DISERTACION - sites.google.com

REPUBLIKA E SHQIPËRISË

UNIVERSITETI I TIRANËS

FAKULTETI I SHKENCAVE TË NATYRËS

DEPARTAMENTI I BIOTEKNOLOGJISË

PROGRAMI I STUDIMIT BIOTEKNOLOGJI BIMORE

DISERTACION

Për marrjen e gradës: ”DOKTOR I SHKENCAVE”

“VLERËSIMI I SHUMËLLOJSHMËRISË SË GJENEVE KODUESE TË MONOTERPEN SINTETAZAVE DHE

PRODUKTEVE ENZIMATIKE TË TYRE TEK POPULLATA

TË SHERBELËS TË SHQIPËRISË SË VERIUT”

Udhëheqës shkencor: Kandidati:

M.Sc. STELA PAPA Prof. Dr. Ariola Bacu

Tiranë 2017

i

REPUBLIKA E SHQIPËRISË

UNIVERSITETI I TIRANËS

FAKULTETI I SHKENCAVE TË NATYRËS

DEPARTAMENTI I BIOTEKNOLOGJISË

PROGRAMI I STUDIMIT BIOTEKNOLOGJI BIMORE

DISERTACION

Paraqitur nga

M.Sc.STELA PAPA

Udhëhequr nga

Prof. Dr. Ariola Bacu

Për marrjen e gradës

DOKTOR I SHKENCAVE

Tema: “VLERËSIMI I SHUMËLLOJSHMËRISË SË GJENEVE KODUESE TË MONOTERPEN SINTETAZAVE DHE

PRODUKTEVE ENZIMATIKE TË TYRE TEK POPULLATA

TË SHERBELËS TË SHQIPËRISË SË VERIUT”

Mbrohet më datë,_______/_______,2017 para Jurisë

1.______________________________________Kryetar

2._____________________________________Anëtar ( Oponent )

3._____________________________________Anëtar ( Oponent )

4._____________________________________Anëtar

5._____________________________________Anëtar

ii

Dedikuar familjes sime!

iii

FALENDERIME

Të gjesh fjalët e duhura për të shprehur mirënjohjen dhe falënderime është shumë e

vështirë. Por unë do doja të veçoja ata persona të cilët kanë luajtur një rol të

rëndësishëm në realizimin e këtij punimi dhe në vazhdimësinë e punës sime ndër vite.

Në rradhë të parë dua të falënderoj udhëheqësen time Prof. Dr. Ariola Bacu për

durimin, inkurajimin, këshillat dhe kohën e gjatë që më ka kushtuar gjatë gjithë

periudhës si studente e saj. Kam qenë me fat të kisha një supervizore që interesohej

maksimalisht për këtë kërkim duke më frymëzuar me pikëpamjet pozitive, motivimin e

vazhdueshëm dhe besimin në hulumtimet e mia. Gjithashtu shpreh me bindje

mirënjohjen për kontributin e saj maksimal në rrjedhën e ngjarjeve të karrierës sime.

Mirënjohja ime e thellë i drejtohet edhe përgjegjëses së Departamentit të

Bioteknologjisë, Prof. Dr. Klementina Puto, për përkrahjen, dashamirësinë, këshillat,

besimin që më ka deleguar në çdo ditë duke më dhënë forcë dhe kurajo për të ecur

përpara. Gjithashtu, do doja ta falënderoja për sugjerimet dhe komentet brilante, pa

të cilat kjo tezë nuk do të kishte marrë këtë formë.

Falenderime dhe mirënjohje për të gjithë kolegët e mi në Departamentin e

Bioteknologjisë për dashamirësinë dhe pozitivitetin e tyre. Me sinqeritetin më të madh

dëshiroj të falënderoj Efterpin dhe Mirën, për ndihmën dhe këshillat në laborator

gjatë realizimit të eksperimenteve.

Falenderime pa fund për eksperiencën e vlefshme dhe ndihmën profesionale për

realizimin e analizave gaz-kromatografike Prof. Asoc. Dr. Aurel Nuro, në

laboratorin e Analizës organike instrumentale, Departamenti i Kimisë, FSHN, UT.

Gjithashtu dua të falënderoj kolegët dhe përgjegjësin e Laboratorit të Gjenetikës

molekulare, Prof. Asoc. Dr. Lucian D. Gorgan në Fakultetin e Biologjisë,

Universitetin “Alexandru Ioan Cuza”, Iasi, Rumani të cilët më kanë ndihmuar me

eksperiencën e tyre të vyer si dhe duke më krijuar kushte të përshtatshme për

realizimin e një pjese të eksperimenteve.

Falenderoj dy koleget dhe mikeshat e mia, Valbonën dhe Lindën për këshillat,

mbështetjen, inkurajimin dhe çdo ndihmesë gjatë kohës të realizimit të këtij punimi.

Dhe së fundmi por jo nga rëndësia falënderimet e gjithë botës i meritojnë familjarët e

mi, të cilët kanë përjetuar me mua uljet dhe ngritjet vit pas viti.

Falënderoj bashkëshortin tim dhe i jam shumë mirënjohëse për dashurinë, durimin,

mbështetjen dhe inkurajimin e vazhdueshëm gjatë gjithë kësaj kohe, duke ma bërë

edhe më të lehtë këtë rrugëtim.

Falënderoj prindërit e mi të shtrenjtë dhe vëllain tim të dashur që më kanë ofruar

mbështetje dhe dashuri në çdo moment. Pa insistimin dhe inkurajimin tuaj karriera

ime nuk do të kishte marrë kurrë këtë kthesë dhe as do të arrija këtu ku jam sot.

Jam me fat që ju kam!

Ju faleminderit nga zemra!

STELA

iv

PASQYRA E LËNDËS

FALENDERIME........................................................................................................ iii

LISTA E SHKURTIMEVE ...................................................................................... vii

LISTA E TABELAVE ................................................................................................ ix

LISTA E FIGURAVE.................................................................................................. x

HYRJE ........................................................................................................................ xii

QËLLIMI DHE OBJEKTIVAT ............................................................................... xv

1. KONSIDERATA TEORIKE ............................................................................... 1

1.1. Përshkrim i përgjithshëm i sherbelës (Salvia officinalis) ................................ 1

1.2. Speciet e familjes Lamiaceae të rritura në Shqipëri ........................................ 2

1.3. Përhapja gjeografike e sherbelës ..................................................................... 3

1.4. Kushtet klimatike – tokësore të favorshme për rritjen e sherbelës ................. 4

1.5. Kultivimi i sherbelës në Shqipëri .................................................................... 6

1.6. Përdorimet e sherbelës në mjekësi .................................................................. 7

1.6.1. Përdorimet e bimës .................................................................................... 7

1.6.2. Përdorimet e vajrave esenciale të specieve të ndryshme të gjinisë Salvia 8

1.7. Vajrat esencialë të sherbelës ........................................................................... 9

1.7.1. Variacioni i përbërësve të vajrave esenciale ............................................ 9

1.7.2. Faktorët që ndikojnë në variacionin e vajrave esenciale ....................... 10

1.8. Terpenet si përbërësit kryesore të vajrave esenciale ..................................... 12

1.8.1. Veçoritë e përgjithshme të terpeneve ..................................................... 12

1.8.2. Biosinteza dhe kompartmentalizimi i terpeneve .................................... 13

1.9. Terpen-sintetazat përgjigjëse për prodhimin e terpeneve ............................. 16

1.10. Sinteza e monoterpeneve nga Salvia officinalis ........................................ 18

1.10.1. Ruajtja dhe sekretimi i monoterpeneve .................................................. 20

1.10.2. Rregullimi i biosintezës të monoterpeneve ............................................ 20

1.10.3. Ndikimi i fazës vegjetative në prodhimin e monoterpeneve ................. 21

1.10.4. Kontrolli i prodhimit të monoterpeneve bazuar në parimin e

transkriptimit ........................................................................................................ 21

1.11. Gjenet koduese të monoterpen-sintetazave në bimë ....................................... 22

1.12. Klonimi i fragmenteve të ADN-Parimi ..................................................... 26

1.12.1. Libraritë gjenomike dhe Libraritë e c-ADN-ve ..................................... 27

1.12.2. Izolimi i gjeneve me anë të PCR ............................................................ 28

v

1.13. Përdorimi i cpADN-së për të vlerësuar diversitetin gjenetik në popullata të

sherbelës ................................................................................................................... 29

1.13.1. Veçori të gjenomës kloroplastike ........................................................... 29

1.13.2. Përdorimi i cpADN-së për të vlerësuar diversitetin gjenetik në popullata

të sherbelës ........................................................................................................... 29

1.14. Analiza RFLP ............................................................................................ 30

1.14.1. Enzimat prerëse të ADN ........................................................................ 31

1.15. Teknologjia e prodhimit të esencave në rrugë gjysmë industriale ............ 32

1.15.1. Trajtimi i materialit bimor para përpunimit ........................................... 32

1.15.2. Gaz-kromatografia e Vajrave Esencialë ................................................ 33

1.15.2.1. Parimi i ndarjeve kromatografike ................................................... 34

1.15.2.2. Analiza gaz-kromatografike .......................................................... 34

1.15.2.3. Aparatura e gaz-kromatografit ........................................................ 35

2. MATERIALE DHE METODA ......................................................................... 37

2.1. Materialet ...................................................................................................... 37

2.2. Metodat e bazuara në acidet nukleike ............................................................... 37

2.2.1 Ekstraktimi i ADN-së gjenomike ................................................................ 37

2.2.2. Vlerësimi sasior dhe cilësor i ADN-së ....................................................... 39

2.2.3. Protokolli i ekstraktimit të ARN totale ....................................................... 40

2.2.4. Matja e sasisë dhe cilësisë së ARN totale .................................................. 41

2.2.5. Vlerësimi i diversitetit të rajonit intergjenik trn të cp-ADN të popullatave

të Salvia officinalis bazuar në PCR-RFLP ........................................................... 41

2.2.5.1. Prerja me enzima restriktive e produkteve të PCR .............................. 42

2.2.6. Shumëfishimi i fragmenteve gjenike të monoterpen-sintetazave nga gADN

dhe ARN totale e popullatave të Salvia officinalis ............................................... 43

2.2.6.1. Amplifikimi i rajonit qëndror të gjeneve koduese të MTP-ve nga ADN

gjenomike .......................................................................................................... 44

2.2.6.2. Amplifikimi i rajonit qendror të gjeneve koduese të MTP-ve nga ARN

totale me anë të RT-PCR .................................................................................. 44

2.2.7. Purifikimi nga xheli i fragmenteve të shumëfishuara me PCR me përmasat

e pritshme ............................................................................................................. 46

2.2.8. Klonimi i ADN-së së purifikuar nga xheli në plazmidet pTOPO 2.1 të Kitit

TA Cloning Kit (pCR 2.1 K2060-40) ................................................................... 47

2.2.9. Analizimi i transformantëve me anë të analizës restriktive ........................ 48

2.2.9.1. Ekstraktimi i ADN-së plazmidike nga klone të përzgjedhura të

baktereve transformante .................................................................................... 48

2.2.9.2 Prerja e plazmideve me enzimat e restriksionit EcoRI dhe TaqI .......... 49

2.3. Vlerësimi i përmbajtjes së monoterpeneve në vajrat esenciale të popullatave të

Salvia officinalis me anë të GC ................................................................................ 49

vi

2.3.1. Izolimi i vajrave esencialë për Salvia officinalis ........................................ 49

2.3.2. Aparatura dhe analiza gaz-kromatografike ................................................. 49

2.3.3. Analiza statistikore e rezultateve ................................................................ 50

3. REZULTATE DHE DISKUTIME ................................................................... 51

3.1 Stabilizimi i metodikave të ekstraktimit të ADN-së gjenomike dhe ARN-së

totale ......................................................................................................................... 51

3.2 Vlerësimi i diversitetit të rajonit intergjenik trn të cp-ADN-së të popullatave të

Salvia officinalis bazuar në PCR-RFLP ................................................................... 54

3.3 Vlerësimi i fragmenteve gjenike të MTP nga popullatat e Salvia officinalis të

Shqipërisë së veriut. ................................................................................................. 61

3.3.2. Analizimi i plazmideve rekombinante me anë të analizës restriktive ........ 62

3.4 Vlerësimi i diversitetit të popullatave të sherbelës së Shqipërisë së veriut

bazuar në përmbajtjen e MTP në vajrat esenciale .................................................... 65

3.4.1. Rezultatet të Gaz-kromatografisë për popullatat e Salvia officinalis ........ 65

3.4.2. Shkalla e ngjashmërisë ndërmjet popullatave bazuar në përmbajtjen e

vajrave esenciale ................................................................................................... 73

PËRFUNDIME .......................................................................................................... 76

BIBLIOGRAFIA........................................................................................................ 78

ANEKS I ..................................................................................................................... 92

ANEKS II .................................................................................................................... 93

ANEKS III .................................................................................................................. 94

PËRMBLEDHJE ..................................................................................................... 118

ABSTRACT .............................................................................................................. 118

vii

LISTA E SHKURTIMEVE

(Co)A Acetil-koenzima

ADN Acidi dezoksiribonukleik

ARN Acidi ribonukleik

BS Bornil difosfat sintetaza

c-ADN ADN komplementare

cpADN ADN kloroplastike

CPP Ent-copalil difosfat

CS Cineol sintetaza

CTAB Cetil-tri-metil-amonium-bromid

DMAPP Dimetilalil difosfat

DMAPP Dimetilalil difosfati

dNTPs Deoksinukleotid trifosfatet

DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

DXPS Rruga jo mevalonike në plaste

E.coli Escheriscia coli

EDTA Etilen Dinitrilo Acetic Acid

ER Rrjeti endoplazmatik

EtOH Etanol

FID Detektor me jonizim me flakë

FPP Farnesyl diphosphate

FSHN Fakulteti i Shkencave të Natyrës

GA Giberelina

GC Gas chromatography

GGPP Geranylgeranyl diphosphate (GGPP)

GPP Geranil difosfati

GPP Geranil pirofosfat

GPP Geranyl diphosphate

HIV-1 Virusi i imunodefiçencës humane

HMG-CoA 3-hidroksi-3-metilglutaryl CoA

HMGR Enzima HMG-CoA reduktazë

IPP izopentenil difosfat

LiCl Klorur litiumi

m-ARN ARN mesazhere

MeJA Metil jasmonati

MEP Methylerythritol phosphate

MgCl Klorur magneziumi

MTPs Monoterpen sintetazat

MVA Rrugëkalimi mevalonik

NaCl Klorur natriumi

OD Densiteti Optik në 260/280 nm

PCoA Principle component analysis

PCR Polymerase Chain Reaction

viii

PTGS Heshtja e gjeneve tek transgjenikët

PTR-MS Mass spectrometry

qPCR Quantitative PCR

rARN ARN ribozomale

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphisms

RT-qPCR Reverse transcriptase qPCR

Rrezatim UV Rrezatim ultraviolet

SBS Sage bornyl dipfospfate

SCS Sage 1,8-cineole synthase

SS Sabiene sintetaza

SSS Sage sabiene synthase

TAE Tris Acetat EDTA

Taq pol- Thermus aquaticus polymerase

TPS Terpen-sintetazat

ix

LISTA E TABELAVE

Tabela 1.1. Lista e specieve kryesore të sherbelës ........................................................ 2

Tabela 1.2. Grumbullimi i gjetheve të sherbelës .......................................................... 3

Tabela 1.3. Sipërfaqja (ha) dhe potenciali prodhues (në ton) i sherbelës në Shqipëri .. 6

Tabela 1.4. Përdorimet e vajrave esencialë të llojeve të sherbelës ............................... 8

Tabela 2.1. Popullata e sherbelës së Shqipërisë së veriut prej nga u izolua ADN

gjenomike & ARN totale ............................................................................................. 40

Tabela 2.2. Sekuencat e çiftit të primerave të përdorur për amplifimin e rajonit

specifik inter-gjenik nga cp-ADN e popullatave të sherbelës ..................................... 42

Tabela 2.3. Gjenotipet për secilën popullatë të sherbelës së Shqipërisë së veriut të

analizuara me PCR-RFLP ............................................................................................ 42

Tabela 2.4. Përzierja e reaksionit të fazës së parë të RT-PCR .................................... 44

Tabela 2.5. Përbërja e reaksionit të RT-PCR .............................................................. 45

Tabela 2.6. Kushtet e ciklimit te RT-PCR .................................................................. 46

Tabela 2.7. Përbërësit e reaksionit të klonimit ............................................................ 47

Tabela 3.1. Rezultatet e matjeve spektrofotometrike të sasisë dhe cilësisë së ADN

gjenomike sipas Doyle & Doyle (1987) i modifikuar ................................................. 51

Tabela 3.2. Rezultatet e matjeve spektrofotometrike të sasisë dhe cilësisë së ADN

gjenomike sipas GenElute TM Plant Genomic DNA Kit (SIGMA) G2N-70 ............. 52

Tabela 3.3. Rezultatet spektrofotometrike të cilësisë dhe sasisë së ARN totale të

ekstraktuar sipas Young et al. 2007 ............................................................................. 53

Tabela 3.4. Përbërja e vajrave esenciale të popullatave të Shqiperisë së veriut

(monoterpenet dhe seskuiterpenet kryesore) ............................................................... 72

x

LISTA E FIGURAVE

Figura 1.1. Sherbela të llojeve të ndryshme.................................................................. 1

Figura 1.2. Sherbela të llojeve të ndryshme.................................................................. 2

Figura 1.3. Hartë shpjeguese e përhapjes së sherbelës në botë. (Allen 2014) .............. 4

Figura 1.4. Biosinteza e IPP dhe DMAPP në rrugëkalimin mevalonik (majtas) dhe në

atë jo-mevalonik (djathtas) .......................................................................................... 14

Figura 1.5. Përshkrim skematik i biosintezës së klasave të ndryshme të terpeneve ... 15

Figura 1.6. Përzgjedhja e monoterpeneve të përftuar nga geranyl difosfati (GPP). ... 16

Figura 1.7. Paraqitje skematike e veprimit të klasave të ndryshme të terpen-

sintetazave .................................................................................................................... 18

Figura 1.8. Protokoll përgjithësues për klonimin e gjeneve dhe krijimin e librarive

gjenomike (sipas T.A.Brown, 2010 ) ........................................................................... 27

Figura 1.9. Skemë e përgjithshme mbi metodat e klonimit të ADN gjenomike

(A.Bacu, 2012) ............................................................................................................. 28

Figura 1.10. Aparati i Gaz-Kromatografit .................................................................. 36

Figura 2.1. Momente pune nga marrja e mostrave ..................................................... 37

Figura 2.2. Pamje nga puna për ekstraktimin e acideve nukleike dhe dokumentimi i të

dhënave ........................................................................................................................ 39

Figura 2.3. Harta e popullatave të Shqipërisë të veriut të marra në studim ................ 39

Figura 2.4. Nga puna në laboratorëte Bioteknologjisë Molekulare, FSHN, UT dhe

pranë Universitetit “Ioan Cusa”, Rumani .................................................................... 41

Figura 3.1. Krahasimi i cilësisë së ADN-së të sherbelës së ekstraktuar duke përdorur

të dy metodat ................................................................................................................ 52

Figura 3.2. Krahasimi i sasisë së ADN-së të sherbelës së ekstraktuar duke përdorur të

dy metodat .................................................................................................................... 53

Figura 3.3. Produktet e shumëfishimit të cpADN nga 13 popullatat e sherbelës së

Shqipërisë së veriut ( 43 gjenotipe) me çiftin e primerave trnL-trnF .......................... 54

Figura3.4.(A) Produktet e marra nga prerja e amplikoneve të PCR me primerat trnL-

trnF me enzimën prerëse TaqI për 43 gjenotipe të Salvia officinalis .......................... 55

Figura3.4.(B) Produktet e marra nga prerja e amplikoneve të PCR me primerat trnL-

trnF me enzimën prerëse AluI për 43 gjenotipe të Salvia officinalis ......................... 56

Figura 3.5.(A) Dendrograma e afërisë për 43 gjenotipe (13 popullata) të sherbelës

bazuar në përmasat e produkteve të prerjes restriktive të fragmenteve të cp-ADN

(Enzima AluI) .............................................................................................................. 56

Figura 3.5.(B) Dendrograma e afërisë për 43 gjenotipe (13 popullata) të sherbelës

bazuar në përmasat e produkteve të prerjes restriktive të fragmenteve të cp-ADN

(Enzima TaqI) .............................................................................................................. 56

Figura 3.6.A/B Kontributi i enzimave prerëse AluI dhe TaqI në zbulimin e diversitetit

gjenetik ndërmjet fragmenteve të cp-ADN për popullatat e sherbelës të Shqipërisë së

veriut ............................................................................................................................ 58

Figura 3.7. Shpërndarja grafike e kontributit të dy enzimave AluI dhe TaqI në

diskriminimin e individëve. ........................................................................................ 59

Figura 3.8. Dendrograma e ndërtuar mbi bazën e të dhënave të PCR-RFLP mbi

cpADN e 43 gjenotipeve të sherbelës së veriut të Shqipërisë, të marra nga të dy

enzimat TaqI dhe AluI ................................................................................................. 60

Figura 3.9. Afëria ndërmjet popullatave sipas të dhënave të PCR- RFLP mbi cpADN

...................................................................................................................................... 60

Figura 3.10. Produktet e shumëfishimit të templatit ADN gjenomike dhe ARN totale

për 13 popullatat me anë të Sbs350/Sbs1010 .............................................................. 61

xi

Figura 3.11. Produktet e shumëfishimit me anë të Sbs350/Sbs1010 nga templat ARN

-je ................................................................................................................................. 62

Figura 3.12. Profilet e prerjes restriktive për popullatën e Krujës .............................. 63

Figura 3.13. Profilet e prerjes restriktive për popullatën e Postribës .......................... 63

Figura 3.14. Profilet e prerjes restriktive për popullatën e Torovicës ........................ 63

Figura 3.15. Kromatogramë e marrë me GC/FID për popullatën e Salvia officinalis të

Shkodrës ....................................................................................................................... 65


Malësisë së Madhe (Grishaj) ....................................................................................... 66


Torovicës...................................................................................................................... 66


Rubikut ......................................................................................................................... 66


Krujës ........................................................................................................................... 67


Balldrenit...................................................................................................................... 67


Fushë Milot-it............................................................................................................... 67

Figura3.22. Kromatogramë e marrë me GC/FID për popullatën e Salvia officinalis të

Lezhës .......................................................................................................................... 68


Lohes ............................................................................................................................ 68


Postribës ....................................................................................................................... 69


Shëngjinit ..................................................................................................................... 69


Ulzës ............................................................................................................................ 70


Valbonës ...................................................................................................................... 70

Figura 3.28. Përmbajtja në kategoritë kryesore të monoterpeneve dhe sesquiterpeneve

në popullatat e Shqipërisë së veriut ............................................................................. 73

Figura 3.29. PCA-Biplot i grupon popullatat në studim në varësi të përmbajtjes së

vajrave esenciale .......................................................................................................... 74

Figura 3.30. Paraqitja grafike e kontributit të çdo përbërësi të vajrave esenciale tek

popullatat e sherbelës së Shqipërisë së veriut në raport me njëri-tjetrin ...................... 74

xii

HYRJE

Gjinia Salvia përfaqësohet nga mbi 950 specie të shpërndara në të gjitha kontinentet,

të karakterizuara me ndryshueshmëri të mëdha morfo-biologjike e me interes të madh

tregtar e ornamental. Ndër to, Salvia officinalis L. është ndër më të vlerësuarat për

përmbajtjen e vajrave esenciale, të cilat së bashku me pjesët vegjetative të bimës

gjejnë përdorime të shumta në mjekësi dhe kulinari.

Përbërësit kryesorë të identifikueshëm në vajrat esencialë të sherbelës janë 40, ndër të

cilët terpenet e llojeve si α- dhe β-tujoni, kamfor, 1,8-cineol, humulene, acetat bornil,

limonene, viridiflorol, karafileni, manool (Asllani, 2000; Velickovic et al., 2003;

Grausgruber-Gröger et al., 2012; Said-Al Ahl et al., 2015; Couladis et al., 2012, etj).

Megjithatë, raportime nga vende të ndryshme të botës tregojnë variabilitet në

përbërjen e vajrave esenciale.

Terpenet janë grupi më i madh i produkteve natyrore bimore, i cili përfshin së paku

30,000 përbërës (Connolly & Hill, 1991). Sot njihen skeletet karbonike të qindra

terpeneve të ndryshme (Aubourg et al., 2002; Dudareva et al., 2003; Tholl, 2006a);

monoterpeneve (C10) (Dewick, 1999), sesquiterpeneve (C15) (Fraga, 2006),

diterpeneve (C20) (Hanson, 2000) dhe triterpeneve (C30) (Connolly & Hill, 2005).

Ata janë kontribuesit kryesorë të arsenalit kimik të bimëve dhe mikroorganiznave, me

rol kryesor në ruajtjen kundër dëmtuesve, tërheqjen e inekteve për kryerjen e

pllenimit dhe sinjalizimit të bimëve të tjera. Në një luftë konstante midis presë dhe

grabitqarëve, profili kimik i terpenoideve të prodhuara nga një organizëm duhet të

evolojë dhe përshtatet në mënyrë të shpejtë në atë që quhet gara e bashkë-evolucionit

(Ehrich and Raven, 1964; Harborne, 1993). Prandaj terpen-sintetazat, enzimat kyçe në

biosintezën e terpenoideve, janë një model tërheqës për studimin e evolucionit të

funksionit të enzimave.

Bazuar në sekuencat e aminoacideve, TPS ndahen në gjashtë nënfamilje, TPS-a deri

TPS-f dhe kanë origjinë evolucionare nga një substrat i vetëm (Bohlmann et al.,

1998). Këta katalizatorë konvertojnë prenil difosfatet aciklike dhe skualenet në forma

të ndryshme ciklike dhe aciklike. Biosinteza e terpeneve (Wise & Croteau, 1999;

Cane, 1999) dhe në veçanti e monterpeneve (Davis & Croteau, 2000; Tholl, 2006;

Christianson, 2006) është studiuar në detaje tashmë, por ende vijon puna për të

kuptuar kujt i dedikohet larmia e këtyre produkteve.

Monoterpenet janë klasa më e thjeshtë e terpenoideve, të cilat e kanë prejardhjen nga

difosfati i izopentenilit (IPP) dhe izomerit alelik të dimetilalil di fosfatit (DMAPP).

Tek bimët, ky prekursor qëndror sintetizohet në plaste. Monoterpenet dhe diterpenet

biosintetizohen në plaste (kloroplaste, kromoplaste, leukoplaste), ndërsa sekuiterpenet

në citoplazmë (Crozier et al., 2006).

Monoterpene sintetazat (ciklazat) janë enzimat kyçe në biosintezën e monoterpeneve

(Croteau,1987) pasi ato kanalizojnë ciklimin e geranil difosfat (GPP/GDP), i cili është

ndërmjetësi i biosintezës së izoprenoideve universale aciklike (C10) në skeletet

specifike të monoterpeneve (El Tamer et al., 2003; Schwab et al., 2001).

Me sa duket, numri i madh i TP i dedikohet jo vetëm shumëllojshmërisë së enzimave

përgjegjëse për biosintezën e tyre, por edhe aftësisë së këtyre katalizatorëve për të

formuar produkte shumëfishe nga një substrat i vetëm. Kjo tregon se kjo klasë

enzimash mund të ketë mekanizma unike për të kontrolluar ciklet e karbokationeve.

xiii

Monterpen-sintetazat janë të tretshme, dhe gjenden në plaste në kushte in vivo

(Bohlmann et al., 1997). Analizat e sekuencave koduese të tyre në bimë të ndryshme

kanë treguar rajone të konservuara dhe karakteristika strukturore, numër të barabartë

intronesh dhe përmasa të ngjashme të ekzoneve, si dhe pozicion të njëjtë të tyre

(Bohlmann et al., 1998).

Raportimet mbi kapacitetin e një terpen-sintetaze të vetme për të prodhuar produkte

shumëfishe shpesh lidhen me veçoritë e gjeneve të tyre koduese. Vitet e fundit një

numër gjenesh të këtij lloji janë klonuar dhe karakterizuar nga specie të kategorive të

gjimnospermëve dhe angjiospermëve, sherebela (Wise et al., 1998), koniferet (Abies

grandis dhe Taxus brevifolia) (Trapp & Croteau, 2001), hardhia (Vitis vinifera)

(Martin dhe Bohlmann, 2004), çaji (Melaleuca alternifolia) (Shelton et al., 2004),

mandarina (Citrus unshiu) (Shimada et al., 2004; Shimada et al., 2005), etj.

Një bimë, e cila prodhon një gamë të gjerë monoterpenesh është Salvia officinalis.

Zakonisht speciet e Salvia officinalis prodhojnë kategori të ndryshme të metabolitëve

sekondarë, shumë prej të cilave janë studiuar për rolin dhe përfitimet e tyre në

funksione të ndryshme biologjike (Balandrin et al., 1985). Kjo klasë e metabolitëve

sekondarë në bimët e larta prodhohen nëpërmjet një rruge konvencionale të acidit

acetat-mevalonik, e cila operon kryesisht në citoplazmë dhe mitokondri dhe sintetizon

kryesisht sterole, seskuiterpene dhe ubikinone.

Në plaste, ndodh rruga e acidit jo-mevalonik dhe sintetizon hemi-, mono-, sesqui-,

dhe diterpenet bashkë me karotenoidet dhe bishtat fitolikë të klorofilave (Singh &

Sharma, 2015).

Popullatat eSalvia officinalis L. të Shqipërisë janë studiuar për një kohë të gjatë për

qëllime tregtare por kohët e fundit kanë qenë objekt studimi i diversitetit gjenetik të

tyre kryesisht në popullatat e Shqipërisë qëndrore dhe jugore (Bacu et al., 2003, 2004,

2005; 2011, etc).

Ky punim konsideron popullatat e Shqipërisë të veriut, të cilat përgjithësisht shfaqin

një diversitet të ulët morfologjik. Duke e konsideruar biodiversitetin e popullatave

natyrale të sherbelës si një pasuri kombëtare, për vlerat e veçanta që ofron përdorimi i

bimës dhe i vajrave esenciale, ky punim synoi të qartësonte shumëllojshmërinë e

gjeneve koduese për monoterpen-sintetazat, një nga grupet kryesore të enzimave që

kontrollojnë prodhimin e monoterpeneve, dhe lidhjen e rezultateve me përbërjen në

monoterpene të vajrave esenciale të tyre.

Monoterpenet janë ndër përbërësit më të vlefshëm të vajrave esenciale të sherbelës

dhe të gjithë bimëve aromatike-mjekësore dhe nivelet e tyre mendohet se mund të

kontrollen bazuar në principin e transkriptimit (Dudareva et al., 1996; McConkey et

al., 2000; Mahmoud and Croteau, 2003; Mahmoud et al., 2004; Xie et al., 2008; Lane

et al., 2010; Schmiderer et al., 2010). Megjithatë, jo të gjitha monoterpenet

kontrollohen në këtë nivel (Xie et al., 2008; Schmiderer et al., 2010).

Metodologjia e ndjekur në këtë studim u bazua në shumëfishimin me PCR të një

fragmenti gjenik qëndror të MTP nga ADN gjenomike dhe ARN totale për të

verifikuar praninë e introneve. Fragmentet e shumëfishuara me përmasat e pritshme u

klonuan dhe rekombinantët u identifikuan sipas parimit të ngjyrimit të kolonive

bakteriale në prani te X-Gal (Kiti i Iinvitrogen) sipas strategjisë të klonimit të

Sambrook (1989).

xiv

Meqënëse, përmasat e MTP-ve të shumëfishuara nga modele të gADN dhe ARN

totale ishin identike, çka do të thotë se rajoni i shumëfishuar ishte kodues në të gjitha

popullatat, u vendos të përzgjidhen për studim të mëtejshëm popullatat më të veçanta.

Monoterpen-sintetazat kanë origjine plastidike, ndaj u vendos që të izolohej cp-ADN

nga të trembëdhjetë popullatat dhe me anën e primerave intergjenike (trnL/F) (sipas

Walker, 2004) u vlerësua bazuar në PCR-RFLP diversiteti i rajonit të shumëfishuar.

Fenomeni i konservimit të gjenomave organelare është studiuar ndër vite për të

dizenjuar primera universalë, të përshtatshëm për të shumëfishuar rajone jo-koduese

polimorfike të cpADN-së të disa algave, briofiteve, pteridofiteve, gjimnospermeve

dhe angjiospermëve (Taberlet et al., 1991; Ibrahim et al., 2012), rajone jo-koduese të

mitokondrive dhe cpADN-ve (Demesure et al., 1995), rajone koduese të cpADN-ve

(Badenes and Parfit, 1995; Tsumura et al., 1996) si dhe gjithë gjenomën kloroplastike

(Dhingra and Folta 2005; Ibrahim et al., 2007; Rashid et al., 2012).

Rajoni inter-gjenik trnL-F dhe sekuencat e gjenit rbcL të cpADN-së janë përdorur për

të studiuar Salvian dhe llojet e përafërta (Walker, 2004; Ibrahim, 2012; Li, 2013) për

të përshkruar lidhjet filogjenetike tek Lamiaceae. Speciet e Salvia të grupuara bazuar

në origjinë (Clebsch, 2003) treguan se rezultati ishte në përputhje me studimin e

Walker (2004), pavarësisht se në studim u perdorën pjesë të ndryshme te cpADN. Po

ashtu, të gjitha speciet e Salvia të përfshira në studimin e Ibrahim (2010) dhe Walker

(2004) u grupuan sipas origjinës.

