2 <0,04 16,93 247,9 <0,05 9,83 11,49 NS 20,83 257,01 <0,04

3. táblázat. TIM-3+/TIM-3- CD8+ Tc, illetve NKdim és NKbright sejtek cytokin termelésének


mintákban. Átlag, ANOVA teszt, szignifikáns a különbség ha, p≤0,05. NS: nem szignifikáns.

* Szig különbség: Nem terhes; 1. és 3. trimesztertől (p<0,01) ** Szig különbség: Nem terhes és 1. trimesztertől (p<0,01) *** Szig különbség: Nem terhestől (p<0,05);1. trimesztertől (p<0,01) $ Szig különbség: 1. trimesztertől (p<0,01) $$ Szig különbség: 1. trimesztertől (p<0,04) $$$ Szig különbség: Nem terhestől (p<0,03);1. trimesztertől (p<0,05)

36

4.4.4. TIM-3 receptort exprersszáló CD8+ Tc, NK és NK sejt szubpopulációk cytotoxikus

aktivitásának meghatározása a terhességi trimeszterekben és nem terhes kontroll

mintákban

Vizsgálva a cytotoxikus aktivitással korreláló CD107a molekula kifejeződését a

harmadik trimeszter TIM-3+ CD8+ Tc sejtjei szignifikánsan nagyobb mennyiségben

expresszálják, mint a terhesség többi trimeszteréből származó, illetve a nem terhes kontroll

minták (13/A ábra). Figyelemre méltó eredmény továbbá, hogy a harmadik trimeszteri TIM-

3+ CD8+ Tc sejtek CD107a szintje szignifikánsan magasabb összehasonlítva a TIM-3 negatív

CD8+ Tc sejtekkel (13/A ábra).

A TIM-3+ NK sejtek cytotoxikus aktivitása a harmadik trimeszterben szignifikáns

emelkedést mutat, mint az első trimeszterben és a nem terhes mintákban (13/B ábra).

Összehasonlítva a TIM-3 receptort kifejező és nem kifejező sejtek CD107a expresszióját

minden vizsgált csoportban a TIM-3 negatív sejtek cytotoxikus aktivitása mutatkozott

magasabbnak (13/B ábra).

Az NKdim szubpopuláció cytotoxicitása hasonló mintázatot mutat, mint az NK sejteké,

mely szerint a CD107a expresszió a harmadik trimeszterben szignifikánsan magasabb, mint

az első trimeszterben és a nem terhes mintákban (14/A ábra). A vizsgált csoportok NKbright

sejtjeinek cytotoxikus aktivitásában szignifikáns különbséget nem tapasztaltunk (14/B ábra).

Összehasonlítva az NK sejt szubpopulációk TIM-3 pozitív és TIM-3 negatív

sejtpopulációit érdekes eredményeket kaptunk, amely szerint a TIM-3+ NKdim szubpopuláció

cytotoxikus aktivitása összes vizsgált csoportban szignifikánsan alacsonyabb, mint a TIM-3

receptort nem expresszáló NKdim szubpopulációkéval (14/A ábra). Az NKbright sejtek

vizsgálata során a nem terhes minták TIM-3 negatív szubpopulációjában szignifikánsan

emelkedett értéket mértünk a TIM-3 pozitív populációhoz viszonyítva. (14/B ábra).

37

13. ábra. TIM-3+/TIM-3- CD8+ Tc és NK sejtpopulációk CD107a expressziójának




38

14. ábra. TIM-3+ és TIM-3- NKdim és NKbright szubpopulációk CD107a expressziójának




39

4.4.5. Szérum szolubilis Gal-9 molekula összehasonlítása a terhesség három trimeszterében

és nem terhes mintákban

Megvizsgálva a szérum Gal-9 molekula koncentrációját, a nem terhes kontroll

mintákban szignifikánsan alacsonyabb értéket mutattunk ki, mint a trimeszterek mintáiban

(15. ábra). Összehasonlítva egymással a terhességi trimesztereket a második és harmadik

trimeszterben mért keringő Gal-9 molekula szignifikánsan nagyobb koncentrációban van

jelen, mint az első trimeszterben (15. ábra).

15. ábra. Szolubilis Gal-9 molekula koncentrációjának összehasonlítása egészséges terhesség

három trimesztere alatt és nem terhes kontroll mintákban. Medián + interkvartilis +

alsó/felső kvartilis terjedelem. ANOVA teszt, szignifikáns a különbség ha, p≤0,05.

40

4.5. Megbeszélés

Az anyai immunrendszer már a terhesség elején igen komoly változásokon esik át,

melyek a fejlődő magzat védelmét szolgálják az anya immunválaszaival szemben.

Egyre több kutatás bizonyítja, hogy a TIM fehérjecsalád tagjai az immunválaszok

egyik központi szabályzói, pleiotropikus hatásuk a reproduktív immunológiában azonban igen

kevéssé ismert.

Kísérleti eredmények igazolták, hogy a Gal-9 ligandnak kapcsolódva a TIM-3+

sejtekkel immunmoduláló hatása van, ami a Th1-es sejtek apoptózisához, valamint számos

cytokin termelődésének megváltozásához vezet. Számos publikáció leírta, hogy a receptor

ligand interakció többek között a T sejtek IFN-γ termelésének csökkenéséhez vezet, illetve

befolyásolja a T sejtes tolerancia mechanizmusok kialakulását is [17],[18].

Funkcionális tesztjeink során kimutattuk, hogy a TIM-3 receptort expresszáló CD8+

Tc sejtek szignifikánsan alacsonyabb mennyiségű pro-inflammatorikus és Th17-es

cytokineket termelnek összehasonlítva a TIM-3-at nem expressszáló CD8+ Tc

sejtpopulációval az első- és a harmadik trimeszteri terhes valamint a nem terhes kontroll

mintákban. Véleményünk szerint a terhesség során az emelkedő koncentrációjú szolubilis

Gal-9 kapcsolódva a CD8+ Tc sejtek TIM-3 receptorával gátolhatja ezt a pro-inflammatorikus

cytokin produkciót, ami hozzájárulhat a Th1 és Th17-es immunválaszok down-

regulációjához. Ezen eredményeinkre alapozva feltételezzük, hogy a Gal-9 képes szabályozni

a TIM-3+ CD8+ Tc sejtek cytokin termelését így pedig az immunválaszok Th2-es irányba

való eltolódásában is szerepet játszhat.

Megvizsgálva a TIM-3+ CD8+ Tc sejtek arányát és cytotoxikus aktivitását a

különböző terhességi korú nőknél az első és második trimeszterben nem tapasztaltunk

változást. Véleményünk szerint ez a TIM-3 negatív CD8+ Tc sejtekével megegyező

cytotoxikus aktivitás igazolhatja, hogy a TIM-3+ CD8+ Tc sejtek továbbra is részt vesznek a

pathogének elleni cytotoxikus immunválaszokban, de csökkent cytokin produkciójuk révén

hozzájárulhatnak a terhesség fenntartásához is az első két trimeszterben.

Ezzel ellentétben, a TIM-3+ CD8+ Tc sejtek száma nem szignifikánsan emelkedik a

harmadik trimeszterben összehasonlítva a második trimeszter értékével, továbbá ezek a

harmadik trimeszteri TIM-3+ CD8+ Tc sejtek szignifikánsan nagyobb cytotoxikus aktivitást

mutatnak, mint az összes többi csoportban vizsgált szubpopuláció. Ismert tény, hogy a szülés

immunológiai fázisában pro-imflammatorikus immunválaszok kerülnek túlsúlyba [59] [60],

fenti eredményeinkből pedig arra következtetünk, hogy a harmadik trimeszteri emelkedett

cytotoxicitású TIM-3+ CD8+ Tc sejtek részesei ezen folyamatoknak .

41

A különböző perifériás vagy deciduális NK sejtek és paramétereik beleértve a sejtek és

a szubpopulációk száma, aránya, cytotoxikus aktivitása, cytokin termelése vagy a különböző

aktiváló és gátló receptorok fehérje és génexpressziója intenzíven kutatott terület, azonban a

perifériás TIM-3 receptort expresszáló NK sejteket a terhességet végigkövetően elsőként

kutatócsoportunk vizsgálta.

Az NK sejtek megfelelő szabályzása nélkülözhetetlen a terhesség sikeres

kiviseléséhez. Irodalmi adatok támasztják alá, miszerint a perifériás vérben lévő NK sejtek

száma szignifikánsan nem változik a terhesség alatt, de a nem terhes kontroll mintákhoz

képest sem [61].

Kísérletünk során az NK sejteknél és a cytotoxikus NKdim szubpopulációnál egy

szignifikánsan emelkedett TIM-3 receptor expressziót mutattunk ki a harmadik trimeszter

mintáiban, összehasonlítva a második trimeszterrel, míg az NKbright szubpopulációnál

különbséget nem mértünk.

Vizsgálva az NK sejtek és szubpopulációik Th1, Th2 és Th17-es cytokin termelését

markáns különbségeket nem találtunk a TIM-3 pozitív és TIM-3 negatív alpopulációk

összehasonlításakor. Ugyanakkor az első és második trimeszteri TIM-3+ NKdim sejtek

szignifikánsan kevesebb IL-2 cytokint termeltek, mint a TIM-3 negatív NKdim sejtek. További

különbséget mértünk a TIM-3+ NKbright sejtek IFN-γ termelését illetően, amely szignifikánsan

magasabbnak mutatkozott összehasonlítva a TIM-3- NKbright sejteknél a második trimeszteri

mintákban.

Eredményeink alapján arra következtetünk, hogy a TIM-3+ NK sejtek, illetve a

keringő vagy membránhoz kötött Gal-9 közötti kapcsolat magyarázhatja az első és második

trimeszterben a periférián mért csökkent cytotoxikus aktivitást, azonban egy nemrég

megjelent publikáció a Gal-9-nek ezt a hatását egy TIM-3 receptor független útvonalon

értelmezi [62].

Az anyai immuntolerancia kialakításában és fenntartásában szerepet játszó

sejtpopulációk megfelelő működéséhez számos molekula hozzájárul. Egyre növekvő számú

publikáció valószínűsíti a galektin molekulák fontos szabályzó szerepét a terhesség alatt

[63],[64].

Számottevő irodalmi adat utal a Gal-9 komplex immunmoduláló szerepére mind a

veleszületett mind a szerzett immunválaszokban [65], amely számos immunsejtet érint.

Általánosságban elmondható, hogy a Gal-9-nek a veleszületett immunválaszok aktiválásában

[66],[67], illetve a Th1 és Th17 válaszok downregulálásában tulajdonítanak szerepet [34].

Legújabb kutatások szerint a Gal-9-nek egy NK sejt szabályzó és CD8+ Tc gátló hatása is

42

lehet, valamint képes elősegíti a Th2-es sejtek migrációját és a Treg sejtek expanzióját,

azonban terhességben ezek az eredmények még nem bizonyítottak.

A Gal-9 tehát szabályozhatja az NK és CD8+ Tc sejtek funkcióit a terhesség alatt, ez

azonban függ a terhességi kortól, a gyulladásos hatásoktól és a sejtek relatív receptor

expressziójától.

Eddig is ismert volt a Gal-9 jelenléte az anya-magzat határfelületen [68],[69], de

nemcsak a placenta expresszálja a ligandot, hanem egy a perifériás vérben található

sejtpopuláció is, a Gal-9+ Th sejtek. Kutatócsoportunk elsőként igazolta, hogy a terhes nők

szérumában igen magas koncentrációban található a Gal-9 molekula, összehasonlítva a nem

terhes mintákkal. Megvizsgálva a szérum Gal-9 szintet a különböző terhességi

trimeszterekben egy emelkedő tendenciát mutattunk ki, szignifikáns különbséggel a második

és harmadik trimeszterben összehasonlítva az első trimeszteri és nem terhes mintákkal,

továbbá ezen eredményekkel párhuzamosan emelkedik a Gal-9+ Th sejtek aránya is a

perifériás vérben. Véleményünk szerint ez lehet az egyik sejtpopuláció, amely Gal-9

szekréciójával meghatározza a terhes nők perifériás vér szérumának Gal-9 szintjét.

