Dissertation.22.11.11 - elib.tiho-hannover.de · induzierte reproduzierbar eine Bronchopneumonie,...
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Tierärztliche Hochschule Hannover
__________________________________________________
Wirts-Erreger-Interaktionen im Respirationstrakt von Kälbern nach
experimenteller aerogener Infektion mit Chlamydia psittaci
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae –
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Katja Möhle
aus Berlin
Hannover 2011
Wissenschaftliche Betreuung: Apl.-Prof. Dr. E. Liebler-Tenorio
Institut für Molekulare Pathogenese
Friedrich-Loeffler-Institut
1. Gutachterin: Apl.-Prof. Dr. E. Liebler-Tenorio
2. Gutachter: Prof. Dr. M. Hewicker-Trautwein
Tag der mündlichen Prüfung: 22.11.2011
Meiner Familie und Valerie
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG............................................................................................. 13
2 LITERATURÜBERSICHT ....................................................................... 15
2.1 Chlamydien ................................................................................................................... 15
2.1.1 Taxonomische Einordnung .................................................................................. 15
2.1.2 Erkrankungen als Folge von Chlamydieninfektionen .......................................... 17
2.1.3 Chlamydialer Entwicklungszyklus ....................................................................... 18
2.1.4 Morphologie der Entwicklungsstadien ................................................................. 20
2.1.5 Zellwand der Chlamydien .................................................................................... 21
2.1.6 Parasitophore Vakuole ......................................................................................... 23
2.1.7 Besonderheiten von Chlamydia psittaci ............................................................... 24
2.1.8 Immunpathogenese von Chlamydieninfektionen ................................................. 25
2.2 Respirationstrakt des Rindes ......................................................................................... 27
2.2.1 Anatomischer und histologischer Aufbau von Trachea und Lunge ..................... 27
2.2.1.1 Ultrastruktur der Alveolen ........................................................................... 30
2.2.2 Histologischer und zellulärer Aufbau der Tonsille .............................................. 31
2.2.3 Histologischer und zellulärer Aufbau des Lymphknotens ................................... 32
2.3 Lymphgewebe und Immunzellen im Respirationstrakt des Rindes .............................. 33
2.3.1 Verteilung von Schleimhaut-assoziiertem Lymphgewebe (MALT) .................... 33
2.3.2 Verteilung, Morphologie und Charakteristika von BALT ................................... 34
2.3.3 Verteilung von Immunzellen in der Lunge des Rindes (außer BALT) ................ 36
2.3.4 Morphologie, Funktion und für die immunhistologische Darstellung gewählte
Epitope der Immunzellen in der Lunge des Rindes ............................................. 37
2.3.4.1 Makrophagen ................................................................................................ 37
2.3.4.2 Neutrophile Granulozyten ............................................................................ 39
2.3.4.3 Dendritische Zellen ...................................................................................... 40
2.3.4.4 T-Lymphozyten ............................................................................................ 42
2.3.4.5 B-Lymphozyten, Plasmazellen und Immunglobulin .................................... 44
2.3.4.6 Interleukin-2 Rezeptor+ Zellen .................................................................... 46
INHALTSVERZEICHNIS
3 MATERIAL UND METHODEN ............................................................. 47
3.1 Versuchsdesign ............................................................................................................. 47
3.2 Eigene Untersuchungen ................................................................................................ 48
3.2.1 Selektion der Versuchstiere .................................................................................. 48
3.2.2 Asservieren des Untersuchungsmaterials ............................................................. 49
3.2.3 Selektion des Untersuchungsmaterials ................................................................. 50
3.2.3.1 Histologische und immunhistologische Untersuchung der Kontrolltiere .... 50
3.2.3.2 Histologische und immunhistologische Untersuchung bei den mit C. psittaci
inokulierten Kälbern .................................................................................... 51
3.2.3.3 Transmissionselektronenmikroskopische Untersuchung ............................. 52
3.2.4 Immunhistologische Untersuchung ...................................................................... 54
3.2.4.1 Allgemeines .................................................................................................. 54
3.2.4.2 Herstellung der Gefrierschnitte .................................................................... 55
3.2.4.3 H.E. - Übersichtsfärbung .............................................................................. 55
3.2.4.4 Primärantikörper ........................................................................................... 56
3.2.4.5 Durchführung der immunhistologischen Markierung .................................. 57
3.2.4.6 Durchführung der immunhistologischen Doppelmarkierung ...................... 59
3.2.4.7 Auswertung und Dokumentation ................................................................. 60
3.2.5 Transmissionselektronenmikroskopische Untersuchung ..................................... 63
3.2.5.1 Vorbehandlung paraffineingebetteter Gewebe ............................................. 63
3.2.5.2 Einbettung in Araldite CY212 ...................................................................... 64
3.2.5.3 Anfertigung von Semidünnschnitten ............................................................ 65
3.2.5.4 Anfertigung von Ultradünnschnitten ............................................................ 65
3.2.5.5 Nachkontrastierung mit Uranylazetat und Bleizitrat .................................... 66
3.2.5.6 Einbettung in LR-White ............................................................................... 66
3.2.5.7 Indirekte Immunogoldmarkierung an Ultradünnschnitten ........................... 67
3.2.5.8 Auswertung und Dokumentation ................................................................. 68
4 ERGEBNISSE............................................................................................. 69
4.1 Immunhistologische Untersuchung .............................................................................. 69
4.1.1 Kontrollkälber ...................................................................................................... 70
4.1.1.1 Verteilung und Menge der Leukozytensubtypen in der Lunge .................... 70
INHALTSVERZEICHNIS
4.1.1.2 Quantitative Auswertung von CD4+, CD8+ und γδ+ T-Lymphozyten ....... 81
4.1.1.3 BALT ........................................................................................................... 82
4.1.1.4 Trachea ......................................................................................................... 88
4.1.1.5 Tonsilla pharyngea ....................................................................................... 88
4.1.1.6 Nl. mediastinalis ........................................................................................... 90
4.1.2 Kälber inokuliert mit C. psittaci ........................................................................... 92
4.1.2.1 Semiquantitative Auswertung von C. psittaci .............................................. 92
4.1.2.2 Verteilung und Menge der Leukozytensubtypen und Chlamydien in der
Lunge am Tag 2 pi ....................................................................................... 95
4.1.2.3 Verteilung und Menge der Leukozytensubtypen und von Chlamydien in der
Lunge am Tag 3 und 4 pi ........................................................................... 104
4.1.2.4 Verteilung und Menge der Leukozytensubtypen und von Chlamydien in der
Lunge am Tag 7 und 10 pi ......................................................................... 112
4.1.2.5 Verteilung und Menge der Leukozytensubtypen und von Chlamydien in der
Lunge am Tag 14 pi ................................................................................... 122
4.1.2.6 Verteilung und Menge der Leukozytensubtypen und von Chlamydien in der
Lunge am Tag 35/37 dpi ............................................................................ 128
4.1.2.7 BALT ......................................................................................................... 133
4.1.2.8 Quantitative Auswertung von CD4+, CD8+ und γδ+ T-Lymphozyten in der
Lunge ......................................................................................................... 135
4.1.2.9 Nl. mediastinalis ......................................................................................... 139
4.1.2.10 Tonsilla pharyngea ..................................................................................... 142
4.2 Ultrastrukturelle Ergebnisse ........................................................................................ 144
4.2.1 Kontrollkälber .................................................................................................... 144
4.2.2 Kälber inokuliert mit C. psittaci ......................................................................... 148
4.2.2.1 Lungenveränderungen nach der Inokulation mit C. psittaci an den Tagen 2,
3, 4, 7 und 10 pi ......................................................................................... 148
4.2.2.2 Morphologie von C. psittaci in der Lunge ................................................. 152
5 DISKUSSION ........................................................................................... 164
6 ZUSAMMENFASSUNG .......................................................................... 180
7 SUMMARY ............................................................................................... 182
INHALTSVERZEICHNIS
8 LITERATURVERZEICHNIS ................................................................ 184
9 ANHANG .................................................................................................. 215
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
A Alveole
Abb. Abbildung
AEC Alveolarepithelzelle
AG Aktiengesellschaft
AP Alkalische Phosphatase
APC professionelle antigenpräsentierende Zelle
Aqua dest. destilliertes Wasser
B Bronchus
BALT Bronchus-assoziiertes lymphatisches Gewebe
BAL bronchoalveoläre Lavage
BALF bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit
BCR B-Zellrezeptor
BGM Buffalo green monkey
bidest. bidestillatus
BM Basalmembran
Br Bronchiolus
BSA Bovines Serum Albumin
bzw. beziehungsweise
C. Chlamydia
CAP ambulant erworbene Pneumonie (community acquired pneumonia)
CD Cluster of differentiation
cm Zentimeter
Cp. Chlamydophila
Da Dalton
DAB Diaminobenzidintetrachloriddihydrat
DC dendritische Zelle
DNA Desoxyribonukleinsäure
DPBS Dulbecco´s Phosphat gepufferte Salzlösung
dpi Tage nach der Inokulation
EBE Einschluss-bildende Einheit
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
E.coli Escherichia coli
EK Elementarkörperchen
Env. Hülle
ER endoplasmatisches Retikulum
Fa. Firma
FAE Follikel-assoziiertes Epithel
FDC follikulär dendritische Zelle
G Blutgefäß
GmbH Gesellschaft mit beschränkter Haftung
h Stunde
HE Hämatoxilin-Eosin
HEV hochendotheliale Venole
HF Holstein Friesian
HRP Meerrettichperoxidase
HSP Hitze Schock Protein
I Interstitium
Inc. Einschluss
IAS Interalveolarseptum
IEM Immunelektronenmikroskopie
IFZ Interfollikularzone
Ig Immunglobulin
IL Interleukin
i.v. intra venös
IK Intermediarkörperchen
Kap. Kapitel
kDa Kilodalton
KDO 2-Keto-3-Desoxyoctonat
kg Kilogramm
l Liter
LGV Lymphogranuloma venereum
LMM Lamina muscularis mucosae
Lp Lamina propria mucosae
LPS Lipopolysaccharid
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
m männlich
M. Mycoplasma
mAb monoklonaler Antikörper
MALT Schleimhaut-assoziiertes Lymphgewebe
Max Maximum
Mbp Megabasenpaare
mg Milligramm
MHC Haupthistokompatibilitätskomplex
min Minute
Min Minimum
ml Milliliter
mm Millimeter
Mol Stoffmenge
MOMP hauptsächliches äußeres Membranprotein
Nl./Nll. Nodulus lymphaticus/ Noduli lymphatici
Nr. Nummer
Omp äußere Membranproteine
pi nach der Inokulation (lat. post inoculationem)
PBS Phosphat-gepufferte Salzlösung
PIM intravaskulärer Makrophage
PMN polymorphkerniger neutrophiler Granulozyt
pIgR polymerer Immunglobulinrezeptor
RB rotbunt
rER raues Endoplasmatisches Retikulum
RK Retikularkörperchen
RT Raumtemperatur
ROI Messfeld (region of interest)
ROS reaktive Sauerstoffspezies
SB schwarzbunt
S-P Surfactantprotein
SM Submukosa
sp. Spezies
SPGA Sucrose-Phosphat-Glutamat-Albumin
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
spp. Spezies
SRCR Scavangerrezeptor
Tab. Tabelle
TCR T-Zellrezeptor
TGF transformierender Wachstumsfaktor
TEM Transmissionselektronenmikroskopie
Th T-Helferzelle
TLLS Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz
TM Tunica muscularis mucosae
TNF Tumornekrosefaktor
TS Teilstrich
SM Submukosa
u. und
u. a. unter anderem
unv. unverdünnt
WC Workshop Cluster
VCAM vaskuläres Zelladhäsionsmolekül
verd. verdünnt
°C Grad Celsius
µ mikro
µl Mikroliter
µm Mikrometer
nm Nanometer
% Prozent
§ Paragraf
13 EINLEITUNG
1 EINLEITUNG
Natürliche Infektionen mit Chlamydien treten weltweit bei Mensch und Tier auf
(LONGBOTTOM u. COULTER 2003). Sie verlaufen oft subklinisch, was dazu führt, dass
die Bedeutung des Erregers vielfach unterschätzt wird (HARKINEZHAD et al. 2007;
ROHDE et al. 2010). Chlamydia (C.) psittaci ist ein gram-negatives, obligat intrazelluläres
Bakterium, das sich biphasisch vermehrt und der Ordnung Chlamydiales angehört (KUO et al.
2011). Die Ordnung umfasst Erreger, die pathogen für Mensch und Tier sind
(LONGBOTTOM u. COULTER 2003). Als Reservoir für C. psittaci gelten Zier- und
Wildvögel (KALETA u. TADAY 2003). C. psittaci ist ein Zoonoseerreger, der beim
Menschen neben subklinischen Infektionen schwerwiegende Erkrankungen, wie Endokarditis,
Hepatitis und Enzephalitis verursachen kann (CARR-LOCKE u. MAIR 1976; SHEE 1988;
NEWMAN et al. 1992; VANROMPAY et al. 1995; BEECKMAN u. VANROMPAY 2009;
FRAEYMAN et al. 2010). Das Rind ist neben anderen Chlamydienspezies (C. pecorum,
C. abortus und C. suis), auch empfänglich für C. psittaci (JEE et al. 2004; REINHOLD u.
SACHSE 2004; PANTCHEV et al. 2010). Die Infektion mit C. psittaci verursacht beim Rind
Erkrankungen des Respirationstrakts und des Intestinaltrakts, wobei auch hier häufig von
inapparenten Verläufen berichtet wird (RONSHOLT 1978; REGGIARDO et al. 1989;
WITTENBRINK et al. 1993; JEE et al. 2004; TWOMEY et al. 2006).
Da bislang unklar ist, ob eine Übertragung des Zoonoseerregers C. psittaci vom Rind auf den
Menschen möglich ist, wurde ein Infektionsmodell an Kälbern zur Charakterisierung der
respiratorischen Erkrankungen und der Erregerausscheidung etabliert. Es wurden 21 Kälber
mit C. psittaci (DC15) intrabronchial inokuliert (OSTERMANN et al. 2010). Der Erreger
induzierte reproduzierbar eine Bronchopneumonie, die innerhalb des Untersuchungszeitraums
von fünf Wochen abheilte (LAMBERTZ 2011). Als Vergleich dienten 21 Kontrollkälber, die
ein steriles Inokulum erhielten. In der vorliegenden Arbeit stand Organmaterial dieser Tiere
für die Untersuchungen zur Verfügung. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die am
Immungeschehen beteiligten Zelltypen während des Infektionsverlaufs mit C. psittaci zu
charakterisieren. Da sich C. psittaci intrazellulär in einer membranumhüllten Vakuole
vermehrt, ist anzunehmen, dass die zellulär vermittelte Immunantwort, insbesondere in Form
von zytotoxischen T-Lymphozyten, entscheidend an der Elimination des Erregers beteiligt ist.
In der Untersuchung wurden neutrophile Granulozyten, CD1b+ dendritische Zellen,
EINLEITUNG 14
Makrophagen, MHC II+ Zellen sowie CD4+, CD8+ und γδ+ T- Lymphozyten aber auch
IgG1+, IgM+ und IgA+ B-Lymphozyten und Plasmazellen in Lunge, Nl. mediastinalis und
Tonsilla pharyngea an konsekutiven Zeitpunkten (Tag 2, 3, 4, 7, 10, 14 und 35/37 nach der
Inokulation) einbezogen. Da von gesunden Kälbern nur wenige Studien zur Verteilung von
Leukozytenpopulationen in der Lunge vorliegen, wurde die Verteilung der oben genannten
Leukozytensubpopulationen in Lunge, Trachea, Tonsilla pharyngea und Nl. mediastinalis von
klinisch gesunden Kälbern untersucht (ALLAN et al. 1979; ANDERSON et al. 1986a, b;
THOMASMEYER 2006).
Ultrastrukturell lassen sich verschiedene Entwicklungsstadien der Chlamydien unterscheiden.
Zudem kann mit dieser Methode die Bildung aberranter Chlamydienstadien nachgewiesen
werden, von denen angenommen wird, dass sie über lange Zeit im Körper verbleiben
(HAMMERSCHLAG et al. 1992; BEATTY et al. 1994; HOGAN et al. 2004; GOELLNER et
al. 2006). Der Nachweis dieser Stadien in vivo ist jedoch selten (POSPISCHIL et al. 2009). In
der vorliegenden Arbeit sollte ergänzend zu den immunhistologischen Methoden die
transmissionselektronenmikroskopische Untersuchung Aufschluss über die Wirts-Erreger-
Interaktionen geben. Neben der Morphologie von C. psittaci waren seine Zielzellen und
subzelluläre Reaktionen nach der Infektion von Interesse.
15 LITERATURÜBERSICHT
2 LITERATURÜBERSICHT
In der vorliegenden Arbeit wurden die pathogenetischen Abläufe nach intrapulmonaler
Infektion von Kälbern mit C. psittaci untersucht. Daher werden in der Literaturübersicht
zunächst Chlamydien, insbesondere C. psittaci und durch sie verursachte Erkrankungen
vorgestellt. Danach wird die Anatomie, Histologie und Ultrastruktur des Respirationstrakts
des Rindes beschrieben. Schließlich wird die Morphologie und Funktion der Zellen
dargestellt, die an einer natürlichen und adaptiven Immunabwehr beteiligt sind.
2.1 Chlamydien
2.1.1 Taxonomische Einordnung
Die Bakterien der Familie Chlamydiaceae (gr. Chlamys-Mantel) sind obligat intrazellulär
lebend, gram-negativ und unbeweglich. Sie zeigen einen einzigartigen Vermehrungszyklus
und werden deshalb einer separaten Ordnung, den Chlamydiales, zugeordnet (STORZ u.
PAGE 1971). Zunächst umfasste die Ordnung eine Familie Chlamydiaceae, mit einem Genus
Chlamydia und zwei Spezies C. trachomatis und C. psittaci (TAMURA et al. 1971).
C. trachomatis wurde lediglich beim Menschen isoliert, wies Glykogenansammlungen im
Einschluss auf und unterschied sich aufgrund seiner Folatsynthese von C. psittaci. Die
Etablierung DNA-basierter Klassifizierungsmethoden nach 1980 ermöglichte die Zuordnung
weiterer Stämme. Zugefügt wurden C. pneumoniae, C. pecorum und Chlamydia trachomatis-
ähnliche Chlamydien, die beim Schwein entdeckt wurden (GRAYSTON et al. 1989;
FUKUSHI u. HIRAI 1992; KALTENBOECK et al. 1993).
Erkenntnisse aus Genomanalysen führten 1999 zu einer Wende in der Taxonomie der
Chlamydiales (Tab. 1). Aufgrund von Übereinstimmungen im 16S und 23S rRNA Gen
wurden weitere Bakterienfamilien Parachlamydiaceae, Simkaniaceae und Waddliaceae
zugefügt (EVERETT et al. 1999). Die Erreger dieser Bakterienfamilien vermehren sich
chlamydienspezifisch, zeigen jedoch Unterschiede in Genom und Färbeverhalten. Dies erklärt
die Einordnung in verschiedene Familien. Bakterien der Familie Chlamydiaceae sind
gekennzeichnet durch die einzigartige Sequenz ihres LPS-Trisaccharids αKdo- (2�8) αKdo-
(2�4) αKdo (KOSMA 1999). Neben dem Genus Chlamydia, das die Spezies C. trachomatis,
C. suis und C. muridarum enthielt, wurde das Genus Chlamydophila (Cp.) etabliert, das die
Spezies umfasste, die sich von C. trachomatis unterschieden. Diese synthetisierten kein
LITERATURÜBERSICHT 16
Glykogen, variierten in Morphologie und Sulfadiazinresistenz und wiesen mit 1,2 Mbp ein
geringfügig größeres Genom auf. Die Spezies Cp. psittaci wurde enger gefasst und auf die
aviären Stämme beschränkt. Die ihnen im Vorfeld zugeordneten Abort-, Katzen- und
Meerschweinchenstämme erhielten eigenständige Speziesbezeichnungen, sodass im Genus
Chlamydophila folgende Spezies unterschieden wurden Cp. abortus, Cp. psittaci, Cp. felis,
Cp. caviae, Cp. pneumoniae und Cp. pecorum (EVERETT et al. 1999).
Da die Neuordnung biologische Zusammengehörigkeiten außer Acht ließ, folgte eine
abermalige taxonomische Neuordnung (SCHACHTER et al. 2001; STEPHENS et al. 2009).
Aktuell sind acht Familien in der Ordnung Chlamydiales enthalten: Chlamydiaceae,
Clavichlamydiaceae, Criblamydiaceae, Parachlamydiaceae, Piscichlamydiaceae,
Rhabdochlamydiaceae, Simkaniaceae und Waddliaceae (KUO et al. 2011). Die seit 2011
gültige Taxonomie sieht keine Trennung in zwei Chlamydiengenera vor, sodass lediglich das
Genus Chlamydia bestehen blieb. Ihm wurden alle neun Chlamydia sp. untergeordnet.
Tab. 1: Taxonomie der Chlaymdiaceae im zeitlichen Verlauf und Wirtsspektrum der
Chlamydienspezies
Taxonomie 1980-1999
Taxonomie nach EVERETT et al.
(1999)
Taxonomie nach KUO et al. (2011)
Wirtsspektrum nach
KERR et al. (2005)
C. trachomatis C. trachomatis C. trachomatis Mensch
C. suis C. suis Schwein C. muridarum C. muridarum Maus, Hamster
C. psittaci Cp. abortus C. abortus Wiederkäuer,
Schwein Cp. psittaci C. psittaci Vogel, Geflügel Cp. felis C. felis Katze Cp. caviae C. caviae Meerschweinchen
C. pneumoniae Cp. pneumoniae C. pneumoniae Mensch
C. pecorum Cp. pecorum C. pecorum Wiederkäuer,
Schwein
17 LITERATURÜBERSICHT
2.1.2 Erkrankungen als Folge von Chlamydieninfektionen
Chlamydien verursachen vielfältige Krankheitsbilder bei Mensch und Tier, beinhalten
Zoonoseerreger und werden deshalb als bedeutende Infektionserreger angesehen
(LONGBOTTOM u. COULTER 2003).
Die Spezies C. trachomatis verursacht Erkrankungen beim Menschen und lässt sich aufgrund
von Gewebetropismus, Pathogenität und biologischem Verhalten in der Zellkultur in das
okuläre, genitale und Lymphogranuloma venereum (LGV) Biovar unterteilen (MOULDER et
al. 1984). Entsprechend der ompA-Sequenzierung sind 18 Serovare zu unterscheiden. Neben
dem Trachom, das durch die Serovare A bis C verursacht wird, kommt es durch die Serovare
D bis K zu den weltweit verbreiteten sexuell übertragbare Krankheiten. Die WHO schätzte
die Prävalenz von venerisch übertragenen C. trachomatis auf 90 Millionen Neuinfektionen
pro Jahr und machte damit auf ihre globale Bedeutung aufmerksam (WHO 1996). Die Erreger
des LGV Biovars verursachen systemische Erkrankungen.
C. pneumoniae umfasst das humane, Koala und equine Biovar. C. pneumoniae ist primär ein
respiratorisches Pathogen des Menschen und wird bei 5-20% der humanen ambulant
erworbenen Pneumonien (community aquired pneumonia (CAP)) als Ursache vermutet
(HAMMERSCHLAG 2000). Der Erreger wird mit persistenten Infektionen in Verbindung
gebracht, wobei ein Zusammenhang zur Atherosklerose und koronaren Herzerkrankung
diskutiert wird (STRATTON u. SRIRAM 2003).
C. psittaci infiziert primär den Vogel und verursacht meist systemische Infektionen, bei denen
viele Organsysteme insbesondere der Intestinaltrakt und Respirationstrakt mit
unterschiedlicher klinischer Ausprägung betroffen sind. Die Stämme von C. psittaci besitzen
zoonotisches Potential und können beim Menschen milde bis schwerwiegende atypische
Pneumonien verursachen.
C. pecorum wurde beim Wiederkäuer, Koala und Schwein isoliert. Die Spezies induziert
verschiedene Krankheitsbilder in unterschiedlicher Ausprägung, darunter Reproduktions-
störungen, Enteritiden und Pneumonien (CARR-LOCKE u. MAIR 1976; MAIR et al. 1988;
SHEE 1988; VANROMPAY et al. 1995; FRAEYMAN et al. 2010).
Der Stamm C. abortus ist bei Wiederkäuern endemisch verbreitet, verursacht vor allem bei
kleinen Wiederkäuern häufig Aborte und kommt vereinzelt als Aborterreger bei schwangeren
Frauen in Frage.
LITERATURÜBERSICHT 18
C. suis ist ein weit verbreiteter Erreger in Schweinebeständen, der sich vermehrt resistent
gegenüber Tetrazyklinen, dem Antibiotikum erster Wahl bei der Behandlung der
Chlamydiose, zeigt (LENART et al. 2001). C. suis verursacht beim Schwein Enteritiden,
Pneumonien, Konjunktivitiden, Perikarditiden und Reproduktionsstörungen und wird mit
Frühsterblichkeit von Ferkeln in Verbindung gebracht (LONGBOTTOM 2004).
Epidemiologische Studien sind nur begrenzt vorhanden. Mitunter wird von Mischinfektionen
berichtet (HOELZLE et al. 2000; POSPISCHIL et al. 2009).
C. muridarum umfasst zwei Stämme (MoPn; SFPD), die aus Maus und Hamster isoliert
wurden. SFPD verursacht keine Erkrankung (FOX et al. 1993). MoPn verläuft
asymptomatisch oder verursacht Lungenentzündungen bei der Maus. C. muridarum wird
häufig im Mausmodell verwendet, um chlamydiale Genitalinfektionen zu simulieren und gibt
Aufschluss über die Abläufe akuter und chronischer Genitalinfektionen.
C. caviae lässt sich beim Meerschweinchen isolieren. Primär wird die Konjunktiva infiziert.
Die experimentelle Infektion des Genitaltrakts verläuft ähnlich der humanen Genitalinfektion
mit C. trachomatis (LONGBOTTOM 2004).
C. felis wird regelmäßig aus der Konjunktiva infizierter Hauskatzen isoliert, die erst eine
unilaterale und dann bilaterale Konjunktivitis zeigen. Aus der Literatur ist bekannt, dass
C. felis auf den Menschen übertragbar ist (SCHACHTER et al. 1969; HARTLEY et al. 2001;
LONGBOTTOM u. COULTER 2003).
2.1.3 Chlamydialer Entwicklungszyklus
Die Chlamydien zeigen einen komplexen Entwicklungszyklus, der vorwiegend in
Epithelzellen der Konjunktiva, des Respirationstrakts, des Urogenitaltrakts und des
Gastrointestinaltrakts stattfindet (Abb. 1). Den Eintritt der infektiösen Elementarkörperchen
(EK) in die Wirtszelle vermitteln Adhäsine, darunter HSP-70, Env-B oder MOMP (SU et al.
1990b; RAULSTON et al. 1993; STEPHENS u. LAMMEL 2001). Elementarkörperchen
werden endozytotisch in Clathrin-ummantelte Vesikel aufgenommen oder
mikrofilamentabhängig phagozytiert und von der Plasmamembran der Wirtszelle umgeben
(HODINKA et al. 1988; FINLAY u. COSSART 1997). Es folgt die chlamydiale Migration
von der Zellperipherie zur perinukleären Region, wo eine als parasitophore Vakuole benannte,
membranumhüllte Struktur entsteht (MAJEED u. KIHLSTROM 1991). In ihr erfolgt die
19 LITERATURÜBERSICHT
Replikation des Erregers (ROCKEY et al. 1996; HACKSTADT et al. 1997;
ABDELRAHMAN u. BELLAND 2005). Der Einschluss blockiert die Fusion mit
wirtseigenen Lysosomen und sichert so das Überleben der Chlamydien (WARD 1983;
MOULDER 1991).
Abb. 1: Chlamydialer Entwicklungszyklus schematisch dargestellt, EK–
Elementarkörperchen, RK–Retikularkörperchen, h–Stunden; modifiziert nach
LONGBOTTOM u. COULTER (2003)
Die Expansion der parasitophoren Vakuole erfolgt synchron zur logarithmischen Vermehrung
des Erregers. Neben der Zellwand ändert sich während der Replikation auch die
Nukleoidstruktur der Chlamydien. Etwa 24 Stunden nach der Infektion mit einem EK enthält
der Einschluss lediglich Retikularkörperchen (RK), die sich ohne offensichtliche
Septenbildung vermehren (KUO et al. 2011). Spät im Replikationszyklus entwickeln sich
RKs asynchron über Intermediärkörperchen (IK) zurück zu EKs (KUO et al. 2011). Bevor die
LITERATURÜBERSICHT 20
Zelle neue infektiöse Stadien entlässt, sind im Einschluss alle drei Entwicklungsformen
sichtbar. Die Inklusion enthält ein Maximum an infektiösen Stadien, wobei ihre Anzahl nicht
allein speziesabhängig ist. In vitro wurde zum einen die intrazelluläre Auflösung des
Einschlusses mit anschließender Zellkern- und Zellwandlysis der Wirtszelle beschrieben, zum
anderen konnte mit Hilfe des konfokalen Laser Scanning Mikroskops die Extrusion des
Einschlusses ohne Zersetzung der infizierten Zelle nachgewiesen werden (HYBISKE u.
STEPHENS 2007). Der Entwicklungszyklus dauert in vitro speziesabhängig 48-72 Stunden
(ROCKEY et al. 1996). Die Immunabwehr des Wirts, der Entzug von Nährstoffen oder die
antibiotische Behandlung können die Entwicklung der Chlamydien beeinflussen und abnorm
geformte Retikularkörperchen hervorrufen (HAMMERSCHLAG 2002). Es handelt sich um
abberante Stadien, die lebensfähig, aber nicht anzuzüchten sind. Unter günstigen
Umgebungsbedingungen können sich die aberranten Dauerstadien schnell in normal
replizierende Chlamydien zurück verwandeln (GOELLNER et al. 2006).
2.1.4 Morphologie der Entwicklungsstadien
Während der Replikation der Chlamydien lassen sich verschiedene Entwicklungsstadien
beobachten. Elementarkörperchen sind 0,2-0,4 µm groß und werden von einer trilaminaren
Wand umgeben (KUO et al. 2011). Aufgrund ihrer geringen Oberfläche und ihrer osmotisch
stabilen und wenig permeablen Hülle sind sie als einziges Stadium extrazellulär
überlebensfähig. Die elektronenmikroskopische Untersuchung zeigt typischerweise
rundgeformte Elementarkörperchen. Nur die Elementarkörperchen des humanen Biovars von
C. pneumoniae sind birnenförmig (MIYASHITA et al. 1993). Das Kernmaterial ist
elektronendicht und liegt kondensiert mit Proteinen und wenigen Ribosomen vor. Die
Kondensation des Kernmaterials kommt durch bakterielle DNA-bindende Proteine (HctA,
HctB) zustande, die dem Histon ähnlich sind (BRICKMAN et al. 1993). Das Nukleoid
formiert sich exzentrisch und lässt eine Assoziation mit der inneren Membran der Zellwand
vermuten (ABDELRAHMAN u. BELLAND 2005). Im Zuge der Reifung lösen sich die
Histon-DNA-Verbindungen und es entstehen pleomorphe, mit 0,6-1,5 µm deutlich größere
Retikularkörperchen (RK), die DNA, RNA und Proteine synthetisieren (KUO et al. 2011).
Ihre trilaminare Zellwand ist dünner und flexibler. Im Gesamten erscheinen sie
ultrastrukturell weniger elektronendicht. Sie besitzen mehr Ribosomen und weisen eine
fibrilläre, aufgelockerte DNA auf, die sich gleichmäßig im Zytoplasma verteilt.
21 LITERATURÜBERSICHT
Rasterelektronen- und transmissionselektronenmikroskopische Untersuchungen zeigen
Knopf-ähnliche Strukturen (spike-like projections) auf der äußeren Oberfläche beider
Entwicklungsstadien, die als Komponenten des Typ-III-Sekretionssystems identifiziert
wurden. Sie dienen dazu virulente Proteine ins Zytoplasma der Wirtszelle zu schleusen
(MATSUMOTO 1982; BAVOIL u. HSIA 1998). Die Spikes auf der Oberfläche von RKs
reichen im Gegensatz zu denen der EKs bis in die Einschlussmembran (MATSUMOTO u.
MANIRE 1970). Während des Entwicklungszyklus lassen sich weiterhin IKs abgrenzen. Ihr
Kernmaterial liegt zentral im Zytoplasma vor, wodurch sie einer Zielscheibe gleichen (KUO
et al. 2011). Aberrante Chlamydienstadien sind deutlich größer und pleomorph. Unter
Einwirkung von Penicillin formt beispielsweise C. psittaci aberrante Stadien, die
elektronenmikroskopisch als pleomorphe, deutlich vergrößerte Retikularkörperchen mit
elektronendichten äußeren Membranen charakterisiert wurden (GOELLNER et al. 2006).
2.1.5 Zellwand der Chlamydien
Aufgrund ihrer geringen Größe wurden Chlamydien ursprünglich für Viren gehalten. Sie
besitzen jedoch eine Zellwand (Abb. 2), die der anderer gram-negativer Bakterien ähnlich ist
(EVERETT u. HATCH 1995). Neben dem typischen Aufbau aus äußerer Doppelmembran,
die Lipopolysaccharide (LPS) und Proteine enthält, einem periplasmatischen Spalt und einer
inneren zytoplasmatischen Membran, fehlt im Gegensatz zu anderen Eubakterien eine in allen
Stadien detektierbare Peptidoglykanschicht (BARBOUR et al. 1982).
Abb. 2: Schemazeichnung des Zellwandaufbaus von Elementarkörperchen von C. psittaci.
Die äußere Membran der Chlamydien enthält MOMP–major outer membrane proteine,
b-LPS, c-Env-A und d-Env-B; modifiziert nach EVERETT u. HATCH (1995)
Äußere Membran
P-Schicht
Innere Membran
LITERATURÜBERSICHT 22
Paradoxerweise reagieren chlamydiale Elementarkörperchen dennoch sensibel auf
Antibiotika, die die Peptidoglykansynthese hemmen (EVERETT et al. 1999; GHUYSEN u.
GOFFIN 1999).
Das hitzestabile LPS der Chlamydien (10 kDa) ist bei allen Chlamydienspezies vorhanden
und bildet eine wichtige antigene Struktur der äußeren Chlamydienwand. Es exprimiert ein
gruppenspezifisches Epitop. Im Vergleich zum LPS anderer gram-negativer Bakterien ist das
LPS der Chlamydien verkürzt und besitzt eine nur geringe endotoxische Aktivität
(KOSMA 1999). Neben dem Lipid A ist eine immunogene Kernregion aus 2-Keto-3-
desoxyoctonsäure (KDO) vorhanden (KOSMA 1999). Ein weiteres genusspezifisches
Antigen ist als GLXA bekannt (KOSMA 1999). Es handelt sich um ein Glykolipid-
Exoantigen, das die Invasion des Erregers vermittelt und auf der Oberfläche von
Elementarkörperchen von C. trachomatis, C. pneumoniae und C. psittaci gefunden wurde.
Immunfluoreszenzmikroskopische Untersuchungen wiesen GLXA ebenfalls auf der
Einschlussmembran von C. trachomatis und C. psittaci nach (WEBLEY et al. 2004). Seine
chemische Zusammensetzung und antigene Struktur ist weitgehend unbekannt. In der
Zellkultur konnte die Blockierung des GLXA durch spezifische Antikörper die Infektiosität
von C. trachomatis, C. pneumoniae und C. psittaci senken (VORA u. STUART 2003).
In der äußeren Membran von Elementarkörperchen sind speziesübergreifend MOMP, Env-A
und Env-B enthalten. MOMP wird durch das Omp-A-Gen verschlüsselt und stellt
möglicherweise das wichtigste Antigen der Chlamydien dar (DANILITION et al. 1990;
ALLEN u. STEPHENS 1993). Es handelt sich um ein mannosereiches Glykoprotein, das in
der Zellwand der Elementarkörperchen rund 60% der Proteinmasse ausmacht und sich bei den
verschiedenen Chlamydienspezies in Struktur und Molekularmasse (~40 kDa) gleicht
(CALDWELL et al. 1981; KOSMA 1999; STEPHENS u. LAMMEL 2001). MOMP dient als
Diffusionsporin und exprimiert variable Epitope, die eine Klassifizierung in Spezies,
Subspezies und Serovare ermöglichen (JONES et al. 2000). Bei den Spezies C. trachomatis
und C. psittaci gilt MOMP als immundominant (HATCH et al. 1984; SU et al. 1990a). Die
osmotisch stabilen EKs besitzen im Gegensatz zu RKs cysteinreiche Hüllenproteine (Env-A,
Env-B), die über Disulfidbrücken mit MOMP kreuzverlinkt und unlöslich in denaturierendem
Natriumdodecylsulfat sind (MATSUMOTO u. MANIRE 1970; HATCH et al. 1984).
Möglicherweise stellt der Komplex aus diesen Proteinen das funktionelle Äquivalent zum
23 LITERATURÜBERSICHT
Peptidoglykan dar (HATCH 1996). Entsprechend ihrer Größe unterscheiden sich das kleine
Env-A (12 kDa) und das große Env-B (60 kDa). Das Env-B ordnet sich regelmäßig an der
inneren Oberfläche der äußeren Membran an und bildet die periplasmatische Schicht (P-
Schicht, HATCH 1996). Die Zusammensetzung der Zellwand ist abhängig vom
Entwicklungszyklus. So erklärt sich die osmotische Fragilität der RK. Neben Disulfidbrücken
fehlt ihnen ebenfalls eine P-Schicht (MATSUMOTO u. MANIRE 1970).
Genomsequenzierungen detektierten ein weiteres oberflächenexponiertes Protein, das
Porin B, das nur wenig Variation zwischen den Isolaten einer Spezies zeigt und im Gegensatz
zu MOMP nur in geringer Menge vorhanden ist (KUBO u. STEPHENS 2001).
Proteine einer multigenen Familie von Antigenen komplettieren den äußeren chlamydialen
Proteinkomplex. Sie sind zum Teil oberflächenexponiert, wobei ihr Vorkommen zwischen
den Spezies variiert (STEPHENS et al. 1998; KALMAN et al. 1999).
Die Proteine HSP-70 und HSP-60 sind nicht Teil des chlamydialen Proteinkomplexes, werden
aber mitunter auf der Oberfläche von Chlamydien exprimiert und gelten als immundominant
(RAULSTON et al. 1998). Funktionell dient HSP-70 als Adhäsin (DANILITION et al. 1990).
Es wurde in der äußeren Membran ebenso wie im Zytoplasma von EK und RK von C.
trachomatis detektiert. HSP-60 ist dem Gro-EL Protein ähnlich und wird von allen
Chlamydien verschlüsselt. Es wird mit der Seroreaktivität infizierter Individuen in
Verbindung gebracht (BAVOIL et al. 1990).
2.1.6 Parasitophore Vakuole
Elementarkörperchen infizieren die Wirtszelle und werden vorerst umgeben von einem
Phagosom, dessen Membran von der Plasmamembran gebildet wird. Das Phagosom
entwickelt sich weiter zu einer Vakuole mit einer spezifischen Wand, die den Chlamydien
eine Nische bietet, in der die Replikation erfolgt. Die Wand der Vakuole ist impermeabel für
Makromoleküle, die größer als >520 Da sind und beteiligt sich an der Modulation der
Wirtszelle (BETTS et al. 2009). Schon früh im Replikationszyklus sichern sich alle
Chlamydienspezies den Zugang zu wirtseigenem Sphingomyelin und Cholesterol, indem sie
auf exozytotische Vesikel des Golgiapparats zugreifen und mit ihnen fusionieren
(HACKSTADT et al. 1997). Transmissionselektronenmikroskopische Untersuchungen zeigen
in mit C. trachomatis infizierten Zellen sogar die weitreichende Manipulation des
Golgiapparats, der im Zuge der Infektion in Golgistapel zerlegt wird und die
LITERATURÜBERSICHT 24
Lipidbeschaffung steigern soll (HEUER et al. 2009). Der Nährstoffbezug ermöglicht die
chlamydiale Reifung, die unter anderem einher geht mit der Modifizierung der
Einschlussmembran durch den Einbau von integralen Inklusionsmembranproteinen (Inc-
Proteine; BANNANTINE et al. 2000). Inc-Proteine werden in hoher Vielfalt von allen
Chlamydia spp. exprimiert (BETTS et al. 2009). Ihnen gemein ist eine hydrophobe Domäne
aus mindestens 40 Aminosäureresten (BANNANTINE et al. 1998). Sie sind dem Zytoplasma
der Wirtszelle zugekehrt und erfüllen vermutlich eher eine strukturerhaltende als eine
interagierende Funktion (FIELDS u. HACKSTADT 2002). Wahrscheinlich ist, dass sie vom
Typ-III-Sekretionssystem synthetisiert werden (FIELDS et al. 2003). Das Typ-III-
Sekretionssystem ist ein Kennzeichen für pathogene, gram-negative Bakterien und wurde bei
allen Chlamydienspezies nachgewiesen (STEPHENS et al. 1998; READ et al. 2000). Es
schleust Effektorenzyme in das Zytoplasma der Wirtszelle aus. So wird der Umbau des
Zytoskeletts, der Zelltod oder die Antigenprozessierung der Wirtszelle beeinflusst (ZHONG
et al. 1999; ZHONG et al. 2000; FIELDS u. HACKSTADT 2002). Weitere Proteine ohne
charakteristische hydrophobe Domäne sind in der Einschlussmembran verankert. Darunter
Cap1, ein 31 kDa schweres Protein von C. trachomatis, von dem nachgewiesen wurde, dass
es von CD8+ T-Lymphozyten erkannt wird (FLING et al. 2001).
2.1.7 Besonderheiten von Chlamydia psittaci
Erstmals 1879 wurden Vögel mit einer Grippe-ähnlichen Krankheit des Menschen in
Verbindung gebracht. Diese wurde im Folgenden nach dem lateinischen Wort für Papagei
(psittacus), als Papageienkrankheit bezeichnet (MORANGE 1895). Beim Vogel, dem
Primärwirt von C. psittaci, führt die Infektion mit unterschiedlicher klinischer Ausprägung zu
Erkrankungen des Intestinaltrakts und Respirationstrakts. C. psittaci verursacht beim
Menschen neben subklinischen Infektionen schwerwiegende Erkrankungen (NEWMAN et al.
1992; BEECKMAN u. VANROMPAY 2009; DICKX u. VANROMPAY 2011). Berichtet
wird von Endokarditiden, Hepatitiden und Enzephalitiden (CARR-LOCKE u. MAIR 1976;
SHEE 1988; VANROMPAY et al. 1995; BEECKMAN u. VANROMPAY 2009;
FRAEYMAN et al. 2010).
Durch die Anwendung monoklonaler Antikörper, die an serovarspezifische Epitope des
MOMPs binden, und durch die PCR-basierte Analyse des Omp-A-Gens wurden neun
Serovare von C. psittaci (A bis F, E/B, WC1, M56) entdeckt (ANDERSEN 1991; SAYADA
25 LITERATURÜBERSICHT
et al. 1995; VANROMPAY et al. 1997; SACHSE u. GROSSMANN 2002; SACHSE et al.
2008). Weitere Genomanalysen zeigen die Heterogenität von C. psittaci durch die Einteilung
in 15 Genotypen (SACHSE et al. 2008). Die Serovare von C. psittaci variieren in
Wirtsspektrum, Virulenz und Genomsequenz. Am häufigsten werden Stämme isoliert, die
dem Genotyp A angehören und hochvirulent für Mensch und Vogel sind (HEDDEMA et al.
2006). Der Genotyp A ist bei Psittaciden, Genotyp B bei Tauben, Genotyp C bei Enten und
Gänsen, Genotyp D bei Puten und Genotyp F bei Psittaciden und Puten verbreitet. Der
Genotyp E ist mit diversen natürlichen Wirten assoziiert und wurde bei Tauben, Laufvögeln,
Enten und Puten nachgewiesen. Genotyp E/B ließ sich aus Tauben, Enten und Puten,
Papageien und dem Menschen isolieren (GEENS et al. 2005). Zwei Genotypen wurden bei
Säugern, dem Rind (WC) und Labornagern (M56), entdeckt.
Die Übertragung auf den Menschen ist durch das Einatmen von mit C. psittaci
kontaminiertem Staub möglich. Dabei kommen wilde und domestizierte Vögel als
Chlamydienreservoir in Frage (VERBIN et al. 1969; HARKINEZHAD et al. 2007; VAN
DROOGENBROECK et al. 2009). Im Vergleich zu anderen Chlamydienspezies bildet
C. psittaci multiple, pleomorphe parasitophore Vakuolen pro Wirtszelle, die sich im gesamten
Zytoplasma ausbreiten (WYRICK et al. 1993). Genomanalysen belegen, dass die meisten der
ursprünglich für Energieparasiten gehaltenen Chlamydien selbständig ATP bilden
(MOULDER 1974). Im Unterschied dazu soll C. psittaci nur begrenzt fähig sein ATP zu
synthetisieren (HARKINEZHAD et al. 2007). Utrastrukturelle Untersuchungen zeigen die
direkte Interaktion zwischen den parasitophoren Vakuolen von C. psittaci und den
Mitochondrien der Wirtszelle (MATSUMOTO et al. 1991; HARKINEZHAD et al. 2007).