Në studimin tonë, paralelisht me vlerësimin e diversitetit gjenetik të gjeneve MTP,

nga popullatat u izoluan vajrat esenciale dhe me anë të GC u përcaktua përmbajtja e

monoterpeneve në to.

Rezultatet e metodave të vlerësimit të bazuara në cp-ADN dhe gaz-kromatografi,

treguan se popullatat mund të grupoheshin duke veçuar si më uniket popullatat e

Krujës, Torovicës dhe Postribës.

Vlerësimi i mëtejshëm i shumëllojshmërise të fragmenteve të klonuara në këto tre

popullata me anë të prerjes me enzima restriktive, tregoi se ato janë të ndryshme edhe

në nivel gjenik.

Në këtë mënyrë, ky punim për herë të parë vlerësoi diversitetin e gjeneve koduese të

MTP të trembëdhjetë popullatave të Shqipërisë së veriut dhe produkteve enzimatike të

tyre, monoterpeneve, dhe tregoi se grupimi i popullatave bazuar në të dyja këto

kategori të dhënash si edhe në variacionin e një rajoni (intergjenik) të cp-ADN

korrelon.

xv

QËLLIMI DHE OBJEKTIVAT

Qëllimi i këtij punimi është:

Vlerësimi i shumëllojshmërisë së gjeneve koduese të monoterpen-sintetazave dhe

produkteve enzimatike të tyre tek popullata të sherbelës të Shqipërisë së veriut.

Objektivat specifikë të këtij punimi janë:

Izolimi i gjeneve/fragmenteve gjenike koduese të monoterpen-sintetazave me

anë të shumëfishimit të bazuar në homologjinë e gjeneve koduesë të TPs me

anë të PCR (nga gADN dhe ARN totale), klonimin e produkteve (në

plazmidin pTOPO2.1), krijimin e librarive përkatëse në E.coli dhe verifikimin

me anë të prerjes restrikive të diversitetit të fragmenteve të klonuara.

Përcaktimi i produkteve enzimatike finale të gjeneve koduese të MTP me anë të

gaz-kromatografisë (GC) dhe krahasimi sasior e cilësor ndërmjet popullatave.

Analizimi i të dhënave dhe arritja e konkluzioneve mbi ngjashmërinë ndërmjet

popullatave, bazuar në të dhënat e profileve kimike të monoterpeneve dhe

rajoneve specifike të cp-ADNsë së popullatave, me synim të kuptuarit e thelluar

të shprehjes së gjeneve koduese të monoterpen sintetazave.

KONSIDERATA TEORIKE

1

1. KONSIDERATA TEORIKE

1.1. Përshkrim i përgjithshëm i sherbelës (Salvia officinalis)

Sherbela është ndër bimët e njohura qysh nga koha e Romës antike. Sherbela rritet

natyralisht përgjatë rajonit të Mesdheut dhe rajoneve të Europës jug-lindore

(Ballkanike). Sipas klasifikimit botanik ajo i përket familjes Lamiaceae, subfamiljes

Nepetoideae, dhe gjinisë Salvia (Papadhopuli et al., 1976). Emri shkencor i sherbelës

është Salvia officinalis. Emri Salvia rrjedh nga fjala latine "salvere", që do të thotë

"për të shpëtuar" për shkak të aftësive të saj mjekësore (Dweck, 2000). Sherbela rritet

mirë në toka ranore, alkaline në kushte të caktuara të rrezatimit diellor.

Ato mund të jenë bimë shumëvjeçare, dyvjeçare ose vjetore, në varësi të kushteve

gjeografike-klimatike. Rritet deri në 170 cm në gjatësi dhe ka rrënjë karakteristike të

drunjta.Gjethet aromatike kanë ngjyrë jeshile në gri dhe sipërfaqe të butë me push.

Gjatë verës çelin lule me ngjyrë blu në vjollcë nga 2-8 të vendosura në aksin vertikal,

që tërheqin bletët ose insekte të tjera, të cilat mundësojnë pllenimin e mëtejshëm të

bimës (Hedge,1972).

Nisur nga forma dhe madhësia e gjetheve dallohen katër lloje të sherbelës: sherbela

me gjethe tre-segmentëshe, sherbela me gjethe halore, sherbela blu, sherbela clary.

Madhësia dhe forma e gjetheve ndikojnë në përdorimet e ndryshme të saj. Sherbela

me gjethe tre-segmentëshe (S.fruticosa ose S.triloba), ka gjethe të rrumbullakëta, rritet

në rajonin e Mesdheut dhe përdoret gjerësisht për përgatitjen e çajit të sherbelës.

Sherbela me gjethe halore, si të pishës (S.rutilans) ka gjethe të freskëta dhe përdoret

për ti shtuar aromë ëmbëlsirave dhe pijeve.

Figura 1.1. Sherbela të llojeve të ndryshme

A) Sherbela me gjethe si të pishës (S.rutilans). B) Sherbela me gjethe tri-segmentëshe

(S.triloba) (Hedge,1972)

Sherbela clary (S.sclarea) ka gjethe shumë aromatike, përdoret për infuzione fyti,

gargara si dhe në parfumeri. Sherbela blu (S.azurea) është bimë e madhe me lule blu,

e cila njihet në Meksikë si një ilaç çudibërës mjekësor (Bailey, 1924).

KONSIDERATA TEORIKE

2

Figura 1.2. Sherbela të llojeve të ndryshme

C) Pamje e sherbelës blu (S.azurea), D) Pamje e sherbelës Clary (S.sclarea) Bailey,

1924

Në familjen e Lamiaceae-ve, gjinia Salvia është më e pasura në specie (mbi 950), të

shpërndara në të gjitha kontinentet dhe të karakterizuara me ndryshueshmëri të mëdha

morfo-biologjike shumë prej të cilave paraqesin interes të madh tregtar e ornamental.

Më kryesoret renditen si më poshtë:

Tabela 1.1. Lista e specieve kryesore të sherbelës

Nr. Gjinia Nr. Gjinia

1. Salvia apiana 19. Salvia leucantha

2. Salvia argentea 20. Salvia leucophylla

3. Salvia arizonica 21. Salvia lyrata

4. Salvia austriaca 22. Salvia mexicana

5. Salvia azurea 23. Salvia mohavensis

6. Salvia clevelandii 24. Salvia microphylla

7. Salvia coccinea 25. Salvia miltiorrhiza

8. Salvia columbariae 26. Salvia nemorosa

9. Salvia divinorum 27. Salvia officinalis

10. Salvia dorrii – Ute 28. Salvia patens

11. Salvia elegans 29. Salvia pratensis

12. Salvia farinacea 30. Salvia sclarea

13. Salvia fruticosa 31. Salvia spathacea

14. Salvia fulgens 32. Salvia splendens

15. Salvia glutinosa 33. Salvia uliginosa

16. Salvia greggii 34. Salvia verbenaca

17. Salvia guaranitica 35. Salvia verticillata

18. Salvia hispanica 36. Salvia viridis

1.2. Speciet e familjes Lamiaceae të rritura në Shqipëri

Sherbela është një bimë që njihet gjerësisht në vendin tonë. Për shkak të vlerave të saj

mjekësore, aromatike, ekonomike, ekologjike dhe estetike, ajo kultivohet me sukses

në disa rajone. Fakti që disa anëtarë të gjinisë Salvia klasifikohen si specie në rrezik,

është i lidhur me rëndësinë ekonomike të tyre. Të tilla janë Salvia officinalis L. (Sin.

Salvia auriculata Ten), Salvia schlarea L., Salvia triloba L. (Sin. Salvia pomifera),

Salvia pratensis L., Salvia glutinosa L., Salvia hormium L., Salvia verticallata, etj.

KONSIDERATA TEORIKE

3

Për këtë arsye, këto specie janë studiuar për të vlerësuar diversitetin brënda llojor

(ekotipe të ndryshme) bazuar në përmbajtjen kimike të vajrave esenciale (U.Asllani

2000, 2004; Babani, 2005; etj) dhe në nivel molekular (Bacu et al., 2005). Emërtimi

popullor i bimës varion nga rajoni në rajon të Shqipërisë si sherbelë, bedunicë,

delenicë, stërbelë, susbelë, cfagë etj.

Grumbullimi i sherbelës (në ton) sipas KEA (2003) ka qënë si vijon:

Tabela 1.2. Grumbullimi i gjetheve të sherbelës

Bimë 1965 1980 1985 1989 2000 2010

Fletë sherbele 3000 2630 2842 456 1700 2500

Në vitet 2003-2005, me financimin e Bankës Botërore, përmes Projektit të

Shërbimeve Bujqësore (ASP) u bë e mundur mbështetja dhe financimi i Programit të

Koleksionimit dhe Vlerësimit të Gjermoplazmës së bimëve aromatike dhe/ose

mjekësore.

Përmes këtij programi u kryen disa misione për koleksionimin e 11 bimëve kryesore

aromatike dhe/ose mjekësore, ku peshën më të madhe të punës e zinte bima me

rëndësi të madhe ekonomike por e rrezikuar e sherbelës me 116 pika eksplorimi. Këto

kishin një shtrirje nga jugu në veri, kryesisht në rrethet Sarandë, Delvinë, Gjirokastër,

Vlorë, Tepelenë, Përmet, Skrapar, Berat, Elbasan, Tiranë, Krujë, Mat, Lezhë.

1.3. Përhapja gjeografike e sherbelës

Ka mbi 900 lloje të Salvia-s në mbarë botën, gjysma e tyre janë të shpërndara

gjerësisht në Amerikën Qendrore dhe Jugore (500 lloje), ndërsa të tjerët janë në Azinë

Qendrore dhe të Mesdheut (250 lloje), Azinë Lindore (90 specie) dhe në rajonin e

Afrikës së Jugut (30 lloje) (Walker et al., 2004). Gjithashtu sherbela është e

shpërndarë gjerësisht në Europë, në zonën jug-lindore e mesdhetare (Walker et al.,

2004).

Është bimë natyrore në Shqipëri; Bosnjë dhe Herzegovinë; Kroaci; Francë (Korsikë

dhe Franca qendrore); Greqi (Ishujt lindorë të Egianit; Greqia qendrore, Kretë; ); Itali

(Italia qendrore, Sardenja, Siçili); Maqedoni, Mali i Zi, Serbi, Kosovë, Slloveni;

Spanjë (Baleares, Spanja qendrore).

Dhe e huazuar në Andorra; Austri; Belgjikë; Bullgari; Republikën Çeke; Danimarkë;

Gjermani; Irlandë; Luxemburg; Maltë; Moldavi; Norvegji; Poloni; Rumani; Rusi

(Rusia Europiane); Sllovaki; Suedi; Zvicër; Turqi (Turqia Europiane); Ukrainë;

Mbretëri e Bashkuar (Britania e Madhe); sipas Allen 2014 (Fig 1.3)

KONSIDERATA TEORIKE

4

Figura 1.3. Hartë shpjeguese e përhapjes së sherbelës në botë. (Allen 2014)

1.4. Kushtet klimatike – tokësore të favorshme për rritjen e sherbelës

Toka dhe klima

Sherbela është bimë me kërkesa të pakta për tokën. Ajo përshtatet në çdo lloj toke,

sidomos ato malore, shkëmbore e gurishtore. Më mirë zhvillohet në toka gëlqerore, në

vende të ngrohta e të mbrojtura nga erërat. Preferon klimën mesdhetare, kodrinore dhe

malore.

KONSIDERATA TEORIKE

5

Sherbela është një bimë tipike mesdhetare termofile dhe eliofile (temperaturë dhe

dritë dashëse). Ajo përballon klimën kryesisht kontinentale me luhatje të mëdha të

temperaturave, përballon temperaturën e ulët të dimrit dhe lagështirën minimale të

ajrit dhe eviton tokat që mbulohen për një kohë të gjatë nga retë. Sherbela vegjeton

normalisht deri në 700 m mbi nivelin e detit, por arrin të rritet deri në 900 m mbi

nivelin e detit. Ajo mund të adaptohet edhe në toka të tjera nëse toka është e mirë-

drenazhuar dhe me ph mbi 6. Ajo është specie e ndjeshme nga të ftohtit (T < - 10 °C)

dhe toleron pak periudhën me lagështirë të tejzgjatur.

Periudhat e thata të tejzgjatura (Maj–Shtator) të shoqëruara me temperatura të larta

bëhen vdekjeprurëse për 10-20 % të bimëve. Edhe pse sherbela është rezistente ndaj

thatësirës, prania e ujit e rrit prodhimin dhe në ambiente të karakterizuara nga

thatësira verore, lejon një vjelje të dytë vjeshtore. Sipas të dhënave të kohës, janë të

përshtatshme 5-9 ndërhyrje ujore me një volum prej 300 m3/ ha secila. Gjithsesi, ajo

është më e përshtatur me thatësirën sesa me lagështirën e tepërt si të tokës ashtu dhe të

ajrit dhe për një kohë të gjatë, gjë e cila, bëhet vdekjeprurëse për të (Papadhopuli et

al., 1976).

Përbërja e tokës ndryshon natyrën dhe sasinë e lëndëve vepruese të bimëve, gjë e cila

lidhet dhe me rritjen dhe përhapjen e llojeve të bimëve. Përshkueshmëria, lagështira,

kapilariteti si dhe poroziteti ndikojnë në pjellorinë e tokës dhe rendimentin e

prodhimtarisë së saj. Sherbela ka kërkesa për rritje në toka argjilore-gëlqerore

(sherbela) (Papadhopuli et al.,1976).

Klima është ndër faktorët jetik të biodiversitetit. Faktorët që ndikojnë në formimin e

klimës janë gjerësia gjeografike, lartësia mbi nivelin e detit, ekspozicioni i diellit,

afërsia e deteve apo liqeneve etj. Zhvillimi dhe përmbajtja e lëndëve vepruese të

bimëve varet shumë nga temperatura mesatare, pasi e njëjta lloj bime mund të gjendet

në zona të ndryshme klimatike, si rrjedhojë sjellja e saj është e ndryshme

(Papadhopuli et al.,1976).

Ndikimi i kultivimit, moshës dhe plehërimit janë faktorë të tjerë që ndikojnë në

përhapjen dhe vetitë e bimëve mjekësore dhe aromatike. Kultivimi i bimëve ndikon

në vlerat dhe rendimentin e tyre. Në qoftë se bima kultivohet në kushte të njëjta ose të

përafërta klimatiko-tokësore, me ato në gjendje të egër, atëherë ajo mund të rrisë

sasinë e lëndëve vepruese, duke çuar dhe në rritjen e rendimentit, por në të kundërt

ndodh që kultivimi mund të ulë përqindjen e lëndës vepruese.

Ndikimi veprues i bimës varet nga mosha e saj në varësi të pjesës së përdorshme të

bimës. Kur mosha e bimës është e re, vetitë e saj vepruese janë më të ulta, duke

përjashtuar rastet kur bimës i përdoret lëvorja dhe rrënjët. Kur mosha e bimës ka

arritur periudhën e pjekurisë, vetitë e saj janë më të larta (në rastet kur i përdoren

frutat e saj). Pra pjesët e ndryshme të bimës kanë veti të ndryshme në varësi të moshës

në të cilën mblidhet bima.

Ndërsa plehërimi është një indikator pozitiv në vlerat e kësaj bime, nëse ai përdoret

rregullisht dhe duke u përgatitur sipas teknologjisë përkatëse dhe masës së duhur

(Papadhopuli et al.,1976).

KONSIDERATA TEORIKE

6

1.5. Kultivimi i sherbelës në Shqipëri

Pas rënies së sasisë së sherbelës së egër dhe rrezikut për zhdukje në disa zona të

vendit tonë, u nxit kultivimi i kësaj bime mjekësore. Sipërfaqet e mbjella me sherbelë,

janë të ndryshme në zona të ndryshme të Shqipërisë, gjithashtu edhe sasia që vilet.

Pas viteve 1990, kulturës së bimëve aromatike mjekësore ju kushtua rëndësi edhe nga

shteti duke subvencionuar dhe inkurajuar kultivimin e tyre nga popullsia, pavarësisht

se nga tregu i huaj lloji i sherbelës që pëlqehet dhe synohet më shumë është sherbela e

egër. Më poshtë paraqitet një tabelë përmbledhëse e rajoneve të vendit tonë ku

kultivohet sherbela.

Tabela 1.3. Sipërfaqja (ha) dhe potenciali prodhues (në ton) i sherbelës në Shqipëri

Nr Emërtimi i qarkut Sip. (ha) Sasia (ton)

1. Berat (Berat, Skrapar, Kuçovë) 1256 522

2. Dibër (Dibër, Bulqizë, Burrel) 1037 54

3. Durrës (Durrës, Krujë) 140 21

4. Elbasan (Elbasan, Librazhd, Gramsh, Peqin) 116 43

5. Shkodër (Shkodër, M.Madhe, Pukë) 5773 1189

6. Gjirokastër (Gjirokastër, Përmet, Tepelenë) 9232 1174

7. Korçë (Korçë, Pogradec, Devoll, Kolonjë) 260 97

8. Kukës (Kukës, Has, Tropojë) 783 192

9. Lezhë (Lezhë Kurbin, Mirditë) 1599 451

10. Tiranë (Tiranë, Kavajë) 36 3

11. Vlorë (Vlorë, Sarandë, Delvinë) 6178 1000

Burimi: Instituti i Kërkimeve Biologjike, Akademia e Shkencave. (Kathe et al. 2000)

Nga të dhënat, llogaritet që sipërfaqja e kultivuar në vitin 2000 ka qenë 26 377 ha,

ndërsa sasia totale 5 346 ton. Sipërfaqet më të mëdha me sherbelë të kultivuar janë

në qarkun e Gjirokastrës, i cili është edhe një ndër qarqet që jep sasinë më të lartë të

sherbelës në treg, ndërsa qarku që prodhon sasinë më të madhe të kësaj bime është ai i

Shkodrës (Instituti i Kërkimeve Biologjike, Akademia e Shkencave).Industria e bimëve

mjekësore dhe aromatike në vitet 2000u shndërrua në një nga industritë kryesore

agrobujqësore në Shqipëri duke zënë mbi 50% të eksporteve bujqësore, duke bërë që

Shqipëria të konsiderohej si eksportuesja e dytë më e madhe e BMA-ve në Europën

JL pas Bullgarisë (Kathe et al., 2000).

KONSIDERATA TEORIKE

7

1.6. Përdorimet e sherbelës në mjekësi

Në mjekësi sherbela përdoret në dy versione bazë, si bimë (gjethe ose çaj) dhe në

formën e vajrave esenciale.

1.6.1. Përdorimet e bimës

Sherbela ka një nga historitë më të gjata në përdorimin në mjekësi dhe në kuzhinë.

Egjiptianët e lashtë e përdornin si ilaç për kurimin e fertilitetit (Bown, 1995). Në

shekullin e parë fizikanti grek Dioscorides raportoi se tretësira ujore që përftohej pas

zierjes së sherbelës, ndihmonte në ndalimin e hemoragjisë së plagëve, pastronte

ulçerën dhe kolitin. Ai gjithashtu, rekomandoi shurupin e sherbelës në ujë të ngrohtë

për kurimin e kollitjes dhe ngjirjen e zërit. Ajo është përdorur nga herbalistët për të

trajtuar reumatizmën, gjakderdhjet e tepërta menstruale, si dhe tharjen e qumështit të

nënës. Veçanërisht është e njohur për efektin që ka në forcimin e sistemit nervor,

përmirësimin e kujtesës dhe mprehjen e shqisave. Sherbela u rendit në Farmokopenë e

Shteteve të Bashkuara të Amerikës nga viti 1840 në vitin 1900.

Rrënjët e S. miltiorrhiza Bunge (Danshen) janë përdorur në mjekësinë tradicionale

kineze për të trajtuar sëmundjet koronare të zemrës, sëmundjet cerebrovaskulare, lloje

të ndryshme të hepatitit, mosfunksionimit kronik të veshkave si dhe për të stimuluar

qarkullimin e gjakut (Jiang et al., 2005; Li et al., 2008).

Lloje të ndryshme të sherbelës turke janë përdorur si kura për stomakun, por edhe si

diuretike, antiseptike, hemostatike, spasmolitike, gjithashtu edhe si kura kundër

infeksioneve të gojës, përfshirë edhe ftohjet (Topcu et al., 2008). Sherbela greke (S.

fruticosa Miller) është e njohur për përdorimin si erëz ose si përbërës i mjekimeve

popullore kundër dhimbjeve të dhëmbit dhe të zorrëve (Karousou et al., 2000).

Efektet pozitive të përdorimit të sherbelës njihen edhe në Afrikën e Jugut, ku përdoret

për trajtimin e ftohjeve, kollës, dhimbjeve të barkut, diarresë, disepsisë dhe

infeksioneve bakteriale (Kamatou et al., 2008).

Ҫaji i sherbelës ose tretësira e sherbelës është një agjent i vlefshëm në rastet e

gjëndjes së pavetëdijshme dhe temperaturave të larta si dhe në sëmundjet nervore. Ai

është gjerësisht i njohur si ilaç, që jepet në doza të vogla dhe të përsëritura. Përdoret

shumë si tonik stimulues për dobësitë e stomakut, sistemit nervor si dhe

mosfunksionimit të duhur të aparatit tretës në përgjithësi. Ai është konsideruar si një

ilaç i dobishëm në ethet e tifos dhe për disa sëmundje të mëlçisë, probleme të

veshkave, hemoragji të mushkërive ose të stomakut, për ftohjet në kokë, si dhe

dhimbjet e fytit, bajameve, fruthit, për dhimbjet në nyje, letargji dhe paralizë.

Ajo është përdorur për të kontrolluar djersitjet e tepruara në rastet e tuberkulozit të

mushkërive. Një filxhan tretësirë e fortë është e mirë për lehtësimin e dhimbjeve

nervore.Baricevic and Bartol (2000) e kanë vlerësuar S. officinalis sinjë bimë të

rëndësishme mjekësore dhe aromatike, e cila shfaq aftësi biologjike antioksidante,

antimikrobiale dhe antifungale, si dhe mjekësore (antiseptike, antispazmoike dhe

antihidrotike).

Në Gjermani, çaji i sherbelës është përdorur në trajtimin e inflamacioneve. Ekstraktet,

tretësirat dhe vajrat esenciale të sherbelës janë përdorur në ilaçe të përgatitura për gojë

dhe fyt si dhe për lëngjet gastrointestinale. Ato mund të jepen në formë të lëngët ose

në doza të ngurta (Leung dhe Foster, 1996; Wichtl 2004). Sherbela është përdorur në

KONSIDERATA TEORIKE

8

mënyrë efektive për kurimin e infeksioneve të grykës, infeksioneve dentare, mishrave

të infektuara dhe ulçerës së gojës.

Acidet fenolike të sherbelës janë veçanërisht të fuqishëm kundër Staphylococcus

aureus.In vitro, vaji i sherbelës ka treguar të jetë efektiv kundër të dy llojeve të

Escherichia coli dhe Salmonellës, dhe kërpudhave filamentoze dhe majave të tilla si

Candida albicans. Sherbela ka një përmbajtje relativisht të lartë të taninave, për këtë

arsye përdoret edhe për kurimin e diarresë te fëmijët. Sherbela ka një veprim anti-

spasmatik që redukton tensionin në muskujt e butë dhe mund të përdoret në sulmet e

astmës duke mbajtur fytyrën në avullin e ujit të nxehtë ku është zierë sherbela. Kjo

është një zgjidhje e shkëlqyer për të shmangur bllokimet e mukozës së rrugëve të

frymëmarrjes, si dhe për të kontrolluar ose parandaluar infeksionet dytësore.

Sherbela mund të përdoret për kurimin e shtrëngimit dhe simptomave të tjera të

disepsisë, dhe është gjithashtu me vlerë në trajtimin e dismenorreas. Komponenti i saj

i hidhur stimulon disa sekrecione që ndihmojnë në tretjen e ushqimit, lëvizshmërinë e

zorrëve, rrjedhjen biliare dhe funksionimin e pankreasit. Gjithashtu ka efekte

relaksuese gjë që e bën këtë bimë të përshtatshme për trajtimin e nervozizmit, ankthit

dhe marramendjeve. Mendohet se sherbela është e ngjashme me rozmarinën në

aftësinë e saj për të përmirësuar funksionin e trurit dhe kujtesës. Ndërkohë aktiviteti i

sherbelës dhe përbërësve të saj, janë studiuar në kërkim të barnave të reja për trajtimin

e sëmundjes së Alzhaimer, të cilat si duket mund të japin rezultate premtuese

(ESCOP, 1997).

1.6.2. Përdorimet e vajrave esenciale të specieve të ndryshme të gjinisë

Salvia

Vajrat esenciale të specieve të ndryshme të gjininsë Salvia kanë aktivitete biologjike

të jashtëzakonshme dhe veçori të ndryshme farmakologjike, të cilat paraqiten në

tabelën e mëposhtme (Tabela 1.4). Midis tyre përmendim aktivitetin mikrobial,

antioksidant, antikolinesterazë, rregullimin e performancës njohëse dhe gjendjes

shpirtërore, reduktimin e stresit lidhur me punën, aktivitetin antimutagjenik,

antikancerogjen, anti-inflamator, koloretik si dhe dallohen për veçoritë e tyre

toksikologjike.

Tabela 1.4. Përdorimet e vajrave esencialë të llojeve të sherbelës

Aktivitetet

farmakologjike

Gjinia Salvia Vajrat

esencialë

Referenca

Aktiviteti mikrobial

S.officinalis,

S.chloroleuca,

S.przewalskii,

S.santolinifolia,

S.hydrangea,

S. mirzayanii,

S. fruticosa,

S. tomentosa

S.recognita

S.macrochlamys

S.lavandulifolia

1, 8-cineole;

α- pinene;

β-pinene,

β-karafilen;

carvacrol;

1,8- cineoli

dhe kamfori

Bouaziz et al., 2009

Yousefzadi et al.,

2007

Sonboli et al.,2006

C. Rota et al., 2004

Pitarokili et al.,2003

Sarac et al., 2008

KONSIDERATA TEORIKE

9

Aktiviteti antioksidant

S.lanigera Poi，

S.officinalis

S.euphratica

S. fruticosa

S.eremophila

Karvakrol

dhe timol

Stagos et al., 2012

Tenore et al., 2011

Farhat G.N et al.,2001

Yumrutas O et

al.,2012

Papageorgiou et

al.,2008

Ebrahimabadi et

al.,2010

Aktiviteti

antikolinesterazë

S.lavandulaefolia

S. officinalis

S. fruticosa

1,8- cineoli dhe

α-pineni

Kennedy et al.,2011

Perry NS et al.,2000

Perry et al., 2002

Ilkay et al., 2008

Senol et al., 2011

Rregullimi i

performancës njohëse

dhe gjendjes shpirtërore

S.officinalis

S.lavandulaefolia

Kamfori;

Tujonet;

limonen

dhe acetat

bornili.

Moss et al.,2010

Tildesley et al.,2005

Kennedy et al., 2011

Reduktimi i stresit lidhur

me punën

S. sclaria Sabinen;

Kamfen dhe

miriceni

Pemberton et al.,2008

Buckle et al.,2003

Aktiviteti

antimutagjenik

S. officinalis α-/β-tujone;

cineol dhe

kamfor

B. Vukovic´-Gacˇic´ et

al., 2006

Aktiviteti

antikancerogjen

S.officinalis

S.libanotica

S.leriifolia

S.acetabulosa

Linalyl acetate;

terpineol dhe

kamfor

Loizzo et al., 2007;

2010

Itani WS et al., 2008

Aktiviteti anti-

inflamator

S. officinalis Borneol Juhás et al., 2008

Aktiviteti koleretik S. desoleana Β-pinen; p-

cimen; linalool

Peana et al., 1994

Veçoritë toksikologjike S. officinalis dhe S.

libanotica

kamforit, α, β-

tujone dhe

kamfen

Lima et al., 2004

Farhat et al., 2001

1.7. Vajrat esencialë të sherbelës

Termi “vaj esencial” u përdor për herë të parë nga Paracelsus von Hohenheim në

shekullin e 16 për të emërtuar përbërësit efektive të drogës „Quinta essential‟

(Guenther, 1950). Këto përzierje komplekse përbëheshin nga hidrokarbone

terpenoidesh, terpene të oksigjenuar dhe seskuiterpene, të cilat e kishin origjinën nga

metabolizmi sekondar i bimës dhe përftoheshin me distilim dhe ekstraktim (Chamoro

et al., 2011).

1.7.1. Variacioni i përbërësve të vajrave esenciale

Përbërësit madhorë të identifikueshëm në vajrat esencialë të sherbelës janë 40, ku ata

që gjenden zakonisht janë α- dhe β-tujoni, kamfor, 1,8-cineol, humulene, acetat

bornil, limonene, viridiflorol, karafileni, manool (Asllani, 2000; Velickovic et al.,

KONSIDERATA TEORIKE

10

2003; Grausgruber-Gröger et al., 2012; Said-Al Ahl et al., 2015; Couladis et al.,

2012, etc).

Megjithatë, raportime nga vende të ndryshme të botës tregojnë variabilitet në

përbërjen e vajrave esenciale. Kështu, sherbela nga Lituania ka vajrat esenciale të

pasura me manool (20.9%) (Bernotiene et al., 2007) me përbërës dominat 1,8 cineolin

dhe cis-tujonet.

Sherbela nga Brazili ka si përbërës kryesorë α-tujonet, kamfor, α-pinene and β-tujone

(Porte et al., 2013). Mostra të ndryshme nga Egjipti treguan prezencë të kamforit,α -

tujonit, sclareol, β-tujonit, 1,8-cineoli, γ-selinene, α-humulene, karafileni, borneol,

limoneni dhe humulenit (Said-Al Ahl et al., 2015). Sipas Couladis 2002, përbërësit

kryesorë në mostra të ndryshme të Serbisë ishin monoterpene të oksigjenuar si α-

tujoni, β-tujoni, 1.8-cineol, kamfor, borneol dhe acetat bornili.

Midis seskuiterpeneve dominonin α-humuleni, viridiflorol dhe manool. Midis 40

përbërësve të identifikuar në mostrat e Malit të Zi (Stesevic et al., 2014), ato më të

dallueshme ishin cis-tujonet, kamfor, 1,8-cineol, trans-tujonet, kamfeni, borneol,

viridiflorol, limoneni, α-pinene, and α-humuleni. Në të gjitha mostrat e analizuara në

Italinë qendrore (Menghini et al., 2012) 1,8-cineoli është prezent në nivel konstant,

ndërsa ndryshime të mëdha gjenden në përbërësit e α-pinenit dhe α-tujoni i cili mbetet

gjithmonë përbërësi kryesor.

Jug-Dujakovic´ et al, (2012), ka raportuar se midis 62 përbërësve të detektuar në

Bosnjë-Herzegovinë, tetë prej tyre (cis-tujone, kamfor, trans-tujone, 1,8-cineoli, β-

pinene, kamfeni, borneol, dhe acetat bornili) zinin 78.13-87.33% të vajrave esencialë

të popullatave individuale.

Gjithashtu është studiuar përbërja kimike e vajrave esenciale nga sherbela e

Shqipërisë dhe në to u detektuan mbi 40 përbërës, nga të cilat afërsisht 30 mund të

identifikoheshin.

Përbërësit kryesorë të identifikueshëm ishin α-tujoni, β-tujoni, kamfor dhe 1,8-cineoli

(Asllani, 2000; Kongjika et al., 2005; Bacu et al., 2005; Babani et al., 2005).

Në një raport në 2015, Cvektovikj tregoi se në Europën jug-lindore midis 80

përbërësve të detektuar tek sherbela, ata me sasi më të madhe ishin β-pineni, 1,8-

cineoli, cis-tujoni, trans-tujoni, kamfor, borneol, trans-karafileni, α-humuleni,

viridiflorol, dhe manool, të cilat përfaqësonin 42.60 deri 85.70% të përbërësve të

vajrave esencialë të analizuar.

Në ditët e sotme, ISO 9909 dhe German Drug Codex rregullojnë sasitë e përbërësve

në vajrat esencialë për qëllime tregtare. Codex rregullon sasitë e pesë përbërësve,

ndërsa ISO 9909 të 11 përbërësve. Limiti i kufirit të poshtëm të kamforit në German

Drug Codex është 3 herë më i ulët ndërsa limiti i kufirit të sipërm është 1.5 herë më i

lartë se rekomandimet e ISO 9909.