Jelenleg ismeretlen a Gal-9 molekula egészséges terhességben betöltött szerepe. A

különböző terhességi trimeszterekből és nem terhes kontroll mintákból mért szérum Gal-9

szint alapján feltételezhető lenne, hogy az terhesség előrehaladtával az egyre nagyobb

mennyiségben jelenlévő molekula a terhességre pozitív hatással van.

Eredményeink alapján úgy gondoljuk, hogy terhesség során a Gal-9 különböző

módokon befolyásolja a periférián a CD8+ Tc és NK sejtek működését. Feltételezzük, hogy

egészséges terhesség során az emelkedő szérum Gal-9 szint eredményezi TIM-3+ CD8+ Tc

sejtek csökkent pro-inflammatorikus cytokin produkcióját, valamint a TIM-3+ NK és NKdim

sejtek csökkent cytotoxikus aktivitását. Ismert tény, hogy a TIM-3-nak szerepet

tulajdonítanak az immuntolerancia kialakulásában [17], ezen tény és eredményeink tudatában

valószínűsítjük a különböző immunsejteken széles körben expresszálódó receptor szabályzó

funkcióját terhesség során.

Kísérleteink eredményei alapján elmondhatjuk, hogy a TIM-3 és Gal-9 molekulák

sejtfüggően képesek befolyásolni a CD8+ Tc és NK sejtek működését a terhesség alatt. A

periférián mért konzekvens eredményeink bizonyításához azonban további vizsgálatok

szükségesek, melyek tisztázhatják a TIM-3/Gal-9 útvonal szerepét az anya-magzat

határfelületen is.

43

V. TIM-3 és Galectin-9 molekulák összehasonlító vizsgálata egészséges terhességben és

early-onset pre-eclampsiában

Az “Involvement of Galectin-9/TIM-3 Pathway in the Systemic Inflammatory Response in

Early-Onset Preeclampsia” című közlemény alapján (lásd mellékletek).


A pre-eclampsia (terhességi toxémia) egy gyakori és súlyos humán terhesség

specifikus megbetegedés, amely a terhességek 3-5%-át érinti [70]. Általában a terhesség

második felében, 20. gesztációs hét után jelentkeznek klasszikus tünetei, a 160 Hgmm-nél

magasabb szisztolés vagy 90 Hgmm-nél magasabb diasztolés vérnyomás, a napi 5 grammnál

nagyobb mennyiségben ürített fehérje, illetve az ödéma kialakulása [71]. A kórkép

diagnózisát csak a klinikai tünetek megjelenése után tudják felállítani, azonban a pre-

eclampsia a legújabb kutatások szerint az implantációval összefüggő képet mutató betegség.

Az implantáció során a trophoblast sejtjeinek endometriumba történő inváziója figyelhető

meg, melynek során a méhfal spirális artériáinak módosítása (kolonizációja) a cél, hiszen az

embriónak közvetve, a placentán keresztül kell bekapcsolódnia az anyai vérkeringésbe, hogy

fejlődése biztosított legyen a terhesség során. Az implantáció végső lépéseként a trophoblast

sejtek megváltoztatják a méh keringését. A jelenlegi hipotézis szerint a trophoblast sejtek nem

megfelelő inváziója okozhatja a lokális anyai immunválaszokhoz való elégtelen

alkalmazkodást pre-eclampsia során [72],[73].

A magzat immunológiai felismerése, illetve az ez által kialakuló anyai

immuntolerancia nem csak az embrió beágyazódása vagy kilökődése miatt lényeges, hanem a

kezdődő implantáció és placentáció szempontjából is fontos. Az extravillosus trophoblaston

expresszálódó polimorf apai antigének az anyai deciduális szövetben inflammatorikus

természetű immunválaszokat idéznek elő, amely így alkalmassá válik a trophoblast sejtek

általi inváziós folyamatokhoz és a spirális artériák kialakulásához. Későbbiekben az apai

monomorf antigének a lokális anyai immunválaszok általi felismerése fogja limitálni a

placentáció mélységét [74],[75]. Pre-eclampsia során ez a trophoblast invázió zavart szenved,

ami placentáció zavarához, illetve alacsony méretű és tömegű méhlepény kialakuláshoz vezet

[76],[77]. Amint a magzat fejlődése felgyorsul (általában a 20. hét után) a kis méretű placentát

és funkcióját kompenzálni kell, ami a pre-eclampsia tüneteinek megjelenéséhez vezet. A

hypoxiás és oxidatívan stresszelt placenta ezen kompenzációs mechanizmusok ellenére is

különböző intrinsic (syncytiotrophoblast mikrovezikula (STBM), anti-angiogenetikus

faktorok) faktorokat termel és jutatt a keringésbe [78]–[82]. A csökkent méretű placenta által

44

termelt és keringésbe jutatott STBM szerepet játszik a pro-inflammatorikus immunválaszok

létrejöttében továbbá TNF-α [83],[84], IL-6 [85] és IFN-γ [86] szekréciót idéz elő, ami

hozzájárul a Th1-es immunválaszok túlsúlyának kialakulásához [87]. A betegség klinikai

megnyilvánulásának hátterében egy szisztémás gyulladásos immunválasz, illetve endotheliális

diszfunkció áll [88].

Kutatócsoportunk egy korábbi munkájában részletesen vizsgálta a kórkép

pathogenezisét és a veleszületett immunrendszer kapcsolatát, amely során a perifériás γ/δ T-

és invariáns NKT (iNKT) sejtek egy emelkedett cytotoxikus aktivitást mutattak, ami együtt

járt az NK sejtek megváltozott aktiváló és gátló receptor expressziós mintázataival [89]. A

jelenlegi elgondolás szerint a pre-eclampsiás betegeket a tünetek megjelenése alapján early

(34. hét előtti) és late (34. hét utáni) csoportba osztják [73]. A különbség a két pathológiás

állapot között a nem megfelelő placentáció kialakulásának oka. Az early-onset pre-eclampsiát

szokás „igazi pre-eclampsiának” nevezni, melynek pathomechanizmusát feljebb tárgyaltam.

Ellenben a late-onset pre-eclampsiás betegeknél az anya egy meglévő kórképe (pl. diabetes

mellitus, anémia, hegyi betegség) miatt kialakult hypoxia és mikrovaszkuláris megbetegedés

kompenzálására nagyobbodik meg a placenta, ami produkálja az early-onset tüneteihez

hasonló állapotot [73].


A fenti előzmények tükrében vizsgálataink céljául early-onset pre-eclampsiás betegek

és harmadik trimeszteri kontroll donorok perifériás véréből izolált mononukleáris sejtek flow

cytometriás analízisét tűztük ki. Részletesen kívántuk vizsgálni a különböző immunsejt

szubpopulációk fenotípusos megoszlását, továbbá ezen sejtek TIM-3 receptor és Gal-9 ligand

expresszióját. A sejtek cytotoxikus aktivitásának meghatározását a CD107a molekula

expressziós szintjének mérésével kívántuk elemezni.


Kísérletünk során 27 early-onset a terhességi pre-eclampsia tüneteit (magas

vérnyomás, proteinuria és ödéma kialakulás) mutató nőt vizsgáltunk. Hypertenziót jelent, ha

24 órán belül két különböző alkalommal mért diasztolés nyomás ≥90 Hgmm, a fehérjevizelést

24 óra alatt a vizeletből ≥5 g fehérje kimutatása jelentette. A kísérlethez tartozó kontroll

csoportot 25 a gesztációs kornak megfelelő egészséges terhes nő alkotta.

45

A pre-eclampsiás nők mintavételi időpontja a 29-34-ik terhességi hetek között történt,

míg az egészséges nők gesztációs ideje a mintavételkor megegyezett a pre-eclampsiás

csoportéval.

A vizsgálati protokoll megfelel az 1975-os Helsinki Nyilatkozat etikai irányelveinek.

Egészséges

terhes nők

Early-onset pre-

eclampsia p-érték

Betegek száma 25 27

Életkor (évek) 32,6±1,03 29,1±1,53 NS

A mintavétel terhességi hete 35,64±0,27 33,74±0,48 NS

A szülési terhességi hete 38,9±0,27 34,1±0,64 p<0,05

Születési súly (g) 3420±126,84 1881±148,28 p<0,05

Előző egészséges újszülött/donor 0,58±0,15 0,88±0,31 NS

4. táblázat. A kísérletben részt vevő nők demográfiai és nőgyógyászati adatai. Átlag ± SEM,

Student t-próba, szignifikáns a különbség ha, p≤0,05. NS: nem szignifikáns.

46

5.4. Eredmények

5.4.1. Egészséges terhes és early-onset pre-eclampsiás terhes mintákból izolált

mononukleáris sejtek fenotípusos analízise

Kísérletünk során részletesen elemeztük a CD3+ T sejtek ezen belül a CD4+ Th és

CD8+ Tc, a Treg, az NK ezen belül NKdim és NKbright valamint az NKT sejtek megoszlási

arányát a perifériás vérből egészséges terhes, illetve early-onset pre-eclampsiás mintákból (5.

táblázat).

Szignifikáns csökkenést tapasztaltunk a Treg, illetve a NKbright sejtek arányát illetően a

pre-eclampsiás csoportban összehasonlítva a kontroll mintákkal (5. táblázat).

Egészséges

terhes

Early-onset

pre-eclampsiás terhes p-érték

CD3+ T sejt 67,51±1,5 66,1±4,39 NS

CD4+ Th sejt 39,98±2,93 37,53±2,98 NS

CD8+ Tc sejt 31,29±2,52 29,92±2,52 NS

Treg sejt 0,92±0,12 0,55±0,08 p<0,05

NK sejt 9,91±0,94 8,12±1,25 NS

NKdim sejt 8,53±0,92 7,54±1,15 NS

NKbright sejt 1,41±0,12 0,61±0,13 p<0,01

NKT sejt 5,11±1,18 3,35±1,11 NS

5. táblázat. Mononukleáris sejtek fenotípusos analízise egészséges terhes kontroll és early-

onset pre-eclampsiás betegek mintáiból. Átlag ± SEM, Student t-próba, szignifikáns a

különbség ha, p≤0,05. NS: nem szignifikáns.

47

5.4.2. TIM-3 receptor expresszió összehasonlító vizsgálata egészséges terhes és early-onset

pre-eclampsiás minták mononukleáris sejtjein

Vizsgálva a TIM-3 expressziót az early-onset pre-eclampsiás mintákban szignifikáns

csökkenést figyeltünk meg a receptor expresszióban a CD8+ Tc, NK és a NKdim sejtek esetén

összehasonlítva a kontroll mintákkal, míg a NKbright sejteknél különbséget nem tapasztaltunk

(16. ábra).

16. ábra. CD8+ Tc, NK és NK sejt szubpopulációk TIM-3 expressziójának összehasonlítása

egészséges terhes kontroll és early-onset pre-eclampsiás betegek mintáiból. Medián +

interkvartilis + alsó/felső kvartilis terjedelem. Student t-próba, szignifikáns a különbség ha,

p≤0,05. NS: nem szignifikáns.

48

5.4.3. Gal-9 expresszió összehasonlítása egészséges terhes és early-onset pre-eclampsiás

minták mononukleáris sejtjein

Méréseink során a perifériás lymphocyták Gal-9 expressziójában szignifikáns

emelkedést figyeltünk meg az early-onset pre-eclampsiás CD8+ Tc, NK és a NKbright

sejtpopulációk esetében összehasonlítva az egészséges kontroll mintákkal, míg Treg sejtek

esetében különbséget nem mértünk (17. ábra).

17. ábra. CD8+ Tc, NK, NKbright és Treg sejtek Gal-9 expressziójának összehasonlítása


interkvartilis + alsó/felső kvartilis terjedelem. Student t-próba, a különbség szignifikáns ha,


49

5.4.4. Egészséges terhes és early-onset pre-eclampsiás nők CD8+ Tc és NK sejtjeinek

cytotoxikus aktivitása

Kísérletünk során szignifikánsan magasabb CD107a expressziós értéket mértünk az

early-onset pre-eclampsiás TIM-3+ CD8+ Tc (18/A ábra) és TIM-3+ NK (18/B ábra) sejteken

összehasonlítva az egészséges terhes kontroll azonos sejtpopulációival.