RKs von C. psittaci machen sich Wirtszell-ATP zu Nutze, das mit Hilfe einer speziellen ATP-
ADP-Translokase verwertbar wird (HATCH et al. 1982). Der Entwicklungszyklus von
C. psittaci ist innerhalb von 48 Stunden abgeschlossen (ROCKEY et al. 1996).
2.1.8 Immunpathogenese von Chlamydieninfektionen
Verschiedene Pathogenesestudien zur Chlamydieninfektion wurden im Tiermodell
durchgeführt. Vorwiegend stehen Ergebnisse zur Verfügung, die unter Verwendung des
humanpathogenen Stammes C. trachomatis oder C. muridarum am Labortier gewonnen
wurden und von in vitro-Studien ergänzt werden. Grundlage des immunologischen
LITERATURÜBERSICHT 26
Paradigmas zur Pathogenese von Chlamydieninfektionen von STEPHENS (2003) bildet die
initiale Infektion von Epithelzellen (Abb. 3).
Abb. 3: Modell über die zellulären Reaktionen auf die Infektion mit Chlamydien; modifiziert
nach STEPHENS (2003)
Epithelzellen sezernieren als Folge der Infektion und Erregerreplikation ein breites
Zytokinspektrum und modulieren so die Immunreaktion (RASMUSSEN et al. 1997; WISSEL
et al. 2005). Sezerniert wurde unter anderem IL-8, das chemotaktisch für neutrophile
Granulozyten (PMN) wirkt (BARTENEVA et al. 1996; MOAZED et al. 1996). Die
experimentelle Depletion von PMN im Tiermodell bei trächtigen Mäusen mit C. abortus
beeinflusste dabei vor allem die Dynamik von CD8+ T-Zellen und führte zu einer
Verminderung der CD8+ T-Zellen in den Entzündungsherden (DE OCA et al. 2000). Die
Elimination der PMNs hatte hingegen keinen Einfluss auf die Elimination von C. pecorum
27 LITERATURÜBERSICHT
(BUENDIA et al. 1999). Durch die Chlamydieninfektion wurden zeitlich verzögert
antigenspezifische T- und B- Lymphozyten zum Ort der Infektion rekrutiert. IFN-γ, das die
Reifung von T-Helferzellen induziert, wird durch IL-12 aktiviert (RUSCONI u. GREUB
2011). Die Bedeutung beider Zytokine wird in Experimenten mit C. muridarum an knock out
Mäusen deutlich. Die Depletion von IL-12 führte dazu, dass die Tiere stärkere
Lungenveränderungen zeigten (LU et al. 2000). IFN-γ-produzierende CD4+ und CD8+ T-
Lymphozyten trugen im Mausmodell zur Beseitigung einer primären Chlamydieninfektionen
bei (RAMSEY u. RANK 1991). IFN-γ limitierte dabei unter anderem durch den Entzug von
Tryptophan das Wachstum der Chlamydien (ROTTENBERG et al. 2002). Die humorale
Immunantwort nimmt Einfluss auf chlamydiale Entwicklungsstadien, die sich im
extrazellulären Raum befinden. Dabei wurde im Mausmodell die sekundäre nicht jedoch die
primäre Chlamydieninfektion durch B-Zellen beeinflusst (MOORE et al. 2003; RANK u.
WHITTUM-HUDSON 2010). Im Besonderen konnte MOMP-spezifisches IgA die
Infektiosität von C. trachomatis während der experimentellen Genitalinfektion vermindern
und die Ausbreitung des Erregers verhindern (RANK u. BATTEIGER 1989).
2.2 Respirationstrakt des Rindes
2.2.1 Anatomischer und histologischer Aufbau von Trachea und Lunge
Die Verzweigung der Bronchien bedingt die tierartspezifische, makroskopisch sichtbare
Lungenlappung (NICKEL et. al. 1979). Beim Wiederkäuer unterteilt sich die linke Lunge in
den Lobus cranialis sinister und in den Lobus caudalis sinister. Der kraniale Lungenlappen ist
zweigeteilt und besteht aus einer pars cranialis und einer pars caudalis. Die rechte Lunge
besteht aus vier Lungenlappen Lobus cranialis, Lobus medius, Lobus caudalis und Lobus
accessorius. Entsprechend der linken Lungenseite unterteilt sich auch der Lobus cranialis
dexter in eine pars cranialis und pars caudalis. Die pars cranialis wird vom trachealen
Bronchus belüftet, der vor der Hauptbifurkation aus der Trachea entspringt und den Lobus
anfällig gegenüber inhaliertem Fremdmaterial macht (CASWELL u. WILLIAMS 2007). Von
der Lungenkapsel (Pleura pulmonalis), die die linke und rechte Lunge umhüllt, ziehen Fasern
ins Innere des Organs und bilden interlobuläres, intralobuläres, peribronchiales und
perivaskuläres Interstitium. In ihnen sind Blutgefäße, Lymphgefäße, Nerven und Bronchien
enthalten. Dieses lockere Bindegewebe führt insbesondere beim Rind zu einer prominenten
LITERATURÜBERSICHT 28
Unterteilung des Lungenparenchyms in Lappen und Läppchen. Die Wand großer Blutgefäße
setzt sich zusammen aus einer inneren Tunica interna (Intima), aus einer mittleren Tunica
media und aus einer Tunica externa (Adventitia; NICKEL et al. 1979; LIEBICH 1998).
Der Respirationstrakt umfasst alle Organe, die die Aufnahme von Sauerstoff und die Abgabe
von Kohlenstoffdioxid sichern. Funktionell und strukturell lassen sich die Kompartimente der
Luftleitung von denen des Luftaustausches unterscheiden. Die Atemwege mit Nasenhöhle
(Cavum nasi), Schlund (Nasopharynx) und Kehlkopf (Larynx), die sich mit der Luftröhre
(Trachea) in die Lunge fortsetzt, sichern die Luftleitung.
Die Trachea ist, wie der Großteil des luftleitenden Systems, mit einem respiratorischen
Epithel ausgekleidet. Es besteht aus einem mehrreihigen, hochprismatischen Epithel. Die
Mehrzahl der Epithelzellen trägt Kinozilien. Zwischen ihnen sind schleimproduzierende
Becherzellen verteilt. Unter der Lamina epithelialis liegt die Lamina propria mucosae (Tunica
elastica mucosae), die feine Kollagenfasern, Gefäße und Nerven einschließt und durch längs
angeordnete elastische Fasern begrenzt wird (NICKEL et al. 1979; LIEBICH 1998). Die
Schleimhaut der Trachea wird zirkulär von hyalinen Knorpelspangen umfasst. Diese sind
dorsal geöffnet und werden durch einen Paries membranaceus bindegewebig verbunden. Der
Bindegewebsmembran liegen innen glatte Muskelfasern des Musculus trachealis an. Eine
Tunica adventitia (Tunica fibroelastica) verbindet die Trachea mit dem anliegenden Gewebe.
An der Bifurcatio tracheae trennt sich die Luftröhre in zwei Hauptbronchien (Bronchi
principales) auf, die intrapulmonal in Lappenbronchien (Bronchi lobares), Bronchi
segmentales und subsegmentales übergehen (Abb. 4; NICKEL et al. 1979; LIEBICH 1998).
29 LITERATURÜBERSICHT
Abb. 4: Bronchus segmentalis mit seinen Verzweigungen und zugehörigen Gefäßen und
Nerven; modifiziert nach NICKEL et al. (1979)
Das respiratorische Epithel, ebenso wie die knorpelige Stütze aus der Trachea setzen sich
zunächst fort, gehen jedoch mit zunehmender Verzweigung verloren, sodass Bronchiolen und
Alveolen ausschließlich durch elastische Faserhäute vor dem Kollabieren geschützt sind. Der
Übergang von luftleitendem System in das luftaustauschende macht den Umbau von Epithel
und Schleimhaut notwendig (Abb. 5), sodass das ursprünglich mehrreihige Epithel
einschichtig wird und seine Zilien und Becherzellen verliert (NICKEL et al. 1979; CRYSTAL
et al. 2008).
LITERATURÜBERSICHT 30
Das luftaustauschende System setzt sich beim Rind aus Alveolargängen (Ductus alveolares),
aus den Alveolarsäckchen (Sacculi alveolares) und aus gasaustauschenden Alveolen
zusammen.
1 2 3 4 1 2 5 4 6 7
Abb. 5: Hauptzelltypen des Lungenepithels, 1–kinozilientragende Epithelzelle,
2-undifferenzierte zylindrische Epithelzelle, 3–sekretorische Epithelzelle (Becherzelle),
4-Basalzelle, 5–Clarazelle, 6-Alveolarepithelzelle Typ II (AEC II), 7–Alveolarepithelzelle
Typ I (AEC I); modifiziert nach CRYSTAL et al. (2008)
2.2.1.1 Ultrastruktur der Alveolen
Verschiedene Zelltypen sind in der Alveole zu finden. Die membranösen
Alveolarepithelzellen (AEC I) sind große, flache Zellen, die die Alveolen zu 90-97%
tapetenartig auskleiden (SUTHERLAND et al. 2001; FEREOL et al. 2008). Sie liegen einer
dünnen Basalmembran auf und sind von einem Netz aus Blutgefäßen umgeben. Lateral sind
AEC I über tight junctions miteinander verbunden. AEC I weisen einen flachen Zellkern auf.
Alveolarepithelzellen Typ I sind ausdifferenzierte Zellen. Sie enthalten keine Antioxidantien
und sind besonders anfällig gegenüber Sauerstoffmangel. Morphologisch und funktionell
lassen sich Alveolarepithelzellen Typ II (AEC II) unterscheiden. Sie treten nur sporadisch in
Nischen der Alveolarwände auf, die durch lumenwärtige Einbuchtung der Kapillare entstehen
(NICKEL et al. 2004b). Den lateralen Kontakt zu AEC I stellen ebenfalls tight junctions her
(RYBICKA et al. 1974; ALLAN 1978). Die Zellen weisen apikale Mikrovilli auf und
enthalten zahlreiche intrazytoplasmatische Organellen, darunter elektronendichte osmiophile,
lamelläre Inklusionen, die das Surfactant mehrlagig speichern. Der Zellkern ist groß und
große Luftwege kleine Luftwege Alveole
31 LITERATURÜBERSICHT
kuboidal. Primär fungieren AEC II als Surfactantlieferanten. In ihnen wird Surfactant nicht
nur synthetisiert, sondern auch recycelt. Die oberflächenaktive Substanz besteht zu 80% aus
Phospolipiden, zu 10% aus neutralen Lipiden und zu 10% aus den Surfactantproteinen (S-P)
A, B, C und D. Sie breiten sich über der alveolären Oberfläche aus und verhindern ihren
Kollaps während der Exspiration. AEC II dienen als Vorläuferzelle des Alveolarepithels
(CASWELL u. WILLIAMS 2007).
Die maximal 100 nm dicke Basalmembran (BM) trennt Epithel und Endothel (CHEVILLE
2009). Die BM wird von Endothelzellen, Epithelzellen oder Myoepithelzellen synthetisiert,
ist fibrillär strukturiert und dem Kollagen ähnlich, wobei Mukopolysaccharide enthalten sind.
Die Epithelzellen sind fest mit der Basalmembran verbunden. Neben der Wirkung als Filter
dient sie als Leitschiene für die Regeneration von Alveolarepithel.
Das kapillare Endothel komplettiert die Blut-Luft-Schranke. Endothelzellen liegen der
Basalmembran eng an und halten damit den Diffusionsweg gering. Die Endothelzellen
werden durch Zellverbindungen mit Macula occludens zusammengehalten und bilden eine
kontinuierliche Barriere (CHEVILLE 2009). Eine feste Verbindung besteht vor allem
luminal. Die interzellulären Verbindungen enthalten Mukopolyssaccharide und repräsentieren
die fusionierten Lagen der äußeren Zytoplasmamembranen benachbarter Endothelzellen. In
plasmalemmalen Vesikeln (Caveolae) werden Makromoleküle aktiv von luminal nach basal
und entgegengesetzt transportiert. Die Zellkerne der Endothelzellen sind verglichen mit denen
des Alveolarepithels kleiner und länglich geformt (SOROKIN 1966). Im Bindegewebe
zwischen Epithel und Endothel sind mitunter Fibroblasten, Lymphozyten und glatte
Muskelfasern zu finden. Fibroblasten bilden eine heterogene Zellpopulation, die
ungleichmäßig mit extrazellulären Matrixproteinen, wie Elastin und Kollagen, assoziiert ist.
Nur dort, wo kein dichtes Bindegewebsnetzwerk vorliegt, kann der Gasaustausch erfolgen
(CHEVILLE 2009).
2.2.2 Histologischer und zellulärer Aufbau der Tonsille
Die Mandeln (Tonsillen) gehören dem Waldeyerschen Rachenring an und bilden eine
lymphoepitheliale Struktur. Sie sind beim Rind an definierten Lokalisationen angelegt und
stehen permanent in Kontakt zu inhalierten und oral aufgenommenen Antigenen (LIEBLER-
TENORIO u. PABST 2006). Den maßgeblichen Bestandteil des Waldeyerschen Rachenrings
bilden dabei Tonsilla pharyngea und Tonsilla palatina (NICKEL et al. 1979). Beide
LITERATURÜBERSICHT 32
unterscheiden sich aufgrund ihrer Lage. Die Tonsilla palatina liegt im Oropharynx. Die
Tonsilla pharyngea liegt im Nasopharynx und gilt deshalb als Wächter des Luftwegs. Beide
entwickeln sich nach der Geburt durch antigene Stimulation (SCHUH u. OLIPHANT 1992;
MANESSE et al. 1998). Dabei sind Kälber bis zur vollen Entwicklung der Tonsillen
besonders anfällig gegenüber Infektionen (SCHUH u. OLIPHANT 1992). Die Tonsillen
bestehen aus zahlreichen Einzellymphknoten (Noduli lymphatici), die im Gesamten
bindegewebig umhüllt und von Drüsen umlagert werden. Tonsillen besitzen im Unterschied
zu anderen lymphatischen Organen keine afferenten Lymphgefäße. Zudem unterscheidet sich
die Morphologie der sekundären Knötchen. Diese weisen eine epithelseitig gerichtete
Lymphozytenkappe und ein exzentrisches Reaktionszentrum auf. In der Tonsille dominiert
die Expression von IgM auf Zentrozyten, im Kryptepithel hingegen verteilen sich vermehrt
solche Zellen, die IgG oder IgA exprimieren (MACLENNAN 1994).
2.2.3 Histologischer und zellulärer Aufbau des Lymphknotens
Lymphknoten sind konstitutiv angelegt und stellen organisiertes lymphatisches Gewebe dar
(DELLMANN 1987). Aus ihrer bindegewebigen Kapsel entspringen kurze Septen, die als
Trabekel ins Organinnere reichen. Ihnen folgen afferente Lymphgefäße, die in das
Sinussystem des Lymphknotens übergehen. Das Sinussystem umfasst den subkapsulären
Marginalsinus, die Intermediärsinusoide und die Marksinusoide. Die Sinusoide werden von
endothelähnlichen modifizierten Retikulumzellen ausgekleidet, die zum Teil fenestriert sind
und den Austausch mit dem lymphoretikulären Gewebe möglich machen. Die Hohlräume der
Sinusoide enthalten neben einem Netzwerk aus Stromazellen Makrophagen. Am Hilus wird
die Lymphe über efferente Lymphgefäße abtransportiert. Das Innere des Lymphknotens
besteht aus einem dreidimensionalen Maschenwerk aus Retikulumzellen und Fasern.
Zwischen ihnen ordnen sich Immunzellen an, deren Verteilung die Kompartimente des
Lymphknotens bestimmt (Abb. 6). Subkapsulär liegt der B-zellhaltige Cortex, der vom T-zell-
abhängigen Paracortex umgeben ist. B-Lymphozyten sind in einem Primär- oder
Sekundärfollikel organisiert. Sekundärfollikel enthalten Keimzentren und weisen auf den
Kontakt mit Antigenen hin. Sie beinhalten eine dunkle Zone mit großen Zentroblasten, die die
kleineren Zentrozyten der hellen Zone produzieren. Die helle Zone enthält zusätzlich ein
dichtes Netzwerk aus follikulär dendritischen Zellen (FDC). Sie speichern langfristig
Antigene und präsentieren sie den B-Lymphozyten (MACLENNAN 1994). Der
33 LITERATURÜBERSICHT
Immunglobulin (Ig) -Isotyp, der von Plasmablasten exprimiert wird, ist variabel.
Lymphknotenfollikel exprimieren vorwiegend den IgG-Isotyp und weniger IgA und IgM
(MACLENNAN 1994). Die Lymphfollikel werden von einem Paracortex umgeben, der vor
allem Thymus-abhängige T-Zellen enthält und infolge dessen als T-Zellzone benannt ist. Im
bovinen Lymphknoten konzentrieren sich wenige γδ+ T-Lymphozyten entlang der Trabekel
(MACKAY u. HEIN 1989). Neben T-Lymphozyten sind Makrophagen, dendritische Zellen
und B-Lymphozyten im Paracortex enthalten. Im Zentrum des Organs befinden sich
Markstränge, die als Lymphknotenmark (Medulla) zusammengefasst werden. Die
Markstränge sind je nach Immunlage mit Plasmazellen gefüllt. Auch hier befinden sich
Makrophagen, B-Lymphozyten und dendritische Zellen (TIZARD 2004e).
Abb. 6: Schemazeichnung eines Lymphknotens; modifiziert nach DELLMANN (1987)
2.3 Lymphgewebe und Immunzellen im Respirationstrakt des Rindes
2.3.1 Verteilung von Schleimhaut-assoziiertem Lymphgewebe (MALT)
Alle Schleimhäute weisen lymphatische Einrichtungen auf, die der Antigenaufnahme dienen
und über die eine Immunantwort ausgelöst werden kann (LIEBLER-TENORIO u. PABST
2006). Diese Strukturen sind als Schleimhaut-assoziiertes Lymphgewebe (MALT) bekannt
und variieren von Spezies zu Spezies hinsichtlich Verteilung, Vorkommen, Morphologie und
LITERATURÜBERSICHT 34
Evolution. Allen MALT zugehörigen Strukturen sind morphologische Charakteristika
gemein. Sie liegen der Schleimhautoberfläche eng an und lassen sich in Kompartimente
unterteilen. Neben Follikeln aus B-Lymphozyten, follikulär dendritischen Zellen (FDC) und
Makrophagen weisen sie interfollikuläre T-Zellzonen (IFZ) auf, die hauptsächlich CD4+ und
CD8+ T-Lymphozyten beinhalten. In ihnen liegen high endothelial venules (HEV), die
spezielle Rezeptoren exprimieren und den Lymphozytenzustrom steuern. Das angrenzende
Epithel ist mit Lymphozyten infiltriert und weist häufig spezialisierte M-Zellen auf, die
ebenso wie intraepithelial lokalisierte dendritische Zellen der Antigenaufnahme dienen. Beim
Rind wurden folgende MALT-Strukturen beschrieben:
- CALT (CHODOSH et al. 1998)
- Waldeyerscher Rachenring (SCHUH u. OLIPHANT 1992)
- LTALT (NICKEL et al. 1979)
- BALT (ANDERSON et al. 1986a)
- GALT (DOUGHRI et al. 1972).
2.3.2 Verteilung, Morphologie und Charakteristika von BAL T
Organisiertes lymphatisches Gewebe in der Schleimhaut der Lunge wird als BALT
bezeichnet (BIENENSTOCK u. PEREY 1973). Nach seiner erstmaligen Beschreibung vor
etwa 100 Jahren wurde das BALT mittlerweile in der Lunge vieler Haussäuger und in der des
Menschen beschrieben (PABST u. GEHRKE 1990; BIENENSTOCK u. MCDERMOTT
2005). Mit Ausnahme von Maus, Ratte und Kaninchen ist das BALT nicht konstitutiv
angelegt (PLESCH et al. 1983; PABST u. GEHRKE 1990; HOLT 1993; TSCHERNIG u.
PABST 2000; LIEBLER-TENORIO u. PABST 2006).
Die Grundstruktur des BALT (Abb. 7) ist eingehend am Labortier beschrieben, wobei das
ausdifferenzierte BALT sämtliche morphologischen Charakteristika des MALT umfasst
(siehe Kap. 2.3.1; PLESCH et al. 1983; VAN DER BRUGGE-GAMELKOORN u. SMINIA
1985; SMINIA et al. 1989). Die B-Zellen der Follikel von Ratte und Kaninchen exprimieren
vorwiegend IgA und IgM (PLESCH et al. 1983). Parafollikulär verteilen sich viele CD4+ und
weniger CD8+ T-Lymphozyten in einem Verhältnis von 2,6:1 (BIENENSTOCK u.
MCDERMOTT 2005).
35 LITERATURÜBERSICHT
Abb. 7: Grundstruktur des BALT und Verteilung der am BALT beteiligten Zelltypen;
modifiziert nach TSCHERNIG u. PABST (2000)
Parafollikulär liegen HEVs, die den Adhäsionsfaktor VCAM-1 exprimieren und so den
selektiven Lymphozytenzustrom aus dem Blut ermöglichen (RANDALL 2010). Auch
efferente lymphatische Gefäße, die zu regionären Lymphknoten führen, liegen parafollikulär.
Ein Domebereich mit interdigitierenden Zellen grenzt an das Epithel. Letztes abgrenzbares
Kompartiment ist das spezialisierte Lymphepithel, das für das Kaninchen als zilienlos mit
infiltrierenden Lymphozyten beschrieben ist (RACZ et al. 1977). Im Gegensatz zu den
Peyerschen Platten im Darm lässt sich die Struktur des BALT nicht auf alle Spezies
übertragen. Zumindest in der Lunge von Ratte, Kaninchen, Meerschweinchen und Hühnern
ist eine beträchtliche Menge an organisiertem BALT zu beobachten (BIENENSTOCK 1985;
SMINIA et al. 1989). Die genaue Bedeutung des BALT am Immungeschehen ist bislang
unklar (TSCHERNIG u. PABST 2009).
Das BALT des Rindes ist verglichen mit dem von Kaninchen und Ratten nur geringgradig
ausgeprägt. So zeigten Untersuchungen an Lungen gesunder Kälber und Rinder variable
Mengen an BALT (ANDERSON et al. 1986a). Bei neugeborenen Kälbern ließ sich kein
BALT nachweisen. Bei älteren Kälbern (4, 8, 18 Monate) nahm die Menge an Lymphgewebe
zu und sank bei adulten, 3 Jahre alten Rinder auf das Mengenniveau der 4 Monate alten
Kälber. Das lymphatische Gewebe ließ sich mit einer Präferenz zu den kranialen
LITERATURÜBERSICHT 36
Lungenlappen in allen Regionen der gesunden Lunge nachweisen. BALT verteilte sich
entlang der luftführenden Wege. Morphologisch waren sekundäre Lymphfollikel durch ein
Keimzentrum mit Mitosefiguren, Makrophagen, dendritischen Zellen und Lymphozyten
gekennzeichnet. In der Interfollikularzone wurden die Lymphfollikel von Lymphozyten,
Plasmazellen und Makrophagen umgeben. Peripher der Lymphfollikel waren vorwiegend
CD4+ T-Lymphozyten und nur wenige CD8+ und γδ+ T-Zellen verteilt (MATHY et al.
1997). Die ultrastrukturelle Untersuchung zeigte parafollikuläre HEVs mit emigrierenden
Lymphozyten (ANDERSON et al. 1986a). Dabei ließ sich transmissionselektronen-
mikroskopisch kein spezielles Lymphepithel nachweisen.
Das BALT von Kälbern mit Enzootischer Pneumonie wich in Morphologie und Menge im
Vergleich zu gesunden 4 Monate alten Tieren ab. Im kranialen Läppchen zeigte sich ein
Anstieg an Lymphgewebe. Das BALT umgab häufig manschettenartig Bronchiolen. Bei den
kranken Kälbern konnte ein zilienloses Lymphepithel nachgewiesen werden (ANDERSON et
al. 1986a).
2.3.3 Verteilung von Immunzellen in der Lunge des Rindes (außer BALT)
In der Lunge lassen sich verschiedene interagierende Kompartimente abgrenzen, die relevant
für die Immunantwort sind (BIENENSTOCK 1984; TSCHERNIG u. PABST 2009).
Ein Kompartiment bilden die Luftwege, wobei Epithel und Lamina propria zu unterscheiden
sind. BIENENSTOCK (1984) vermutet, dass das Epithel der Luftwege ähnlich dem
Darmepithel durch intraepitheliale zytotoxische T-Zellen vor invasiven Pathogenen geschützt
ist (BIENENSTOCK 1984). Das Bronchialepithel von gesunden Kälbern zeigte in der
Untersuchung durch ALLAN und Mitarbeiter (1979) eine Markierung für IgA und IgM.
Darüber hinaus gibt es bislang keine publizierten Untersuchungsergebnisse über
intraepitheliale Zellen des Bronchialepithels des Rindes.
In der Lamina propria der Luftwege waren von der Trachea bis zu den terminalen
Bronchiolen hauptsächlich IgA+ Plasmazellen nachweisbar (ALLAN et al. 1979;
ANDERSON et al. 1986b). Diese verteilten sich überwiegend entlang der Basalmembran
(ANDERSON et al. 1986b). In abnehmender Zahl waren IgG1+, IgG2+ und IgM+
Plasmazellen vorhanden. Die Anzahl der gefundenen Plasmazellen war altersabhängig. So
konnten bei neugeborenen Kälbern keine Plasmazellen nachgewiesen werden. Bei 18 Monate
alten Kälbern waren im Vergleich zu vier und acht Monate alten Kälbern und zu drei Jahre
37 LITERATURÜBERSICHT
alten Rindern die meisten Plasmazellen zu sehen. Die Anzahl der Plasmazellen nahm mit
Verkleinerung der Luftwege ab (ANDERSON et al. 1986b). In Untersuchungen von
THOMASMEYER (2006) konnte gezeigt werden, dass beim Rind zahlreiche MHC II+
dendritische Zellen unterhalb der Basalmembran in der Lamina propria mucosae vorliegen,
die mit zunehmendem Alter der Tiere ein Netzwerk bilden.
Ein weiteres Kompartiment umfasst das alveoläre Parenchym mit Interalveolarsepten und
Alveolarlumen, wobei über die Verteilung der Leukozyten in den Interalveolarsepten beim
Rind nur wenig bekannt ist. In immunhistologischen Untersuchungen an Kälberlungen durch
ANDERSON et al. (1986b) waren im alveolären Parenchym nur selten Plasmazellen
nachweisbar. Zellen, die sich im bronchoalveolären Raum verteilen, werden durch
bronchoalveoläre Lavage (BAL) gewonnen und sind dadurch diagnostisch zugänglich.
Untersuchungen der BAL zeigten Alveolarmakrophagen, die mit 87% den Hauptanteil
bildeten. Etwa 10% der Zellen wurden als Lymphozyten und nur etwa 2% als neutrophile
Ganulozyten identifiziert (LIGGITT 1985). Bei den gewonnenen Lymphozyten handelte es
sich überwiegend um CD8+ T-Lymphozyten, die den Aktivierungsmarker CD25 exprimierten
(MCBRIDE et al. 1997).
BALT (siehe Kap. 2.3.2), intravaskulär zirkulierende Leukozyten und das periarteriale
Interstitium vervollständigen die Lungenkompartimente (PABST u. TSCHERNIG 1995;
TSCHERNIG u. PABST 2009). Im Unterschied zu Labornagern und dem Menschen ließen
sich beim Rind ultrastrukturell durch RYBICKA u. DALY (1974) in den Gefäßen der Lunge
intravaskuläre Makrophagen (PIM) nachweisen.
2.3.4 Morphologie, Funktion und für die immunhistologische Darstellung gewählte
Epitope der Immunzellen in der Lunge des Rindes
2.3.4.1 Makrophagen
Die verschiedenen Makrophagenpopulationen in der Lunge sind maßgeblich für den Erhalt
der Homeostase und die Sterilität der tiefen Atemwege verantwortlich. Makrophagen
stammen von myeloiden Vorläuferzellen ab und zirkulieren als Monozyten im Blut.
Makrophagen sind Teil des mononukleären Phagozytosesystems und finden sich in drei
Kompartimenten der Lunge wieder (Abb. 8; LOHMANN-MATTHES et al. 1994). Unter
homeostatischen Bedingungen und während einer Entzündung werden sie durch Monozyten
LITERATURÜBERSICHT 38
erneuert. Aufgrund unterschiedlicher Funktion, Lokalisation (in Alveolen, Interstitium und
Kapillaren) und Morphologie bilden Makrophagen eine heterogene Zellpopulation.
Alveolarmakrophagen und intravaskuläre Makrophagen (PIM) phagozytieren partikuläres
Material und Mikroorganismen. Aufgenommenes Antigen wird intrazellulär in Membran-
gebundenen Phagolysosomen enzymatisch verdaut und gebunden an MHC I oder MHC II auf
der Oberfläche präsentiert. Während der Entzündung sezernieren Alveolarmakrophagen und
PIMs mikrobizide Mediatoren (ROS) und proinflammatorische Zytokine (TNF-α, IL-1β, IL-
8, TGF-β und TGF-α), die Gewebeschäden hervorrufen (CASWELL u. WILLIAMS 2007).
AEC I
AEC II
1
2
3
Monozyten
Endothel
Monozyt
AEC IAEC I
AEC II
1
2
3
Monozyten
Endothel
Monozyt
AEC I
Abb. 8: Mononukleäres Phagozytosesystem in der Lunge von Kälbern,
1-Alveolarmakrophage, 2–interstitieller Makrophage, 3–intravaskulärer Makrophage;
modifiziert nach STAUB (1994)
Unter homeostatischen Bedingungen setzen Alveolarmakrophagen nur geringe
Zytokinmengen frei, sind schwach antigenpräsentierend und supprimieren die Immunantwort
gegenüber unbedeutendem Antigen (HOLT et al. 1993; LAMBRECHT 2006; CASWELL u.
WILLIAMS 2007).
Interstitielle Makrophagen befinden sich zwischen Endothel und Alveolarepithel. Im
Vergleich zu Alveolarmakrophagen sind sie verstärkt an der Induktion und dem Erhalt einer
Immunantwort beteiligt. Sie sind durch eine vermehrte Expression von MHC II
gekennzeichnet und sezernieren IL-1 und IL-6 (STEINMULLER et al. 2000; CASWELL u.
WILLIAMS 2007). Wahrscheinlich begrenzen sie die Entzündung, beteiligen sich an der
Antigenpräsentation und verursachen Fibrose (WARNER u. BRAIN 1990; LOHMANN-
39 LITERATURÜBERSICHT
MATTHES et al. 1994; TSCHERNIG u. PABST 2009). Morphologische Unterschiede der
Makrophagen in der Lunge lassen sich ultrastrukturell beobachten. Kennzeichen der
Alveolarmakrophagen sind Pseudopodien (LIGGITT 1985). Alveolarmakrophagen besitzen
im naiven Zustand einen großen Zellkern, der von ausgedehntem Zytoplasma umgeben ist. Im
Zytoplasma befinden sich hoch entwickelte Golgikomplexe und kleine primäre Lysosomen,
die saure Hydrolasen und Lysozyme enthalten. PIMs wurden erstmals beim Kalb identifiziert,
existieren aber ebenso bei Schwein, Pferd und Ziege (RYBICKA u. DALY 1974;
SCHNEBERGER et al. 2011). PIMs entsprechen morphologisch reifen großen Makrophagen,
die mit angrenzenden Endothelzellen Adhäsionskomplexe bilden und in der Kapillare
residieren. Das elektronendurchlässige Zytoplasma beherbergt zahlreiche Organellen, die
weiter entwickelt sind, als die der Monozyten (LONGWORTH 1997). Für die
immunhistologische Darstellung von bovinen Alveolarmakrophagen wurde der monoklonale
Antikörper EBM11 verwendet (BIELEFELDT-OHMANN et al. 1988). Der Antikörper
markiert ein Glycoprotein mit einer Masse von 110 kDa, das als CD68 Molekül bezeichnet
wird. CD68 ist assoziiert mit zytoplasmatischen Granula von Makrophagen, myeloiden Zellen
und bestimmten neoplastischen, mononukleären Zellen (ACKERMANN et al. 1994).
2.3.4.2 Neutrophile Granulozyten
Neutrophile Granulozyten (PMN) stammen von denselben Vorläuferzellen ab wie
Monozyten. Dies macht die Zuordnung in das mononukleäre Phagozytosesystem möglich und
erklärt die Kooperation beider Zellpopulationen gegenüber invasiven Pathogenen
(SILVA 2011). PMNs zirkulieren als ausgereifte Zellen für 6 bis 12 Stunden im Blut. Dabei
sind PMNs, die in das Gewebe rekrutiert wurden, phagozytotisch aktiver als im Blut
zirkulierende PMNs (SILVA 2011). Sie sind Teil der natürlichen Immunabwehr und werden
in Folge stimulatorisch wirksamer Zytokine, wie IL-8, schnell rekrutiert (BAGGIOLINI et al.
1989). Im Gewebe sezernieren stimulierte PMNs TNF-α und IL-1 und entlassen mikrobizide
Sauerstoffradikale, die intrazellulär in Phagolysosomen oder im Extrazellularraum wirken
(TIZARD 2004c). Der Prozess wird als respiratory burst bezeichnet und durch das NADPH
Multiproteinsystem katalysiert (TIZARD 2004c). Die mikrobiziden Sauerstoffradikale sind an
der Elimination von invasiven Pathogenen beteiligt, rufen aber ebenso Schäden an
körpereigenen Zellen hervor.
LITERATURÜBERSICHT 40
PMNs sind durch charakteristische intrazytoplasmatische Granula gekennzeichnet, wobei je
nach Inhalt zwischen azurophilen und spezifischen Granula unterschieden wird (CHEVILLE
1983). Enthalten sind unter anderem Laktoferrine, die Eisen binden und damit unzugänglich
für den bakteriellen Stoffwechsel machen und proteolytische Enzyme, die dem Abbau von
Kollagen und Elastin dienen. Die proteolytischen Enzyme wirken zudem gewebeschädigend
(BORREGAARD 2010). Als Besonderheit fehlt den bovinen neutrophilen Granulozyten das
Lysozym, das die glykosidische Bindung von bakteriellem Peptidoglykan zerstört (RAUSCH
u. MOORE 1975; ELLISON u. GIEHL 1991). Zudem existiert beim Rind ein zusätzlicher
tertiärer Granulatyp, der sauerstoffunabhängige bakterizide Substanzen enthält (GENNARO
et al. 1983). Der Inhalt der peroxidasepositiven und peroxidasenegativen Granula wird in den
Extrazellularraum oder in das Phagolysosom abgegeben (SORENSEN et al. 2001). PMN und
Alveolarmakrophagen ergänzen einander in der Abwehr von Pathogenen. In vivo
Untersuchungen zeigten die Phagozytose von freien intrazellulären Erregern, die wiederum in
Alveolarmakrophagen gelangten (LASKAY et al. 2008). Durch die Sekretion von TNF-α,
IFN-γ und IL-8 beeinflussen sie Makrophagen, Lymphozyten und sich selbst.
2.3.4.3 Dendritische Zellen
Dendritische Zellen (DC, gr. dendron–Baum) bilden eine heterogene Zellpopulation und
gehören dem mononukleären Phagozytosesystem an. Dendritische Zellen sind professionelle
antigenpräsentierende Zellen, die eine spezifische Immunantwort initiieren. Im Vergleich zu
B-Lymphozyten und Makrophagen sind sie die potentesten Immunstimulatoren. Dabei genügt
eine DC um bis zu 1000 T-Zellen zu stimulieren (VAN VOORHIS et al. 1983; REDDY et al.
1997; BANCHEREAU u. STEINMAN 1998; GUERMONPREZ et al. 2002). Naive
dendritische Zellen finden sich im Respirationstrakt an Orten, wo die Antigenbelastung erhöht
ist und präsentieren sich dort als Wächterzellen. Sie bilden ein dichtes Netzwerk im Epithel
der Luftwege und in den Alveolen (TIZARD 2004e). Naive DC kennzeichnen sich durch eine
hohe Phagozytosefähigkeit, die im Zuge der Reifung verloren geht. DC nehmen Antigene
phagozytotisch, makropinozytotisch und pinozytotisch auf (FLORES-ROMO 2001). Neben
Mikroben und geschädigtem Gewebe veranlassen auch inflammatorische Stimuli, wie TNFα
oder IL-1, die Reifung DC (VINEY 2001).
Reife DC präsentieren viele MHC II Moleküle auf ihrer Oberfläche (FLORES-ROMO 2001;
BAROIS et al. 2002). MHC II Moleküle, sind heterodimere integrale Membranproteine, die
41 LITERATURÜBERSICHT
der Antigenpräsentation von extrazellulären Peptiden dienen. Sie werden auf der Oberfläche
von professionell antigenpräsentierenden Zellen (APC) exprimiert und von CD4+ T-
Lymphozyten erkannt (GROMME u. NEEFJES 2002). Zur Darstellung MHC II+ Zellen in
der vorliegenden Untersuchung erfolgte die Anwendung des monoklonalen Antikörpers
IL-A21, der mit einer monomorphen Determinante des bovinen MHC II Moleküls reagiert
(DELVERDIER et al. 1996). Dieses Molekül ist auf einer Vielzahl der Körperzellen
vorhanden, sodass sIg+ B-Lymphozyten, Monozyten, aktivierte bovine CD4+, CD8+ und γδ+
T-Lymphozyten detektiert werden können (TAYLOR et al. 1993).
Als Besonderheit können DC ebenso wie Makrophagen exogenes Antigen über MHC I
Moleküle präsentieren und aktivieren so zytotoxische T-Zellen (GUERMONPREZ et al.
2002; BRODE u. MACARY 2004). Diese Kreuzpräsentation ist wichtig für die Elimination
von Erregern, die die DC nicht infizieren. Das MHC I Molekül ist dabei dem MHC II
Molekül ähnlich und sichert die Antigenprozessierung von antigenen Peptiden, die sich im
Zytoplasma der Wirtszelle befinden (ALBERT et al. 1998). Es wird auf der Zelloberfläche
aller kernhaltigen Zellen exprimiert und von zytotoxischen CD8+ T-Lymphozyten erkannt
(GROMME u. NEEFJES 2002).
Als weiteres Epitop sind CD1 Moleküle auf DC zu finden. CD1 Moleküle sind funktionell
den MHC Molekülen ähnlich, wobei sie im Unterschied zu MHC nicht Proteine sondern
Lipide präsentieren (GELIN et al. 2009). Zur Darstellung von CD1b+ DC wurde in der
vorliegenden Arbeit der monoklonale Antikörperklon CC20 verwendet. Dieser reagiert mit
dem bovinen Zelloberflächenantigen CD1w2. Hierbei handelt es sich um ein Glycoprotein,
das auf Thymozyten und einer Subpopulation von Zellen mit dendritischer Morphologie
exprimiert wird (HOWARD et al. 1993).
Reife DC verlassen die Lungen und migrieren über afferente lymphatische Gefäße in den
Paracortex der regionären Lymphknoten, wo sie mit naiven T-Zellen interagieren und eine
antigenspezifische T-Zellantwort hervorrufen können (NICOD u. COCHAND 2001). Sie
polarisieren über Zytokine und über die Expression von costimulatorischen Rezeptoren die
spezifische Immunantwort in Richtung T1-Helferzellen (Th1) oder T2-Helferzellen (Th2)
(MALDONADO-LOPEZ u. MOSER 2001; GOGOLAK et al. 2003).
LITERATURÜBERSICHT 42
2.3.4.4 T-Lymphozyten
Zwei spezialisierte Zellpopulationen (T- und B-Lymphozyten) schützen den Organismus vor
intra- und extrazellulären Pathogenen (GROMME u. NEEFJES 2002). Beide
Zellpopulationen stammen aus dem Knochenmark, wobei T-Lymphozyten zusätzlich im
Thymus reifen. Lymphozyten sind morphologisch uniform, besitzen einen großen Zellkern
und einen dünnen Zytoplasmasaum. Kennzeichnend für T-Lymphozyten ist der T-
Zellrezeptor (TCR) mit Hilfe dessen Antigene erkannt werden. Nach der Antigenerkennung
folgt die klonale Expansion der angesprochenen Zellen zu kurzlebigen Effektorzellen und
langlebigen Gedächtniszellen. Die T-Lymphozyten lassen sich aufgrund des Aufbaus des
TCR in αβ+ und in γδ+ T-Lymphozyten unterteilen.
αβ+ T-Lymphozyten
Konventionelle αβ+ T-Lymphozyten exprimieren zusätzlich einen CD4+ oder CD8+
Corezeptor. Diese steigern die Signaltransduktion des TCR um das 100fache (TIZARD
2004a). CD4+ T-Lymphozyten werden als T-Helferzellen bezeichnet. Sie sezernieren
verschiedene Zytokine. Th1-Zellen sezernieren IL-2, IL-4, IL-10 und IFNγ und vermitteln
eine zelluläre Immunantwort. Neben den kurzlebigen Effektorzellen, die Makrophagen
aktivieren und eine Resistenz gegenüber intrazellulären Bakterien generieren, entstehen
langlebige Gedächtniszellen. Th2-Zellen sezernieren IL-4, IL-5, IL-10 und IL-13 und
vermitteln eine humorale Immunantwort (TIZARD 2004a). Der in der Untersuchung
verwendete monoklonale Antikörper IL-A11 stellt CD 4+ T-Helferzellen dar. Mit dem
Antikörper werden Oberflächendeterminanten mit einer Masse von 52 und 55 kDa des
bovinen CD4 detektiert, wobei das Molekül in seiner Verteilung, Molekularmasse und
Funktion dem humanen CD4 entspricht (BALDWIN et al. 1986; TEALE et al. 1986). Beim
Rind wird CD4 nicht auf Makrophagen coexprimiert (TIZARD 2004a).
Neben T-Helferzellen, die CD4 exprimieren, existieren zytotoxische CD8+ T-Lymphozyten.
Diese sind wirksam gegenüber intrazellulären Erregern und werden typischerweise durch
Antigene stimuliert, die über MHC I präsentiert werden (ALBERT et al. 1998). Unabhängig
davon können CD8+ T-Lymphozyten ebenfalls durch extrazelluläre Pathogene stimuliert
werden (OYKHMAN u. MODY 2010). Beispielsweise werden CD8+ T-Zellen über T-
Zellwachstumsfaktoren aktiviert und gegen extrazelluläre Candida albicans wirksam (BENO
43 LITERATURÜBERSICHT
et al. 1995). Durch die Stimulation entstehen CD8+ Effektorzellen, die über IFN-γ, den
Fas/FasL-Pathway oder die granuläre Exozytose von Granulysin oder Perforin zytotoxisch
wirksam sind (TIZARD 2004b). Granulysin beispielsweise erhöht die Membranpermeabilität
der Zelle, sodass Flüssigkeit in das Zytoplasma einfließt und die Zelle zerstört (SHI et al.
2005; OYKHMAN u. MODY 2010). Perforin zerstört gleichfalls die Wirtszellmembran und
bewirkt den Einstrom von schädigendem Calcium (KEEFE et al. 2005). Das IFN-γ der CD8+
T-Zellen nimmt zumeist indirekt Einfluss auf den Stoffwechsel des Erregers. Es katalysiert
die Produktion von Stickstoffmonoxid (NO), verstärkt die Wirkung von professionellen
antigenpräsentierenden Zellen oder entzieht dem Erreger essentielles L-Tryptophan
(ROTTENBERG et al. 2002).
In der vorliegenden Untersuchung wurde der monoklonale Antikörper CC63 verwendet, um
CD8+ T-Lymphozyten darzustellen. Dabei markiert der Antikörper die homodimere (68 kDa)
und heterodimere (64 kDa) Form des bovinen CD8-Moleküls (MACHUGH u. SOPP 1991).
γδ+ T-Lymphozyten
T-Lymphozyten mit γδ+ TCR unterliegen einer spezies- und altersabhängigen Diversität.