1.7.2. Faktorët që ndikojnë në variacionin e vajrave esenciale

Faza vegjetative

Sasia e monoterpeneve e prodhuar zakonisht lidhet me moshën dhe përmasën e

gjëndrës ose me densitetin e gjëndrave për sipërfaqe të indit bimor. Tek mentja,

monoterpen sinteza dhe akumulimi kontrollohen nga zhvillimi i gjëndrave të vajit

KONSIDERATA TEORIKE

11

gjatë rritjes sezonale. Sasia e monoterpeneve rritet në mënyrë të qëndrueshme kur

gjëndra rritet në numër, për shembull, kur gjëndrat kalojnë një, dy, katër dhe tetë

stadet qelizore të zhvillimit të tyre (Turner et al., 2000a). Sasia e monoterpeneve

gjithashtu rritet gjatë sezoneve. Gjithashtu nga studimet është konsistuar se numri

total i gjëndrave peltate rritet ndjeshëm gjatë fazës vegjetative, gjethet e para të

prodhuara në një sezon kanë 2000 gjëndra secila; ndërsa gjethe të përmasave të

ngjashme më të vonshme në sezon kishin deri në 17.000 gjëndra secila për çdo gjethe

(Colson et al., 1993). Si rrjedhim sasia e vajit esencial rritet me rritjen e numrit të

gjëndrave të vajit në gjethe.

Stinët

Kushtet mjedisore si temperatura, gjatësia e ditës dhe drita influencojnë përbëresit

sasiore të vajrave esenciale (Figueiredo et al., 2008). Këto kushte ndryshojnë në

mënyrë të konsiderueshme (temperatura të larta dhe zgjatja e ditës në muajt e verës,

etj) duke çuar në një model të variacionit sezonal te metabolitëve bimorë, i cili

përsëritet çdo vit.

Shumë kultura bujqësore mblidhen vetëm një herë në vit, ose në fund të zhvillimit të

tyre ose në stadin e prodhueshmërisë më të lartë. Megjithatë, kur mblidhen bimë si

sherbela, situata ndryshon, për shkak se në kushte klimatike të favorshme, mund të

përftohen disa të korrura të ndryshme. Prandaj, rekomandohen njohuritë bazë mbi

influencën sezonale në përbërësit e metabolizmit sekondar të bimës për të përcaktuar

kohën optimale për mbledhjen e saj, me një cilësi të mirë të prodhimit bimor.

Monoterpenet kryesore, cineoli, kamfor dhe α-/β-tujonet tregojnë dinamika të

theksuara gjatë ciklit vegjetativ që është konfirmuar nën kushte gjeografike të

ndryshme (Pitarevic et al., 1984; Putievsky et al., 1986; Belhattab et al., 2005; Maric

et al., 2006). Cineoli në mënyrë të qëndrueshme ulet gjatë periudhave vegjetative

(përafërsisht Maj-Qershor), kamfori arrin pikun në mes të periudhës vegjetative dhe

α-/β-tujonet rriten ndjeshëm gjatë periudhës vegjetative.

Pozicioni gjeografik/klima/pedologjia

Një drejtim i rëndësishëm në lidhje me monoterpen sintetazat është edhe studimi i

faktorëve që ndikojnë në shprehjen e këtyre enzimave. Është supozuar që shumë

faktorë të jashtëm mjedisorë dhe të brendshëm hormonalë ndikojnë në aktivitetin dhe

rendimentin e monoterpen sintetazave, enzimave përgjegjëse për hapin e parë të

reaksioneve të shndërrimit të geranildifosfatit GPP në produkte si tujonet, 1,8-cineoli,

kamfeni etj.

Faktorët mjedisore si temperatura, gjatësia e ditës, dhe drita kanë një influencë të

konsiderueshme në sasinë e kompozimeve që prodhohen nga bimët aromatike

mjekësore si lëndët volatile dhe vajrat esenciale (Figueiredo et al., 2008).

Këto kushte ndryshojnë ndjeshëm dhe në mënyrë të parashikueshme gjatë periudhave

të vegjetacionit (temperatura më të ngrohta dhe gjatësi dite më të gjatë gjatë muajve të

verës, etj), çka ndikon në proçeset metabolike të bimëve në mënyrë të përsëritur çdo

vit. Për këtë qëllim janë kryer disa studime për të kuptuar se si ndikojnë faktorët

mjedisorë në aktivitetin e disa sintetazave duke studiuar në mënyrë të drejtëpërdrejtë

produktet e tyre respektive si sabiene, α-tujon dhe β-tujon, kamfor, dhe bornilacetat.

KONSIDERATA TEORIKE

12

Hormonet bimore

Është provuar tashmë që hormonet bimore luajnë një rol të rëndësishëm në shumë

proçese fiziologjike bimore. Giberelinat rregullojnë proçese fiziologjike të ndryshme

si ndarja e qelizave, mbirja e farave dhe zgjatja e rrënjëve (MacMillan, 2001;

Rademacher, 2000).

Për shkak të efektit të rregullatorëve të rritjes si GA3 dhe daminozidet është studiuar

ndikimi i tyre në shprehjen e gjeneve që kodojnë për monoterpen-sintetazat, si dhe

ndikimi i tyre në morfologjinë e gjetheve dhe në formimin e vajrave esenciale

(Steinborn et al., 2011). Giberelinat (GAs) janë hormone të rëndësishme të bimëve

vaskulare, kërpudhave dhe baktereve, të cilat përmbajnë më shumë se 125

komponime me strukturë të ngjashme. Duke u nisur nga ndikimi i gjerë i këtyre

rregullatorëve bimorë, u studiua efekti i tyre në shprehjen e gjeneve të monoterpen-

sintetazave duke u bazuar në sasinë e produkteve finale që prodhohen kur në bimët e

marra në studim janë aplikuar rregullatorë të jashtëm si GA3 dhe bimë defiçente me

GA, të trajtuara me daminozide të cilat janë bllokues të jashtëm të GA3 .

Nga rezultatet është konkluduarse morfologjia (gjatësia, pesha e thatë, pesha e njomë,

sipërfaqja) e gjetheve dhe përmbajtja e vajrave esenciale për njësi peshe dhe njësi

sipërfaqeje, varet nga mosha e gjetheve po aq sa ndikimi i GA3 dhe inhibitorit të

GA3, daminozidës.

Ndryshimet morfologjike kanë çuar edhe në ndryshime të transkriptimit të tre

monoterpen-sintetazave. Veprimi i një sasie optimale të GA3 (sepse në sasi më të

lartë kishte efekt të kundët), ka sjellë rritje të transkriptimit të të tre monoterpen-

sintetazave, ndërsa veprimi i inhibitorit të GA3, daminozides ka sjellë ulje të niveleve

të transkriptimit të tyre. Rritja e transkripteve të monoterpen-sintetazave nga veprimi i

niveleve optimale të GA3 mund të kenë rezultuar nga dy efekte të mundshme të GA3

aktive: (i) rritje e numrit të trikomave dhe (ii) rritja e rendimentit të prodhimit të

qelizave (Steinborn et al., 2011).

1.8. Terpenet si përbërësit kryesore të vajrave esenciale

Terpenet janë një klasë komponimesh natyrale, pjesa më e madhe me origjinë bimore.

Sipas përkufizimit modern, terpenet janë hidrokarbure me origjinë bimore, me

formulë të përgjithshme (C5H8)n. Ato formojnë më tej derivate të oksigjenuara, të

hidrogjenizuara dhe dehidrogjenizuara.

1.8.1. Veçoritë e përgjithshme të terpeneve

Terpenet janë hidrokarbone organike natyrore të njohura si izoprenoide ose terpenoide

pas oksidimit ose rirregullimit të skeletit karbonik. Të gjitha terpenet e kanë

prejardhjen nga kondensimi i njësisë karbonike izopentenil difosfat (IPP) dhe izomerit

të tij dimetilalil difosfat (DMAPP). Në varësi të njësive të izopreneve të lidhura

bashkë, terpenet klasifikohen në hemiterpene (C5), monoterpene (C10), seskuiterpene

(C15), diterpene (C20), sesterpene (C25), triterpene (C30) dhe tetraterpene (C40).

Pjesa më e madhe e terpenoideve janë pa ngjyrë, lëngje aromatike më të lehta se uji

dhe të avullueshme. Disa prej tyre janë solide p.sh. kamfori. Të gjithë janë të tretshëm

në tretës organike dhe zakonisht të patretshëm në ujë. Shumica e tyre janë optikisht

aktive. Janë molekula me zinxhir të hapur ose komponime ciklike të pangopura, që

KONSIDERATA TEORIKE

13

kanë një ose më shumë lidhje dyfishe. Rrjedhimisht ato i nënshtrohen reaksioneve të

shtimit të hidrogjenit, halogjeneve, acideve etj.

Një numër i produkteve plotësuese kanë veti antiseptike. Ata i nënshtrohen

polimerizimit dhe dehidrogjenizimit. Ata i nënshtrohen lehtësisht oksigjenimit nga

agjentët oksidues dhe në dekompozimet termike, shumica e terpenoideve japin si

produkt isoprenet.

Monoterpenet njihen si përbërës të vajrave të bimëve mjekësore, që përftohen nga

gjethet, lulet dhe frutat dhe se bashku me sesquiterpenet janë përbërësit kryesorë të

vajrave esenciale. Monoterpenet dhe diterpenet biosintetizohen në plaste (kloroplaste,

kromoplaste, leukoplaste), ndërsa sekuiterpenet në citoplazmë) (Crozier et al., 2006).

Monoterpenet janë disa llojesh si:

a) Monoterpene aciklikë që derivojnë nga 2,6-dimethyloctane si nerol, linalool

etj. Roli i monoterpeneve të thjeshta evidentohet më së shumti në komponimet

ku bëjnë pjesë, si psh linalool dhe ocimen, të cilët prodhohen në rastet e

dëmtimit të bimëve nga insektet (Paré W et al.,1997).

b) Monoterpene monociklike që derivojnë nga ciklohekzanet. Një ndër më të

rëndësishmit është limoneni, nje monoterpen, i cili përdoret për prodhimin e

produkteve të tjera optikisht aktive (Schwab et al., 2013).

c) Monoterpene biciklike. Në këtë klasë bëjnë pjesë komponime si sabineni,

kamfori, tujonet, etj. Tujonet përdoren në pije dhe ushqime, ndaj në shumë

vende sasia e lejuar për përdorim është e rregulluar me ligj (Paré et al., 1997).

1.8.2. Biosinteza dhe kompartmentalizimi i terpeneve

Prej shumë vitesh, supozohej se IPP dhe DMAPP sintetizoheshin ekskluzivisht nga

mevalonati në citosol nëpërmjet të ashtuquajturës rrugëkalimi mevalonik (MVA). Në

hapin e parë të kësaj rruge, tre molekula të acetik-koenzimës (Co)A bashkoheshin për

të përftuar

3-hidroksi-3-metilglutaryl CoA (HMG-CoA), e cila më pas reduktohet nga enzima

HMG-CoA reduktazë (HMGR) për të përftuar acidin mevalonik (MVA).

Në dy hapat pasardhës, mevalonat kinaza dhe mevalonat 5-fosfat kinaza fosforilojnë

MVA për të formuar mevalonat 5-difosfatin, i cili më pas dekarboksilohet për të

përftuar IPP (Figura 1.4) (Liu et al., 2005). Fluksi i kësaj rruge rregullohet nga

aktiviteti i HMGR tek gjitarët dhe kërpudhat (Chappell et al., 1995). Studime të

ndryshme të kryera për të provuar rolin rregullator të HMGR-së tek bimët, në

përgjithësi kanë treguar rezultate të diskutueshme.

Vite më vonë për të shuar këto polemika u zbulua një rrugë e re e pavarur nga

mevalonati për sintezën e IPP tek bimët (Rodriguez-Concepcion and Boronat, 2002)

dhe bakteret (Rohmer et al., 1993) (Liu et al., 2005). (Figura 1.4)

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12223763?ordinalpos=35&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DefaultReportPanel.Pubmed_RVDocSum

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12223763?ordinalpos=35&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DefaultReportPanel.Pubmed_RVDocSum

KONSIDERATA TEORIKE

14

Figura 1.4. Biosinteza e IPP dhe DMAPP në rrugëkalimin mevalonik (majtas) dhe në atë jo-

mevalonik (djathtas)

Tek bimët e larta, ky rrugëkalim lokalizohet në plastide ku është dhe burimi kryesor

për prekursorët e hemiterpeneve, monoterpeneve, diterpeneve dhe karotenoideve.

Ndërsa prekursorët për sterolet, seskuiterpenet dhe ubikinonet e kanë prejardhjen nga

rruga mevalonike, që realizohet në citoplazmë dhe mitokondri (Lichtenthaler, 1999).

Sipas Estevez (2001) dhe Rodriguez-Concepcion (2001) DXPS është një nga hapat

kufizues në prodhimin e IPP në plaste. Në mënyrë të ngjashme, shprehja ektopike e

DXR-së tek mentja shkakton një rritje në prodhimin e monoterpeneve me 40-60%

(Mahmoud and Croteau, 2001).

Informacioni mbi rregullimin e bashkëveprimit të dy rrugëve MVA dhe DXP është i

pakët (Bouvier et al., 2005, Eisenreich et al., 2004, Rodriguez-Concepcion et al.,

2004). Megjithatë, është vërtetuar shkëmbimi i metabolitëve midis këtyre 2 rrugëve

në studime të ndryshme (Bick and Lange, 2003, Laule et al., 2003, Schuhr et al.,

2003, Dudareva et al., 2005, Hampel et al., 2005, Hemmerlin et al.,2003; Cusidó et

al., 2007).

KONSIDERATA TEORIKE

15

Figura 1.5. Përshkrim skematik i biosintezës së klasave të ndryshme të terpeneve

McCaskill (1995) dhe Laule (2003) demonstruan se ndërmjetësit e gjeneruar në

rrugën DXP kompensojnë fluksin e reduktuar nëpërmjet rrugës mevalonike

(McCaskill and Croteau, 1995; Laule et al., 2003), dhe mbishprehja e HMGR rrit

nivelin e steroleve dhe njëkohësisht të mono dhe seskuiterpeneve. Pra, monoterpenet

(ashtu si hemiterpenet, diterpenet dhe karotenoidet) nuk prodhohen detyrimisht

nëpërmjet rrugës DXP. Megjithatë, natyra e këtij shkëmbimi metabolitesh dhe

rregullimi i tij nuk është përcaktuar ende.

FPP është prekursori për seskuiterpenet (Figura 1.5) në citoplazmë. Terpenet e larta

sintetizohen nga një vazhdim i këtij zinxhiri proçesesh, ose nëpërmjet shtimit të IPP-

së në GGPP për të përftuar sesterpenet (C25) (në plaste) ose nëpërmjet kondensimit të

dy FPP-ve ose dy GGPP-ve për të përftuar triterpenet (C30) në citozol, ose për të

përftuar tetraterpenet (C40) në plaste (Liu et al., 2005).

Një gamë e gjerë terpenesh e gjetur në vajrat esenciale, terpentinat dhe rezinat e

bimëve, prodhohen nga ciklimi i GPP-së, FPP-së ose GGPP-së, dhe gjithashtu nga

KONSIDERATA TEORIKE

16

transformimi i vazhdueshëm i këtyre skeleteve primare nga një seri reaksionesh

izomerike redox dhe lidhjeje.

Shumë monoterpene rezultojnë nga prejardhja e GPP-së dhe rirregullimi i skeleteve

primare të monoterpeneve (Figura 1.6). Meqënëse monoterpenet përfaqësojnë

përbërësit kryesorë të vajrave esencialë tek Salvia officinalis, vetëm sinteza e tyre

sqarohet më në detaje si më poshtë.

Figura 1.6. Përzgjedhja e monoterpeneve të përftuar nga geranyl difosfati (GPP).

Shigjetat me ndërprerje tregojnë rrugët me mundësi ndërveprimesh të shumëfishta

(Wise et al. 1998)

1.9. Terpen-sintetazat përgjigjëse për prodhimin e terpeneve

Sherbela (Salvia officinalis) prodhon një numër të gjërë monoterpenesh ndër të cilat

vendin kryesor e zënë (1)- dhe (2)-α-pineni, (1)- dhe (2)- β-pineni, (1)- dhe (2)-

kamfeni, (1)-sabineni, (1)- dhe (2)- limoneni, mirceni, 1,8-cineoli, dhe (1)-bornil

difosfati. Për këtë arsye, kjo bimë ofron një sistem ideal për studimin e

shumëllojshmërisë së sintetazave terpenoidike, të cilat duke përdorur të njëjtin

substrat prodhojnë produkte të ndryshme, falë ndryshimeve në mekanizmat e

reaksioneve.

Në listën e enzimave më shpesh të gjendura përmendim bornil difosfat-sintetazën

(enzima që prodhon prekursorin e kamforit), 1,8-cineol-sintetazën, sabinen-sintetazën

(enzima që prodhon prekursorin e 3-izotujonit), dhe një numër pinen-sintetazash.

Studimet kanë treguar që një enzimë e vetme, pinen-sintetaza (ciklaza I) është

përgjegjëse për sintezën α-pinenit dhe kamfenit, dhe në sasi më të vogla edhe për

limonenin dhe mircenin. Po ashtu, pinen-sintetaza (ciklaza II) është provuar që

KONSIDERATA TEORIKE

17

prodhon α-pinen, β-pinen, kamfen, dhe në sasira më të vogla edhe limonen, terpinolen

dhe mircen (Gambliel et al., 1984). Së fundmi, një sintetazë e tretë nga sherbela,

ciklaza III, duket se prodhon një përzierje të α-pinenit dhe β-pinenit dhe në sasira më

të vogla mircen. Provat që këto reaksione janë katalizuar nga enzima multifunksionale

individuale, janë përftuar nga purifikimi dhe studime të inhibimit diferencues

(Wagschal et al.,1994).

Krahasimi i madhësive, arkitekturës së nënnjësive dhe shpërndarjes së produkteve të

këtyre enzimave, qartëson funksionet katalitike specifike të monoterpen-sintetazave.

Krahasimi i strukturave primare të monoterpen-sintetazave, që kanë mekanizma të

ndryshme veprimi brenda të njëjtës bimë, lejon arritjen e konkluzioneve mbi

ndërveprimet e siteve aktive dhe krijon mundësi për studime edhe më të detajuara të

lidhjeve strukturë-funksion (Wise et al., 1998)

Shprehja e sintetazave heterogjene prodhon bornil difosfat, 1,8-cineol dhe 1-sabinen

nisur nga geranil difosfati. Bornildifosfat-sintetaza prodhon a-pinen, kamfen dhe

limonen. 1,8-cineol-sintetaza prodhon 1- dhe 2-α-pinen, 1- dhe 2-β-pinen, mircen dhe

sabinen-sintetaza prodhon Ɣ-terpinen dhe terpinelol. Të tre enzimat e mësipërme

translatohen si preproteina. Analizat e sekuencave dhe veçimi sipas masës me anë të

kromatografisë, kanë treguar që bornildifosfat-sintetaza është një homodimer, ndërsa

dy enzimat e tjera janë monomerike (Wise et al., 1998).

GPP, FPP, dhe GGPP sintetizohen nga preniltransferazat, të cilat fuzionojnë DMAPP

me një numër të ndryshëm të njësive izopentenike (IPP). Reaksionet enzimatike të të

gjitha terpen-sintetazave të klasës së pare (I) përfshijnë një faze fillestare gjatë së cilës

substrati prenil-difosfat jonizohet. Klasa II, diterpen-sintetazat, si ent-copalil difosfat

(CPP) sintetaza, katalizojnë një ciklizim të substratit GGPP në CPP.

Terpen-sintetazat bifunksionale (klasa I/klasa II), si abietadien sintetaza, katalizojnë

një ciklizim fillestar të GGPP me CPP, të pasuar nga ciklizimi i CPP dhe një sërë

hapash shtesë drejt formimit të abietadienit. Diterpen-sintetazat e Klasës I i krijojnë

produktet nga CPP ose GGPP. Të gjitha produktet e terpen-sintetazave mund të jenë

objekt i transformimeve të mëtejshme sekondare (Wise et al., 1998).

Monoterpen-sintetazat janë izoluar dhe klonuar nga shumë bimë duke përfshirë këtu

menten, limonin, livandën, Arabidopsis dhe gjimnosperme si fieri (Alonso et al.,

1992; Colby et al., 1993; Wise et al., 1998; Bohlmann et al., 1999; Bohlmann et al.,

2000; Lucker et al., 2002; Dudareva et al., 2003).

Një tipar i përbashkët i monoterpen-sintetazave është dhënia e produkteve të

shumëfishta. Për shembull, limonen-sintetaza prodhon kryesisht limonen por

gjithashtu sasi të vogla të mircenit dhe α-/β-pinenit (McGarvey and Croteau, 1995).

Ky diversitet produktesh flet për origjinën e përbashkët të terpen-sintetazave bimore.

Të gjitha kanë veçori të ngjashme si masa molekulare, që varion nga 50-100kDa

(monomerike ose dimerike), kërkesa për jonin metal divalent si ko-faktor (zakonisht

Mg2+

ose Mn2+

për angjiospermet, K+, Mn

2+, Fe

2+ për gjimnospermet) dhe për pH

optimal thuajse neutral (Bohlmann et al., 1998b).

Monoterpen-sintetazat janë të tretshme, dhe gjenden në plaste në kushte in vivo

(Bohlmann et al., 1997). Analizat e sekuencave koduese të tyre në bimë të ndryshme

kanë treguar rajone të konservuara dhe karakteristika strukturore, numër të barabartë

KONSIDERATA TEORIKE

18

intronesh dhe përmasa të ngjashme të ekzoneve, si dhe pozicion të njëjtë të tyre

(Bohlmann et al., 1998b).

Wise (1998) në një studim mbi 33 monoterpen-sintetaza të përzgjedhura nga specie të

ndryshme bimore (angjiosperme dhe gjimnosperme) tregoi 4 motive të ruajtura

aminoacidesh (McGeady and Croteau, 1995, Wise et al., 1998). Motivet janë

përgjegjëse për aktivitetin enzimatik, koordinimin e kationeve divalente dhe si pasojë

përgjegjëse për lidhjen e substratit dhe jonizimin, respektivisht (Whittington et al.,

2002, Christianson, 2006). Analizat filogjenetike i kategorizojnë terpen-sintetazat

(TPS) në 6 nënfamilje gjenike (të emërtuara TPSa-TPSf). Shumë prej tyre, përfshirë

nga familja Lamiaceae, i përkasin nënfamiljes TPSb (Bohlmann et al., 1998b, Trapp

and Croteau, 2001).

Figura 1.7. Paraqitje skematike e veprimit të klasave të ndryshme të terpen-sintetazave

1.10. Sinteza e monoterpeneve nga Salvia officinalis

Ciklimi i prekursorit universal geranil difosfati për të formuar monoterpene

monociklike dhe biciklike katalizohet nga një grup enzimash të quajtura monoterpen-

sintaza ose ciklaza. Transformimi biokimik i geranil difosfatit në produkte ciklike

është studiuar duke përdorur enzima nga bimë të ndryshme, përfshirë këtu

angjiospermet (Croteau 1987) dhe gjimnospermet (Lewinsohn et al., 1992; Savage et

al., 1994, 1995) dhe është përcaktuar një mekanizëm për këto transformime (Skema

1) (Croteau et al., 1987.; Lewinsohn et al., 1992.; Savage et al., 1994.; Savage et al.

1995.; Wise and Croteau 1998 ). Edhe pse janë sqaruar tashmë një numër i

KONSIDERATA TEORIKE

19

konsiderueshëm reaksionesh ciklimi të monoterpeneve, mekanizmi molekular përmes

të cilit enzimat i kryejnë këto transformime nuk kuptohet ende mirë.

Sherbela prodhon një numër monoterpenesh, duke përfshirë α-pinen, β-pinen, kamfen,

sabinen, limonen, mircen, 1,8- cineol dhe bornil difosfatin (Skema 1) (Croteau, 1987).

Për shkak se sherbela prodhon këtë gamë të gjerë të monoterpeneve aciklike,

monociklike dhe biciklike, duke përfshirë izomerë të ndryshëm olefinash, estere

ciklike dhe estere difosfatike, kjo bimë përbën një sistem ideal për studimin e shumë

sintetazave, ku të gjitha përdorin të njëjtin substrat por prodhojnë produkte të

ndryshme nga variacione mbi një mekanizën të vetëm reaksioni (Croteau 1987; Wise

and Croteau, 1998). Këto përfshijnë bornil difosfat sintetazën (enzimën që prodhon

prekursin e kamforit (Croteau, 1979), 1,8–cineol sintetazën, sabinen-sintetazën

(enzimën që prodhon prekursorët e -3-izotujoneve (Croteau, 1992.; Wise and Croteau,

1998) dhe shumë pinen-sintetaza (Gambliel et al. 1982; Gambliel and Croteau, 1984;

Wagschal et al.,1994; Pyun et al., 1994).

Siç është tipike për ciklazat monoterpenoidike (Wise and Croteau, 1998; Wagschal et

al., 1991), shumë prej këtyre enzimave të sherbelës prodhojnë produkte të

shumëfishta nga geranil difosfati.

Ekzistojnë prova se këto reaksione katalizohen nga enzima individuale

multifunksionale, (Gambliel and Croteau 1984). Pavarësisht përpjekjeve të

konsiderueshme, pinen-sintetaza nuk është ndarë asnjëherë me kromatografi nga

bornil difosfat-sintetaza (McGeady et al., 1995), dhe as pinen-sintetaza nuk është

shkëputur asnjëherë nga 1,8-cineol-sintetaza, edhe pse konsiderata të ndryshme

stereokimike tregojnë se të dyja mund të jenë lloje të ndryshme enzimash (Croteau et

al., 1994).

Terpen-sintetazat janë një familje enzimash, që kodohen nga një klasë gjenike, te cilat

në mënyrë indirekte janë përgjegjëse për katalizën e reaksioneve komplekse

shumëfazëshe, duke prodhuar dhe gjeneruar qindra komponime me struktura të

ndryshme me rëndësi biologjike dhe komerciale (Bryan et al.,2006). Është interesant

fakti që terpen-sintetaza të gjallesave taksonomikisht të largëta (nga kërpudhat te

bimët), të gjitha kanë një rajon tri-dimensional të pandryshuar dhe krahasimi

molekular i siteve aktive të tyre, tregon që ata pasurohen me mbetje aminoacidike

relativisht inerte, që nuk ndikojnë në mënyrë të drejtëpërdrejtë në reaksionet e

ndërmjetme. Mendohet që specifiteti katalitik lidhet me konturet dhe dinamizmin e

siteve aktive (Kampranis et al., 2007).

Pavarësisht nga shkalla e lartë e ngjashmërisë dhe lidhjes së terpen-sintetazave,

studime të mëparshme tregojnë se nuk mund të deshifrohet lehtë lidhja midis

organizimit filogjenik dhe specificitetit katalitik. Duke u bazuar në identifikimin

sistematik dhe zëvendësimet mutacionale të zonave brenda dhe jashtë siteve aktive,

është bërë e mundur të raportohet një ndërkonvertim reciprok midis dy sintetazave me

prejardhje evolutive të njëjtë.

Për më tepër, është zbuluar aktivitet biosintetik gjatë ndërkonvertimit, aktivitet që

mund të ketë qenë i pranishëm tek një paraardhës i përbashkët i këtyre dy sintetazave

shumë të lidhura.

Këto rezultate sigurojnë një mënyrë të thjeshtëzuar për hartimin e karakteristikave

strukturore, që janë përgjegjëse për vetitë funksionale të këtyre sintetazave dhe

KONSIDERATA TEORIKE

20

mundësojnë një strategji për identifikimin e grupeve që çojnë në ndryshimet e

veçorive biosintetike të terpeneve me lidhje filogjenetike.

1.10.1. Ruajtja dhe sekretimi i monoterpeneve

Aty ku sasi të mëdha të terpenoideve hidrofobikë prodhohen dhe akumulohen,

kërkohen zakonisht struktura sekretuese të specializuara. Terpenet ndonjëherë

prodhohen dhe ruhen afër vendeve të dëmtuara ose në afërsi të ndonjë plage

(McGarvey and Croteau, 1995). Të tjera ndodhen në formën e pikëzave në

citoplazmën e qelizave epidermale dhe qelizave të mesofilit të sepaleve (Pichersky et

al., 1994; McGarvey and Croteau, 1995).

Tek Lamiaceae-t prodhimi i vajrave esenciale dhe sekretimi i tyre lokalizohet në

trikomat e specializuara gjëndrore (Fahn, 1988). Keto të fundit janë qime epidermale

të modifikuara që mbulojnë gjethet, kërcejtë dhe pjesë të luleve. Dallohen dy forma të

trikomave të granulave.

Më e vogla, trikoma granulare në formë koke konsiston në një qelizë bazike, një

kërcell të shkurtër dhe një deri në dy qeliza të kokës (Fahn, 1988). Ndërsa trikomat e

granulave peltate janë më komplekse. Ato janë të përbëra nga 8 qeliza sekretuese

(qeliza në formë disku), një kërcell dhe një qelizë bazike, që mbajnë të lidhur

trikomën në epidermë (Fahn, 1988). Sipërfaqja e jashtme e çdo gjëndre mbulohet me

kutikula.

Vaji esencial akumulohet në hapësirat nën-kutikulare, të cilat formohen nga ndarja e

kutikulave prej murit apikal të qelizave sekretuese. Sekretimi i përbërësve të vajit

esencial mendohet se arrihet me anë të difuzionit të volatilëve nëpërmjet kutikulave

ose nga thyerja e kutikulave (Fahn, 1988).

Tiparet ultrastrukturore të trikomave të mentes sugjerojnë se sinteza e monoterpeneve

realizohet në leukoplaste të specializuara brenda tyre. Qeliza sekretuese mature të

trikomave granulare peltate karakterizohen nga leukoplaste të zmadhuara të rrethuara

nga një rrjet endoplazmatik i lëmuar. Këto qeliza kanë mungesë të kloroplasteve,

granave dhe kokrrave të niseshtesë, një tipar që i bën inaktive për fotosintezë (Turner

et al., 2000a), por i ndihmon të realizojnë funksionin e tyre si vende të sintezës të

terpeneve.

Megjithatë, enzimat e përfshira në biosintezën e monoterpeneve nuk gjenden vetem

në leukoplaste. Keshtu, lokalizimi i enzimave të rrugës biosintetike të mentolit tek

mentja tregoi se sintazat e përfshira në hapat e hershme (sinteza e GPP) u lokalizuan

në leukoplaste, por më tej u gjendën në citoplazmë (pulegon reduktaza) ose në

mitokondri (izopiperitinol dehidrogjenaza) (Turner and Croteau, 2004).

Këto zbulime u shpjeguan në një model të propozuar nga Turner (2004), në të cilin

monoterpenet primare, p.sh. limoneni, sintetizohen në plaste, e më pas transportohen

përmes ER për tu modifikuar më tej (Turner et al., 2000a, Turner and Croteau, 2004).

1.10.2. Rregullimi i biosintezës të monoterpeneve

Metabolitët sekondarë, si monoterpenet, kanë një varietet funksionesh ekologjike dhe

rregullohen nga mjedisi ku gjallojnë. Lulet prodhojnë sasitë më të mëdha dhe më të

shumëllojshme të monoterpneve pak para se sythet e luleve të hapen, domethënë kur

KONSIDERATA TEORIKE

21

lulja është gati për pjalmim. Volatilët e çliruar shërbejnë si tërheqës pjalmimi (Raguso

and Pichersky, 1999).

Terpenet gjithashtu funksionojnë si pengues patogjenësh. Mbrojtja indirekte e bimëve

ndaj herbivorëve shpesh përfshin emetimin e induktuar të terpenoideve volatile.

Monoterpenet veprojnë si mbrojtës kundër stresit të temperaturave të larta (Velikova

et al., 2006) dhe emetimi i tyre rregullohet nga niveli i rrezatimit diellor në disa specie

bimore (Staudt and Seufert, 1995).

Tek mentja, e ngjashme me sherbelën, rritja e bimës dhe përftimi i vajrave ndikohen

nga fotoperioda, ditët e shkurtra rezultonin në bimë të kërrusura, me gjethe të vogla

dhe shumë stolone, ndërsa ditët e gjata, densiteti i lartë i fluksit të fotoneve dhe

temperatura e lartë e natës favorizonin drejtimin e bimës, gjethe dhe lule të mëdha dhe

përftim të lartë të vajrave esenciale. Intensiteti i dritës, zgjatja e ditës dhe temperatura

e ambientit gjithashtu ndikonin përbërësit e vajrave esencialë. Ditët e gjata, fluksi i

lartë i fotoneve dhe netët e freskëta favorizojnë akumulimin e më shumë

monoterpeneve të oksiduara si 1,8-cineoli dhe menthoni (Clark and Menary, 1980).

1.10.3. Ndikimi i fazës vegjetative në prodhimin e monoterpeneve

Profili i monoterpeneve të një bime ndryshon gjatë stadeve të ndryshme të zhvillimit

bimor. Dudareva (2003) tregoi se emetimi i β-ocimenit dhe mircenit nga lulet e

Antirrhinum kontrollohej nga gjëndja e zhvillimit: emetimi i monoterpeneve ishte

pothuajse i pakapshëm në lulet e pahapura në ditën e parë, ndërsa rritej ndjeshëm në

ditën e dytë, dhe arrinte kulmin 5-7 ditë pas lulëzimit.

Tek mentja, sasia e monoterpeneve lidhej me stadet e zhvillimit të gjetheve. Ajo ishte

shumë e ulët në gjethet e sapodala, por rritej ndjeshëm pasi gjethja zgjerohej. Kulmi i

biosintezës të monoterpeneve arrinte midis 12-24 ditë pas hapjes të gjethes, dhe në

mënyrë shumë të shpejtë binte kur gjethja arrinte hapjen e plotë (Turner et al., 2000).

