DNA Rekombinan
description
Transcript of DNA Rekombinan
DR.Restu Syamsul Hadi, MKes.
Teknologi dna rekombinan (GENETIC ENGINEERING)
Teknik Rekombinan meliputi:
-Teknik untuk mengisolasi DNA-Teknik untuk memotong DNA.-Teknik untuk menggabung atau menyambung DNA.-Teknik untuk memasukkan DNA kedalam sel hidup sehingga DNA rekombinan dapat bereplikasi dan dapat diekspresikan
Organisme transgenik: organisme yang membawa gen yang berasal dari jenis organisme lainnya.
Organisme transgenik dihasilkan melalui Rekayasa Genetika
Rekayasa Genetika menggunakan Teknologi DNA Rekombinan
Teknologi DNA Rekombinan kumpulan teknik atau metoda yang digunakan untuk mengkombinasikan gen-gen secara buatan.
Perubahan genetik suatu organisme, atau keturunan, teknik untuk menghilangkan karakteristik bahan yang tidak diinginkan atau untuk menghasilkan bahan yang baru yang diinginkan.
Penambahan, penghapusan, atau manipulasi sifat tunggal dalam organisme untuk menciptakan perubahan yang diinginkan
Definisi:
Apa Rekayasa Genetika?
Isolasi dan pemurnian DNA• Isolasi DNA bakteri• Isolasi DNA plasmid• Pemurnian secara kimiawi dan enzimatis
Berbagai jenis dan karakterisasi vektor• vektor plasmid• vektor yeast• vektor bakteriofag
Enzim restriksi dan ligase• Jenis enzim restriksi• Faktor yang berpengaruh terhadap enzim restriksi• Faktor yang berpengaruh terhadap enzim ligase
Teknik Elektroforesis dan PCR• Faktor yang berpengaruh dalam elektroforesis• Faktor yang berpengaruh terhadap PCR
DNA sekuensing dan hibridisasi• southern blot• northern blot• western blot
DNA rekombinan dan Transformasi• Isolasi• Restriksi• Sel kompeten• Transformasi
Rekayasa genetik pada :• Rekayasa genetik pada hewan• Rekayasa genetik pada tumbuhan• Rekayasa genetika pada manusia
Produk transgenik, keamanan dan bioetika• Biosafety• bioetika• GMO dan genetically modofied foods
Rekayasa genetika, juga dikenal sebagai teknologi DNA rekombinan, berarti mengubah gen dalam organisme hidup untuk menghasilkan Genetically Modified Organism (GMO) dengan genotipe baru
Berbagai jenis modifikasi genetik yang mungkin: memasukkan gen asing dari satu spesies menjadi
- spesies lain, - membentuk organisme transgenik; - mengubah gen yang ada sehingga produknya
berubah, - mengubah ekspresi gen sehingga ditranslasikan lebih sering atau tidak sama sekali
Awalnya manipulasi genetik secara tradisional seperti : pemuliaan selektif untuk meningkatkan nilai gizi tanaman → terlalu lambat
Pengenalan gen dari satu spesies yang berasal dari organisme ke organisme dari spesies yang berbeda (organisme transgenik)
• Kloning gen untuk menentukan fungsinya • Mengubah fenotip suatu organisme untuk meningkatkan sifat
yang diinginkan
Rekayasa genetika dengan teknik molekuler • Memungkinkan untuk menciptakan perubahan genetik lebih besar
pada kecepatan yang jauh lebih cepat• Produksi bahan farmasi dalam jumlah besar
MENGAPA ILMUWAN MENGEMBANGKAN REKAYASA GENETIKA..?
Teknik Dasar Rekayasa Genetika
Selective BreedingTanaman atau hewan dengan karakteristik yang diinginkan paling banyak digunakan untuk pemuliaan lebih lanjut
Hybridization (Crossbreeding)Menggabungkan strain yang berbeda spesies untuk menggabungkan karakteristik terbaik dari keduanya.(burung dara + perkutut = sinom)
Recombinant DNA TechnologiesTransformasi
Basic steps in genetic engineering
1. Isolasi gen2. Insersi ke dalam host menggunakan vector3. Perbanyak copy DNA sebanyak mungkin4. Pemisahan produk gen yang dihasilkan5. Ekstraksi produk gen yang diinginkan
Fluorescent proteins are a useful tool in biotechnology
Menjadi petanda adanya ekspresi gen dan protein target dalam sel-sel hidup suatu organisme
Paling banyak digunakan adalah green fluorescent protein (GFP) pertama kali diisolasi dari Victoria aequorea (ubur-ubur), dapat dilekatkan ke hampir semua protein dan yang menarik dan masih dapat menjadi fluorescent molecule.