Kälber weisen erhöhte Zellzahlen auf, wobei der Anteil der γδ+ T-Lymphozyten an
mononukleären Zellen des peripheren Bluts bei drei Monate alten Kälbern bei 30% liegt
(MACKAY u. HEIN 1989; CLEVERS et al. 1990; WILSON et al. 1996). Phänotypisch
lassen sich γδ+ T-Lymphozyten über das Workshop Cluster (WC) 1 Molekül differenzieren,
das einzigartig bei Rind und Schwein verbreitet ist. Es handelt sich um ein transmembranes
Glykoprotein, das der scavanger receptor cysteine rich (SRCR) Familie angehört
(FREEMAN et al. 1990). Da die Phosphorylierung des WC1 Moleküls notwendig ist, um die
Proliferation von WC1+ γδ+ T-Zellen auszulösen, fungiert es möglicherweise als
Costimulator ähnlich dem CD4 oder CD8 (WANG et al. 2009). WC1+ γδ+ T-Zellen sind
regulatorisch aktiv (RHODES et al. 2001). Das WC1 Molekül kommt in zwei Isoformen vor,
sodass WC1.1 und WC1.2 unterschieden werden. Vorwiegend WC1.1+ Zellen bilden IFN-γ
und stimulieren die Th1-Antwort (ROGERS et al. 2005; PRICE et al. 2007).
Im Unterschied zu konventionellen T-Zellen mit αβ+ T-Zellrezeptor sind γδ+ T-Zellen nicht
MHC-restringiert, sodass Zytokine, Protozoen und Bakterien ihre Proliferation direkt
stimulieren (WELSH et al. 2002; LAHMERS et al. 2005; PRICE et al. 2007). γδ+ T-
Lymphozyten sind entsprechend den zytotoxischen CD8+ T-Zellen über Perforin oder
LITERATURÜBERSICHT 44
Granulysin zytolytisch wirksam und stellen durch die Sekretion von IFN-γ den Link zur
adaptiven Immunabwehr her (CICCONE et al. 1988; PRICE et al. 2007). Die von ihnen
sezernierten Zytokine aktivieren Makrophagen, neutrophile Granulozyten und Lymphozyten
(BLUMERMAN et al. 2007; JUTILA et al. 2008). Zur immunhistologischen Darstellung γδ+
T-Lymphozyten wurde in der vorliegenden Unteruchung der monoklonale Antikörper IL-A29
verwendet. Dieser markiert Oberflächenstrukturen boviner Zellen mit einer Molekülmasse
von 215/300 kDa, das als WC1 Molekül definiert ist. Durch den Antikörper wird ein T-
Zellsubtyp mit γδ+ TCR und CD3+ Corezeptor markiert. Bovine γδ+ T-Lymphozyten sind
meist negativ für CD4 und CD8 (CLEVERS et al. 1990).
2.3.4.5 B-Lymphozyten, Plasmazellen und Immunglobulin
B-Lymphozyten sind spezialisierte Zellen, die vielseitig die Immunantwort beeinflussen.
Kennzeichnend für B-Lymphozyten ist die Expression des B-Zellrezeptors (BCR) mit Hilfe
dessen Antigene erkannt werden (Abb. 9). Zudem können B-Lymphozyten Antigene über
MHC II präsentieren (LANZAVECCHIA u. BOVE 1985; LANZAVECCHIA 2007). Nach
der Antigenerkennung folgt die klonale Expansion der angesprochenen Zellen in kurzlebige
Effektorzellen und langlebige Gedächtniszellen. Während der Reifung von B-Lymphozyten
zu Plasmazellen wird der BCR in ein sekretorisches Immunglobulin umgewandelt
(MCDERMOTT et al. 1982).
Abb. 9: Schematische Darstellung der B-Zellreifung und B-Zellaktivierung; modifiziert nach
TEDDER et al. (1984); Ig-Immunglobulin
Eine Plasmazelle ist ultrastrukturell durch Chromatinaggregate gekennzeichnet, die entlang
der Zellkernmembran aufgereiht sind. Ihr Zytoplasma ist mit rauem endoplasmatischen
Retikulum (rER) und immunglobulinhaltigen Zisternen gefüllt (SACCO 2009). Ihr Isotyp
Stammzelle Prä-B-Zelle unreife reife aktivierte Plasmazelle B-Zelle B-Zelle B-Zelle
45 LITERATURÜBERSICHT
wird über Zytokine umliegender CD4+ T-Zellen bestimmt. Nach ihrer Aktivierung
sezernieren Plasmazellen einen der fünf Immunglobulinisotypen. IgA stellt dabei die primäre
Barriere der Schleimhaut dar. Es wird als Dimer von Plasmazellen abgegeben und mit Hilfe
des polymeren Immunglobulinrezeptors (pIgR) durch das Epithel transportiert (LAMM 1997;
TIZARD 2004). Im Lumen verhindert es durch die Bildung von Immunkomplexen, die
Adhärenz des Erregers an das Epithel (immune exclusion; MCDERMOTT et al. 1982;
BRANDTZAEG 2009). IgM wird initial, während der Stimulation des Immunsystems
gebildet. Verglichen mit dem IgA binden große pentamere IgM-Moleküle nur instabil an den
pIgR (BRANDTZAEG 1975). IgG ist unterdessen proinflammatorisch wirksam, indem es
Leukozyten und Komplement aktiviert (LAMM 1997). IgG dominiert im Serum und wird nur
von einer kleinen Population der in der Schleimhaut lokalisierten Plasmazellen gebildet. Ein
selektiver Transport durch das Epithel fehlt und es verteilt sich durch Diffusion. IgG
dominiert in den peripheren Luftwegen und vermittelt die Phagozytose von Bakterien.
In der vorliegenden Untersuchung wurden mit Hilfe folgender Antikörper B-Lymphozyten,
Plasmazellen und Antikörper detektiert. Der monoklonale Antikörper IL-A71 richtet sich
spezifisch gegen bovines IgA. Der Antikörper reagiert mit einem Protein (61-63 kDa) auf der
schweren alpha-Kette des Immunglobulins und auf der sekretorischen Komponente des
Isotyps. Der monoklonale Antikörper IL-A30 bindet spezifisch an ein Epitop der zellulären
Oberfläche boviner IgM+ Lymphozyten. Der monoklonale Antikörper IL-A60 (Maus anti-
bovines IgG1) detektiert Proteine mit der Masse von 55-59 kDa und richtet sich gegen
bovines IgG1. Der Nachweis der spezifischen Bindung aller drei Antikörper wurde mittels
ELISA überprüft (NAESSENS et al. 1988; WILLIAMS et al. 1990).
Mit dem monoklonalen Antikörper CC56 werden B-Lymphozyten in den Lymphfollikeln
dargestellt. Der Antikörper detektiert ein Epitop mit demselben Molekulargewicht (180 kDa),
wie das WC3 Molekül (MUKWEDEYA et al. 1993). MUKWEDEYA (1993) vermutet einen
Bezug zum bovinen WC 3 Molekül, das auf Ig+ B-Lymphozyten präsent ist. Die Verteilung
und die Größe des WC 3 Antigens ähnelt dem humanen CD21, dem Komplementrezeptor 2,
der auf reifen und aktivierten B-Zellen exprimiert wird (NAESSENS u. HOWARD 1991;
MUKWEDEYA et al. 1993). Mit dem Antikörper werden B-Zellareale von Lymphknoten
und Tonsille markiert. Zusätzlich reagieren Zellen mit dendritischer Morphologie. Durch den
LITERATURÜBERSICHT 46
Antikörper werden keine boCD2+ T-Zellen, boWC1+ T-Zellen, Makrophagen, Monozyten
oder Granulozyten markiert.
2.3.4.6 Interleukin-2 Rezeptor+ Zellen
Der IL-2 Rezeptor ist ein Multimer aus CD25 (IL-Rα), CD122 (IL-2Rβ) und CD132 (IL-
2Rγ). Wichtig für die Affinitätsbindung des IL-2 an den Rezeptor ist der heterodimere
Komplex aus α und β Kette (NAESSENS et al. 1988; NAESSENS et al. 1992). IL-2 wirkt
unter anderem autokrin und wird hauptsächlich von CD4+ T-Helferzellen produziert.
Bei Mensch und Maus wird CD25 im Unterschied zu unreifen Thymozyten nur von wenigen
ruhenden CD4+ und CD8+ T-Zellen mit Gedächtnisphänotyp exprimiert (TAGA et al. 1991).
Der Rezeptor wird weiterhin von NK-Zellen, B-Zellen und Makrophagen exprimiert
(GAFFEN 2001). Murine CD25+ B-Lymphozyten gelten als aktiviert, funktionell ausgereift
und migratorisch aktiv (AMU et al. 2010). Die Stimulation des TCR oder BCR auf der
Oberfläche reifer Lymphozyten bewirkt eine temporär gesteigerte Expression des IL-2
Rezeptors (NELSON u. WILLERFORD 1998). Der Aktivierung des IL-2 Rezeptors folgt
eine Kaskade an Signalen, die die Immunfunktionen modulieren. Es fördert das T-
Zellwachstum und sichert das Überleben der Zelle. Die Bedeutung des IL-2 für die
Elimination des Pathogens ist abhängig davon, wie wirkungsvoll das Antigen die angeborene
Immunabwehr angeregt hat (BACHMANN u. OXENIUS 2007). Das Interleukin-2 Signal
beeinflusst besonders die CD8+ T-Zelldynamik und polarisiert entweder in Richtung
kurzlebige Effektorzellen oder langlebige Gedächtniszellen (COX et al. 2011). Auch wenn
das Interleukin-2 entbehrlich für die Initiation der frühen Immunantwort ist, so fördert es das
Überleben, die Differenzierung und die Bildung von Gedächtniszellen (BACHMANN u.
OXENIUS 2007).
In der vorliegenden Untersuchung wurde der monoklonale Antikörper CACT116A verwendet
um IL-2 Rezeptor+ Zellen zu markieren. Der Antikörper reagiert mit der alpha Untereinheit
des Interleukin-2 Rezeptors, der dem CD25 entspricht. Dabei ist das Vorkommen des IL-2
Rezeptors nicht auf die T-Zelllinie beschränkt, sondern erstreckt sich auf stimulierte T-
Lymphozyten, B-Lymphozyten und Monozyten (WAHL et al. 1987).
47 MATERIAL UND METHODEN
3 MATERIAL UND METHODEN
3.1 Versuchsdesign
Versuchstiere
Am Friedrich-Loeffler Institut am Standort Jena wurde ein respiratorisches Infektionsmodell
zur Untersuchung der Infektion mit Chlamydia (C.) psittaci in der Lunge von Kälbern
etabliert. Der Tierversuch wurde vom Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und
Verbraucherschutz (TLLV) unter der Registrierungsnummer: 04-002/07 und dem Thema:
„Infektionsversuch mit Chlamydophila (Cp.) psittaci beim Rind“ genehmigt. In den Versuch
wurden 42 männliche Holstein-Friesian Kälber aus konventioneller Haltung einbezogen, in
deren Herkunftsbetrieb keine Krankheiten aufgetreten waren, die mit Chlamydien zu
assoziieren sind. Die Tiere wurden in Gruppen aufgeteilt. Im Alter von fünf bis neun Wochen
erhielten 21 Kälber ein Inokulum, das C. psittaci enthielt und 21 Kälber ein steriles Inokulum.
Das Inokulum wurde einmalig an acht definierten Lokalisationen des Bronchialbaums
(Abb. 10) per Bronchoskop abgesetzt (OSTERMANN et al. 2010). Nach der Inokulation
wurden die Versuchstiere unter Einhaltung des Arbeitsschutzes täglich untersucht. Neben der
allgemeinen klinischen Untersuchung, erfolgte die Untersuchung des Herz-Kreislaufsystems
und des Respirationstrakts.
Inokulum
1,5 ml
1 ml
0,5 ml
Abb. 10: Inokulationsstellen in der
Lunge und Inokulationsmengen,
modifiziert nach OSTERMANN et al.
(2010), Lunge des Rindes
Dorsalansicht; modifiziert nach
NICKEL et al. (1979)
MATERIAL UND METHODEN 48
Die 42 Kälber des Tierversuchs erhielten ein Inokulum mit unterschiedlicher
Zusammensetzung:
- 21 Kälber erhielten 6 ml SPGA1-Nährmedium und BGM-Zellen, das lebende
C. psittaci mit einem Titer von 108 Einschluss-bildenden Einheiten (EBE) enthielt.
Der verwendete Stamm DC15 wurde aus einem abortierten Rinderfetus isoliert.
- 21 Kälber dienten als Negativkontrollen. Ihnen wurde ein steriles Inokulum aus
SPGA-Nährmedium und BGM-Zellen eingegeben.
Sektion
Jeweils drei Kälber, die das sterile und drei Kälber, die das erregerhaltige Inokulum erhalten
hatten, wurden im Anschluss an die Inokulation (pi) an den Tagen 2, 3, 4, 7, 10, 14 und 35/37
seziert. Vor der Sektion wurden die Kälber in tiefe Narkose2 gelegt und so eröffnet, dass
Trachea und Oesophagus abgeklemmt werden konnten. Dies verhinderte die Kontamination
der Lunge durch Aspiration. Die Tiere wurden anschließend unter Blutentzug getötet und
seziert. Befunde an der Lunge und am Tierkörper wurden dokumentiert (LAMBERTZ 2011).
Probenentnahme
Zahlreiche Proben wurden aus der Lunge und aus anderen Organsystemen entnommen und
für die histologische, immunhistologische, elektronenmikroskopische, mikrobiologische und
molekularbiologische Untersuchung vorbereitet (LAMBERTZ 2011).
3.2 Eigene Untersuchungen
3.2.1 Selektion der Versuchstiere
Von den 21 Kontrollkälbern wurden sechs Kälber für die eigenen Untersuchungen
ausgewählt. Berücksichtigt wurden hierbei je ein Kalb für alle Zeitpunkte nach Inokulation
mit Ausnahme von Tag 10 pi. Ein zusätzliches Kalb (Tier Nr. 7) wurde verwendet, da eine
Lungenprobe nicht zu bearbeiten war. Alle 21 mit C. psittaci inokulierten Kälber wurden in
die Untersuchung einbezogen. Die laufenden Tiernummern, Rasse, Geschlecht, Alter bei
Inokulation, Alter bei Sektion, Zeitpunkt der Sektion und der Versuchszeitraum sind in Tab. 2
zusammengefasst. 1 eigene Herstellung, siehe Anhang 2 i.v. 90mg/kg Pentobarbital Release®, WDT, Garbsen, Deutschland
49 MATERIAL UND METHODEN
Tab. 2: Liste der Kontrollkälber und der mit C. psittaci inokulierten Kälber von denen das
Untersuchungsmaterial stammte
Tier- nummer
Rasse Geschl. Alter bei
Inokulation (d)
Sektion dpi
Alter bei Sektion
(d)
Versuchs-zeitraum
Kon
trol
lkäl
ber
1 HF SB m. 43 2 45 04 - 05.2010 2 HF SB m. 42 3 45 01 - 02.2010 3 HF SB m. 52 4 56 04 - 05.2010 4 HF SB m. 49 7 56 01 - 03.2010 5 HF SB m. 54 14 68 01 - 03.2010 6 HF SB m. 57 35 92 01 - 03.2010 7 HF SB m. 47 7 55 04 - 05.2010
mit
C. p
sitta
ci in
okul
iert
e K
älbe
r
8 HF SB m. 42 2 44 08 - 10.2009 9 HF SB m. 50 2 52 08 - 10.2009 10 HF SB m. 46 2 48 02 - 04.2009 11 HF SB m. 53 3 56 08 - 10.2009 12 HF SB m. 50 3 53 08 - 10.2009 13 HF SB m. 44 3 47 02 - 04.2009 14 HF SB m. 39 4 53 08 - 10.2009 15 HF SB m. 52 4 56 08 - 10.2009 16 HF SB m. 47 4 51 02 - 04.2009 17 HF SB m. 54 7 61 08 - 10.2009 18 HF SB m. 45 7 52 08 - 10.2009 19 HF SB m. 52 7 59 02 - 04.2009 20 HF SB m. 49 10 59 08 - 10.2009 21 HF SB m. 48 10 58 08 - 10.2009 22 HF SB m. 47 10 57 02 - 04.2009 23 HF SB m. 50 14 64 08 - 10.2009 24 HF SB m. 53 14 67 02 - 04.2009 25 HF SB m. 54 14 68 02 - 04.2009 26 HF SB m. 51 35 86 08 - 10.2009 27 HF SB m. 50 37 87 08 - 10.2009 28 HF SB m. 51 37 88 08 - 10.2009
Geschl.-Geschlecht, HF–Holstein Friesian, SB–Schwarz-Bunte, m–männlich; d–Tage; dpi–Tage nach der Inokulation,
3.2.2 Asservieren des Untersuchungsmaterials
Die Proben, die für die histologische und immunhistologische Untersuchung bestimmt waren,
wurden während der Sektion schockgefroren. Dazu wurde ein Gefäß mit 2-Methylbutan3 zur
Hälfte gefüllt und mit flüssigem Stickstoff auf -70°C gekühlt. Die Proben wurden unmittelbar
3 Fa. Fluka Chemie GmbH, Buchs, Schweiz
MATERIAL UND METHODEN 50
nach der Entnahme für etwa 60 Sekunden mit einer Pinzette in das kalte Isopentan
eingetaucht. Die gefrorenen Proben wurden in Aluminiumfolie verpackt und bis zur weiteren
Behandlung bei -80°C gelagert. Gewebeproben, die für die elektronenmikroskopische
Präparation bestimmt waren, wurden auf eine Größe von 1-2 mm³ zugeschnitten und in
2,5%igem Glutaraldehyd in 0,1 Mol Kakodylatpuffer4 asserviert. Diese Proben wurden bei
4°C gelagert.
3.2.3 Selektion des Untersuchungsmaterials
3.2.3.1 Histologische und immunhistologische Untersuchung der Kontrolltiere
Aus der Lunge jedes Kontrolltieres wurden zehn Lungenproben (Abb. 11) in die
Untersuchung einbezogen. Die Lungenprobe a eines Kalbes (Tier Nr. 4) ließ sich am
Gefriermikrotom nicht bearbeiten, als Ersatz diente die entsprechende Probe eines anderen
Kalbes (Tier Nr. 7). Neben den Lungenproben wurden die Tonsilla pharyngea, der Nl.
mediastinalis und die Trachea für die Untersuchung ausgewählt.
Abb. 11: Probenentnahmeschema der Kontrollkälber, Lunge Rind Dorsalansicht; modifiziert
nach NICKEL et al. (1979)
4 eigene Herstellung, siehe Anhang
a – Lobus cranialis sinister, pars cranialis
b – Lobus cranialis sinister, pars caudalis
c1 – Lobus caudalis sinister, caudal
c2 – Lobus caudalis sinister, cranial
d – Lobus cranialis dexter, pars cranialis
e – Lobus cranialis dexter, pars caudalis
f – Lobus medius
g1 – Lobus caudalis dexter, caudal
g2 – Lobus caudalis dexter, cranial
51 MATERIAL UND METHODEN
3.2.3.2 Histologische und immunhistologische Untersuchung bei den mit C. psittaci
inokulierten Kälbern
Anhand der makroskopischen Befunde wurden drei Lungenlokalisationen für die
Untersuchung ausgewählt (Abb. 12). Die Proben stammten aus Lungenlappen, die im akuten
Stadium der Entzündung hochgradig verändert waren. Die Proben wurden aus der pars
caudalis des linken (b) oder rechten (e) Lobus cranialis, aus dem linken (c1) oder rechten (g1)
Lobus caudalis und dem Lobus accessorius (h) entnommen. Dabei wurde die Lungenseite
berücksichtigt, die stärkere Veränderungen zeigte (Tab. 3). War makroskopisch kein
Unterschied zwischen beiden Seiten erkennbar, wurde die Probe der linken Lunge gewählt.
Zusätzlich wurden Tonsilla pharyngea und Nl. mediastinalis untersucht.
Abb. 12: links: Verteilung der Lungenläsionen (durch gestrichelte Linien dargestellt,
beispielhaft bei Tier Nr. 9 am Tag 2 pi); modifiziert nach LAMBERTZ (2011); rechts:
Probenentnahmeschema der Lunge für die mit C. psittaci inokulierten Kälber; modifiziert
nach NICKEL et al. (1979)
b – Lobus cranialis
sinister, pars caudalis
c1 – Lobus caudalis
sinister, caudal
e – Lobus cranialis
dexter pars caudalis
g1 – Lobus caudalis
dexter, caudal
h – Lobus accessorius
MATERIAL UND METHODEN 52
Tab. 3: Entnahmestellen der Lungenproben für die immunhistologische Untersuchung bei den
mit C. psittaci inokulierten Kälbern
Tiernr.
Entnahmestellen Lobus cranialis
sinister, pars caudalis
Lobus cranialis dexter,
pars caudalis
Lobus caudalis sinister, caudal
Lobus caudalis dexter, caudal
Lobus accessorius
8 x x x 9 x x x 10 x x x 11 x x x 12 x x x 13 x x x 14 x x x 15 x x x 16 x x x 17 x x x 18 x x x 19 x x x 20 x x x 21 x x x 22 x x x 23 x x x 24 x x x 25 x x x 26 x x x 27 x x x 28 x x x
3.2.3.3 Transmissionselektronenmikroskopische Untersuchung
Von jedem mit C. psittaci inokulierten Tier der Tage 2-10 pi wurde eine Lungenlokalisation
für die Einbettung in Kunstharz ausgewählt (Tab. 4). Von den in Glutaraldehyd fixierten
Proben wurden jeweils 4 bis 5 Gewebeblöckchen je Lungenprobe eingebettet. Weiterhin
wurde Gewebe aus Paraffinblöcken von zwei Kälbern der Tage 2 und 3 pi und je einem Kalb
der Tage 4 und 7 pi entnommen, in denen immunhistologisch Chlamydiaceae-LPS
nachgewiesen worden war (LAMBERTZ 2011). Diese sind nicht optimal fixiert, können aber
für die ultrastrukturelle Untersuchung verwendet werden. Für die Entnahme des
Paraffinmaterials wurden die Paraffinschnitte, in denen der Chlamydiennachweis
immunhistologisch erfolgte, lichtmikroskopisch auf Erregergehalt kontrolliert und
erregerhaltige Areale auf dem Schnitt gekennzeichnet. Anschließend wurden aus dem
53 MATERIAL UND METHODEN
entsprechenden Bereich des Paraffinblocks mit Hilfe einer Biopsie-Einmalstanze5
Stanzproben mit einem Durchmesser von 1 mm entnommen. Um zusätzlich den
ultrastrukturellen Nachweis von Chlamydien mit Goldmarkierung durchführen zu können,
war die Einbettung des Gewebes in ein hydrophiles Kunstharz notwendig. Berücksichtigt
wurden solche Lokalisationen, die in der bereits erfolgten ultrastrukturellen Untersuchung
Hinweise auf Erregerstrukturen lieferten (Tab. 4). Dazu wurden weitere 3 bis 4
Gewebeblöckchen je Lokalisation von den in Glutaraldehydlösung fixierten Geweben in
LR-White6 eingebettet.
Tab. 4: Übersicht über die Gewebe, die transmissionselektronenmikroskopisch untersucht
wurden unter Angabe der Präparationstechnik
Tiernr. Lungen-lokalisation
Konventionelle TEM
Umbettung von Paraffin in Araldite
Immun-elektronen-mikroskopie
Kontrollen
1 e x 2 b x 3 b x 4 b x 5 b x 6 b x
2 dpi 8 b x x 9 b x x 10 b x x x
3 dpi
11 b x x 12 e x 13 h x x x 13 b x x
4 dpi 14 e x 15 e x 16 e x x x
7 dpi 18 b x x 19 b x x
10 dpi 20 b x 21 e x 22 e x
5 Einmalhautstanze, Fa. Mercateo AG, Köthen, Deutschland 6 Fa. London Resin Company Ltd., Berkshire, England
b – Lobus cranialis sinister, pars caudalis; c1 – Lobus caudalis sinister, caudal; e – Lobus cranialis dexter pars caudalis; g1 – Lobus caudalis dexter, caudal; h – Lobus accessorius
MATERIAL UND METHODEN 54
3.2.4 Immunhistologische Untersuchung
3.2.4.1 Allgemeines
Alle immunhistolologischen Untersuchungen wurden an Gefrierschnitten durchgeführt. Durch
Schockgefrieren des Gewebes ohne das Anwenden eines Fixierungsmittels werden Antigene
im Gewebeschnitt besser erhalten und zugänglich für immunhistologische Untersuchungen.
Im Vergleich zu formalinfixierten und paraffineingebetteten Proben lässt sich ein verbesserter
Antigenerhalt im Gewebe erzielen. Nachteil dieser Methodik ist jedoch ein mäßiger
Strukturerhalt. Angewendet wurde die indirekte Immunmarkierung, bei der neben einem
Primärantikörper ein enzymkonjugierter Sekundärantikörper eingesetzt wird (Abb. 13). Der
primäre Antikörper bindet zuerst an das zu lokalisierende Antigen und wird im sich
anschließenden Reaktionsschritt durch einen sekundären Antikörper gebunden. Ein Substrat
wird zugesetzt und während der Reaktion durch das Enzym reduziert. Die frei werdenden
Protonen bewirken die Umsetzung eines eingesetzten farblosen Chromogens in ein
unlösliches farbiges Präzipitat, das die gelungene Immunmarkierung sichtbar macht.
Abb. 13: Schema der indirekten Immunmarkierung, G–Epitope im Gewebe, A–Antigen,
B-Primärantikörper, C-markierter Sekundärantikörper; modifiziert nach ROMEIS (2010)
55 MATERIAL UND METHODEN
3.2.4.2 Herstellung der Gefrierschnitte
Die Bearbeitung der Proben, die von den Kälbern stammten, die C. psittaci erhalten hatten,
erfolgte unter einer Atemschutzmaske mit Filter7. Die in Aluminiumfolie verpackten Proben
wurden mit gekühlter Pinzette und Skalpell auf Trockeneis oder im Kryostaten8 auf 1x1x1 cm
große Gewebeblöcke getrimmt und mittels Gefriermedium9 auf den Objekthalter des
Mikrotomschlittens aufgefroren. Von den Proben wurden mindestens 15 konsekutive
Kryostatschnitte der Lungen mit einer Schnittdicke von 7 µm und der Tonsilla, Trachea und
Lymphknoten mit einer Schnittdicke von 5 µm angefertigt und auf mit Chromalaungelatine10
beschichtete Objektträger11 aufgezogen. Die Gefrierschnitte der Gewebe, die von den mit
C. psittaci inokulierten Kälbern stammten, wurden für etwa fünf Sekunden in Azeton12
vorfixiert. Die Objektträger trockneten bei Raumtemperatur über Nacht und wurden bis zur
sich anschließenden Färbung oder immunhistologischen Markierung bei -20°C aufbewahrt.
3.2.4.3 H.E. - Übersichtsfärbung
Die Hämalaun-Eosin Färbung wird als Übersichtsfärbung routinemäßig eingesetzt. Dabei
sorgt das Hämalaun als positiv geladener Farbstoff für eine selektive Blaufärbung des
Zellkerns. Eosinlösungen färben das Zytoplasma, Kollagene, Keratine und Erythrozyten rot.
Die Gefrierschnitte wurden für 5 Minuten in einer Hämalaun-Lösung nach P. Mayer13 gefärbt.
Anschließend wurde durch eine 15-minütige Spülung unter Leitungswasser die Bläuung des
Farbstoffs erreicht und ungebundener Farbstoff ausgewaschen. Es schloss sich eine
dreiminütige Gegenfärbung in 1%igem Eosin14 an. In der aufsteigenden Alkoholreihe wurden
die Schnitte entwässert. Dazu wurden sie zweimal kurz in 70%igen vergällten Alkohol und
zweimal in 80%igen vergällten Alkohol eingetaucht und verblieben je nach
Differenzierungsgrad zweimal bis zu 2 Minuten in 96%igem Alkohol. Die Schnitte wurden
im Anschluss für 3 min in Karbolxylol15 inkubiert und schließlich noch weitere zwei Mal für
7 Dräger X-plore 7500, Dräger Safety AG & Co. KGaA, Lübeck, Deutschland 8 Figocut 2800E, Fa. Leica Instruments GmbH, Wetzlar, Deutschland 9 Neg-50, Fa. Thermo Fisher Scientific GmbH, Dreieich, Deutschland 10 eigene Herstellung; siehe Anhang 11 Star Frost, Fa. Engelbrecht GmbH, Edermünde, Deutschland 12 Fa. Carl Roth GmbH & Co KG, Karlsruhe, Deutschland 13 eigene Herstellung; siehe Anhang 14 eigene Herstellung; siehe Anhang 15 eigene Herstellung; siehe Anhang
MATERIAL UND METHODEN 56
2 min in Xylol gestellt. Die gefärbten Gefrierschnitte wurden luftdicht mit Kanadabalsam16
eingedeckt.
3.2.4.4 Primärantikörper
In den Lungen, der Tonsille, dem Lymphknoten und der Trachea wurden folgende Antigene
dargestellt: CD4, CD8, CD25, boWC1, MHC II, CD68, CD1b, IgA, IgM, IgG1 und boWC3.
Zudem wurde in der Lunge Panzytokeratin dargestellt. Der dazu gewählte monoklonale
Antikörperklon MNF11617 (Maus anti-humanes Zytokeratin) reagiert mit einem auf
Epithelzellen weit verbreiteten Epitop und markiert das Zytoplasma von Zellen epithelialen
Ursprungs.
An den Geweben, die von den mit C. psittaci inokulierten Kälbern stammten, wurde
immunhistologisch das Chlamydiaceae-LPS dargestellt. Der gewählte monoklonale
Antikörper ACI-P50018 (Maus anti-Chlamydia) reagiert dabei mit einem genusspezifischen
Epitop des Chlamydien-LPS. Der Antikörper markiert intrazelluläre Einschlüsse,
extrazelluläre Elementarkörperchen und freies zellassoziiertes Antigen u.a. von C. psittaci.
Die optimale Verdünnung der Primärantikörper wurde durch eine Titrationsreihe am
Lungengewebe und Lymphknoten ermittelt. In Tab. 5 sind Spezifität des Klons, Isotyp, die
dargestellten Zelltypen, die angewendete Verdünnung und die Referenzen aufgelistet.
16 Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Seelze-Hannover, Deutschland 17 Dako Denmark A/S, Glostrup, Dänemark 18 Progen Biotechnik GmbH, Heidelberg, Deutschland
57 MATERIAL UND METHODEN
Tab. 5: Übersicht über die verwendeten Primärantikörper
Klon Spezifität Isotyp markierte Zelltypen Verd. Referenz
IL-A1119 CD4 IgG2 T-Helferzellen unv. (BALDWIN et al.
1986)
CC6319 CD8 IgG2a zytotoxische T-Lymphozyten unv. (MACHUGH et al.
1991)
CACT116A20 boCD25 IgG1 aktivierte Lymphozyten,
Monozyten 1:100
(NAESSENS et al. 1992)
IL-A2919 boWC1 IgG1 γδ+ T-Lymphozyten 1:800 (CLEVERS et al.
1990)
IL-A2119 MHC II IgG2a Lymphozyten, Monozyten,
Epithel-, Endothelzellen 1:100
(TAYLOR et al. 1993)
EBM1121 CD68 IgG1, kappa
Makrophagen, myeloide Zellen, neoplastische Zellen
1:800 (ACKERMANN et al.
1994)
CC2019 CD1b IgG2a Subpopulation dendritischer
Zellen, Thymozyten 1:10
(HOWARD et al. 1993)
IL-A7119 IgA IgG2a IgA+ Zellen 1:10 (WILLIAMS et al.
1990)
IL-A3019 IgM IgG1 IgM+ Zellen 1:100 (NAESSENS et al.
1988)
IL-A6019 IgG1 IgG1 IgG1+ Zellen 1:100 (WILLIAMS et al.
1990)
CC5619 boWC3 IgG2a Immunglobulin+ B-Zellen 1:2 (NAESSENS u.
HOWARD 1991)
MNF116 Zytokeratin IgG1, kappa
Epithelzellen 1:100 Dako Denmark A/S, Glostrup, Dänemark
ACI-P500 Chlamydiaceae-LPS IgG3 Chlamydien 1:200 (NAHER et al. 1988)
Verd.–Verdünnung; unv.–unverdünnt
3.2.4.5 Durchführung der immunhistologischen Markierung
Die Gefrierschnitte wurden aus dem Gefrierschrank entnommen und trockneten für 60
Minuten bei Raumtemperatur (RT). Es folgte bei unterschiedlicher Temperatur eine 10-
minütige Fixierung in Azeton (Tab. 6).
Tab. 6: Temperatur der zur Fixierung eingesetzten Azetonlösung bei den verwendeten mAbs
IL-A11 CC63
CACT 116A
IL-A29
IL-A21
EBM 11 CC20
IL-A71
IL-A30
IL-A60 CC56
MNF 116
ACI-P500
RT - - - + + + + + + + + + +
-20°C + + + - - - - - - - - - -
RT–Raumtemperatur
19 European Collection of Cell Cultures, Salisbury, England 20 Fa. VMRD, Pullman, USA, vertrieben durch Labor Diagnostik Leipzig, Leipzig, Deutschland 21 Fa. Dako Denmark A/S, Glostrup, Dänemark
MATERIAL UND METHODEN 58
Die Gefrierschnitte wurden mit einem Fettstift22 umrandet und zweimal für 5 Minuten in
DPBS23 gespült. Die Gefrierschnitte wurden abhängig von ihrer Größe generell mit 60-100 µl
Medium oder Antikörper bedeckt. Um unerwünschte Hintergrundmarkierungen zu
vermeiden, die entstehen, wenn der sekundäre Antikörper mit endogenen Epitopen der Probe
kreuzreagiert, wurden sie mit verdünntem Normalserum vom Schaf in einer Konzentration
von 1:10 in BSA/DPBS24 in feuchten Kammern25 inkubiert. Nach 20-minütiger Einwirkzeit
wurde das Serum dekantiert und der Primärantikörper aufgetragen. Die Negativkontrolle
wurde mit BSA/DPBS anstelle des Primärantikörpers inkubiert. Die Schnitte wurden für 60
Minuten in feuchte Kammern eingesetzt. Im Anschluss wurde der Antikörper abgespült und
die Schnitte dreimal für 5 Minuten in DPBS gespült. Um die im Gewebe enthaltene endogene
Peroxidase zu blockieren, wurden die Gefrierschnitte für 40 Minuten bei 37°C in warmer
0,06%iger Phenylhydrazinlösung26 im Wasserbad27 inkubiert. Die Objektträger wurden erneut
dreimal für 5 Minuten in DPBS gespült. Anschließend folgte die Inkubation mit dem
sekundären Antikörper in der feuchten Kammer. Der Sekundärantikörper NA931V28 (Schaf
anti-Maus IgG) wurde 1:50 verdünnt in BSA/DPBS angewendet. Im Anschluss an die
einstündige Inkubationszeit wurden die Schnitte mit DPBS abgespült und weitere drei Mal in
DPBS gespült. Die Schnitte wurden für 7 Minuten bei Raumtemperatur in frisch angesetzte
und filtrierte Diaminobenzidin-Lösung29 unter Zusatz von 3%igem Wasserstoffperoxid30
verbracht. Durch das Spülen mit Aqua dest. kam es zum Abbruch der Reaktion. Das
kurzzeitige Auftropfen von 0,01%iger Osmiumlösung31 verstärkte die Braunfärbung. Es
folgte die 10-minütige Gegenfärbung der immunmarkierten Gefrierschnitte mit 2%iger
Methylengrünlösung32. Diese wurden in Aqua dest. solange gespült bis sich keine Farbwolken
mehr lösten. Die Schnitte wurden abschließend mit Glyceringelatine33 luftdicht eingedeckt.
22 PAP-Pen/Dako Pen, Fa. Dako, Hamburg, Deutschland 23 eigene Herstellung, siehe Anhang 24 eigene Herstellung, siehe Anhang 25 Fa. Carl Roth GmbH & Co KG, Karlsruhe, Deutschland 26 eigene Herstellung, siehe Anhang
27 Mikrobiologischer Brutschrank B6200, Fa. Kendro Laboratory Products GmbH, Langenselbold, Deutschland
28 GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg, Deutschland
29 eigene Herstellung, siehe Anhang
30 Fa. Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
31 eigene Herstellung, siehe Anhang
32 eigene Herstellung, siehe Anhang 33 Fa. Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
59 MATERIAL UND METHODEN
3.2.4.6 Durchführung der immunhistologischen Doppelmarkierung
Die Doppelmarkierung von CD1b+ dendritischen Zellen und Epithelstrukturen sollte an
ausgewählten Lungenschnitten der mit C. psittaci inokulierten Kälber die Verteilung
dendritischer Zellen in Bezug zu hyperplastischen Epithelien darstellen. Abweichend vom
zuvor beschriebenen Protokoll (siehe Kap. 3.2.4.5), folgte nun die Anwendung zweier
Primärantikörper und zweier Sekundärantikörper. Die Schnitte wurden aus dem
Gefrierschrank entnommen und bei Raumtemperatur für eine Stunde getrocknet. Es schloss
sich eine 10minütige Fixierung in Azeton bei Raumtemperatur an. Die Gefrierschnitte wurden
mit einem Fettstift umrandet und in DPBS gespült. Im Anschluss wurde Normalserum34 aus
der Ziege in einer Verdünnung von 1:10 in BSA/DPBS aufgetragen und für 20 Minuten in
feuchten Kammern belassen. Die Inkubation der aufgetragenen Substanzen wurde unter
mehrmaliger Spülung in DPBS beendet (siehe Kap. 3.2.4.5). Es folgte die 60-minütige
Inkubation der Schnitte mit dem Primärantikörper CC20. Eine 40-minütige Inkubation mit
0,06%igem Phenylhydrazin, dem das 60-minütige Auftragen mit einem Sekundärantikörper
(Ziege anti-Maus IgG235) in einer Konzentration von 1:50 in BSA/DPBS folgte. Der
sekundäre Antikörper war mit Meerrettichperoxidase (HRP) konjugiert. Die erste Reaktion
wurde mittels DAB entwickelt unter einer Einwirkzeit von 7 Minuten. Anschließend wurden
die Schnitte mit einem zweiten Primärantikörper MNF116 für 60 Minuten inkubiert. Es folgte
die Antigen-Antikörper-Bindung mit einem Sekundärantikörper (Ziege anti-Maus IgG136),
der mit Alkalischer Phosphatase (AP) konjugiert war und in einer Verdünnung von 1:50 in
BSA/DPBS angewendet wurde. Die Antigen-Antikörper-Bindung wurde mit Levamisol37
versetztem Vector Blue38 entwickelt. Für die Gegenfärbung wurde Kernechtrot39 verwendet.
Die markierten Gewebeschnitte wurden mit Glyceringelatine eingedeckt.
34 Tierhaus Friedrich-Loeffler Institut, Jena, Deutschland 35 Fa. SouthernBiotech, Birmingham, USA
36 Fa. SouthernBiotech, Birmingham, USA
37 Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland
38 Fa. Biozol Diagnostica Vertrieb GmbH, Eiching, Deutschland
39 eigene Herstellung, siehe Anhang
MATERIAL UND METHODEN 60
3.2.4.7 Auswertung und Dokumentation
Semiquantitative Auswertung der immunhistologischen Markierung und der HE-Färbung
Die Gefrierschnitte der Organe wurden mit Hilfe eines Lichtmikroskops40 ausgewertet. Für
die HE gefärbten und immunhistologisch CD4, CD8, CD25, γδ, MHC II, CD68, CD1b, IgA,
IgM und IgG1 markierten Gewebe wurden die Zellzahlen semiquantitativ anhand eines
Bewertungsscores erhoben (Tab. 7). Der Bewertungscore wurde auch auf die histologisch
identifizierten neutrophilen Granulozyten (PMN) angewendet. Die Auswertung
berücksichtigte die Kompartimente der Trachea mit respiratorischem Epithel und Lamina
propria; der Tonsille mit respiratorischem Epithel, Interfollikularzone, Lymphfollikel und
subepithelialem Bereich und dem Lymphknoten mit Cortex, Paracortex und Medulla. Die
Zellen wurden in vier Gesichtsfeldern in der 400fachen Vergrößerung ausgezählt.
In der Lunge wurden folgende Kompartimente unterschieden: luftleitendes System mit
Bronchus und Bronchiolus, luftaustauschendes System mit Alveolen und Interalveolarsepten,
interlobuläres Interstitium und Blutgefäße. Die Zellzahlen in Bronchus und Bronchiolus und
in den Blutgefäßen wurden für das gesamte Kompartiment bestimmt. Die Datenerhebung für
den Alveolarraum und das interlobuläre Interstitium erfolgte in vier Gesichtsfeldern in der
400fachen Vergrößerung.
Tab. 7: Tabellarische Darstellung der Bewertungskriterien für die semiquantitative
Auswertung nach immunhistologischer Markierung der Leukozytensubtypen
Semiquantitative Auswertung
Zellzahlen/Blickfeld bzw. /Bronchus, /Bronchiolus,
/Blutgefäß Interpretation
- 0 keine DAB+ Zelle (+) 1-5 Zellen einzelne DAB+ Zellen + 6-10 Zellen wenige DAB+ Zellen
++ 11-20 Zellen viele DAB+ Zellen +++ 21-50 Zellen sehr viele DAB+ Zellen
++++ >50 Zellen massenhaft DAB+ Zellen
40 Firma Olympus, Hamburg, Deutschland
61 MATERIAL UND METHODEN
Semiquantitative Auswertung von C. psittaci in der Lunge
In den Gefrierschnitten der mit C. psittaci inokulierten Kälber wurde der immunhistologische
Nachweis des Erregerantigens durchgeführt. Als Erregerantigen wurden braune, granuläre
Reaktionsprodukte, deren Morphologie variierte, innerhalb des Zytoplasmas einer Zielzelle
angesprochen. Zu unterscheiden waren kleine, kugelige Granula (1 bis 3 µm), große, runde
Einschlüsse (5 bis 10 µm) und spindelförmige Markierungen (bis 20 µm). Die Proben der
Kontrolltiere waren negativ (LAMBERTZ 2011). Die Auswertung der immunhistologisch mit
dem mAb ACI-P500 markierten Schnitte, erfolgte in der 100fachen Vergrößerung unter
Berücksichtigung semiquantitativer Kriterien, die beispielhaft in Abb. 24 dargestellt sind. Es
erfolgte eine Einteilung in: keine Erregerstadien nachweisbar, wenige Erregerstadien
nachweisbar (Abb. 24A), viele Erregerstadien nachweisbar (Abb. 24B) und sehr viele
Chlamydien-Einschlüsse nachweisbar (Abb. 24C).
Quantitative Auswertung des BALT
Die Lungenlokalisationen beider Versuchsgruppen wurden hinsichtlich lymphatischer
Aggregate untersucht. BALT wird definiert als organisiertes lymphatisches Gewebe, das an
Bronchien und Bronchiolen liegt. In der vorliegenden Untersuchung wurde die Anzahl und
Lage von nodulär organisierten, lymphatischen Aggregaten ermittelt, die sich durch den mAb
CC56 netzwerkartig schwach bis intensiv markierten. Weiterhin wurde die Menge an
unorganisierten lymphatischen Infiltraten aus CD4+ T-Lymphozyten ermittelt. Gezählt
wurden Anhäufungen, die aus mindestens zehn Zellen bestanden, deren Zellmembranen sich
berührten oder die locker nebeneinander lagen.
Quantitative Auswertung von CD4+, CD8+, γδ+ T-Lymphozyten
Zusätzlich zur semiquantitativen Auswertung der CD4+, CD8+ und γδ+ Zellen in den
Gefrierschnitten wurden die Zellzahlen quantitativ in ausgewählten Lungenproben ermittelt.
Berücksichtigt wurde der Lobus cranialis sinister, pars caudalis (b), der Lobus caudalis
sinister (c1) und der Lobus accessorius (h) der Kontrollkälber und die Lungenproben, der mit
C. psittaci inokulierten Tiere. Die Datenerhebung erfolgte an den immunhistologisch
markierten Gefrierschnitten und wurde mit Hilfe eines computergestützten halb-
MATERIAL UND METHODEN 62
automatischen Bildanalysesystems41 durchgeführt. Das Bild des auszuwertenden
Lungenschnittes wurde lichtmikroskopisch erfasst und über eine Kamera42 auf einen
Computerbildschirm übertragen. In der 400fachen Vergrößerung wurde ein Standbild
aufgenommen und die verwendete Objektivgröße in das Computerprogramm eingegeben. Die
Fläche des angezeigten Messfeldes (ROI), in der die Zellzählung erfolgte, betrug stets 0,16
mm². Um für die Auswertung berücksichtigt zu werden, mussten im Messfeld zumindest 50%
an Gewebe vorhanden sein. War die Voraussetzung nicht erfüllt, musste der Schnitt in
derselben Richtung, in der das Präparat gerade verschoben wurde, weiter bewegt werden. Bei
der Zählung wurden Zellen berücksichtigt, deren Zellkern sichtbar war und deren
Zellmembran zu 50% braun markiert war. Zellen die Kontakt zur rechten oder unteren
Begrenzungslinie des Messfeldes hatten, blieben unbeachtet. Pro Lungenschnitt wurden fünf
ROIs in der 400fachen Vergrößerung ausgezählt (Abb. 14).