Duke konsideruar rëndësinë farmaceutike të çdo përbërësi të vajrave esenciale, shumë

studime konsideronin vlerësimin e variacionit të tyre përgjatë periudhave fenologjike.

Koha më e mirë për marrjen e materialit është periudha fillestare e lulëzimit, nëse

objektivi është përftimi i lartë i α-tujonit dhe gjatë lulëzimit të plotë nëse objektivi

është një nivel i lartë i çdo përbërësi të vajrave esenciale sipas (Arraiza 2002 ).

Studime të tjera konsiderojnë influencën sezonale në formimin e monoterpeneve

kryesore dhe konkludonin se të gjitha monoterpen sintezat influencoheshin nga

kultivarët dhe stina (Grausgruber-Gröger et al., 2012).

1.10.4. Kontrolli i prodhimit të monoterpeneve bazuar në parimin e

transkriptimit

Monoterpenet dhe derivatet e tyre duhet të jenë të disponueshme në çdo kohë, kushte

mjedisore dhe stade zhvillimi, dhe të përmirësojnë mbijetesën e bimës. Ndaj

biosinteza e monoterpeneve dhe emetimi i tyre duhet të jetë gjithmonë sipas

kërkesave të bimës.

Nivelet e monoterpeneve mendohet se mund të kontrollohen bazuar në principin e

transkriptimit (Dudareva et al., 1996; McConkey et al., 2000; Mahmoud and Croteau,

2003; Mahmoud et al., 2004; Xie et al., 2008; Lane et al., 2010; Schmiderer et al.,

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Grausgruber-Gr%C3%B6ger%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22196947

KONSIDERATA TEORIKE

22

2010). Megjithatë, jo të gjitha monoterpenet kontrollohen në këtë nivel (Xie et al.,

2008; Schmiderer et al., 2010).

Në këtë studim u vrojtua variacioni sezonal në shprehjen e klasës së gjeneve që

kodojnë për enzimat përgjegjëse për hapin e parë të formimit të monoterpeneve te

sherbela. Shprehja e gjeneve u mat me numrin absolut të kopjeve të transkripteve, pra

të mARN.

Monoterpenet në këto bimë prodhohen dhe akumulohen në trikomat epidermale, ku

sasia më e lartë e akumulimit të monoterpeneve është në gjendrat e indeve të gjetheve

të njoma. Për këtë qëllim, analizat e studimeve zakonisht synojnë përdorimin e

gjetheve të reja për eksperiment, duke qenë se shprehja e gjeneve të monoterpen

sintetazave dhe si rrjedhojë fomimi i tyre është maksimal.

1.11. Gjenet koduese të monoterpen-sintetazave në bimë

S.officinalis prodhon një varietet strukturor të monoterpeneve, ndaj kjo specie është

përdorur gjerësisht për studime në enzimologji, stereokimi dhe reaksione të

mekanizmit të ciklimit të monoterpeneve (Croteau, 1987; Wise and Croteau,1998).

Wise (1998) përshkroi i pari klonimin bazuar në homologji, sekuencimin dhe

shprehjen heterologe të tre monoterpen-sintazave nga gjene të ADN-së të sherbelës,

enzimat rekombinante të të cilave prodhojnë tre tipe monoterpenesh ciklike, sabinenin

(olefine biciklike), 1,8-cineolin (eter biciklik) dhe bornil difosfatin (ester biciklik

difosfatik), respektivisht (Skema 1).

Analizat strukturore të monoterpen-sintazave dhe studime më të detajuara të

mekanizmave të ciklizimit kërkojnë izolimin e cADN-së që kodon këto enzima.

Purifikimi i proteinave nga sherbela, si baza për izolimin e cADN-së, ka pasur pak

sukses (McGeady et al., 1995) për shkak të numrit të sintetazave prezente dhe

ngjashmërisë së tyre në veçori fizike (Alonso et al. 1993).

Si një alternativë e mundshme e klonimit të bazuar në proteina (terpen-sintetaza), u

përdor një strategji e bazuar në PCR (Steel et al., 1995), që u zhvillua nga krahasimi i

sekuencave të cADN që kodonin për një monoterpen sintetazë (Colby et al., 1993),

një seskuiterpen sintetazë (Wise et al., 1998) dhe një diterpen sintetazë (Wise et al.,

1998) të specieve angjiosperme me distanca filogjenetike. U identifikuan tre rajone të

sekuencave të dobishme për hartimin e primerave të PCR-së. Dy nga këto primera

amplifikuan një fragment 600 çb duke përdorur cADN-në e gjetheve të sherbelës si

templat.

Klonimi dhe sekuencimi treguan se produkti i amplifikuar korrespondonte me dy

grupe sekuencash, që tregonin të dyja ngjashmëri me sekuencat e kloneve të terpen-

sintazave, por vetëm një prej tyre hibridizonte një target 2kbp me analizën Northern

blot të mARN-së të sherbelës. Ky prob efikas u përdor për të ngritur librarinë e

cADN-së të gjetheve të sherbelës. Ato u shprehën në terren XL1-Blue me qeliza

E.coli dhe ekstraktet e përftuara u analizuan për aktivitetin funksional të monoterpene

sintazave duke monitoruar konvertimin e [1-3H] geranil difosfatit në monoterpene

oleina, monoterpene të oksigjenuara dhe estere monoterpenildifosfatike.

Një numër publikimesh në vazhdim provuan sukses në izolimin e gjeneve koduese të

MTP në bimë të ndryshme. Kështu, për të karakterizuar gjenet koduese të

monoterpen-sintetazave tek sherbela Mitchel (1998) hartoi një strategji të bazuar në

KONSIDERATA TEORIKE

23

PCR për të izoluar gjenet përgjegjëse. U vu re se cADN-ja kodonte për disa enzima

njëherësh.

Kur ky fragment shprehej tek Eschericia coli, prodhonte një grup enzimash si bornil

difosfati përgjegjës për sintezën e 1,8-kubikinonit dhe sabinenit, α-pienenit, kamfenit

dhe limonenit; Ndërsa 1,8-cineol-sintetaza prodhonte sasi të njëjta të (+) dhe (-)

αpinenit, (+) dhe (-)β pinenit, mikrenit dhe sabinenit; Sabinen-sintetaza prodhonte sasi

të barabarta të γ-terpenit dhe terpinolenit. Të tre këto enzima kodohen nga e njëjta

sekuencë cADN-je e inxhinieruar në E. coli, por dikur e pranishme në bimë.

Bohlmann (1988) përdori primera të dizenjuar bazuar mbi rajone koduese të

monoterpen sintetazave tek bredhi (Abies grandis). Amplikoni prej 300çb u përdor si

prob hibridizues, i cili çoi në 4 fragmente të ndryshme cADN-je nga qelizat e bredhit.

Libraria e cADN-së, e krijuar në këtë mënyrë, kodonte për katër monoterpen-sintetaza

të ndryshme. Shprehja në Escheria coli e ndjekur nga analiza enzimatike në prani të

geranil difosfatit (C10), farnesil difosfatit (C15), dhe geranilgeranildifosfatit (C20)

dhe rezultatet e GC dhe MS, konfirmuan se këto sekuenca kodojnë për katër

monoterpen sintetaza të reja, (-)-kamphen sintetazën, (-) beta- felandren sintetazën,

terpinolen-sintetazën dhe një enzimë, e cila prodhon (-)-limonenin dhe (-)-alpha-

pinenin.

Analizat e sekuencave aminoacidike treguan se këto enzima, të cilat përmbajnë 618

deri në 637 aminoacide (71-73 kDa) dhe translatohen si pre-proteina, përmbajnë një

aminoacid terminal plastidial (plastid targeting sequence 50-60 U). Largimi i një

fragmenti të shkurtër nga cADN-ja u vu re se lejonte shprehjen e formave

“pseudomature”. Nga krahasimi i sekuencave u vu re se këto monoterpen-sintetaza të

reja, tek bredhi janë anëtare të subfamiljes Tps-d dhe ngjajnë me seskuiterpen

sintetazën (C15) dhe diterpen sintetazën (C20) e konifereve.

Në vitin 2011, Falara në studimin e saj për Solanum lycopersicum vërtetoi se gjenoma

e domates ka 44 gjene përgjegjesë për terpen sintetazat (TPS), nga të cilat 29 janë

funksionalë. Nga këto 26 shprehen në të paktën disa organe ose inde të bimës.

Gjenet koduese për MTP veçohen nga ato të terpenoideve të tjera dhe ndahen në tre

klasa: TPS-b, TPS-g dhe TPS-e/f. Soja është një tjetër bimë e pasur me MTP. Man

Zhang (2013) raportoi identifikimin e një gjeni të ri (GmNES) kloroplastik nga farat e

sojës, i cili kodon për nerol-sintetazën.

Izolimi i monoterpen-sintetazave (MTP) si klasë e terpen-ciklazave është studiuar nga

autorë të ndryshëm. E para monoterpen-sintetazë e prodhuar in vitro ka qenë limonen-

sintetaza tek Mentha spicata, e klonuar dhe sekuencuar në nivel gjenik nga Savage,

(1993). Më pas (Savage, 1994) studioi Pinus contorta për identifikimin e enzimës dhe

përbërjen e aminoacideve. Një ekstrakt “cell free” nga ksilema e Pinus contorta u

evidentua sekatalizonte shndërrimin e geranil pirofosfatit në një monoterpen alkalin (i

pranishëm në oleoresinën e pishës).

Më pas, u kuptua se enzima përgjegjëse vepronte në mënyrë të ngjashme me

terpenoid-ciklazat e bredhit (Abies grandis) dhe të bimëve të larta. Megjithatë,

antitrupat specifikë për limonen-sintetazën e angiospermëve, nuk dedektuan praninë e

limonen-sintetazës në këtë ekstrakt, as tek pisha edhe as tek bredhi. Mendohet se

monoterpen-sintetazat e izoluara nga koniferet mund të kenë renditje aminoacidesh të

ndryshme edhe në sitet aktive, krahasuar me ato të angiospermëve.

KONSIDERATA TEORIKE

24

Një evolucion të mirëfilltë solli analizimi në 1999, i monoterpeneve tek Quercus ilex

L. dhe bimët transgjenike të Betula pendula Roth, nga Bohlmann. Izopreni (C5) është

elementi më i emetuar nga bimët, i pasuar nga monoterpenet (C10). Disa specie

bimore i ruajnë monoterpenet në struktura të specializuara (koniferet, Lamiaceae), të

tjera si p.sh lisi (Quercus ilex L.) nuk kanë struktura për ruajtje. Bohlmann (1999)

izoloi dhe karakterizoi monoterpen sintetaza nga Quercus ilex L. 24 cADN u

analizuan me RFLP dhe u klasifikuan në 5 grupe bazuar në hartën restriktive.

Dy prej kloneve të izoluara u shprehën tek E. coli nga ku u vu re se njëri kodonte për

multiprodukt të panjohur të kategorisë së monoterpen-sintetazave, i cili katalizonte

formimin e α-pinenit (41.2 %), sabinenit (34.3 %) dhe β-pinenit (24.5 %)); ndërsa

kloni i dytë i emërtuar QiPINS përbënte një sekuencë të plotë koduese, e cila është

paraqitur në EMBL me kodin AM283099. Bazuar në sekuencën e tij QiPINS u

klasifikua në subfamiljen Tps-b (Bohlmann et al., 1998). Kjo enzimë përmban rajonet

e pranishme në shumicën e monoterpen-sintetazave, të cilat janë mbetjet e argininave

dyfishe (RRX8E) në fundin N-terminal dhe të pasura me aspartat (DDXXD) në

qendrën aktive. Lucker et al., (2002) studioi monoterpen-sintetazat tek limoni (Citrus

limon), meqënëse ai përmban një numër të madh MTP të gjendura sidomos në lëvore.

Gjenet përgjegjëse për prodhimin e monoterpen- sintetazave u izoluan, sekuencuan

dhe cADN u shprehën në mënyrë funksionale tek E. coli. Produktet kryesore të

enzimave në testet me geranil difosfatin si substrat ishin limonen sintetaza, beta-pinen

sintetaza dhe gamma terpinenin sintetaza. Të katërta llojet e enzimave për prodhimin

e 10-17 monoterpeneve zakonisht të vëzhguara tek limoni, korrespondojnë me më

shumë se 90% të produkteve të pranishme (Lücker,et al., 2002).

Në 2004, Shelton studioi monoterpen-sintetazat tek Melaleuca alternifolia, një pemë

australiane e njohur për vajin e pasur me MTP. Ai krijoi një librari klonale cADN-je

dhe 500 sekuenca të shprehura (ESTs) u sekuencuan. Shprehja heterologe e gjeneve

tek E.coli dhe analiza e sekuencave dhe enzimave rekombinante nuk dha si produkt

terpinen-4-ol-it, pjesa më e madhe përbërëse e vajit të kësaj peme, ndaj u gjykua se

nisur nga natyra racemike linalooli mund të mos kishte orgjinë enzimatike.

Në vitin 2004 Shimada T. izoloi katër cADN tek mandarina (Citrus unshiu Marc), të

cilat përmbanin gjenet për monoterpen sintetazat (CitMTSE1, CitMTS3, CitMTS61,

dhe CitMTS62). Nga testet in vitro u demonstrua se ato kodonin për d-lemonen

sintetazën, gama-terpen sintetazën, ɣ- terpen sintetazën dhe β-pinen sintetazën,

përkatësisht. Shprehja e mARN e shumicës së kloneve ishte aktive në fazat e para të

zhvillimit të frutit. CitMTSE1 dhe CitMTS3 u shprehën gjithashtu edhe gjatë

periudhës së lulëzimit duke treguar se kishin një mekanizëm rregullimi të ndryshëm.

Fahnrich (2011) studioi MTP tek speciet Nicotiana, meqë ato kanë karakteristikë të

emetojnë komponentë aromatikë bimorë të të ashtuquajturës “Cineole cassette”, që

përbëhen nga 1,8- cineoli, limoneni, myrceni, α-pineni, β-pineni, sabineni dhe α-

terpineoli. U izoluan gjenettekNicotiana alatadheNicotiana langsdorfiisë bashku me

enzimat koduese, të cilat prodhonin monoterpene karakteristike.

Në familjen Lamiaceae (Labiatae) gjenden disa monoterpen-sinteza përfshirë linalool

dhe limonen sintetazën, të cilat janë klonuar dhe përcaktuar funksionalisht në disa

bimë të familjes Labiatae. Saeidnia (2014) përcaktoi praninë e linaloolit dhe limonen-

sintetazës në katër specie të familjes Labiatae përfshirë Nepeta cataria, Lavandula

angustifolia, Hyssopus officinalis dhe Salvia schlarea duke përdorur teknika të

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=L%C3%BCcker%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12084056

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Saeidnia%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24761118

KONSIDERATA TEORIKE

25

bioteknologjisë molekulare së bashku me analizat “Head space SPME-GC-MS” për të

përcaktuar aromën e këtyre specieve.

Monoterpenet si produkte të metabolizmit sekondar kanë për funksion mbrotjen e

bimës nga dëmtimet mekanike dhe insektet invazive, ndaj transkriptimi dhe

translatimi i gjeneve përgjegjës për to rritet sidomos pas dëmtimeve mekanike.

Gjithashtu, monterpen sintetazat janë rregullatorë të transkriptimit për gjene të tjerë, si

gjenet përgjegjës për sintezën e seskuiterpeneve apo diterpeneve.

Steele (1998) studioi kontrollin e transkriptimit të monoterpen sintetazave tek Abies

Grandis në nivel gjenik duke përdorur probe të shënuara. Në pamje të parë, dukej se

sinteza e të gjitha klasave të sintetazave ndodhte njëkohësisht. Sidoqoftë, pas

studimeve të mëtejshme u vu re se monoterpen- sintetazat sintetizohen më herët, rreth

6 deri në 48 orë.

Terra (2013) përshkroi shprehjen dhe karakterizimin funksional të cADN-së koduese

për monoterpen-sintetazat tek Coffea arabica. Përbërja kimike e pijes së kafes është

mjaft komplekse duke qënë se është e përbërë nga qindra komponentë volatilë dhe jo

volatilë shumica e të cilëve formohen gjatë proçesit të pjekjes. ARN-ja u ekstraktua

nga lulet, farat dhe frutat e C. arabica (cv. Cutai Red) në katër fazat e pjekjes. U

analizua shprehja e gjeneve në inde të ndryshme dhe në faza të ndryshme të zhvillimit

dhe pas shprehjes heterologe të këtyre proteinave në E. coli, u krye analizimi i

aktivitetit enzimatik në kultura in vitro, duke inkubuar proteinat rekombinante me

geranil pirofosfat (GPP), geranilgeranil pirofosfat (GGPP) dhe farnesil pirofosfat

(FPP), prekursorë respektivisht të mono-, di- dhe seskuiterpeneve.

Një aspekt tjetër shumë i rëndësishëm është se monoterpenet bimore janë pjesë e

metabolitëve sekondarë, që ndërmjetësojnë ndërveprimet biotike dhe abiotike duke

dhënë efekt të drejtpërdrejtë në përshtatjen e bimës. Për të vërtetuar këtë dhe

hipotezën se diversiteti i monoterpeneve është i lidhur me diversitetin funksional për

shkak të dublikimit të gjeneve, u kryen studime nga Zapata (2013).

Ai rindërtoi historinë evolutive të monoterpen sintetazave (TPSb) tek speciet Protium,

si edhe ndryshimet taksonomike e kimike në gjininë e pemëve tropikale. U izoluan

kopje shumëfishe të gjeneve TPS-b nga specie Protium dhe u rikrijua filogjeneza e

kësaj familje gjenike. Studimi rezultoi në gjetjen e provave se për një specie të lashtë

dhe për një të vonët, ngjaret e dublikimit kanë çuar në formimin e 3 deri në 5 kopje të

gjeneve TPSb tanimë të pranishëm në Protium.

Në 2014, midis studimeve mbi MTP-të spikatën dy, njëri mbi Eleutherococcus

trifaliatus ngaKulheim dhe tjetri mbixhenxhefilin (Zingiber montanum (Koenig) Link

ex Dietr nga Saoealuck Bua-in. U përcaktua një fragment përgjegjës për monoterpen

sintetazën tek E. trifoliatus duke përdorur një çift primerash degjenerativë

(C. Külheim, 2014). Pas amplifikimit të fundeve të cADN-së (5‟-3‟RACE) u

përcaktua vargu i plotë i ADN-së. Gjeni i zbuluar EtLIM përmban një ORF prej 1752

bp me një masë molekulare 67.3 kDa dhe shprehet në gjethet e reja, trupin e bimës

dhe në frut. Produkti i gjenit EtLIM është identifikuar me gas-kromatografi/ mass

spektrometri (GC/MS) si limonen.

Xhenxhefili është një tjetër bimë me përmbajtje të lartë të terpenoideve në vajin e tij.

Për këtë arsye është studiuar shprehja e gjeneve për MTP dhe mënyra sesi dëmtimet

mekanike mund të influencojnë në transkriptimin e tyre. Një transkript i ZMM1 u

detektua pothuajse vetëm në gjethe dhe çlirohej mbas dëmtimit të tyre.

https://www.researchgate.net/profile/Lorenzo_Del_Terra

KONSIDERATA TEORIKE

26

Salvia officinalis, një nga bimët më të rëndësishme për industrinë farmaceutike është

e pasur në vajra esenciale të prodhuara nga gjethet e reja, që përbëhen nga

monoterpenet 1,8 kineol, α- thujoni, β-thujoni dhe kamfuri (produkte të 1,8- kinol

sintetazës, (+) - sabinen sintetazës dhe (+) – bronil difosfat sintetazës, përkatësisht)

(Mitchel et al., 1998). Studime të kryera tek Salvia officinalis nga Grausgruber-

Gröger (2012) për ndikimin sezonal në shprehjen e gjeneve koduese te monoterpen-

sintetazave tregojnë se prania dhe sasia vareshin nga kultivari dhe koha e vlerësimit.

Në nivel transkriptimi terpen-sintetazat tregonin një maksimum në mes të periudhës

vegjetative dhe më pas rënie;

Studimi i biosintezës dhe emetimit të monoterpeneve nga stimulimi prej të ushqyerit

të herbivorëve, ishte një tjetër drejtim i rëndësishëm studimor për njohjen e faktorëve,

që ndikojnë në sintezën e monoterpeneve. Eksperimentet e kryera në kushte të

kontrolluara në laborator, në sera dhe në fushë, për të testuar se si metil jasmonati

(MeJA) ose dëmtimet do të ndikonin në shprehjen e gjeneve koduese të MTPS dhe

përqëndrimin dhe emetimin e MTP, treguan se MeJA luan rolin e represorit tek

Quercus ilex L.

Meqënëse bredhi përbën një sistem model për studimin e dëmtimeve të induktuara tek

koniferët, si për shembull përgjigjen ndaj sulmit të insekteve, kjo specie vijoi të

studiohej nga një numër kërkuesish ndër vite. Oleorezina, e cila është një përzierje

terpenesh (85% monoterpene, 15% seskuiterpene) dhe rosine (diterpen dhe resinë), që

çlirohet gjatë dëmtimeve është toksike për insektet invaduese dhe në këtë mënyrë

shmang efektin e tyre patogjenik. Përpjekje të ndryshme janë bërë për të rritur

prodhimin terpenoidik përmes inxhinierimit të metabolitëve (Cheng et al., 2007).

Studime të tilla datojnë që në 1998 (Bohlmann) kur Bentula pendula Roth një

emetues i dobët i monoterpeneve u tranformua me një fragment kodues (QiMYRS) të

mikren sintetazës i marrë nga Quercus ilex L. Linjat transgjenike u rigjeneruan dhe u

testuan në nivel ADN-je dhe ARN-je. Mungesa e transkriptimit të QiMYRS u

vëzhgua në linjat transgjenike, ndërkohë që transkriptimi i gjenit nptII sillte

inaktivizimin e transgjenit.

Dy ishin arsyet e supozuara të këtij inaktivizimi, njëra mundësia e metilimit të

promotorit 35S dhe tjetra e lidhur me rajonin N-terminal. Kur transgjenikët u testuan

me mass spectrometry (PTR-MS) u vu re se nuk shfaqnin emetim monoterpenesh.

Fenomeni i heshtjes së gjeneve tek transgjenikët, i njohur si PTGS ose RNAi është i

njohur, dhe i raportuar në mjaft publikime që spjegojnë mekanizma të mundshëm të

heshtjes bazuar në aktivizimin e sistemit enzimatik që përdor siARN. Për këtë arsye,

suksesi në prodhimin e transgjenikëve për metabolitë të kategorisë së TPS mbetet një

sfidë e rëndësishme e bioteknologjisë së bimëve.

1.12. Klonimi i fragmenteve të ADN-Parimi

Çdo procedurë për klonimin e ADN ka katër faza kryesore:

Përcaktimin e një metodë për krijimin e fragmenteve të ADN

Reaksionet që bashkojnë ADN-në e huaj me vektorin

Metodën e futjes së rekombinantit artificial në një qelizë mbartëse ku mund të

replikohet

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0176161711004585


KONSIDERATA TEORIKE

27

Metodën për selektimin e qelizave marrëse që e kanë pranuar rekombinantin

(Figura 1.8).

1.12.1. Libraritë gjenomike dhe Libraritë e c-ADN-ve

Për të kuptuar ekzaktësisht sesi klonimi mund të ofrojë një mostër të pastër të një

gjeni, mbani parasysh se fragmenti i ADN-së që do të klonohet është pjesë e një

përzierjeje të shumë fragmenteve të ndryshme, secili mbartës i një gjeni të vetëm ose

pjese të një gjeni.

Figura 1.8. Protokoll përgjithësues për klonimin e gjeneve dhe krijimin e librarive

gjenomike (sipas T.A.Brown, 2010 )

Kjo përzierje në fakt mund të përfaqësojë gjithë përmbajtjen e një gjenome të një

organizmi, njeriut për shembull. Çdonjëri nga këto fragmente futet në një molekulë

vektoriale më vete për të prodhuar një familje molekulash të ADN-së rekombinante,

njëra nga të cilat përmban gjenin me interes. Zakonisht vetëm një molekulë

rekombinante ADN-je transportohet në një qelizë strehuese të caktuar, kështu që

ndonëse grupi përfundimtar i kloneve mund të përmbajë shumë molekula

rekombinante të ndryshme, çdo klon individual përmban kopje të shumëfishta të të

njëjtës molekulë.

Fragmenti gjenik tashmë mund të veçohet nga të tjerët dhe karakteristikat e tij

specifike mund të studiohen në detaje. Në praktikë, çelësi i suksesit apo dështimit në

një eksperiment për klonimin e gjeneve, është aftësia për të identifikuar gjenin me

interes ndërmjet shumë gjeneve të tjera.

Megjithatë, për të siguruar përftimin e gjenit të duhur me anë të klonimit, mund të

përdoren një numër strategjish. Disa prej tyre përmbajnë modifikime të procedurës

bazë të klonimit, kështu që vetëm qelizat që përmbajnë molekulën e dëshiruar

rekombinante mund të ndahen, dhe kloni me interes për ne seleksionohet

automatikisht.

KONSIDERATA TEORIKE

28

Megjithatë, për të siguruar përftimin e gjenit të duhur me anë të klonimit, mund të

përdoren një numër strategjish (Figura 1.9).

Figura 1.9. Skemë e përgjithshme mbi metodat e klonimit të ADN gjenomike (A.Bacu, 2012)

Disa prej tyre përmbajnë modifikime të procedurës bazë të klonimit, kështu që vetëm

qelizat që përmbajnë molekulën e dëshiruar rekombinante mund të ndahen, dhe kloni

me interes për ne seleksionohet automatikisht. Metoda të tjera përfshijnë metoda që

mundësojnë identifikimin e klonit të dëshiruar nga një përzierje klonesh të ndryshme.

Pas izolimit të klonit, praktikisht nuk ka më kufizim të informacionit që mund të

merret mbi strukturën dhe shprehjen e tij. Posedimi i materialit të klonuar ka nxitur

zhvillimin e metodave analitike të studimit të gjeneve, të pasuruara nga teknika të reja

në vazhdimësi.

1.12.2. Izolimi i gjeneve me anë të PCR

Reaksioni i shumëfishimit zinxhir mund të përdoret për të përftuar një mostër të

pastër të një fragmenti gjenik. Kjo, pasi rajoni që kopjohet gjatë PCR është segmenti

kufijtë e të cilit janë shënuar nga pozicionet e lidhjes së dy primerave

oligonukleotidikë. Nëse primerat lidhen në të dy skajet e gjenit me interes, mund të

sintetizohen shumë kopje të atij gjeni.

KONSIDERATA TEORIKE

29

Rezultati do jetë i njëjtë me atë të eksperimentit të klonimit të gjeneve, megjithëse

problemi i seleksionimit nuk ekziston pasi gjeni i dëshiruar seleksionohet

automatikisht si rezultat i pozicioneve në të cilat lidhen primerat.

1.13. Përdorimi i cpADN-së për të vlerësuar diversitetin gjenetik në popullata të

sherbelës

1.13.1. Veçori të gjenomës kloroplastike

Gjenoma e kloroplasteve (cpADN) trashëgohet nga nëna në shumicën e specieve

angiospeme dhe nga babai në shumicën e gjimnospermëve. Gjendet me shumicë në

gjethe dhe është e mundur të izolohet. Sekuenca e plotë gjenike kloroplastike njihet

vetëm tek disa specie dhe duket se është shumë e ruajtur për sa i përket përmasave,

strukturës, përmbajtjes së gjeneve dhe renditjes së tyre. Egzistojnë primera që mund të

përdoren për studimin e biodiversitetit në të gjithë nivelet taksonomike (Demesure et

al. 1995;

Sekuencat e cpADN-ve dihet se zhvendosen me raste në bërthamë (Baldauf and

Palmer, 1990; Baldauf et al.,1990; Gantt et al., 1991), dhe në fakt egziston një

mbështetje indirekte e konsiderueshme mbi mundësinë e shkëmbimeve ndërmjet

gjenomave të mtADN-së, cpADN-së, dhe nADN-së (Nugent and Palmer, 1991).

Molekula varion në përmasa nga rreth 120 në 217 kb në bimët tokësore fotosintetike,

kryesisht për shkak të tolerancës së rishfaqjes të një rajoni përsëritës, që përfshin

gjenet për nënnjësitë e rARN-së (Zurawski and Clegg, 1987).

Shpejtësia e evoluimit të cpADN-ve përgjithësisht shfaqet e ulët si në terma të

sekuencave nukleotidike primare dhe në terma të rirregullimit gjenik ”gene

rearrangement” (Curtis and Clegg, 1984; Palmer,1990; Ritland and Clegg,1987). Për

shkak të përmasave të mëdha të ADN-së kloroplastike dhe evoluimit të saj të

ngadaltë, shumica e trajtimeve sistematike kanë përfshirë përcaktime të siteve

restriktive ose sekuencave për gjene të veçanta, ose kanë monitoruar shpërndarjet

taksonomike të karakteristikave strukturale unike të cpADN në bimët e taksoneve të

larta (Downie and Palmer, 1992; Walker, 2004; Ibrahim 2012).

Sidoqoftë, egzistojnë edhe disa studime që japin variacione intraspecifike të

pashpjeguara të cpADN-ve (D.E.Soltis et al., 1992).

1.13.2. Përdorimi i cpADN-së për të vlerësuar diversitetin gjenetik në popullata

të sherbelës

Një numër studimesh mbi cpADN-në bimore kanë treguar se rajonet jo-koduese të saj

shfaqin frekuencë më të lartë të mutacioneve, kështu që shumëfishimi dhe sekuencimi

i këtyre rajoneve mund të ofrojë të dhëna me vlerë për tu përdorur në studime

evolucionare dhe për identifikimin e markerëve gjenetikë intraspecifikë (Taberlet et

al., 1991; Walker, 2004; Ibrahim 2012; Li, 2013).

Fenomeni i konservimit të gjenomave organelare është studiuar për të dizenjuar

primera universalë, të përshtatshëm për të shumëfishuar rajone jo-koduese

polimorfike të cpADN-së të disa algave, briofiteve, pteridofiteve, gjimnospermeve

dhe angjiospermëve (Taberlet et al., 1991; Ibrahim et al., 2012), rajone jo-koduese të

mitokondrive dhe cpADN-të (Demesure et al., 1995), rajone koduese të cpADN-ve

KONSIDERATA TEORIKE

30

(Badenes and Parfit, 1995; Tsumura et al., 1996) si dhe gjithë gjenomën kloroplastike

(Dhingra and Folta 2005; Ibrahim et al., 2007; Rashid et al., 2012).

Analiza restriktive e fragmenteve të shumëfishuar me primera universalë është

përdorur në studime për identifikim speciesh, studime të diversitetit gjenetik dhe ato

filogjenetike (Gielly and Taberlet 1994; Badenes and Parfitt et al. 1995; Demesure et

al., 1996; Tsumura et al., 1996; Parducci and Szmidt 1999; Huang and Sun 2000;

Parani et al., 2000, 2001; Wang et al., 2000; Xu et al., 2001).

Shumëfishimi me PCR i rajoneve të cpADN-ve të veçanta dhe rajoneve të mtADN-

ve, të ndjekura nga analiza restriktive (PCR-RFLP) është përdorur gjerësisht për të

analizuar variacione në gjenomën intraspecifike të organeleve në disa specie

(Boscherini et al., 1994; Dumolin et al., 1995; Vicario et al., 1995; Demesure et

al.,1996; Parducci and Szmidt, 1999; Parani et al., 2000, 2001; Xu et al., 2001).

Shkalla e polimorfizmit mund të variojë ndjeshëm përgjatë gjenomës kloroplastike

për shkak të pranisë së ri-rregullimeve mikro dhe makro-strukturale, insertimeve

dhe/ose delecioneve, zëvendësimeve dhe translokacioneve, si edhe inversioneve të

mëdha si në rastin e Oenothera elata dhe Lotus japonicus.

Walker (2004) përdori rajonin inter-gjenik trnL-F dhe sekuencat e gjenit rbcL të

cpADN-së për të studiuar Salvian dhe llojet e përafërta. Gjithashtu Ibrahim (2012;

2006) sekuencoi një rajon 15kbp të cpADN-së të sherbelës. Rajone kloroplastike

(rbcL, matK dhe trnH-psbA) u përdorën nga Li (2013) për të përshkruar lidhjet

filogjenetike tek Lamiaceae në Kinë.

Speciet e Salvia u grupuan bazuar në origjinë (Clebsch, 2003) dhe u pa se rezultati

ishte në përputhje me studimin e Walker (2004) pavarësisht se në studim u perdorën

pjesë të ndryshme të cpADN-së. Të gjitha speciet e Salvia të përfshira në studimin e

Ibrahim (2010) dhe Walker (2004) u grupuan sipas origjinës.

Zhang (2013), në një studim që konfirmon rolin ekologjik të terpeneve dhe na

informon për inxhinierimin metabolik të tyre në bimët transgjenike, karakterizoi një

gjen të ri kodues të nerol-sintetazës të lokalizur në kloroplastet e sojës.