Dapat digunakan untuk melokalisasi protein yang sebelumnya belum di-karakterisasi untuk memvisualisasikan dan melacak protein untuk lebih memahami peristiwa selular.
Dapat digunakan untuk melihat proses perkembangan
Hewan Transgenik
Tikus transgenik dapat digunakan untuk mempelajari sistem kekebalan tubuh dan penyakit genetik
Babi : Faktor VIII pada pembekuan darah, organ-organ untuk transplantasi
Hewan lain : hormon pertumbuhan IL-2 (kanker), albumin
Organisme rekombinan
Tanaman tahan hama jagung (gen toksin dari Bacillus
thuringiensis yang dapat membunuh serangga)
Tanaman tomat Golden rice (beta-carotene) Plant-based vaccines
Genetically Modified Organisms
Tanaman tahan hama Jagung Bt (mengandung gen toksin dari
Bacillus thuringiensis yang membunuh hama)
Golden rice (mengandung beta-carotene) Tanaman sebagai vaksin
Genetic engineering of Bt-resistant corn (Bt-corn)
Bt-transgenic plants are resistant to insects, no need for spraying
insecticide
Clone Bt toxin gene from bacteria and express in plants
Tanaman jagung tidak perlu lagi insektisida, serangga/ulat akan mati bila memakan jagung
Contoh penerapan rekayasa genetika pada tanaman“Golden Rice” mengandung gen untuk menghasilkan vitamin
A
Biji beras (endosperm) kekurangan senyawa essential seperti vitamin A dan precursornya (β-carotene). Defisiensi Vitamin A dapat meyebabkan kebutaan dan penurunan sistem imun tubuh.
HUMAN GENETIC ENGINEERING HUMAN GENETIC ENGINEERING Rekayasa genetika manusia berarti mengubah gen Rekayasa genetika manusia berarti mengubah gen
dalam sel manusia yang hidupdalam sel manusia yang hidup
Misalnya pada penderita penyakit paru-paru yang Misalnya pada penderita penyakit paru-paru yang disebabkan oleh gen yang cacat dalam sel paru-paru. disebabkan oleh gen yang cacat dalam sel paru-paru. Dengan cara memperbaiki gen-gen memungkinkan Dengan cara memperbaiki gen-gen memungkinkan akan sembuhakan sembuh . .
Mengubah gen dalam sel hidup dengan menempatkan Mengubah gen dalam sel hidup dengan menempatkan gen baru yang diinginkan ke virus yang diperbolehkan gen baru yang diinginkan ke virus yang diperbolehkan untuk masuk ke sel-sel manusia dan yang memasukkan untuk masuk ke sel-sel manusia dan yang memasukkan gen baru ke dalam sel bersama dengan sebelumnyagen baru ke dalam sel bersama dengan sebelumnya
HUMAN GENETIC HUMAN GENETIC ENGINEERING ENGINEERING
"Somatic" genetic engineeringRekayasa genetika yang menargetkan gen di organ Rekayasa genetika yang menargetkan gen di organ
tertentu dan jaringan tubuh orang yang ada tanpa tertentu dan jaringan tubuh orang yang ada tanpa mempengaruhi gen dalam telur atau sperma.mempengaruhi gen dalam telur atau sperma.