Abb. 14: Zellzählung am Gefrierschnitt der Lunge schematisch dargestellt – links: bei den
Kontrollkälbern; rechts: bei den mit C. psittaci inokulierten Kälbern; TS-Teilstrich; ROI-
Messfeld
Um eine repräsentative Auswahl der Messfelder zu erhalten, wurde als Ausgangspunkt die
Mitte des Lungenschnittes bzw. bei den mit C. psittaci inokulierten Kälbern das Zentrum der
Läsion unter Verwendung der Lupenvergrößerung anvisiert. Hier wurde das erste Messfeld
(ROI 1) gesetzt. Um die folgenden Messfelder zu erreichen, wurde der Schnitt, um die
Übersicht zu behalten, in der 200fachen Vergrößerung wie folgt verschoben:
41 Cell* imaging Software, Fa: Olympus Soft Imaging Solutions GmbH, Münster, Deutschland 42 DP71, Fa: Olympus, Hamburg, Deutschland
63 MATERIAL UND METHODEN
- ausgehend vom ersten ROI um einen Teilstrich (TS) nach unten und um zwei TS nach
rechts (ROI 2)
- um vier TS nach links (ROI 3)
- um zwei TS nach oben (ROI 4)
- um vier TS nach rechts (ROI 5).
Bei den Lungenlokalisationen der mit C. psittaci infizierten Kälber wurde, um sicher zu
stellen, dass sich die fünf Messfelder innerhalb der Läsion befanden, der Radius peripher des
ersten ROIs vermindert und die Teilstriche zwischen den Messfeldern halbiert.
Die ausgezählten Zellen wurden auf eine Fläche von 1 mm² umgerechnet.
Statistik
Die Messwerte aus der Auszählung des lymphatischen Gewebes und der T-Zellsubtypen/mm²
wurden statistisch ausgewertet. Verwendet wurde das Programm SPSS43 unter Anwendung
des Kolmogorov-Smirnov-Test für den Test auf Normalverteilung und der Mann-Whitney-U-
Test zur Prüfung der Signifikanz der Übereinstimmung zweier unabhängiger Verteilungen
unter der Annahme eines Signifikanzniveaus von p ≤ 0,05. Repräsentative Gewebeschnitte
wurden mit Hilfe eines computergestützten Bildanalysesystems fotografisch dokumentiert.
3.2.5 Transmissionselektronenmikroskopische Untersuchung
3.2.5.1 Vorbehandlung paraffineingebetteter Gewebe
Die aus Paraffinblöcken ausgestanzten Gewebeproben wurden zunächst in Xylol für 15
Minuten entparaffiniert. Die Proben wurden auf einer Rotationsscheibe44 langsam bewegt und
währenddessen zwei Mal für 15 Minuten in 90%igem vergälltem Alkohol inkubiert. Es folgte
die Inkubation in 70%igem vergälltem Alkohol zwei Mal für je 15 Minuten und einmalig für
15 Minuten in 50%igem vergälltem Alkohol. Anschließend wurden die Proben für 15
Minuten in Aqua dest. gestellt. Hiernach wurde entsprechend der üblichen Präparation für die
ultrastrukturelle Untersuchung verfahren (siehe Kap. 3.2.5.2).
43 SPSS Statistics 19, IBM, Deutschland 44 Culture tube Rotator SC1, Fa. Stuart Scientific, Stone Staffordshire, England
MATERIAL UND METHODEN 64
3.2.5.2 Einbettung in Araldite CY212
Von den in 2,5%iger kakodylatgepufferter Glutaraldehydlösung fixierten Gewebeproben
wurden 10–12 Gewebeblöckchen pro Lokalisation in Epoxidharz45 eingebettet. Hierzu wurde
nach einer Einwirkzeit von mindestens 24 Stunden das Glutaraldehyd mit Hilfe von
Kakodylatpuffer ausgewaschen. Die Proben wurden langsam auf einer Rotationsscheibe
bewegt und fünf- bis sechsmal jeweils für 30 Minuten mit dem Puffer gespült. Es schloss sich
eine zweistündige Nachfixierung mit 2%igem Osmiumtetroxid46 an, das den Kontrast des
Gewebes erhöhte. Das Osmiumtetroxid wurde wiederum mit Kakodylatpuffer ausgewaschen.
Am Folgetag wurden die Proben in steigender Azetonkonzentration schrittweise entwässert:
- für 15 Minuten in 30%igem Azeton,
- für 30 Minuten in 50%igem Azeton,
- für 60 Minuten in 70%igem Azeton,
- für weitere 60 Minuten in 90%igem Azeton.
Anschließend wurden die Proben in wasserfreies Azeton verbracht und zweimal für 30
Minuten inkubiert. Die Infiltration mit dem Einbettmedium erfolgte stufenweise. Zunächst
wurde wasserfreies Azeton und Araldite I47 im Verhältnis 3:1 gemischt und eine Stunde auf
die Proben verbracht. Es folgte für eine Stunde die Infiltration mit einem Verhältnis von
Azeton zu Araldite I von 1:1. Über Nacht wurden die Proben dann in einem Teil wasserfreiem
Azeton mit drei Teilen Araldite I eingelegt. Am nächsten Tag folgte die Inkubation der
Proben mit frisch angesetzter Araldite I für zweimal 1 bis 2 Stunden bei 50°C. Die Proben
wurden schließlich in reines Araldite II48 überführt. In Araldite II verblieben sie für weitere
zwei Stunden bei 50°C. Die Proben wurden schließlich in Silikonkautschukformen49
überführt, die mit Araldite II aufgefüllt wurden. Die Proben wurden mindestens 48 Stunden
bei einer Temperatur von 50-70°C ausgehärtet.
45 Araldite CY212, Fa. Plano GmbH, Wetzlar, Deutschland 46 eigene Herstellung, siehe Anhang 47 eigene Herstellung, siehe Anhang 48 eigene Herstellung, siehe Anhang 49 Fa. Plano GmbH, Wetzlar, Deutschland
65 MATERIAL UND METHODEN
3.2.5.3 Anfertigung von Semidünnschnitten
Von drei der pro Lokalisation eingebetteten Gewebeblöckchen wurden Semidünnschnitte mit
einer Schnittdicke von 300 nm angefertigt. Anhand derer konnte die Fixierung und
Einbettung überprüft werden. Weiterhin dienten Semidünnschnitte der Orientierung im
Gewebe für die Auswahl der Ultradünnschnitte. Vor der Herstellung der Semidünnschnitte
wurde die eingebettete Probe mit einer Fräse50 von überschüssigem Harz befreit und konisch
getrimmt. Das getrimmte Kunstharzblöckchen wurde in das Ultramikrotom51 eingespannt, ein
Diamantmesser52 wurde eingesetzt und an der Anschnittsfläche ausgerichtet. Vor dem
Schneiden wurde der Messertrog des Mikrotoms mit sterilem Ampuwa-Wasser53 gefüllt,
sodass die Messerschneide feucht blieb aber kein Wasser das Kunstharzblöckchen benetzte.
Die Semidünnschnitte wurden am Ultramikrotom geschnitten und mit einem Glasstab aus
dem Wassertrog abgefangen und ummittelbar flotierend mit Toluidinblau54 gefärbt.
Anschließend wurde der Schnitt auf einen Tropfen aus A. dest auf einen Objektträger
übertragen und zum Trocknen auf eine 60°C heiße Heizplatte55 gelegt. Trockene
Semidünnschnitte wurden mit Entellan56 eingedeckt und bei 4°C gelagert.
3.2.5.4 Anfertigung von Ultradünnschnitten
Die Semidünnschnitte wurden lichtmikroskopisch untersucht und Bereiche, die von Interesse
waren, wurden in eine Schemazeichnung eingezeichnet. Die in Kunstharz eingebetteten
Gewebe wurden in den Päparatehalter eingespannt und unter mikroskopischer Kontrolle
erfolgte das Zuschneiden der Probe mit einer Rasierklinge, sodass die ausgewählten Bereiche
erhalten blieben. Der Block wurde in Form eines Trapezes getrimmt und hatte eine
Oberfläche von maximal 0,1-0,3 mm2. Im Folgenden wurde das Diamantmesser57 in den
Messerhalter eingesetzt und der Wassertrog mit sterilem Ampuwa-Wasser aufgefüllt. Die
80 nm dicken Ultradünnschnitte glitten als Schnittbänder in einen wassergefüllten Trog. Aus
50 Leica EM Trim, Fa. Leica, Bensheim, Deutschland
51 Ultracut UCT-GA-DE 1/00, Fa. Leica, Bensheim, Deutschland
52 Histo Hi 7447, Fa. DiATOME, Hatfield, USA 53 Ampuwa Wasser für Injektionszwecke, Nord Apotheke, Jena, Deutschland
54 Eigene Herstellung, siehe Anhang 55 Leica EM MP, Fa. Leica, Bensheim, Deutschland 56 Fa. Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
57 Ultra 45°, DiS-Galetzka Ultramikrotomie Messerservice, Weinheim, Deutschland
MATERIAL UND METHODEN 66
diesem wurden die ultradünnen Schnitte mit einem Kupfernetz58 aufgenommen und auf
Filterpapier getrocknet.
3.2.5.5 Nachkontrastierung mit Uranylazetat und Bleizitrat
Um einen höheren Kontrast zu erreichen, wurden die Ultradünnschnitte mit Uranylazetat und
Bleizitrat kontrastiert (VENABLE u. COGGESHALL 1965). Das Uranylazetat reagiert mit
Nukleinsäuren und das Bleizitrat mit Membranen, Proteinen, Nukleinsäuren und Glykogen.
Für die Kontrastierung wurden die Netzchen für 15 Minuten auf einen Tropfen aus
Uranylazetatlösung59, der sich auf einer Zahnwachsplatte60 befand, gelegt. Im Folgenden
wurde die Lösung mit Ampuwa-Wasser abgespült und das Trägernetz getrocknet. Ein Teil der
Zahnwachsplatte wurde in eine Petrischale eingesetzt, an deren Rand Natriumhydroxid-
Plätzchen61 ausgelegt waren, um das Kohlenstoffdioxid zu binden. Im Anschluss wurde das
Trägernetz für 25 Minuten auf einen Tropfen aus Bleizitrat-Lösung62 gelegt. Die Lösung
wurde ebenfalls mit sterilem Ampuwa-Wasser gründlich abgespült und die Netze getrocknet.
3.2.5.6 Einbettung in LR-White
Auch für die LR-White Einbettung wurden Gewebeproben, die in 2,5% Glutaraldehyd fixiert
worden waren mit 4°C kaltem Kakodylatpuffer aus den Gewebeblöckchen ausgewaschen.
Der Puffer wurde fünf Mal in 30-minütigen Abständen gewechselt. Die Proben wurden
während der Bearbeitung bei 4°C aufbewahrt. Sie wurden in aufsteigenden Konzentrationen
von Ethanol: zunächst 30%, dann 50% und schließlich 70%, für jeweils 30 Minuten
entwässert. Anschließend wurden sie für jeweils 30 Minuten in eine aufsteigende Mischung
aus absolutem Ethanol und LR-White verbracht. Dabei erhöhte sich mit jedem Schritt der
Anteil des hydrophilen Acrylharzes. Begonnen wurde mit einem Verhältnis von 2:1, es
folgten gleiche Teile von absolutem Ethanol und LR-White und schließlich ein Verhältnis von
1:2 mit einem überwiegenden Anteil des Harzes. Die Proben verblieben über Nacht in LR-
White und wurden im Anschluss unter Luftabschluss in Gelatinekapseln63 eingebettet. Die
58 Typ 200 square mesh, ppar 3,05 mm, Fa. Plano GmbH, Wetzlar, Deutschland 59 eigene Herstellung, siehe Anhang
60 Dental-Wachs, Fa. Plano, GmbH, Wetzlar, Deutschland 61 Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland
62 eigene Herstellung, siehe Anhang 63 Gelatinekapseln Größe 3, Fa. Plano, Wetzlar, Deutschland
67 MATERIAL UND METHODEN
Kapseln härteten für 24 Stunden bei 50°C aus. Im Anschluss wurden 300 nm dicke
Semidünnschnitte und 80 nm dicke Ultradünnschnitte angefertigt (siehe Kap. 3.2.5.3; Kap
3.2.5.4), die abweichend auf 200 mesh Goldnetzchen64 aufgezogen wurden.
3.2.5.7 Indirekte Immunogoldmarkierung an Ultradünnschnitte n
Die mit Gewebe beladenen Netzchen wurden für 30 Minuten auf einen Tropfen 0,2%iger
BSA-c65 Lösung in DPBS aufgelegt (Tab. 8). Daran schloss sich die 10-minütige Inkubation
auf einem Tropfen aus 0,02 Mol Glycin66 in Aqua. bidest und die 1-stündige Inkubation mit
dem mAb ACI-P500. Dieser wurde 1:250 in DPBS mit Zusatz von Ziegennormalserum und
BSA-c67 verdünnt. Die Negativkontrolle wurde mit einem für das BVD-Virus spezifischen
Primärantikörper68 in derselben Konzentration inkubiert. Anschließend folgte eine 5-malige
Spülung mit der Dauer von jeweils 2 Minuten unter Verwendung des bereits verwendeten
DPBS mit 0,2% BSA-c Gemisches. Der mit 18 nm Gold-konjugierte zweite polyklonale
Antikörper69 wurde mit DPBS und BSA-c70 1:10 verdünnt und für 60 Minuten auf dem
Schnitt belassen. Anschließend wiederholte sich das Waschen der Netzchen. Die Reaktion
wurde unter mehrmaliger Spülung in Ampuwa-Wasser beendet. Es folgte die Kontrastierung
in Uranylazetat und Bleizitrat (siehe Kap. 3.2.5.5).
Tab. 8: Schritte der indirekten Immunogoldmarkierung am Ultradünnschnitt
1.
Schritt 2.
Schritt 3. Schritt
4. Schritt
5. Schritt 6. Schritt 7.
Schritt
Medium
DPBS mit
0,2% BSA-c
0,02 M Glycin
mAb ACIP500 bzw. C16
verd. in DPBS mit 0,2%
Ziegennormalserum u. 0,2% BSA-c
DPBS mit
0,2% BSA-c
Ziege anti-Maus IgG markiert mit Gold in DPBS mit 0,2% BSA-c 1:10
DPBS mit 0,2% BSA-
c Ampuwa
Einwirkzeit 30
Minuten 10
Minuten 1 Stunde
5 x je 2 Minuten
1 Stunde 5 x je 2 Minuten
5 x je 5 Minuten
64 Fa. Baltic Präparation, Weinheim, Deutschland 65 eigene Herstellung, siehe Anhang 66 eigene Herstellung, siehe Anhang 67 eigene Herstellung, siehe Anhang 68 mAb C16, freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Moennig, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover,
Deutschland 69 Ziege anti-Maus IgG 18nm Gold, DIANOVA GmbH, Hamburg, Deutschland 70 eigene Herstellung, siehe Anhang
MATERIAL UND METHODEN 68
3.2.5.8 Auswertung und Dokumentation
Die Auswertung der ultradünnen Schnitte wurde mit Hilfe eines Transmissionselektronen-
mikroskops71 durchgeführt. Charakteristische und repräsentative Befunde wurden durch
analoge Aufnahmen auf Planfilm72 dokumentiert. Neben den Abzügen auf Fotopapier73
erfolgte die Digitalisierung der Aufnahmen und die Bearbeitung mit Photoshop74.
71 Tecnai 12, Fa. Philips, Hamburg, Deutschland 72 Kodak SO163, Fa. Plano GmbH, Wetzlar, Deutschland 73 Ilford Multigrad IV, Fa. Ilford Imaging GmbH, Dreieich, Deutschland 74 Adobe Photoshop CS5, Fa. Adobe Systems GmbH, München, Deutschland
69 ERGEBNISSE
4 ERGEBNISSE
4.1 Immunhistologische Untersuchung
Die in der Untersuchung verwendeten Organe stammten aus einem Infektionsversuch an
Kälbern, bei dem ein respiratorisches Tiermodell zur Untersuchung der C. psittaci-Infektion
etabliert werden sollte. Bei diesem Infektionsversuch wurde C. psittaci intrapulmonal
verabreicht und induzierte bei allen inokulierten Tieren eine Bronchopneumonie
(OSTERMANN et al. 2010). Die Verteilung der Lungenveränderungen entsprach den
Applikationsstellen. Somit waren besonders häufig Veränderungen im linken kaudalen
Spitzenlappen, dem Mittellappen, den Basislappen und dem akzessorischen Lungenlappen zu
finden (LAMBERTZ 2011). Der Mittellappen konnte histologisch nicht ausgewertet werden,
da er durch die Gewinnung von BALF hochgradige Artefakte aufwies. Für die vorliegende
Untersuchung wurde gezielt verändertes Lungengewebe aus dem linken kaudalen
Spitzenlappen, den Basislappen und dem akzessorischen Lungenlappen sowie die regionären
Lymphknoten und repräsentativ für den oberen Respirationstrakt die Tonsille ausgewählt.
Von den mit C. psittaci inokulierten Kälbern, die am Ende des Beobachtungszeitraums keine
Lungenveränderungen aufwiesen und den Kontrollkälbern, von denen keines während des
gesamten Beobachtungszeitraums entzündliche Lungenveränderungen zeigte, wurden
Lungenproben aus denselben anatomischen Lokalisationen untersucht. Bei den
Kontrollkälbern wurden zusätzlich die Trachea und weitere Lungenproben aus den übrigen
Lungenlappen in die Untersuchung einbezogen, sodass bei diesen Tieren insgesamt 10
Lokalisationen aus der Lunge berücksichtigt wurden.
Die Anwendung verschiedener Antikörper ermöglichte die differenzierte Darstellung der
Leukozyten im Gewebeschnitt.
° Durch die Anwendung der Antikörper IL-A11, CC63 und IL-A29 wurde die
Zelloberfläche von CD4+, CD8+ und γδ+ T-Lymphozyten markiert. T-Lymphozyten
waren durch einen großen Zellkern und einen schmalen Zytoplasmasaum
gekennzeichnet. In der Lunge von gesunden Kälbern erschwerte eine unspezifische
Hintergrundmarkierung die Abgrenzung einzelner CD8+ T-Zellen.
ERGEBNISSE 70
° Der Antikörper CACT116A markierte CD25, einen Aktivierungsmarker, der von
Lymphozyten und Makrophagen exprimiert wird.
° Mit den Antikörpern IL-A71, IL-A30 und IL-A60 wurden IgA+, IgM+ und IgG1+ B-
Lymphozyten und Plasmazellen dargestellt. Plasmazellen waren durch ein breites
Zytoplasma von B-Lymphozyten zu unterscheiden.
° Eine Subpopulation dendritischer Zellen ließ sich durch den Antikörper CC20, der
CD1b+ in der Zellwand markiert, darstellen.
° Der Antikörper EBM11 markierte das Zytoplasma von CD68+ Makrophagen.
° MHC II ließ sich auf Zellen mit heterogener Morphologie darstellen. Markiert wurden
Makrophagen, dendritische Zellen, Lymphozyten, Epithel- und Endothelzellen. Die
untersuchten Kompartimente wurden diffus markiert. Ohne Markierung blieben
neutrophile Granulozyten, Muskelzellen und Knorpel.
° Neutrophile Granulozyten wurden in der HE-Färbung anhand ihres segmentierten
Zellkerns identifiziert.
Da die oben aufgeführten Leukozytensubpopulationen nicht gleichmäßig in den untersuchten
Organen verteilt waren, wurden bei der Auswertung verschiedene funktionelle Kom-
partimente unterschieden. Bei den Kontrollkälbern wurden beispielsweise luftleitendes und
luftaustauschendes Gewebe, Blutgefäße, Lymphfollikel und Paracortex bzw.
Interfollikularzone getrennt beurteilt. Bei den mit C. psittaci-inokulierten Kälbern erfolgte
zusätzlich die Unterscheidung von Nekrose und Regenerationszone.
4.1.1 Kontrollkälber
In den Organen, die in die Untersuchung einbezogen wurden, waren immunhistologisch keine
Chlamydien nachweisbar (LAMBERTZ 2011).
4.1.1.1 Verteilung und Menge der Leukozytensubtypen in der Lunge
Die Lunge lässt sich funktionell und morphologisch in luftleitendes System (Bronchien,
Bronchiolen) und luftaustauschendes System (Alveolen, Interalveolarsepten), in Blutgefäße
und Interstitium unterteilen (Abb. 15). Befunde, die das BALT betreffen, sind separat in
Kap. 4.1.1.3 dokumentiert.
71 ERGEBNISSE
Abb. 15: Kompartimente der Lunge: A-Alveolen, IAS–Interalveolarsepten, B–Bronchus, Br –
Bronchiolus, G–Blutgefäß, I–interlobuläres Interstitium
Bronchien und Bronchiolen
CD8+ und γδ+ T-Lymphozyten lagen vereinzelt zwischen den Zellen des respiratorischen
Epithels (Abb. 16BC). Sie waren häufiger im Epithel der Bronchien als in den Bronchiolen zu
finden. In der Lamina propria mucosae (Lp) waren überwiegend sehr viele CD4+, CD8+ und
weniger γδ+ T-Lymphozyten vorhanden (16A,B,C).In der Mehrzahl befanden sie sich
gleichmäßig über den Querschnitt verteilt. CD4+ und CD8+ T-Zellen bildeten zusätzlich
fokal bis multifokal lockere Ansammlungen. Bei einem Kalb lagen CD4+ T-Zellen in
mehreren Lagen vor (Tier Nr. 6). Die Bronchiolen wiesen meist weniger CD8+ T-
Lymphozyten in der Lp auf als CD4+ T-Zellen. Lediglich im accessorischen Lungenlappen
eines Tieres (Tier Nr. 1) waren wenige aktivierte CD25+ Zellen zu sehen. Markiert wurden
kleine, runde Zellen, die sich in der Lp der Bronchien und im peribronchiolären Interstitium
verteilten (Abb. 16D). Das apikale oder das gesamte Zytoplasma des Bronchial- und
Bronchiolarepithels zeigte bei allen Kälbern eine Markierung für IgA mit unterschiedlicher
Intensität (Abb. 16E). Ausnahme bildete der Lobus caudalis eines Tieres (Tier Nr. 1), bei dem
das Epithel eines Bronchus keine Markierung für IgA aufwies, wobei sich periphere
Bronchiolarepithelien schwach für IgA markierten. In einem Teil der Lungenlokalisationen
bei vier der Kälber war zudem eine schwächere IgM+ Markierung zu sehen (Tiere Nr. 1, 2,
4, 5). IgG1 markierte diffus die Kompartimente der luftführenden Wege mit Ausnahme des
Epithels und des Knorpels (Abb. 16F).
ERGEBNISSE 72
Abb. 16: Darstellung der immunhistologischen Befunde von CD4+, CD8+, γδ+ T-Zellen,
CD25+ Zellen, IgA+ und IgG1+ Plasmazellen im luftführenden System der Kontrollkälber.
A-C, E indirekte Immunperoxidase an konsekutiven Kryostatschnitten von Tier Nr. 5,
Lobus caudalis sinister; Eichstrich = 200 µm
A: Sehr viele CD4+ T-Lymphozyten (Pfeile, exemplarisch) verteilen sich diffus oder in
Ansammlungen in der Lamina propria (Lp) und im peribronchialen Interstitium (I).
B: Sehr viele CD8+ T-Lymphozyten (Pfeile, exemplarisch) verteilen sich gleichmäßig in der
Lp (Lp) und im peribronchialen Interstitium (I). Einzelne CD8+ T-Zellen liegen
intraepithelial (Pfeilspitze, exemplarisch).
C: In der Lp (Lp) und im peribronchialen Interstitium (I) befinden sich wenige γδ+ T-Zellen
(Pfeile, exemplarisch). Einzelne γδ+ T-Zellen liegen intraepithelial (Pfeilspitze,
exemplarisch).
D: Wenige aktivierte CD25+ Zellen (Pfeile, exemplarisch) verteilen sich diffus und in einer
Ansammlung in der Lp (Lp) und im peribronchialen Interstitium (I) eines Bronchus.
Indirekte Immunperoxidase am Kryostatschnitt von Tier Nr. 1, Lobus accessorius; Eichstrich
= 200 µm
E: Das apikale Bronchiolarepithel markiert sich für IgA. Zudem liegen wenige IgA+
Plasmazellen (Pfeile, exemplarisch) in der Lp (*) und im peribronchiolären Interstitium (I).
F: In der diffus für IgG1 markierten Lp (Lp) und in dem diffus für IgG1 markierten
peribronchialen Interstitium (I) liegen einzelne IgG1+ Plasmazellen (Pfeile, exemplarisch).
Das Bronchialepithel ist von der diffusen Markierung für IgG1+ ausgenommen.
Indirekte Immunperoxidase am Kryostatschnitt von Tier Nr. 6, Lobus medius; Eichstrich =
500 µm
73 ERGEBNISSE
ERGEBNISSE 74
Im luftführenden Kompartiment waren nur Plasmazellen und keine B-Lymphozyten zu
beobachten. In der Mehrzahl der untersuchten Lungenlokalisationen waren in der Lp der
Bronchien viele bis sehr viele IgA+ und weniger IgM+ Plasmazellen und IgG1+ Plasmazellen
vorhanden (Abb. 16E,F). In den Spitzenlappen von Tier Nr. 5 waren zum Teil viele IgG1+
Plasmazellen vorhanden. IgA+ und IgM+ Plasmazellen lagen zum Teil eng aneinander gereiht
und basal des Bronchialepithels angeordnet. Die Bronchialwand, dessen Epithel negativ für
IgA war, enthielt keine IgA+ Plasmazellen (Tier Nr. 1). Im selben Schnitt waren in der Lp
von Bronchiolen wenige IgA+ Plasmazellen enthalten. Im Vergleich zu den Bronchien wiesen
die Bronchiolen weniger IgA+, IgM+, IgG1+ Plasmazellen auf, wobei sich IgA+ und IgM+
Plasmazellen überwiegend in der Submukosa (SM) verteilten. Regelmäßig waren wenige
IgG1+ Plasmazellen in der Lp oder peribronchiolär verteilt.
Das Luftwegsepithel mit Flimmerepithelzellen und Becherzellen zeigte in mehr als 50% der
untersuchten Luftwege eine apikale, granuläre oder eine diffuse Markierung für MHC II. In
der Lp und im peribronchialen bzw. peribronchiolären Bindegewebe waren sehr viele in
Zytoplasmaausläufer positiv für MHC II und umgaben regelmäßig den Luftweg. Weniger
häufig lagen polygonale und runde MHC II+ Zellen vor.
CD1b+ dendritische Zellen waren vereinzelt zwischen den Epithelzellen und vermehrt in der
Lp, meist basal des Epithels der Bronchien und Bronchiolen zu sehen (Abb. 17A). Häufig
waren zudem fokale Ansammlungen aus CD1b+ dendritischen Zellen (DC) ober- oder
unterhalb der Lamina muscularis mucosae (LMM) bzw. der Tunica muscularis (TM) im
peribronchialen oder peribronchiolären Bindegewebe lokalisiert. Mitunter waren keine
CD1b+ dendritischen Zellen in den Bronchiolen vorhanden. Multifokal ließen sich einzelne
CD1b+ dendritische Zellen mit schaumigem Zytoplasma im Lumen der Luftwege nachweisen
(Tier Nr. 1). CD1b+ dendritische Zellen stimmten mit der Lage MHC II+ Zellen überein,
wobei weniger Zellen markiert waren. Makrophagen waren selten im Lumen der Bronchien
und häufiger im Lumen von Bronchiolen zu beobachten. Im rechten kaudalen Spitzenlappen
eines Tieres sammelten sich fokal viele Makrophagen im Lumen eines Bronchiolus (Tier
Nr. 3). In der Lp und im peribronchialen und peribronchiolären Bindegewebe waren wenige
Makrophagen darstellbar, die sich diffus verteilten (Abb. 17B).
Neutrophile Granulozyten waren nur vereinzelt in der Lp nachweisbar.
75 ERGEBNISSE
Abb. 17: Darstellung der immunhistologischen Befunde von CD1b+ dendritischen Zellen und
CD68+ Makrophagen im luftführenden System der Kontrollkälber.
A, B indirekte Immunperoxidase an konsekutiven Kryostatschnitten von Tier Nr. 5,
Lobus medius; Eichstrich = 200 µm
A: Wenige CD1b+ dendritische Zellen (Pfeile, exemplarisch) befinden sich in der Lp (Lp)
eines Bronchus.
B: Wenige schlanke Makrophagen (Pfeile, exemplarisch) verteilen sich in der Lp (Lp) eines
Bronchus.
ERGEBNISSE 76
Alveolen und Interalveolarsepten
Sehr viele CD4+ und CD8+ Zellen verteilten sich diffus und seltener in kleinen
Ansammlungen in den Interalveolarsepten (Abb. 18A,B). Weniger häufig waren γδ+ T-Zellen
zu sehen, die sich überwiegend diffus in den Interalveolarsepten verteilten (Abb. 18C). Bei
zwei Kälbern lagen erhöhte CD4+ Zellzahlen vor (Tiere Nr. 5, 6). Vereinzelt waren CD8+ T-
Zellen im Alveolarlumen zu sehen. Aktivierte CD25+ Zellen waren lediglich im
accessorischen Lungenlappen eines Tieres vorhanden (Tier Nr. 2). Sie waren unregelmäßig in
den Interalveolarsepten verteilt. In einem Teil der untersuchten Lungenlokalisationen waren
einzelne Plasmazellen in den Interalveolarsepten zu erkennen, die IgA+ (Abb. 18D) und
weniger häufig IgM+ waren. Zudem markierten sich in einem Teil der Schnitte zahlreiche
Zellausläufer und Interalveolarsepten diffus oder granulär intensiv für IgA und für IgM. Die
Verteilung entsprach dabei der von interstitiellen und intravaskulären Makrophagen. Diese
Markierung trat sporadisch bei allen Tieren auf. IgG1+ granuläre Präzipitate waren diffus in
den Interalveolarsepten zu sehen (Abb. 18E). Einzelne CD1b+ dendritische Zellen und zum
Teil Ansammlungen aus CD1b+ dendritischen Zellen waren in den Interalveolarsepten
verteilt (Abb. 18F). Bei einem Tier waren multifokal CD1b+ Zellen in den Alveolarlumina
vorhanden (Tier Nr. 3). Bei einem Kalb lagen in der Mehrzahl der Lungenlokalisationen
erhöhte Mengen an CD1b+ dendritischen Zellen in den Interalveolarsepten (Tier Nr. 5). Zum
Teil waren unterschiedlich intensive Markierungen der Zellen vorhanden. CD68+
Alveolarmakrophagen konnten aufgrund ihres granulär markierten breiten Zytoplasmas von
schlanken interstitiellen und intravaskulären Makrophagen unterschieden werden (Abb. 19B).
In den Interalveolarsepten waren massenhaft interstitielle und krophagen gleichmäßig verteilt
(Abb. 19A,B). In den Lumina der Alveolen waren nur wenige Alveolarmakrophagen zu sehen
(Abb. 19B). Die Mehrzahl der Zellen in den Interalveolarsepten war schwach für MHC II
markiert. Markiert wurden kleine, runde Zellen und schlanke Zellen. Multifokal waren
intensiv markierte Zytoplasmaausläufer zu erkennen, die aufgrund ihrer Morphologie als
dendritische Zellen identifiziert wurden. In den Interalveolarsepten reagierten einzelne Zellen
negativ für MHC II. In den Alveolarlumina lagen regelmäßig einzelne MHC II+ große runde
Zellen, die mit der Verteilung von Alveolarmakrophagen übereinstimmten.
77 ERGEBNISSE
Blutgefäße
Einzelne CD4+, CD8+ und γδ+ T-Zellen waren in der Gefäßadventitia verteilt. In den
Lungenlokalisationen einzelner Tiere waren kleine Gefäße regelmäßig von CD4+ Zellen
umgeben (Tiere Nr. 4, 5, 6). Zum Teil waren einzelne γδ+ und CD8+ Zellen auf dem
Gefäßendothel lokalisiert. Nur bei wenigen Tieren waren einzelne IgA+ und IgM+
Plasmazellen in den Gefäßwänden vorhanden. Die Gefäßwände markierten sich mit
Ausnahme der Tunica media diffus für IgG1.
CD1b+ dendritische Zellen verteilten sich in variabler Anzahl in den Gefäßwänden. Ein
Großteil kleiner Gefäße wurde von einem Netzwerk aus CD1b+ Zellen umgeben. CD68+
Makrophagen waren nur selten in den Gefäßwänden zu sehen. Die Markierung der
Gefäßwände für MHC II variierte stark. Im selben Schnittpräparat waren sowohl Gefäßwände
mit zahlreichen MHC II+ Zellen als auch solche ohne jegliche Markierung zu finden. In der
Mehrzahl waren viele Zytoplasmaausläufer gleichmäßig in den Gefäßwänden und vermehrt
im perivaskulären Bindegewebe verteilt. Die Endothelzellen waren in der Mehrzahl positiv
für MHC II.
Interstitium
In der Mehrzahl der untersuchten Lungenlokalisationen waren wenige CD4+ T-Zellen
unregelmäßig in den interlobulären Interstitien angeordnet. Bei zwei Kälbern waren CD4+
T-Zellen in erhöhter Anzahl vorhanden und diffus im interlobulären Bindegewebe verteilt
(Tiere Nr. 5, 6). Einzelne CD8+ und γδ+ T-Lymphozyten und seltener einzelne IgM+ und
IgG1+ Plasmazellen ließen sich im interlobulären Interstitium nachweisen (Tiere Nr. 2, 5, 6).
Wenige CD1b+ Zellausläufer waren multifokal locker aneinander gereiht oder lagen einzeln
vor. Bei einem der Kälber waren CD1b+ dendritische Zellen vermehrt vorhanden und
bildeten multifokale Ansammlungen (Tier Nr. 1). Selten waren einzelne Makrophagen im
interlobulären Bindegewebe zu sehen. Wenige MHC II+ Zellen ließen sich als kleine und
runde Zellen, polygonale Zellen und Zytoplasmaausläufer darstellen. Sie waren regelmäßig in
den Interstitien enthalten. Multifokal waren Infiltrate aus MHC II+ Zellen zu sehen.
ERGEBNISSE 78
Abb. 18: Darstellung der immunhistologischen Befunde von CD4+, CD8+, γδ+ T-Zellen,
IgA+ und IgG1+ Plasmazellen und CD1b+ dendritischen Zellen im luftaustauschenden
System der Kontrollkälber.
Indirekte Immunperoxidase an Kryostatschnitten; Eichstrich = 200 µm
A-C konsekutive Kryostatschnitte von Tier Nr. 5, Lobus caudalis sinister;
A: Sehr viele CD4+ T-Lymphozyten (Pfeile, exemplarisch) liegen in den Interalveolarsepten
(IAS).
B: Sehr viele CD8+ T-Lymphozyten (Pfeile, exemplarisch) verteilen sich in den
Interalveolarsepten (IAS). Zudem liegt eine unspezifische Hintergrundmarkierung in den IAS
vor (Pfeilspitze, exemplarisch).
C: Viele γδ+ T-Lymphozyten (Pfeile, exemplarisch) verteilen sich in den Interalveolarsepten
(IAS).
D: In den Interalveolarsepten (IAS) liegen IgA+ Ablagerungen und einzelne IgA+
Plasmazellen (Pfeile, exemplarisch).
Tier Nr. 6, Lobus medius;
E: Die Interalveolarsepten (IAS) markieren sich diffus für IgG1. Dabei zeigt sich eine
besonders intensive Markierung in der Wand einer Arteriole (G).
Tier Nr. 6, Lobus accessorius;
F: CD1b+ dendritische Zellen liegen einzeln (Pfeilspitze, exemplarisch) oder als
Ansammlung (Pfeil, exemplarisch) in den Interalveolarsepten (IAS).
Tier Nr. 5, Lobus medius;
79 ERGEBNISSE
ERGEBNISSE 80
Abb. 19: Darstellung der immunhistologischen Befunde von CD68+ Makrophagen im
luftaustauschenden System bei einem Kontrolltier.
Indirekte Immunperoxidase am Kryostatschnitt;
A: CD68+ Makrophagen liegen massenhaft in den Interalveolarsepten (IAS).
Tier Nr. 5, Lobus caudalis sinister; Eichstrich = 200 µm
B: Die höhere Vergrößerung von A erlaubt die Unterscheidung von Alveolarmakrophagen
mit breit markiertem Zytoplasma (Pfeilspitzen, exemplarisch) und schlanken interstitiellen
bzw. intravaskulären Makrophagen (Pfeile, exemplarisch).
Tier Nr. 6, Lobus accessorius; Eichstrich = 100 µm
81 ERGEBNISSE
4.1.1.2 Quantitative Auswertung von CD4+, CD8+ und γδ+ T-Lymphozyten
Die Anzahl der CD4+, CD8+ und γδ+ T-Lymphozyten wurde quantitativ in den linken
kaudalen Spitzenlappen, den linken Basislappen und den accessorischen Lungenlappen
ermittelt. Hierbei wurden keine Kompartimente unterschieden. Lediglich BALT blieb bei der
Untersuchung unberücksichtigt. Zwischen den drei untersuchten Lungenlokalisationen lagen
keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich der Anzahl an CD4+, CD8+ und γδ+
T-Lymphozyten vor. Fasst man die Daten der drei Lungenlokalisationen zusammen, so waren
78 ± 26 CD4+ T-Zellen/mm² Lungengewebe, 65 ± 23 CD8+ T-Zellen/mm² Lungengewebe
und 30 ± 18 γδ+ T-Zellen/mm² Lungengewebe zu finden (Abb. 20). Das bedeutet, dass CD4+
und CD8+ T-Lymphozyten in etwa doppelt so häufig im Vergleich zu γδ+ T-Lymphozyten im
Lungenparenchym zu finden sind. Die Anzahl der CD4+ T-Lymphozyten ist geringgradig
höher als die der CD8+ T-Lymphozyten. Die tierindividuelle Schwankung der T-Zellzahlen
findet in den teils recht großen Standardabweichungen Ausdruck.
0
20
40
60
80
100
120
CD4
CD8
γ δ
Abb. 20: Arithmetische Mittelwerte und Standardabweichungen der Zellzahlen/mm² der
CD4+, CD8+ und γδ+ T-Lymphozyten im Lobus cranialis, Lobus caudalis und Lobus
accessorius der Kontrollkälber
Lobus cranialis Lobus caudalis Lobus accessorius
Zel
lzah
l/mm
²
Quantitative Auswertung der T-Zellsubtypen
ERGEBNISSE 82
Vergleicht man das Verhältnis von CD4+:CD8+ T-Lymphozyten zwischen den einzelnen
Tieren, so lässt sich bestätigen, dass bei der Mehrzahl der untersuchten Kontrollkälber und in
der Mehrzahl der Lungenlappen mehr CD4+ als CD8+ T-Lymphozyten im Lungengewebe zu
finden waren (Abb. 21). Dies spiegelte sich im durchschnittlichen Verhältnis von 1,2:1
wieder. Nur bei einem Kalb dominierten in allen untersuchten Lungenlokalisationen CD8+ T-
Lymphozyten (Tier Nr. 2). Bei zwei Tieren waren in einem der drei Lungenlappen
überwiegend CD8+ T-Lymphozyten vorhanden (Tiere Nr. 3, 5).
Abb. 21: Verhältnis zwischen CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten in den verschiedenen
Lungenlokalisationen bei den Kontrollkälbern
4.1.1.3 BALT
Das Vorkommen und die Organisation des lymphatischen Gewebes in der Lunge der
Kontrollkälber unterlag großen tierindividuellen Schwankungen und variierte zwischen den
Lungenlokalisationen. Die Menge an BALT und an lymphatischen Aggregaten unterschied
sich jedoch nicht signifikant zwischen den Spitzenlappen, Basislappen und accessorischen
Lungenlappen. In den Lungen der sechs Kontrollkälber war in unterschiedlicher Menge
organisiertes lymphatisches Gewebe (BALT) vorhanden. Signifikant häufiger lagen
Ansammlungen aus vorwiegend CD4+ T-Lymphozyten ohne Organisation vor, die als
Lobus cranialis
Lobus caudalis
Lobus accessorius
Ver
häl
tnis
CD
4:C
D8
Tiernummern der Kontrollkälber
83 ERGEBNISSE
lymphatische Aggregate zusammengefasst wurden. Der Median des BALT lag im gesunden
Lungengewebe bei 0,7 Anschnitte/cm².
BALT trat nahe der Bronchien und Bronchiolen auf. Das BALT war in der Mehrzahl, bei
62 %, mit Bronchien assoziiert (Abb. 22). Das Bronchus-assoziierte Lymphgewebe verteilte
sich überwiegend in der Lamina propria. Es durchbrach zum Teil die glatte Muskulatur und
dehnte sich bis in die Submukosa aus. Weiterhin lag es isoliert in der Submukosa vor. Nur
vereinzelt war BALT in unmittelbarer Nähe von Gefäßen lokalisiert. Bronchiolus-assoziiertes
Lymphgewebe lag isoliert in der Lamina propria, dehnte sich bis in die Submukosa aus,
grenzte an Gefäße oder verteilte sich in der Submukosa mit Kontakt zu angrenzenden
Gefäßen. Seltener lag es isoliert in der Submukosa.
Die lymphatischen Aggregate waren assoziiert mit Luftwegen, Interalveolarsepten und
Blutgefäßen oder grenzten an die interlobulären Interstitien (Abb. 23E,F). In der Wand der
Luftwege setzten sie sich aus CD4+ T-Lymphozyten und randständigen dendritischen Zellen
zusammen. Lymphatische Aggregate, die an das Interstitium und an die Blutgefäße grenzten
oder in den Interalveolarsepten vorlagen, bestanden hingegen ausschließlich aus CD4+ T-
Lymphozyten. Der Median der lymphatischen Aggregate lag im gesunden Lungengewebe bei
3,53 Anschnitte/cm². Im BALT war folgende Zellzusammensetzung zu finden: Die Follikel
waren homogen für MHC II (Abb. 22B) markiert. Dabei zeigte das Follikelzentrum eine
intensive retikuläre oder homogene diffuse Markierung für CC56 (Abb. 22A). Das
Follikelzentrum war zudem positiv für IgM und IgG1 (Abb. 22C,D). Weniger häufig war der
Lymphfollikel für IgA (Abb. 22E) markiert. Viele Makrophagen, einzelne IgM+
Plasmazellen, IgG1+ Plasmazellen und CD4+ T-Lymphozyten waren im Follikelzentrum
lokalisiert, wobei Plasmazellen gehäuft am Follikelrand zu beobachten waren (Abb. 22C,D,F;
Abb. 23A). Aktivierte CD25+ Zellen lagen in der epithelseitigen Hälfte des Follikels, die sich
mit schwacher Intensität netzwerkartig für CD25 markierte. Der parafollikuläre Bereich
bestand hauptsächlich aus CD4+ T-Lymphozyten (Abb. 23A), aus wenigen CD8+, γδ+ T-
Lymphozyten, Makrophagen und dendritischen Zellen (Abb. 22A,B,C,D). CD1b+
dendritische Zellen waren vorwiegend subepithelial angeordnet. Einzelne CD8+ und γδ+ T-
Lymphozyten und zum Teil intraepitheliale IgM+ Präzipitate waren im FAE vorhanden (Abb.
22C). Bei zwei Kälbern waren zum Teil viele IgG1+ Plasmazellen im Domebereich des
BALT zu finden (Tiere Nr. 5, 6).
ERGEBNISSE 84
Abb. 22: Darstellung der immunhistologischen Befunde von CC56, MHC II, IgM+, IgG1+
und IgA+ Plasmazellen und CD68+ Makrophagen im BALT bei den Kontrollkälbern.
Indirekte Immunperoxidase;
A, E konsekutive Kryostatschnitte von Tier Nr. 6, Lobus medius;
Eichstrich = 200 µm
B-D, F konsekutive Kryostatschnitte von Tier Nr. 5, Lobus medius;
Eichstrich = 500 µm
A: In den Lymphfollikeln (F) zeigt sich eine diffuse Markierung für CC56. CC56+
Einzelzellen (Pfeil, exemplarisch) sind in der Lp (Sterne) und im peribronchialen Interstitium
(I) zu sehen.
B: Das BALT ist homogen für MHC II markiert (Stern). Das Epithel des Bronchus zeigt eine
apikale MHC II+ Markierung. Zudem liegen viele MHC II+ Zellen in der Lp (Sterne) und im
peribronchialen Interstitium (I).
C: Im Lymphfollikel (F) ist eine netzwerkartige Markierung für IgM vorhanden. Im darüber
liegenden Epithel verteilen sich multifokal IgM+ Ablagerungen (Pfeilspitze, exemplarisch).
Viele IgM+ Plasmazellen (Pfeile, exemplarisch) verteilen sich in der Lp (Sterne) des
Bronchus.