18. ábra. TIM-3+/ TIM-3- CD8+ Tc és NK sejtek CD107a expressziójának összehasonlítása




50

Elemezve a két NK sejt szubpopulációt szintén egy szignifikánsan emelkedett

cytotoxikus aktivitást mértünk az early-onset pre-eclampsiás nők TIM-3+ NKdim sejtjeinél

összehasonlítva az egészséges terhes nők mintáival (19. ábra), NKbright sejtek esetében

azonban különbséget nem tapasztaltunk a két vizsgált csoport értékeit illetően (19. ábra).

19. ábra. TIM-3+/ TIM-3- NK sejt szubpopulációk CD107a expressziójának összehasonlítása




51

5.5. Megbeszélés

A pre-eclampsia pathogenezisében az anyai immunrendszer központi szerepet játszik,

de a betegség pre-klinikai és klinikai stádiumait különböző módokon befolyásolja. Elsőként

meg kell említeni az implantáció során kialakuló a lokális immunválaszokhoz való elégtelen

alkalmazkodást, illetve ezt követően a trophoblast nem kellő mértékű invázióját, amik

együttesen eredményezik a későbbiekben kialakuló placenta alacsony oxigén és tápanyag

ellátását. A betegség kialakulásához hozzájárul az anyai oldalon, a deciduában az egészséges

terhességhez képest megváltozott működésű immunsejtek megjelenése is, melyek elsősorban

a veleszületett immunrendszer elemei, úgy mint az NK-, NKT- és γδ T sejtek. A klinikai

tünetek a kisméretű és a magzatot nem megfelelően tápláló placenta működésének

kompenzálásakor jelennek meg, így a mai vélekedés szerint az elégtelen placentáció az

elsődleges oka a pre-eclampsia kialakulásának. A betegség ezen fázisában a placentából az

anyai keringésbe jutó intrinsic faktorok szisztémás, nem specifikus gyulladásos

immunválaszokat generálnak. Ugyanis a placentából felszabaduló molekulák monocyták és

DC-k általi felismerése pro-inflammatorikus cytokinek keringésbe jutásához vezet, ami a

gyulladásos válaszok és reakciók irányába tolja el az immunológiai egyensúlyt.

Az anya klinikai tüneteket produkál, amíg a placenta az uterusban van, de ezek néha

még a szülést követően is fennmaradnak, ami az immunregulációs mechanizmusok elégtelen

működésére utalhat. Számos tanulmány igazolta a pre-eclampsiás betegek csökkent Treg

arányát [90]–[92], ezek a sejtek ugyanis különböző immunszuppresszív tulajdonságokkal

rendelkeznek, úgy mint gátló cytokinek termelése (TGF-β, IL-10) vagy a DC-k gátlása [93].

Eredetileg a TIM-3/Gal-9 interakció funkcionális következményét úgy definiálták,

hogy apoptózist indukál a Th1-es sejteken ezáltal gátolva a Th1-es immunválaszokat és az

IFN-γ szekréciót. Későbbi kísérletek azonban egyértelművé tették, hogy a kapcsolatnak fontos

szerepe van a transzplantációs immunológiában, fertőzéseknél, autoimmunitásban,

gyulladásokban és a tumor immunitásban is.

Egyre több kutatás foglalkozik a TIM-3/Gal-9 molekulákkal és kapcsolódásuk

funkcionális következményeinek hatásával különböző humán pathológiás állapotokban,

terhesség során szerepük azonban kevésbé ismert. Kutatócsoportunk egy korábbi munkájában

kimutatta, hogy a pre-eclampsiás betegek aktivált γ/δ T sejtjei emelkedett cytotoxikus

potenciállal rendelkeznek, ami együtt járhat a megváltozott TIM-3 expressziós mintázatukkal

[90]. Egy nem rég megjelent publikációban allogenikus egérmodellt használva Chabtini és

52

mtsai. a TIM-3 receptort expresszáló, a fetomaternális határon jelen lévő veleszületett

immunsejtek toleranciában betöltött szerepére hívják fel a figyelmet [56].

Az egyik TIM-3 és a terhesség kapcsolatát vizsgáló tanulmányban Zhao és mtsai.

kapcsolatot véltek felfedezni a vetélés és ezen nők perifériás véréből izolált monocytáinak

emelkedett TIM-3 expressziójában [57].

A fenti eredmények alapján elmondható, hogy a TIM-3/Gal-9 útvonal fontos szerepet

játszhat a terhesség során kialakuló immunregulációs folyamatokban, továbbá a receptor és a

ligandjának megváltozott expressziós szintje kapcsolatba hozható a pre-eclampsia során

megfigyelt aktivált Th1-es lymphocytákkal és a túlsúlyba kerülő Th1-es immunválaszokkal.

Jelen kutatásunkban a TIM-3 receptor expresszióját és funkcióját tanulmányoztuk

early-onset pre-eclampsiás nők perifériás vérében, különös figyelmet fordítva a terhesség

második felében a TIM-3 receptort expresszáló lymphocyta szubpopulációk ezen betegség

gyulladásos immunválaszaiban betöltött szerepére. Megvizsgálva az early-onset pre-

eclampsiás betegek perifériás véréből izolált sejtjeinek TIM-3 expresszióját szignifikánsan

alacsonyabb értéket kaptunk CD8+ Tc, NK és NKdim sejtek esetében összehasonlítva

egészséges terhes mintákkal. Érdekes módon a Gal-9 expressziós szintjét elemezve

szignifikáns emelkedést tapasztaltunk az early-onset pre-eclampsiás csoport CD8+ Tc, NK és

NKbright sejtjeit illetően összehasonlítva az egészséges terhességből származó mintákkal.

Kísérletünk folytatásában vizsgálva a sejtek cytotoxikus aktivitását emelkedést

figyeltünk meg az early-onset pre-eclampsiás csoport CD8+ Tc és NKdim sejtjeinél.

Véleményünk szerint a sejteken early-onset pre-eclampsia során megfigyelt alacsonyabb

TIM-3 expresszió teszi lehetővé Gal-9 általi negatív reguláció elmaradását, aminek

következménye lehet a Th1 és Th17-es immunválaszok up regulációja továbbá az early-onset

pre-eclampsiára jellemző szisztémás gyulladásos immunválaszok túlsúlyba kerülése. Ezzel az

állítással ellentétesnek tűnhet az early-onset pre-eclampsiás betegek CD8+ Tc és NK effektor

sejtjein mért emelkedett Gal-9 expresszió összehasonlítva az egészséges kontroll csoport

értékeivel, de véleményünk szerint ez is alátámasztja a Gal-9 mediálta szabályzó

folyamatokban megfigyelhető zavart.

Az inkább cytokin termelő [94], szövetbe és nyirokcsomóba vándorló NKbright sejtek

immunregulatorikus tulajdonságuk révén lényeges szerepet töltenek be olyan fiziológiás

állapotokban, ahol az immuntolerancia kiemelt fontosságú, mint amilyen a terhesség is [95].

Ismert tény, amely szerint a növekvő arányú NKbright sejtek kontakt függő módon képesek az

aktivált T sejtek túlélését befolyásolni [95], úgy gondoljuk, hogy az általunk mért emelkedett

Gal-9 expressziós szint ezen early-onset pre-eclampsiás betegek perifériás véréből izolált

53

NKbright sejteken egy kompenzáló mechanizmus lehet a szervezet részéről, mellyel ezen sejtek

szignifikánsan csökkent arányát próbálja ellensúlyozni.

Nemrégen közzétett tanulmányban Bielekova és mtsai. SM betegeknél daclizumab

terápia hatására a NKbright sejtek nagymértékű expanzióját figyelték meg, amely egyenes

arányt mutatott az agyban lévő gyulladás csökkenésével [96]. Ezen eredményekből kiindulva

valószínűsíthető, hogy a daclizumab kezelés elősegítheti a TIM-3/Gal-9 útvonal jövőbeli

terápiás módon való felhasználását.

Végeredményben elmondhatjuk, hogy az a tény mely szerint a legnagyobb mértékű

cytotoxikus választ a különböző lymphocyta szubpopulációban a TIM-3 pozitív sejtek

produkálták nyomatékosítja, hogy az early-onset pre-eclampsiával járó szisztémás

gyulladásos immunválaszokban a TIM-3 receptornak a szerepe vitathatatlan, továbbá

lényeges eleme lehet a terápiás céllal való immunszuppresszió létrehozásában is.

További kísérletekre van azonban szükség annak tisztázása érdekében, hogy TIM-3 és

a Gal-9 expressziója, illetve kapcsolódásuk hatásmechanizmusa miért mutat eltérő képet az

immunválaszokban egészséges terhesség és early-onset pre-eclampsiában.

54

VI. NK sejtek összehasonlító vizsgálata sikeres és sikertelen mesterséges

megtermékenyítésen átesett nőkben

A “Possible role of natural killer and natural killer T-like cells in implantation after IVF”

című közlemény alapján (lásd mellékletek).


Az NK sejtek terhesség során betöltött fontos szerepét hangsúlyozza, hogy hormonális

szabályozás alatt állnak, a menstruációs ciklus luteális szakaszában - amikor az implantáció

történik - számuk megemelkedik [97], illetve jelen vannak a terhesség korai szakában - a

trophoblast deciduába történő inváziója idején - és nagy számban találhatóak meg az infiltráló

trophoblast sejtek körül [98]. Ezzel szemben habituális vetélő nők deciduális és perifériás NK

sejtjei fokozott cytotoxicitást mutatnak és kórosan magas a deciduában a NKbright/CD16+

sejtek aránya a NKbright/CD16- sejtekhez képest [99].

A deciduában az anyai eredetű fehérvérsejtek többségét NK sejtek és T sejtek alkotják.

Az NK és T sejtek mediálta cytotoxicitás két kontakt-dependens mechanizmus segítségével

jöhet létre. Az első a lymphocyták granulumainak exocytosisát jelenti, melyet elsősorban a

CD8+ Tc-, NK és lymphokin aktiválta „killer” sejtek használnak. A célsejtettel történő

konjugáció után a cytotoxikus granulumok az érintkezési felület oldalára migrálnak és a

perforin molekula által a célsejteken okozott pórusokon keresztül azok elhalását okozzák

[100]. A második útvonal egy receptor-ligand (Fas/Fas-ligand) kapcsolódáson alapul, ezt a

mechanizmust főleg a T- és B lymphocyták, illetve az NK sejtek alkalmazzák a megfelelő

liganddal rendelkező célsejtekkel szemben [100].

A cytotoxikus lymphocyták lítikus granulumai, melyek tulajdonképpen szekretoros

lysosomáknak tekinthetők, perforint és egyéb szerin proteázokat (pl. granzyme-A és B)

tartalmaznak [101]. Perforint tartalmazó granulumok kimutathatóak az NK sejtekben, a γ/δ T

lymphocytákban és a CD8+ Tc sejtek szubpopulációjában. A perforin egy kb. 70 kDa-os

molekula, mely sejten belül lysosoma-szerű granulumokban tárolódik [102],[103] és

szabályozott szekrécióval jut ki az intracelluláris térbe, közvetlenül azután, hogy a

lymphocyta a célsejthez konjugálódott [104]. A perforin monomerek a szekréciós fázist

követően, Ca2+-ionok jelenlétében funkcionális csatornákká, más néven pórusokká

aggregálódnak a célsejtek membránjában, melyek felületén a perforin molekulák számára a

phosphorylcholin-lipid molekulák szolgálnak receptorként [105]. Ezen pórusok, hasonlóan a

komplementrendszer aktiválódásához, a célsejt membránjában annak megváltozott

permeabilitásához és végül a sejt ozmotikus líziséhez vezetnek.