1.14. Analiza RFLP

Përdorimi i Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLPs) si markerë

gjenetikë u propozua fillimisht në kontekstin e gjenetikës humane dhe i takon kësaj

fushe përdorimi më i shumtë i kësaj ideje. Lidhja e RFLP-ve me lokuse të sëmundjeve

të trashëgueshme është demonstruar në një sërë rastesh dhe përdorimi i tyre si

markerë molekularë në këto kushte është gjithashtu i testuar.

RFLP është një mjet i fuqishëm dhe i besueshëm i përdorur për studime filogjenetike,

për identifikimin e gjenotipeve të veçanta brenda një popullate, për „‟mapping‟‟ e një

popullate dhe kryqëzimet. Për këtë arsye analiza RFLP është me interes të madh për

tu përdorur në programe të përmirësimit të specieve bujqësore.

Me ndikimin më të madh ndër metodat e përdorimit të eseve të ADN-së kanë qenë

hibridizimi ADN-ADN, analizat e RFLP dhe sekuencimi. Secila prej këtyre metodave

aplikohet në mënyrë të suksesshme në klasa të veçanta gjenesh, ose produktesh të

tyre.

KONSIDERATA TEORIKE

31

RFLPs janë përdorur me sukses në një sërë sistemesh gjenetike përfshirë ADN-

mitokondriale, ADN- kloroplastike, ADN- bërthamore, gjenet që kodojnë për rARN,

dhe një sërë kategorish elementesh përsëritës.

Në një laborator të gjenetikës molekulare, enzimat restriktive gjejnë aplikime të

shumta në esetë e ashtuquajtura Restriction Fragment Length Polymorphisms

(RFLPs). Gjithë RFLP-të përfshijnë prerjen e ADN-së me një ose më shumë

endonukleaza, veçimin e fragmenteve rezultuese sipas masës së tyre molekulare me

anë të elektroforezës, dhe vizualizimin e tyre. Dallimet ndërmjet individëve në këto

”profile prerjesh” mund të rezultojnë nga zëvëndësimet e bazave brenda zonave të

prerjeve, shtimeve apo prerjeve të ADN-së, ose ripërshtatjeve të sekuencave, gjatë të

cilave prodhohen ndryshime karakteristike të bandave.

Tre janë parametrat e ndryshueshëm në esetë RFLP, lloji i metodës elektroforetike të

zgjedhur, mënyra e vizualizimit të fragmenteve dhe zgjedhja e ADN-së që do të

analizohet.

Përgjithësisht, fragmentet e ADN-së në xhel denatyrohen në një solucion bazik dhe

transferohen si vargje njëfishe (me anë të kapilaritetit) në një membranë najloni ose

nitroceluloze. Membrana inkubohet me një “prob”(ADN e izoluar dhe purifikuara më

parë), në kushte të tilla që çdo varg në mëmbranë që është komplementar me vargun e

prob-it, hibridizohet me të duke dhënë duplekse radioaktive.

Kështu, probet në fakt “kapin” sekuencat komplementare dhe ato homologe ndër

mijëra ose miliona fragmente të padiktuara, që gjithashtu kanë migruar në xhel. Këto

fragmente me ngjashmëri ndaj probit, më pas janë bërë të dukshme me anë të

autoradiografisë (Southern blot). Probi në hibridizimet Southern identifikon në këtë

mënyrë ADN-në e studiuar në një drejtim specifik.

Ky prob mund të përbëjë për shembull, një fragment gjenik të gjenomit bërthamor apo

citoplazmik, një fragment jo-kodues të një sekuence ADN-je, ose të një ADN-je

mitokondriale të një individi. Nëse probi përmban ADN komplementare me gjene të

shumëfishta, Southern blot ofron fragmente nga gjithë anëtarët e familjes me të cilët

ky prob u hibridizua. Në raste të tilla, Southern blot mund të ofrojnë profile prerjesh

shumë komplekse, në të cilat pothuaj gjithë individët dallohen nga fingerprintet e tyre.

Probet mund të përgatiten me metoda fizike (psh ADN mitokondriale e izoluar me

anë të centrifugimit me bazë gradientin e CsCl), ose normalisht përmes klonimit të

gjeneve të veçanta në vektorë biologjikë (John C.Avise, 1994). Për sekuenca që

evolojnë me lehtësi, përdorimi i probeve mund të shndërrohet në metodë vlerësimi të

diversitetit ndërmjet ose brenda speciesh të afërta, ndërsa për sekuenca që evolojnë

ngadalë probet mund të ruajnë përdorimin në grumbullime taksonomike më të gjera.

Një nga versionet më të përdorura të RFLP është PCR-RFLP, gjatë të cilit produkte

specifike të shumëfishuara me PCR i nënshtrohen prerjes me emzima restriktive, për

të dalluar variacionin në përmbajtje. Pikërisht ky version është përdorur në një sërë

studimesh mbi diversitetin e gjenomave kloroplastike të referuara në nënkapitullin

1.13.2

1.14.1. Enzimat prerëse të ADN-së

Klonimi i gjeneve kërkon që molekulat e ADN-së të priten në mënyre precize dhe të

riprodhueshme. Vëzhgimi fillestar që çoi në zbulimin e endonukleazave restriktive u

KONSIDERATA TEORIKE

32

krye në vitet 50, kur u u vu re se disa baktere janë të imunizuara ndaj infeksioneve

fagale, një fenomen ky i njohur si prerja e kontrolluar nga strehuesi (host-controlled

restriction). Prerja ndodh pasi bakteret prodhojnë një enzimë që degradon ADN-në

fagale para se kjo e fundit të replikohet dhe ti nënshtrohet sintezës së grimcave të reja

fagale.

Enzimat prerëse mund të grupohen në tre klasa kryesore, që dallojnë nga mënyra e

veprimit. Tipet I dhe II janë më komplekse dhe kanë përdorim të kufizuar në

bioteknologji. Tipit të II-të i përkasin ato që i konsiderojmë enzima prerëse me

përdorim të domosdoshëm në klonimin e gjeneve. Karakteristika bazë e

endonukleazave prerëse të tipit të II-të është se çdonjëra ka një sekuencë të njohur

specifike tek ADN-ja ku pret.

Një enzimë e caktuar e pret një molekulë ADN-je në sekuencën e njohjes dhe askund

tjetër. Shumë prej këtyre enzimave njohin zona hegzanukleotidike (të përbëra nga

gjashtë nukleotide), por të tjera presin në zona me gjatësi katërshe, pesëshe, tetëshe

ose edhe më të gjata. Njihen gjithashtu rastet e enzimave me zona njohjeje

degjenerative, dmth që e presin ADN-në në një familje zonash njohjeje. Natyra e

saktë e prerjeve të krijuara nga endonukleazat restriktive është me shumë rëndësi në

hartimin e një eksperimenti për klonimin e gjeneve.

Shumica e enzimave bëjnë një prerje të të dy vargjeve të molekulës së ADN-së, duke

dhënë të ashtuquajturat funde blunt (blunt ends). Të tjera enzima presin të dy vargjet e

ADN-së por jo në të njëjtin pozicion, kështu fragmentet rezultuese të ADN-së kanë

zgjatime njëvargore të shkurtra në secilin nga fundet. Këto funde njihen si funde

ngjitëse (sticky ends), meqënese çiftimi i bazave të tyre mund të riformojë molekulën

e prerë sërish. Një veçori me rëndësi e këtyre enzimave është se endonukleaza

restriktive me sekuenca njohjeje të ndryshme mund të prodhojnë të njëjtat funde

ngjitëse.

1.15. Teknologjia e prodhimit të esencave në rrugë gjysmë industriale

Teknologjia e prodhimit të esencave kalon në disa faza duke filluar me trajtimin e

materialit bimor, përpunimin e tij dhe kromatografinë e gaztë të përbërësve të vajrave

esenciale të renditura si vijon më poshtë.

1.15.1. Trajtimi i materialit bimor para përpunimit

Pavarësisht nga teknologjia e prodhimit të esencave bimore, del e nevojshme që

materiali bimor të parapërgatitet me qëllimin që prej tij të nxirret sa më shumë esencë

me cilësi sa më të mirë dhe me sa më pak shpenzime. Për këtë qëllim, materiali bimor

veçohet, copëtohet, thërmohet (bluhet) apo edhe njomet (sipas rasteve). (Nuro et al.,

2015).

Veçimi kryhet sepse jo të gjithë organet e një bime përmbajnë esencë në sasinë dhe

cilësinë e duhur. Kështu p.sh kërcejtë e thatë të mentes nuk përmbajnë pothuajse fare

vajra eterikë.

Copëtimi përfshin proçesin e prerjes së rizomeve apo të kërcenjve të bimëve që

përmbajnë esencë edhe në kërcej, gjë që bën të mundur ekspozimin e një sipërfaqeje

sa më të gjerë të materialit bimor në proçesin e përpunimit.

KONSIDERATA TEORIKE

33

Thërmimi (bluarja).Ky proçes nuk kryhet në të gjitha rastet sepse gjethet, lulet apo

materiale të tjerë të imët, jo shumë të fortë, distilohen pa qenë nevoja të copëtohen.

Mirëpo ka ograne si p.sh farat e disa bimëve që përmbajnë esencë, të cilët duhen

thërmuar plotësisht që të thyhen sa më shumë muret ndarës të qelizave, gjë që bën të

mundur të nxirret vaji esencial. Rrënjët, kërcejtë si dhe gjithë materialet e tjera të

drunjëzuara duhen prerë në pjesë të shkurtra.

Njomja e materialit bimor para përpunimit ka për qellim zbutjen e membranave

qelizore në mënyrë që gjatë distilimit të shkëputet më me lehtësi vaji esencial. Ky

proçes kryhet p.sh. për farat e anisit, koriandrit etj. por këtu duhet treguar kujdes sepse

materiali bimor që njomet është e mira të kalojë menjëherë për distilim, në të kundërt,

për shkak të avullimit ulet në mënyrë të ndjeshme rrezja e esencës. Gjithashtu

ndodhin edhe ndryshime kimike sepse një pjesë e përbërësve të këtyre esencave kanë

pikë vlimi të ulët dhe si rrjedhim avullohen shumë shpejtë.

Ruajtja dhe magazinimi i materialit bimor para përpunimit kryhet në varësi të

kërkesave të çdo bime dhe ndikon drejtëpërdrejtë në sasinë dhe cilësinë e vajit eterik i

cili nxirret. Në përgjithësi materiali bimor para përpunimit ruhet në ambiente pa

lagështi, në temperatura të ulëta dhe pa qarkullim ajri.

Humbja e vajit eterik para distilatit. Vaji eterik (esenca) që përqëndrohet në indet

bimore, pas vjeljes deri në kohën e përpunimit, për shkak të avullimit, të oksidimit

apo të proçeseve të tjerë kimike largohet në sasi të ndryshme.

Masa e njomë e mentes si dhe gjithë materialet e tjera bimore, me përmbajtje të lartë

lagështie, nuk mund të distilohen plotësisht deri në fund ashtu në gjendje të njomë si

edhe janë. Distilimi i plotë i masës së njomë arrihet me vështirësi të mëdha edhe pas

disa orësh distilimi. Duke e distiluar një pjesë mente në gjendje të njomë (menjëherë

pas korrjes) dhe një pjesë tjetër në gjendje të vyshkur, gati të tharë, del se materiali i

njomë përmban më shumë vaj esencial por për të vazhduar deri në fund distilimin e tij

është shumë më e vështirë.Humbjet e vajit esencial janë më të mëdha gjatë periudhës

nga vjelja deri në magazinim, sesa gjatë magazinimit deri në përpunim. Ky ndryshim

shpjegohet me faktin se gjatë periudhës së parë të vyshkjes dhe tharjes, materiali

bimor përmban një sasi të madhe lagështie, e cila bën që vaji esencial të dërgohet në

sipërfaqen e qelizave mbajtëse dhe kështu ato avullojnë (Nuro et al., 2015). Ndërsa

humbjet e vajit eterik gjatë ruajtjes varen nga mënyra e ruajtjes, kohëzgjatja në

magazinë si dhe shume faktorë të tjerë. Si rregull i përgjithshëm, me pak përjashtime,

lulet, gjethet dhe materialet e tjera bimore delikate nuk durojnë të mbahen gjatë nëpër

magazina, ndërsa farat, rrënjët, rizomat dhe pjesët e drunjëzuara kanë tendencë ti

mbajnë vajrat eterikë për kohë më të gjatë. Mirëpo edhe në këto raste rol të

rëndësishëm luan mënyra e ruajtjes, sasia e lagështisë, temperatura e mjedisit ku

magazinohet materiali bimor e të tjera arsye si këto. Humbja më e madhe e vajit eterik

nga avullimi apo oksidimi ndodh në materialin bimor të thërmuar (të bluar) para

distilimit.

1.15.2. Gaz-kromatografia e Vajrave Esencialë

Kromatografia e gaztë është metoda analitike me përdorim më të gjerë nga metodat e

tjera të ndarjes. Me anë të saj bëhet ndarja e përzierjeve të ndërlikuara në fazë të gaztë

të komponentëve përbërës. Këta analitë të gaztë kalojnë në një kollonë të

përshtatshme dhe shtyhen përgjatë saj nga një eluent në fazë të gaztë. Me anën e kësaj

KONSIDERATA TEORIKE

34

teknike kryhet analiza cilësore dhe sasiore e tyre sepse komponentët përfundojnë të

ndarë nga njëri-tjetri tek një dedektor i përshtatshëm.

1.15.2.1. Parimi i ndarjeve kromatografike

Në qoftë se një përzierje substancash injektohet në kreun e një kolone kromatografike

(në një sistem të hapur apo të mbyllur) qysh në momentin e parë përbërësit e

ndryshëm shpërndahen në mënyra të ndryshme midis fazës stacionare dhe asaj të

lëvizshme (Nuro et al., 2016) Shpërndarja për secilin komponim jepet nga Ligji i

Shpërndarjes:

Ki=Cip/Cil

Ki-Koefiçienti i shpërndarjes për përbërësin i

Cip-përqëndrimi i komponimeve në fazën e palëvizshme

Cil- përqëndrimi i komponimeve në fazën e lëvizshme

Kur koefiçientët e shpërndarjes janë të ndryshëm atëherë ndryshon edhe shpejtësia e

shtegtimit të tyre. Në përqëndrime të vogla të zakonshme për kromatografinë vlerat e

kostanteve të shpërndarjes nuk varen nga përqëndrimet. Proçesi i shpëlarjes nga një

mjet eluues (zakonisht një gaz inert, një solvent apo përzierje e tyre) bën që përbërësit

me K më të madhe pra me tretshmëri të lartë në fazën e palëvizshme lëvizin ngadalë

dhe e kundërta.

1.15.2.2. Analiza gaz-kromatografike

Në kromatografinë e gaztë komponentet e mostrës ndahen nga njëri-tjetri si rrjedhojë

e shpërndarjes së tyre ndërmjet një faze të gaztë të lëvizshme dhe një faze të

palëvizshme që ndodhet në kolonë. Kur faza e palëvizshme është e ngurtë, proçeset e

shpërndarjes bazohen në ekuilibrat e ndajthithjes, kur faza e palëvizshme është një

lëng (që mbartet nga një lëndë e ngurtë inerte), proçeset e shpërndarjes bazohen në

ekuilibrat gaz-lëng dhe mbi këto ekuilibra bazohet dhe metoda e kromatografisë së

gaztë (Nuro et al., 2015).

Ndarja kromatografike bazohet në lëvizjen me shpejtësi të ndryshme në fazën

stacionare të eluuar nga faza e lëvizshme të komponimeve në varësi të koefiçienteve

të shpërndarjes. Aftësia ndarëse e sistemit gazkromatografik shprehet me lartësinë

ekuivalente të pjatës teorike dhe matematikisht jepet nga ekuacioni i Van Demterit:

H = 2λdp + [2γDm / Um] + [8K’ef2 / π

2(1+K’)2Df]Umku:

λ-parametër pa dimension ku merret parasysh çrregullsia e mbushjes së kolonës

dp-diametri mesatar i mbushësit të kollonës

Dm-koefiçienti i difuzionit molekular në fazën e gaztë

Um-shpejtësia lineare e gazit mbartës K’ = K*Fs / F1koeficienti i shpërndarjes

ef-trashësia mesatare efazës stacionare

Df-koefiçienti i difuzionit molekular në fazën stacionare.

Ky ekuacion paraqitet në formë të thjeshtuar:

H = A + B / Um + CUm

KONSIDERATA TEORIKE

35

ku:

A = 2λdp

B = 2γDm

C = [8K’ef2 / π

2(1+K’)2Df]Um

Në qoftë se A,B dhe C do të merren konstante atëhere LEPT do të varej nga shpejtësia

e gazit mbartës dhe kjo do të jetë hiperbolike siç edhe tregohet në figurën 3.1.

Në këtë diagram mund të shihet ndikimi që ushtrojnë termat A,B dhe C në lartësinë

ekuivalente të pjatës teorike:

Termi “A” lidhet me difuzionin turbulent. Sikurëse shihet ky term mbetet konstant

dhe me ndryshimin e shpejtësisë së gazit gjë që flet për një lëvizje laminare të gazeve

nëpër kolonat gazkromatografike panvarsisht nga shpejtësi të ndryshme që ai mund të

ketë. Ky term zvogëlohet me zvogëlimin e diametrit të kokërrizave. Kjo e fundit është

e kufizuar, sepse për kokërriza me diametër shumë të vogël diferenca e presioneve në

hyrje dhe në dalje të kollonës (raporti Pd/Ph) bëhet shumë i madh që nuk merret

parasysh nga Ekuacioni i Van Demterit dhe rrjedhimisht vështirësohet shumë puna në

aparat.

Termi “B”. Për shpejtësi të vogla të gazit vlerat e këtij termi janë mjaft të larta, sepse

në këto kushte difuzioni molekular është relativisht i madh kundrejt shpejtësisë

lineare të gazit. Ky term zvogëlohet me rritjen e shpejtësisë lineare të gazit. Vlera e

këtij termi varet nga lloji i gazit . Për gazet me densitet të lartë si argon dhe azot është

i vogël por zakonisht përdoret helium ose hidrogjen (Nuro et al., 2015). Ndërkaq ulja

e difuzionit molekular ndikon negativisht në proçesin e shkëmbimit të masës.

Termi “C” lidhet me shkëmbimin e masës dmth me koefiçientin e shpërndarjes si dhe

ndikohet drejpërsëderjti nga trashësia e fazës stacionare. Sa më e hollë të jetë kjo

shtresë aq më i madh bëhet koeficienti i difuzionit në fazën stacionare.

1.15.2.3. Aparatura e gaz-kromatografit

Teknika e gaz-kromatografisë është mjaft e rëndësishme dhe me zbatim mjaft të gjerë

ndër teknikat e ndarjes dhe analizën e rendeve mikrogjyrmë. Funksionimi i kësaj

teknike nuk do të ishte aspak i mundur pa aparaturën e gaz kromatografit. Njohja e

kësaj aparature është e rëndësishme sepse na lejon që të sqarojmë bazën teorike dhe

më tej manipulimet e mundshme për ndarje dhe identifikim sa më të mirë të

përzierjeve të komponimeve qoftë dhe në matrica të ndërlikuara (Nuro et al., 2016).

Aparati përbëhet nga këto pjesë kryesore:

Injektori

Kollona kapilare

Furra

Dedektori

Qarku elektronik

Temperatura në teknikën gaz kromatografike luan një rol të rëndësishëm dhe të

veçantë. Ajo duhet të jetë e kontrolluar dhe me stade të përcaktuara qartë. Kjo zgjidh

jo vetëm problemin e të qënit të komponimeve që do të analizohen në fazë të gaztë

KONSIDERATA TEORIKE

36

por edhe në koefiçientin e mbajtjes së komponimeve të ndryshme dhe për rrjedhojë në

shtegëtimin e secilit komponim në kollonë.

Pararqitje skematike e aparatit të gaz kromatografit

Figura 1.10. Aparati i Gaz-Kromatografit

Gazi

mbartës

Injektori Dedektori

Kollona kapilare

Furra

Zona me temperaturë të kontrolluar

Sistemi i të dhënave

Aparati i Gaz Kromatografit

MATERIALE DHE METODA

37

2. MATERIALE DHE METODA

2.1. Materialet

Materiali bimor i analizuar në këtë studim ishte i kategorisë gjethe të njoma (për

analizat e bazuara në acide nukleike) dhe gjethe të thata (për analizat e bazuara në

gaz-kromatografi) të sherbelës (Salvia officinalis L.) nga popullata të Shqipërisë së

veriut. Listat e popullatave dhe gjenotipeve të analizuara paraqiten në seksionet në

vazhdim (Figura 2.1).

Figura 2.1. Momente pune nga marrja e mostrave

Materialet dhe pajisjet laboratorike në dispozicion janë pjesë e Laboratorit të

Bioteknologjisë Molekulare, FSHN, UT.

2.2. Metodat e bazuara në acidet nukleike

Në këtë studim metodat e bazuara në acidet nukleike përfshijnë: ekstraktimin e ADN-

së gjenomike, ekstraktimine ARN-së totale, vlerësimin sasior dhe cilësor të tyre,

vlerësimin e diversitetit të rajonit intergjenik trn të cpADN-së bazuar në PCR-RFLP,

shumëfishimin e fragmenteve gjenike të MTPs nga gADN dhe ARN, klonimin dhe

vlerësimin e përmbajtjes së MTP-ve të vajrave esenciale me anë të GC.

2.2.1 Ekstraktimi i ADN-së gjenomike

Me synim përzgjedhjen e një protokolli të përshtatshëm për akstraktimin e ADN-së

gjenomike, u përdorën dy protokolle, sipas Doyle & Doyle, 1987 dhe GenElute TM

Plant Genomic DNA Kit (SIGMA) G2N-70. ADN gjenomike u ekstraktua nga 65

gjenotipe që u përkisnin 13 popullatave të sherbelës së Shqipërisë së veriut. (Tabela

2.1)

Protokolli Doyle & Doyle (1987)

10mg nga çdo mostër e gjetheve të freskëta homogjenizohet në azot të lëngët

deri në pluhurizim.


38

pluhuri hidhet në mikrotuba 1.5ml që përmbajnë 700ml të buferit të

ekstraktimi CTAB (20 mM EDTA, 0.1 M Tris-HCl ph 8.0, 1.4M NaCl, 2%

CTAB, dhe 0.4% β-mercaptoethanol të shtuar përpara përdorimit);

inkubohet përzierja në 650C për 45 minuta, duke u përzier lehtë me inversion

çdo 15 minuta; më pas shtohet 500ml kloroform-isoamilalkool (24:1) dhe

përzihet lehtë për 1 min.

mostrat centrifugohen për 10 min në 12.000rpm.

600 µl supernatant transferohet në tuba të pastër ku shtohet 500µl kloroform-

isoamilalkol (24:1); përsëritet kjo procedurë 2 herë;

500µl nga supernatanti transferohet në tuba të rinj që përmbajnë 700µl

isopropanol të ftohtë (-20°C); mostrat përzihen me inversion dhe

centrifugohen në 12.000 rpm për 10 min;

Pelleti i ADN-së shpëlahet me 700µl etanol 70% dhe lejohet të thahet në

temperaturë dhome.

Tretet pelleti në 50µl bufer TE ku shtohet 5µl ribonukleazë.

Tretësira inkubohet në 37°C për 1orë dhe më pas ruhet në -20

°C.

Përmbajtja e buferit të ekstraktimit jepet e detajuar në Aneksin I.

Protokolli sipas GenElute TM Plant Genomic DNA Kit (SIGMA) protocol G2N-

70

1. Pluhurizohet 100mg ind bimor në azot të lëngët.

2. Lizohet me 350µl të Solucionit Lizues (Part A) dhe 50 µl të Solucionit Lizues

(Part B).

Shtohet 13µl Solucion Precipitimi. Mbetjet bien në trajtë pelleti dhe supernatanti

transferohet në kolonën me filtër blu.

3. Shtohet 500µl Solucion përgatitës i kolonës tek kolona lidhëse.

4. Shtohet 700µl Solucion lidhës në filtrat. Transferohet 700µl përzierje në

kolonën lidhëse. Pasi përsëritet ky hap transferohet kolona në një tub të ri

kolektori.

5. Shtohet 500µl Solucion larës në kolonë. Pas centrifugimit përsëritet kjo fazë.

6. Transferohet kolona në një tub të ri kolektori. Shtohet 100µl Solucion tretës (i

ngrohur në 650C) në kolonë.

Pas procedurës të ekstraktimit e përshkruar në protokollin e Plant Genomic DNA Kit

(SIGMA) u krye një procedurë e dytë purifikimi sipas Sambrook et al., 1989.


39

Figura 2.2. Pamje nga puna për ekstraktimin e acideve nukleike dhe dokumentimi i të

dhënave

2.2.2. Vlerësimi sasior dhe cilësor i ADN-së

Vlerësimi i cilësisë dhe sasisë së ADN gjenomike u krye sipas Sambrook et al., 1989

dhe me anë të një procedure PCR standard sipas Demesure et al., 1995 me anë të kitit

Phire Plant Direct Kit F-130.

Amplifikimi i fragmentit kontroll të ADN-së sipas Demesure et al., 1995.

50ng ADN gjenomike u përdor si templat për shumëfishim me anë të PCR të një

fragmenti të pritshëm prej 300çb. Reaksioni i shumëfishimit u krye në një volum të

përgjithshëm prej 20µl, i cili përmbante 10µl bufer PCR 2X Phire Plant (me dNTPs

dhe MgCl2), 25µM Primer mix kontroll, 0.4µl Phire Hot start II ADN Polimerazë dhe

7.2 µl ddH2O.

Kushtet e ciklimit: 5 min në 98°C, e ndjekur nga 5 sekonda denatyrim në 98

°C- 5

sekonda në 62°C - 20 sekonda zgjatje në 72

°C, e përsëritur për 40 cikle dhe 1 minutë

në 72°C.

Më poshtë paraqitet harta e popullatave të Shqipërisë të veriut (Figura 2.3) nga ku u

morën mostra për izolimin e ADN-së gjenomike dhe ARN-së totale. Gjithashtu në

tabelën e mëposhtme (Tabela 2.1) paraqiten 13 popullatat e marra në studim me nga 5

gjenotipe për secilën prej tyre si dhe koordinatat respektive.

Figura 2.3. Harta e popullatave të Shqipërisë të veriut të marra në studim


40

Tabela 2.1. Popullata e sherbelës së Shqipërisë së veriut prej nga u izolua ADN gjenomike &

ARN totale

Nr

Popullatat

Gjerësi

Gjatësi

Koordinatat GPS

1-5 Krujë 41.493402 19.771796 41° 29' 36.2472'' N19° 46'

18.4656'' E

6-10 Torovica 41.892877 19.530494 41° 53' 34.3572'' N19° 31'

49.7784'' E

11-15 Shkodër (

Shirokë)

42.066447 19.428860 42° 3' 59.2092'' N19° 25'

43.896'' E

16-20 Rubik

(A dhe B)

41.766822 19.777343 41° 46' 0.5592'' N19° 46'

38.4348'' E

21-25 M.Madhe

(Grishaj)

42.281956 19.453365 42° 16' 55.0416'' N19° 27'

12.114'' E

26-30 Balldren 41.799867 19.630841 41° 47' 59.5212'' N19° 37'

51.0276'' E

31-35 Lohe 42.273489 19.536202 42° 16' 24.5604'' N19° 32'

10.3272'' E

36-40 F.Milot 41.700425 19.725456 41° 42' 1.53'' N19° 43'

31.6416'' E

41-45 Postribë 42.145131 19.592587 42° 8' 42.4716'' N19° 35'

33.3132'' E

46-50 Shëngjin 41.824211 19.577079 41° 49' 27.1596'' N19° 34'

37.4844'' E

51-55 Valbona 42.441253 19.883999 42° 26' 28.5108'' N19° 53'

2.3964'' E

56-60 Ulza 41.677475 19.864193 41° 40' 38.91'' N19° 51'

51.0948'' E

61-65 Lezhë 41.777724 19.658028 41° 46' 39.8064'' N19° 39'

28.9008'' E

2.2.3. Protokolli i ekstraktimit të ARN totale

ARN totale u ekstraktua nga të njëjtat popullata si dhe ADN gjenomike sipas

protokollit të Young et al., 2007 (Tabela 2.1).

1. Homogjenizohen në azot të lëngët 0.25 g gjethe të freskëta.

2. Transferohet homogjenati në një mikrotub ku shtohet 1.5 ml bufer ekstraktimi

dhe 0.250 ml fenol i saturuar me ujë (pH=4).

3. Centrifugohen mostrat për 15 min në 8 000 rpm.

4. Transferohet supernatanti në mikrotuba që përmbajnë 0.250 ml fenol të ftohtë

të saturuar me ujë dhe 0.250 ml klorophorm : izoamil alkool (24:1).

5. Centrifugohen 1 min në 8 000 rpm.


41

6. Transferohen supernatantet në tuba të rinj që përmbajnë 500 µl etanol 100% të

ftohtë, inkubohen për 15 min në -20°C.

7. Centrifugohen për 1 min në 8 000rpm.

8. Derdhet supernatanti dhe shtohet 0.5 µl etanol 70% i ftohtë.

9. Centrifugohet në 8 000rpm. Përsëritet hapi 8 edhe një herë.

10. Pelleti thahet në temperaturë dhome dhe tretet në 50 µl ddH2O të trajtuar me

DEPC.

*Përmbajtja e buferit të ekstraktimit jepet e detajuar në Aneksin II.

2.2.4. Matja e sasisë dhe cilësisë së ARN totale

U krye sipas protokollit standart sipas Sambrook, Fritsch, Maniatis, 1989.

Figura 2.4. Nga puna në laboratorët e Bioteknologjisë Molekulare, FSHN, UT dhe pranë

Universitetit “Ioan Cusa”, Rumani

2.2.5. Vlerësimi i diversitetit të rajonit intergjenik trn të cp-ADN të popullatave

të Salvia officinalis bazuar në PCR-RFLP

Nisur nga fakti se përbërësit monoterpenoidike të vajrave esenciale të bimëve është

provuar se sintetizohen përmes një rrugëkalimi jo-mevalonik (Eisenreich, 1997), dhe

se origjina e monoterpen-sintetazave e kompartmentalizimi i tyre ka të bëjë me

kloroplastet dhe leukoplastet e qelizave të parenkimës fotosintetizuese (Bouvier,

2005), në këtë punim fillimisht u vlerësua diversiteti i rajonit intergjenik trn të ADNsë

kloroplastike, i cili rezulton të jetë përdorur me sukses për të zbuluar diversitetin e

popullatave të Salvia officinalis.

ADN gjenomike (Tab 1) u përdor për të shumëfishuar rajonin specifik intergjenik trn

të cpADN me anë të setit të primerave trnL-trnF sipas Taberlet (1991).

Shumëfishimi me PCR i fragmenteve trn u krye në një volum total prej 25 µl që

përmbante 30 ng ADN gjenomike. Programi i ciklimit: 3 minutash në 940C, i ndjekur

nga 35 cikle për 30 sekonda në 940C, 30 sekonda në 54

0C, 1 minutë në 72

0C dhe 10

minuta zgjatje përfundimtare në 720C u realizua sipas Ibrahim et al., 2012.


42

Suksesi i çdo reaksioni PCR-je u verifikua me anë të elektroforezës në xhele agaroze

1% në bufer TBE-10X, të ngjyrosur me bromur etidiumi (0.5 µg/ml) dhe u bë i

dukshëm nën rrezatimin UV.

Seti i primerave

Sekuenca e primerave të përdorur për shumëfishimin e rajonit trn të cp-ADN paraqitet

në Tabelën 2.2.

Tabela 2.2. Sekuencat e çiftit të primerave të përdorur për amplifimin e rajonit specifik inter-

gjenik nga cp-ADN e popullatave të sherbelës

Çifti i

primerave

Sekuenca Tipi Referenca

trnL-trnF 5‟-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3‟

5‟-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3‟

cpDNA Taberlet et al., 1991

2.2.5.1. Prerja me enzima restriktive e produkteve të PCR

Pas amplifikimit, 15 µl të çdo amplikoni u prenë me dy enzima restriksioni AluI dhe

TaqI (Promega). Në një volum total të reaksionit të prerjes prej 25 µl përmbahej 2.5

µl bufer (10mM Tris-HCl (pH 7.4), 100mM sodium citrate, 0.1mM EDTA, 1mM

DTT, 0.5mg/ml BSA, 50% glycerol), 0.2 µl nga çdo enzimë (AluI; TaqI, 10U/µl) dhe

15.3 ddH2O bazuar në protokollin respektiv të enzimave të Promega.

Mostrat u inkubuan në 37°C për 15 minuta dhe më pas në 65°C për 20 minuta. Pas

inkubimeve produktet e prerjes u analizuan me anë të elektroforezës në xhel agaroze

2,5% në 10X TBE, dhe përmasat e tyre u vlerësuan përkundrejt markerit standart

1kbp. Xhelet u vizualizuan dhe fotografuan nën rrezatimin UV.

Në tabelën e mëposhtme paraqiten gjenotipet për secilën popullatë të sherbelës së

Shqipërisë së veriut të analizuara me PCR-RFLP. Tek të dy kolonat pasqyrohen

gjenotipet sipas prerjeve me enzimat AluI dhe TaqI respektivisht.