Percobaan transfer gen somatik sedang menjalani Percobaan transfer gen somatik sedang menjalani uji klinis, dengan hasil yang beragam sampai saat uji klinis, dengan hasil yang beragam sampai saat ini. Suatu hari nanti mungkin akan dapat digunakan ini. Suatu hari nanti mungkin akan dapat digunakan dengan efektifdengan efektif
"Germ line" genetic "Germ line" genetic engineeringengineering
RRekayasa genetika yang menargetkan gen dalam ekayasa genetika yang menargetkan gen dalam
telur, sperma, atau embrio sangat awaltelur, sperma, atau embrio sangat awal Perubahan yang mempengaruhi setiap sel dalam Perubahan yang mempengaruhi setiap sel dalam
tubuh individu yang dihasilkan, dan diwariskan tubuh individu yang dihasilkan, dan diwariskan kepada semua generasi berikutnyakepada semua generasi berikutnya
[note: The term "somatic" comes from the Greek "soma" for "body."The term "germline" refers to the "germ" or "germinal" cells, the eggs and sperm.
• Insulin (diabetics)• Factor VIII (males w/hemophilia A)• Factor IX (hemophilia B)• Human growth hormone• Erythropoietin (anemia)• Angiostatin/endostatin(anti-cancer drugs)• leptin
Produk DNA Recombinant untuk terapi pada manusia
DESIGNER BABY
Kesulitan pada Rekayasa Genetika Manusia
Inserting gene in correct cellsInserting gene so it is expressed correctly
– Orientation– Regulation
Controlling virus vectorEthical issues
KLONING GEN
Kloning - definisiDari Bahasa Yunani - klon, rantingKumpulan turunan suatu individu
yang dihasilkan tanpa melalui perkawinan; kumpulan replika sebagian atau seluruh makromolekul (contoh, DNA atau antibodi)
Suatu individu yang tumbuh dari satu sel somatik induknya serta memiliki identitas genetik yang sama dengan induknya
Klon: Koleksi molekul atau sel yang semua identitasnya sama dengan molekul atau sel penurunnya
Kloning DNA
Metoda untuk memurnikan atau
mengidentifikasi dan memperbanyak
suatu potongan DNA tertentu (klon) yang
dikehendaki dari campuran potongan-
potongan DNA yang kompleks.
Kloning Gen
Ketika keseluruhan DNA dari suatu organisme diekstraksi, akan diperoleh seluruh gen yang dimiliki organisme tersebut
Pada kloning gen, hanya gen (DNA) tertentu yang diisolasi, dimurnikan, dan diperbanyak (diklon)
Tujuan mengklon GenMenentukan urutan basa nukleotida
penyusun gen tersebutMenganalisis atau mengidentifikasi
urutan basa nukleotida pengendali gen tersebut
Mempelajari fungsi RNA / protein/enzim yang disandi gen tersebut
Mengidentifikasi mutasi yang terjadi pada kecacatan gen yang mengakibatkan penyakit bawaan
Merekayasa organisme untuk tujuan tertentu, misalnya memproduksi insulin, ketahanan terhadap hama, dll.
Sumber DNA untuk diklon DNA kromosom cDNA (complementary DNA) yang
disintesis menggunakan mRNA sebagai cetakan (template)
DNA yang dihasilkan dari perbanyakan menggunakan PCR
Bahan / Alat untuk Mengklon
Enzim endonuklease restriksi Enzim ligaseVektorsInang (Host)Metoda untuk memasukkan DNA ke
dalam sel inang
Memotong DNAMenggunakan enzim
endonuklease restriksiUjung “lengket” (sticky
ends)Ujung “tumpul” (blunt
ends)
Penamaan enzimEcoRIE = genus (Escherichia)co = species (coli)R = strainI = # of enzyme
Penyambungan (pasting) DNA
Pembentukan ikatan-H pada ujung-ujung yang komplemen (sticky ends)
Ligase membentuk ikatan fosfodiester untuk merekatkan benang-benang DNA
Vektor untuk Mengklon
Diperlukan suatu wahana (vehicle) untuk memasukkan suatu potongan DNA ke dalam sel agar DNA tersebut dapat disimpan dan diperbanyak di dalam sel tersebut