55

Egészséges terhesekben az NK cytotoxicitás szignifikánsan alacsonyabb, mint a nem

terhes populációban, és ez az aktivitás a terminus közeledtével szignifikáns emelkedést mutat

[106]. Továbbá, a lymphocyták perforin expressziója a terminus időpontjában szintén

szignifikánsabban magasabb szintű, mint az első trimeszter környékén [107]. Az első

trimeszterben a perifériás lymphocyták 25-27 %-os perforin pozitivitásával szemben a

deciduában ugyanakkor a lymphocyták 55 %-a tartalmaz perforin granulumokat [108]. A

perforint expresszáló deciduális lymphocyták többsége funkciójában eltér a perifériás NK

sejtektől, hiszen a magas perforintartalom ellenére a lymphocyták cytotoxikus aktivitása

mégis alacsony hozzájárulva ezzel a terhesség zavartalan lefolyásához [109].

Az NK sejteken az utóbbi években számos, az MHC molekulák felismerésére képes

receptort azonosítottak. Ezek sejtfelszíni fehérjék, amelyek között mind gátló, mind pedig

aktiváló jelet továbbító receptorokat is találunk. Az NK sejt receptorok 3 strukturális családba

sorolhatók. A Killer immunglubulin like receptors család, melybe egyaránt aktiváló és gátló

receptorok is tartoznak. A HLA-C, HLA-B, illetve HLA-A specifikus NK receptorok, illetve

a harmadik csoport a C-típusú lektinek. A humán lektin típusú NK-receptorok polimorf,

HLA-A, HLA-B, HLA-C molekulákat felismerő heterodimer fehérjék, amelyek CD94-ből és

az ahhoz kovalens módon kapcsolódó, az NKG2 családba tartozó molekulákból állnak. Ilyen

gátló receptor a CD94/NKG2A, illetve aktiváló jelet továbbít a CD94/NKG2C és a

CD94/NKG2D receptor.

20. ábra. NK sejt gátló és aktiváló receptorok funkciója.

56

Az NK sejtek a cytotoxocitás és a cytokin termelés effektor funkciójával

rendelkeznek, melyek alkalmazása függ a sejtek felszínén kifejeződő aktiváló és gátló

receptorok kombinációjától, főként a specifikus MHC I osztály, illetve a nem MHC

természetű ligandoktól. Ha a gátló receptorok vannak túlsúlyban, akkor az inhibitoros

funkciók érvényesülnek és a célsejtet nem pusztítják el. Azonban ha az aktiváló receptorok

vannak többségben, akkor a sejtek speciális funkciója teljesül, amely a célsejt lízisét és

cytokin termelést foglal magában.

6.2. In vitro fertilizáció (IVF)

Az asszisztált reprodukciós kezelések (ART), azon belül az IVF és az embrió transzfer

ma már igen fontos szerepet játszanak a súlyos, egyéb módon nem kezelhető meddőségi

probléma megoldásában. A saját gyermekre vágyó meddő párok utolsó esélye, hogy egy

lombikbébi programba bekerülve orvosi segítséggel sikerüljön az utódnemzés.

A természetes fogamzások mintegy 30%-a még a beágyazódás előtt elpusztul, további

30%-uk már az implantációt követően, de még a terhesség klinikai jeleinek felismerése előtt

vész el, míg a spontán vetélés átlagosan 10%-ban fordul elő, így az élveszülések aránya 30%

körülire tehető. Mindezek ismeretében érthető az igény mind a kezelésre jelentkező párok,

mind az őket ellátó orvosok részéről arra, hogy az asszisztált reprodukciós kezelés során

fogant terhességek várható kimenetelét minél előbb és minél megbízhatóbban lehessen előre

jelezni, és amennyiben szükséges, a kezelést ezen információ birtokában módosítani.

2012-ben Magyarországon 4830 IVF kezelést végeztek, ebből 303 embrió beültetés

történt a Pécsi Tudományegyetem Szülészeti és Nőgyógyászati Klinikáján [110]. 2012-ben az

újszülöttek kevesebb, mint 2 százaléka fogant mesterséges úton [111]. Ezek alapján

kimondható, hogy az eljárás hozzáférhető és igen nagy arányban sikeres. Számtalan

tanulmány igazolta már, hogy milyen magas eredményességgel tud a kezelés segíteni meddő

párokon. Ugyanakkor a hatékonyság mellett, még mindig viszonylag kevés az információ az

eljárás biztonságosságáról, esetleges mellékhatásokról, szövődményekről.

A fogamzásnak és a sikeres IVF kezelésnek közös kulcspontja a beágyazódó embrió

és a méhnyálkahártya közötti interakció zavartalansága, amelyet az endometrium

receptivitásával jellemezhetünk. Számos tanulmány foglalkozik azzal, hogy milyen markerek

mérésével követhető nyomon a méhnyálkahártya állapota, mennyiben jelezhető előre az, hogy

egy adott ciklusban felkészült-e az endometrium a beültetendő embriók befogadására, vagy

érdemesebb azokat egy későbbi, a beágyazódás szempontjából kedvezőbb időpontig

fagyasztva tárolni.

57

Jelenleg az IVF eljárás egy hormonális kezeléssel kezdődik. Ez a stimulációs fázis,

amely során a petefészekben lévő petesejtek érésének fokozása történik. Ezt követően

megfelelő tüszőnövekedés esetén a petesejtek ultrahangos ellenőrzés mellett történő leszívását

végzik, amelyet a petesejtek megtermékenyítése és tenyésztése követ. A normálisan fejlődő

embriók méh üregbe való visszahelyezésére (embrió transzfer) a petesejtszívást követő

második-harmadik napon kerül sor (21. ábra). A sikeres megtapadás érdekében az embriók

visszaültetése után 2-3 órás fekvés, majd 2-3 hét otthoni pihenés ajánlott.

21. ábra. Az IVF protokoll lépései [112].


Jelen kísérletünk során sikeres és sikertelen mesterséges megtermékenyítésen átesett

nők perifériás véréből izolált NK-, illetve NK sejt szubpopulációk valamint NKT sejtek

összehasonlítását végeztük közvetlenül a beültetés előtt és 1 héttel utána. Részletesen

vizsgáltuk az NK sejtek különböző aktiváló receptorainak (NKG2D, CD69, CD160) valamint

a TIM-3 receptor expressziós szintjét, illetve változását az eljárás előtt és azt követően. A

CD107a és a perforin molekulák elemzésével a vizsgált sejtpopulációk funkcionalitására

voltunk kíváncsiak, illetve, hogy van-e valamilyen hatása ezen sejtek működésének a

mesterséges megtermékenyítés sikerességében.

58


Kísérletünk során 19 nőt vizsgáltunk, akiket a PTE-KK Szülészeti és Nőgyógyászati

Klinika IVF programja keretében kezeltek, megfelelő kivizsgálás után (hormonvizsgálat,

cytológia, laparoscopia, hysteroscopia, férj vizsgálata). A programba jelentkezett házaspárok,

vagy a feleség (petevezetők elzáródása, ill. hiánya, esetleg egyéb ok), vagy a férj (pl. alacsony

spermium szám) részéről meglévő elváltozás miatt természetes úton nem tudtak gyermeket

nemzeni.

Vizsgálataink során az első mintavétel a stimulációs fázis végén a pete leszívásának

napján, míg a második az embriók visszaültetését követő 7. napon történt.

Sikeres IVF

(terhes) Sikertelen IVF (nem terhes)

p-érték

Betegek száma 8 11

Életkor (évek, átlag) 36,87 35,18 NS

Tuba faktor (%) 27,27 22,5 NS

Apai ok (%) 45,45 62,5 NS

Egyéb (%) 27,27 25 NS

Ismeretlen (%) 0 0 NS

Meddőség hossza (évek) (átlag) 6,06 4,95 NS

Alap FSH szint (IU/ml) 7,63 6,29 NS

Korábbi sikertelen IVF beavatkozások száma 2,37 1,45 NS

Korábbi vetélések száma 0 0 NS

Nyert petesejtek száma (átlag) 6,6 9,63 NS

Felhasználható embriók száma (átlag) 4,62 4,45 NS

Beültetett embriók száma (átlag) 2,87 2,45 NS

6. táblázat. A kísérletben részt vevő IVF páciensek demográfiai és nőgyógyászati adatai

(átlag értékek). Student t-próba, szignifikáns a különbség ha, p≤0,05. NS: nem szignifikáns.

59

6.5. Eredmények

6.5.1. Sikeres és sikertelen mesterséges megtermékenyítésen átesett nők NK és NK sejt

szubpopulációinak fenotípusos analízise, illetve aktiváló-gátló receptorainak expressziója

Összehasonlítva az IVF előtti és utáni állapotot szignifikáns különbséget csak a

sikertelen csoportban mértünk. Ugyanis ezen páciensek perifériás vérében lévő NK sejtek és

NK szubpopulációk (NKdim, NKbright) aránya szignifikánsan megemelkedik 1 héttel az IVF

procedúra után összehasonlítva az eljárás előtti állapottal (22. ábra). Továbbá 1 héttel a

beültetést követően ezek az emelkedett arányban jelen lévő NK sejtek és NK szubpopulációk

szignifikánsan nagyobb arányban expresszálják a CD160 és NKG2D receptorokat

összehasonlítva az IVF eljárás előtti mintákkal (7. táblázat). Megvizsgálva a sikertelen IVF

procedúrán átesett nők NK sejtjeinek TIM-3 receptor (23. ábra), illetve CD69 (7. táblázat)

aktivációs marker kifejeződését a két mintavételi időpont között emelkedést tapasztaltunk,

ami azonban nem érte el a szignifikáns értéket.

60

Sikeres IVF Sikertelen IVF

Páciensek száma

8 11

IVF előtt IVF után p-érték IVF előtt IVF után p-érték

Fenotípusos megoszlás

NK sejt 11,09 ± 3,16 11,01 ± 2,8 NS 5,28 ± 0,74 9,66 ± 1,11 p<0,01

NK bright sejt 1,41 ± 0,42 1,67 ± 0,56 NS 0,47 ± 0,07 1,26 ± 0,39 p<0,04

NK dim sejt 9,94 ± 2,85 9,61 ± 2,38 NS 4,88 ± 0,73 8,53 ± 0,88 p<0,01

TIM-3 expresszió

NK sejt 38,98 ± 3,38 40,22 ± 6,49 NS 43,82 ± 3,37 50,47 ± 3,53 NS

NK bright sejt 44,23 ± 5,61 43,51 ± 9,05 NS 41,93 ± 4,06 54,07 ± 5,73 NS

NK dim sejt 38,26 ± 3,26 39,81 ± 6,49 NS 44,15 ± 3,47 49,52 ± 3,21 NS

CD69 expresszió

NK sejt 2,84 ± 0,7 3,27 ± 0,91 NS 3,51 ± 0,64 4,04 ± 0,82 NS


NK dim sejt 2,89 ± 0,69 3,31 ± 0,95 NS 3,7 ± 0,7 4,21 ± 0,87 NS

CD160 expresszió

NK sejt 26,31 ± 4,43 24,68 ± 5,69 NS 20,43 ± 3,38 27,71 ± 2,88 p<0,03


NK dim sejt 28,14 ± 4,69 26,04 ± 6,11 NS 21,25 ± 3,51 28,61 ± 2,84 p<0,05

NKG2D expresszió

NK sejt 73,7 ± 9,12 69,93 ± 8,6 NS 50,14 ± 8,35 71,64 ± 9,28 p<0,01


NK dim sejt 71,77 ± 9,38 68,27 ± 9,07 NS 47,81 ± 8,16 70,71 ± 9,38 p<0,01

7. táblázat. NK és NK sejt szubpopulációk fenotípusos analízise sikeres, illetve sikertelen IVF

kezelésen átesett nők perifériás vér mintáiból. Átlag ± SEM, párosított t-próba, szignifikáns a

különbség ha, p≤0,05. NS: nem szignifikáns.

61

22. ábra. NK és NK sejt szubpopulációk megoszlása sikeres, illetve sikertelen IVF kezelésen

átesett nők perifériás vér mintáiból. Átlag ± SEM, párosított t-próba, szignifikáns a különbség

ha, p≤0,05.