Tabela 2.3. Gjenotipet për secilën popullatë të sherbelës së Shqipërisë së veriut të analizuara

me PCR-RFLP

Nr

(sipas prerjes

me Alu1)

Gjenotipet Nr

(sipas prerjes me

Taq1)

Gjenotipet

1 Postriba 1 1 Lohe 1





6 Rubik(A) 1 6 Balldren 1

7 Rubik (A) 2 7 Balldren 2

8 Rubik (A)3 8 Balldren 3



11 F. Milot 1 11 Rubik(B) 1



43




16 Lohe 1 16 Krujë 1





21 Balldren 1 21 Krujë 8

22 Balldren 2 22 Shkodër 4

23 Balldren 3 23 Shkodër 5

24 Balldren 4 24 F.Milot 5

25 Balldren 5 25 Rubik(A) 1

26 Rubik (B) 1 26 Rubik(A) 2




30 Rubik (B) 5 30 F.Milot 1

31 Krujë 1 31 F.Milot 2

32 Krujë 2 32 F. Milot 3

33 Krujë 3 33 F. Milot 4

34 Krujë 4 34 Torovica 1

35 Krujë6 35 Torovica 2

36 Krujë 8 36 Torovica 3

37 Shkodër 4 37 Torovica 4

38 Shkodër 5 38 Torovica 5

39 Torovica 1 39 Postriba 1





Analizimi i të dhënave

Pas verifikimit të përmasave të fragmenteve të prodhuara nga prerja me enzima

restriksioni, u ndërtua një matricë binare (prezenca e bandave u shënua me 1 dhe

mungesa me 0), e cila u përdor për të ndërtuar dendrogramat e ngjashmërisë midis

gjenotipeve duke përdorur metodën UPGMA të softit NTSYS 2.1.

2.2.6. Shumëfishimi i fragmenteve gjenike të monoterpen-sintetazave nga gADN

dhe ARN totale e popullatave të Salvia officinalis

Fragmentet gjenike të MTP-ve nga ADN-ja gjenomike dhe ARN-ja totale për 13

popullatat e marra në studim u analizuan si më poshtë.


44

2.2.6.1. Amplifikimi i rajonit qëndror të gjeneve koduese të MTP-ve nga ADN

gjenomike

Primerat e përdorur për të shumëfishuar një rajon qëndror të ruajtur të gjeneve

koduese të monoterpen sintetazave ishin:

Forward Sbs350 -5‟ TTCAACAGTTGGAGTTGATTGATGA 3‟- dhe

Reverse Sbs1010 -5‟ ATTCCACAATCCTATCTCTCACAAA-3‟, të hartuar për të

shumëfishuar një amplikon ~800 bp Sekuencat e tyre janë përcaktuar pas

mbivendosjes së disa gjeneve koduese të MTP nga bimë aromatike, përcaktimit të

rajoneve intronike, dhe përzgjedhjes së rajoneve të konservuara mirë. Më pas prej

gjenit kodues të sabinen sintetazës nga Salvia officinalis është përzgjedhur një rajon

pa introne për të hartuar primerat (A.Grazhdani, 2004).

Volumi i reaksionit të shumëfishimit ishte 25 µl dhe përmbante këto përqëndrimet

finale të përbërësve: Buffer PCR1X, 0.2 mM dNTP, 100 pmol primera (forward dhe

reverse), 3 mM MgCl2 , 0.5 U Taq ADN Polimerazë dhe 20-30 ng ADN.

Kushtet e ciklimit: 3 minuta në 94°C, e ndjekur nga 0.5 minuta denatyrim në 94

°C, 1

minutë lidhje në 50°C, 30 sekonda në 72

°C e përsëritur për 35 cikle, dhe 5 minuta në

72°C.

2.2.6.2. Amplifikimi i rajonit qendror të gjeneve koduese të MTP-ve nga ARN

totale me anë të RT-PCR

Me synim kontrollin e diversitetit të fragmentit gjenik specifik të MTP nga popullatat

e ndryshme në studim, u vendos që amplikoni të shumëfishohej nga templat ADN je

gjenomike dhe ARNje totale. Për procedurën e RT-PCR me primerat specifike Sbs

350/Sbs 1010 u përdor kiti OneTaq®

RT-PCR i Invitrogen. Ky kit kombinon dy

përzierje, M-MuLV Enzyme Mix and OneTaq Hot Start 2X Master Mix me bufer

Standart për aplikimet dy-fazëshe të RT-PCR.

Reaksioni i sintezës së vargut të parë të cADN-së:

• Denatyrimi i ARN-së në 70°C për 5 min për të larguar struktura dytësore që mund të

pengojnë sintezën e cADN në gjatësinë e duhur.

• Inkubim në 42°C për një orë.

Sinteza e vargut të parë të cADN-së.

1. Përzihet mostra e ARN-së dhe d(T)23VN në dy tuba mikrocentrifuge RN-aza-

free (të paraqitura në tabelën 2.4).

Tabela 2.4. Përzierja e reaksionit të fazës së parë të RT-PCR

Përbërësit Vëllimi

ARN-ja totale 3 µl

d(T)₂₃VN(50µM) 6µl

H₂O i pastër nga nukleazat 15 µl

Vëllimi total 21 µl (7 µl për tub + 1 µl ARN)


45

2. Denatyrohet ARN për 5 min në 70⁰C. Vorteksohen mostrat me shpejtësi dhe

vendosen në akull.

3. Shtohen përbërësit e mëposhtëm në një tub që përmban 8µl

ARN/primer/solucion dNTP dhe përzihen duke pipetuar.

Reaksion Mix M-MuLV 10µl

Enzimë Mix M-MuLV 2 µl

Në tubin kontroll që rezulton negativ shtojmë:

Reaksion Mix Mix M-MuLV 30 µl

H₂O 6 µl

4. Inkubohet sasia prej 20 µl e reaksionit të sintezës së cADN-së në 42⁰C për një orë.

5. Inaktivizohen enzimat në 80⁰C për 4 min. Ҫohet sasia e reaksionit në 50µl me 30µl

H₂O. Produkti i cADN-së ruhet në -20⁰C.

Shumëfishimi i cADN me PCR

1. Përdoret 2-5 µl e produktit të cADN-së për 25 µl reaksion mix të PCR.

2. Përzihen sa më poshtë në një tub PCR-je në akull (reaksioni paraqitet tek tabela

2.5):

Tabela 2.5. Përbërja e reaksionit të RT-PCR

Përbërësit Sasia

One Taq Hot Start 2X Master Mix 37,5 µl

10 µl Forward Primer Sbs 1,5 µl

10 µl Reverse Primer Sbs 1,5 µl

cADN-ja e holluar 6 µl

H₂O i pastër nga nukleazat 28,5 µl

Sasia totale 69 µl

23 µl për tub + 2 µl cADN

Përzierja i nënshtrohet kushteve të ciklimit të paraqitura në tabelën 2.6


46

Tabela 2.6. Kushtet e ciklimit te RT-PCR

Analizimi i produkteve te RT-PCR u krye në xhel agarozë 1,2% ne TAE 1X.

2.2.7. Purifikimi nga xheli i fragmenteve të shumëfishuara me PCR me përmasat

e pritshme

Për të ekstraktuar nga xheli produktet me përmasat e pritshme rreth 800çb, u përdor

protokolli i Promega Quick Protocol të Wizard R SV gel & PCR clean-up System.

Protokolli

a) Pas elektroforezës, pritet banda nga xheli dhe vendoset në një tub

mikrocentrifuge 1.5 ml.

b) Shtohet 10 µl solucion tretës për cdo 10 mg të xhelit të prerë. Kryhet

vortex dhe inkubohet në 50-650C, deri sa xheli të tretet plotësisht (për 30

minuta).

a) Futet minikolona SV në një tub kolektor.

b) Transferohet përzierja e xhelit të tretur në minikolonë. Inkubohet në

temperaturë dhome për 1 minutë.

c) Centrifugohet në 16,000 xg (14.500 rpm) për 1 minutë.

d) Ruhet minikolona duke e vendosur ne një tub te ri kolektor.

e) Shtohet 700 µl solucion larës membranor (shtohet edhe etanol)

f) Centrifugohet në 16.000 xg (14.500 rpm) për 1 minutë. Derdhet mbetja

dhe ri-insertohet minikolona në tubin kolektor.

g) Përsëritet larja e membranës së kolonës me 500 µl solucion larës

membranor dhe centrifugohet në 16.000 xg për 5 minuta.

h) Zbrazet tubi kolektor dhe ri-centrifugohet pelleti në kolonë për 1 minutë

me kapakun e mikrocentrifugës të hapur për të lejuar avullimin e çdo

mbetje etanoli.

i) Transferohet minikolona në tub mikrocentrifuge 1.5 ml.

j) Shtohet 50 µl dd H2O në minikolonë. Inkubohet në temperaturë dhome për

1 minutë deri në 3 minuta dhe më pas centrifugohet në 16.000xg për 1

minutë.

a) ADN-ja ruhet në 40C ose -20

0C.

Denatyrimi 95⁰C 30 sek

25-40 cikle

94⁰C

66⁰C

68⁰C

15-30 sek

30 sek

1 min x kb

Zgjatja finale 68⁰C 5 min

Mbajtja 4-10⁰C ∞

30X


47

2.2.8. Klonimi i ADN-së së purifikuar nga xheli në plazmidet pTOPO 2.1 të Kitit

TA Cloning Kit (pCR 2.1 K2060-40)

Përbërësit e reaksionit të klonimit janë përshkruar në tabelën 2.7.

Tabela 2.7. Përbërësit e reaksionit të klonimit

Përbërësit Volumi

Reaksioni i lidhjes 10 µl

Ujë i bidistiluar 5 µl

10X Bufer lidhje 1 µl

Vektor PCR-je (25 ng/µl) 2 µl

Produkt i freskët PCR-je (~10 ng) 1 µl

T4 ADN ligazë 1 µl

1. Inkubohen reaksionet e lidhjes në 14°C për të paktën 4 orë.

2. Centrifugohen reaksionet e lidhjes për pak sekonda dhe vendosen në akull.

Transformimi

1. Lejohen të shkrihen shishet me qelizat One Shot në akull.

2. Piketohet 1-2µl të çdo reaksioni lidhje tek qelizat dhe përzihen lehtësisht me

pipetë për t‟u përzier më mirë.

3. Inkubohen shishet në akull për 30 minuta.

4. Vendosen në banjo uji për ekzaktësisht 30 sekonda në temperaturë 420C. Më

pas vendosen direkt në akull pa u përzier.

5. Shtohet 250 µl terren SOC në çdo shishe.

6. Përzihen shishet në një inkubator me tundje në 37°C në 225 rpm për 1 orë.

Analizimi

1. Vendosen 10µl qeliza transformante mbi një pjatë me terren LB që përmban

50 µg/ml ampicilinë dhe X-Gal.

2. Inkubohen në 37°C për 18 orë. Pjatat e petrit vendosen në +4

°C për 2-3 orë për

ndryshimin e ngjyrës.

3. Më pas u analizuan 12 nga transformantët e pangjyruar (të bardhë) të

popullatave të Krujës, Torovicës dhe Postribës për praninë e insertit me anë të

analizës restriktive.


48

2.2.9. Analizimi i transformantëve me anë të analizës restriktive

Së pari u vlerësuan përmasat e inserteve të kloneve pozitive me anë të prerjes së

plazmideve rekombiante me EcoRI.

Për këtë:

U përgatitën kultura bakteriale nga klonet pozitive

U ekstraktuan plazmidet nga këto baktere

U prenë plazmidet me enzimat prerëse EcoRI dhe Taq I.

Përgatitja e kulturave bakteriale

Nga kolonitë e bardha të librarive të popullatave të Krujës, Torovicës dhe Postribës

(nga katër për çdonjërën) u morr material dhe u mboll në kulturë LB që përmbante

100g/ml ampicilinë.

2.2.9.1. Ekstraktimi i ADN-së plazmidike nga klone të përzgjedhura të baktereve

transformante

Pas përzgjedhjes të baktereve transformonte u ekstraktua ADN-ja plazmidike me kitin

GenElute TM

Plasmid Miniprep Kit, SIGMA, protokolli i të cilit paraqitet më poshtë.

Protokolli:

Të gjitha hapat realizohen në temperaturë dhome.

1. Precipitohet 1-5ml pellet me anë të centrifugimit nga kultura me E.coli

rekombinante në 12.000xg për 1 minutë.

2. Pelleti bakterial tretet në 200 µl solucion tretjeje.

3. Lizohen qelizat duke shtuar 200 µl solucion lizimi. Menjëherë përzihen

përbërësit me inversion të lehtë (6-8 herë) deri sa përzierja bëhet e qartë dhe

viskoze.

4. Precipitohen mbetjet qelizore duke shtuar 350 µl të solucionit

lidhës/neutralizues. Me kujdes përzihen tubat me inversion 4-6 herë. Përftohet

pelleti qelizor me centrifugim në 12.000 xg 10 minuta.

5. Përgatitja e kolonës. Futet kolona lidhëse e GenElute Miniprep në një

mikrotub. Shtohet 500 µl solucion i përgatitjes të kolonës në çdo kolonë

miniprep dhe centrifugohet në 12.000 xg për 30 sekonda-1 minutë. Derdhet

përzierja e rënë nga kolona.

6. Shtimi i lizatit të pastër. Transferohet lizati i pastër i përftuar nga hapi 4 në

kolonën e përgatitur në hapin 5 dhe centrifugohet në 12.000 xg për 30

sekonda-1 minutë. Përsëri derdhet përzierja e rënë nga kolona.

7. Përpara përdorimit shtohet etanol në solucionin e përqëndruar të shpëlarjes.

Shtohet 750 µl i solucionit larës i tretur me etanol në kolonë. Centrifugohet në

12.000 g për 30 sek-1 min. Derdhet përzierja dhe centrifugohet përsëri në

shpejtësi maksimale 1-2 minuta pa asnjë solucion larës për të larguar etanolin

e tepërt.


49

8. Tretja e ADN-së. Transferohet kolona në një tub kolektor të pastër. Shtohet

100 µl solucion tretës ose ujë i bidistiluar në kolonë. Centrifugohet në 12.000

g për 1 minutë. ADN ruhet në -20°C.

2.2.9.2 Prerja e plazmideve me enzimat e restriksionit EcoRI dhe TaqI

Me synim identifikimin e përmasave të fragmenteve të klonuara në plazmide, u krye

prerja e tyre me dy enzima restriksioni EcoRI dhe TaqI.

Protokolli i prerjes u realizua sipas përcaktimeve të Kitit (Invitrogen) për EcoRI, dhe

Promega për TaqI. Në reaksionet e prerjes u përdorën:

1µl enzimë prerëse EcoRI (50U/µl), 2 µl Buffer 10X, 30ng ADN plazmidike, dhe

ddH2O, deri në volumin total prej 20 µl; Për prerjen me TaqI u përdorën 2.5 µl buffer

10X, 0.2 µl enzimë TaqI (10U/µl), 30ng ADN plazmidike dhe ddH2O deri në 25 µl.

2.3. Vlerësimi i përmbajtjes së monoterpeneve në vajrat esenciale të popullatave

të Salvia officinalis me anë të GC

Paraprakisht u izoluan vajrat esenciale nga gjethe të thara të sherbelës nga 13

popullatat e marra në studim të paraqitura në tabelën 2.1 dhe më pas u analizuan

përbërësit e tyre me analizën gaz-kromatografike.

2.3.1. Izolimi i vajrave esencialë për Salvia officinalis

Gjethet e sherbelës (50g gjethe të thara në hije) ishin subjekt i hidro-distilimit për 16

orë pa ndërprerje me aparaturën e llojit Clevenger (rekomanduar nga Pharmacophea

Europea, 2014) për izolimin e vajit esencial. Vaji esencial u grumbullua në 1 ml

toluen si solvent ekstraktimi. Ekstraktit ju largua uji duke shtuar 1 gr sulfat natriumi

anhidër (Asllani, 2004). Ai u ruajt në shishe te errëta (viale) në +40C. Vaji esencial i

gjetheve të sherbelës i tretur në toluen u analizua me anë të GC/FID.

2.3.2. Aparatura dhe analiza gaz-kromatografike

Pajisja e përdorur për të analizuar vajrat esenciale të popullatave në studim ishte e

tipit Varian 450 GC e pajisur me injektor PTV dhe detektor me jonizim në flakë

(FID). Ndarja e komponimeve të esencave të sherebelës u krye në kolonën kapilare

VF-1ms (30 m gjatësi x 0.33 mm diametër të brendshëm x 0.25 μm film).

Temperatura e injektorit dhe e detektorit u vendosën respektivisht në 280°C dhe

300°C. Mënyra e injektimit u zgjodh split (1:100). Si gaz mbartës dhe gaz ndihmës u

përdor azoti me prurje totale respektivisht 1ml/min dhe 24ml/min. Temperatura

fillestare e furrës u mbajt 50°C për 2min pastaj u rrit në 150

°C me 6

°C/min. Pas kësaj

në 280°C me 8

°C/min dhe së fundi në 300

°C me 10

°C/min. Në 300°C u mbajt për 2

minuta. U injektua për çdo mostër një vëllim prej 2μl. Për vlerësimin cilësor dhe

sasior u përdor një përzierje e n-oktanit (C8) deri tek eikosanet (C20) për të llogaritur

indeksin e Kovats-it. Rezultatet së bashku me të dhënat e literaturës u përdorën për

identifikimin e komponimeve kryesore (Adams, 1995; David et al, 2010; Konig et al,

1999). Të dhënat sasiore të komponimeve të analizuara janë dhënë në % kundrejt

totalit.


50

2.3.3. Analiza statistikore e rezultateve

Përbërësit e vajrave esenciale të popullatave të analizuara me anë të GC u përpunuan

me anë të programit statistikor PCo-A. Si rezultat u përftua grupimi i popullatave

sipas nivelit të ngjashmërisë.

REZULTATE DHE DISKUTIME

51

3. REZULTATE DHE DISKUTIME

3.1 Stabilizimi i metodikave të ekstraktimit të ADN-së gjenomike dhe ARN-së

totale

Doyle & Doyle (1987) dhe GenElute TM Plant Genomic DNA Kit (SIGMA) G2N-70

ishin dy metodat e përdorura për ekstraktimin e ADN gjenomike nga gjethe të

sherbelës. Përcaktimi i protokollit, që do të jepte sasinë më të madhe të materialit

gjenetik me një nivel minimal kontaminantësh është faza e parë e punës në biologjinë

molekulare të bazuar tek acidet nukleike. Sasia dhe cilësia e mirë e ADN-së është e

domosdoshme nëse materiali gjenetik do të përdoret në teknika si polymerase chain

reaction (PCR), Southern blotting dhe analiza të tjera gjenomike. Protokolli Doyle &

Doyle (1987) (i modifikuar) dhe metoda e bazuar në kitin GenElute TM Plant

Genomic DNA, dhanë rezultate të kënaqshme pas modifikimeve shtesë (Tabela

3.1&Figura 3.1). Kështu, Doyle &Doyle (1987) i bazuar ne CTAB, një detergjent

jonik i fortë i përdorur për të lehtësuar ndarjen e proteinave nga acidet nukleike në

materialet biologjike të ekstraktuara, u modifikua duke shtuar trajtimet me PVPP dhe

Proteinazë K (Krizman et al., 2006).

Protokolli i dytë i bazuar në GenElute TM Plant Genomic DNA Kit (SIGMA) u

modifikua duke shtuar një fazë purifikimi me fenol:kloroform:izoamilalkool.

Tabela 3.1. Rezultatet e matjeve spektrofotometrike të sasisë dhe cilësisë së ADN gjenomike

sipas Doyle & Doyle (1987) i modifikuar

Popullatat Abs260 Abs280 Abs230 260/280 260/230 Përqëndrimi

(ng/µl) Lloji

Postriba 1.432 0.741 0.81 1.93 1.79 71.6 dsADN

Rubik(A) 1.297 0.675 0.711 1.92 1.82 64.8 dsADN

Rubik(B) 1.462 0.93 1.7 1.58 0.86 73.1 dsADN

F.Milot 1.75 1.08 1.04 1.62 1.68 87.5 dsADN

Lohe 1.359 0.679 1.289 2 1.05 67.9 dsADN

Balldren 1.614 0.784 0.925 2.06 1.74 80.7 dsADN

Kruja 0.934 0.48 0.56 1.94 1.66 46.7 dsADN

Shiroka 1.526 0.88 0.79 1.73 1.93 76.3 dsADN

Torovica 0.968 0.54 1.06 1.82 0.91 48.4 dsADN

Grishaj 1.316 0.67 1.04 1.96 1.27 65.8 dsADN

Shëngjin 1.115 0.61 0.89 1.82 1.24 55.75 dsADN

Valbona 1.33 0.75 1.14 1.76 1.17 66.5 dsADN

Ulza 1.19 0.6 0.92 1.98 1.3 59.5 dsADN

Lezha 0.892 0.46 0.69 1.95 1.29 44.6 dsADN


52

Tabela 3.2. Rezultatet e matjeve spektrofotometrike të sasisë dhe cilësisë së ADN gjenomike

sipas GenElute TM Plant Genomic DNA Kit (SIGMA) G2N-70


(ng/µl) Lloji

Postriba 0.767 0.426 0.572 1.8 1.34 38.35 dsADN

Rubik(A) 0.293 0.151 0.136 1.94 2.15 14.6 dsADN

Rubik(B) 0.996 0.53 0.702 1.88 1.42 49.7 dsADN

F.Milot 0.75 0.39 0.62 1.92 1.22 37.5 dsADN

Lohe 0.968 0.59 0.81 1.62 1.22 48.5 dsADN

Balldren 0.488 0.245 0.19 1.99 2.57 24.3 dsADN

Kruja 0.724 0.41 0.28 1.75 2.68 36.2 dsADN

Shiroka 0.814 0.45 0.58 1.8 1.42 40.7 dsADN

Torovica 0.692 0.43 0.92 1.6 0.75 34.6 dsADN

Grishaj 0.967 0.55 0.85 1.77 1.14 48.35 dsADN

Shëngjin 0.758 0.39 0.72 1.9 1.05 37.9 dsADN

Valbona 0.892 0.55 0.72 1.63 1.24 44.6 dsADN

Ulza 0.685 0.4 0.48 1.71 1.42 34.25 dsADN

Lezha 0.693 0.41 0.91 1.67 0.76 34.65 dsADN

Tabelat 3.1 dhe 3.2 përshkruajnë rezultatet e matjeve të sasisë dhe cilësisë së ADN-ve

gjenomike nga trembëdhjetë popullatat e marra në studim sipas protokollit Doyle &

Doyle (1987) të modifikuar dhe atij të GenElute TM Plant Genomic DNA Kit

(SIGMA) G2N-70 respektivisht.

Figura 3.1. Krahasimi i cilësisë së ADN-së të sherbelës së ekstraktuar duke përdorur të dy

metodat

Metoda Doyle & Doyle (1987) e modifikuar, jep rezultate më të mira mbi cilësinë e

ADN-së (Tabela 3.1/3.2 dhe Figura 3.1).


53

Figura 3.2. Krahasimi i sasisë së ADN-së të sherbelës së ekstraktuar duke përdorur të dy

metodat

Sipas rezultateve të përftuara të paraqitura më lart në figurën 3.2, metoda Doyle &

Doyle (1987) e modifikuar, jep rezultate më të mira mbi sasinë e ADN-së.

Në vijim në Tabelën 3.3 jepen rezultatet spektrofotometrike të cilësisë dhe sasisë së

ARN totale të ekstraktuar sipas Young et al. 2007.

Tabela 3.3. Rezultatet spektrofotometrike të cilësisë dhe sasisë së ARN totale të ekstraktuar

sipas Young et al. 2007


(ng/µl) Lloji

Postriba 0.966 0.478 0.52 2.02 1.85 38.64 ARN

Rubik(A) 0.967 0.408 0.51 2.37 1.9 38.68 ARN

Rubik(B) 1.082 0.538 0.551 2.01 1.96 43.28 ARN

F.Milot 1.52 0.72 0.76 2.11 1.99 60.8 ARN

Lohe 1.634 0.8 0.89 2.03 1.84 65.4 ARN

Balldren 1.027 0.384 0.564 2.07 1.82 41.08 ARN

Kruja 1.854 0.964 1.037 1.92 1.79 74.16 ARN

Shiroka 1.384 0.68 0.59 2.04 2.32 55.4 ARN

Torovica 1.352 0.65 0.81 2.08 1.66 54.08 ARN

Grishaj 1.453 0.71 1.05 2.06 1.39 58.12 ARN

Shëngjin 1.326 0.63 0.73 2.11 1.82 53.04 ARN

Valbona 1.264 0.62 0.75 2.03 1.69 50.56 ARN

Ulza 1.65 0.77 1.07 2.12 1.53 66.1 ARN

Lezha 1.16 0.52 0.81 2.21 1.42 46.4 ARN

Stabilizimi i metodikave të ekstraktimit të acideve nukleike të kategorive ADN

gjenomike dhe ARN totale ishte hapi i parë në vargun e metodave të përdorura në këtë

punim. Cilësia dhe sasia e të dy biomolekulave rezulton e kënaqshme për përdorimin

e tyre në praktikat që vijojnë.


54

3.2 Vlerësimi i diversitetit të rajonit intergjenik trn të cp-ADN-së të popullatave

të Salvia officinalis bazuar në PCR-RFLP

Gjenomat organelare përfshirë ato kloroplastike evolojnë më ngadalë se gjenoma

bërthamore. Ky fenomen konservimi prej kohësh është përdorur për të hartuar primera

të aftë për të shumëfishuar rajone polimorfike jo-koduese dhe koduese të cpADN-së,

si edhe gjenomën e plotë kloroplastike në specie bimore (Dhingra and Folta 2005;

Ibrahim et al., 2007.).

Tashmë është i njohur fakti se përbërësit monoterpenoidike të vajrave esencialë të

bimëve janë provuar se sintetizohen përmes një rrugëkalimi jo-mevalonik (Eisenreich,

1997) dhe se origjina e monoterpen-sintetazave e kompartmentalizimi i tyre ka të bëjë

me kloroplastet dhe leukoplastet e qelizave të parenkimës fotosintetizuese (Bouvier,

2000).Për këtë arsye në këtë punim fillimisht u vlerësua diversiteti i rajonit intergjenik

trn të ADN-së kloroplastike, i cili rezulton të jetë përdorur me sukses për të zbuluar

diversitetin e popullatave të Salvia officinalis.

Çifti i primerave trnF-trnL sipas Ibrahim (2012), shumëfishoi me sukses rajonet

korresponduese të cpADN-ve në të gjitha gjenotipet e analizuara të Salvia officinalis.

Produktet e shumëfishimit të cpADN-së paraqiten në Figurën 3.3 për 13 popullatat e

sherbelës së Shqipërisë së veriut ( 43 gjenotipe) me çiftin e primerave trnL-trnF (të

hartuar sipas Ibrahim et al., 2012).Nga e majta në të djathtë paraqiten gjenotipet e

përshkruara në Tabelën 2.3 të kapitullit II. Markeri molekular 1kbp gjendet në tre

puse, respektivisht i fundit në të dy gjysmat exhelit të parë (në të majtë) dhe i dhjeti në

xhelin e dytë (në të djathtë).

Rajoni inter-gjenik trnL-F dhe sekuencat e gjenit rbcL të cpADN-së janë përdorur për

të studiuar Salviat dhe llojet e përafërta (Walker, 2004; Ibrahim, 2012; Li, 2013) për

të përshkruar lidhjet filogjenetike nga një numër autorësh. Speciet e Salvia grupohen

bazuar në origjinë (Clebsch, 2003) dhe ky rezultat është në përputhje me studimin e

Walker (2004) dhe Ibrahim (2010), pavarësisht se në studim u përdorën rajone të

ndryshme të cpADN-së.

Figura 3.3. Produktet e shumëfishimit të cpADN nga 13 popullatat e sherbelës së Shqipërisë

së veriut ( 43 gjenotipe) me çiftin e primerave trnL-trnF


55

Në studimin tonë, meqënëse amplikoni i shumëfishuar kishte përmasa të njëjta për të

gjithë gjenotipet (Figura 3.3), u vendos të përdorej prerja me enzima restriktive të dy

tipeve për të zbuluar dallimet ndërmjet fragmenteve një-përmasore. Profilet e prerjes

me enzimat e restriksionit TaqI dhe AluI paraqiten në Figurën 3.4A dhe 3.4B. Enzima

Taq1 prodhoi 4 banda madhore prezente në të gjitha gjenotipet dhe një bandë minore

polimorfike (Figura 3.4 A/B).

Ne figurën 3.4.A mostrat renditen nga e majta në të djathtë; markeri molekular 100çb

gjendet në tre puse, respektivisht i fundit në gjysmën e sipërme të xhelit, i gjashti në

gjysmën e poshtme dhe i fundit në xhelin e dytë (në të djathtë), respektivisht. Numrat

1-43 përkojnë me gjenotipet e përshkruara në Tabelën 2.3, M tregon markerin

molekular të tipit GeneRulerTM 100bp.

Figura3.4.(A) Produktet e marra nga prerja e amplikoneve të PCR me primerat trnL-trnF me

enzimën prerëse TaqI për 43 gjenotipe të Salvia officinalis

Enzima e dytë restriktive prodhoi katër banda madhore dhe katër banda polimorfike

minore (Figura 3.4.B). Gjithashtu,numrat 1-43 përkojnë me gjenotipet e përshkruara

në Tabelën 2.3, M tregon markerin molekular te tipit GeneRulerTM 100bp. Markeri

ndodhet në 3 puset e fundit tek dy gjysmat e xhelit të parë (në të majtë) dhe xhelit të

dytë (në të djathtë).


56

Figura 3.4 (B) Produktet e marra nga prerja e amplikoneve të PCR me primerat trnL-trnF me

enzimën prerëse AluI për 43 gjenotipe të Salvia officinalis.

Analiza e të dhënave nga RFLP-PCR bazuar në analizën UPGMA rezultoi në

dendrogramat e ngjashmërive ndërmejt popullatave të pasqyruara në Figurat 3.5A dhe

3.5.B.

Figura 3.5A tregon se prerja me AluI e amplikonit mund ti organizojë 43 gjenotipet e

Salvias në gjashtë grupe kryesore, ndër të cilat popullata e Krujës rezulton më e

veçanta pasi ndan me të tjerat një ngjashmëri të nivelit 40%.

Figura 3.5.(A). Dendrograma e afërisë për 43 gjenotipe (13 popullata) të sherbelës bazuar në

përmasat e produkteve të prerjes restriktive të fragmenteve të cp-ADN (Enzima Alu1)

Produktet e prerjes me TaqI të amplikoneve u përdorën për të ndërtuar një

dendrogramë ngjashmërie ndërmjet gjenotipeve të analizuara (Figura 3.5.B).

Dendrograma i organizon gjenotipet në dy grupe kryesore që ndajnë 75% ngjashmëri,

pa mundur të veçojë popullata të caktuara.

RFLPs on S.officinalis AluI

Coefficient of Jaccard

0.00 0.25 0.50 0.75 1.00

1

2

20

21

22

40

23

24

25

32

29

27

26

28

30

41

44

43

42

3

17

18

19

37

36

31

38

34

4

5

6

7

8

16

15

14

13

12

11

10

9

39

33

35


57

Figura 3.5.(B) Dendrograma e afërisë për 43 gjenotipe (13 popullata) të sherbelës bazuar në

përmasat e produkteve të prerjes restriktive të fragmenteve të cp-ADN (Enzima Taq1)

Meqënëse qëllimi i punës ishte përdorimi i cpADN-së bazuar në profilet e PCR-RFLP

për të zbuluar diversitet gjenetik të mundshëm midis popullatave kryesore të sherbelës

të Shqipërisë së veriut, përdorimi i profileve AluI rezultoi shumë më informativ se ai i

TaqI. (Fig 3.5 A)

Çdo bandë e përftuar nga PCR-RFLP shërben për të dalluar individët. Rezultatet mbi

numrin e bandave të dhëna nga secila enzimë janë 8 për AluI dhe 5 për Taq1,

respektivisht.

Kontribut më të madh ndaj dimensionit 1 jep enzima AluI ndërsa enzima Taq1 jep një

kontribut shumë të vogël pothuajse të pakonsiderueshëm.

Vija me ngjyrë të kuqe të ndërprera në figurat e mëposhtme tregon kontributin

mesatar të pritshëm. Për një dimension të dhënë, çdo kategori me një kontribut më të

madh se vlera kufi konsiderohet i rëndësishëm në kontributin ndaj të njëjtit

dimension.

RFLPs on Salvia officinalis of Northern Albania 43 genotypesTaqI

Coefficient

0.00 0.25 0.50 0.75 1.00

1

2

3

4

5

6

36

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

43

40

38

41

34

33

30

28

26

24

22

20

18

32

39

42

19

21

23

25

27

29

31

35

37


58

Figura 3.6.A/B. Kontributi i enzimave prerëse AluI dhe TaqI në zbulimin e diversitetit

gjenetik ndërmjet fragmenteve të cp-ADN për popullatat e sherbelës të Shqipërisë së veriut

Dy figurat 3.6 A/B tregojnë kontributin e enzimave AluI dhe TaqI në evidentimin e

shkallës së ngjashmërisë ndërmjet gjenotipeve të analizuara, të konceptuara me anë të

softit PcoA, i cili është aplikuar mbi një matricë të përbashkët të të dhënave të

përftuara nga përdorimi i të dy enzimave.