Plasmid
DNA bukan kromosom (extrachromosomal DNA) yang secara alami dimiliki suatu jasad
Bentuknya benang ganda (double strands DNA, dsDNA) sirkular
Plasmid buatan (Artificial plasmids) dapat dibuat dengan menambahkan potongan-potongan DNA lain
Vektor untuk MengklonPlasmid dapat dimodifikasi untuk mampu membawa potongan DNA lain ke dalam sel bila memiliki:
Replikator (origin of replication) Penanda (Marker) yang mudah diseleksi
(misalnya gen ketahanan terhadap antibiotik)
Situs untuk mengklon (potongan DNA yang memiliki urutan basa nukleotida yang menjadi sasaran enzim restriksi tetapi tidak terletak di dalam daerah replikator atau penanda
Plasmid yang Dimiliki oleh Escherichia coli
Berasal dari plasmid alami E. coli
Potongan DNA tambahan
Potongan DNA tambahan
Plasmid Khimera (Chimeric Plasmids)
Khimera berasal dari mitologi Yunani, makhluk dengan tubuh gabungan dari bagian-bagian makhluk binatang lain
Setelah pemotongan plasmid menggunakan suatu enzim restriksi, potongan DNA asing yang memiliki ujung pemotongan yang sama dapat disisipkan
Setelah ujung-ujung plasmid dan potongan DNA asing disambung, akan dihasilkan "plasmid rekombinan"
Plasmid rekombinan dapat bereplikasi dalam sel inang yang sesuai
Kloning Terorientasi
Bila diinginkan untuk menginsersikan potongan DNA asing dengan orientasi tertentu
Dilakukan dengan memotong DNA vektor maupun DNA sumber gen yang dikehendaki menggunakan dua enzim restriksi yang berbeda
Vektor untuk Mengklon
1 Vektor berupa plasmid
2 Vektor berupa bakteriofaga
3 Cosmid
4 BACs (Bacterial Artificial Chromosome) & YAC (Yeast Artificial Chromosome)
1. Memiliki origin of replication dari inang yang dituju, sehingga memungkinkan replikasi secara independen terhadap genom inang.
2. Memiliki penanda selektif: Memudahkan seleksi sel pembawa plasmid tersisipi DNA asingketahanan terhadap antibiotik ganda penapisan biru-putih
3. Memiliki banyak situs pengkloningan (multiple cloning sites, MCS)
4. Mudah diisolasi dari sel inang.
Vektor berupa Plasmid
Multiple Cloning Site (MCS)
Vektor berupa Plasmid
Vektor berupa Plasmid
Keunggulan:Kecil, mudah pengerjaannyaStrategi seleksi mudahBerguna untuk mengklon potongan DNA ukuran kecil (< 10kbp)
Kelemahan:Kurang bermanfaat untuk mengklon potongan DNA ukuran besar (> 10kbp)
Bakteriofaga (phage)
Vektor berupa bakteriofaga (vectors)
Lengan kiri:Protein penyusun
kepala & ekorLengan kanan:
Sintesis DNAPengendalianLisis inang
Daerah yang dihilangkan:integrasi & eksisiPengendalian
Vektor berupa bakteriofaga (vectors)
Vektor berupa Bakteriofaga
Keunggulan:Bermanfaat untuk mengklon potongan DNA ukuran besar (10 - 23 kbp)
Seleksi berdasar ukuranKelemahan:
Lebih sulit pengerjaannya
Vektor Cosmid
Keunggulan:Bermanfaat untuk mengklon potongan DNA berukuran sangat besar (32 - 47 kbp)
Seleksi berdasar ukuranPengerjaan seperti plasmid
Kelemahan:Tidak terlalu mudah untuk mengerjakan plasmid dengan ukuran sangat besar (~ 50 kbp)
Gabungan sifat vektor plasmid dan sifat berguna dari situs cos (dihilangkan pada vektor )
Vektor Cosmid
Vektor BACReplikasi dimediasi oriS dan oriE
parA and parB mengendalikan agar hanya terdapat satu vektor dalam sel
Menggunakan penanda ketahanan terhadap KhloramfenikolR
Vecktor YAC
Dapat disisipi gen asing 200 - 2000 kbp dan dimasukkan ke dalam yeast
telomere telomerecentromere
URA3ARS HIS3
replicationorigin
markers
largeinserts
BACs dan YACs
Keunggulan:Dapat digunakan untuk mengklon potongan DNA