23. ábra. NK és NK sejt szubpopulációk TIM-3 expressziója sikeres, illetve sikertelen IVF

kezelésen átesett nők perifériás vér mintáiból. Átlag ± SEM, párosított t-próba, szignifikáns a

különbség ha, p≤0,05.

62

6.5.2. Sikeres, illetve sikertelen IVF eljáráson átesett nők NK és NK szubpopulációinak

cytotoxikus aktivitása és perforin expressziója

Funkcionális tesztjeink során az NK sejtek cytotoxikus aktivitását és perforin

termelését vizsgáltuk sikeres és sikertelen IVF-en átesett nőknél összehasonlítva a

beavatkozás előtti és utáni állapotot. Perifériás vérből származó mintáinkból a sikertelen IVF

kezelésen átesett csoportban az eljárás után szignifikánsan megemelkedett a perforin

granulumok száma a NKbright sejteknél (8. táblázat). A cytotoxikus aktivitás vizsgálatakor az

NK és NKdim sejtek szignifikánssan emelkedett CD107a expressziót mutattak egy héttel az

embrió visszaültetését követően azon pácienseknél, akiknél később sikertelenül zárult a

procedúra. (8. táblázat).


Páciensek száma

8 11


Perforin expresszió

NK sejt 52,54 ± 6,53 50,05 ± 4,96 NS 55,59 ± 4,16 57,51 ± 3,23 NS

NK bright sejt 16,75 ±3,92 18,51 ± 5,21 NS 15,29 ± 5,24 24,34 ± 5,49 p<0,02

NK dim sejt 55,51 ± 7,02 52,41 ± 5,25 NS 58,44 ± 4,08 60,00 ± 3,34 NS

CD107a expresszió

NK sejt 15,69 ± 2,6 15,27 ± 3,8 NS 12,48 ± 2,23 15,94 ± 2,57 p<0,02


NK dim sejt 16,73 ± 2,64 15,68 ± 3,96 NS 12,01 ± 2,49 15,92 ±2,52 p<0,02

8. táblázat. NK és NK sejt szubpopulációk cytotoxikus aktivitása és perforin expressziója

sikeres, illetve sikertelen IVF kezelésen átesett nők perifériás vér mintáiból. Átlag ± SEM,

párosított t-próba, szignifikáns a különbség ha, p≤0,05. NS: nem szignifikáns.

63

6.5.3. Sikeres, illetve sikertelen IVF procedúrán átesett nők NKT sejtjeinek fenotípusos

analízise, receptor és perforin expressziója

Kísérletünk során részletesen elemeztük az NKT sejtek felszínén lévő receptorok

expressziós szintjét sikeres és sikertelen mesterséges megtermékenyítésen átesett nőknél.

Sikertelen beültetést követően szignifikánsan megemelkedett az NKT sejtpopuláció aránya

összehasonlítva a beültetést megelőző állapothoz képest (9. táblázat). Megvizsgálva a sejtek

perforin granulumainak expresszióját sikeres IVF beavatkozást követően számuk

szignifikánsan lecsökkent az eljárás előtti állapothoz viszonyítva. Hasonló mintázatot mutatott

ezen csoportban a CD160 aktivációs receptor expressziója is. A sikertelen eljáráson átesett

nőknél azonban a CD160, illetve egy másik általunk vizsgált aktivációs receptor az NKG2D

expressziója szignifikánsan megemelkedik a beavatkozás előtti szinthez hasonlítva (9.

táblázat).


Páciensek száma

8 11


Fenotípusos megoszlás

NKT sejt 3,57 ± 0,67 4,56 ± 1,92 NS 3,33 ± 1,35 4,26 ± 1,52 p<0,01

Receptor expresszió

TIM-3 7,15 ± 1,49 6,45 ± 0,98 NS 8,75 ± 1,49 6,45 ± 0,98 NS

CD69 5,51 ± 1,87 6,05 ± 1,85 NS 3,88 ± 1,01 4,72 ± 0,81 NS

CD160 3,09 ± 0,82 2,04 ± 0,81 p<0,05 1,57 ± 0,36 2,20 ± 0,5 p<0,04

NKG2D 65,65 ± 8,98 62,03 ± 8,91 NS 41,96 ± 7,27 65,59 ± 9,25 p<0,01

Perforin expresszió 23,38 ± 4,52 13,52 ± 2,38 p<0,02 17,73 ± 2,39 18,41 ± 3,73 NS

9. táblázat. NKT sejtek fenotípusos analízise sikeres, illetve sikertelen IVF kezelésen átesett

nők perifériás vér mintáiból. Átlag ± SEM, párosított t-próba, szignifikáns a különbség ha,


64

6.6. Megbeszélés

Az asszisztált reprodukciós technikák mára rutin nőgyógyászati módszereknek

tekinthetőek és habár eredményességük megkérdőjelezhetetlen, a beavatkozások egy jelentős

hányada sikertelenül végződik, ami anyagilag és érzelmileg igen megterhelő a programban

részt vevő párokra nézve. Az utóbbi időben jelentős kutatások történtek az IVF kezelések

hatékonyabbá tételét, illetve a várható eredményük minél pontosabb előrejelzését illetően.

Ezek a vizsgálatok elsősorban az IVF-re váró anyák immunprofiljának analízisét jelentik,

ugyanis az ismeretlen anyai infertilitás, az ismétlődő spontán abortusz és az implantáció

sikertelensége visszavezethető az anyai pathológiás immuntolerancia mechanizmusokra. Az

NK sejtek számának és funkcionalitásának elemzése IVF programban részt vevő nőknél egy

intenzíven kutatott terület. Beer és mtsai. kimutatták, miszerint a perifériás vér 18% fölé

emelkedett NK sejt szintje negatív prognosztizáló faktor többszörös sikertelen IVF kezelésen

átesett ismeretlen eredetű infertilis nők esetében [113]. Egy másik tanulmány nem talált

szignifikáns különbséget a sikeres és a sikertelen IVF procedúrán átesett nők perifériás NK

sejt számát illetően [114], ellenben egy másik kísérletben szintén IVF kezelésen átesett nőknél

a perifériás NKdim CD16+ CD69+ sejtek emelkedett cytotoxicitása összefüggött a terhességek

sikertelenségével [115]. Egy prospektív vizsgálat során komoly rizikófaktornak minősítették

az IVF eljárás sikertelenségét illetően a CD69 és CD161 NK aktivációs marker emelkedett

expresszióját, illetve a megnövekedett cytotoxicitást [116].

Kísérletünkben az IVF program során kezelt nők analízisét egy az eddigiektől eltérő

módon végeztük. Amellett, hogy különválasztottuk a sikeres és sikertelen IVF eljáráson

átesett nőket, további két időpontban a petesejt leszívásának napján, illetve az embrió

transzfert követő 7. napon is vizsgáltuk az NK és NKT sejtek megoszlását és tulajdonságaikat.

Egy héttel a sikertelen beültetést követően megemelkedett az NK- azon belül a NKdim és a

NKbright továbbá az NKT sejtpopulációk aránya is a perifériás vérben. Ugyanezen csoportban

magasabb volt a NKbright sejtek perforin expressziója, amit az összes vizsgált sejtpopuláció

megnövekedett NK aktiváló receptorainak (CD160, NKG2D) expressziója kísért. Egy 2008-

as tanulmány szerint a sikertelen IVF csoportban mért emelkedett NKbright sejt arány

összefügghet a nem megfelelő deciduális mikrokörnyezettel, ami jelezheti a beágyazódás

sikertelenségét [116]. Jelenlegi eredményeink szerint a sikertelen terhesség alatt az emelkedett

aktiváló NK sejt receptorok expressziója szoros összefüggést mutat egyéb a témában készült

publikációk eredményeivel [117] [118].

Eredményeink alapján elmondhatjuk, hogy a sikeres IVF kezelés előtt az NK sejtek

aránya szignifikánsan magasabb, mint a sikertelen beültetést megelőzően, azonban ez az érték

65

nem éri el a Beer mtsai. által leírt abnormális 18%-os arányt [113]. Mindazonáltal

feltételezhető, hogy a sikertelen IVF kezelés egyik oka éppen az NK sejtek arányának

szignifikáns emelkedése a petenyerés és az embrió transzfert követő 7. napi mintavétel között

eltelt időben. A két mintavétel között eltelt rövid idő alatt az NK és NKT sejtek Th1-es irányú

változásai mutathatóak ki a sikertelen IVF programban részt vett nőknél, ami összefüggésbe

hozható a kezelésük kimenetelével. Ezt alátámasztja a sikertelen embrió beültetést követő

mintavétel során mért emelkedett cytotoxikus aktivitás az NK és NKdim szubpopulációk

esetében. Vizsgálva a terhes nők követéses kísérletének eredményeit különbséget nem sok

esetben találtunk összehasonlítva a két mintavétel eredményeit. Az NKT sejtek CD160 és

perforin expressziója azonban szignifikáns csökkenést mutatott a két mintavétel között a

sikeres IVF-en átesett nőknél, ami hasznos paraméter lehet a sikertelen IVF kezelésen

résztvevő donorok ezen eredményeinek összehasonlításakor.

Eddig a témában készült kísérletek és publikációk elsősorban az IVF procedúra

sikeressége alapján hasonlította össze a perifériás NK sejtek arányát és tulajdonságait

[113],[115],[119]. Jelen kutatásunkban azonban terhesség kimenetelétől függetlenül is a

petesejt leszívását követő, illetve az embrió transzfert követő 7. napi mintavétel után

vizsgáltuk az NK és NKT sejtek megoszlását és tulajdonságait a korai terhességben, ami

fontos adatokkal szolgálhat az embrió sikeres implantációját illetően.

66

VII. Összegzés

1. A TIM-3/Gal-9 útvonal szerepe egészséges terhességben

1.1 Egészséges terhes nők perifériás lymphocytáinak felszínén a TIM-3 receptor

expressziója dinamikus változást mutat a terhesség előrehaladtával mind az

adaptív, mind a természetes immunitás sejtjeinek felszínén.

1.2 Egészséges terhesség alatt az NK sejtek és azon belül a NKdim szubpopuláció

expresszálja legnagyobb arányban a TIM-3 receptort.

1.3 A CD8+ Tc sejtek TIM-3 expressziója nem mutat változást a terhesség első

kétharmadában, ugyanakkor a TIM-3 receptort hordozó alpopuláció csökkent pro-

inflammatórikus cytokintermelése révén támogatja az anyai tolerancia

mechanizmusokat.

1.4 A terhesség harmadik trimeszterében TIM-3+ CD8+ Tc sejtek cytotoxicitása

fokozódik, kedvező immunológiai feltételeket teremtve a szülés megindulásának a

közeljövőben.

1.5 Minden vizsgált csoportban, beleértve a kontroll csoportot is a TIM-3 receptort

hordozó NK sejtek cytotoxicitása alacsonyabbnak mutatkozott, mint a receptort

nem expresszáló sejteké.

1.6 A terhesség első kétharmadában az NK sejtek TIM-3 expressziója változatlan,

ugyanakkor lecsökken a TIM-3+ NKdim sejtek IL-2 termelése, míg a TIM-3+

NKbright sejtek IFN-γ termelése nő.

1.7 A terhesség 3. trimeszterében az NK sejtek és azon belül is az NKdim sejtek

fokozott TIM-3 expressziót mutatnak, cytotoxicitásuk megemelkedik.

1.8 Egészséges terhességben már az első trimeszterben jelentősen megnő a szérum

szolubilis Gal-9 koncentrációja, amely a terhesség második és harmadik

harmadában további növekedést mutat. Ezzel párhuzamosan, a szolubilis Gal-9-et

termelő Th sejtpopuláció aránya is megemelkedik a periférián a terhesség utolsó

harmadában. Az emelkedett szolubilis Gal-9 szinttel magyarázható a TIM-3+

CD8+ Tc sejtek csökkent pro-inflammatórikus cytokintermelése, valamint a TIM-

3+ NK és NKdim sejtek csökkent cytotoxikus aktivitása.