D: Im Lymphfollikel (F) ist eine netzwerkartige Markierung für IgG1 vorhanden. Zusätzlich
liegen viele IgG1+ Plasmazellen im Domebereich (Pfeile, exemplarisch). Wenige IgG1+
Plasmazellen verteilen sich weiterhin in der Lp (Sterne) des Bronchus (Pfeilspitzen,
exemplarisch).
E: Im Lymphfollikel (F) ist eine netzwerkartige Markierung für IgA vorhanden. Das
Bronchialepithel ist positiv für IgA. Wenige IgA+ Plasmazellen (Pfeilspitzen weiß,
exemplarisch) befinden sich in der Lp (Sterne) und im peribronchialen Interstitium (I).
F: Im Lymphfollikel (F) verteilen sich gleichmäßig sehr viele Makrophagen. Viele
Makrophagen (Pfeile, exemplarisch) liegen in der Lp (Sterne) des Bronchus.
85 ERGEBNISSE
ERGEBNISSE 86
Abb. 23: Darstellung der immunhistologischen Befunde von CD4+, CD8+ und γδ+ T-Zellen
und CD1b+ dendritischen Zellen im BALT und Darstellung immunhistologischer Befunde
von nicht organisierten lymphatischen Aggregaten (E-F) bei den Kontrollkälbern.
Indirekte Immunperoxidase an Kryostatschnitten;
A, B konsekutive Kryostatschnitte von Tier Nr. 6, Lobus medius;
Eichstrich = 200 µm
C, D konsekutive Kryostatschnitte von Tier Nr. 5, Lobus medius;
Eichstrich = 500 µm
A: Sehr viele CD4+ T-Zellen sind in der Peripherie des Lymphfollikels (F) angeordnet
(Pfeile, exemplarisch). In der Lp (Sterne) befinden sich viele CD4+ T-Zellen (Pfeilspitze,
exemplarisch).
B: Wenige CD8+ T-Zellen liegen im parafollikulären Bereich des BALT (Pfeile,
exemplarisch). In der Lp (Sterne) und vermehrt im peribronchiolären Interstitium (I) befinden
sich CD8+ T-Zellen.
C: Wenige γδ+ T-Zellen sind parafollikulär angeordnet (Pfeile, exemplarisch). Viele γδ+ T-
Zellen sind in der Lp (Sterne) des Bronchus verteilt (Pfeilspitze, exemplarisch).
D: Wenige CD1b+ dendritische Zellen sind parafollikulär angeordnet (Pfeile, exemplarisch).
Zudem sind viele CD1b+ dendritische Zellen in der Lp (Sterne) des Bronchus verteilt
(Pfeilspitze, exemplarisch).
E: CD4+ T-Zellen liegen als Ansammlung (Stern) fokal in der Wand (Lp) eines Bronchus.
Ein Teil des Aggregates liegt im peribronchialen Interstitium (Sterne, exemplarisch).
Indirekte Immunperoxidase am Kryostatschnitt von Tier Nr. 4, Lobus cranialis sinister, pars
caudalis; Eichstrich = 200 µm
F: CD4+ T-Zellen liegen fokal als Ansammlung (Stern) im Interalveolarseptum (IAS). Sehr
viele CD4+ T-Zellen verteilen sich im umliegenden Lungengewebe.
Indirekte Immunperoxidase am Kryostatschnitt von Tier Nr. 5, Lobus cranialis sinister pars
cranialis; Eichstrich = 200 µm
87 ERGEBNISSE
ERGEBNISSE 88
4.1.1.4 Trachea
Die untersuchten Zelltypen waren vorwiegend im respiratorischen Epithel und in der Lamina
propria mucosae zu finden- Sie lagen hauptsächlich entlang der Basalmembran.
Respiratorisches Epithel
Das apikale Zytoplasma und der Ziliarsaum des respiratorischen Epithels war schwach positiv
für MHC II und unterschiedlich intensiv für IgA markiert. Bei Tier Nr. 2 war das apikale
Zytoplasma zudem schwach für IgM markiert. Einzelne CD8+ und γδ+ T-Zellen verteilten
sich zwischen den Epithelzellen. Bei Tier Nr. (1) lagen CD8+ T-Zellen vermehrt und
teilweise als kleine Ansammlungen im Epithel. Einzelne intraepitheliale CD1b+ dendritische
Zellausläufer waren zu beobachten.
Lamina propria
Wenige IgA+ Plasmazellen waren entlang der Basalmembran ungleichmäßig angeordnet.
Zum Teil waren einzelne IgM+ B-Lymphozyten zu sehen (Tiere Nr. 2, 3). Die Lp markierte
sich ungleichmäßig diffus für IgG1 und war basal des Epithels besonders intensiv gefärbt.
IgG1+ Plasmazellen wurden nicht gefunden. Viele MHC II+ Zellausläufer und runde Zellen
ordneten sich kontinuierlich basal des Epithels an. Einzelne Makrophagen waren multifokal
und wenige CD1b+ dendritische Zellen gleichmäßig basal des Epithels angeordnet. In der
Mehrzahl waren unterschiedlich dichte Ansammlungen aus CD1b+ dendritischen Zellen fokal
oder multifokal zu sehen. Wenige CD4+, CD8+ und γδ+ T-Lymphozyten waren überwiegend
gleichmäßig entlang der Basalmembran vorhanden. Bei einem Kalb lagen einzelne aktivierte
CD25+ Zellen basal des Epithels (Tier Nr. 5). Einzelne neutrophile Granulozyten lagen
mitunter subepithelial oder im Lumen kleiner Gefäße. Das apikale Zytoplasma des
Trachealdrüsenepithels färbte sich homogen für IgA und schwach für MHC II. Zusätzlich
waren einzelne MHC II+ Zellen und CD8+ T-Zellen um die Trachealdrüsen verteilt.
4.1.1.5 Tonsilla pharyngea
Die Tonsille enthielt zahlreiche Lymphfollikel, die von einer breiten Interfollikularzone
umgeben waren. Der Bereich zwischen Lymphfollikel und Epithel der Tonsillarkrypte wird
als subepithelialer Bereich bezeichnet. Im Epithel ließen sich Abschnitte mit Follikel-
assoziiertem Epithel (FAE) unterscheiden.
89 ERGEBNISSE
Lymphfollikel
Die Läppchen der Tonsilla pharyngea wiesen bei allen Kontrollkälbern kleine, runde und
große ovale Follikel auf. Diese markierten sich homogen braun für MHC II und ließen sich
gut von der Interfollikularzone abgrenzen. Die Lymphfollikel markierten sich netzwerkartig
für IgM, IgG1 und schwach für IgA. In den Follikeln wurden bei drei Kälbern (Tiere Nr. 2, 4,
5) einzelne IgM+, bei drei Kälbern (Tiere Nr. 3, 5, 6) einzelne IgG1+ und bei einem Kalb
(Tier Nr. 3) einzelne IgA+ Plasmazellen gefunden. Viele CD4+ und wenige CD8+ und γδ+ T-
Zellen waren in den Follikeln verteilt. Der Follikel markierte sich schwach netzwerkartig für
CD25. Die Follikel waren gleichmäßig von vielen Makrophagen durchsetzt.
Interfollikularzone (IFZ)
In der IFZ waren sehr viele runde, polygonale und MHC II+ Zytoplasmaausläufer verteilt, die
sich überwiegend granulär markierten. Die IFZ bestand aus massenhaft CD4+ und CD8+ T-
Zellen, die eng nebeneinander lagen. Weniger γδ+ T-Zellen waren ungleichmäßig verteilt. Bei
Tier Nr. (6) ließen sich multifokale Ansammlungen aus γδ+ T-Zellen beobachten. Die
Markierung der Lymphfollikel für CD25 dehnte sich mitunter auf den interfollikulären
Bereich aus. Mit Ausnahme zweier Tiere, die viele aktivierte CD25+ Zellen aufwiesen (Tiere
Nr. 2, 5), waren wenige CD25+ runde Einzelzellen unregelmäßig um die Follikel verteilt.
Multifokal waren viele kleine Makrophagen in der IFZ nachweisbar. Viele CD1b+
dendritische Zellen waren peripher der Follikel meist gleichmäßig und nur selten in
Zellgruppen angeordnet. Mitunter säumten CD1b+ dendritische Zellen die Lymphfollikel
(Tiere Nr. 3, 6). Zwischen den Follikeln waren ungleichmäßig viele IgM+ B-Lymphozyten
verteilt. Nur vereinzelt lagen Plasmazellen und neutrophile Granulozyten im interfollikulären
Bereich.
Subepithelialer Bereich
Die Mehrzahl der Zellen im subepithelialen Bereich war MHC II+. Dabei handelte es sich um
runde oder polygonale Zellen und um Zytoplasmaausläufer. Multifokal waren MHC II+
Zellaggregate vorhanden. Viele IgM+ und IgG1+ B-Lymphozyten und Plasmazellen und
viele γδ+ T-Lymphozyten waren in der epithelnahen Interfollikularzone überwiegend
gleichmäßig verteilt. γδ+ T-Lymphozyten waren in einer oder in mehreren Lagen aufgereiht.
Bei zwei der sechs Kontrollkälber waren weniger γδ+ T-Zellen nachweisbar (Tiere Nr. 1, 6).
ERGEBNISSE 90
Wenige CD1b+ dendritische Zellen und wenige kleine Makrophagen waren unregelmäßig
subepithelial verteilt. Im Vergleich zum angrenzenden interfollikulären Bereich war die
Anzahl der CD4+ T-Zellen und CD8+ T-Zellen im subepithelialen Bereich geringer. In der
Mehrzahl der Kontrollkälber waren wenige IgA+ Plasmazellen subepithelial verteilt. Bei Tier
Nr. (3) waren viele IgA+ Plasmazellen vorhanden.
Epithel
Das apikale Zytoplasma des Tonsillarepithels war positiv für MHC II und IgA und schwach
positiv für IgM. Regelmäßig waren IgM+ Präzipitate im Zytoplasma der Epithelzellen zu
sehen. Einzelne IgG1+ Plasmazellen lagen bei einem Kalb zwischen den Epithelzellen
(Tier Nr. 5). Im Tonsillarepithel waren einzelne kleine, runde MHC II+ Zellen oder MHC II+
Zytoplasmaausläufer zu sehen. Im Epithel waren wenige CD8+ T-Zellen, einzelne γδ+ T-
Lymphozyten und CD1b+ dendritische Zellen zwischen den Epithelzellen nachweisbar. Das
FAE ließ sich durch die Ansammlung von MHC II+ Zellen vom restlichen Tonsillarepithel
abgrenzen. Im FAE waren im Vergleich zum übrigen Tonsillarepithel vermehrt CD4+ und
CD8+ T-Zellen zu sehen.
4.1.1.6 Nl. mediastinalis
Der Lymphknoten lässt sich morphologisch in Cortex, Paracortex und Medulla unterteilen.
Cortex
Der Cortex des Lymphknotens enthielt zahlreiche Lymphfollikel, die sich homogen für
MHC II markierten und dadurch gut abzugrenzen waren. Die Lymphfollikel bestanden aus
IgM+ B-Lymphozyten und markierten sich am Übergang zum Keimzentrum netzwerkartig
für IgM. Bei Tier Nr. 5 war das Keimzentrum lediglich schwach für IgM markiert. Die
Follikel zeigten, mit einer Ausnahme (Tier Nr. 5) in der Mehrzahl eine retikuläre Markierung
für IgA und IgG1. Die Lymphfollikel wurden von wenigen Makrophagen durchzogen.
Überwiegend waren wenige CD4+ T-Zellen und einzelne CD8+ T-Zellen innerhalb der
Lymphfollikel nachweisbar. Die Follikel waren bei Tier Nr. 5 randständig für CD25 markiert.
Paracortex
Der Paracortex wies eine netzwerkartige Markierung für MHC II auf. Sehr viele bis
massenhaft CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten verteilten sich überwiegend dicht gedrängt im
91 ERGEBNISSE
Paracortex. Zwischen Follikel und Kapsel lagen sie weniger zahlreich vor. Viele
γδ+ T-Lymphozyten waren überwiegend gleichmäßig entlang der Intermediärsinusoide
vorhanden. Der Paracortex wies eine schwache netzwerkartige Markierung für CD25 auf und
enthielt in der Mehrzahl einzelne CD25+ Zellen. Bei zwei Kälbern (Tiere Nr. 5, 6) waren
wenige CD25+ Zellen diffus verteilt, oder multifokal gehäuft. Wenige bis viele IgM+
Plasmazellen und einzelne IgA+ und IgG1+ Plasmazellen ließen sich im Paracortex
nachweisen. Viele CD1b+ dendritische Zellen waren gleichmäßig um die Follikel lokalisiert
und dominierten entlang der Sinusoide. Ansammlungen aus CD1b+ DC waren als
netzförmige Markierung sichtbar. Im parafollikulären Bereich waren einzelne Makrophagen
sichtbar.
Medulla
Entlang der Markstränge waren sehr viele MHC II+ Zellen verteilt, darunter polygonale
Zellen und Zellen mit Zytoplasmaausläufern, die unregelmäßig dicht beieinander lagen.
Wenige CD1b+ dendritische Zellen und viele bis sehr viele Makrophagen waren in den
Marksträngen zu finden. Weiterhin lagen viele CD4+ und CD8+ T-Zellen vor, die sich im
Vergleich zum Paracortex weniger dicht aneinander reihten. Bei zwei Tieren waren
multifokale Zellansammlungen aus CD4+ und CD8+ T-Zellen zu beobachten (Tiere Nr. 2, 5).
Die Anzahl der γδ+ T-Lymphozyten variierte zwischen den Kontrollkälbern von wenigen
(Tiere Nr. 1, 2) bis sehr vielen Zellen (Tier Nr. 5). Wenige Zellen mit Aktivierungsmarker
CD25 waren bei einem Tier zu beobachten (Tier Nr. 5). Die Markstränge waren diffus oder
granulär für IgA und schwach für IgM markiert. Viele bis sehr viele IgM+ Plasmazellen
verteilten sich diffus oder häuften sich multifokal. Wenige IgG1+ und einzelne IgA+
Plasmazellen waren zu sehen.
ERGEBNISSE 92
4.1.2 Kälber inokuliert mit C. psittaci
Im Folgenden werden Befunde an Lunge, regionärem Lymphknoten und Tonsille an den
Tagen 2, 3, 4, 7, 10, 14 und 35/37 pi dargestellt. Hierbei wird schwerpunktmäßig auf Befunde
eingegangen, die sich von denen der Kontrolltiere unterscheiden. Neben den
Leukozytensubpopulationen wird, um den Bezug zwischen Pathogen (C. psittaci) und
Wirtsantwort (Leukozytensubpopulationen) darstellen zu können, die Verteilung von
C. psittaci beschrieben. Befunde, die das BALT betreffen, sind separat in Kap. 4.1.2.7
dokumentiert.
4.1.2.1 Semiquantitative Auswertung von C. psittaci
Bei den Kälbern der Infektionsgruppe waren während des gesamten Versuchszeitraums
Chlamydieneinschlüsse in den Lungen darstellbar, wobei je nach Untersuchungszeitpunkt und
je nach Lungenlokalisation die Menge an Chlamydien variierte. Bei der Auswertung wurde
das Lungenläppchen des Gefrierschnittes berücksichtigt, in dem die meisten Chlamydien
nachweisbar waren. Die Beurteilung der Erregermenge erfolgte semiquantitativ in keine,
wenige, viele und sehr viele Chlamydieneinschlüsse (Abb. 24).
Die Auswertung des semiquantitativen Nachweises von C. psittaci ist vergleichend für die
drei untersuchten Lungenlokalisationen in Abb. 25 dargestellt. Bereits am Tag 2 pi konnten
sehr viele Chlamydien im Spitzenlappen und Basislappen nachgewiesen werden. Bis Tag
10 pi waren in den veränderten Bereichen von Spitzenlappen, Basislappen und
accessorischem Lungenlappen viele bis sehr viele Chlamydien vorhanden. Am Tag 14 pi
waren überwiegend nur noch viele Chlamydien verteilt. Am Tag 35/37 pi hingegen konnten
nur noch wenige Chlamydieneinschlüsse im Basislappen eines Kalbes nachgewiesen werden
(Tier Nr. 26). Im Spitzenlappen und im accessorischen Lungenlappen wurden keine
Chlamydien gefunden. Zwischen den untersuchten Lungenlokalisationen lagen je nach
Zeitpunkt keine deutlichen Unterschiede in der Menge an Chlamydien vor.
93 ERGEBNISSE
Abb. 24: Unterschiedliche Menge von Chlamydien im Lungengewebe
Indirekte Immunperoxidase am Kryostatschnitt; Eichstrich = 200 µm
A: Wenige Chlamydieneinschlüsse am Tag
2 pi.
Tier Nr. 10, Lobus cranialis sinister pars
caudalis;
B: Viele Chlamydieneinschlüsse am Tag 7 pi.
Tier Nr. 19, Lobus accessorius;
C: Sehr viele Chlamydieneinschlüsse am Tag
4 pi.
Tier Nr. 15, Lobus cranialis dexter pars
caudalis;
ERGEBNISSE 94
Abb. 25: Verteilung der semiquantitativ erhobenen Menge an Chlamydien in den
verschiedenen Lungenlappen nach der Inokulation mit C. psittaci: Score 0 – keine / Score 1 –
wenige / Score 2 - viele und Score 3 – sehr viele Chlamydieneinschlüsse nachweisbar.
Boxplots zeigen Median, 25. und 75. Perzentil (Box)
95 ERGEBNISSE
4.1.2.2 Verteilung und Menge der Leukozytensubtypen und Chlamydien in der Lunge
am Tag 2 pi
Lungenveränderungen und Verteilung von C. psittaci
Am Tag 2 pi zeigten die Lungenlokalisationen in der Mehrzahl herdförmige bis diffuse eitrig-
fibrinöse Bronchopneumonien (Abb. 26A). Der accessorische Lungenlappen eines Kalbes
war histologisch unverändert (Tier Nr. 8). Die Gefrierschnitte enthielten mitunter
unveränderte Läppchen (Tiere Nr. 9, 10). Multifokal war proteinreiches Exsudat peripher von
kleinen Blutgefäßen und in den Interalveolarsepten und Alveolarlumina zu beobachten. Die
Adventitia der Gefäße war verbreitert, enthielt eine eosinophile, aufgelockerte Masse und
unterschiedliche Mengen an Entzündungszellen. Im veränderten Spitzenlappen und im
veränderten Basislappen von Tier Nr. 8 waren zudem multifokal kleine strukturlose Herde zu
beobachten, die sich verstärkt eosinophil anfärbten. Bei zwei Kälbern waren viele
Chlamydieneinschlüsse und bei einem Kalb wenige Chlamydien (Abb. 24A) nachweisbar. In
der unveränderten Lokalisation waren keine Chlamydieneinschlüsse nachgewiesen werden.
Sie verteilten sich überwiegend multifokal im Läppchen. Mehrfach wurden im Exsudat von
Bronchiolen und fokal im Exsudat eines Bronchus (Tier Nr. 10) Chlamydieneinschlüsse
gefunden, die nicht epithelassoziiert waren. Die Morphologie der Chlamydieneinschlüsse
variierte. Am Tag 2 pi waren meist granuläre Erregerstrukturen sichtbar, die mit neutrophilen
Granulozyten und Alveolarmakrophagen assoziiert waren. Im Spitzenlappen und Basislappen
von Tier Nr. 8, im Basislappen von Tier Nr. 9 und im Spitzenlappen von Tier Nr. 10 waren
vereinzelt spindelförmige Markierungen in Alveolarepithelzellen zu sehen (Abb. 26B).
Alveolen und Interalveolarsepten
In den Alveolen waren massenhaft neutrophile Granulozyten (Abb. 26A), wenige MHC II+
Alveolarmakrophagen, wenige CD4+, CD8+, γδ+ T-Zellen und einzelne aktivierte CD25+
Zellen verteilt. Die Alveolen waren inhomogen zellulär infiltriert, sodass sich multifokale
Bereiche diffus für MHC II markierten. In den weniger zelldichten Bereichen waren MHC II+
polygonale Zellen mit breitem Zytoplasma von MHC II- neutrophilen Granulozyten
abgrenzbar. Fokal lagen sie in Zellgruppen in der Umgebung eines kleinen Gefäßes vor
(Tier Nr. 8A). Einzelne CD1b+ Zellen wiesen ein schaumiges Zytoplasma auf.
ERGEBNISSE 96
Die verbreiterten Interalveolarsepten markierten sich für MHC II und enthielten weniger
interstitielle und intravaskuläre Makrophagen als bei den Kontrollkälbern (Abb. 26C), aber
viele neutrophile Granulozyten. Im Vergleich zu den Kontrollkälbern waren im veränderten
Lungengewebe weniger CD4+ (Abb. 26E), CD8+, γδ+ T-Lymphozyten vorhanden. Die T-
Zellen waren ungleichmäßig verteilt. Abweichend von den Kontrolltieren waren einzelne
aktivierte CD25+ Zellen zu beobachten (Abb. 26F). Eine Hintergrundfärbung durch den
monoklonalen Antikörper CC63 lag in den veränderten Bereichen nicht vor. CD1b+
dendritische Zellen waren in ihrer Anzahl stark vermindert und markierten sich nur vereinzelt
in den Alveolarsepten (Abb. 26D). Einzelne IgA+ Plasmazellen waren entsprechend der
Kontrollen verteilt. Die Interalveolarsepten waren weiterhin diffus für IgG1 markiert.
Bronchien und Bronchiolen
Die Bronchial- und Bronchiolarlumina waren mit variablen Mengen an neutrophilen
Granulozyten gefüllt (Abb. 27A) und enthielten nur vereinzelt polygonale MHC II+ Zellen
(Abb. 27B). Zum Teil war das Exsudat granulär für IgA (Abb. 27E) markiert. Das
Zytoplasma des Epithels vorwiegend großer Bronchiolen markierte sich diffus für MHC II.
Vor allem abgeflachte Bronchiolarepithelzellen waren zudem diffus für IgA markiert, wobei
dem geschädigten Epithel eine durchgehende IgA+ Markierung fehlte. Einzelne neutrophile
Granulozyten waren regelmäßig im Bronchial- und Bronchiolarepithel zu sehen (Abb. 27A).
Im Gegensatz zu den Kontrollen waren in der Lp von Bronchien und Bronchiolen weniger
CD1b+ dendritische Zellen und Makrophagen verteilt. MHC II+ Zellen und CD4+ (Abb.
27C), CD8+ und γδ+ T-Zellen verteilten sich in der Lp entsprechend der Kontrollen und
waren vermehrt peribronchial bzw. peribronchiolär unterhalb der LMM bzw. TM zu
beobachten. Zudem umrandeten viele IgA+ Plasmazellen die Bronchien und zum Teil die
Bronchiolen. Wenige bis viele aktivierte CD25+ Einzelzellen waren in der Lp und vermehrt
peribronchiolär locker aneinander gereiht (Abb. 27D). Stark geschädigte Bronchiolen wiesen
weniger oder keine T-Lymphozyten oder Plasmazellen (Abb. 27F) auf.
97 ERGEBNISSE
Blutgefäße
Am Gefäßendothel hafteten wenige überwiegend runde MHC II+ Zellen. Zum Teil waren
wenige IgA+ und einzelne IgM+ Plasmazellen in den Gefäßwänden verteilt (Tiere Nr. 8, 9).
Im Unterschied zu den Kontrollen waren viele bis sehr viele MHC II+ polygonale Zellen und
Zellen mit Zytoplasmaausläufern in den Wänden großer Gefäße sichtbar. Ein Teil der MHC
II+ Zellen ließ sich als Makrophagen identifizieren. Die MHC II+ Zellen waren überwiegend
negativ für CD1b. Arteriolen in den Lungenveränderungen waren teilweise von vielen CD4+,
CD8+, γδ+ T-Zellen und CD25+ Zellen umgeben (Abb. 28C). Wenige IgA+ Plasmazellen
umgaben in den Lungenveränderungen größere Gefäße (Abb. 28D). Perivaskuläres Exsudat
war fibrindurchtränkt und diffus für IgG1 markiert (Abb. 28A,B).
Interlobuläre Interstitien
Die interlobulären Interstitien waren durch ein proteinreiches IgG1+ Exsudat verbreitert und
enthielten multifokal Ansammlungen aus Entzündungszellen. Sehr viele überwiegend
polygonale MHC II+ Zellen verteilten sich gleichmäßig in den interlobulären Interstitien. Nur
vereinzelt waren CD68+ Makrophagen oder CD1b+ dendritische Zellen nachweisbar. In den
Fibrinansammlungen lagen multifokale Ansammlungen aus CD4+, CD8+ und γδ+ T-
Lymphozyten. Bei allen drei Kälbern lagen wenige und fokal bis multifokal viele kleine runde
CD25+ Zellen vor.
ERGEBNISSE 98
Abb. 26: Darstellung der histologischen Befunde und immunhistologischen Befunde von
Chlamydiaceae-LPS, Makrophagen, CD1b+ dendritischen Zellen, CD4+ T-Zellen und
CD25+ Zellen im luftaustauschenden System des veränderten Lungengewebes am Tag 2 pi.
A HE-Färbung am Kryostatschnitt;
B-F indirekte Immunperoxidase am Kryostatschnitt;
A: In den Alveolen (A) befinden sich massenhaft neutrophile Granulozyten.
Tier Nr. 10, Lobus cranialis pars caudalis; Eichstrich = 200 µm
B: Chlamydiale Einschlüsse sind in Alveolarepithelzellen (Pfeilspitze, exemplarisch) und im
alveolären Exsudat (Pfeile, exemplarisch) zu sehen.
Tier Nr. 10, Lobus cranialis sinister pars caudalis; Eichstrich = 100 µm
C: Die Anzahl an interstitiellen und intravaskulären Makrophagen (Pfeile, exemplarisch) ist
in der pneumonisch veränderten Lunge herabgesetzt. Einzelne Alveolarmakrophagen
(Pfeilspitzen, exemplarisch) sind in den Alveolen (A) zu unterscheiden.
Tier Nr. 10, Lobus cranialis sinister pars caudalis; Eichstrich = 200 µm
D: In den Interalveolarsepten ist lediglich eine einzelne CD1b+ dendritische Zelle
(Pfeilspitze) zu sehen.
Tier Nr. 10, Lobus cranialis sinister pars caudalis; Eichstrich = 200 µm
E: Die Anzahl an CD4+ T-Lymphozyten ist in den Interalveolarsepten der pneumonisch
veränderten Lunge vermindert (Pfeile, exemplarisch).
Tier Nr. 10, Lobus cranialis sinister pars caudalis; Eichstrich = 200 µm
F: Viele CD25+ Zellen (Pfeile, exemplarisch) verteilen sich diffus in der veränderten Lunge.
Tier Nr. 10, Lobus cranialis sinister pars caudalis; Eichstrich = 200 µm
99 ERGEBNISSE
ERGEBNISSE 100
Abb. 27: Darstellung der histologischen Befunde und der immunhistologischen Befunde von
MHC II+, CD4+ T-Zellen, CD25+ Zellen und IgA+ Plasmazellen im luftleitenden System des
veränderten Lungengewebes am Tag 2 pi.
A HE-Färbung am Kryostatschnitt;
B-F indirekte Immunperoxidase am Kryostatschnitt;
A: Zahlreiche neutrophile Granulozyten (Sterne, exemplarisch) liegen im Lumen und Epithel
(Pfeile, exemplarisch) eines Bronchus (B).
Tier Nr. 8, Lobus cranialis sinister pars caudalis; Eichstrich = 100 µm
B: Sehr viele MHC II+ Zellen verteilen sich in der Lp (Lp) und im peribronchialen
Interstitium (I). Das Exsudat im Lumen des Bronchus besteht aus MHC II+ Zellen und
neutrophilen Granulozyten (Stern).
Tier Nr. 10, Lobus cranialis sinister pars caudalis; Eichstrich = 200 µm
C: Sehr viele CD4+ T-Zellen (Pfeile, exemplarisch) verteilen sich gleichmäßig im
peribronchiolären Interstitium (I). Wenige sind weiterhin diffus in der Lp (Stern) verteilt.
Tier Nr. 10, Lobus cranialis sinister pars caudalis; Eichstrich = 200 µm
D: Viele aktivierte CD25+ T-Zellen (Pfeile, exemplarisch) verteilen sich gleichmäßig im
peribronchiolären Interstitium (I). Wenige CD25+ Zellen verteilen sich gleichmäßig in der Lp
(Stern).
Tier Nr. 8, Lobus cranialis sinister pars caudalis; Eichstrich = 200 µm
E: Das Epithel eines Bronchiolus (Br) markiert sich diffus für IgA. Viele IgA+ Plasmazellen
(Pfeile, exemplarisch) sind im umliegenden Interstitium (I) verteilt.
Tier Nr. 8, Lobus cranialis sinister pars caudalis; Eichstrich = 200 µm
F: Die Schädigung des Epithels eines Bronchiolus (Br) bedingt den Verlust der IgA+
Markierung (schmale Pfeile, exemplarisch). Abgeflachte Epithelzellen markieren sich diffus
für IgA (Pfeilspitzen, exemplarisch). Vereinzelt sind IgA+ Plasmazellen sichtbar (dicke
Pfeile, exemplarisch).
Tier Nr. 8, Lobus cranialis sinister pars caudalis; Eichstrich = 200 µm
101 ERGEBNISSE
ERGEBNISSE 102
Abb. 28: Darstellung der histologischen Befunde und der immunhistologischen Befunde von
IgG1+, CD25+ Zellen und IgA+ Plasmazellen an den Blutgefäßen des veränderten
Lungengewebes am Tag 2 pi.
A HE-Färbung am Kryostatschnitt;
B-D indirekte Immunperoxidase am Kryostatschnitt;
A: Das perivaskuläre Bindegewebe und die Interalveolarsepten sind mit Fibrin durchsetzt.
Neutrophile Granulozyten befinden sich im Gefäßlumen (Stern) und in den
Interalveolarsepten (Sterne).
Tier Nr. 10, Lobus cranialis sinister pars caudalis; Eichstrich = 100 µm
B: Das perivaskuläre Bindegewebe markiert sich intensiv für IgG1 (Stern).
Tier Nr. 10, Lobus cranialis sinister pars cranialis; Eichstrich = 200 µm
C: Viele CD25+ Zellen (Pfeilspitzen, exemplarisch) umgeben eine Arteriole (G). Einzelne
aktivierte Zellen (Pfeile, exemplarisch) verteilen sich in den umliegenden Alveolen (A).
Tier Nr. 8, Lobus cranialis sinister pars cranialis; Eichstrich = 100 µm
D: IgA+ Plasmazellen (Pfeil, exemplarisch) liegen in den Gefäßwänden und verteilen sich
vereinzelt (Pfeilspitze, exemplarisch) in umliegenden Alveolen (A).
Tier Nr. 8, Lobus cranialis sinister pars cranialis; Eichstrich = 200 µm
103 ERGEBNISSE
ERGEBNISSE 104
4.1.2.3 Verteilung und Menge der Leukozytensubtypen und von Chlamydien in der
Lunge am Tag 3 und 4 pi
Lungenveränderungen und Verteilung von C. psittaci
An den Tagen 3 und 4 pi zeigte sich in der Mehrzahl der Lungenschnitte eine hochgradige
akute fibrinös-eitrige Bronchopneumonie mit Nekroseherden. Aufgrund der
übereinstimmenden histopathologischen Veränderungen wurden die Befunde beider
Zeitpunkte zusammengefasst. Die veränderten Lungen wiesen zum Teil herdförmige
strukturlose Areale auf, die sich verstärkt eosinophil anfärbten und in denen nur vereinzelt
Zytokeratinfilamente und desquamierte Alveolarepithelzellen nachweisbar waren (Abb. 29A).
Diese Areale traten multifokal auf und wurden als Nekrosen angesprochen. Betroffen waren
Interalveolarsepten, Bronchiolen und kleine Gefäße. Multifokal waren die Lumina kleiner
Gefäße bindegewebig verschlossen. Sämtliche umliegende Alveolen, Bronchiolen und
Bronchien enthielten viele Entzündungszellen und Ödemflüssigkeit. Die interlobulären
Interstitien waren hochgradig verbreitert und enthielten dilatierte Lymphgefäße mit
Fibrinthromben. In einzelnen Lungenlokalisationen waren keine Nekrosen enthalten (Tiere
Nr. 12, 15). Zu diesem Zeitpunkt konnten Chlamydien in allen Lungenlokalisationen
nachgewiesen werden (Abb. 25). In solchen Läppchen, in denen der Erreger massenhaft
nachgewiesen wurde, verteilten sich die Chlamydieneinschlüsse diffus im luftaustauschenden
Parenchym und begrenzt vom interlobulären Bindegewebe (Abb. 24C). Betroffen waren die
Spitzenlappen aller Tiere und zum Teil die Basislappen (Tiere Nr. 14, 16) und accessorischen
Lungenlappen (Abb. 29B; Tiere Nr. 11, 12, 13, 16). Wurden geringere Mengen an
Chlamydieneinschlüssen beobachtet, waren sie entsprechend Tag 2 pi multifokal im
Läppchen verteilt. Regelmäßig waren mit Chlamydien infizierte Zellen im Exsudat von
untergehenden Bronchiolen verteilt. Bei zwei Tieren wurden einzelne mit Chlamydien
infizierte Zellen im Blutgefäß beobachtet (Tiere Nr. 11, 12). Die Zellen hafteten am
Gefäßendothel und enthielten einen großen, runden Einschluss. Die Chlamydieneinschlüsse
waren entsprechend Tag 2 pi mit neutrophilen Granulozyten, Alveolarmakrophagen und
untergehendem Gewebe assoziiert. In einem Teil der Lungenschnitte konnten einzelne
spindelförmige Chlamydieneinschlüsse in Alveolarepithelzellen nachgewiesen werden (Tiere
Nr. 11, 13, 15). Neben granulären Strukturen waren vermehrt größere, runde Markierungen
(> 3µm) vorhanden, die das Zytoplasma der infizierten Zellen ausfüllten.
105 ERGEBNISSE
Alveolen und Interalveolarsepten
Die Alveolen peripher der Nekrosen waren heterogen zellulär infiltriert. Das Exsudat bestand
zunehmend aus MHC II+ Alveolarmakrophagen (Abb. 29E). Besonders die Alveolen, die an
das Interstitium oder an Blutgefäße grenzten, waren vollständig von Makrophagen infiltriert
und diffus für MHC II markiert (Tier Nr. 11). Einzeln liegende Alveolarmakrophagen waren
intensiv für MHC II markiert. Zum Teil waren entsprechend 2 dpi wenige überwiegend
kleine, runde CD25+ Zellen diffus im Alveolarlumen verteilt (Abb. 29C). Fokal war eine
Vielzahl an aktivierten CD25+ Zellen zu beobachten (Abb. 29D, Tier Nr. 16). Multifokal
waren homogene IgA+, IgM+ und IgG1+ Reaktionsprodukte und nur wenige IgA+ und
einzelne IgM+ Plasmazellen zu sehen. Wenige CD1b+ dendritische Zellen waren teilweise in
eitrig-fibrinösem Exsudat ungleichmäßig peripher von Nekrosen verteilt (Tier Nr. 14). In den
verbreiterten Interalveolarsepten waren weiterhin weniger interstitielle und intravaskuläre
Makrophagen und CD1b+ dendritische Zellen als bei den Kontrollen zu beobachten. Wenige
CD4+, CD8+ und γδ+ Zellen waren nachweisbar, darunter einzelne aktivierte CD25+ Zellen.
Die Nekrosebereiche enthielten untergehende neutrophile Granulozyten. Zudem waren sie
diffus für MHC II markiert. CD4+, CD8+ und γδ+ Zellen, darunter aktivierte CD25+ Zellen
lagen nur vereinzelt vor. In den Nekrosen waren keine CD1b+ dendritischen Zellen enthalten.
ERGEBNISSE 106
Abb. 29: Darstellung immunhistologischer Befunde von Zytokeratin, Chlamydiaceae-LPS,
CD25+ Zellen und Makrophagen im luftaustauschenden System des veränderten
Lungengewebes an den Tagen 3 und 4 pi.
Indirekte Immunperoxidase am Kryostatschnitt;
A: Die Schädigung an Bronchiolarepithelzellen (Pfeilspitzen, exemplarisch) und
Alveolarepithelzellen (Pfeile, exemplarisch) wird durch die Zytokeratinmarkierung deutlich.
Dabei lösen sich kuboidale Epithelzellen aus dem Verband.
Tier Nr. 11, Lobus cranialis sinister pars caudalis; Eichstrich = 200 µm
B: Im Exsudat der Alveolen (A) verteilen sich zunehmend Chlamydieneinschlüsse in
unterschiedlicher Morphologie.
Tier Nr. 16, Lobus cranialis sinister pars cranialis; Eichstrich = 200 µm
C: Wenige aktivierte CD25+ Zellen (Pfeile, exemplarisch) verteilen sich diffus im
veränderten Lungengewebe.
Indirekte Immunperoxidase am Kryostatschnitt, Tier Nr. 11, Lobus cranialis sinister, pars
caudalis; Eichstrich = 500 µm
D: Bei einem Tier sind sehr viele aktivierte CD25+ Zellen (Pfeile, exemplarisch) in den
Alveolen vorhanden.
Tier Nr. 16, Lobus accessorius; Eichstrich = 200 µm
E: Alveolarmakrophagen (Pfeilspitzen, exemplarisch) liegen in zunehmender Anzahl in den
Alveolen (A).
Tier Nr. 11, Lobus cranialis sinister pars caudalis; Eichstrich = 100 µm
107 ERGEBNISSE
ERGEBNISSE 108
Bronchien und Bronchiolen
Das Lumen von Bronchien und häufiger von Bronchiolen war multifokal verlegt. Das
Exsudat bestand aus neutrophilen Granulozyten und aus variablen Mengen an MHC II+
Zellen (Abb. 30A). Fokal waren überwiegend MHC II+ Makrophagen enthalten (Tier Nr. 11).
Waren wenige MHC II+ Makrophagen im Exsudat enthalten, verteilten sie sich meist
randständig im Exsudat. Dabei bildeten Alveolarmakrophagen einen großen Anteil (Abb.
30B). Zum Teil wurde das Exsudat von einzelnen CD1b+ dendritischen Zellen umhüllt (Abb.
30C). Das Exsudat markierte sich zum Teil diffus für IgA oder enthielt IgA+ Präzipitate
(Abb. 30D). Zum Teil waren im Lumen von defekten Bronchiolen abgeschilferte
Epithelzellen zu sehen, deren Zytoplasma weiterhin apikal für IgA markiert war. Im
Zytoplasma untergehender Bronchiolen war granuläres MHC II+ Reaktionsprodukt
vorhanden. Peribronchioläre IgA+, IgM+ und IgG1+ Plasmazellen waren in ihrer Anzahl
reduziert und nur vereinzelt nachweisbar. In der Lamina propria und im Interstitium der
Bronchien waren weiterhin viele IgA+ und IgM+ Plasmazellen zu beobachten. CD4+, CD8+
und γδ+ T-Zellen waren in der Lp und vermehrt, zum Teil in mehreren Lagen, im Interstitium
von Bronchien verteilt aber kaum zu untergehenden Bronchiolen assoziiert (Abb. 30E,F). In
entsprechender Lage fanden sich aktivierte CD25+ Zellen wieder. Vereinzelt waren CD1b+
dendritische Zellen im peribronchialen Interstitium verteilt. In der Lp der Bronchien waren
entsprechend Tag 2 pi nur einzelne Makrophagen vorhanden und nur vereinzelt CD1b+
dendritische Zellen darstellbar.
Blutgefäße
Regelmäßig hafteten einzelne IgM+ Plasmazellen am Gefäßendothel. In den Gefäßwänden
waren wenige CD4+, CD8+ und γδ+ T-Zellen sowie einzelne aktivierte CD25+ Zellen
vorhanden. Perivaskuläre CD25+ Zellen waren rund oder besaßen Zellausläufer. In der
Adventitia von großen Blutgefäßen waren unterschiedlich viele MHC II+ Zellen vorhanden.
Darunter polygonale Alveolarmakrophagen und wenige MHC II+ Zellen mit
Zytoplasmaausläufern. Dabei waren keine CD1b+ dendritischen Zellen nachweisbar. Mitunter
waren einzelne IgA+ und IgM+ Plasmazellen in den Wänden der Blutgefäße vorhanden. Die
Markierung mit IgG1 entsprach an beiden Tagen der Markierung von Tag 2 pi.
109 ERGEBNISSE
Interlobuläre Interstitien
In den Fibrinthromben waren wenige segmentkernige Granulozyten und viele, überwiegend
diffus verteilte MHC II+ Zellen enthalten. Ein Teil der MHC II+ Zellen stimmten in Lage und
Morphologie mit Makrophagen überein. In der Mehrzahl der Lungenlokalisationen waren
zudem viele CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten zu beobachten, die sich multifokal häuften
oder gleichmäßig verteilten. Im Vergleich zu CD4+ und CD8+ waren weniger γδ+ T-Zellen
zu beobachten. Vereinzelt lagen aktivierte CD25+ Zellen vor.
ERGEBNISSE 110
Abb. 30: Darstellung immunhistologischer Befunde von MHC II, Makrophagen,
CD1b+ dendritischen Zellen, IgA+ Plasmazellen, CD8+ und γδ+ T-Zellen im luftleitenden
System des veränderten Lungengewebes am Tag 3 pi an konsekutiven Gefrierschnitten eines
Bronchus.
A-F indirekte Immunperoxidase an Kryostatschnitten von Tier Nr. 11, Lobus
caudalis; Eichstrich = 500 µm
A: Zahlreiche MHC II+ Zellen verteilen sich in der Lp (Lp) und im peribronchialen und
perivaskulären Bindegewebe (I). Das Exsudat im Lumen von Bronchus (B) und Alveolen (A)
besteht größtenteils aus MHC II+ Zellen.
B: Zahlreiche Makrophagen bilden einen Großteil des bronchialen und alveolären Exsudats
(E). Wenige Makrophagen (Pfeilspitze, exemplarisch) sind in der Lp (Lp) und im
peribronchialen Bindegewebe (I) vorhanden.
C: Einzelne CD1b+ dendritische Zelle (Pfeilspitzen, exemplarisch) liegen im Lumen (B) und
in der Lp (Lp) eines Bronchus.
D: Das Exsudat (E) weist granuläres Präzipitat und eine diffuse Markierung für IgA auf
(Stern weiß). In der Lp (Lp) und peribronchial (I) verteilen sich viele IgA+ Plasmazellen
(Pfeile, exemplarisch).
E: Sehr viele CD8+ T-Lymphozyten (Pfeile, exemplarisch) sind gleichmäßig im
peribronchialen Bindegewebe (I) angeordnet.
F: Sehr viele γδ+ T-Lymphozyten (Pfeile, exemplarisch) liegen im peribronchialen
Bindegewebe (I).
111 ERGEBNISSE
ERGEBNISSE 112
4.1.2.4 Verteilung und Menge der Leukozytensubtypen und von Chlamydien in der
Lunge am Tag 7 und 10 pi
Lungenveränderungen und Verteilung von C. psittaci
Aufgrund weitestgehender Übereinstimmung der histopathologischen Veränderungen wurden
die Befunde für Tag 7 und 10 pi zusammengefasst. Als Lungenveränderungen waren
subakute fibrinöse Bronchopneumonien zu finden. Weiterhin waren Nekrosen vorhanden, die
sich überwiegend lobulär ausdehnten. Im Spitzenlappen von Tier Nr. 19, im accessorischen
Lungenlappen zweier Kälber (Tiere Nr. 17, 20) und im Basislappen zweier Kälber (Tiere Nr.
20, 22) waren die Nekrosen auf multiple Herde beschränkt. In den Nekrosen waren einzelne
kuboidale Epithelzellen oder Zytokeratinfilamente verteilt. Die Nekrosen wurden zunehmend
von einer Regenerationszone aus hyperplastischen Alveolarepithelzellen Typ II (AEC II)
begrenzt. Der Regeneration folgte eine zelluläre Infiltration. An die Läsionen grenzten
vermehrt unveränderte Läppchen (Tiere Nr. 20, 21). Der Spitzenlappen von Tier Nr. 17 und
der accessorische Lungenlappen von Tier Nr. 21 wiesen eine fibrinöse Bronchopneumonie
auf. Einzelne abgeschilferte Zellen verteilten sich im Lumen von Bronchiolen. In der
Mehrzahl waren sie frei von Exsudat. Multifokal fielen im Spitzenlappen und im
accessorischen Lungenlappen von Tier Nr. 17 Bronchien mit mehrreihigem Epithel auf. Die
Interalveolarsepten, die Gefäßadventitia und das peribronchiale und interlobuläre Interstitium
waren weiterhin verbreitert und enthielten proteinreiches Exsudat.