59

Figura 3.7. Shpërndarja grafike e kontributit të dy enzimave AluI dhe TaqI në diskriminimin

e individëve.

Më sipër (Figura 3.7.) paraqitet shpërndarja grafike e kontributit të dy enzimave për

secilën bandë të dhënë, të analizuara me softin PCA. Këto variabla na ndihmojnë të

përcaktojmë kategoritë më të rëndësishme në përcaktimin e dimensioneve dhe tregon

se në cilin pol të dimensioneve janë duke kontribuar kategoritë e marra në analizim.

Në këtë rast dimensionet janë bandat e përftuara në xhel dhe të dhënat tregojnë se si

kanë kontribuar të dy enzimat e përdorura në diskriminimin dhe diversitetin midis

individëve duke përcaktuar numrin e bandave të përftuara.

Dendrograma e ndërtuar në Figurën 3.8, duke përdorur këto të dhëna i organizon

popullatat në gjashtë grupe kryesore: Kruja (si popullata më e veçantë që ndan vetëm

45% me të tjerat), Postriba, Torovica, Rubik-Milot, Balldren-Rubik-Lohe, Rubik-

Shkodër, që ndajnë rreth 80% ngjashmëri me njëra-tjetrën. Nga mënyra e grupimit në

nivelet e ngjashmërisë nga 80-100%, popullata më të veçanta rezultojnë Kruja,

Torovica dhe Postriba.


60

Figura 3.8. Dendrograma e ndërtuar mbi bazën e të dhënave të PCR-RFLP mbi cpADN e 43

gjenotipeve të sherbelës së veriut të Shqipërisë, të marra nga të dy enzimat TaqI dhe AluI

Për të përftuar një pamje më të qartë të afërisë ndërmjet popullatave bazuar në këtë

rajon specifik të cpADN-ve, u përdor softi PcoA, i cili bazuar në matricë binare të të

dhënave të PCR-RFLP të përshkruar më lart, prodhoi një paraqitje grafike të treguar

në figurën 3.9.

Figura 3.9. Afëria ndërmjet popullatave sipas të dhënave të PCR- RFLP mbi cpADN

Edhe kjo paraqitje grafike (Figura 3.9) tregon se popullatat e Krujës, Torovicës dhe

Postribës veçohen nga te tjerat, duke treguar një nivel diversiteti të konsiderueshëm

ndërmjet popullatave të Shqipërisë së veriut, të cilat reflektojnë një dallueshmëri të

pamjaftueshme morfologjike për tu përdorur në evidentimin e diversitetit të tyre.

Përdorimi i PCR-RFLP-së sipas protokollit të ndjekur në këtë studim është përdorur

nga disa autorë për të kryer studime taksonomike të bimëve.


61

Walker(2004) përdori pikërisht rajonin trnL-F të cpADN-së për të studiuar

monofiletinë/polifiletinë e gjinisë Salvacea dhe lidhjet e saj me Menthae.

Më pas Ibrahim (2012) dhe autorë të tjerë e perdorën për studime në nivelin e

popullatave te Salvia officinalis duke arritur në konkluzione të rëndësishme mbi

diversitetin dhe evoluimin e tyre.

3.3 Vlerësimi i fragmenteve gjenike të MTP nga popullatat e Salvia officinalis

të Shqipërisë së veriut.

Rezultatet për vlerësimin e fragmenteve gjenike të MTP-ve nga popullatat e marra në

studim shpjegohet në ndarjet e mëposhtme.

3.3.1 Shumëfishimi i fragmenteve gjenike të MTP nga gADN dhe ARN totale

Trembëdhjetë popullata natyrore të sherbelës së Shqipërisë së veriut u analizuan për të

vlerësuar diversitetin e gjeneve koduese të monoterpen-sintetazave sipas një strategjie

të bazuar në homologjinë e kësaj klase gjenike. Metodologjia e ndjekur u bazua në

shumëfishimin me PCR të një fragmenti gjenik qëndror të gjenit kodues për sabinën-

sintetazën nga modele gADN dhe ARN totale. Sekuencat e primerave specifike të

përdorur (Grazhdani A., 2003) u përcaktuan pas mbivendosjes së disa gjeneve

koduese të MTP nga bimë aromatike dhe përcaktimit të rajoneve të konservuara mirë,

prej nga ku u hartuan primerat Sbs1010/Sbs 350 (të përshkruar ne Kapitullin 2 të

kësaj teze). Meqënëse gjenet koduese të MTP shpesh gjenden në një kopje të vetme

në gjenomat bimore, e në raste të tjera raportohen të jenë të organizuar në familje

gjenike, çka e reflekton edhe ngjashmëria e lartë ndërmjet enzimave që kodojnë, në

këtë punim u vendos të shumëfishohet fragmenti specifik nga të dy kategoritë e

acideve nukleike. Kjo u krye për të parë nëse në popullatat e sherbelës të veriut

produktet e shumëfishimit do të ishin polimorfike, dhe nëse do të kishte dallime për

shkak të acideve nukleike të përdorura si modele për shumëfishimin.Figura 3.10 më

poshtë tregon fragmentet e shumëfishuara nga të dy kategoritë e templateve, që

rezultuan të njëjta, duke provuar se rajoni i shumëfishuar në të gjitha popullatat nuk

përmbante introne, pra ishte pjesë e një fragmenti plotësisht kodues.

Figura 3.10. Produktet e shumëfishimit të templatit ADN gjenomike dhe ARN totale për 13

popullatat me anë të Sbs350/Sbs1010


62

Figura 3.11. Produktet e shumëfishimit me anë të Sbs350/Sbs1010 nga templat ARN -je

Në figurën 3.10, nga e majta në të djathtë në gjysmën e sipërme të xhelit renditen

produktet e shumëfishimit të 13 gjenotipeve me anë të Sbs350/Sbs1010; Mostrat 1-13

nga templat gADN;1-6 nga tempat ARN; Markeri molekular 1kbp. Në gjysmën e

poshtme të xhelit renditen nga e majta në të djathtë mostrat 7-10 nga templat ARN,

kontrolli dhe Markeri 1kbp.

Në figurën 3.11, nga e majta në të djathtë në xhel renditen produktet e shumëfishimit

me anë të Sbs350/Sbs1010 nga templat ARN 11-13; kontrolli; Markeri 1kbp.

Produkti i pritshëm i shumëfishimit është rreth 800çb, dhe është prodhuar në të gjitha

mostrat.

Me synim evidentimin e dallimeve ndërmjet amplikoneve që kanë përmasa të njëjta, u

vendos që të vijonte puna me nxjerrjen nga xheli dhe klonimin e tyre në E.coli sipas

metodologjisë së Invitrogen. Klonimi do të mundësojë veçimin e produkteve të

shumëfishta një-përmasore pasi çdo plazmid mund të strehojë vetëm një fragment

ADN-je.

3.3.2. Analizimi i plazmideve rekombinante me anë të analizës restriktive

Përmasat e inserteve të kloneve pozitive nga popullatat më të veçanta u vlerësuan me

anë të prerjes së plazmideve rekombinante me EcoRI. Në figurën 3.12 paraqiten

profilet e prerjeve të amplikoneve për kater koloni transformante nga popullata e

Krujës.


63

Figura 3.12. Profilet e prerjes restriktive për popullatën e Krujës

Në figurën e mësipërme 3.12 paraqiten profilet e prerjes restriktive për popullatën e

Krujës, nga e majta në të djathtë; Markeri molekular 1kbp, kolonitë 1, 2, 3, 4 Siç duket nga figura 3.12 kolonia 1 ka dhënë dy produkte prerjeje të amplikonit me

përmasa respektivisht 0,2 dhe 0,7 kbp; Kolonitë 2 dhe katër kanë dhënë produkte me

përmasa 0,3 dhe 0,5 kbp; Kolonia 3 ka dhënë një fragment 0.9kbp. Referuar këtyre

profileve në popullatën e Krujës ka së paku tre fragmente të ndryshme të gjeneve

koduese të MTP.

Figura 3.13. Profilet e prerjes restriktive për popullatën e Postribës


Postribës, nga e majta në të djathtë; Markeri molekular 1kbp, kolonitë 1, 2, 3, 4. Siç duket nga figura 3.13, në popullatën e Postribës, plazmidet rekombinante kanë

strehuar nga një fragment të vetëm në të katër kolonitë e analizuara.

Figura 3.14. Profilet e prerjes restriktive për popullatën e Torovicës


64


Torovicës, nga e majta në të djathtë; Markeri molekular 1kbp, kolonitë 1, 2, 3, 4. Profilet e prerjes tregojnë se kolonitë 1 dhe 3 kanë strehuar nga një fragment 0,8kbp të

barabartë në përmasa; Kolonia 2 ka strehuar dy fragmente 0,3 dhe 0,5kbp; kolonia 4

ka strehuar një fragment 7,5kbp. Bazuar në figurën 3.14 prej popullatës së Torovicës

janë shumëfishuar së paku tre fragmente gjenike të ndryshme të MTP.

Si rrjedhim, popullatat e marra në studim përmbajnë deri në tre kategori të

fragmenteve gjenike të MTPs. Kjo tregon se pavarësisht ngjashmërisë së madhe të

fragmenteve të izoluara, ato nuk janë identike, një rezultat ky i rëndësishëm për

diversitetin e gjeneve koduese të MTPs në këto popullata.

Metodat për izolimin e gjeneve koduese të MTPs të përdorura ndër vite janë të

ndryshme, por të gjitha marrin në konsideratë faktet se shprehja e tyre është e

kontrolluar në qelizat gjëndrore të trikomave, ose e kufizuar në faza të caktuara

vegjetative të bimës, ose e nxitur si një përgjigje mbrojtëse ndaj predatorëve.

Njëherësh, disa metoda marrin parasysh shprehjen në qeliza ose inde specifike të

MTPs (Grazhdani, 2000). Nëse do të klasifikoheshin metoda bazë të përdorura janë

metoda të gjenetikës reverse të bazuara ne enzimat e purifikuara, PCR të bazuara në

ngjashmerinë e rajoneve gjenike, dhe teknika të bazuara tek mutantët.

Në analizimin e gjeneve koduese të MTPs një evolucion të mirëfilltë solli analizimi në

1999, i monoterpeneve tek Quercus ilex L. dhe bimët transgjenike të Betula pendula

Roth, nga Bohlmann (1999). 24 fragmente koduese të MTPs u analizuan me RFLP

dhe u klasifikuan në 5 grupe bazuar në hartën restriktive.

Dy prej kloneve të izoluara u shprehën tek E. coli nga ku u vu re se njëri kodonte për

multiprodukt të panjohur të kategorisë së monoterpen-sintetazave, i cili katalizonte

formimin e α-pinenit, sabinenit dhe β-pinenit, ndërsa kloni i dytë i emërtuar QiPINS

përbënte një sekuencë të plotë koduese.

Raportimet mbi kapacitetin e një terpen-sintetaze të vetme për të prodhuar produkte

shumëfishe shpesh lidhen me veçoritë e gjeneve të tyre koduese. Analizat e

sekuencave koduese të MTPs në bimë të ndryshme kanë treguar rajone të konservuara

dhe karakteristika strukturore, numër të barabartë intronesh dhe përmasa të ngjashme

të ekzoneve, si dhe pozicion të njëjtë të tyre (Bohlmann et al., 1998).

Por, një numër autorësh mendojnë se diversiteti i monoterpeneve është i lidhur me

diversitetin funksional për shkak të dublikimit të gjeneve. Zapata (2013) rindërtoi

historinë evolutive të monoterpen sintetazave (TPSb) tek speciet Protium, si edhe

ndryshimet taksonomike e kimike në gjininë e pemëve tropikale. Studimi rezultoi në

gjetjen e provave se ngjaret e dublikimit kanë çuar në formimin e 3 deri në 5 kopje të

gjeneve TPSb tanimë të pranishëm në Protium.

Në mbështetje të kësaj ideje ka qënë edhe Mac Lean (1983), i cili raporton se gjenet

koduese të terpen-sintetazave i përkasin një familjeje gjenike, anëtaret e të cilës

karakterizohen nga rajone shumë të konservuara dhe nga rajone, që ka mundësi të

kodojnë për domene katalitike, të cilat mund të kenë diverguar lehtësisht prej njeri-

tjetrit përmes akumulimit të mutacioneve të ndryshme.

Në familjen Lamiaceae (Labiatae) gjenden disa monoterpen-sinteza përfshirë linalool

dhe limonen sintetazën, të cilat janë klonuar dhe përcaktuar funksionalisht në disa

bimë të familjes Labiatae. Saeidnia (2014) përcaktoi praninë e linaloolit dhe limonen-



65

sintetazës në katër specie të familjes Labiatae përfshirë Nepeta cataria, Lavandula angustifolia, Hyssopus officinalis dhe Salvia schlarea.

Studime mbi gjenet koduese të MTPs tek Salvia officinalis dhe Salvia fruticosa të Greqisë (Grazhdani A., 2000; 2003, 2004) kanë raportuar izolimin dhe karakterizimin e një sërë sekuencash të gjeneve të MTPs të cilat ndajnë ngjashmëri të mëdha (të vërejtura nga mbivendosja e fragmenteve gjenike dhe ajo e sekuencave të deduktuara të aminoacideve respektive. Sipas Bohlmann (1998) ngjashmëria ndërmjet anëtarëve të familjeve gjenike të këtij lloji është e pritshme (në mjaft raste është e nivelit mbi 40%).

3.4 Vlerësimi i diversitetit të popullatave të sherbelës së Shqipërisë së veriut bazuar në përmbajtjen e MTP në vajrat esenciale

Diversiteti i popullatave të sherbelës së Shqipërisë të Veriut bazuar në përmbajtjen e monoterpeneve në vajrat esenciale u vlerësua me anë të teknikës Gaz-kromatografike.

3.4.1. Rezultatet të Gaz-kromatografisë për popullatat e Salvia officinalis Më poshtë janë paraqitur kromatogramat e marra me anë të teknikës të gaz-kromatografisë me detektor me jonizim me flakë. Me anë të kësaj teknike në përgjithësi fitohen nga 70 deri 120 komponime por vetëm 20-25 prej tyre përbëjnë komponentët kryesore (me përqëndrim më të madh se 1%). Këto kompozime kryesore janë identifikuar tek të gjitha mostrat e marra në analizë dhe janë përdorur për studimin tonë.

Në kromatograma e rëndësishme është koha e daljes (retention time) të secilit pik, e vendosur në boshtin e abshisave. Kjo është e lidhur me identifikimin e komponentit dhe analizën cilësore të tij. Në kushte të njëjta kromatografike një komponim del gjithmonë në të njëjtën kohë. Lartësia e pikeve gjithashtu është e rëndësishme sepse ajo është e lidhur me analizën sasiore.Sa më i madh të jetë piku, aq më i madh është përqëndrimi i tij. Lartësia e pikeve matet me Hz në boshtin e ordinatave. Në studimin tonë jemi bazuar në raportin relativ të sipërfaqjes të secilit pik kundrejt totalit të sipërfaqjeve të të gjithë pikeve të integruar. Totali i tyre konsiderohet 100%.


Shkodrës

36343230282624222018161412108642

2,200,000

2,000,000

1,800,000

1,600,000

1,400,000

1,200,000

1,000,000

800,000

600,000

400,000

200,000

0

-200,000

-400,000

-600,000

TI

ON

TI

OF

F

RT [min]

sherebele shkoder90.DATAµV


66


Malësisë së Madhe (Grishaj)


Torovicës


Rubikut

3836343230282624222018161412108642

5,000,000

4,500,000

4,000,000

3,500,000

3,000,000

2,500,000

2,000,000

1,500,000

1,000,000

500,000

0

-500,000

TI

ON

TI

OF

F

RT [min]

Sherebele malesi madhe87.DATAµV

3836343230282624222018161412108642

1,900,0001,800,000

1,700,000

1,600,000

1,500,0001,400,000

1,300,000

1,200,000

1,100,0001,000,000

900,000

800,000700,000

600,000

500,000

400,000300,000

200,000

100,000

0-100,000

-200,000

-300,000

TI

ON

TI

OF

F

RT [min]

Sherebele Torovec87.DATAµV

36343230282624222018161412108642

5,000,000

4,500,000

4,000,000

3,500,000

3,000,000

2,500,000

2,000,000

1,500,000

1,000,000

500,000

0

-500,000

-1,000,000

TI

ON

TI

OF

F

RT [min]

Sherebele Rubik87.DATAµV


67

Figura 3.19. Kromatogramë e marrë me GC/FID për popullatën e Salvia officinalis të Krujës


Balldrenit

Figura 3.21. Kromatogramë e marrë me GC/FID për popullatën e Salvia officinalis të Fushë

Milot-it

36343230282624222018161412108642

2,800,000

2,600,000

2,400,000

2,200,000

2,000,000

1,800,000

1,600,000

1,400,000

1,200,000

1,000,000

800,000

600,000

400,000

200,000

0

-200,000

-400,000

TI

ON

TI

OF

F

RT [min]

sherebeleKruje87.DATAµV

3836343230282624222018161412108642

2,800,000

2,600,000

2,400,000

2,200,000

2,000,000

1,800,000

1,600,000

1,400,000

1,200,000

1,000,000

800,000

600,000

400,000

200,000

0

-200,000

-400,000

-600,000

-800,000

TI

ON

TI

OF

F

RT [min]

Sherebele Balldren87.DATAµV


68

Figura3.22. Kromatogramë e marrë me GC/FID për popullatën e Salvia officinalis të Lezhës

Figura 3.23. Kromatogramë e marrë me GC/FID për popullatën e Salvia officinalis të Lohes


69


Postribës


Shëngjinit


70

Figura 3.26. Kromatogramë e marrë me GC/FID për popullatën e Salvia officinalis të Ulzës


Valbonës

Përbërja e vajrave esenciale për 13 popullatat natyrore të sherbelës të Shqipërisë së

veriut tregoi se nga 20 përbërës të vajrave esencialë të analizuar me GC/FID (figura


71

3.28, tabela 3.4), përbërësit më të shumtë janë α-tujon, β-tujon, kamfor, 1,8-cineol dhe

kamfen.

Αlfa-tujon është përbërësi më predominant me një rang shpërndarje nga 18.67% (në

popullatat e Shëngjinit) në 36.1% (popullata e Postribës), e ndjekur nga kamfori në

një rang 10.98% (Balldren) deri në 22.95% (Rubik); 1.8-cineol nga 8.4% (Valbona)

në 22.23% (Shkodër); kamfen nga 2.14% (Balldren) në 11.43% (Rubik); β-tujon nga

2.29% (Ulza) në 7.67% (Valbona), dhe α-pinen nga 2.2% (Postriba) në 9.42%

(Kruja). Monoterpene të tjera të gjetura ishin borneol (1.21% në Balldren-3.89% në

popullatat e Shëngjinit), β-pinen (0.88% tek popullata e Torovicës në 2.44% tek

Lezha), mirceni (0.4% në popullatën e Ulzës deri në 1.96% në popullatën e Lezhës),

bornil acetati (0.33% në popullatën e Shkodrës në 2.77% në popullatën e Lohes).

Dy nga 20 përbërësit e analizuar ishin seskuiterpene, β-karafilen dhe humulen, të

gjetura në një sasi që i korrespondojnë vlerave nga 0.25% (në popullatën e Grishaj,

Malësi e Madhe) në 7.62% (popullatën e Balldrenit) dhe nga 0.32% (popullata e

Shëngjinit) në 8.02% (popullata e Ulzës), respektivisht. Përëbërësit e tjerë ishin në

sasi më të vogla se 1%. Kontributi (në përqindje) i grupeve terpenoide varionte midis

popullatave. Përbërësit e monoterpeneve varionin nga 0.02-36.1% dhe seskuiterpenet

nga 0.25%-8.02%. Ndryshime të vogla u panë për monoterpenet e oksigjenuara.

Mirceni ishte monoterpeni me sasi më të vogël (0.4%-2.84%). (Tabela 3.4)

Rezultatet e përbërësve të vajrave esenciale për popullatat e Shqipërisë të Veriut

(Tabela 3.4) janë në përputhje me literaturën në lidhje me përbërësit kryesorë të

terpenoideve (Said-Al Ahlet al., 2015; Porte et al., 2013; Couladis et al., 2002;

Stesevic et al., 2014; Menghini et al., 2012; Jug-Dujakovic´ et al., 2012). Ndërkohë,

sasitë e përbërësve, ashtu siç pritej, ndryshojnë nga ato të raportuara në vendet e

Mesdheut dhe vende të tjera të botës, gjithashtu edhe midis popullatave lokale në

studim.

Ndryshime të rëndësishme në sasi ka shprehur α-tujoni, i cili në popullatat e

Shqipërisë të veriut rezultoi më i lartë krahasuar me ato të popullatave të Brazilit

(Porte et al., 2013); popullatat e Egjiptit (Said-Al Ahl et al., 2015); popullatat e

Serbisë (Couladis et al., 2002); popullatat e Malit të Zi (Stesevic et al., 2014) dhe

Italisë qendrore (Menghini et al., 2012). Ndërsa popullatat e Bosnjë-Hercegovinës

tregojnë përqindje më të lartë për α-tujonin (Jug-Dujakovic´et al., 2012) krahasuar me

popullatat tona.


72

Tabela 3.4. Përbërja e vajrave esenciale të popullatave të Shqiperisë së veriut (monoterpenet dhe seskuiterpenet kryesore)


73

Sasia totale e monoterpeneve në popullatat e Shqipërisë të veriut është më e ulët se ato

të raportuara nga mostrat e Hercegovinës qendrore dhe Europës jugore (Cvektovikj et

al., 2015; Jug-Dujakovic´ et al., 2012). Duke konsideruar përbërësit e

seskuiterpeneve, vajrat esenciale nga Shqipëria e veriut përmbajnë dy përbërës,

humulene dhe β-karafilen, ndërsa mostrat nga lindja e Lituanisë (Bernotien et al.,

2007), Serbisë (Couladis et al., 2007), Europës jugore (Cvektovikj et al., 2015), dhe

Malit të Zi (Stesevic et al., 2014) kanë një përqindje të vogël të tre përbërësve shtesë.

Nëse shohim ndryshimet në përbërësit madhorë midis popullatave lokale shqiptare,

është e dukshme se mostrat nga Torovica, Malësi e Madhe (Grishja), Lohe, Prostriba,

Balldren dhe Valbona kanë nivelin më lartë të α-tujonit (Tabela 3.4, figura 3.28).

Popullatat e Balldrenit dhe Valbonës kanë vlerat më të larta të β-tujonit; Tetë prej 13

popullatave kanë përbërësin kamfor më shumë se 20% dhe gjithashtu ka shumë

variabilitet në përbërësit e 1,8-cineolit dhe α-pinenit.

Figura 3.28. Përmbajtja në kategoritë kryesore të monoterpeneve dhe sesquiterpeneve

në popullatat e Shqipërisë së veriut

Përbërja e kamfenit tregon rritje për 2 popullatat (Shkodër, Rubik), ndërsa popullatat e

tjera kanë pothuajse gjysmën e sasisë.

3.4.2. Shkalla e ngjashmërisë ndërmjet popullatave bazuar në përmbajtjen e

vajrave esenciale

Krahasimi i përbërësve të vajrave esenciale në 13 popullatat në studim mund të

shërbejnë për ti grupuar ato në 6 grupe kryesore, të cilat nuk janë të lidhura me

afërsinë gjeografike ose lartësinë mbi nivelin e detit (Figura 3.29).


74

Figura 3.29. PCA-Biplot i grupon popullatat në studim në varësi të përmbajtjes së vajrave

esenciale

Në figurën e mësipërme rreshtat përfaqësojnë popullatat dhe kolonat (kategoria e

variablave) përfaqëson çdo përbërës të vajrave esencialë për secilën popullatë.

Distanca midis çdo popullate ose përbërësi te vajit esencial na jep informacion mbi

diversitetin e tyre. Popullatat me profile të ngjashme janë afër faktorit të hartës si për

boshtet X (popullatat) dhe boshtet Y (kolonat për vajrat esencialë).

Figura 3.30. Paraqitja grafike e kontributit të çdo përbërësi të vajrave esenciale tek popullatat

e sherbelës së Shqipërisë së veriut në raport me njëri-tjetrin


75

Përbërja cilësore dhe sasiore e vajrave esenciale të sherbelës është e rëndësishme

veçanërisht për qëllime tregtare. Bazuar në ISO 9909 për përdorimet mjekësore, jo të

gjithë përbërësit e vajrave esenciale të sherbelës të marra në studim (Figura 3.28)

përputhen me kërkesat e ISO 9909 dhe German Drug Codex. Shumica e popullatave

natyrore të Shqipërisë të veriut kanë sasinë e duhur të α-tujonit, kamforit, 1,8-cineolit,

β-tujonit, α-humulenit, linalool, borneol dhe acetat bornilit, por përbërës të tjerë

(Figura 3.30) si α-pineni, kamfeni dhe limoneni rezultojnë në sasi më të mëdha.

Figura më lart paraqet kontributin e cdo përbërësi të vajrave esenciale të sherbelës në

popullatat e marra në studim, duke evidentuar kështu vlerën reale të cdo njërës

popullatë për tu përdorur për qëllime tregtare.

Nëse krahasojmë grupimin e popullatave të sherbelës bazuar në rezultatet e RFLPs të

rajonit trn të cp-DNA me rezultatet e Figurës 3.9, vërejmë ngjashmëri të

konsiderueshme. Përdorimi i rajoneve ndërgjenike të cpDNA si mjete për studime

sistematike në nivel popullatash është i rëndësishëm për shkak të shumëllojshmërisë

së lartë të dëshmuar nga këto rajone krahasuar me rajonet gjenike të cpDNA. Kështu,

variabilitieti i sasisë së monoterpeneve, si produkte të gjeneve koduese të

monoterpen-sintetazave, që korrespondon me variabilitietin e rajoneve trn të cp-DNA,

mund të shpjegohet me rolin e mundshëm të këtyre rajoneve jo-koduese në

rregullimin e shprehjes së gjeneve për MTPs, i cili është raportuar se ndodh në qelizat

e specializuara të trikomave gjëndrore të indeve të ndryshme të sherbelës.

PERFUNDIME

76

PËRFUNDIME

Trembëdhjetë popullata natyrore të sherbelës së Shqipërisë së veriut u

analizuan për herë të parë për të vlerësuar diversitetin e gjeneve koduese të

monoterpen-sintetazave dhe produkteve të tyre monoterpenoidike.

Metodologjia e ndjekur u bazua në shumëfishimin e bazuar në homologjinë e

gjeneve koduesë te TPs me anë të PCR (nga gADN dhe ARN totale), klonimin

e produkteve (në plazmidin pTOPO2.1), krijimin e librarive përkatëse në

E.coli dhe verifikimin me anë të prerjes restrikive të diversitetit të fragmenteve

të klonuara.

Produkti i pritshëm 0.9kbp i gjeneve koduese të MTPs u prodhua nga të gjitha

popullatat, dhe prerja restriktive e kloneve të tre popullatave më të veçanta

(sipas profileve kimike dhe PCR-RFLP të cpADN-së) provoi praninë e

produkteve të shumëfishta një-përmasore.

Paraprakisht, për të përcaktuar popullatat më të veçanta të sherbelës, të cilat

nuk paraqesin dallime morfologjike, u përdor RFLP-PCR mbi cpADN-të e

tyre. Çifti i primerave trnF-trnL (Ibrahim et al., 2012) shumëfishoi fragmentin

e pritshëm nga të gjitha mostrat e Salvia officinalis të analizuara dhe në vijim

iu nënshtrua RFLP për të verifikuar dallimet në përmbajtjen e fragmenteve për

çdo popullatë.

Analiza e të dhënave nga RFLP-PCR e cp-ADN (AluI dhe TaqI), bazuar në

UPGMA cluster analysis prodhoi dendrograma të ngjashmërisë, falë të cilave

43 gjenotipet u organizuan në gjashtë grupe kryesore.

Efektiviteti i enzimave prerëse AluI dhe TaqI për të evidentuar dallimet në

produktet e shumëfishuara nga cpADN, u bë i dukshëm me anë të software

PCoA, grafikët e prodhuar treguan superioritetin e AluI.

Gaz-kromatografia u përdor për të analizuar përmbajtjen në MT të vajrave

esenciale të 13 popullatave të marra në studim. Përbërësit kryesorë rezultuan

α-tujoni, β-tujoni, kamfori, cineoli, α-pineni, dhe kamfeni. Monoterpenet me

sasi të vogla zenë vetëm deri 5%; sesquiterpenet përfaqësohen nga β-

kariofileni dhe humuleni, që përbëjnë më pak se 10%;

Dallim i rëndësishëm vihet re në sasinë e α-tujonit të mostrave shqiptare, e cila

krahasuar me ato të Brazilit, Egjyptit, Serbisë, dhe Italisë qendrore është e

lartë, ndërsa ndaj mostrave të Malit te Zi më e ulët.

Software PCoA u përdor për të grupuar popullatat sipas ngjashmërisë së

profileve kimike. Bazuar në të popullatat mund të konsiderohen si shumë të

ngjashme (Postriba-Valbona; Torovica-Malësi e Madhe); mund të grupohen

(Shkodra-Rubik; F.Milot-Shëngjin); ose të veçohen si të ndryshme (Balldren,

Kruja, Lohe, Ulza, Lezha).

Grupimi i popullatave bazuar në profilet e vajrave esenciale nuk ka të bëjë me

aferinë gjeografike apo lartësinë mbi nivelin e detit të popullatave.

PERFUNDIME

77

Krahasimi i grupimeve të popullatave të sherbelës sipas ngjashmërisë, bazuar

në diversitetin e rajonit trn të cp-ADN-ve dhe sipas profileve të vajrave

esenciale, tregon se ato janë të ngjashme.

Variabiliteti në përmbajtjen cilësore dhe sasiore të monoterpeneve, si produkti

final i gjeneve koduese të monoterpen sintazave, të cilat korrespondojnë me

variabilitetin e rajoneve trn të cpADN-ve, mund të shpjegohen me rolin e

mundshëm të ketij rajoni në rregullimin e shprehjes të gjeneve koduese të

monoterpeneve.

Produktet e shumëfishta të rajonit qendror të gjeneve koduese të MTP-ve të

izoluara nga popullatat e Krujës, Postribës dhe Torovicës, të cilat bazuar në të

tre kategoritë e analizave të kryera rezultojnë më të veçantat, dëshmojnë

diversitetin gjenetik të këtyre gjeneve edhe në sherbelat e veriut të Shqipërisë.

BIBLIOGRAFIA

78

BIBLIOGRAFIA

1. Allen D.J. (2014). Salvia officinalis. The IUCN Red List of Threatened

Species:e.T203260A2762648. http://dx.doi.org/10.2305/IUCN.UK.2014-

1.RLTS.T203260A2762648.

2. Alonso W. R., and Croteau R. (1993) Methods Plant Biochem. 9, 239–260

3. Alonso W.R.; Rajaonarivony J.I.; Gershenzon J. and Croteau R. (1992).

Purification of 4S-limonene synthase, a monoterpene cyclase from the

glandular trichomes of peppermint (Mentha x piperita) and spearmint (Mentha

spicata). Journal of Biological Chemistry 267:7582-7587.

4. Arraiza M.P.; Arrabal C.; López J.L.(2012). Seasonal variation of essential oil

yield and composition of sage (Salvia officinalis L.), grown in Castilla – La

Mancha (Central Spain). 5. Asllani U. (2004): Bimët mjekësore të vendit tonë. Monografi, Tiranë; 81-95

6. Asllani U. (2004): Bimët mjekësore të vendit tonë. Monografi, Tiranë; 81-95

7. Asllani U. (2000). Journal of Essential Oil Research 12(1):79-84

8. Asllani U. (2000). Journal of Essential Oil Research 12(1):79-84.

9. Avise J.C. (1994). Molecular Markers, Natural History, and Evolution.

Chapman & Hall, New York (511 pp.).

10. Babani F.; Toska V.; Koci K.; Bacu A.; Misiri E. (2005). Genetical and

chemical characterization of four populations of Salvia officinalis. Stud. Biol.

No10, 69-77, 2005.

11. Babani F.; Toska V.; Koci K.; Bacu A.; Misiri E. (2005). Genetical and

chemical characterization of four populations of Salvia officinalis. Stud. Biol.

No10, 69-77, 2005. 12. Grazhdani A., Makris. A, Owen C.; 2003. Use of the restriction analysis as a useful

tool for the identification of the differences among PCR amplified products of TPS

gene fragments. Stud. Biol.

13. Grazhdani-Bacu A., Makris.A, Owen.C, 2004. Expression patterns of two

unique MTP gene fragments isolated from Salvia officinalis and Salvia

fruticosa, Biological Studies 8/2004: 3-8.

14. Bacu A.; Babani F. (2005).Molecular characterization of Salvia officinalis

andSalvia triloba grown in Albania. AJNTS (Albanian Journal of Natural and

Technical Sciences), 2005.Pg 65-71. ISSN: 2074-0867.

15. Bacu A.; Loeser C.; Marko O.; Appenroth K. (2011). Amplified length

polymorphisms (AFLP) group populations of Salvia officinalis of Albania in

accordance to their geographical locations. International Journal of Ecosystem

and Environment Research (IJEES). ISBN: 978-9928-4068-0-4. Vol I, Issue 1.