67

2. A TIM-3/Gal-9 útvonal lehetséges szerepe pathológiás terhességben

2.1 Early-onset pre-eclampsiás betegek perifériás vérében a CD8+ Tc, NK és NKdim

sejtek felszínén csökken a TIM-3 receptor expressziója.

2.2 Early-onset pre-eclampsiás betegek perifériás vérében CD8+ Tc, NK és NKbright

sejtek nagyobb arányban expresszálnak Gal-9 molekulát a felszínükön.

2.3 A TIM-3 receptort hordozó CD8+ Tc és NKdim sejtjek cytotoxikus kapacitása

fokozódik early-onset pre-eclampsiában, feltételezhetően a csökkent TIM-3

expresszió következtében, amit még a sejtek megnövekedett Gal-9 expressziója

sem tud kompenzálni.

3. A TIM-3/Gal-9 útvonal prognosztikai szerepe mesterséges megtermékenyítés során

3.1 In vitro fertilizáció során egy héttel a beültetést követően megemelkedett az NK,

és azon belül a NKdim és a NKbright, továbbá az NKT sejtpopulációk aránya a

perifériás vérben azokban a nőkben, akiknél az eljárás sikertelen volt.

3.2 A sikertelen mesterséges megtermékenyítésen átesett nők csoportjában magasabb

volt a NKbright sejtek perforin expressziója.

3.3 Az IVF eljárás sikertelenségével mutat összefüggést a beavatkozás után az NK és

NKT sejteken megnövekedett NK aktiváló receptorok, a CD160 és NKG2D

expressziója mindkét szubpopulációt érintve.

3.4 Sem az NK, sem az NKT sejtek TIM-3 expressziójának mértéke nem mutat

eltérést sikeres illetve sikertelen IVF eljáráson átesett nők perifériás vérében.

3.5 Az NK és NKdim sejtpopulációk cytotoxicitásának megemelkedése az

embriótranszfer utáni héten összefüggést mutat az eljárás sikertelenségével.

68

VIII. Új eredmények, következtetések

1. Összehasonlítva a terhességi trimesztereket egy csökkent mennyiségű Th1 és Th17-

es cytokin produkciót mutattunk ki TIM-3 receptort expresszáló CD8+ Tc sejtek esetében

összehasonlítva a TIM-3-at nem expressszáló CD8+ Tc sejtekkel. Kísérleteink további

részében a TIM-3+ NK sejteknél és a TIM-3+ NKdim szubpopulációnál egy szignifikánsan

emelkedett cytotoxikus aktivitást mértünk összehasonlítva a TIM-3- szubpopulációkkal, amit

a szérumban keringő Gal-9 molekula emelkedő koncentrációja kísért a terhesség

előrehaladtával. Véleményünk szerint a TIM-3 receptor és a keringő Gal-9 a terhesség során

eltérő módon hat CD8+ Tc és NK sejtek működésére, erre hivatkozva valószínűsítjük

szabályzó funkciójuknak fontosságát a terhesség alatt.

2. Pathológiás terhesség során, early-onset pre-eclampsiás betegek CD8+ Tc-, NK és

NKdim sejtjeinek TIM-3 expressziója szignifikánsan magasabb volt, mint a kontroll

mintákban. Úgy gondoljuk, hogy ez a csökkent receptor expresszió okozhatja a Gal-9

közvetítette Th1-es immunválaszok down regulációjának elmaradását, amivel szorosan

összefügg az early-onset pre-eclampsiás csoport TIM-3+ CD8+ Tc és TIM-3+ NKdim

sejtjeinél mért, a kontroll mintákkal összehasonlított emelkedett cytotoxikus aktivitás is.

Véleményünk szerint az early-onset pre-eclampsiás betegek csökkent TIM-3-at expresszáló

CD8+ Tc és NKdim sejtjein az emelkedett cytotoxikus aktivitás szerepet játszik a betegségre

jellemző pro-inflammatorikus immunválaszok túlsúlyba kerülésében. Ezen sejtek emelkedett

Gal-9 expressziója a bizonyíték továbbá a receptor-ligand interakció terhességben és early-

onset pre-eclampsiában betöltött lényeges szerepére.

3. Kísérletsorozatunk harmadik részében egy héttel a sikertelen IVF beavatkozást

követően a perifériás vér NK és szubpopulációi továbbá az NKT sejtek emelkedett arányát

mutattuk ki. Kiindulva, hogy a sikeres IVF procedúra előtt az NK sejtek aránya szignifikánsan

magasabb volt feltételezzük, hogy a sikertelen beültetés egyik oka a petenyerés és a beültetést

követő 7. nap között eltelt idő alatt megfigyelhető NK sejt expanzió lehet. Vizsgálataink során

a TIM-3 receptor expressziót tekintve különbségeket nem tapasztaltunk, azonban a sikertelen

IVF-en átesett nőknél, a két mintavételi időpont között az NK és NKT-sejtek emelkedett

CD160 és NKG2D receptor expressziói mutathatóak ki, ami utalhat kezelésük kimenetelére

továbbá lényeges információt nyújthat az embrió későbbi sikeres implantációját illetően.

69

IX. Az értekezés alapjául szolgáló eredeti közlemények 1. M. Meggyes, E. Miko, B. Polgar, B. Farkas, Z. Illes, L. Szereday. Peripheral blood

TIM-3 positive NK and CD8+ T cells throughout pregnancy: TIM-3/galectin-9 interaction and its possible role during pregnancy. PLoS One 9, e92371 (2014). (Impact factor: 3,534)

2. E. Miko, M. Meggyes, B. Bogar, N. Schmitz, A. Barakonyi, A. Varnagy, B. Farkas, P.

Tamas, J. Bodis, J. Szekeres-Bartho, Z. Illes, L. Szereday. Involvement of Galectin-9/TIM-3 pathway in the systemic inflammatory response in early-onset preeclampsia. PLoS One 8, e71811 (2013). (Impact factor: 3,534)

3. E. Miko, Z. Manfai, M. Meggyes, A. Barakonyi, F. Wilhelm, A. Varnagy, J. Bodis, Z.

Illes, J. Szekeres-Bartho, L. Szereday. Possible role of natural killer and natural killer T-like cells in implantation failure after IVF. Reprod. Biomed. Online 21, 750–6 (2010). (Impact factor: 2.285)

X. Egyéb közlemények 1. L. Szereday, E. Miko, M. Meggyes, A. Barakonyi, B. Farkas, A. Varnagy, J. Bodis, L.

Lynch, C. O’ Farelly, J. Szekeres-Bartho. Commitment of decidual haematopoietic progenitor cells in first trimester pregnancy. Am. J. Reprod. Immunol. 67, 9–16 (2012). (Impact factor: 3,317)

2. M. Meggyes, A. Lajko, T. Palkovics, A. Totsimon, Z. Illes, L. Szereday, E. Miko. Feto-

maternal immune regulation by TIM-3/Galectin-9 pathway and PD-1 molecule in pregnant mice. Biology of Reproduction (submitted)

70

XI. Irodalomjegyzék

1. Szereday L, Varga P, Szekeres-Bartho J. Cytokine production by lymphocytes in pregnancy. Am. J. Reprod. Immunol. 1997; 38:418–22.

2. Barakonyi A, Miko E, Szereday L, Polgar PD, Nemeth T, Szekeres-Bartho J, Engels GL . Cell death mechanisms and potentially cytotoxic natural immune cells in human pregnancies complicated by preeclampsia. Reprod. Sci. 2014; 21:155–66.

3. Christiansen OB, Lauritsen JG, Andersen ES, Grunnet N. Autoimmune associated recurrent abortions. Hum. Reprod. 1989; 4:913–7.

4. Tilburgs T, Scherjon SA, Claas FHJ. Major histocompatibility complex (MHC)-mediated immune regulation of decidual leukocytes at the fetal-maternal interface. J. Reprod. Immunol. 2010; 85:58–62.

5. Hammer A, Hutter H, Dohr G . HLA class I expression on the materno-fetal interface. Am. J. Reprod. Immunol. 1997; 38:150–7.

6. McIntyre JA, Faulk WP . Allotypic trophoblast-lymphocyte cross-reactive (TLX) cell surface antigens. Hum. Immunol. 1982; 4:27–35.

7. Diehl M, Münz C, Keilholz W, Stevanović S, Holmes N, Loke YW, Rammensee HG. Nonclassical HLA-G molecules are classical peptide presenters. Curr. Biol. 1996; 6:305–14.

8. Miller JS . The biology of natural killer cells in cancer, infection, and pregnancy. Exp. Hematol. 2001; 29:1157–68.

9. Zenclussen AC. Regulatory T cells in pregnancy. Springer Semin. Immunopathol. 2006; 28:31–9.

10. Szekeres-Bartho J. Immunosuppression by Progesterone in Pregnancy. 1992.

11. Walsh SW. Preeclampsia: an imbalance in placental prostacyclin and thromboxane production. Am. J. Obstet. Gynecol. 1985; 152:335–40.

12. Ulmsten U. Treatment of normotensive and hypertensive patients with preterm labor using oral nifedipine, a calcium antagonist. Arch. Gynecol. 1984; 236:69–72.

13. Kaplan G, Totsuka A, Thompson P, Akatsuka T, Moritsugu Y, Feinstone SM. Identification of a surface glycoprotein on African green monkey kidney cells as a receptor for hepatitis A virus. EMBO J. 1996; 15:4282–96.

14. Kuchroo VK, Umetsu DT, DeKruyff RH, Freeman GJ. The TIM gene family: emerging roles in immunity and disease. Nat. Rev. Immunol. 2003; 3:454–62.

15. Hughes RAC. Experimental Allergic Encephalomyelitis: A Useful Model for Multiple Sclerosis: Progress in Clinical and Biological Research, vol 146. J. R. Soc. Med. 1985; 78:180. [Accessed December 9, 2014].

71

16. Monney L, Sabatos CA, Gaglia JL, Ryu A, Waldner H, Chernova T, Manning S, et al. Th1-specific cell surface protein Tim-3 regulates macrophage activation and severity of an autoimmune disease. Nature. 2002; 415:536–41.

17. Sabatos CA, Chakravarti S, Cha E, Schubart A, Sánchez-Fueyo A, Zheng XX, Coyle AJ, et al. Interaction of Tim-3 and Tim-3 ligand regulates T helper type 1 responses and induction of peripheral tolerance. Nat. Immunol. 2003; 4:1102–10.

18. Sánchez-Fueyo A, Tian J, Picarella D, Domenig C, Zheng XX, Sabatos CA, Manlongat N, et al. Tim-3 inhibits T helper type 1-mediated auto- and alloimmune responses and promotes immunological tolerance. Nat. Immunol. 2003; 4:1093–101.

19. Kearley J, McMillan SJ, Lloyd CM . Th2-driven, allergen-induced airway inflammation is reduced after treatment with anti-Tim-3 antibody in vivo. J. Exp. Med. 2007; 204:1289–94.

20. Anderson AC, Anderson DE, Bregoli L, Hastings WD, Kassam N, Lei C, Chandwaskar R, et al. Promotion of tissue inflammation by the immune receptor Tim-3 expressed on innate immune cells. Science. 2007; 318:1141–3.

21. Nakae S, Iikura M, Suto H, Akiba H, Umetsu DT, Dekruyff RH, Saito H, et al. TIM-1 and TIM-3 enhancement of Th2 cytokine production by mast cells. Blood. 2007; 110:2565–8.

22. Barondes SH, Castronovo V, Cooper DN, Cummings RD, Drickamer K, Feizi T, Gitt MA, et al. Galectins: a family of animal beta-galactoside-binding lectins. Cell. 1994; 76:597–8.

23. Cooper DNW. Galectinomics: finding themes in complexity. Biochim. Biophys. Acta. 2002; 1572:209–31.

24. Hirabayashi J, Hashidate T, Arata Y, Nishi N, Nakamura T, Hirashima M, Urashima T, et al. Oligosaccharide specificity of galectins: a search by frontal affinity chromatography. Biochim. Biophys. Acta. 2002; 1572:232–54.