An beiden Tagen unterschieden sich die Erregermengen nicht signifikant. In der Mehrzahl
waren sehr viele Chlamydieneinschlüsse vorhanden. Ausnahmen bildeten die histologisch
unveränderten Lungenlokalisationen der Tiere Nr. 17 und 21, in denen nur wenige
Chlamydieneinschlüsse in Einzelzellen vorhanden waren bzw. keine Erregerstrukturen
nachgewiesen werden konnten. Chlamydien verteilten sich im Zentrum (Abb. 24B) oder am
Rand der Nekrosen (Abb. 31B, Abb. 32B). Zudem waren im Basislappen von Tier Nr. 17 und
im accessorischen Lungenlappen von Tier Nr. 18 Erregerstrukturen multifokal in der
Regenerationszone verteilt. Die Chlamydieneinschlüsse waren als große, runde
intrazytoplasmatische Markierung und weiterhin als granuläre Strukturen sichtbar.
113 ERGEBNISSE
Nekrosen
Die Nekrosen enthielten Fibrin und Zelldetritus (Abb. 31A, Abb. 32A). In ihnen waren
wenige intensiv markierte runde oder schlanke MHC II+ Zellen verteilt. Ebenfalls ließen sich
wenige CD1b+ dendritische Zellen (Abb. 31D) aber keine Makrophagen darstellen. Zum Teil
waren einzelne CD8+, γδ+, CD4+ Zellen und aktivierte CD25+ Zellen in der Nekrose
enthalten (Tiere Nr. 19, 21, 22). Peripher der Nekrosen waren sehr viele Makrophagen
(Abb. 31C). viele CD25+ T-Zellen und CD4+ T-Zellen (Tiere Nr. 17, 18) und weniger CD8+
T-Zellen zu beobachten (Abb. 31E,F).
Regenerationsbereich
Am Tag 7 pi war die Regenerationszone aus kuboidalen AEC II zunächst multifokal entlang
der interlobulären Interstitien zu beobachten. Am Tag 10 pi war die Regenerationszone
vergrößert und entlang des interlobulären Bindegewebes ausgedehnt (Abb. 32C). Das
Zytoplasma der AEC II wies eine feingranuläre Markierung für IgA auf (Abb. 32D, F). Am
Tag 7 und vermehrt am Tag 10 pi waren viele IgA+ Plasmazellen und IgM+ Plasmazellen
und IgM+ B-Lymphozyten in einer oder mehreren Lagen entlang des interlobulären
Interstitiums angeordnet. Die Regenerationszone markierte sich homogen für MHC II. Von
der diffusen Markierung ließen sich wenige intensiv für MHC II+ markierte Einzelzellen mit
runder oder schlanker Gestalt abgrenzen. Durch die Doppelmarkierung von Zytokeratin und
CD1b+ dendritischer Zellen waren regelmäßig wenige CD1b+ dendritische Zellen basal und
luminal der hyperplastischen Alveolarepithelzellen abgrenzbar (Abb. 32F). Die
hyperplastischen AEC II lagen in Zellverbänden und bildeten Hohlräume, in denen sich
zunächst IgA+ und IgM+ und im weiteren Verlauf vermehrt IgG1+ Präzipitate sammelten.
Die Hohlräume waren überwiegend von Alveolarmakrophagen infiltriert, die so die Nekrosen
begrenzten (Abb. 31C). Am Tag 10 pi waren neben Alveolarmakrophagen vermehrt
interstitielle Makrophagen (Abb. 32E) vorhanden. Dabei waren Häufungen zum einen
unmittelbar angrenzend an die Nekrose und zum anderen in der Peripherie des
Regenerationsbereiches, dicht am interlobulären Interstitium, zu finden. CD4+, CD8+ T-
Zellen und γδ+ T-Zellen nahmen in ihrer Anzahl zu und breiteten sich diffus in der
Regenerationszone aus (Abb. 33A,B,C). Wenige CD25+ Zellen waren weiterhin im
Regenerationsbereich verteilt (Abb. 33D). Multifokal entlang des interlobulären Interstitiums
ERGEBNISSE 114
waren Ansammlungen aus CD4+ und weniger aus CD8+ Zellen zu sehen (Abb. 33A). In der
Lunge eines Kalbes waren multifokale Lymphozyteninfiltrate vorhanden, die sich
netzwerkartig für CD25 markierten, mit Makrophagen durchsetzt waren und wenige IgM+ B-
Lymphozyten enthielten (Tier Nr. 20).
Alveolen und Interalveolarsepten
Der Spitzenlappen von Tier Nr. 17 war weitgehend unverändert. Lediglich verbreiterte
Interalveolarsepten waren zu sehen. Entsprechend der Kontrollen verteilten sich interstitielle
und intravaskuläre Makrophagen. Zudem waren wenige CD4+, CD8+ und einzelne γδ+ T-
Zellen unregelmäßig in den Interalveolarsepten verteilt. CD25+ Zellen waren nicht enthalten.
Zum Teil waren Bereiche vorhanden, in denen sich IgM+ Zellausläufer entsprechend der
Kontrollen markierten. Im Vergleich zu den veränderten Lungen, lagen CD1b+ dendritische
Zellen am Tag 7 pi im angrenzenden, unveränderten Gewebe in erhöhter Zahl vor.
Bronchien und Bronchiolen
Ein Teil der Luftwege war weiterhin mit Detritus, Fibrinansammlungen und neutrophilen
Granulozyten verlegt. Das Exsudat markierte sich diffus für MHC II und wurde häufig von
CD1b+ dendritischen Zellen infiltriert und umgeben. In der Lp von Bronchien und
Bronchiolen waren wenige neutrophile Granulozyten zu sehen. Im peribronchialen
Interstitium waren vermehrt IgM+ Plasmazellen vorhanden. Sehr viele CD4+ und CD8+ T-
Lymphozyten, wenige IgA+ Plasmazellen und γδ+ T-Zellen und einzelne aktivierte CD25+
Zellen waren peribronchial bzw. peribronchiolär verteilt. Ab Tag 10 pi waren die Lumina von
Bronchiolen multifokal durch Granulationsgewebe verlegt, das von hyperplatischen
Epithelzellen umgeben wurde. Im Granulationsgewebe befanden sich einzelne neutrophile
Granulozyten.
115 ERGEBNISSE
Blutgefäße
Viele MHC II+ Zellen und Makrophagen waren in der Gefäßadventitia zu beobachten.
CD1b+ dendritische Zellen ließen sich nicht nachweisen. Ab Tag 10 pi waren vermehrt IgM+
und IgA+ Plasmazellen gleichmäßig im Querschnitt der Gefäßwände verteilt. Weiterhin
waren sehr viele CD4+ und weniger CD8+ und γδ+ T-Lymphozyten im perivaskulären
Bindegewebe zu beobachten. Zum Teil waren wenige aktivierte CD25+ Zellen zu sehen (Tier
Nr. 22).
Interlobuläres Interstitium
Im interlobulären Bindegewebe waren noch immer Fibrinthromben, viele Entzündungszellen
und Zelldetritus enthalten. Im Vergleich zu den vorherigen Zeitpunkten und im Vergleich zu
den Kontrollen lagen am Tag 10 pi vermehrt MHC II+ Zellen vor, darunter viele
Makrophagen (Abb. 32E) und zum Teil viele CD1b+ dendritische Zellen. CD1b+
dendritische Zellen bildeten vermehrt multifokale Zellansammlungen. Sehr viele CD4+ und
CD8+ T-Zellen und weniger γδ+ T-Zellen waren zu beobachten. Zum Teil bildeten CD4+ und
CD8+ T-Zellen multifokal kleine Ansammlungen.
ERGEBNISSE 116
Abb. 31: Darstellung histologischer Befunde und immunhistologischer Befunde von
Chlamydiaceae-LPS, Makrophagen, dendritischen Zellen sowie CD4+ und CD8+ T-Zellen
im veränderten Lungengewebe am Tag 7 pi.
A HE-Färbung am Kryostatschnitt;
B-F indirekte Immunperoxidase an Kryostatschnitten;
A, B, D konsekutive Kryostatschnitte von Tier Nr. 19, Lobus accessorius;
C, E, F konsekutive Kryostatschnitte von Tier Nr.17, Lobus accessorius;
Eichstrich = 500 µm
A: Subakute, fibrinöse Bronchopneumonie mit herdförmiger Nekrose (N).
B: In der Nekrose (N) lassen sich sehr viele Chlamydienstadien (Pfeilspitzen, exemplarisch)
nachweisen.
C: Die Nekrose (N) ist von zahlreichen Alveolarmakrophagen umgeben (Pfeile,
exemplarisch).
D: In der Nekrose und im Randbereich verteilen sich viele CD1b+ dendritische Zellen (Pfeile,
exemplarisch).
E: Viele CD4+ T-Zellen (Pfeile, exemplarisch) sind peripher der Nekrose (N) in den
umliegenden Alveolen zu finden.
F: Wenige CD8+ T-Lymphozyten (Pfeile, exemplarisch) sind peripher der Nekrose (N) in
den umliegenden Alveolen verteilt.
117 ERGEBNISSE
ERGEBNISSE 118
Abb. 32: Darstellung der histologischen Befunde und immunhistologischen Befunde von
Chlamydiaceae-LPS, Zytokeratin, IgA, Makrophagen und CD1b+ dendritischen Zellen im
veränderten Lungengewebe am Tag 10 pi an konsekutiven Kryostatschnitten von Tier Nr. 21,
Lobus caudalis.
A HE-Färbung am Kryostatschnitt;
B-F indirekte Immunperoxidase
A: Der Regenerationsbereich (R) aus hyperplastischen alveolären Epithelzellen (Pfeile,
exemplarisch) grenzt an das interlobuläre Interstitium (I) und demarkiert die Nekrose (N).
Entlang des Interstitiums lassen sich zelluläre Infiltrate nachweisen (Pfeilspitze,
exemplarisch). Eichstrich = 500 µm
B: Chlamydieneinschlüsse verteilen sich überwiegend im Randbereich der Nekrose (N).
Wenige Chlamydieneinschlüsse (Pfeile, exemplarisch) sind in der Regenerationszone (R)
enthalten. Eichstrich = 500 µm
C: Die Markierung des Zytokeratins zeigt tubuläre Epithelstrukturen mit zentralen
Hohlräumen (R), die an das interlobuläre Interstitium (I) grenzen und die Nekrose (N)
demarkieren. Eichstrich = 500 µm
D: Die hyperplastischen Alveolarepithelzellen Typ II weisen eine feine granuläre Markierung
für IgA auf (Pfeilspitzen, exemplarisch) in der Regenerationszone (R). Viele IgA+
Plasmazellen (Pfeile, exemplarisch) sind entlang der interlobulären Interstitien (I) aufgereiht
und vereinzelt (schlanke Pfeile, exemplarisch) in den Randbereichen der Nekrose (N) zu
finden. Eichstrich = 500 µm
E: Makrophagen (Sterne, exemplarisch) häufen sich peripher der Nekrose (N) und im
Regenerationsbereich (R) entlang der interlobulären Interstitien (I). Eichstrich = 500 µm
F: CD1b+ dendritische Zellen verteilen sich im Regenerationsbereich (R) unmittelbar entlang
der hyperplastischen AEC II (Pfeile, exemplarisch).
Doppelmarkierung von CD1b und Zytokeratin; Eichstrich = 200 µm
119 ERGEBNISSE
ERGEBNISSE 120
Abb. 33: Darstellung der immunhistologischen Befunde von CD4+, CD8+, γδ+ T-
Lymphozyten und CD25+ Zellen im veränderten Lungengewebe am Tag 10 pi an
konsekutiven Gefrierschnitten.
Indirekte Immunperoxidase, Tier Nr. 21, Lobus caudalis; Eichstrich = 500 µm
A: Zahlreiche CD4+ T-Zellen (Pfeile, exemplarisch) liegen diffus im Regenerationsbereich
(R). Zusätzlich sind multifokale Ansammlungen aus CD4+ T-Zellen (Pfeilspitzen,
exemplarisch) entlang des interlobulären Interstitiums (I) zu sehen. Einzelne CD4+ T-Zellen
befinden sich in den interlobulären Interstitien und in der Nekrose (N).
B: CD8+ T-Zellen (Pfeile, exemplarisch) sind zahlreich, aber im Vergleich zu CD4+ T-
Zellen in geringerer Anzahl im Regenerationsbereich (R) verteilt. Einzelne CD8+ T-Zellen
liegen in den interlobulären Interstitien (I) und in der Nekrose (N).
C: Wenige γδ+ T-Zellen liegen im Regenerationsbereich (R). Einzelne γδ+ T-Zellen verteilen
sich in den interlobulären Interstitien (I) und in der Nekrose (N).
D: Einzelne CD25+ Zellen (Pfeile, exemplarisch) sind im Regenerationsbereich (R) verteilt.
121 ERGEBNISSE
ERGEBNISSE 122
4.1.2.5 Verteilung und Menge der Leukozytensubtypen und von Chlamydien in der
Lunge am Tag 14 pi
Lungenveränderungen und Verteilung von C. psittaci
Am Tag 14 pi war das Lungengewebe durch weitgehende Regeneration der veränderten
Bereiche gekennzeichnet. Die Regenerationszonen verdrängten zunehmend die Nekrosen
(Abb. 34A). Nur noch in einem Teil der Lungenschnitte waren Nekrosen vorhanden - in den
Spitzenlappen zweier Kälber (Tiere Nr. 23, 25), im Basislappen und im accessorischen
Lungenlappen von jeweils einem (Tiere Nr. 24, 25). Im Unterschied zu Tag 10 pi waren die
Nekrosen hochgradig zellulär infiltriert. Weiterhin ließen sich Lymphozytenansammlungen
entlang des interlobulären Interstitiums beobachten, wovon ein Großteil follikuläre Strukturen
aufwies. Das Alveolarepithel der Regenerationszone war überwiegend flach und umgab
ausgeweitete Alveolen. Angrenzende Läppchen waren in der Mehrzahl histologisch
unverändert.
Chlamydien lagen in geringer Zahl, diffus oder randständig in den Nekrosen vor (Abb. 34B).
Bei einem Tier (Nr. 25) im Spitzenlappen wurde eine herdförmige Ansammlung aus
chlamydialen Einschlüssen im interlobulären Bindegewebe beobachtet. Die lymphozytären
Infiltrate entlang des interlobulären Bindegewebes enthielten keine chlamydialen Einschlüsse.
Im angrenzenden unveränderten Lungengewebe waren wenige, einzeln gelegene mit
Chlamydien infizierte Zellen zu beobachten. Im accessorischen Lungenlappen von Tier Nr. 23
stimmte die Lage von CD1b+ dendritischen Zellen mit den markierten
Chlamydieneinschlüssen überein.
Alveolen und Interalveolarsepten
In den unveränderten Läppchen entsprachen Menge und Verteilung der untersuchten
Zelltypen denen der Kontrollkälber.
Nekrosen
Die Nekrosen markierten sich diffus für MHC II und enthielten massenhaft Makrophagen,
sehr viele CD8+ und viele CD4+ und γδ+ T-Lymphozyten (Abb. 34C,D,E,F). Wenige CD1b+
dendritische Zellen verteilten sich diffus in der Nekrose. Die T-Lymphozyten waren
gleichmäßig in der Nekrose verteilt.
123 ERGEBNISSE
Regenerationsbereich
Die Regenerationszone war schwach diffus für MHC II markiert. Das Zytoplasma der
hyperplastischen Alveolarepithelzellen wies weiterhin eine feingranuläre Markierung für IgA
auf. Wenige CD1b+ dendritische Zellen waren regelmäßig basal und luminal von
hyperplastischen Epithelzellen zu finden. Viele IgM+, IgA+ und IgG1+ Plasmazellen
verteilten sich gleichmäßig in der Regenerationszone und unmittelbar angrenzend an die
Nekrose. Zusätzlich lagen massenhaft IgM+ B-Lymphozyten in unterschiedlich ausgedehnten
Ansammlungen vor. Sehr viele CD4+, CD8+ und γδ+ T-Zellen lagen gleichmäßig verteilt in
der Regenerationszone. Ihre Anzahl war in der Regenerationszone geringer als in der
Nekrose.
Lymphozytäre Aggregate
Multifokale lymphozytären Aggregate lagen entlang des interlobulären Interstitiums
aufgereiht oder perivaskulär. Sie waren homogen für MHC II markiert. Sie bestanden
überwiegend aus CD4+ T-Lymphozyten, IgM+ B-Lymphozyten und wenigen bis vielen
CD1b+ DC (Abb. 35B,C,D). Zudem waren sie netzwerkartig für CD25 markiert. Es ließen
sich T- und B-Zellzone unterscheiden. Die B-Zellzone zeigte eine retikuläre Markierung für
CC56 (Abb. 35A) und eine netzwerkartige Markierung für IgM. Eine nur schwache
Markierung konnte für IgG1 und IgA beobachtet werden. Im Follikelzentrum lagen vereinzelt
CD4+ T-Lymphozyten und Makrophagen vor. Im parafollikulären Bereich verteilten sich
viele CD4+ T-Zellen, viele dendritische Zellen und wenige Makrophagen.
Blutgefäße
CD4+ T-Zellen bildeten perivaskuläre Infiltrate, die besonders um kleine Gefäße zu
beobachten waren (Tier Nr. 23). Weiterhin befanden sich viele MHC II+ Zellen in den
Gefäßwänden. Das perivaskuläre Bindegewebe markierte sich diffus für IgG1. IgA+ IgM+
und IgG1+ Plasmazellen ließen sich nicht nachweisen. Im perivaskulären Bindegewebe waren
regelmäßig Ansammlungen aus CD1b+ DC zu sehen.
ERGEBNISSE 124
Abb. 34: Darstellung der immunhistologischen Befunde von Zytokeratin, Chlamydiaceae-
LPS, Makrophagen, CD4+, CD8+ und γδ+ T-Lymphozyten im veränderten Lungengewebe
am Tag 10 pi an konsekutiven Gefrierschnitten.
Indirekte Immunperoxidase, Tier Nr. 24, Lobus caudalis; Eichstrich = 500 µm
A: Die Nekrose (N, durch gestrichelte Linie dargestellt) kennzeichnet sich durch das Fehlen
von Zytokeratin+ Alveolarepithelzellen. Ein Regenerationsbereich umgibt die Nekrose und
weist eingeengte Bronchiolarlumina auf (Bronchiolitis obliterans (B)).
B: Viele Chlamydieneinschlüssen liegen in der Nekrose (durch gestrichelte Linie dargestellt)
und zwischen regeneriertem Epithel.
C: Die Nekrose (N, durch gestrichelte Linie dargestellt) ist hochgradig mit
Alveolarmakrophagen infiltriert. Alveolarmakrophagen sind zusätzlich in umliegenden
Alveolen (A) verteilt.
D: Zahlreiche CD4+ T-Zellen verteilen sich in der Nekrose (N, durch gestrichelte Linie
dargestellt). Zudem liegt eine Ansammlung aus CD4+ Zellen (Stern) neben einem Blutgefäß
(G).
E: CD8+ T-Zellen (Pfeile, exemplarisch) infiltrieren deutlich die Nekrose (N, durch
gestrichelte Linie dargestellt).
E: Viele γδ+ T-Zellen (Pfeile, exemplarisch) verteilen sich in der Nekrose (N, durch
gestrichelte Linie dargestellt).
125 ERGEBNISSE
ERGEBNISSE 126
Abb. 35: Zelluläre Zusammensetzung der lymphatischen Aggregate in den Interstitien am Tag
14 pi an konsekutiven Gefrierschnitten.
Indirekte Immunperoxidase am Kryostatschnitt; Tier Nr. 24, Lobus caudalis; Eichstrich =
500 µm
A: Lymphozyteninfiltrate entlang der interlobulären Interstitien (I) zeigen herdförmige,
netzartige Markierung für CC56 (Sterne).
B: Lymphozyteninfiltrate entlang des interlobulären Interstitien (I) enthalten Ansammlungen
von IgM+ B-Lymphozyten (Sterne).
C: Zahlreiche CD4+ T-Lymphozyten sind parafollikulär (Sterne) in den lymphozytären
Aggregaten der interlobulären Interstitien (I) angeordnet.
D: Lymphozyteninfiltrate (Sterne) im interlobulären Interstitium (I) enthalten zahlreiche
CD1b+ dendritischen Zellen (Pfeile, exemplarisch) im parafollikulären Bereich.
127 ERGEBNISSE
ERGEBNISSE 128
Bronchien und Bronchiolen
Multifokal waren Bronchien zu beobachten, in deren Lp die untersuchten
Leukozytensubtypen in Anzahl und Verteilung entsprechend der Kontrollen verteilt waren.
Dabei war die Epithelmarkierung durch IgA nur bei einem Tier wie bei den Kontrollen (Tier
Nr. 25). Im peribronchialen und peribronchiolären Bindegewebe waren vermehrt
Ansammlungen aus CD1b+ DC zu sehen.
Interlobuläres Bindegewebe
Neben den bereits beschriebenen lymphozytären Aggregaten waren im interlobulären
Interstitium, das die Läsionen begrenzte, sehr viele MHC II+ Makrophagen und wenige
CD1b+ dendritische Zellen nachweisbar. Die T-Zellsubtypen verteilten sich in den
interlobulären Interstitien entsprechend Tag 10 pi. IgA+, IgM+ und IgG1+ Plasmazellen
wurden nicht beobachtet. Im interlobulären Bindegewebe waren regelmäßig Aggregate aus
vielen CD1b+ DC zu sehen.
4.1.2.6 Verteilung und Menge der Leukozytensubtypen und von Chlamydien in der
Lunge am Tag 35/37 dpi
Lungenveränderungen und Verteilung von C. psittaci
Am Tag 35/37 pi war die Mehrzahl der untersuchten Lungen histologisch unverändert. In den
unveränderten Läppchen waren die untersuchten Zelltypen in Menge und Verteilung
entsprechend der Kontrollkälber verteilt. Regelmäßig waren follikuläre Strukturen entlang der
Luftwege, des interlobulären Interstitiums und perivaskulär zu beobachten. Im Spitzenlappen
eines Tieres war vermehrt hyperplastisches BALT vorhanden (Tier Nr. 27). Peripher des
BALT, waren viele IgA+ und IgM+ Plasmazellen in der Lp der Bronchien verteilt. Zudem
waren einzelne CD25+ aktivierte Zellen in der Lp von Bronchien und Bronchiolen zu sehen.
Im Basislappen eines Kalbes (Tier Nr. 26) befanden sich zwei Herde granulomatöse
Entzündung (Abb. 36A,B). In ihnen ließen sich immunhistologisch Chlamydienstadien
nachweisen (Abb. 36C). Die Chlamydieneinschlüsse lagen als blass-braunes, homogenes
Material im Zytoplasma von Makrophagen, die sich im Inneren des Granuloms verteilten. Im
Zentrum der Veränderung waren sehr viele Makrophagen, mehrere mehrkernige Riesenzellen
129 ERGEBNISSE
(Abb. 36A,D) und sehr viele CD8+ T-Zellen verteilt (Abb. 36E). Zusätzlich ließen sich
einzelne CD1b+ dendritische Zellen, CD4+ und γδ+ T-Zellen (Abb. 36F). In der Peripherie
des Granuloms lagen sehr viele bis massenhaft CD8+ T-Zellen und weniger γδ+ T-Zellen
nachweisen (Abb. 36E,F). Peripher der Veränderungen waren vermehrt IgA+ Plasmazellen zu
sehen (Abb. 37B). CD4+ T-Lymphozyten waren in geringer Zahl vorhanden. Sie bildeten
multifokale Ansammlungen um Gefäße und entlang des Interstitiums (Abb. 37A). Die
Aggregate waren positiv für CD25 und wurden von wenigen CD8+, γδ+ T-Zellen und CD1b+
dendritischen Zellen umgeben.
ERGEBNISSE 130
Abb. 36: Darstellung histologischer und immunhistologischer Befunde von Zytokeratin,
Chlamydiaceae-LPS, Makrophagen, CD8+ und γδ+ T-Lymphozyten im veränderten
Lungengewebe am Tag 35/37 pi.
A HE-Färbung am Kryostatschnitt;
B-F indirekte Immunperoxidase an konsekutiven Kryostatschnitten von Tier Nr. 26,
Lobus caudalis;
A: Fokale granulomatöse Entzündung (Gr, durch gestrichelte Linie dargestellt) mit
mehrkernigen Riesenzellen (Pfeilspitze, exemplarisch). In der Peripherie des Granuloms
befindet sich ein perivaskuläres lymphozytäres Infiltrat (Stern, weiß).
Eichstrich = 500 µm
B: In der Veränderung (Gr, durch gestrichelte Linie dargestellt) sind keine Zytokeratin+
Epithelstrukturen vorhanden.
Eichstrich = 500 µm
C: In dem Granulom (Gr, durch gestrichelte Linie dargestellt) sind wenige
Chlamydieneinschlüsse (Pfeilspitzen, exemplarisch) in Makrophagen zu erkennen.
Eichstrich = 100 µm
D: In dem Granulom (Gr, durch gestrichelte Linie dargestellt) sind Ansammlungen von
Makrophagen (Pfeile, exemplarisch) und mehrkernige Riesenzellen (Pfeilspitze,
exemplarisch) zu finden.
Eichstrich = 500 µm
E: Zahlreiche CD8+ T-Zellen (Pfeile, exemplarisch) verteilen sich im Granulom (Gr, durch
gestrichelte Linie dargestellt) und in der Peripherie.
Eichstrich = 500 µm
F: Viele γδ+ T-Lymphozyten (Pfeile, exemplarisch) verteilen sich diffus im Granulom (Gr,
durch gestrichelte Linie dargestellt) und peripher davon.
Eichstrich = 500 µm
131 ERGEBNISSE
ERGEBNISSE 132
Abb. 37: Darstellung immunhistologischer Befunde von CD4+ T-Lymphozyten und
IgA+ Plasmazellen im veränderten Lungengewebe am Tag 35/37 pi.
Indirekte Immunperoxidase an konsekutiven Kryostatschnitten von Tier Nr. 26, Lobus
caudalis; Eichstrich = 500 µm
A: CD4+ T-Zellen verteilen sich diffus in und vermehrt peripher des Granuloms (Gr). Fokal
liegt ein perivaskuläres lymphozytäres Aggregat (Pfeilspitze).
B: Viele IgA+ Plasmazellen (Pfeilspitzen, exemplarisch) sind peripher des Granuloms (Gr,
durch gestrichelte Linien dargestellt) verteilt.
133 ERGEBNISSE
4.1.2.7 BALT
Bis zum Tag 14 pi waren unregelmäßig einzelne Bronchus- oder Bronchiolus-assoziierte
Follikel in den Lungenlokalisationen verteilt. Erstmals am Tag 7 pi fiel im Spitzenlappen
eines Tieres ein geringgradig ausgeprägter CC56+ Follikel am interlobulären Bindegewebe
auf (Tier Nr. 17A). Diese ektopischen Follikel traten ab Tag 14 pi regelmäßig in den
untersuchten Lungenlokalisationen auf. Am Tag 14 pi waren, wie bei den Kontrollen, in der
Mehrzahl Bronchus-assoziierte Follikel vorhanden, die sich überwiegend isoliert in der
Submukosa und ohne Kontakt zum Epithel oder zu Gefäßen verteilten. Vereinzelt lag der
Follikel in der Lamina propria oder mit Gefäßkontakt in der Submukosa vor. Bronchiolus-
assoziierte lymphatische Follikel waren entsprechend der Kontrolltiere lokalisiert. In einem
Teil der Lungenlappen waren multifokal ektopische CC56+ Follikel entlang des
interlobulären Bindegewebes (Tiere Nr. 23, 24, 25) verteilt und/oder multiple perivaskuläre
CC56+ Follikel zu sehen (Tiere Nr. 24, 25). Diese traten in Spitzenlappen, Basislappen oder
accessorischen Lungenlappen auf. Neben netzwerkartig markierten Follikeln waren zudem
multifokal Aggregate aus CC56+ B-Lymphozyten entlang des interlobulären Bindegewebes
und perivaskulär verteilt. Am Tag 14 pi lag der Median des BALT bei 2,5 Anschnitte/cm²
Lungengewebe. Der Median für Lymphaggregate lag am Tag 14 pi bei 6,91 Anschnitte/cm²
Lungengewebe.
Am Tag 35/37 pi waren deutlich ausgeprägte BALT Follikel vorhanden, die weiterhin
überwiegend mit Bronchien assoziiert waren. Dabei lagen sie zu gleichen Teilen isoliert in der
Lamina propria oder isoliert in der Submukosa (SM) vor. Die Bronchiolus-assoziierten
Follikel waren zu gleichen Teilen in der Lp oder in der SM mit Gefäßkontakt zu finden. Fokal
in einem accessorischen Lungenlappen waren sie ausschließlich in der Submukosa lokalisiert
(Tier Nr. 27). Verglichen mit Tag 14 pi waren ektopische Follikel weniger häufig entlang des
interlobulären Bindegewebes zu sehen (Tiere Nr. 26, 27, 28). Perivaskuläre CC56+ Follikel
konnten nicht nachgewiesen werden. Am Tag 35/37 pi lag der Median des BALT bei 3,77
Anschnitte/cm² Lungengewebe. Damit war die Menge an BALT am Tag 35/37 pi im
Vergleich zu den Kontrolltieren, bei denen 0,7 Anschnitte/cm² Lungengewebe zu finden
waren, signifikant erhöht (Abb. 38). Am Tag 35/37 pi lag der Median für lymphatische
ERGEBNISSE 134
Aggregate bei bei 2,49 Anschnitte/cm² Lungengewebe. Diese Anzahl unterschied sich
signifikant von der der Kontrollkälber.
Abb. 38: Menge des BALT und der lymphatischen Aggregate bei den Kontrollkälbern sowie
am Tag 14 und 35/37 pi. Boxplots zeigen Median, 25. und 75. Perzentil (Box), MIN/MAX,
Ausreißer (o), Mann-Whitney-Test, p-Wert ≤ 0,05 zeigt signifikante Unterschiede (*)
Die Zellzusammensetzung im BALT entsprach an den Tagen 14 pi und 35/37 pi der, die im
BALT der Kontrollkälber beobachtet wurde. Die BALT Follikel ebenso sowie ein Teil der
ektopischen Follikel waren netzwerkartig positiv für IgM markiert oder bestanden aus dicht
beieinander liegenden IgM+ B-Lymphozyten. Eine schwache Markierung für IgA und IgG1
war nur zum Teil zu beobachten. Teile der Follikel markierten sich schwach netzwerkartig für
CD25. Die Darstellung von MHC II, CD68, CD1b, CD4, CD8 und γδ, entsprach der, die bei
den Kontrollkälbern zu beobachten war.
135 ERGEBNISSE
4.1.2.8 Quantitative Auswertung von CD4+, CD8+ und γδ+ T-Lymphozyten in der
Lunge
Entsprechend dem Vorgehen bei den Kontrollkälbern wurde die Anzahl der CD4+, CD8+ und
γδ+ T-Lymphozyten aus den drei Lungenlokalisationen der mit C. psittaci inokulierten Kälber
ermittelt. Die Zellzahlen der drei Lungenlokalisationen wurden je Zeitpunkt und Subtyp
zusammengefasst.
ERGEBNISSE 136
Im Vergleich zu den Kontrollen waren in den veränderten Lungen die CD4+ T-
Lymphozyten/mm² an den Tagen 2, 3, 4, 7 pi signifikant erniedrigt (Abb. 39). Am Tag 10 und
14 pi waren auffällige Streuungen der CD4+ Zellzahlen/mm² vorhanden. Am Tag 10 pi
unterschieden sich die CD4+ T-Zellen/mm² signifikant von den Kontrollen. Die Zellzahlen
der CD4+ T-Zellen/mm² waren am Tag 10 pi im Vergleich zu Tag 7 signifikant erhöht. Die
CD4+ T-Zellen unterschieden sich weiterhin signifikant zwischen den Tagen 10 und 14 pi.
Abb. 39: CD4+ T-Lymphozyten/mm² Lungengewebe im zeitlichen Verlauf nach der
Inokulation mit C. psittaci im Vergleich zur Kontrollgruppe. Boxplots zeigen Median, 25. und
75. Perzentil (Box), MIN/MAX und Ausreißer (o), p-Wert ≤ 0,05 zeigt signifikante
Unterschiede zur Kontrollgruppe (*) und hinsichtlich des zuvor untersuchten Zeitpunktes pi
(#)
CD
4+ T
-Lym
phoz
yten
/mm
² Lu
ngen
gew
ebe
137 ERGEBNISSE
Die CD8+ T-Lymphozyten/mm² waren im Vergleich zu den Kontrollen an den Tagen 2, 3, 4
und 7 pi signifikant vermindert. Am Tag 14 pi waren CD8+ T-Lymphozyten/mm² im
Vergleich zu den Kontrollen signifikant erhöht (Abb. 40). Vergleicht man die Zellzahlen/mm²
mit den jeweils vorhergehenden Zeitpunkten, so unterschieden sich die Zellzahlen zwischen
den Tagen 7 und 10 pi und zwischen den Tagen 10 und 14 pi signifikant voneinander. Dabei
lässt sich an den Tagen 10 und 14 pi eine deutliche Streuung der Zellzahlen beobachten.
Abb. 40: CD8+ T-Lymphozyten/mm² in der Lunge im zeitlichen Verlauf nach der Inokulation
mit C. psittaci im Vergleich zur Kontrollgruppe. Boxplots zeigen Median, 25. und 75.
Perzentil (Box), MIN/MAX und Ausreißer (o), p-Wert ≤ 0,05 zeigt signifikante Unterschiede
zur Kontrollgruppe (*) und hinsichtlich des zuvor untersuchten Zeitpunktes pi (#)
CD
8+ T
-Lym
phoz
yten
/mm
² Lu
ngen
gew
ebe
ERGEBNISSE 138
γδ+ T-Lymphozyten/mm² waren im Vergleich zu den Kontrollen an den Tagen 2, 3, 4, 7 pi
signifikant vermindert. Dabei fallen deutliche Streuungen der γδ+ T-Zellzahlen/mm² am Tag
4 pi auf. Am Tag 14 pi war die γδ+ T-Zellzahl signifikant erhöht (Abb. 41). Vergleicht man
die Zellzahlen/mm² mit den jeweils vorangehenden Zeitpunkten, so unterschieden sich die
Zellzahlen zwischen den Tagen 7 und 10 pi, 10 und 14 pi, und 14 und 35/37 pi signifikant
voneinander.
Abb. 41: γδ+ T-Lymphozyten/mm² in der Lunge im zeitlichen Verlauf nach der Inokulation
mit C. psittaci im Vergleich zur Kontrollgruppe. Boxplots zeigen Median, 25. und 75.
Perzentil (Box), MIN/MAX und Ausreißer (o), p-Wert ≤ 0,05 zeigt signifikante Unterschiede
zur Kontrollgruppe (*) und hinsichtlich des zuvor untersuchten Zeitpunktes pi (#)
γδ+
T-L
ymph
ozyt
en/m
m²
Lung
enge
web
e
139 ERGEBNISSE
4.1.2.9 Nl. mediastinalis
In den Lymphknoten zeigte sich im Verlauf der Infektion mit C. psittaci eine Reaktion
sowohl innerhalb der Follikel als auch im Paracortex und in der Medulla. Im Nl. mediastinalis
konnten immunhistologisch keine Erregerstadien nachgewiesen werden.
Subkapsulär- und Intermediärsinusoide
Die homogene MHC II Markierung der Follikel war mitunter auf subkapsuläre Bereiche und
auf die intermediären Sinusoide ausgedehnt. Die Follikel ließen sich zum Teil nicht vom
Paracortex abgrenzen (Tier Nr. 13). Bis Tag 7 pi waren die Sinusoide der Lymphknoten mit
Makrophagen ausgefüllt und wenige CD1b+ dendritische Zellen nachweisbar. Bei einem Tier
waren zusätzliche multifokale dichte Ansammlungen aus Makrophagen und wenige
dendritischen Zellen aufgereiht in den kapsulären Sinusoiden vorhanden (Tier Nr. 17). Bei
einem anderen Tier waren Makrophagen überwiegend in den Medullarsinusoiden und nicht
subkapsulär zu beobachten (Tier Nr. 16). Neben Makrophagen waren einzelne CD1b+
dendritische Zellen, CD4+ und CD8+ T-Zellen in den Sinusoiden aufgereiht (Tiere Nr. 16,
17). Wie bei den Kontrollen waren wenige bis viele γδ+ T-Lymphozyten ungleichmäßig in
den Intermediärsinusoiden enthalten. Die Sinusoide waren in einem Teil der Lymphknoten
retikulär für CD25 markiert (Tiere Nr. 8, 17).
Am Tag 4 pi wurden sehr viele IgM+ Plasmazellen und B-Lymphozyten, viele IgA+ und
wenige IgG1+ Plasmazellen in den Intermediärsinusoiden gesehen. Sie waren vorwiegend am
Übergang zwischen Paracortex und Medulla lokalisiert (Tiere Nr. 14, 15, 16). Ab Tag 7 pi
waren zum Teil viele IgG1+ Plasmazellen gleichmäßig oder in multifokalen Ansammlungen
in den Intermediärsinusoiden verteilt (Tiere Nr. 14, 17). IgA+ und IgM+ Plasmazellen waren
weiterhin in unterschiedlicher Anzahl vorhanden. Am Tag10 pi waren viele Makrophagen
multifokal (Tier Nr. 23) oder gleichmäßig (Tier Nr. 20) in den Intermediärsinusoiden
vorhanden und nur wenige in den kapsulären Sinusoiden zu sehen.
Cortex
Im Verlauf der Infektion mit C. psittaci war zunehmend eine Zonierung der Lymphfollikel zu
beobachten, die sich bereits zu Beginn der Untersuchung am Tag 2 pi in einem Teil der
Lymphfollikel zeigte. Die Lymphfollikel setzten sich wie bei den Kontrollen aus dicht
ERGEBNISSE 140
aneinander liegenden IgM+ B-Lymphozyten zusammen, die sich überwiegend netzwerkartig
für IgM markierten und einzelne IgM+ Plasmazellen aufwiesen (Tiere Nr. 13, 16). Ein Teil
der subkapsulären Follikel war im Verlauf der Infektion zudem netzwerkartig für IgA
markiert (Tiere Nr. 15, 24, 26). Einzelne Lymphfollikel wurden von IgA+ Plasmazellen
umgeben (Tiere Nr. 8, 28). Die zonierten Follikel waren zudem positiv für IgG1 und
enthielten mitunter einzelne IgG1+ Plasmazellen.
In den Follikeln waren regelmäßig wenige CD4+ T-Zellen verteilt und einzelne CD8+ T-
Zellen zu beobachten. Bei zwei Tieren waren einzelne γδ+ T-Zellen in den Follikeln verteilt
(Tiere Nr. 16, 22). Makrophagen waren wie bei den Kontrollen diffus verteilt. Die Follikel
waren mit Bereichen des umliegenden Paracortex netzwerkartig für CD25 markiert. Teilweise
waren die Lymphfollikel lediglich kapselseitig positiv für CD25 (Tiere Nr. 18, 21) oder
lediglich randständig markiert.
Am Tag 35/37 pi wiesen die Follikel mit einer Ausnahme (Tier Nr. 26) eine netzwerkartige
CD25+ retikuläre Markierung der kapselseitigen Follikelhälfte auf. Die Follikel waren zum
Teil positiv für IgM und IgG1 und enthielten bei einem Tier einzelne IgG1+ Plasmazellen
(Tier Nr. 26).
Paracortex
Im Paracortex waren im Verlauf der Infektion wie bei den Kontrollen überwiegend dicht
gedrängte CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten verteilt. Zwischen der retikulären CD25+
Markierung von Teilen des Paracortex waren wenige und zum Teil multifokal viele CD25+
aktivierte Zellen verteilt. Markiert wurden kleine und große, überwiegend runde Zellen. Im
Paracortex eines Lymphknotens waren keine aktivierten CD25+ Zellen vorhanden (Tier
Nr. 21). Abweichend zu den Kontrollen waren bei einzelnen Tieren am Übergang von
Paracortex zur Medulla vermehrt γδ+ T-Lymphozyten verteilt (Tiere Nr. 8, 13, 22). Im
übrigen Paracortex befanden sich regelmäßig einzelne γδ+ T-Zellen. Einzelne IgM+
Plasmazellen waren um die Follikel lokalisiert. Bei einem Tier waren multifokal subkapsulär
Ansammlungen aus IgM+ Plasmazellen zu sehen (Tier Nr. 16). Wenige kleine Makrophagen
waren regelmäßig multifokal im Paracortex verteilt. Bei den Tieren Nr. 13 und 22 waren viele
Makrophagen zu sehen. Weiterhin waren viele CD1b+ dendritischen Zellen zu beobachten,
die die Lymphfollikel umgaben und sich diffus im Paracortex verteilten. Im Vergleich zu den
141 ERGEBNISSE
Kontrollen waren am Tag 2 pi und 3 pi zum Teil (Tiere Nr. 10, 11, 13) vermehrt dendritische
Einzelzellen entlang der Intermediärsinusoide sichtbar. Weiterhin markierten sich
überwiegend einzelne Zellkörper. Am Tag 4 und 7 pi lagen bei zwei Tieren (Tiere Nr. 14, 17)
weniger dendritischer Zellen vor. Dabei waren nur einzelne dendritische Zellen im Paracortex
verteilt. Sie waren subkapsulär und entlang der Intermediärsinusoide angeordnet. Im weiteren
Verlauf waren meist ungleichmäßige Verteilungsmuster und Mengen zu beobachten. Bei Tier
Nr. 20 waren weniger dendritische Zellen als bei den Kontrollen vorhanden. Am Tag 10 pi
waren einzelne IgM+ Plasmazellen um die Follikel verteilt. Am Tag 35/37 pi waren im
Paracortex multifokal Ansammlungen aus IgM+ B-Lymphozyten und Plasmazellen
vorhanden. Am Tag 35/37 pi waren dendritische Zellen in unterschiedlicher Zahl
entsprechend der Kontrollen verteilt.
Medulla
Die T-Zellsubtypen, CD1b+ dendritische Zellen und Makrophagen verteilten sich in den
Marksträngen wie bei den Kontrollen. Plasmazellen unterschieden sich in der Anzahl von
Tier zu Tier und im Verlauf der Infektion. Nur zum Teil war eine diffuse granuläre
Markierung für IgA und für IgM vorhanden, zum Teil fehlte sie (Tiere Nr. 8, 13). Am Tag 2
und 3 pi waren keine IgA+ und nur wenige IgM+ Plasmazellen zu sehen (Tiere Nr. 8, 13)
oder sehr viele IgM+ Plasmazellen gleichmäßig in den Marksträngen angeordnet (Tier
Nr. 12). Zudem waren einzelne IgG1+ Plasmazellen zu sehen. Am Tag 4 pi wurden sehr viele
IgM+ Plasmazellen und B-Lymphozyten, viele IgA+ und wenige IgG1+ Plasmazellen, die
vorwiegend am Übergang zwischen Paracortex und Medulla lagen, beobachtet (Tiere Nr. 14,
15, 16). Ab Tag 7 pi waren zum Teil viele IgG1+ Plasmazellen gleichmäßig oder in
multifokalen Ansammlungen in den Medullarsinusoiden verteilt (Tiere Nr. 14, 17). IgA+ und
IgM+ Plasmazellen waren in unterschiedlicher Anzahl vorhanden. In einem Teil der
Lymphknoten waren viele IgA+ Plasmazellen verteilt (Tiere Nr. 19, 24, 26). Die Zahl an
IgM+ Plasmazellen nahm im Gegensatz zu IgG1+ Plasmazellen im Infektionsverlauf ab. Zum
Teil waren vermehrt IgM+ B-Lymphozyten vorhanden (Tiere Nr. 21, 25). IgG1+
Plasmazellen lagen am Tag 14 pi multifokal in Ansammlungen vor (Tiere Nr. 23, 24). Bei
einem Tier waren einzelne IgG1+ Plasmazellen vorhanden (Tier Nr. 25). Zusätzlich waren
IgM+ und IgA+ Ablagerungen zwischen den Zellen vorhanden (Tier Nr. 25).
ERGEBNISSE 142
Am Tag 35/37 pi waren die Markstränge diffus für IgA und schwach für IgM markiert. IgA+
und IgM+ Plasmazellen waren bei einem Tier nicht enthalten (Tier Nr. 26). Bei einem
anderen Tier waren viele IgM+ B-Lymphozyten und Plasmazellen vorhanden (Tier Nr. 27).
Viele IgG1+ Plasmazellen lagen multifokal in kleinen Ansammlungen vor (Tiere Nr. 27, 28).
4.1.2.10 Tonsilla pharyngea
Die Tonsilla pharyngea blieb im Verlauf der Infektion mit C. psittaci in ihrer Struktur
unverändert. Im Infektionsverlauf waren immunhistologisch keine Erregerstadien
nachweisbar.
Epithel
Die Anzahl und Verteilung der intraepithelialen Leukozytensubpopulationen waren nach der
Inokulation mit C. psittaci weitestgehend unverändert. Im Unterschied zu den Kontrollkälbern
waren am Tag 7 und 10 pi einzelne aktivierte CD25+ Zellen vorhanden (Tiere Nr. 17, 22).