dengan ukuran sangat besar (100 - 2,000 kbp)Penting digunakan dalam proyek penetapan
urutan basa nukleotida total genomKelemahan:
Tidak mudah mengerjakan molekul DNA dengan ukuran sangat besar
BACs : Bacterial Artificial Chromosomes
YACs : Yeast Artificial Chromosomes
Shuttle VectorVektor yang dapat digunakan untuk dua macam
inang (memiliki origin of replication dari masing-masing inang)
Memilih Vektor
Ukuran DNA yang disisipkan
Ukuran vektor Situs enzim
restriksi yang tersedia
Jumlah salinan (copy number)
Efisiensi kloningKemampuan
untuk menapis DNA sisipan
Rencana penelitian selanjutnya
Cara Mengklon DNA (1)Isolasi vektor kloning
(plasmid bacterial) & DNA sumber gen
Pemotongan DNA sumber gen & vektor kloning menggunakan enzim restriksi yang sama
Penyisipan potongan DNA sumber gen ke dalam vektor kloning yang telah dipotong menggunakan enzim restriksi yang sama; potongan disambung dengan bantuan enzim DNA ligase
Cara Mengklon DNA (2)Vektor kloning yang
telah tersisipi potongan DNA dimasukkan ke dalam sel inang (transformasi sel inang)
Penapisan sel pengklon (dan gen yang dimasukkan)
Identifikasi sel pengklon pembawa gen yang dikehendaki
Transformasi Sel InangMemasukkan plasmid (yang merupakan vektor yang telah disisipi gen) ke dalam sel inang
Transformasi PRA-INKUBASI
Sel E. coli calon penerima plasmid dipaparkan kepada ion positif kalsium klorida (CaCl2). Perlakuan ini memberikan cekaman kepada bakteri yang mengakibatkan membran sel dan dinding sel bakteri tersebut menjadi permeabel terhadap plasmid donor. Proses ini mengakibatkan E. coli menjadi “kompeten" untuk menerima plasmid .
Transformasi INKUBASI
Plasmid ditambahkan ke dalam suspensi sel E. coli kompeten.
Suspensi sel E. coli kompeten lainnya yang tidak ditambah plasmid digunakan sebagai kontrol.
Transformasi KEJUTAN PANAS (HEAT SHOCK)
Sel kompeten (baik yang diberi plasmid maupun kontrol) dipaparkan sejenak (90 detik) kepada suhu 42 oC. Langkah ini memaksimumkan masuknya plasmid menembus membran dan dinding sel.
Transformasi PENYEMBUHAN (RECOVERY)
Sel kompeten (baik yang diberi plasmid maupun kontrol) ditumbuhkan dalam medium kaya nutrisi untuk memberi kesempatan penyembuhan setelah mengalami cekaman dan kejutan. Masa penyembuhan biasanya berlangsung satu waktu generasi (untuk E. coli berkisar antara 30 hingga 45 menit)
Transformasi PENAPISAN (SCREENING)
Sel kompeten yang telah mengalami penyembuhan ditapis pada medium padat yang mengandung senyawa penapis berdasarkan penanda yang dibawa oleh plasmid.
Koloni E. coli yang membawa plasmid dengan penanda gen pendar fluor (pGLO)
E. coli yang Membawa Plasmid pGlo
Penapisan KlonMedium pertumbuhan
diberi antibiotik yang sesuai dengan sifat ketahanan yang digunakan sebagai penanda, misalnya Kanamisin
Bakteri di paruh cawan petri sebelah kanan memiliki plasmid dengan penanda ketahanan terhadap Kanamisin(Kanr), yang di sebelah kiri tidak memilikinya
Manfaat
Teknologi DNA rekombinan telah memberikan manfaat dibidang ilmu pengetahuan maupun dibidang terapan.
Contoh: Bidang Kesehatan:
Insulin manusia telah diproduksi secara massal menggunakan bakteri E.coli dan telah diperdagangkan untuk mengobati penyakit diabetis. Merekdagang: HumulinR
Hormon tumbuh manusia (GH) diproduksi menggunakan E.coli dan digunakan untuk mengobati kelainan pertumbuhan (misal: cebol).
Vaksin hepatitis B digunakan untuk mencegah infeksi virus hepatitis. Telah diproduksi secara komersial menggunakan S.cereviciae dalam skala industri