25. Türeci O, Schmitt H, Fadle N, Pfreundschuh M, Sahin U. Molecular definition of a novel human galectin which is immunogenic in patients with Hodgkin’s disease. J. Biol. Chem. 1997; 272:6416–22.

26. Wada J, Kanwar YS. Identification and characterization of galectin-9, a novel beta-galactoside-binding mammalian lectin. J. Biol. Chem. 1997; 272:6078–86.

27. Matsumoto R, Matsumoto H, Seki M, Hata M, Asano Y, Kanegasaki S, Stevens RL, et al. Human ecalectin, a variant of human galectin-9, is a novel eosinophil chemoattractant produced by T lymphocytes. J. Biol. Chem. 1998; 273:16976–84.

28. Perillo NL, Marcus ME, Baum LG . Galectins: versatile modulators of cell adhesion, cell proliferation, and cell death. J. Mol. Med. (Berl). 1998; 76:402–12.

29. Perillo NL, Pace KE, Seilhamer JJ, Baum LG. Apoptosis of T cells mediated by galectin-1. Nature. 1995; 378:736–9.

72

30. Yang RY, Hsu DK, Yu L, Ni J, Liu FT . Cell cycle regulation by galectin-12, a new member of the galectin superfamily. J. Biol. Chem. 2001; 276:20252–60.

31. Dai S-Y, Nakagawa R, Itoh A, Murakami H, Kashio Y, Abe H, Katoh S, et al. Galectin-9 induces maturation of human monocyte-derived dendritic cells. J. Immunol. 2005; 175:2974–81.

32. Kasamatsu A, Uzawa K, Nakashima D, Koike H, Shiiba M, Bukawa H, Yokoe H, et al. Galectin-9 as a regulator of cellular adhesion in human oral squamous cell carcinoma cell lines. Int. J. Mol. Med. 2005; 16:269–73.

33. Seki M, Sakata K, Oomizu S, Arikawa T, Sakata A, Ueno M, Nobumoto A, et al. Beneficial effect of galectin 9 on rheumatoid arthritis by induction of apoptosis of synovial fibroblasts. Arthritis Rheum. 2007; 56:3968–76.

34. Seki M, Oomizu S, Sakata K-M, Sakata A, Arikawa T, Watanabe K, Ito K, et al. Galectin-9 suppresses the generation of Th17, promotes the induction of regulatory T cells, and regulates experimental autoimmune arthritis. Clin. Immunol. 2008; 127:78–88.

35. Kashio Y, Nakamura K, Abedin MJ, Seki M, Nishi N, Yoshida N, Nakamura T, et al. Galectin-9 induces apoptosis through the calcium-calpain-caspase-1 pathway. J. Immunol. 2003; 170:3631–6.

36. Zhu C, Anderson AC, Schubart A, Xiong H, Imitola J, Khoury SJ, Zheng XX, et al. The Tim-3 ligand galectin-9 negatively regulates T helper type 1 immunity. Nat. Immunol. 2005; 6:1245–52.

37. Nagahara K, Arikawa T, Oomizu S, Kontani K, Nobumoto A, Tateno H, Watanabe K, et al. Galectin-9 increases Tim-3+ dendritic cells and CD8+ T cells and enhances antitumor immunity via galectin-9-Tim-3 interactions. J. Immunol. 2008; 181:7660–9.

38. Oomizu S, Arikawa T, Niki T, Kadowaki T, Ueno M, Nishi N, Yamauchi A, et al. Cell surface galectin-9 expressing Th cells regulate Th17 and Foxp3+ Treg development by galectin-9 secretion. PLoS One. 2012; 7:e48574.

39. Mackay IR. Science, medicine, and the future: Tolerance and autoimmunity. BMJ. 2000; 321:93–6.

40. Strom TB, Roy-Chaudhury P, Manfro R, Zheng XX, Nickerson PW, Wood K, Bushell A. The Th1/Th2 paradigm and the allograft response. Curr. Opin. Immunol. 1996; 8:688–93.

41. Anderson GP, Coyle AJ. TH2 and ‘TH2-like’ cells in allergy and asthma: pharmacological perspectives. Trends Pharmacol. Sci. 1994; 15:324–32.

42. Hirashima M, Kashio Y, Nishi N, Yamauchi A, Imaizumi T, Kageshita T, Saita N, et al. Galectin-9 in physiological and pathological conditions. Glycoconj. J. 2004; 19:593–600.

43. Kuchroo VK, Dardalhon V, Xiao S, Anderson AC. New roles for TIM family members in immune regulation. Nat. Rev. Immunol. 2008; 8:577–80.

73

44. Halloran PF. Immunosuppressive drugs for kidney transplantation. N. Engl. J. Med. 2004; 351:2715–29.

45. Marleau AM, Sarvetnick N. T cell homeostasis in tolerance and immunity. J. Leukoc. Biol. 2005; 78:575–84.

46. Zheng XX, Sanchez-Fueyo A, Domenig C, Strom TB. The balance of deletion and regulation in allograft tolerance. Immunol. Rev. 2003; 196:75–84.

47. Wang F, He W, Yuan J, Wu K, Zhou H, Zhang W, Chen ZK . Activation of Tim-3-Galectin-9 pathway improves survival of fully allogeneic skin grafts. Transpl. Immunol. 2008; 19:12–9.

48. Naka EL, Ponciano VC, Cenedeze MA, Pacheco-Silva A, Câmara NOS. Detection of the Tim-3 ligand, galectin-9, inside the allograft during a rejection episode. Int. Immunopharmacol. 2009; 9:658–62.

49. Calabresi PA, Tranquill LR, McFarland HF, Cowan EP. Cytokine gene expression in cells derived from CSF of multiple sclerosis patients. J. Neuroimmunol. 1998; 89:198–205.

50. Khademi M, Illés Z, Gielen AW, Marta M, Takazawa N, Baecher-Allan C, Brundin L, et al. T Cell Ig- and mucin-domain-containing molecule-3 (TIM-3) and TIM-1 molecules are differentially expressed on human Th1 and Th2 cells and in cerebrospinal fluid-derived mononuclear cells in multiple sclerosis. J. Immunol. 2004; 172:7169–76.

51. Anon. BD Biosciences FACSCalibur flow cytometer - Features - Applications.

52. Jiang W, Chai NR, Maric D, Bielekova B. Unexpected role for granzyme K in CD56bright NK cell-mediated immunoregulation of multiple sclerosis. J. Immunol. 2011; 187:781–90.

53. Robertson MJ, Ritz J. Biology and clinical relevance of human natural killer cells. Blood. 1990; 76:2421–38.

54. Cooper MA, Fehniger TA, Turner SC, Chen KS, Ghaheri BA, Ghayur T, Carson WE, et al. Human natural killer cells: a unique innate immunoregulatory role for the CD56(bright) subset. Blood. 2001; 97:3146–51.

55. Oikawa T, Kamimura Y, Akiba H, Yagita H, Okumura K, Takahashi H, Zeniya M, et al. Preferential involvement of Tim-3 in the regulation of hepatic CD8+ T cells in murine acute graft-versus-host disease. J. Immunol. 2006; 177:4281–7.

56. Chabtini L, Mfarrej B, Mounayar M, Zhu B, Batal I, Dakle PJ, Smith BD, et al. TIM-3 regulates innate immune cells to induce fetomaternal tolerance. J. Immunol. 2013; 190:88–96.

57. Zhao J, Lei Z, Liu Y, Li B, Zhang L, Fang H, Song C, et al. Human pregnancy up-regulates Tim-3 in innate immune cells for systemic immunity. J. Immunol. 2009; 182:6618–24.

74

58. Heusschen R, Freitag N, Tirado-González I, Barrientos G, Moschansky P, Muñoz-Fernández R, Leno-Durán E, et al. Profiling Lgals9 splice variant expression at the fetal-maternal interface: implications in normal and pathological human pregnancy. Biol. Reprod. 2013; 88:22.

59. Mor G, Cardenas I. The immune system in pregnancy: a unique complexity. Am. J. Reprod. Immunol. 2010; 63:425–33.

60. Challis JR, Lockwood CJ, Myatt L, Norman JE, Strauss JF, Petraglia F. Inflammation and pregnancy. Reprod. Sci. 2009; 16:206–15.

61. Kwak-Kim J, Gilman-Sachs A. Clinical implication of natural killer cells and reproduction. Am. J. Reprod. Immunol. 2008; 59:388–400.

62. Golden-Mason L, McMahan RH, Strong M, Reisdorph R, Mahaffey S, Palmer BE, Cheng L, et al. Galectin-9 functionally impairs natural killer cells in humans and mice. J. Virol. 2013; 87:4835–45.

63. Rabinovich GA, Toscano MA. Turning ‘sweet’ on immunity: galectin-glycan interactions in immune tolerance and inflammation. Nat. Rev. Immunol. 2009; 9:338–52.

64. Li Y-H, Zhou W-H, Tao Y, Wang S-C, Jiang Y-L, Zhang D, Piao H-L, et al. The Galectin-9/Tim-3 pathway is involved in the regulation of NK cell function at the maternal-fetal interface in early pregnancy. Cell. Mol. Immunol. 2015.

65. Blidner AG, Rabinovich GA. ‘Sweetening’ pregnancy: galectins at the fetomaternal interface. Am. J. Reprod. Immunol. 2013; 69:369–82.

66. Klibi J, Niki T, Riedel A, Pioche-Durieu C, Souquere S, Rubinstein E, Le Moulec S, et al. Blood diffusion and Th1-suppressive effects of galectin-9-containing exosomes released by Epstein-Barr virus-infected nasopharyngeal carcinoma cells. Blood. 2009; 113:1957–66.

67. Mengshol JA, Golden-Mason L, Arikawa T, Smith M, Niki T, McWilliams R, Randall JA, et al. A crucial role for Kupffer cell-derived galectin-9 in regulation of T cell immunity in hepatitis C infection. PLoS One. 2010; 5:e9504.

68. Popovici RM, Krause MS, Germeyer A, Strowitzki T, von Wolff M . Galectin-9: a new endometrial epithelial marker for the mid- and late-secretory and decidual phases in humans. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2005; 90:6170–6.

69. Von Wolff M, Wang X, Gabius H-J, Strowitzki T . Galectin fingerprinting in human endometrium and decidua during the menstrual cycle and in early gestation. Mol. Hum. Reprod. 2005; 11:189–94.

70. Duley L. The global impact of pre-eclampsia and eclampsia. Semin. Perinatol. 2009; 33:130–7.

71. Roberts JM, Pearson GD, Cutler JA, Lindheimer MD. Summary of the NHLBI Working Group on Research on Hypertension During Pregnancy. Hypertens. pregnancy. 2003; 22:109–27.

75

72. Huppertz B. Placental origins of preeclampsia: challenging the current hypothesis. Hypertension. 2008; 51:970–5.

73. Roberts JM, Hubel CA. The two stage model of preeclampsia: variations on the theme. Placenta. 2009; 30 Suppl A:S32–7.

74. Moffett-King A . Natural killer cells and pregnancy. Nat. Rev. Immunol. 2002; 2:656–63.

75. Saito S, Sakai M, Sasaki Y, Nakashima A, Shiozaki A. Inadequate tolerance induction may induce pre-eclampsia. J. Reprod. Immunol. 2007; 76:30–9.

76. Redman CW, Sargent IL. Latest advances in understanding preeclampsia. Science. 2005; 308:1592–4.

77. Hiby SE, Walker JJ, O’shaughnessy KM, Redman CWG, Carrington M, Trowsdale J, Moffett A . Combinations of maternal KIR and fetal HLA-C genes influence the risk of preeclampsia and reproductive success. J. Exp. Med. 2004; 200:957–65.

78. Redman CWG, Tannetta DS, Dragovic RA, Gardiner C, Southcombe JH, Collett GP, Sargent IL. Review: Does size matter? Placental debris and the pathophysiology of pre-eclampsia. Placenta. 2012; 33 Suppl:S48–54.