Bei einem Kalb (Tier Nr. 21) lagen fokal vermehrt CD8+ T-Zellen vor. Teilweise waren
einzelne eosinophile Granulozyten zwischen den Epithelzellen lokalisiert (Tiere Nr. 21, 22,
27).
Subepithelialer Bereich
Ab Tag 4 pi waren multifokale Ansammlungen aus IgM+ B-Lymphozyten zu sehen (Tiere
Nr. 14, 16) und bei einem Tier (Tier Nr. 17) kleine Ansammlungen aus IgA+ Plasmazellen zu
beobachten. Wenige aktivierte CD25+ Zellen verteilten sich im Verlauf der Infektion
ungleichmäßig entlang des Tonsillarepithels. Ab Tag 7 pi lagen sie zum Teil in fokalen
Ansammlungen vor (Tiere Nr. 17, 27). Am Tag 35 pi waren erneut und entsprechend der
Kontrollen subepithelial einzelne IgG1+ Plasmazellen aufgereiht.
Lymphfollikel
Die Follikel markierten sich weiterhin homogen für MHC II, wobei sie durch die diffuse
Markierung der anderen Bereiche nur bedingt von der IFZ abzugrenzen waren. Die Follikel
bestanden aus IgM+ B-Lymphozyten und markierten sich überwiegend retikulär für IgM. Sie
waren zudem diffus oder netzwerkartig für IgG1+ markiert und wiesen regelmäßig in der
Peripherie zum Teil einzelne IgM+ und/oder IgG1+ Plasmazellen auf. Bei einzelnen
Lymphfollikeln markierte sich das Keimzentrum retikulär für IgA.
143 ERGEBNISSE
Ab Tag 2 pi waren vermehrt CD4+ T-Zellen im Follikel verteilt. Bei einem Tier waren viele
CD4+ Zellen vorhanden (Tier Nr. 21). Die Lymphfollikel waren heterogen für CD25
markiert. Die Follikel waren im Gesamten, mit der epithelseitigen Zone oder randständig
markiert. Am Tag 35/37 pi waren die Follikel nur noch schwach positiv für CD25 oder
lediglich randständig markiert.
Interfollikularzone (IFZ)
In der Interfollikularzone waren CD4+ T-Zellen im Unterschied zu den Kontrollen zusätzlich
als dichte Ansammlungen vorhanden. Einzelne γδ+ T-Zellen waren um die Follikel
lokalisiert. Die retikuläre CD25+ Markierung der Follikel fand sich zum Teil in der IFZ
wieder (Tiere Nr. 8, 16). Zudem waren wenige bis viele (Tier Nr. 13) CD25+ Einzelzellen
multifokal in kleinen Ansammlungen verteilt. Ab Tag 4 pi waren multifokal vermehrt IgM+
B-Lymphozyten zu sehen und einzelne IgM+ und IgA+ Plasmazellen vorhanden.
ERGEBNISSE 144
4.2 Ultrastrukturelle Ergebnisse
Von den Kontrollkälbern und von Kälbern, die C. psittaci erhalten hatten, wurden Proben aus
der Lunge für die transmissionselektronenmikroskopische Untersuchung aufbereitet.
4.2.1 Kontrollkälber
Die Blut-Luft-Schranke wurde von dünnen Lagen aus Alveolarepithelzellen Typ I (AEC I),
Basalmembran und Endothelzellen gebildet. In den Lungen klinisch gesunder Kälber waren
die langen Ausläufer der AEC I über tight junctions verbunden. Ihre luminale Oberfläche war
meist wellig. Der ovale Zellkern wurde von einem dünnen Zytoplasmasaum umgeben und
war nur selten sichtbar (Abb. 42A). Die Ausläufer der AEC I enthielten zahlreiche kleine
Vesikel von kreisrunder oder ovaler Form, selten waren oval geformte Mitochondrien zu
sehen, die überwiegend kernnah vorlagen. Mitunter waren Alveolarepithelzellen vom Typ II
(AEC II) über tight junctions in den Zellverband eingegliedert (Abb. 42B). Im Vergleich zu
den AEC I bildeten sie nur einen kleinen Anteil der alveolären Oberfläche. An der apikalen
Seite der AEC II waren kurze und plumpe Mikrovilli zu sehen. Der Zellkern enthielt bis zu
zwei Nukleoli und war chromatinreich. AEC II besaßen einen breiten Zytoplasmasaum.
Charakteristisches Merkmal waren intrazytoplasmatische lamelläre Körperchen in
unterschiedlicher Größe. Im Zytoplasma waren Vakuolen, polymorphe Mitochondrien, raues
Endoplasmatisches Retikulum (rER) und freie Ribosomen vorhanden.
Die Endothelzellen von Arteriolen und Kapillaren waren durch zahlreiche, kleine einheitlich
große pinozytotische Vesikel im Zytoplasma gekennzeichnet. Ihre polymorphen Zellkerne
waren häufig sichtbar und ragten in das Kapillarlumen oder legten sich der Basalmembran
(BM) flach an. Die Endothelzellen waren fest über interzelluläre tight junctions miteinander
verbunden. Das Lumen von Kapillaren oder Arteriolen war häufig mit einem oder mehreren
Erythrozyten ausgefüllt; zum Teil waren Thrombozyten (Tier Nr. 1) oder große intravaskuläre
Makrophagen zu sehen (Tier Nr. 5). In dem translucenten Zytoplasma der PIMs befanden sich
viele Mitochondrien und Phagolysosomen mit heterogen elektronendichtem Inhalt.
Die Basalmembran war mäßig elektronendicht und lag dem Endothel und Epithel
gleichmäßig eng an. Die Basalmembran wurde stichprobenartig vermessen und war zwischen
30 und 90 nm dick.
145 ERGEBNISSE
Im Alveolarlumen waren selten Alveolarmakrophagen zu finden (Abb. 42C; Tiere Nr. 1, 3).
Sie lagen dem Alveolarepithel auf oder lagen frei im Alveolarlumen. Auf ihrer Zelloberfläche
zeigten sich Pseudopodien, die vereinzelt extrazelluläre Partikel umgaben (Tier Nr. 3). Im
Zytoplasma waren zahlreiche unterschiedlich große polymorphe Phagolysosomen mit
heterogenem Inhalt zu sehen. Sie enthielten häufig osmiophile Substanz oder amorphes
Material, das sich auch frei in den Alveolen wiederfand. Im Zytoplasma waren viele
vorwiegend oval geformte Mitochondrien, ER und elektronendichte Granula vorhanden. Der
runde oder ovale chromatinarme Zellkern wies einen oder mehrere Nukleoli auf.
ERGEBNISSE 146
Abb. 42: Transmissionselektronenmikroskopische Befunde des Alveolarepithels (A, B) und
eines Alveolarmakrophagen (C) bei den Kontrollkälbern.
A: Alveolarepithelzellen Typ I (AEC I) besitzen lange Zytoplasmaausläufer (Pfeilspitzen,
exemplarisch) und einen längsovalen Zellkern (Z).
Tier Nr. 1, Lobus cranialis dexter, pars caudalis; Eichstrich = 5 µm
B: Alveolarepithelzellen Typ II (AEC II) besitzen charakteristische lamelläre Körperchen
(Stern, exemplarisch) und zahlreiche Mitochondrien (Pfeilspitzen, exemplarisch). Auf ihrer
Oberfläche sind plumpe Mikrovilli sichtbar.
Tier Nr. 1, Lobus cranialis dexter, pars caudalis; Eichstrich = 3 µm
C: Alveolarmakrophage mit multiplen Phagolysosomen (Sterne weiß, exemplarisch),
Pfeilspitze zeigt, die Phagozytose von extrazellulärem Material.
Tier Nr. 3, Lobus cranialis sinister, pars caudalis; Eichstrich = 3 µm
147 ERGEBNISSE
ERGEBNISSE 148
4.2.2 Kälber inokuliert mit C. psittaci
4.2.2.1 Lungenveränderungen nach der Inokulation mit C. psittaci an den Tagen 2, 3, 4,
7 und 10 pi
Am Tag 2 pi infiltrierten vorwiegend neutrophile Granulozyten das Alveolarlumen
(Abb. 43A). Neutrophile Granulozyten ließen sich aufgrund des elektronendichten
segmentierten Zellkerns und der vielen elektronendichten Granula im Zytoplasma
unterscheiden. Sie grenzten mitunter eng aneinander, wobei fädige Zytoplasmaausstülpungen
den Kontakt zu angrenzenden PMNs herstellten. Die Mehrzahl der PMNs enthielt ein oder
mehrere intrazytoplasmatische Phagolysosomen mit heterogenem Inhalt und Vakuolen.
Weiterhin waren AEC II abzugrenzen, die Vesikel mit osmiophiler Substanz enthielten. Ihre
Oberfläche wurde luminal von neutrophilen Granulozyten umgeben. Die Basalmembran war
überwiegend intakt. In angrenzenden Kapillaren zeigten sich vermehrt Erythrozyten (Tier
Nr. 8). Im Alveolarlumen waren vereinzelt Alveolarmakrophagen (Abb. 43B) mit
segmentiertem Zellkern oder untergehende Zellen sichtbar. Zudem waren multifokal Bündel
aus feinen Fasern mit periodischer Querstreifung, die der Morphologie und dem Aufbau von
Fibrin entsprachen, vorhanden. Die Alveolarepithelzellen Typ I (Tiere Nr. 8, 13) waren
geschwollen, translucent und enthielten vergrößerte pinozytotische Vesikel. AEC I waren
überwiegend als intakter Zellverband organisiert, wobei sie sich multifokal von der
Basalmembran lösten. Die Endothelzellen waren ebenfalls geschwollen und translucent und
der interzelluläre Spalt war nicht mehr zu erkennen (Tier Nr. 8). Multifokal war lediglich die
Basalmembran ohne Endothel und Epithel sichtbar. Bei einem Tier war in einer Kapillare ein
PIM mit translucentem, organellenreichem Zytoplasma, der ein Phagolysosom mit
unterschiedlich großen, runden Gebilden und mit unterschiedlicher Elektronendichte enthielt,
vorhanden. Der Zellkern war dabei nicht zu sehen.
Am Tag 3 pi war zunehmende Strukturlosigkeit zu beobachten. Neutrophile Granulozyten
enthielten zahlreiche Vakuolen und zeigten geschwollene Zellkerne. Lediglich die
Basalmembran gab Hinweise auf die ursprüngliche Morphologie der Lunge. Wenige intakte
Alveolarmakrophagen konnten identifiziert werden.
Am Tag 4 pi waren viele geschwollene, nicht mehr intakte Zellen, wenige
Alveolarmakrophagen (Abb. 43C) und einzelne neutrophile Granulozyten zu sehen. Die
149 ERGEBNISSE
Zellkerne untergehender Zellen wiesen einen erweiterten perinukleären Spalt auf, das
Chromatin war in der Peripherie verklumpt und im Gesamtenerschienen die Zellkerne und
Zytoplasma translucent. Das Zytolplasma war Ihr Zytoplasma enthielt multiple große
Phagolysosomen (Abb. 43C). Diese wiesen unterschiedlich elektronendichte nicht
zuzuordnende Fragmente auf, die sich zum Teil immunelektronenmikroskopisch mit Gold
markierten (Abb. 47). Intakte PMNs waren eng assoziiert mit solchen Alveolarmakrophagen,
die intrazytoplasmatische Einschlüsse aufwiesen (Tier Nr. 16). Bei einem Tier war eine Zelle
mit langen Zytoplasmaausläufern vorhanden, die als DC identifiziert wurde. Im Zytoplasma
war zahlreiches ER und wenige Mitochondrien enthalten (Tier Nr. 15). Die Zelle wies einen
großen Zellkern auf, der gleichmäßig schwach elektronendicht war und wenig granuläres
Chromatin enthielt.
Am Tag 7 und 10 pi war überwiegend keine eindeutige Zellstruktur zu erkennen. Die
strukturlose Masse enthielt Fibrinfäden und einzelne Erythrozyten. Bei einem Tier konnte im
Alveolarraum eine weitere DC identifiziert werden (Tier Nr. 17). Häufig waren lediglich die
Kapillaren abgrenzbar. Sie waren überwiegend mit Erythrozyten ausgefüllt. Bei einem Tier
grenzte an die intakte Basalmembran eine große Zelle mit gleichmäßig elektronendichtem
Zellkern und weniger elektronendichtem Zytoplasma (Tier Nr. 22). Das Zytoplasma enthielt
ein großes Phagolysosom mit stark osmiophilen Fragmenten. Peripher war keine eindeutige
Zellstruktur zu erkennen und weiterhin Fibrin enthalten. Phagolysosomen prägten das Bild zu
diesen Zeitpunkten, diese waren überwiegen zu untergehenden Zellen assoziiert (Tier Nr. 20).
ERGEBNISSE 150
Abb. 43: Transmissionselektronenmikroskopische Befunde an den Tagen 2 und 4 pi im
veränderten Lungengewebe nach der Inokulation mit C. psittaci.
A: Neutrophile Granulozyten (Sterne, exemplarisch) sind am Tag 2 pi zahlreich im
Alveolarraum verteilt. Wenige Chlamydienstadien liegen frei im Zytoplasma oder finden sich
in Phagolysosomen wieder (Pfeilspitze, exemplarisch). Eine Zelle weist eine hochgradige
Kernwandhyperchromasie (K) auf.
Tier Nr. 10, Lobus cranialis sinister, pars caudalis; Eichstrich = 5,0 µm
B: Alveolarmakrophage (Sterne) ist am Tag 2 pi von neutrophilen Granulozyten (Stern)
umgeben. Im Zytoplasma liegen 0,3 µm große Chlamydienstadien (Pfeilspitzen,
exemplarisch). Zudem liegen zahlreiche Phagolysosomen mit heterogenem Inhalt vor.
Tier Nr. 10, Lobus cranialis sinister, pars caudalis; Eichstrich = 3,0 µm
C: Alveolarmakrophage (Sterne) enthält am Tag 4 pi multiple Phagolysosomen (P) mit
heterogenem Inhalt, wobei Chlamydienstadien nicht abzugrenzen sind.
Tier Nr. 16, Lobus cranialis dexter pars caudalis; Eichstrich = 5,0 µm
151 ERGEBNISSE
ERGEBNISSE 152
4.2.2.2 Morphologie von C. psittaci in der Lunge
Die Spezifität des Nachweises von C. psittaci wurde an den Tagen 2 und 4 pi durch den
immunelektronenmikroskopischen Nachweis und durch die gezielte Entnahme aus
paraffineingebettetem Gewebe erhöht. Dabei waren die in paraffineingebetteten Gewebe
aufgrund des geringen Strukturerhaltes nur begrenzt auswertbar.
Am Tag 2 pi wurden Einschlüsse mit verschiedenen Entwicklungsstadien der Chlamydien
nachgewiesen (Abb. 44). Alle Stadien waren von einer Doppelmembran umgeben. Die äußere
Membran war teilweise abgehoben und wellig. Es waren Körperchen mit einem Durchmesser
von 0,3 µm zu sehen, die als Elementarkörperchen (EK) identifiziert wurden. Ihr Zellleib war
homogen elektronendicht und von einer glatten Doppelmembran begrenzt. Zudem waren
Körperchen mit einem Durchmesser von 0,3-0,6 µm vorhanden, die als
Intermediärkörperchen (IK) identifiziert wurden. IKs waren vermehrt elektronendurchlässig
und enthielten einen meist zentralen elektronendichten Kern. Ihre Zellwand war glatt oder
gewellt. Weiterhin waren größere Körperchen mit einem Durchmesser von 0,5-0,7 µm und
mäßig elektronendichtem, granulären Zellleib vorhanden, die von einer unebenen Membran
umgeben waren. Sie wurden als Retikularkörperchen (RK) identifiziert. Bei der
immunelektronenmikroskopischen Markierung waren 18 nm Goldpartikel gehäuft in der
Zellmembran der Chlamydien nachweisbar. Im übrigen Schnitt waren nur vereinzelte
Goldpartikel nachweisbar. Dies stimmt überein mit Befunden an C. psittaci infizierten
Zellkulturzellen, die als positive Kontrolle verwendet wurde. In dieser waren alle
Erregerstadien entlang der Zellmembran mit Goldpartikeln markiert. Von jedem
Schnittpräparat wurde ein Konsekutivschnitt mit einem Antikörper desselben Isotyps gegen
BVDV anstelle des ersten Antikörpers gegen Chlamydiaceae-LPS behandelt. In diesen
Negativkontrollen waren nur einzelne Goldpartikel zu finden. In der Lungenprobe eines
Tieres waren Einschlüsse zu sehen, die zugleich EK, IK und RK enthielten (Tier Nr. 10). Die
Chlamydienstadien waren größtenteils von einer Inklusionsmembran umgeben. Der
Einschluss befand sich in einer flachen Zelle, die der Basalmembran eng auflag und aufgrund
dessen als AEC I identifiziert wurde (Abb. 44). Im selben Tier war ein ähnlicher Einschluss in
einer weiteren AEC I zu sehen (Abb. 45). Da diese Einschlüsse sehr selten waren, konnten sie
bei der immunelektronenmikroskopischen Untersuchung nicht nachgewiesen werden
153 ERGEBNISSE
Abb. 44: Chlamydieneinschluss mit verschiedenen Erregerstadien. Zu sehen sind
Elementarkörperchen (E, exemplarisch) mit einer Größe von 0,3 µm, Intermediärkörperchen
(I, exemplarisch) mit einer Größe von 0,4 µm und Retikularkörperchen (R, exemplarisch) mit
einer Größe von 0,6 µm.
Tier Nr. 10, Lobus cranialis sinister, pars caudalis; Eichstrich = 800 nm
ERGEBNISSE 154
Am Tag 2 pi lagen neutrophile Granulozyten zahlreich in den Alveolarlumina (Abb. 43A). In
den neutrophilen Granulozyten waren EKs und häufiger IKs frei im Zytoplasma zu finden
(Abb. 43A; Tiere Nr. 8, 10). Zusätzlich gab es kleine Vakuolen, die wenige Erregerstadien
(Abb. 46) und elektronendichtes Material enthielten. Diese wurden nicht als chlamydiale
Einschlüsse, sondern als Phagolysosomen angesprochen. Immunelektronenmikroskopisch
ließen sich Goldpartikel an der Außenmembran der EKs und IKs finden. Sowohl frei im
Zytoplasma, als auch in Phagolysosomen liegende Chlamydien wurden mit Gold markiert.
Chlamydien waren zu diesem Zeitpunkt auch in Alveolarmakrophagen darstellbar. EKs und
IKs lagen frei im Zytoplasma oder befanden sich im Phagolysosom (Abb. 47).
155 ERGEBNISSE
An den Tagen 3 und 4 pi waren EKs und IKs mit einem Durchmesser von 0,2-0,4 µm einzeln
oder in Ansammlungen in untergehenden Zellen zu finden. Häufig war lediglich unscharf
begrenztes, granuläres Zytoplasma zu sehen, ohne dass die Wirtszelle identifiziert werden
konnte (Tiere Nr. 8, 11, 13). Seltener waren pyknotische, einheitlich elektronendichte
segmentierte Zellkerne sichtbar. Die Chlamydienstadien waren zum Teil von einer Membran
umgrenzt. In den Alveolen waren Alveolarmakrophagen mit zahlreichen Phagolysosomen
und wenigen neutrophilen Granulozyten zu finden (Tier Nr. 13). Alveolarmakrophagen und
neutrophile Granulozyten enthielten Chlamydienstadien, die sich immunelektronen-
mikroskopisch mit Gold markieren ließen. Zudem waren heterogen elektronendichte
Phagolysosomen vorhanden, in denen keine eindeutigen Erregerstadien erkennbar waren
(Abb. 47). Die Alveolarmakrophagen waren am Tag 4 pi häufig von dilatiertem ER
durchzogen und enthielten im Zytoplasma multiple Einschlüsse, die aus elektronenarmen,
runden Strukturen und elektronendichten Massen bestanden. Immunelektronenmikroskopisch
ließen sich in den Phagolysosomen der Alveolarmakrophagen nicht eindeutig mit
Erregerstadien assoziierte Ansammlungen von Goldpartikeln beobachten (Tier Nr. 16). Diese
lagen in der Zellwand von Strukturen, die nicht das charakteristische Aussehen von
Chlamydien hatten, und als teilweise abgebaute Chlamydien interpretiert wurden.
ERGEBNISSE 156
Abb. 45: Transmissionselektronenmikroskopische Befunde am Tag 2 pi im veränderten
Lungengewebe.
Tier Nr. 10, Lobus cranialis sinister, pars caudalis;
A: Ein Chlamydieneinschluss in einer AEC I, die der Basalmembran (Pfeile, exemplarisch)
anliegt. Im Alveolarbereich liegt ein neutrophiler Granulozyt (Stern schwarz). Im
Kapillarlumen befinden sich Thrombozyten (T, exemplarisch) und Fibrin (Sterne weiß,
exemplarisch).
Eichstrich = 2,3 µm
B: Die höhere Vergrößerung von A zeigt den Inhalt des Chlamydieneinschlusses mit
Elementarkörperchen (E, exemplarisch) und Intermediärkörperchen (I, exemplarisch). Zudem
liegt ein großes wenig elektronendichtes Körperchen (Sterne schwarz) mit einem
Durchmesser von 1 µm vor, bei dem es sich möglicherweise um ein Retikularkörperchen
handelt.
Eichstrich = 1,2 µm
157 ERGEBNISSE
ERGEBNISSE 158
Abb. 46: Darstellung der immunelelektronenmikroskopischen Befunde am Tag 2 pi.
Tier Nr. 10, Lobus cranialis sinister, pars caudalis;
A: Im Zytoplasma eines neutrophilen Granulozyten (Stern) liegt ein EK (Pfeilspitze) und ein
IK (Pfeil). Die Wand der Chlamydienstadien ist mit Goldpartikeln markiert. Die beiden
Erregerstadien liegen in einer membrangebundenen Vakuole (P), in der sich zusätzlich
amorphes Material befindet. Einzelne Goldpartikel sind diffus über dem Schnitt verteilt
(Pfeilspitze umrandet, exemplarisch).
Eichstrich = 3,0 µm
B: Die höhere Vergrößerung von A zeigt 18 nm Goldpartikel (Pfeilspitzen, exemplarisch)
entlang der Außenmembran der Chlamydien (Stern) in einem Phagolysosom (P).
Eichstrich = 600 nm
159 ERGEBNISSE
ERGEBNISSE 160
Abb. 47: Darstellung der immunelelektronenmikroskopischen Befunde am Tag 2 pi in einem
Alveolarmakrophagen.
Tier Nr. 10, Lobus cranialis sinister, pars caudalis;
A: Goldpartikel markieren Chlamydienstadien (Pfeile), die frei im Zytoplasma eines
Alveolarmakrophagen (PAM) vorliegen. Zusätzlich ist ein Phagolysosom mit amorphem
Material enthalten (Pfeilspitze umrandet).
Eichstrich = 3,0 µm
B: Die höhere Vergrößerung von B zeigt mit Gold markierte 0,4-0,6 µm große
Intermediärkörperchen (Sterne).
Eichstrich = 600 nm
161 ERGEBNISSE
ERGEBNISSE 162
Abb. 48: Immunelelektronenmikroskopische Befunde am Tag 4 pi in einer degenerierten
Zelle.
Tier Nr. 16, Lobus cranialis dexter, pars caudalis;
A: Die Zelle ist geschwollen und zeigt dilatiertes ER. Sie enthält mehrere Phagolysosomen
(P), in denen sich Ansammlungen von 18 nm Goldpartikeln befinden (Pfeilspitze).
Eichstrich = 2,3 µm
B: Die höhere Vergrößerung von A zeigt 18 nm Goldpartikel, die die Außenwand eines
0,3 µm großen Körperchens (Stern) markieren, das keine typische Chlamydienmorphologie
aufweist.
Eichstrich = 500 nm
163 ERGEBNISSE
DISKUSSION 164
5 DISKUSSION
Natürliche Infektionen mit Chlamydien treten weltweit bei Mensch und Tier auf
(LONGBOTTOM u. COULTER 2003). Dabei verlaufen Infektionen mit Chlamydien oft
subklinisch oder werden aufgrund schwieriger Diagnostik fehlerhaft interpretiert. Dies führt
dazu, dass die Bedeutung des Erregers unterschätzt wird (HARKINEZHAD et al. 2007;
ROHDE et al. 2010). Im Fokus aktueller Forschung stehen in erster Linie die
humanpathogenen Spezies C. trachomatis und C. pneumoniae. Beim Menschen verursacht
C. trachomatis üblicherweise Infektionen des Urogenitaltrakts und des Auges (SCHACHTER
1999). C. pneumoniae ist primär ein respiratorisches Pathogen und wird bei 5-20 % der
humanen ambulant erworbenen Pneumonien als Ursache vermutet (HAMMERSCHLAG
2000). Es gibt Hinweise darauf, dass Infektionen mit C. pneumoniae im Zusammenhang zu
Atherosklerose, Alzheimer und Multipler Sklerose stehen (STRATTON u. SRIRAM 2003;
BOREL et al. 2008).
C. psittaci ist eine Chlamydienspezies mit breitem Wirtsspektrum, die primär Vögel infiziert.
Bisher konnte der Erreger oder dessen Antikörper in 469 verschiedenen Vogelarten
nachgewiesen werden (KALETA u. TADAY 2003). C. psittaci ist übertragbar auf den
Menschen und stellt damit einen Zoonosererreger dar (MEYER 1967; NEWMAN et al. 1992;
BEECKMAN et al. 2008). Die aviäre Chlamydiose des Menschen ist weltweit, auch in
Deutschland, verbreitet (HARKINEZHAD et al. 2007; STRAUBE 2010). C. psittaci
verursacht beim Menschen meist respiratorische Erkrankungen mit variabler Symptomatik.
Nach der initialen Vermehrung in Epithelzellen kann der Erreger mit Hilfe von Makrophagen
im Organismus verschleppt werden und Endokarditis, Hepatitis oder Enzephalitis auslösen
(CARR-LOCKE u. MAIR 1976; SHEE 1988; VANROMPAY et al. 1995; BEECKMAN u.
VANROMPAY 2009; FRAEYMAN et al. 2010). Das Rind ist natürlicher Wirt für
verschiedene Chlamydienspezies (C. pecorum, C. abortus, C. psittaci, C. suis), die
Erkrankungen des Urogenitaltrakts, der Gelenke, des Euters, des Respirationstrakts oder des
Intestinaltrakts verursachen können (RONSHOLT 1978; REGGIARDO et al. 1989;
WITTENBRINK et al. 1993; JEE et al. 2004; PANTCHEV et al. 2010). Bei Kälbern in den
USA lag die Prävalenz von Chlamydieninfektionen bei 61 % (JEE et al. 2004). Beim Rind
wird häufig von inapparenten Infektionen berichtet (RONSHOLT 1978; SHEWEN 1980).
165 DISKUSSION
In der vorliegenden Studie wurde Organmaterial verwendet, das aus einem Tierversuch zur
Etablierung eines respiratorischen Infektionsmodells für C. psittaci stammte (OSTERMANN
et al. 2010). In der Studie wurden 21 Kälber mit C. psittaci intrabronchial inokuliert. Um den
Verlauf der Infektion untersuchen zu können, folgte im Anschluss an die Inokulation, an den
Tagen 2, 3, 4, 7, 10, 14 und 35/37, die sequentielle Sektion der Kälber. Die hier vorgelegte
Untersuchung hatte zum Ziel, die Immunreaktion des Wirtes auf die Infektion mit C. psittaci
im zeitlichen Verlauf immunhistologisch in Lunge, Nl. mediastinalis und Tonsilla pharyngea
zu verfolgen. Da Informationen zur Verteilung dieser Zelltypen bei gesunden Kälbern sehr
begrenzt zur Verfügung stehen, wurde diese zunächst bei nicht infizierten Kontrollkälbern
ausführlich dokumentiert (ALLAN et al. 1979; ANDERSON et al. 1986a, b; MATHY et al.
1997; BUCHENAU 2003; THOMASMEYER 2006). Dabei erfolgte eine vergleichende
Untersuchung zwischen den verschiedenen Lungenlappen. An die immunhistologische
Untersuchung schloss sich eine ultrastrukturelle Untersuchung an. Dabei war vorwiegend von
Interesse, bis zu welchem Zeitpunkt nach der Inokulation und in welchen Zellen der Erreger
replizierte.
Im ersten Teil der durchgeführten Studie wurde die Verteilung der Leukozytensubtypen bei
1,5 bis drei Monate alten Kälbern in der Lunge, in der Trachea, im Lymphknoten und in der
Tonsilla pharyngea untersucht. In der durchgeführten Untersuchung an den Lungen der
Kontrollkälber lagen zwischen den verschiedenen Lungenlappen keine Unterschiede in
Menge und Verteilung der untersuchten Leukozytensubpopulationen vor. Makrophagen
bildeten die dominierende Zellpopulation in der Lunge der klinisch gesunden Kälber. Dabei
ließen sich aufgrund von Lage und Morphologie Alveolarmakrophagen und Makrophagen in
den Interalveolarsepten unterscheiden. In den Interalveolarsepten konnte lichtmikroskopisch
nicht zwischen den in der Literatur beschriebenen interstitiellen und intravaskulären
Makrophagen (PIMs) unterschieden werden (STAUB 1994; ACKERMANN 2009). Eine
Identifizierung von intravaskulären Makrophagen war erst durch die sich anschließende
ultrastrukturelle Untersuchung möglich. Entsprechend der Beschreibung durch RYBICKA u.
DALY (1974) stellten sich PIMs als Zellen mit translucentem Zytoplasma dar, die dem
Endothel der Kapillaren auflagen. Die Zellen enthielten teilweise Phagolysosomen. Dies
spricht für, die in der Literatur beschriebene phagozytotische Aktivität der PIMs und ihre
Beteiligung an der Clearance von intravaskulär zirkulierenden Bakterien (CASWELL u.
DISKUSSION 166
WILLIAMS 2007). Zudem ist beschrieben, dass sie proinflammatorische Zytokine entlassen,
sobald sie mit bakteriellem Endotoxin in Kontakt kommen, was dazu führt, dass
Entzündungszellen angelockt werden (SINGH et al. 2004; CASWELL u. WILLIAMS 2007).
PIMs sind nicht in der gesunden Lunge des Menschen vorhanden (STAUB 1994), weshalb
der Vergleich der Situation bei Rind und Mensch nur bedingt möglich ist.
Die in geringer Zahl in den Alveolen vorliegenden Alveolarmakrophagen sollen unter
homeostatischen Bedingungen immunsuppressiv wirksam sein und das Alveolarepithel vor
unbedeutendem Antigen schützen (HOLT 1978; HOLT et al. 1993). In vitro-Untersuchungen
von HOLT (1993) zeigen, dass Alveolarmakrophagen humoral die Antigenpräsentation
dendritischer Zellen unterdrücken. Alveolarmakrophagen prozessieren und präsentieren
Antigen und initiieren so eine Immunantwort. Während einer Entzündungsreaktion sind sie
immunregulatorisch aktiv (CASWELL u. WILLIAMS 2007). Alveolarmakrophagen werden
über den mukoziliären Transport aus der Lunge entfernt und ausgehustet oder abgeschluckt.
Im Vergleich zu Alveolarmakrophagen sind dendritische Zellen potentere
antigenpräsentierende Zellen (REDDY et al. 1997). Generell werden sie als Wächterzellen
beschrieben, die an antigenzugänglichen Orten lokalisiert sind (STEINBRINK et al. 2009). In
der vorliegenden Arbeit wurde eine Subpopulation dendritischer Zellen untersucht, die CD1b
auf ihrer Oberfläche exprimieren (HOWARD et al. 1993). CD1b ist strukturell und
funktionell dem MHC ähnlich und dient der Präsentation lipidhaltiger Antigene (GELIN et al.
2009), wie beispielsweise das LPS der Chlamydien. CD1b+ und MHC II+ DC waren in der
vorliegenden Untersuchung in der Lamina propria mucosae von Trachea, Bronchien und
Bronchiolen aber auch in Interalveolarsepten, perivaskulär und im Interstitium verteilt.
Ähnliche Verteilungsmuster werden bei MHC II+ dendritischen Zellen in der menschlichen
Lunge beschrieben (SERTL et al. 1986).
In der vorliegenden Untersuchung war die Anzahl der DC an Bronchien besonders groß,
während weniger DC in der Lamina propria mucosae der Bronchiolen und in den
Interalveolarsepten zu finden waren. Diese Ergebnisse bestätigen Befunde von
THOMASMEYER (2006), die das Vorkommen dendritischer Zellen bei lungengesunden
Kälbern in Trachea und Lunge untersuchte und hierbei neugeborene bis 4 Monate alte Kälber,
6 bis 7 Monate alte Kälber und adulte Schlachtrinder einbezog. Eine mögliche Erklärung für
167 DISKUSSION
die Verteilung könnte sein, dass die Antigenexposition im Tracheobronchialbaum intensiver
ist als in tieferen Bereichen der Lunge.
In der eigenen Untersuchung ließ sich in der gesunden Kälberlunge die Expression von
MHC II auf Makrophagen, dendritischen Zellen, B-Lymphozyten, T-Lymphozyten,
Epithelzellen und Endothelzellen nachweisen. Dies bestätigt, die in der Literatur beschriebene
Verteilung des MHC II Moleküls auf einer Vielzahl von Körperzellen (TAYLOR et al. 1993;
TIZARD 2004c). In der vorliegenden Studie war neben MHC II positivem ebenfalls MHC II
negatives Bronchialepithel und Gefäßendothel zu beobachten. Von humanen
Alveolarepithelzellen Typ II wird in der Literatur berichtet, dass sie konstitutiv MHC II auf
ihrer Oberfläche tragen (CUNNINGHAM et al. 1997). Offensichtlich beteiligen sich
Epithelzellen des Respirationstrakts an der Antigenpräsentation. Dies wurde auch durch
Untersuchungen an Bronchialepithelzellen des Menschen, die per Bronchoskopie gewonnen
wurden, bestätigt. Dabei konnte nachgewiesen werden, dass Bronchialepithelzellen MHC II
Moleküle aktiv synthetisieren (ROSSI et al. 1990). In den Interalveolarsepten waren nur
einzelne Zellen von der Markierung für MHC II ausgespart. TAYLOR et al. (1993)
beschreiben eine Verteilung von MHC II auf aktivierten T-Lymphozyten. Möglicherweise
handelte es sich bei den MHC II – Zellen in den Interalveolarsepten um naive T-
Lymphozyten.
Das Epithel von Bronchien und Bronchiolen in der Lunge der Kontrollkälber war
unterschiedlich stark für IgA und IgM markiert. Aus der Literatur ist für beide
Immunglobulinisotypen der an pIgR-gebundene Transport durch das Epithel bekannt
(BRANDTZAEG 1975; LAMM 1997). Dabei bildet IgA eine wirksame Barriere, indem es
das Eindringen von inhalierten Pathogenen verhindert. Die weniger intensive Markierung
oder das Fehlen der Markierung für IgM an Bronchial- bzw. Bronchiolarepithelien erklärt
sich trotz des mit IgA-übereinstimmenden Nachweises im Epithel dadurch, dass das polymere
IgM im Gegensatz zu dimerem IgA weniger stabile Komplexe bildet und somit nicht auf der
Oberfläche der Luftwege anhaften bleibt (BRANDTZAEG 1975). In der vorliegenden
Untersuchung waren bei den Kontrollkälbern mehr IgA+ Plasmazellen in der Lamina propria
mucosae als IgM+ und IgG1+ Plasmazellen vorhanden. Im alveolären Parenchym waren
kaum Plasmazellen nachweisbar. Es lag jedoch eine diffuse intensive Markierung für IgG1
vor. Dies deutet auf die Bedeutung von IgG für das alveoläre Kompartiment hin. Bestätigt
DISKUSSION 168
werden diese Befunde von anderen Untersuchern, die im Vergleich zu IgG2, IgG1 und IgM
vermehrt IgA+ Plasmazellen in der Lamina propria mucosae des Tracheobronchialbaums und
kaum Plasmazellen im alveolären Parenchym fanden (ALLAN et al. 1979; ANDERSON et al.
1986b).
In den Lungen der klinisch gesunden Kälber waren IL-2 Rezeptor+ Zellen nur im BALT und
im Parenchym einer Lungenlokaliation bei einem Kalb vorhanden. Dies deutet darauf hin,
dass die vorhandene Antigenexposition nicht ausreichte, um die Expression des IL-2
Rezeptors zu stimulieren. Ähnlich dem MHC II Molekül wird auch der IL-2 Rezeptor als
Aktivierungsmarker beschrieben (QUADE u. ROTH 1999). Aus der Literatur ist bekannt,
dass dieser auf der Zelloberfläche von T- und B-Lymphozyten und Monozyten exprimiert
wird (WAHL et al. 1987). Eine genaue Zuordnung des Oberflächenrezeptors zu einer
Leukozytenpopulation war in der vorliegenden Untersuchung allein basierend auf der
Morphologie der Zellen im Kryostatschnitt nicht möglich und sollte in weiterführenden
Untersuchungen mit Hilfe einer Doppelmarkierung erfolgen. Hinweis auf unterschiedliche
Expressionmuster abhängig vom T-Zellsubtyp geben durchflusszytometrische
Untersuchungen an mononukleären Blutzellen, die von 12 Wochen alten Kälbern stammten
und mit M. bovis stimuliert wurden (VANDEN BUSH u. ROSENBUSCH 2003). Die
Untersuchung konnte zeigen, dass die Stimulation durch M. bovis, einem bakteriellen
extrazellulären Erreger, einen Anstieg des IL-2 Rezeptors auf CD4+, CD8+ und γδ+ T-
Lymphozyten zur Folge hat, wobei der Anstieg des IL-2 Rezeptors auf CD8+ T-Zellen
proportional kleiner war als auf CD4+ und γδ+ T-Lymphozyten.
In der eigenen Untersuchung an den Lungen der Kontrollkälber wurde die Verteilung und
Menge von CD4+, CD8+ und γδ+ T-Lymphozyten in den Alveolen und Bronchiolen
bestimmt. Dabei dominierten CD4+ T-Zellen gegenüber CD8+ T-Zellen in einem
durchschnittlichen Verhältnis von 1,2:1. Das Verhältnis aus beiden T-Zellpopulationen war
demnach im Vergleich mit dem Verhältnis, das im Blut von drei Monate alten Kälbern
vorliegt und bei 1,43:1 liegt, geringgradig zugunsten der CD8+ T-Lymphozyten verschoben
(WILSON et al. 1996). Im Gegensatz zu den eigenen Untersuchungen ergaben
Untersuchungen der BALF von 12 bis 18 Monate alten Kälbern und durchflusszytometrisch
untersuchtem Lungenparenchym derselben Altersgruppe überwiegend CD8+ T-Zellen
(MATHY et al. 1997). Eine Erklärung hierfür könnte sein, dass bei der Gewinnung von
169 DISKUSSION
BALF vor allem Zellen aus dem Alveolarlumen und Bronchiallumen berücksichtigt werden,
nicht aber aus den Interalveolarsepten. Dadurch werden vermehrt intraepitheliale CD8+ T-
Zellen gewonnen. Die in der vorgelegten Untersuchung durchgeführte immunhistologische
Charakterisierung lässt eine detaillierte Lagebestimmung zu und erlaubt eine differenziertere
Betrachtung als die Untersuchung von BALF und homogenisiertem Lungengewebe in der
Durchflusszytometrie.
Im Vergleich zu CD4+ oder CD8+ T-Lymphozyten konnten in den Alveolen und Bronchiolen
etwa halb so viele γδ+ T-Lymphozyten nachgewiesen werden. Von diesen Ergebnissen
weichen Befunde im Blut von Kälbern des gleichen Alters ab, in dem sich vermehrt γδ+ T-
Lymphozyten (30%) und seltener CD4+ (10%) und CD8+ T-Lymphozyten (7%) nachweisen
lassen (WILSON et al. 1996). Der relative Anteil der γδ+ T-Lymphozyten ist speziesabhängig
und altersabhängig. Mit zunehmendem Alter der Tiere ändert sich das Verhältnis zugunsten
der CD4+ T-Zellen (PARK et al. 1992). γδ+ T-Lymphozyten ließen sich unter anderem im
Epithel von Bronchien und Bronchiolen finden, von wo aus sie eine erste Abwehrlinie
gegenüber inhaliertem Antigen bilden. Aus diesem Grund werden sie funktionell der
natürlichen Immunabwehr zugeordnet, bei der keine auf MHC Moleküle beschränkte
Präsentation von Antigenen notwendig ist, um ihre Stimulation zu erreichen. In der eigenen
Untersuchung wurden selektiv γδ+ T-Lymphozyten mit WC1 Molekül markiert. Von diesen
ist aus der Literatur bekannt, dass sie im Gegensatz zu WC1- γδ+ T-Lymphozyten kein CD8
koexprimieren. Daher wurde durch die Anwendung des Antikörpers eine selektive
Markierung von γδ+ T-Lymphozyten erreicht. Die WC1+ Subpopulation umfasst γδ+ T-
Lymphozyten, die nach antigener Stimulation IFN-γ sezernierten (BLUMERMAN et al.
2006). Als Besonderheit und im Unterschied zum humanen Organismus, bei denen
CD4+/CD25+ T-Lymphozyten mit der Expression von Foxp3 regulatorisch wirksame Zellen
darstellen, sollen beim Rind γδ+ T-Lymphozyten diese Funktion übernehmen und die
Homeostase des Immunsystems erhalten (HOEK et al. 2009).
In der vorliegenden Arbeit wurde das lymphatische Gewebe (BALT) in der Lunge besonders
berücksichtigt. Aus der Literatur ist bekannt, dass BALT eine dynamische Struktur darstellt,
das sich in Abhängigkeit von der Antigenexposition entwickelt (ANDERSON et al. 1986a).
Bei den untersuchten Kontrollkälbern gab es große interindividuelle Unterschiede in Zahl und
Morphologie des BALT. Im Vergleich zu BALT wurden signifikant häufiger unorganisierte
DISKUSSION 170
Lymphaggregate aus CD4+ T-Lymphozyten gefunden. Dass nur wenig organisiertes BALT
vorhanden war, entspricht Ergebnissen anderer Untersucher und ist auf das Alter und die gute
Lungengesundheit der Kälber zurückzuführen (ANDERSON et al. 1986a). Eine bevorzugte
Verteilung von BALT in kranialen Lungenlappen, wie von ANDERSON (1986a)
beschrieben, konnte nicht bestätigt werden und erklärt sich durch die geringe Anzahl an
BALT, das in den Lungen zu finden war. Die Befunde zur Zellzusammensetzung des BALT
decken sich mit den Ergebnissen von TSCHERNIG u. PABST (2000), die am BALT des
Menschen erhoben wurden. Ähnlich zu den Follikeln in Tonsille und Lymphknoten
exprimierten auch im vorliegenden BALT B-Lymphozyten IgA, IgM und IgG1.
In der vorliegenden Untersuchung wurden die Leukozytensubpopulationen in der Tonsilla
pharyngea immunhistologisch charakterisiert. Beim gesunden Kalb entsprechen die Befunde,
denen von MANESSE und Mitarbeitern (1998), die an Kryostatschnitten der Tonsilla
pharyngea von Kälbern unterschiedlichen Alters (21 Tage, 60 Tage und 300 Tage alte Rinder)
die Verteilung von T-Lymphozyten, IgM, IgG und MHC II beschreiben.
Im zweiten Teil der durchgeführten Studie wurde die Entzündungsreaktion und
Immunantwort auf die intrabronchiale Applikation von C. psittaci bei 1,5 bis drei Monate
alten Kälbern charakterisiert. Dazu wurden Abwehrzellen des natürlichen und erworbenen
Immunsystems im entzündeten Lungengewebe und ergänzend im Nl. mediastinalis und in der
Tonsilla pharyngea untersucht. Dabei lassen die Abwehrzellen, die in das mit Chlamydien
infizierte Lungengewebe strömen, Rückschlüsse auf die Funktion des Immunsystems zu.
Durch ultrastrukturelle Untersuchungen wurde die Reaktion des Erregers auf die
Immunantwort erfasst. Hinlängliche in vivo- und in vitro-Studien zu C. trachomatis existieren
bereits und begründen die Fragestellung danach, ob die für C. trachomatis gewonnenen
Erkenntnisse auch auf andere Chlamydienstämme im Besonderen auf C. psittaci übertragbar
sind. Zwischen den beiden Chlamydienspezies bestehen sowohl Übereinstimmungen als auch
Differenzen hinsichtlich ihres Wirtsspektrums, ihrer Inklusionsmorphologie und ihrer
Ultrastruktur (KINGSBURY u. WEISS 1968; MOULDER 1991).
Die Verabreichung von C. psittaci in einer hohen Dosis in die Bronchien von Kälbern
induzierte eine hochgradig eitrig-fibrinöse Bronchopneumonie mit Nekroseherden. Dabei
waren die pathomorphologischen Veränderungen auf die Infektion und Replikation von
171 DISKUSSION
C. psittaci im Lungengewebe zurückzuführen, da die Inokulation von sterilem SPGA-
Medium und BGM-Zellen oder inaktivierten Chlamydien des gleichen Volumens bei der
Kontrollgruppe keine Lungenveränderungen hervorrief (LAMBERTZ 2011). Generell
beeinflusst die Anatomie der bovinen Lunge die Pathogenese bakterieller Infektionen. So
wird die Bronchopneumonie durch fehlende kollaterale Alveolarverbindungen und ein
ausgeprägtes interlobuläres Bindegewebe auf die Läppchen begrenzt (ROBINSON 1982;
CASWELL u. WILLIAMS 2007). Die Schädigung war besonders an den Tagen 3 und 4
hochgradig ausgeprägt und lässt sich nur zum Teil durch die direkte Wirkung der Chlamydien
erklären, die sich in den Wirtszellen vermehren. Vor allem bedingen infiltrierende
Abwehrzellen den Zelluntergang.
Immunhistologisch waren Chlamydien bereits 2 Tage nach der Inokulation in
Alveolarepithelzellen Typ I zu sehen. Dies ließ sich auch in der
transmissionselektronenmikroskopischen Untersuchung bestätigen, mit Hilfe derer zu diesem
Zeitpunkt intrazelluläre Einschlüsse zu beobachten waren, die alle Entwicklungsstadien
aufwiesen. Damit konnte in der vorliegenden Studie gezeigt werden, dass C. psittaci in vivo in
AEC I repliziert. Auch aus der Literatur ist bekannt, dass Chlamydien primär Nicht-
Immunzellen infizieren (RASMUSSEN et al. 1997; STEPHENS 2003). Dabei unterscheiden
sich Chlamydien in vielerlei Hinsicht gegenüber regulären gram-negativen Bakterien. So ist
das üblicherweise als Virulenzfaktor gram-negativer Bakterien beschriebene LPS bei den
Chlamydien durch das speziell aufgebaute Lipid A nur gering endotoxisch aktiv (KOSMA
1999). Zudem fehlt den Chlamydien das Proteoglykan, das in der Literatur als ein weiterer
typischer Auslöser von Entzündungen beschrieben wird (BARBOUR et al. 1982;
HEUMANN u. ROGER 2002). Aus der Literatur sind verschiedene Evasionsmechanismen
bekannt, die die Chlamydien nutzen, um ihr Überleben zu sichern. Beispielsweise konnte von
ZHONG und Mitarbeitern (1999, 2000) bei in vitro-Experimenten gezeigt werden, dass
C. trachomatis über chlamydiale Proteasen die infizierte Epithelzelle moduliert. Dies
verhindert die Antigenpräsentation über MHC und sichert das Überleben der Chlamydien in
Epithelzellen. Ob dies als Strategie von C. psittaci in der vorliegenden Untersuchung vorliegt,
ist durch die angewendete Methodik nicht nachvollziehbar.
DISKUSSION 172
Neben der direkten Schädigung der Lungenarchitektur durch die Infektion mit C. psittaci
nehmen Chlamydien auch indirekt Einfluss auf den Untergang des Alveolar- und
Bronchiolarepithels. So fanden RASMUSSEN und Mitarbeiter (1991) durch in vitro-Studien
an Kolon- und Cervixepithelzellen heraus, dass der Infektion mit C. trachomatis im
Unterschied zu anderen invasiven gram-negativen Bakterien eine langanhaltende Sekretion
von proinflammatorischen Zytokinen folgt. Beschrieben ist die Sekretion von IL-8, GROα,
GM-CSF und IL-6 (AGACE et al. 1993; MCCORMICK et al. 1993; RASMUSSEN et al.
1997; STEPHENS 2003). Diese Ergebnisse bestätigten sich auch bei in vivo-Infektionen
muriner Alveolarepithelzellen mit C. pneumoniae (RASMUSSEN et al. 1997; WISSEL et al.
2005). Von einem der sezernierten Zytokine, vom IL-8, ist aus der Literatur bekannt, dass es
deutlich die Immunantwort moduliert, indem es den Einstrom von neutrophilen Granulozyten
(PMN) aus der Blutzirkulation in das infizierte Gewebe hervorruft (BARTENEVA et al.
1996; MOAZED et al. 1996). Diese Erkenntnisse geben Grund zu der Annahme, dass das in
der vorliegenden Untersuchung beobachtete Exsudat in Alveolen, Bronchiolen und Bronchien
am Tag 2 pi eine Folge der Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen, wie IL-8, durch
die infizierten AEC I war. Die ins Gewebe eingewanderten neutrophilen Granulozyten sind
mikrobizid wirksam und ein wichtiger Teil einer erfolgreichen Wirtsantwort (SOETHOUT et
al. 2002).
In der vorliegenden Arbeit waren Chlamydienstadien immunhistologisch und transmissions-
bzw. immunelektronenmikroskopisch an den Tagen 2 und 3 pi in neutrophilen Granulozyten
nachweisbar. Es waren jedoch keine Einschlüsse mit allen Stadien des Vermehrungszyklus zu
beobachten, sondern vorwiegend Elementarkörperchen und Intermediärkörperchen. Diese
lagen einzeln frei im Zytoplasma oder in kleinen Gruppen in Vakuolen, die als
Phagolysosomen interpretiert wurden. Dies spricht dafür, dass in den neutrophilen
Granulozyten keine Vermehrung stattfindet. Die vorliegenden Ergebnisse werden durch in
vitro-Untersuchungen mit humanpathogenen C. trachomatis-Biovaren unterstützt, bei denen
transmissionselektronenmikroskopisch die Degradation der Chlamydien in peroxidasehaltigen
Phagolysosomen in humanen neutrophilen Granulozyten innerhalb kürzester Zeit erfolgte
(YONG et al. 1982; YONG et al. 1986).
173 DISKUSSION
Neben der Wirksamkeit gegenüber C. psittaci führt eine Freisetzung proteolytischer Enzyme
in der Lunge aber auch dazu, dass das Alveolarepithel geschädigt wird (BORREGAARD
2010). Der Epitheluntergang konnte in der vorliegenden Untersuchung ab Tag 2 pi durch die
fehlende Markierung der Interalveolarsepten mit Zytokeratin gezeigt werden. Zudem war die
Anzahl der potentiell antigenpräsentierenden Makrophagen und T-Lymphozyten, die im
gesunden Gewebe in den Interalveolarsepten vorhanden sind, herabgesetzt. Hierbei könnte es
sich jedoch auch um eine relative Abnahme durch die hochgradige Verbreiterung der
Interalveolarsepten und Erweiterung der Alveolarräume durch neutrophile Granulozyten und
Fibrin handeln. Von der Schädigung betroffen waren ebenfalls kleine Gefäße.
Gefäßwandschäden wurden durch perivaskuläres Exsudat, das sich intensiv für IgG1
markierte, deutlich.
In der vorliegenden Untersuchung setzte sich im Verlauf der Infektion ab Tag 3 und 4 pi das
alveoläre, bronchioläre und bronchiale Exsudat vermehrt aus Alveolarmakrophagen
zusammen. Aus der Literatur ist bekannt, dass Alveolarmakrophagen direkt durch die
Phagozytose und indirekt über ein breites Zytokinspektrum am Entzündungsgeschehen und an
Reparationsprozessen in der Lunge beteiligt sind (CASWELL u. WILLIAMS 2007). Daher
ist davon auszugehen, dass Alveolarmakrophagen als potente Phagozyten auch in der
vorliegenden Untersuchung an der zahlenmäßigen Abnahme der PMNs ab Tag 3 und 4 pi
beteiligt waren. Die phagozytotische Aktivität der Alveolarmakrophagen kann dabei günstig
für den Wirt oder für den Erreger sein. Falls Alveolarmakrophagen infizierte Zellen
phagozytieren und antigenes Peptid über MHC präsentieren, ist dies nützlich für den Wirt, da
dadurch Effektor T-Lymphozyten aktiviert werden. In der vorliegenden Untersuchung spricht
die immunhistologisch nachweisbare Expression von MHC II auf den Alveolarmakrophagen
ab Tag 3 pi für diese Wirkung. In der Literatur ist auch eine stille Infektion beschrieben
(RUPP et al. 2009). Dabei dienen neutrophile Granulozyten als Vektoren, um die länger
lebenden Makrophagen zu infizieren. Dies stellt eine Möglichkeit für die Chlamydien dar in
andere Organe disseminiert zu werden. C. psittaci konnte in der vorliegenden Verlaufsstudie
ähnlich wie in neutrophilen Granuloyzten auch in Alveolarmakrophagen ultrastrukturell
dargestellt werden. Auch in Alveolarmakrophagen ließen sich keine Einschlüsse mit allen
Vermehrungsstadien, sondern überwiegend stark abgebaute Erreger finden.
DISKUSSION 174
Dendritische Zellen gelten allgemein als Schlüsselinduktoren für die erworbene
Immunantwort. Sie können vielseitig über MHC I, II und CD1 chlamydiales Antigen
präsentieren (REY-LADINO et al. 2005; AGRAWAL et al. 2008; FIEGL 2011). Durch
MHC I und II werden antigene Peptide präsentiert. Über das untersuchte CD1b Molekül
könnte im Besonderen chlamydiales Lipid-A präsentiert werden. Eine besondere Eigenschaft
der DC ist ihre Fähigkeit zur Kreuzpräsentation (GUERMONPREZ et al. 2002). Für die
Infektion mit Chlamydien bedeutet dies, dass auch exogen vorliegende Erreger über MHC I
für CD8+ T-Zellen präsentiert werden können. In der Zellkultur können Chlamydien DC
infizieren (FIEGL 2011). Die Replikation verläuft jedoch anders ab als in Epithelzellen. Die
Erreger werden aus dem Einschluss nicht extrazellulär freigesetzt, sondern gelangen in
mikrovesikuläre Kompartimente der Zelle und damit in den Kreuzpräsentationsweg (FIEGL
2011). Durch die Kokultivierung mit Chlamydien-infizierten DCs wurden CD4+ und CD8+
T-Zellen stimuliert (SU et al. 1998; FIEGL 2011). Die Stimulation der CD8+ T-Zellen führte
hierbei zur Sekretion von INF-γ (FIEGL 2011).
Ab Tag 2 waren MHC II+ Zellen, aber kaum CD1b+ DC im entzündeten Lungengewebe
nachweisbar. Dabei liegt die Vermutung nahe, dass CD1b+ DC in regionäre Lymphknoten
abgewandert sind, um T-Lymphozyten zu stimulieren. Der Lymphknoten ist als sekundäres
lymphatisches Organ Schaltstelle der Immunantwort und wies bereits 2 Tage pi reaktive
Veränderungen auf. Dabei waren vermehrt Makrophagen und bei einigen Tieren ebenfalls
vermehrt DC in den Sinusoiden des regionären Lymphknoten zu sehen. Ab Tag 2 pi waren
die Keimzentren vergrößert. Ein anderer Erklärungsansatz für die geringe Zahl an CD1b+ DC
an den Tagen 2, 3 und 4 pi im entzündeten Lungengewebe bietet die Reifung der CD1b+ DC.
Diese geht einher mit dem Verlust an CD1b+ Molekülen auf der Oberfläche und mit der
vermehrten Expression von MHC II (GELIN et al. 2009; AQUINO et al. 2011). Am Tag 7 pi
waren fokale Anhäufungen von CD1b+ DC im Bereich der Nekrosen in den Lungen zu finden
und damit genau in den Bereichen, in denen zu diesem Zeitpunkt immunhistologisch ein
besonders deutliches Signal für Chlamydien vorlag. Dies spricht für eine anhaltende
Antigenpräsentation und für die Stimulation einer Immunantwort.
Im akuten Stadium der Bronchopneumonie waren im Unterschied zu den Kontrollen im
veränderten Lungengewebe vermehrt IL-2 Rezeptor+ Zellen vorhanden. Die Expression des
175 DISKUSSION
Rezeptors ist demzufolge mit großer Wahrscheinlichkeit mit der Auseinandersetzung mit
C. psittaci assoziiert. Dabei ist die Expression des Rezeptors kein Indiz für eine spezielle
Effektorfunktion der markierten Zellen (SANDBULTE u. ROTH 2004). Bei den im
Lungengewebe immunhistologisch markierten IL-2R+ Zellen handelte es sich aufgrund von
übereinstimmender Lage und Morphologie mit hoher Wahrscheinlichkeit um
T-Lymphozyten, die CD4+, CD8+ oder γδ+ waren. In der Literatur ist die Expression des
IL-2 Rezeptors auf T- und B-Lymphozyten und auf Monozyten beschrieben (WAHL et al.
1987). Um den T-Zellsubtyp zu identifizieren, der IL-2 Rezeptor+ ist, müsste in
weiterführenden Studien eine Doppelmarkierung erfolgen. Aufgrund übereinstimmender Lage
und Morphologie konnte zudem die Expression von MHC II auf T-Lymphozyten beobachtet
werden, was damit den Ergebnissen von HAMMERLING (1976) entspricht.
Generell ist für die Elimination eines intrazellulär replizierenden Erregers, wie von
C. psittaci, eine zelluläre Immunantwort durch chlamydienspezifische CD4+ und CD8+
Effektor-T-Zellen notwendig. Diese werden im regionären Lymphknoten durch
antigenpräsentierende Zellen, im Besonderen durch DC stimuliert und wandern danach in die
Lunge ein (REDDY et al. 1997; GUERMONPREZ et al. 2002). In der vorliegenden
Untersuchung war die Zellzahl der T-Lymphozyten bis zum Tag 7 nach der Inokulation mit
C. psittaci in den veränderten Lungenbereichen deutlich verringert. Grund hierfür ist die
exsudatbedingte Expansion der Interalveolarsepten, durch die es zu einer relativen Abnahme
der T-Lymphozyten kommt. Dieser Effekt könnte durch den Untergang von T-Lymphozyen
verstärkt werden. In vitro-Untersuchungen konnten zeigen, dass mit C. trachomatis infizierte
Makrophagen die Apoptose von kokultivierten T-Lymphozyten auslösen (JENDRO et al.
2000). Dies lässt sich als weitere Strategie der Chlamydien interpretieren das eigene
Überleben zu sichern, indem sie in die Steuerung des energieabhängigen Zelluntergangs
eingreifen. So ist eine Hemmung der Apoptose von Wirtszellen dann sinnvoll, wenn es sich
um Zielzellen handelt, in denen der Erreger repliziert, ihre Induktion ist dagegen bei Zellen
sinnvoll, die nicht infiziert sind und zur Wirtsabwehr gehören (FAN et al. 1998; OJCIUS et
al. 1998; JENDRO et al. 2000; SCHOIER et al. 2001).
Ab Tag 7 pi konnte in der vorliegenden Untersuchung die Regeneration des Alveolarepithels
in Form von hyperplastischen Alveolarepithelzellen Typ II (AEC II) beobachtet werden. Sie
DISKUSSION 176
produzieren Matrixbestandteile und ermöglichen so die Reepithelialisierung der
Basalmembran. Der Prozess folgt einem allgemeinen Schema mit schneller Mobilisation,
Proliferation und Redifferenzierung der AEC II zu AEC I. Im Verlauf der Regeneration ließ
sich eine Bronchiolitis obliterans beobachten, die gehäuft bei chronischen
Bronchopneumonien des Kalbes beschrieben werden und die als Zeichen für eine fehlerhafte
Wundheilung gilt (CASWELL u. WILLIAMS 2007). Als Ursache für die Schädigung des
Bronchiolarepithels wird unter anderem das Einwirken neutrophiler Granulozyten genannt,
wie dies auch in der vorliegenden Untersuchung zu beobachten war.
Ab Tag 10 pi setzte die zelluläre Immunantwort aus T-Lymphozyten ein, wobei primär CD4+
T-Zellen zu beobachten waren. Von ihnen ist aus der Literatur bekannt, dass sie die
erworbene Immunantwort koordinieren und Einfluss auf CD8+ T-Zellen, auf Makrophagen
oder auf Antikörper produzierende Immunzellen nehmen. Von anderen Untersuchern ist
bekannt, dass die Proteine der äußeren Membran der Chlamydien über MHC II CD4+ T-
Zellen stimulieren (BEATTY u. STEPHENS 1992). Im weiteren Verlauf am Tag 14 pi war
eine zunehmende Regeneration des Lungengewebes zu beobachten, die dazu führte, dass
multifokal lediglich kleine Nekroseherde nachweisbar waren. Lymphozyten, Plasmazellen,
DC und Makrophagen waren in der Regenerationszone am Rand zu finden. Ihre Zahl war
jedoch besonders groß innerhalb der zunehmend kleiner werdenden Nekroseherde. In den
Nekrosen waren neben Makrophagen und dendritischen Zellen, CD4+ und γδ+ T-Zellen vor
allem CD8+ T-Lymphozyten nachweisbar. Von CD8+ T-Zellen ist aus der Literatur bekannt,
dass sie gegenüber intrazellulären Bakterien zytotoxisch wirksam sind. Die Erkennung von
Chlamydien ist dabei möglich, weil chlamydiale Proteine auf der Einschlussmembran
exprimiert werden oder mit Hilfe des Typ-III-Sekretionssystems an MHC I gekoppelt und
CD8+ T-Zellen präsentiert werden (WIZEL et al. 2008). Zumindest für das Cap-1 Protein von
C. trachomatis wurde diese stimulierende Wirkung bewiesen (FLING et al. 2001).
CD8+ T-Zellen sind neben ihrer zytotoxischen Aktivität durch die Sekretion von IFN-γ
gekennzeichnet. IFN-γ entzieht dabei den Chlamydien essentielles Tryptophan und führt zur
Bildung aberranter Retikularkörperchen, die in metabolisch inaktiver Form im Gewebe
persistieren können (ROTTENBERG et al. 2002). Durch in vitro-Untersuchungen von
177 DISKUSSION
BEATTY und Mitarbeitern (1997) konnte die Effektivität von spezifischen CD8+ T-
Lymphozyten für die Elimination von Chlamydien bestätigt werden. Sie zeigt jedoch
Unterschiede zwischen den Spezies C. trachomatis und C. psittaci. Zellen, die mit C. psittaci
infiziert waren, reagierten sensibler auf die Zerstörung durch CTLs als Zellen, die mit C.
trachomatis infiziert waren (BEATTY et al. 1997). Widersprüchliche Ergebnisse zur
Wirksamkeit von CTLs ergaben sich bei der experimentellen Infektion von Mäusen mit
C. trachomatis und deuten auf weitere speziesbedingte Unterschiede hin (SU u. CALDWELL
1995). Aus der Literatur ist bekannt, dass neben CD8+ T-Zellen auch γδ+ T-Zellen
zytotoxisch wirksam werden können und infizierte Zellen zerstören. Funktionelle Studien
belegen ihre zytotoxische Aktivität durch Granulysin und Perforin und ihre Fähigkeit IFN-γ
zu sezernieren (BLUMERMAN et al. 2007). Die in den Veränderungen nachgewiesenen γδ+
T-Zellen könnten damit ähnlich wie CD8+ T-Lymphozyten einerseits dazu dienen C. psittaci
zu eliminieren. Andererseits könnten sie auch CD8+ T-Zellen regulatorisch beeinflussen. Für
die γδ+ T-Zellen der Wiederkäuer ist beschrieben, dass sie anstelle der CD4+/CD25+/Foxp3+
Zellen regulatorisch wirksam sind, um eine überschießende Immunreaktion zu verhindern
(HOEK et al. 2009). Dysbalancen zwischen zytotoxischen und IFN-γ bei den CD8+ T-Zellen
und γδ+ T-Zellen könnten dazugeführt haben, dass Chlamydien in das Persistenzstadium
übergehen und in einzelnen Herden in der Lunge überleben. Es bleibt ungelöst, ob diese
Herde im weiteren Verlauf abheilen oder Ausgangspunkt für die Erregerstreuung in andere
Organe sind.
Zusätzlich zu einer T-Zellantwort war im Verlauf der Infektion mit C. psittaci im veränderten
Lungengewebe und im Lymphknoten eine humorale Immunantwort zu beobachten, bei der
primär IgM und im weiteren Verlauf gleichfalls IgG1+ detektiert wurde. Entlang des
neugebildeten Alveolarepithels dominierten IgA+ Plasmazellen, die dabei offensichtlich
effizient verhindern, dass das neugebildete Epithel mit C. psittaci infiziert wird. Dabei ist
bislang unklar, in wie weit und über welchen Mechanismus lokales Immunglobulin wirksam
gegenüber Chlamydien ist (YANG u. BRUNHAM 1998).
Zusätzlich zum BALT an Luftwegen und Gefäßen trat im Infektionsverlauf mit C. psittaci
ektopisches BALT in den interlobulären Interstitien der Lunge auf. Dieses war vergleichbar
DISKUSSION 178
mit dem, was im Mausmodell im Verlauf einer Influenzavirusinfektion gesehen wurde und als
Induktionsbereich für eine spezifische T- und B-Zellantwort diskutiert wird (MOYRON-
QUIROZ et al. 2004). Neben ektopischem BALT war zudem hyperplastisches BALT
vorhanden, das im Vergleich zu den Kontrollkälbern signifikant an Menge am zuletzt
untersuchten Zeitpunkt, am Tag 35/37 pi, zunahm. Dies könnte ein Hinweis auf die Bildung
des bei chronisch mit Chlamydien infizierten Kälbern beobachteten hyperplastischen BALT
sein (JÄGER et al. 2007). Ähnliche Befunde ergaben auch Untersuchungen der Lungen von
Kälbern mit Enzootischer Pneumonie (ANDERSON et al. 1986a). Dies bestätigt die Theorie,
das BALT beim Rind antigeninduziert ist. Wie langlebig ektopisches oder hyperplastisches
BALT ist und ob es als Reservoir für spezifische Immunzellen dient, können nur
weiterführende Untersuchungen zeigen.
In der vorliegenden Arbeit wurde die Immunantwort im Verlauf einer experimentellen
Infektion von Kälbern mit C. psittaci charakterisiert. Dies gibt einen Einblick in die
Immunpathogenese von C. psittaci in einem natürlichen Wirt. Trotz ihrer einzigartigen
intrazellulären Reproduktion, induzierte C. psittaci eine kaskadenartige Immunantwort, die
sowohl das natürliche als auch das erworbene Immunsystem ansprach und bei den meisten
Tieren innerhalb des untersuchten Zeitraums von etwa 5 Wochen C. psittaci erfolgreich
eliminierte. Dies ermöglichte eine vollständige Regeneration der Lungenveränderungen.
Nur bei einem Tier war am Ende des Beobachtungszeitraums am Tag 35 pi in der Lunge eine
herdförmige granulomatöse Entzündung mit Chlamydien in Makrophagen zu finden und
mehrkernige Riesenzellen vorhanden. Diese wiesen lichtmikroskopisch eine von der
Erregermorphologie, die an den Tagen 2 bis 14 pi gefunden wurde, abweichende Struktur auf,
sodass angenommen werden kann, dass es sich um aberrante Stadien handelte. Es sollte
abgeklärt werden, ob dies mit dem von OSTERMANN et al. (2011) berichteten protrahierten
Krankheitsverlauf in Zusammenhang steht.
Ausgehend von den vorliegenden Untersuchungsbefunden, könnten weiterführende
Untersuchungen noch genauer auf einzelne Schritte der Immunantwort fokussieren. So
könnten Untersuchungen zur Antigenspezifität der jeweiligen Abwehrzellen erfolgen. Ein
weiterer Ansatzpunkt wäre die Untersuchung von Zytokinen und Chemokinen, die bedeutend
179 DISKUSSION
Einfluss auf die Schädigung des Lungengewebes nehmen und die Clearance bzw. die
Persistenz des Erregers bedingen. Dabei könnte die Untersuchung nicht nur im Blut (VOGEL
2010) und in der BALF, sondern auch im Gewebe helfen einen unmittelbaren Zusammenhang
zu den Schäden im Lungengewebe herzustellen.
ZUSAMMENFASSUNG 180
6 ZUSAMMENFASSUNG
Katja Möhle: Wirts-Erreger-Interaktionen im Respira tionstrakt von Kälbern nach
experimenteller aerogener Infektion mit Chlamydia psittaci
Die experimentelle intrapulmonale Inokulation von Kälbern mit C. psittaci verursacht eine
akute eitrig-fibrinöse Bronchopneumonie mit Nekroseherden, die innerhalb von 5 Wochen
weitgehend abheilt. Ziel der vorliegenden Untersuchung war es, die zellulären Reaktionen im
Verlauf der akuten Entzündung und der Abheilung zu charakterisieren. Von Kälbern, die
intrabronchial 108 EBE C. psittaci (Stamm DC 15) erhalten hatten, wurden Lungenproben,
Nl. mediastinalis und Tonsilla pharyngea an konsekutiven Zeitpunkten 2, 3, 4, 7, 10, 14 und
35/37 Tage nach der Inokulation (dpi) entnommen. In den Organen wurde die Anzahl und
Verteilung von Immunzellen ermittelt. Untersucht wurden neutrophile Granulozyten,
Makrophagen, dendritische Zellen (DC), CD4+, CD8+ und γδ+ T-Lymphozyten, IgA+,
IgM+, IgG1+ Plasmazellen/B-Lymphozyten, sowie Chlamydien. Weitere sechs Kälber, die
nicht infiziertes Medium erhalten hatten, dienten als Kontrollen (Sektionszeitpunkt 2, 3, 4, 7,
14 und 35/37 dpi). Neben der immunhistologischen Untersuchung wurde zu ausgewählten
Zeitpunkten eine transmissionselektronenmikroskopische Untersuchung der Lungenproben
durchgeführt, um Hinweise auf Wirtszellen, Zielzellen und die Replikation von C. psittaci zu
erhalten.
Bei den mit C. psittaci inokulierten Kälbern war die Βronchopneumonie an den Tagen 2 und
3 durch ein Exsudat aus neutrophilen Granulozyten gekennzeichnet. An den Tagen 3 und 4 pi
waren vermehrt Alveolarmakrophagen zu finden. Chlamydien ließen sich initial in
Alveolarepithelzellen und zunehmend in neutrophilen Granulozyten und
Alveolarmakrophagen, besonders in Nekrosebereichen nachweisen. Ultrastrukturell waren
chlamydiale Einschlüsse mit Elementarkörperchen, Retikularkörperchen und
Intermediärkörperchen in Alveolarepithelzellen Typ I und Intermediär- und
Elementarkörperchen frei im Zytoplasma oder in Phagolysosomen von neutrophilen
Granulozyten und Alveolarmakrophagen darstellbar. Am Tag 7 pi war eine enge Assoziation
von Chlamydien und CD1b+ DC in Nekroseherden zu beobachten. Die Nekrosen wurden
teilweise durch hyperplastische Alveolarepithelzellen Typ II und Makrophagen begrenzt. Am
181 ZUSAMMENFASSUNG
Tag 10 pi war die Regenerationszone konfluent und von CD1b+ DC, Makrophagen, CD4+,
CD8+ und γδ+ T-Lymphozyten, IgA+ und IgM+ Plasmazellen/B-Lymphozyten infiltriert. Im
Vergleich zu Tag 7 pi wurden am Tag 10 pi signifikant erhöhte Zellzahlen von CD4+, CD8+
und γδ+ T-Lymphozyten ermittelt. Am Tag 14 pi waren die Nekrosen von Makrophagen, DC,
CD4+, CD8+ und γδ+ T-Lymphozyten infiltriert und die Anzahl der Chlamydien war deutlich
geringer. Ektopische Lymphfollikel aus IgM+ B-Lymphozyten, die parafollikulär von CD4+
T-Lymphozyten und CD1b+ DC umgeben waren, traten entlang der interlobulären Interstitien
auf. Am Tag 35/37 pi waren die Chlamydien weitgehend aus der Lunge eliminiert und das
Lungengewebe hatte sich regeneriert. Die Anzahl und Verteilung der nicht organisierten
Immunzellen entsprach der bei den Kontrollkälbern, aber das BALT war ausgeprägter und die
Anzahl der Anschnitte von BALT/cm² Lungengewebe war signifikant erhöht. Lediglich in
einer Lungenlokalisation eines Kalbes waren wenige Chlamydien mit atypischer Morphologie
(besonders groß und immunhistologisch schwach markiert) in Makrophagen nachweisbar.
In der vorliegenden Untersuchung führte die initiale Infektion von Alveolarepithelzellen mit
C. psittaci über die Freisetzung chemotaktischer proinflammatorischer Zytokine zu einem
Einstrom zahlreicher neutrophiler Granulozyten. Die Freisetzung der Granula und der Zerfall
der neutrophilen Granulozyten verursachte ausgedehnte Schäden des Lungengewebes mit
Nekrosen. Zahlreiche Chlamydien waren zwischen untergehenden neutrophilen Granulozyten
und Alveolarmakrophagen zu finden. Die zelluläre Wirtsantwort war initial durch
antigenpräsentierende Zellen und im weiteren Infektionsverlauf zunehmend von T- und B-
Lymphozyten bzw. Plasmazellen dominiert. Diese zelluläre Abwehreaktion bedingt eine
weitgehende Elimination von C. psittaci und ermöglicht die Regeneration des
Lungengewebes. Die wenigen am Tag 35 pi vorhandenen atypischen Chlamydien geben
möglicherweise Hinweise auf die Bildung von aberranten Retikularkörperchen und die
Entstehung von Persistenz.
SUMMARY 182
7 SUMMARY
Katja Möhle: Host-pathogen interactions in the respiratory tract of calves after
intrapulmonary infection with Chlamydia psittaci
Experimental intrapulmonary inoculation of calves with C. psittaci causes acute
fibrinopurulent bronchopneumonia with multifocal necrosis that regresses completely within
5 weeks. The objective of the present study was to characterize local cellular reactions in the
course of acute inflammation and regeneration. Samples of lung, mediastinal lymph node and
pharyngeal tonsil were collected at consecutive days (2, 3, 4, 7, 10, 14 and 35/37 days post
inoculation (dpi) from calves that had intrabronchially received 108 inclusion forming units of
C. psittaci (strain DC15). Number and distribution of neutrophils, macrophages, CD1b+
dendritic cells (DCs), CD4+, CD8+, γδ+ T-lymphocytes as well as IgM+, IgA+ and IgG1+ B-
lymphocytes/plasma cells and chlamydia were determined in these tissues by
immunohistochemistry. Six calves that had received non infected medium served as controls
(necropsy at 2, 3, 4, 7, 14 and 35 dpi). Transmission electron microscopy and immune
electron microscopy were performed on selected pulmonary samples collected at 2, 3, 4, 7
and 10 dpi to investigate the cellular tropism and replication of C. psittaci.
At days 2 and 3 pi, the pneumonic exsudate in the calves inoculated with C. psittaci consisted
predominantly of neutrophils. Increasing numbers of alveolar macrophages were seen at 3 and
4 dpi. Chlamydiae were seen initially in alveolar epithelial cells and increasingly in
neutrophils and alveolar macrophages especially in areas of necrosis. Ultrastructural
investigation revealed chlamydial inclusions with reticular bodies, intermediate bodies and
elementary bodies in alveolar epithelial cells type 1, while intermediate and elementary bodies
were seen free in the cytoplasm or in phagolysosomes of neutrophils and alveolar
macrophages. A close association between chlamydia and CD1b+ DC was seen in areas of
necrosis at 7 dpi. The areas of necrosis were partially demarcated by hyperplastic epithelial
cells of type 2 and dense infiltrates of macrophages. The zones of regeneration became
confluent at 10 dpi and were infiltrated by CD1b+ DC, macrophages, CD4+, CD8+ and γδ+
T-lymphocytes, IgM+ and IgA+ B-lymphocytes/plasma cells. Numbers of CD4+, CD8+ and
γδ+ T-lymphocytes were significantly increased at 10 dpi compared to 7 dpi. At day 14 pi, the
areas of necrosis were infiltrated by macrophages, DC, CD4+, CD8+ and γδ+ T-lymphocytes
183 SUMMARY
and the number of chlamydia was markedly reduced. Ectopic lymphoid follicles formed by
IgM+ B-lymphocytes and parafollicular CD4+ T-lymphocytes and CD1b+ DC were located
within interlobular interstitium. At days 35/37 pi, chlamydia had been eliminated from most
parts of the lungs and pulmonary tissue had regenerated. Number and distribution of
unorganized immune cells were as seen in control calves, but BALT was more pronounced
and the number of sites with BALT/cm² pulmonary tissue was significantly increased
compared to the controls. Only in one pulmonary lobe of one calf, there was an area of
granulomatous inflammation and few chlamydia with atypical morphology (large, weakly
stained by immunohistochemistry) were seen in macrophages.
In the presented investigation the initial infection of alveolar epithelial cells with C. psittaci
was followed by a rapid influx of neutrophils most likely mediated by chemotactic
inflammatory cytokines produced by the infected alveolar epithelial cells. Degranulation and
decay of neutrophils caused extensive damage of the pulmonary tissue and necrosis.
Numerous chlamydia were seen in association with disintegrating neutrophils and alveolar
macrophages. The host’s cellular reactions were initially dominated by antigen presenting
cells and later increasingly by T- and B-lymphocytes as well as plasma cells. This cellular
reaction resulted in an almost complete elimination of C. psittaci and allowed regeneration of
the pulmonary tissue. The few atypical chlamydia found at 35 dpi may be indicative for the
formation of aberrant reticular bodies and chlamydial persistence.
LITERATURVERZEICHNIS 184
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215 ANHANG
9 ANHANG
Inokulum
SPGA Stabilisator
• 74,6 g Saccharose 0,52 g KH2PO4 1,25 g K2HPO4 0,92 g L- Glutaminsäure (Na- Salz) werden in 1000 ml Aqua bidest. gelöst.
• Es folgt die Zugabe und das Lösen von 1 g bovines Albumin, Fraktion V. • Die Lösung wird steril filtriert.
Verwendete Chemikalien
Behandlung der Objektträger
Chromalaungelatine zur Beschichtung von Objektträgern für Kryostatschnitte:
• 0,625 g Gelatine75 in 250 ml Aqua dest. bei 80°C lösen • die erkaltete Lösung mit 0,063 g Chromalaun76 und 1-5 Körnchen Thymol77 versetzen.
Färbungen
Hämalaun–Eosin-Färbung
Hämalaun nach P. Mayer: • 1 g Hämatoxylin78 in 1000 ml Aqua dest. lösen • 0,2 g Natriumjodat79 und 50 g chemisch reines Kalilaun80 zugeben und unter schütteln
lösen, • besitzt die Lösung einen blau-violetten Farbton folgt die Zugabe von 50 g Chloralhydrat81
und 1 g kristallisierter Zitronensäure82: • Die rot-violette Lösung wird für den sofortigen Gebrauch filtriert. Die Farbe ist bei Erhalt
des Farbtons wiederholt zu gebrauchen.
75 Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Seelze, Deutschland 76 VEB Laborchemie, Apolda, Deutschland 77 Thüringische Universitätsapotheke, Jena, Deutschland 78 Fa. Riedel-de Haen AG, Seelze- Hannover, Deutschland 79 Fa. Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland 80 Fa. VEB Laborchemie, Apolda, Deutschland (DDR) 81 Fa. Carl Roth GmbH und Co, Karlsruhe, Deutschland 82 Fa. VWR International, Darmstadt, Deutschland
ANHANG 216
1%ige Eosin-Lösung:
• 1 g Eosin83 in 50% Ethanol dest. gelöst. • Ethanol dest. erhält man aus gleichen Mengen Ethanol und Aqua bidest. • Unmittelbar vor Gebrauch wird 1 Tropfen Eisessig84 auf 100 ml der Lösung zugesetzt. • Vor Gebrauch frisch ansetzen und filtrieren.
Karbolxylol
• 10g Phenol85 wird in 100ml Xylol86 gelöst.
Methylengrünlösung
• 2 g Methylengrün87 in 100 ml Aqua. dest auflösen. Zweifach filtrieren, ist mehrfach zu gebrauchen, vor Gebrauch stets filtrieren.
Kernechtrot
• 5 g Aluminiumsulfat88 in 100 ml Aqua dest. lösen. • Die Aluminiumsulfatlösung erhitzen und 0,1 g Kernechtrot89 einrühren, bis sich Farbstoff
löst, abkühlen und filtrieren.
Tuloidinblau
2,5-%ige wässrige Natriumhydrogencarbonatlösung (NaHCO3): • 2,5 g Natriumhydrogencarbonat in 100 ml Aqua bidest. lösen • mit NAOH oder HCL auf pH-Wert 11 einstellen.
1%iges Toluidinblau (Stammlösung ist über Monate haltbar):
• 1 g Toluidinblau90 in einem Messkolben mit frisch hergestellter Natriumhydrogen-carbonatlösung auf 100 ml auffüllen und lösen.
83 Fa. Roth GmbH und Co, Karlsruhe, Deutschland 84 Fa. Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland 85 Fa. Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland 86 Dr. K. Hollborn & Söhne GmbH & Co KG, Leipzig, Deutschland 87 Fa. Sigma Aldrich Chemie, Steinheim, Deutschland 88 VEB Laborchemie, Apolda, Deuschland 89 Fa. Fluka AG, Buchs, Schweiz 90 Fa. Arcochemie, Berlin, Deutschland
217 ANHANG
Toluidinblau-Gebrauchslösung: • 25 ml Stammlösung ad 100 ml Aqua dest. (1:4) • frisch hergestellte Lösungen verwenden und vor Gebrauch filtrieren • Lösung sollte keine metallisch-glänzende Schicht auf der Oberfläche haben
Immunhistologie
PBS- Puffer
PBS-Stammlösung (pH 6,8):
• 800 ml Aqua dest. 40 g NaCl91 10 g NaH2PO4 x 2H2O
92 150 ml Aqua dest. zugeben.
• Den pH mit 5N NaOH auf 6,8 einstellen und mit Aqua dest. auf 1000 ml auffüllen. PBS-Gebrauchslösung (pH 7,1): • 200 ml PBS-Stammlösung
800 ml Aqua dest.
Dulbecco’s PBS- Puffer (DPBS)
DPBS-Stammlösung:
• 40 g NaCl93 1 g KCl94 1 g KH2PO4
95
7,15 g Na2HPO4 x 2H2O96
in 1000 ml Aqua dest. lösen.
DPBS-Gebrauchslösung (pH 7,4):
• 200 ml DBPS-Stammlösung 800 ml Aqua dest
91 Fa. Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland 92 Fa. VWR International, Darmstadt, Deutschland 93 Fa. Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland 94 Fa. Carl Roth GmbH und Co, Karlsruhe, Deutschland 95 Fa. Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland 96 Fa. VWR International, Darmstadt, Deutschland
ANHANG 218
12,5% BSA in DPBS (BSA/DPBS)
• 12,5 g Bovines Serum Albumin (BSA)97 in 100 ml DPBS-Gebrauchslösung lösen.
0,06%ige Phenylhydrazin-Lösung
• 30 µl Phenylhydrazin98 in 50 ml PBS lösen.
Diaminobenzidintetrachlorid-dihydrat-Lösung (DAB)
• 24 mg DAB99 in 40 ml PBS lösen • unter Rühren langsam 400 µl 30% H2O2
100 1:10 verdünnt in Aqua dest. zusetzen,
• filtrieren und sofort benutzen
0,01%ige Osmiumsäure
• 250 µl Osmiumtetroxid101 in 100 ml Aqua dest.
Elektronenmikroskopie
2,5%iges Glutaraldehyd
• 25% Glutaraldehyd102 1:10 mit Cacodylatpuffer pH 7,2 verd.
Kakodylatpuffer pH 7,2
• 21,4 g Natriumcacodylat103 mit Aqua bidest auf 1l lösen pH mit 1N HCL auf 7,2 einstellen
2%iges Osmiumtetroxid
• 4%iges Osmiumtetroxid104 1:1 mit Cacodylatpuffer verdünnen
97 Fa. Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Deutschland 98 Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Seelze, Deutschland 99 Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Seelze, Deutschland 100 Fa. Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland 101 Carl Roth GmbH & Co KG, Karlsruhe, Deutschland 102 Fa. VWR, Merck, Dresden, Deutschland 103 Fa. Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland 104 Fa. Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland
219 ANHANG
Araldite I
• 10 ml Araldite CY212105 10 ml Dodecenylbersteinsäure (Härter)106 0,1 – 0,2 ml Dibutylphthalat (Weichmacher)107
Araldite II
• ml Araldite CY212 10 ml Dodecylbernsteinsäure 0,1 – 0,2 ml Dibutylphthalat 0,3 – 0,4 ml NN-Dimethylbezylamin (Beschleuniger)108
• beide Mischungen 15–30 min langsam rühren, anschließend etwa 15 Minuten bei 50°C homogenisieren
Uranylazetat, gesättigte wässrige Lösung
• Uranylazetat (UO2Ac)109 in 100 ml Aqua bidest. lösen • Vorgang mehrfach wiederholen, bis nach 3 Stunden die Lösung gesättigt vorliegt. • Lösung über Nacht stehen lassen. • Überstand vorsichtig in ein frisches Zentrifugenröhrchen pipettieren. • Mit Tischzentrifuge bei 1300 U/min 15 min abzentrifugieren. • In einem Aliquot pH messen, pH Sollwert liegt bei 4,0. • Überstand abpipettieren und in einer dunklen Glasflasche aufbewahren.
Bleizitrat
• 0,665 g Bleizitrat (Pb(NO3)2)110 und 0,88 g Tri-Natriumzitrat-2-hydrat (Na3(C6H5O7))
111 in15 ml Aqua bidest. Lösen
• stark schütteln bis nach 30 min die Umwandlung von Bleinitrat in Bleizitrat eintritt • 4 ml 1N NaOH (carbonatfrei) zusetzen und auf 25 ml mit Aqua bidest auffüllen und
schwenken. • nach Auflösung des Bleizitrats ist die Lösung gebrauchsfertig (pH 12)
105 Fa. Plano GmbH, Wetzlar, Deutschland 106 Fa. Plano GmbH, Wetzlar, Deutschland 107 Fa. Plano GmbH, Wetzlar, Deutschland 108 Fa. Plano GmbH, Wetzlar, Deutschland 109 Fa. Plano GmbH, Wetzlar, Deutschland 110 Fa. Fluka Chemie GmbH, Buchs, Schweiz 111 Fa. Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
ANHANG 220
Indirekte Immunogoldmarkierung am Ultradünnschnitt:
DPBS mit 0,2% BSA-c™
• 0,2 ml 10%iges BSA-c™112 • 9,8 ml DPBS-Gebrauchslösung
Gycin 0,2 Mol
• 0,02 g Glycin113 ad. 10 ml Ampuwa
DPBS mit BSA-c™ und Ziegennormalserum
• 4,7 ml DPBS • 0,05 ml 10%iges BSA-c™ • 0,25 ml Ziege Normalserum
DPBS mit BSA-c™
• 4,7 ml DPBS • 0,05 ml 10%iges BSA-c™
112 Fa. Aurion, Wageningen, Niederlande 113 Fa. Baltic Präparation, Weinheim, Deutschland
Danksagung
Meiner Doktormutter, Frau Apl.-Prof. Dr. E. Liebler-Tenorio gilt mein besonderer Dank für
die Überlassung des interessanten Themas, die konstruktive Zusammenarbeit und für die
jederzeit und in jeder Hinsicht gewährte Unterstützung. Insbesondere möchte ich mich für die
wertvollen Ratschläge und das ausgesprochen freundliche Arbeitsklima bedanken.
Bei Sabine Lied und Lisa Wirker bedanke ich mich ganz herzlich für die tatkräftige
Unterstützung bei der Bearbeitung der Proben und die freundliche Zusammenarbeit.
Wolfram Maginot danke ich ganz besonders für die investierte Zeit und Mühe bei der
Bearbeitung der unzähligen Fotos, die Hilfsbereitschaft und den aufmunternden Beistand.
Herrn Thalmann danke ich sehr für die technische Unterstützung.
Bei Frau Rohde bedanke ich mich sehr für die ausdauernde Hilfe bei der Literatursuche.
Herrn Dr. Diller danke ich für die Einführung in das Statistikprogramm SPSS und für die
Hilfestellung bei der statistischen Auswertung.
Bedanken möchte ich mich bei allen, die am Versuchsvorhaben beteiligt waren, insbesondere
bei Frau PD Dr. Dr. P. Reinhold für die gute Zusammenarbeit.
Jacqueline, Anneka, Christin, Katharina, Maria, Markus, Michaela und Ulrike danke ich für
das sehr freundliche Miteinander und für viele gute Gespräche. Jan Schinköthe bin ich sehr
dankbar für die Mithilfe bei der Probensortierung.
Meiner Familie, insbesondere meiner Mutter, möchte ich für die liebevolle Unterstützung, für
den Glauben an mich und vor allem für das Ermöglichen meines beruflichen Werdegangs
danken. Meinem Freund Valerie danke ich von Herzen für seine Geduld und Unterstützung.