79. Knight M, Redman CWG, Linton EA, Sargent IL . Shedding of syncytiotrophoblast microvilli into the maternal circulation in pre-eclamptic pregnancies. BJOG An Int. J. Obstet. Gynaecol. 1998; 105:632–640.

80. Levine RJ, Lam C, Qian C, Yu KF, Maynard SE, Sachs BP, Sibai BM, et al. Soluble endoglin and other circulating antiangiogenic factors in preeclampsia. N. Engl. J. Med. 2006; 355:992–1005.

81. Ishihara N, Matsuo H, Murakoshi H, Laoag-Fernandez JB, Samoto T, Maruo T. Increased apoptosis in the syncytiotrophoblast in human term placentas complicated by either preeclampsia or intrauterine growth retardation. Am. J. Obstet. Gynecol. 2002; 186:158–66.

82. Maynard SE, Moore Simas TA, Bur L, Crawford SL, Solitro MJ, Meyer BA . Soluble endoglin for the prediction of preeclampsia in a high risk cohort. Hypertens. pregnancy. 2010; 29:330–41.

83. Pennington KA, Schlitt JM, Jackson DL, Schulz LC, Schust DJ. Preeclampsia: multiple approaches for a multifactorial disease. Dis. Model. Mech. 2012; 5:9–18.

84. Benyo DF, Smarason A, Redman CW, Sims C, Conrad KP. Expression of inflammatory cytokines in placentas from women with preeclampsia. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2001; 86:2505–12.

85. Vince GS, Starkey PM, Austgulen R, Kwiatkowski D, Redman CW. Interleukin-6, tumour necrosis factor and soluble tumour necrosis factor receptors in women with pre-eclampsia. Br. J. Obstet. Gynaecol. 1995; 102:20–5.

76

86. Sakai M, Shiozaki A, Sasaki Y, Yoneda S, Saito S. The ratio of interleukin (IL)-18 to IL-12 secreted by peripheral blood mononuclear cells is increased in normal pregnant subjects and decreased in pre-eclamptic patients. J. Reprod. Immunol. 2004; 61:133–43.

87. Sargent IL, Borzychowski AM, Redman CWG. NK cells and human pregnancy--an inflammatory view. Trends Immunol. 2006; 27:399–404.

88. Redman CWG, Sargent IL. Pre-eclampsia, the placenta and the maternal systemic inflammatory response--a review. Placenta. 2003; 24 Suppl A:S21–7.

89. Miko E, Szereday L, Barakonyi A, Jarkovich A, Varga P, Szekeres-Bartho J. Immunoactivation in preeclampsia: Vdelta2+ and regulatory T cells during the inflammatory stage of disease. J. Reprod. Immunol. 2009; 80:100–8.

90. Toldi G, Saito S, Shima T, Halmos A, Veresh Z, Vásárhelyi B, Rigó J, et al. The frequency of peripheral blood CD4+ CD25high FoxP3+ and CD4+ CD25- FoxP3+ regulatory T cells in normal pregnancy and pre-eclampsia. Am. J. Reprod. Immunol. 2012; 68:175–80.

91. Darmochwał-Kolarz D, Oleszczuk J. The critical role of Th17 cells, Treg cells and co-stimulatory molecules in the development of pre-eclampsia. Dev. period Med. 2014; 18:141–7.

92. Hafeez NAA, Fouda ME-T, Abdel Gawad ER, Assar T, Mansour AI. The role of regulatory T cells in preeclampsia. Egypt. J. Immunol. 2014; 21:45–55.

93. Saito S, Nakashima A, Shima T, Ito M. Th1/Th2/Th17 and regulatory T-cell paradigm in pregnancy. Am. J. Reprod. Immunol. 2010; 63:601–10.

94. Trotta R, Parihar R, Yu J, Becknell B, Allard J, Wen J, Ding W, et al. Differential expression of SHIP1 in CD56bright and CD56dim NK cells provides a molecular basis for distinct functional responses to monokine costimulation. Blood. 2005; 105:3011–8.

95. Poli A, Michel T, Thérésine M, Andrès E, Hentges F, Zimmer J. CD56bright natural killer (NK) cells: an important NK cell subset. Immunology. 2009; 126:458–65.

96. Bielekova B, Catalfamo M, Reichert-Scrivner S, Packer A, Cerna M, Waldmann TA, McFarland H, et al. Regulatory CD56(bright) natural killer cells mediate immunomodulatory effects of IL-2Ralpha-targeted therapy (daclizumab) in multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2006; 103:5941–6.

97. Ho HN, Chao KH, Chen CK, Yang YS, Huang SC. Activation status of T and NK cells in the endometrium throughout menstrual cycle and normal and abnormal early pregnancy. Hum. Immunol. 1996; 49:130–6.

98. BURTON G. Human Implantation: Cell Biology and Immunology. By Y. W. Loke and Ashley King. (Pp. xiv + 2992; some figures; f50/$80 hardback; ISBN 0 521 44193 5.) Cambridge: Cambridge University Press. 1995. J. Anat. 1997; 190:473–475.

77

99. Yamamoto T, Takahashi Y, Kase N, Mori H. Decidual natural killer cells in recurrent spontaneous abortion with normal chromosomal content. Am. J. Reprod. Immunol. 1999; 41:337–42.

100. Henkart PA. Lymphocyte-mediated cytotoxicity: two pathways and multiple effector molecules. Immunity. 1994; 1:343–6.

101. Shiver JW, Su L, Henkart PA. Cytotoxicity with target DNA breakdown by rat basophilic leukemia cells expressing both cytolysin and granzyme A. Cell. 1992; 71:315–22.

102. Yannelli JR, Sullivan JA, Mandell GL, Engelhard VH. Reorientation and fusion of cytotoxic T lymphocyte granules after interaction with target cells as determined by high resolution cinemicrography. J. Immunol. 1986; 136:377–82.

103. Ortaldo JR, Winkler-Pickett RT, Nagashima K, Yagita H, Okumura K . Direct evidence for release of pore-forming protein during NK cellular lysis. J. Leukoc. Biol. 1992; 52:483–8.

104. Tschopp J, Schäfer S, Masson D, Peitsch MC, Heusser C. Phosphorylcholine acts as a Ca2+-dependent receptor molecule for lymphocyte perforin. Nature. 1989; 337:272–4.

105. Podack ER, Dennert G. Assembly of two types of tubules with putative cytolytic function by cloned natural killer cells. Nature. 302:442–5.

106. Szekeres-Bartho J, Varga P, Pacsa AS. Immunologic factors contributing to the initiation of labor--lymphocyte reactivity in term labor and threatened preterm delivery. Am. J. Obstet. Gynecol. 1986; 155:108–12.

107. Rukavina D, Podack ER, Rubesa G, Spanjol-Pandelo S, Randic L. Down-regulated expression of perforin-positive/CD16+ cells in the peripheral blood lymphocytes in the first trimester of pregnancy and up-regulation at the end of pregnancy. Am. J. Reprod. Immunol. 1997; 38:189–96.

108. Rukavina D, Rubesa G, Gudelj L, Haller H, Podack ER. Characteristics of perforin expressing lymphocytes within the first trimester decidua of human pregnancy. Am. J. Reprod. Immunol. 1995; 33:394–404.

109. King A, Wooding P, Gardner L, Loke YW. Expression of perforin, granzyme A and TIA-1 by human uterine CD56+ NK cells implies they are activated and capable of effector functions. Hum. Reprod. 1993; 8:2061–7.

110. Oep A. Jelentés asszisztált reprodukciós eljárásokat végző intézmények Asszisztált reprodukciós intézetek mutatóinak , rövidítéseinek magyarázata. 2012; 2008:1–16.

111. Anon. Eurostat - Tables, Graphs and Maps Interface (TGM) table.

112. Anon. Stages in fertility treatment | Thomson Fertility Centre.

78

113. Beer AE, Kwak JY, Ruiz JE. Immunophenotypic profiles of peripheral blood lymphocytes in women with recurrent pregnancy losses and in infertile women with multiple failed in vitro fertilization cycles. Am. J. Reprod. Immunol. 1996; 35:376–82.

114. Thum MY, Bhaskaran S, Bansal AS, Shehata H, Ford B, Sumar N, Abdalla HI. Simple enumerations of peripheral blood natural killer (CD56+ NK) cells, B cells and T cells have no predictive value in IVF treatment outcome. Hum. Reprod. 2005; 20:1272–6.

115. Thum MY, Bhaskaran S, Abdalla HI, Ford B, Sumar N, Shehata H, Bansal AS. An increase in the absolute count of CD56dimCD16+CD69+ NK cells in the peripheral blood is associated with a poorer IVF treatment and pregnancy outcome. Hum. Reprod. 2004; 19:2395–400.

116. Coulam CB, Roussev RG. Correlation of NK cell activation and inhibition markers with NK cytoxicity among women experiencing immunologic implantation failure after in vitro fertilization and embryo transfer. J. Assist. Reprod. Genet. 2003; 20:58–62.

117. Van den Heuvel MJ, Hatta K, Peralta CG, Han VK, Clark DA . CD56+ cells are recruited to the uterus in two waves: at ovulation and during the first 2 weeks after missed menses. Am. J. Reprod. Immunol. 2008; 59:90–8.

118. Ntrivalas EI, Kwak-Kim JY, Gilman-Sachs A, Chung-Bang H, Ng SC, Beaman KD, Mantouvalos HP, et al. Status of peripheral blood natural killer cells in women with recurrent spontaneous abortions and infertility of unknown aetiology. Hum. Reprod. 2001; 16:855–61.

119. Coulam CB, Roussev RG. Increasing circulating T-cell activation markers are linked to subsequent implantation failure after transfer of in vitro fertilized embryos. Am. J. Reprod. Immunol. 2003; 50:340–5.

79

XII. Köszönetnyilvánítás

Elsőként témavezetőmnek Dr. Szereday Lászlónak szeretnék köszönetet mondani, aki a

kezdetektől fogva egyengeti kutatói pályámat, és akitől rengeteg segítséget és támogatást

kaptam az intézetben töltött éveim alatt.

Köszönettel tartozom a PTE-KK Orvosi Mikrobiológiai és Immunitástani Intézet

minden dolgozójának, akik segítették munkámat, illetve prof. Dr. Szekeres-Barthó Júliának,

és az általa vezetett Terhességi Immunológiai Kutatócsoportnak. Külön szeretném

megköszönni Molnár Évának és Kiss Ágnesnek a kezdeti időszakban nyújtott segítségét mind

az alap technikák elsajátítását, mind a csoportba való beilleszkedést illetően. Hálás köszönet

Dr. Mikó Évának és Dr. Polgár Beátának, akik hasznos tanácsaikkal segítettek kutató

munkámban és dolgozatom megírásában.

Végül szeretném kifejezni legszívélyesebb köszönetemet családomnak és

kedvesemnek, akik mindenben támogattak és bíztattak.

80

XIII. Mellékletek

1. Közlemény

M. Meggyes, E. Miko, B. Polgar, B. Farkas, Z. Illes, L. Szereday. Peripheral blood TIM-3

positive NK and CD8+ T cells throughout pregnancy: TIM-3/galectin-9 interaction and its

possible role during pregnancy. PLoS One 9, e92371 (2014).

2. Közlemény

E. Miko, M. Meggyes, B. Bogar, N. Schmitz, A. Barakonyi, A. Varnagy, B. Farkas, P.

Tamas, J. Bodis, J. Szekeres-Bartho, Z. Illes, L. Szereday. Involvement of Galectin-9/TIM-3

pathway in the systemic inflammatory response in early-onset preeclampsia. PLoS One 8,

e71811 (2013).

3. Közlemény

E. Miko, Z. Manfai, M. Meggyes, A. Barakonyi, F. Wilhelm, A. Varnagy, J. Bodis, Z. Illes, J.

Szekeres-Bartho, L. Szereday. Possible role of natural killer and natural killer T-like cells in

implantation failure after IVF. Reprod. Biomed. Online 21, 750–6 (2010).

ŐKNÉL DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS - PTE...

Documents

Transcript of ŐKNÉL DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS - PTE...