2011. Pg.172-176.

16. BacuA. (2012). Baza të Bioteknologjisë Molekulare.

17. Badenes M. L. and Parfitt D. E., (1995). Phylogenetic relationships of the

cultivated Prunus species from an analysis of chloroplast DNA

variation. Theor. Appl. Genet. 90: 1035–1041.

18. Bailey L.H. (1924). "Manual of Cultivated Plants" 1924

19. Baldauf S.L.; Palmer J.D. (1990) Evolutionary transfer of the chloroplast tufA

gene to the nucleus. 344-262-265

BIBLIOGRAFIA

79

20. Baricevic D.; Bartol T. (2000). The biological pharmacological activity of the

Salvia genus V., In: Kintzios, S. E. The Genus Salvia Haewood Academic

Publishers, Amsterdam, 2000.

21. Belhattab R.; Larous L.; Figueiredo A.C.; Santos-Gomes P.A.; Barroso J.G.;

Pedro L.G. (2005).Origanum glandulosum Desf. grown wild in Algeria:

essential oil composition and glycosidic bound volatiles. Flavour Fragrance J

2005;20: 209–12.

22. Bernotienė G.; Nivinskienė O.; Butkienė R.; and Mockutė D. (2007). Essential

oil composition variability in sage (Salvia officinalisL.). CHEMIJA. 2007.

Vol. 18. No. 4. P. 38–43

23. Bick, J.A. and B.M. Lange (2003) Metabolic cross talk between cytosolic and

plastidial pathways of isoprenoid biosynthesis: Unidirectional transport of

intermediates across the chloroplast envelope membrane. Archives of

Biochemistry and Biophysics 415:146-154

24. Bohlmann J.; Steele C.L.; Croteau R. (1998) Monoterpene synthases from

grand fir (Abies grandis): cDNA isolation, characterization and functional

expression of myrcene synthase, (−)-4S-limonene synthase and (−)-(1S,5S)-

pinene synthase. J Biol Chem. 1997;272:21784–21792. [PubMed]

25. Bohlmann J.;Phillips M.; Ramachandiran V.;Katoh S.;Croteau R. (1999):

cDNA Cloning, Characterization, and Functional Expression of Four Nee

Monoterpene Synthase Members of the Tpsd Gene Family from Grand Fir

(Abies grandis). Archives of Biochemistry and Biophysics. Vol. 368. Issue

2;232 – 243

26. Bohlmann, J.; Steele C.L.; and Croteau R. (1997). Monoterpene synthases

from grand fir (Abies grandis). cDNA isolation, characterization, and

functional expression of myrcene synthase, (-)-(4S)-limonene synthase, and (-

)-(1S,5S)-pinene synthase. Journal of Biological Chemistry 272:21784-21792.

27. Bohlmann J.; Martin D.; Oldham N.J. and Gershenzon J. (2000). Terpenoid

secondary metabolism in Arabidopsis thaliana: CDNA cloning,

characterization, and functional expression of a myrcene/(E)-beta-ocimene

synthase. Archives of Biochemistry and Biophysics 375:261-269.

28. Bohlmann J.; Meyer-Gauen G. and Croteau R. (1998b). Plant terpenoid

synthases: Molecular biology and phylogenetic analysis. Proceedings of the

National Academy of Sciences of the United States of America 95:4126-4133.

29. Bohlmann J.; Phillips M.; Ramachandiran V.; Katoh S. and Croteau R. (1999)

cDNA cloning, characterization, and functional expression of four new

monoterpene synthase members of the tpsd gene family from grand fir (Abies

grandis). Archives of Biochemistry and Biophysics 368:232–243.

30. Bohlmann J.; Meyer-Gauen G. and Croteau R. (1998): Plant terpenoid

synthases: Molecular biology and phylogenetic analysis. Proceedings of the

National Academy of Sciences. 95, 4126-4133

31. Boscherini G.; Morgante M.; Rossi P. (1994). Allozyme and chloroplast DNA

variation in Italian and Greek populations of Pinus

leucodermis. Heredity 73: 284–290.

32. Bouaziz M.; Yangui T.; Sayadi S.; Abdelhafidh and Dhouib. (2009)

Disinfectant properties of essential oils from Salvia officinalis L. cultivated in

Tunisia. Food Chem Toxicol. 2009; 47:2755–2760.

33. Bouvier F.; Rahier A. and Camara B. (2005). Biogenesis, molecular regulation

and function of plant isoprenoids. Progress in Lipid Research 44:357-429.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9268308






http://www.sciencedirect.com/science/journal/00039861

BIBLIOGRAFIA

80

34. Bown D.(1995)The herb Society of America: encyclopedia of herbs & their

uses. New York: Dorling Kindersley Publishing Inc. 1995. 563p.

35. Brown T.A. (2010). Gene cloning and DNA analysis: An introduction, 6th

Edition. Wiley-Blackwell.

36. Buckle J. (2003). Clinical Aromatherapy. New York: Churchill Livingstone.

37. Chamorro E.R.; Zambón S.N.; Morales W.G.; Sequeira A.F.; Velasco G.A.

(2011). Study of the Chemical Composition of Essential Oils by Gas

Chromatography. Gas Chromatography in Plant Science, Wine Technology,

Toxicology and Some Specific Applications. Pg 307-325

38. Chappell, J., F. Wolf, J. Proulx, R. Cuellar and C. Saunders (1995). Is the

reaction catalyzed by 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase a

rate-limiting step for isoprenoid biosynthesis in plants? Plant Physiology

109:1337-1343.

39. Cheng, A., Lou, Y., Mao, Y., Lu, S., Wang, L. and X. Chen. (2007): Plant

terpenoids: Biosynthesis and ecological functions. Journal of Integrative Plant

Biology. 49, 179-186

40. Christianson, D.W. (2006). Structural biology and chemistry of the terpenoid

cyclases. Chemical Reviews 106:3412-3442.

41. Clark, R.J. and Menary R.C. (1980a). Environmental effects on peppermint

(Mentha piperita L.). II. Effects of temperature on photosynthesis,

photorespiration and dark respiration in peppermint with reference to oil

composition. Australian Journal of Plant Physiology 7:693-697.

42. Clark, R.J. and Menary R.C. (1980b). Environmental effects on peppermint

(Mentha piperita L.). I. Effect of day length, photon flux density, night

temperature and day temperature on the yield and composition of peppermint

oil. Australian Journal of Plant Physiology 7:685-692.

43. Clebsch, B. (2003). The new book of Salvias, sages for every garden. Timber

Press, Portland, Oregon, U.S.A.

44. Colby, S.M. Alonso W.R.; Katahira E.J.; McGarvey D.J. and Croteau R.

(1993). 4S-limonene synthase from the oil glands of spearmint (Mentha

spicata). cDNA isolation, characterization, and bacterial expression of the

catalytically active monoterpene cyclase. Journal of Biological Chemistry

268:23016-23024.

45. Colson, M., Pupier R. and Perrin A. (1993). Biomathematical study of the

number of peltate glands on Mentha x piperita leaves. Canadian Journal of

Botany 71:1202-1211.

46. Couladis M.; Tzakou O.; Mimica-Dukic N.; Jancic R.; Stojanovic D. (2002).

Essential oil of Salvia officinalis L. from Serbia and Montenegro. Flavor and

Fragrance Journal. Volume 17, Issue 2 March/April 2002 Pages 119–126.

DOI: 10.1002/ffj.1065.

47. Croteau, R. (1987) Chem. Rev. 87,929–954

48. Croteau, R. (1992) in Recent Developments in Flavor and Fragrance

Chemistry(Hopp, R., and Mori, K., eds) pp. 263–273, VCH, Weinheim,

Germany

49. Croteau, R., Alonso, W. R., Koepp, A. E., and Johnson, M. A. (1994) Arch.

Biochem. Biophys. 309, 184–192

50. Croteau, R., and Karp, F. (1979) Arch. Biochem. Biophys. 198,512–522

BIBLIOGRAFIA

81

51. Crozier A.; Clifford M.N.; Yokota T., Jaganath I.B.; Marks S.C.; Saltmarsh

M. (2006). Secondary metabolites in fruits, vegetables, beverages and other

plant-based dietary components. Pg 208-302. Blackwell Publishing Ltd.

52. Curtis, S. E. and Clegg M.T. (1984) Molecular evolution of chloroplast DNA

sequences. Mol. Biol. Evol.1:29 l-301

53. Cusidó, R.M.; Palazón J.; Bonfill M.; Expósito O.; Moyano E. and Piñol M.T.

(2007). Source of isopentenyl diphosphate for taxol and baccatin III

biosynthesis in cell cultures of Taxus baccata. Biochemical Engineering

Journal 33:159-167.

54. Cvektovikj I.; Stefkov Gj.; Karapandzova M.; Kulevanova S.; Satovic Z.

(2015). Essential Oils and Chemical Diversity of Southeast European

Populations of Salvia officinalis L. Chemistry and biodiversity Journal.

Volume 12, Issue 7 July 2015 Pages 1025–1039. DOI:

10.1002/cbdv.201400273

55. David F., Scanlan F., Sandra P., Szelewski M. (2010): Analysis of essential oil

compounds using retention time locked methods and retention time databases,

Application, Agilent Technologies, 5988-6530EN

56. De Sortis A.; Di Pasquale G.; Dolce M.; Gregolo S.; Papa S.; Rettore G.F.

(2009). Linee guida per la riduzione della vulnerabilità di elementi non

strutturali arredi e impianti, Presidenza del Consiglio dei Ministri

Dipartimento della Protezione Civile (in Italian).

57. Demesure B.; Sodzi N. and Petit R. J. (1995). A set of universal primers for

amplication of polymorphic noncoding regions of mitochondrial and

chloroplast DNA in plants. _/ Mol. Ecol. 4: 129_/131.

58. Dhingdra A. and Folta M.K. (2005). ASAP: Amplification, sequencing and

annotation of plastomes. BMC Genomics 6: 176 doi: 10.1186/1471-2164-6-

176.

59. Downie S.R, Palmer J.D (1992a) Use of chloroplast DNA rearrangements in

reconstructing plant phylogeny. In: Soltis PS, Soltis DE, Doyle JJ (eds)

Molecular systematics of plants. Chapman and Hall, New York, pp 14-35.

60. Doyle, J.J., and J.L. Doyle, (1987): A rapid DNA isolation procedure for

small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem. Bull. v. 9: 11-15.

61. Dudareva N.; Cseke L.; Blanc VM.; Pichersky E. (1996) Evolution of floral

scent in Clarkia: novel patterns of S-linalool synthase gene expression in the

C. breweriflower. Plant Cell8:1137–1148

62. Dudareva, N.; Martin D.; Kish C..; Kolosova N.; Gorenstein N.; Faldt J.;

Miller B. and Bohlmann J. (2003). (E)-beta-ocimene and myrcene synthase

genes of floral scent biosynthesis in snapdragon: Function and expression of

three terpene synthase genes of a new terpene synthase subfamily. The Plant

Cell 15:1227-1241.

63. Dudareva N.; Andersson S.; Orlova I.; Gatto N.; Reichelt M.; Rhodes D.;

Boland W. and Gershenzon J. (2005). The nonmevalonate pathway supports

both monoterpene and sesquiterpene formation in snapdragon flowers.

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of

America 102:933-938.

64. Dumolin S.; Demesure B. and Petit R. J.(1995). Inheritance of chloroplast and

mitochondrial genomes in pedunculate oak investigated with an efficient PCR

method. Theor. Appl. Genet. 91: 1253–1256.

BIBLIOGRAFIA

82

65. Dweck A. C.(2000). The folklore and cosmetic use of various Salvia species,

in: Kintzios, S. E. (Ed.), Sage; The Genus Salvia. Harëood Academic

Publishers, Amsterdam, pp. 1-26.

66. Ebrahimabadi A.H.; Mazoochi A.; Kashi F.J.; Djafari-Bidgoli Z. and Batooli

H. (2010) Essential oil omposition and antioxidant and antimicrobial

properties of the aerial parts of Salvia eremophila Boiss. from Iran. Food

Chem Toxicol. 2010; 48(5):1371-6.

67. Eisenreich W.; Bacher A.; Arigoni D. and Rohdich F. (2004). Biosynthesis of

isoprenoids via the non-mevalonate pathway. Cellular and Molecular Life

Sciences 61:1401-1426.

68. Estevez J.M.; Cantero A.; Reindl A.; Reichler S. and Leon P. (2001). 1-deoxy-

D-xylulose-5-phosphate synthase, a limiting enzyme for plastidic isoprenoid

biosynthesis in plants. Journal of Biological Chemistry 276:22901-22909.

69. Fahn A. (1988). Secretory tissues in vascular plants. New Phytologist

108:229-257.

70. Fähnrich A.; Krause K.; Piechulla B. (2011): Product Variability of the

„Cineole Cassette‟ Monoterpene Synthases of Related Nicotiana Species.

Molecular Plant. Vol. 4. No. 6; 965 – 984

71. Falara V.;Akhtar T.A.; Nguyen T.T.H.;Spyropoulou E.A.;Bleeker

P.M.;Schauvinhold I.;Matsuba Y.;Bonini M.E.;Schilmiller A.L.;Last

R.L.;Schuurink R.C.;Pichersky E. (2011): The Tomato Terpene Synthase

Gene Family. Plant Physiology. Vol. 157 no. 2; 770 – 789

72. Farhat G.N.; Affara N.I. and Gali-Muhtasib H.U. (2001) Seasonal changes in

the composition of the essential oil extract of East Mediterranean sage (Salvia

libanotica) and its toxicity in mice. Toxicon. 2001; 39(10):1601-5.

73. Figueiredo A.C.; Barroso J.G.; Pedro L.G.; Scheffer J.J.C. (2008) Factors

affecting secondary metabolite production in plants: volatile components and

essential oils. Flavour Fragrance J 2008;23:213–26.

74. Gambliel H. and Croteau R. (1982) J. Biol. Chem. 257, 2335–2342

75. Gambliel, H., and Croteau, R. (1984) J. Biol. Chem. 259, 740–748

76. Gantt J. S.; Baldauf S.L.; Calie P.J.; Weeden N. F. & Palmer J. D. (1991)

Transfer of rpl22 to the nucleus greatly preceded its loss from the chloroplast

and involved the gain of an intron. EMBO J. 10, 3073–3078.

77. Gielly L. and Taberlet P. (1994). The use of chloroplast DNA to resolve plant

phylogenies: noncoding versus rbcL sequence. Mol. Biol. Evol. 11: 769–777.

78. Grausgruber-Gröger S.; Schmiderer C.; Steinborn R.; Novak J. (2012). Journal

of Plant Physiol. 2012. Mar 1;169(4):353-9. doi: 10.1016/j.jplph.2011.11.004.

Epub 2011. Seasonal influence on gene expression of monoterpene synthases

in Salvia officinalis (Lamiaceae).

79. Greenhagen B.T.; O‟Maille P.E.; Noel J.P.; and Chappell J. (2006).

Identifying and manipulating structural determinates linking catalytic

specificities in terpene synthases.

80. Güenther E. (1950). 3RD

Ed. The Essential Oils. D. Van Nostrand, New York

81. Hampel D.; Mosandl A. and Wust M. (2005). Biosynthesis of mono- and

sesquiterpenes in carrot roots and leaves (Daucus carota L.): Metabolic cross

talk of cytosolic mevalonate and plastidial methylerythritol phosphate

pathways. Phytochemistry 66:305-311.

82. Hedge I.C.; Tutin T.G.; Hetwood V.H.; Burges N.A.; Moore D.M.; Valentine,

D.H.; Walters S.M. and Webb D.A. (1972) (Eds.), Salvia L., in: Flora

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Grausgruber-Gr%C3%B6ger%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22196947

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Schmiderer%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22196947

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Steinborn%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22196947

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Novak%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22196947



BIBLIOGRAFIA

83

Europaea, vol. 3 Diapensiaceae to Myoporaceae, The Press Syndicate of the

University of Cambridge Publishers, Great Britain, pp 188-192.

83. Hemmerlin A.; Hoeffler J.F.; Meyer O.; Tritsch D.; Kagan I.A.;

Grosdemange-Billiard C.; Rohmer M and Bach T.J. (2003). Cross-talk

between the cytosolic mevalonate and the plastidial methylerythritol

phosphate pathways in tobacco bright yellow-2 cells. The Journal of

Biological Chemistry 278:26666-26676.

84. Huang J. C. and Sun M. (2000). Genetic diversity and relationships of

sweetpotato and its wild relatives in Ipomoea series Batatas (Convolvulaceae)

as revealed by intersimple sequence repeat (ISSR) and restriction analysis of

chloroplast DNA. _/ Theor. Appl. Genet. 100:1050_/1060.

85. Ibrahim R.I.H.; Sakamoto M. and Azuma J.I. (2012). PCR-RFLP and genetic

diversity analysis of cp-DNA in some species of the genus Salvia L.

Chromosome Botany 7: Pg 1-8

86. Ibrahim R.I.H.; Azuma, J.I.; and Sakamoto M. (2007). PCR_RFLP analysis of

the whole chloroplast DNA from three cultivated species of cotton

(Gossypium L.). Euphytica 156: 47-56

87. Ibrahim, R.I.H.; Azuma, J.I., and Sakamoto, M. (2006). Complete nucteotide

sequence of the cotton (Gossypium barbadense L.) chloroplast genome with a

comparative analysis of sequence among 9 dicot plants. Gen. Genet. Syst.

81:311-321

88. Orhan I.; Kartal M.; Kan Y. and Sener B. (2008) Activity of Essential Oils and

Individual Components against Acetyl-and Butyrylcholinesterase. Z.

Naturforsch. 2008; 63c, 547-553.

89. Itani W.S.; El-Banna S.H.; Hassan S.B.; Larsson R.L.; Bazarbachi A and Gali-

Muhtasib H.U. (2008) Anti colon cancer components from Lebanese sage

(Salvia libanotica) essential oil. Cancer Biol Ther. 2008; 7(11): 1765-73.

90. Jiang R.W.; Lau K.M.; Hon P.M.; Mak T.C.; Woo, K.S. and Fung K.P. (2005)

Chemistry and biological activities of caffeic acid derivatives from Salvia

miltiorrhiza. Curr. Med. Chem., 12, 237-246.

91. Jug-Dujakovic M.;Ristic M.;PljevljakusicD.;Dajic´-Stevanovic Z.;Liber

Z.;Hancevic K.; Radic T.;Sˇatovic Z. (2012). High Diversity of Indigenous

Populations of Dalmatian Sage (Salvia officinalis L.) in Essential-Oil

Composition. CHEMISTRY & BIODIVERSITY – Vol. 9 (2012). Pg. 2309-

2324.

92. Juhás S.; Cikos S.; Czikková S.; Veselá J.; Il'ková G.; Hájek T.; Domaracká

K.; Domaracký M.; Bujnáková D.; Rehák P. and Koppel J. (2008) Effects of

Borneol and Thymoquinone on TNBS-Induced Colitis in Mice. Folia Biol

(Praha). 2008; 54(1): 1-7.

93. Kamatou G.P.P.; Makunga N.P.; Ramogola W.P.N. and Viljoen A.M. (2008).

South Africa Salvia species: a revieë of biological activities and

phytochemistry. J. Ethnopharmacol., 119, 664-672.

94. Kampranis S.C.; Ioannidis D.; Purvis A.; Mahrez W.; Ninga E.; Katerelos

N.A. (2007). Rational conversion of substrate and product specificity in a

Salvia monoterpene synthase: structural insights into the evolution of terpene

synthase function.Plant Cell19 1994–2005. 10.1105/tpc.106.047779 [PMC

free article][PubMed][Cross Ref]

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1955729/



https://dx.doi.org/10.1105%2Ftpc.106.047779

BIBLIOGRAFIA

84

95. Karousou R.; Hanlidou E. and Kokkini S. (2000). The sage plants of Greece:

distribution and infraspecific variation, in: Kintzios, S. E. (Ed.), Sage; The

Genus Salvia. Harëood Academic Publishers, Amsterdam, pp 27-46.

96. Kathe A.; Honnef S.; Heym A. (2000) Medicinal and Aromatic Plants in

Albania, Bosnia-Herzegovina, Bulgaria, Croatia and Romania‖, Bonn,

Germany 2000, fq.65

97. Kennedy D.O.; Dodd F.L.; Robertson B.C.; Okello E.J.; Reay J.L.; Scholey

A.B. and Haskell C.F. (2011) Monoterpenoid extract of sage (Salvia

lavandulaefolia) with cholinesterase inhibiting properties improves cognitive

performance and mood in healthy adults. J Psychopharmacol. 2011; 25(8):

1088-1100.

98. Kongjika E.; Bacu A.; Papajani V. (2005). "Scientific assessment of some

aromatic medicinal plants, their cultivation perspective", coauthor, Tirana

2005, ISBN 99943-656-7-3.

99. Külheim C.; Padovan A.; Hefer C.; Krause S.T.; Köllner T.G.; Myburg

A.A.; Degenhardt J.; Foley W.J. (2014): The Eucalyptus terpene synthase gene

family. BMC Genomics. DOI 10.1186/s12864-015-1598-x

100. Lane A.; Boecklemann A.; Woronuk G.N.; Sarker L.; Mahmoud S.S. (2010) A

genomics resource for investigating regulation of essential oil production in

Lavandula angustifolia. Planta 2010;231:835–45.

101. Laule O.; Furholz A.; Chang H.S.; Zhu T.; Wang X.; Heifetz P.B.; Gruissem

W. and Lange M. (2003). Crosstalk between cytosolic and plastidial pathways

of isoprenoid biosynthesis in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the

National Academy of Sciences of the United States of America 100:6866-

6871.

102. Leung A.Y.; Foster S. (1996). Encyclopaedia of common natural ingredients

used in food, drugs and cosmetic s, Wiley, New York. 2nd ed: pp. 173-17

103. Lewinsohn E.; Gijzen M.; and Croteau R. (1992) Arch. Biochem. Biophys.

293, 167–173

104. LI Q.Q.; Hui LI M.; Yuan J-Q.; Cui H.Zh.; Huang. Q. L.; Xiao P-G. (2013).

Phylogenetic relationships of Salvia (Lamiaceae) in China: Evidence from

DNA sequence datasets. Journal of Systematics and Evolution 51 (2): 184–195

(2013) doi: 10.1111/j.1759-6831.2012.00232.x

105. Li M.H.; Chen J.M.; Peng Y.; Wu Q. and Xiao, P.G. (2008). Investigation of

Danshen and related medicinal plants in China. J. Ethnopharmacol., 120, 419-

426.

106. Lichtenthaler H.K. (1999). The 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate pathway of

isoprenoid biosynthesis in plants. Annual Review of Plant Physiology and

Plant Molecular Biology 50:47-65.

107. Lima C.F.; Carvalho F.; Fernandes E.; Bastos M.L.; Santos-Gomes P.C.;

Fernandes-Ferreira M. and Pereira-Wilson C. (2004) Evaluation of

toxic/protective effects of the essential oil of Salvia officinalis on freshly

isolated rat hepatocytes. Toxicol In Vitro. 2004; 18(4): 457-65.

108. Liu Y.; Wang H.Y andLi G. (2005). Advances in the plant isoprenoid

biosynthesis pathway and its metabolic engineering. Journal of Integrative

Plant Biology 47:769-782.

109. Loizzo M.R.; Menichini F.; Tundis R.; Bonesi M.; Nadjafi F.; Saab A.M.;

Frega N.G. and Menichini F. (2010) Comparative Chemical Composition and

Antiproliferative Activity of Aerial Parts of Salvia leriifolia Benth. and Salvia

BIBLIOGRAFIA

85

acetabulosa L. Essential Oils Against Human Tumor CellIn Vitro Models. J

Med Food. 2010; 13(1):62-9.

110. Loizzo M.R.; Tundis R.; Menichini F.; Saab A.M.; Statti G.A. and Menichini

F. (2007) Cytotoxic Activity of Essential Oils from Labiatae and Lauraceae

Families Against In Vitro Human Tumor Models. Anticancer Res. 2007;

27(5A): 3293-9.

111. Lücker J.;El Tamer M.K.;Scheab E.;Verstappen F.E.;Van der Plas

L.H.;Bouemeester H.J.;Verhoeven H.A. (2002): Monoterpene biosynthesis in

lemon (Citrus limon). cDNA isolation and functional analysis of four

monoterpene synthases. Eur J Biochem. 269(13):3160-71

112. MacMillan, J. (2001). Occurrence of gibberellins in vascular plants, fungi, and

bacteria. Journal of plant growth regulation, 20 (4), 387 - 442.

113. Mahmoud S.S. and Croteau R.B. (2001). Metabolic engineering of essential

oil yield and composition in mint by altering expression of deoxyxylulose

phosphate reductoisomerase and menthofuran synthase. Proceedings of the

National Academy of Sciences of the United States of America 98:8915-8920.

114. Mahmoud S.S. and Croteau R.B. (2003). Menthofuran regulates essential oil

biosynthesis in peppermint by controlling a downstream monoterpene

reductase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United

States of America 100:14481-14486.

115. Mahmoud S.S.; Williams M. and Croteau R. (2004) Cosuppression of

limonene-3-hydroxylase in peppermint promotes accumulation of limonene in

the essential oil. Phytochemistry 65:547-554.

116. Maric S.; Maksimovic M.; Milos M. (2006) The impact of the locality

altitudes and stages of development on the volatile constituents of Salvia

officinalis L. from Bosnia and Herzegovina. J Essent Oil Res 2006;18:178–80.

117. McCaskill D. and Croteau R. (1995). Isoprenoid synthesis in peppermint

(Mentha x piperita): Development of a model system for measuring flux of

intermediates through the mevalonic acid pathway in plants. Biochemical

Society Transactions 23:290S.

118. McConkey M.E.; Gershenzon J.; Croteau R.B. (2000) Developmental

regulation of monoterpene biosynthesis in the glandular trichomes of

peppermint.Plant Physiol122:215–223

119. McGarvey D.J. and Croteau R. (1995). Terpenoid metabolism. The Plant Cell

7:1015-1026.

120. McGeady P. and R. Croteau (1995). Isolation and characterization of an

active-site peptide from a monoterpene cyclase labelled with a mechanism-

based inhibitor. Archives of Biochemistry and Biophysics 317:149-155.

121. Menghini L.; Leporini L.; Pintore G.; Chessa M.; Tirillini B. (2012). Essential

oil content and composition of three sagevarieties grown in Central Italy.

Journal of Medicinal Plants Research Vol. 7(9), pp. 480-489, 3 March,

2013 Available online at

http://www.academicjournals.org/JMPRDOI:10.5897/JMPR012.960ISSN

1996-0875 ©2013 Academic Journals.

122. Mitchell L.E.; Savage T.

J.; Katahira E. and Croteau R. (1998): Monoterpene synthases from Common

Sage (Salvia officinalis) The Journal of Biological Chemistry. Vol 273. No.

24; 14891 – 14899

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=L%C3%BCcker%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12084056

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=El%20Tamer%20MK%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12084056

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Schwab%20W%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12084056

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Verstappen%20FW%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12084056

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=van%20der%20Plas%20LH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12084056

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=van%20der%20Plas%20LH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12084056

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Bouwmeester%20HJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12084056

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Verhoeven%20HA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12084056

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12084056

BIBLIOGRAFIA

86

123. Moss L.; Rouseaa M.; Wesnes K.A. and Moss M. (2010) Differential effects

of the aromas of Salvia species on memory and mood. Hum Psychopharmacol

Clin Exp. 2010; 25: 388–396.

124. Nugent J.M. and Palmer J.D. (1991) RNA-mediated transfer of the gene cox

II from the mitochondrion to the nucleus during flowering plant evolution.

Cell 66: 473–481

125. Nuro A.;Shëngjergji D.; Dama A.; Napuçe A.; Borshi Xh.; Salihila J. (2016)

“Characterization Of Thymus Vulgaris Essential Oil Using Gc/Fid Technique.

Case Study: Populates From North Albania - Karakterizimi Kimik Me Gc/Fid

I Vajit Esencial Për Timus Vulgaris. Rast Studimi Popullata Nga Veriu I

Shqipërisë” Revistë shkencore e Albanian University. Nr 3 Fq 25-32 (2016)

ISSN 2220 – 461X

126. Nuro A.; Salihila J.; Marku E.; Shëngjergji D.; Napuçe A.; Dama A. (2015)

“Study by chromatographic techniques of essential Oil for Pinus Nigre

populations, Albania - Studimi me teknikën e kromatografisë të gaztë i vajit

esencial për popullatën e Pinus Nigre, Shqipëri” Nr 3 Fq 19-25 (2015) ISSN

2220 – 461X

127. Nuro A.; Salihila J.; Shëngjergji D.; Napuce A.; Dama A. (2015) “Chemical

analyze of Essential Oil of Helichrysum Italicum in North Albania - Analiza

kimike e vajit esencial për Helichrysum Italicum nga Veriu i Shqipërisë”

Revista “Optime” Reviste shkencore e Albanian University.Nr 3 Fq 25-32

(2015) ISSN 2220 – 461X

128. Nuro A.; Salihila J.; Marku E. (2015) “Analiza me GC/FID e

esencavetëdëllinjëstëkuqe (Juniperusoxycedrus L.) dhedëllinjëstë zezë

(Juniperuscommunis L.) ngadisa zona tëvendittonë” “Buletini i Shkencave te

Natyrës”, Nr 19 Fq 158-167 (2015) Tiranë. www.fshn.edu.al/buletini

129. Palmer J.D. (1987). Chloroplast DNA evolution and biosystematic uses of

chloroplast DNA variation. Am.Nat. 130:6-29.

130. Papadhopuli G. (1976) Bimët mjekësore dhe aromatike të Shqipërisë, Tiranë

1976, fq.340

131. Papageorgiou V.; Gardeli C.; Mallouchos A.; Papaioannou M. and Komaitis

M. (2008) Variation of the chemical profile and antioxidant behavior of

Rosmarinus officinalis L. and Salvia fruticosa Miller grown in Greece. J Agric

Food Chem. 2008; 56(16):7254-64.

132. Parani M.; Rajesh K.; Lakshmi M. (2001). Species identification in seven

small millet species using polymerase chain reaction restrition fragment length

polymorphism of trnS-psbC gene region. _/ Genome 44:495_/499.

133. Parducci L. and Szmidt A.E. (1999). PCR-RFLP analysis of cpDNA in the

genus Abies. _/ Theor. Appl. Genet. 98: 802_/808.

134. Paré P.W.; Tumlinson J.H. (1997) De Novo Biosynthesis of Volatiles lnduced

by lnsect Herbivory in Cotton Plants. Paré PW et al., Plant Physiol 1997, 114,

1161.

135. Peana A.; Satta M.; Moretti M.D. and Orecchioni M. (1994) A study

oncholeretic activity of Salvia. Planta Med. 1994; 60(5):478-9.

136. Pemberton E.; Turpin P.G. (2008) The Effect of Essential Oils on Work-

Related Stress in Intensive Care Unit Nurses. Holist Nurs Pract. 2008; 22(2):

97–102.

http://www.fshn.edu.al/buletini

BIBLIOGRAFIA

87

137. Perry N.S.L.; Houghton P.J.; Jenner P.; Keith A. and Perry E.K. (2002) Salvia

lavandulaefolia essential oil inhibits cholinesterase in vivo. Phytomedicine.

2002; 9: 48–51.

138. Perry N.SL.; Houghton P.J.; Theobald A.; Jenner P. and Perry E.K. (2000)

Invitro inhibition of human erythrocyte acetylcholinesterase by salvia

lavandulaefolia essential oil and constituent terpenes. J Pharm Pharmacol.

2000; 52(7): 895-902.

139. Pichersky E.;. Raguso R.A.; Lewinsohn E. and Croteau R. (1994). Floral scent

production in Clarkia (Onagraceae) (I. localization and developmental

modulation of monoterpene emission and linalool synthase activity). Plant

Physiology 106:1533-1540.

140. Pitarevic I.; Kuftinec J.; Blazevic N.; Kustrak D. (1984) Seasonal variation of

essential oil yield and composition of Dalmatian sage, Salvia officinalis. J

Nat Prod 1984;47:409–12.

141. Pitarokili D.; Tzakou O.; Loukis A. and Harvala C. (2003) Volatile

metabolites from Salvia fruticosaas antifungal agents in soilborne pathogens. J

Agric Food Chem. 2003; 51(11):3294-301.

142. Porte A.; Godoy R.L.O.; Maia-Porte L.H. (2013). Chemical composition of

sage (Salvia officinalisL.) essential oil from the Rio de Janeiro State (Brazil).

Rev. Bras. Pl. Med., Campinas, v.15, n.3, p.438-441, 2013.

143. Putievsky E.; Ravid U.; Dudai N. (1986) The influence of season and harvest

frequency on essential oil and herbal yields from a pure clone of sage (Salvia

officinalis L.), grown under cultivation conditions. J Nat Prod 1986;49:326–9.

144. Pyun H.J.; Wagschal K.C.; Jung D.I.; Coates R.M. and Croteau R. (1994)

Arch. Biochem. Biophys. 308,488–496

145. Rademacher W. (2000). Growth retardants: Effects on gibberellin biosynthesis

and other metabolic pathways. Annu. Rev. Plant Physiol. Mol. Biol. 51:510–

531.

146. Raguso R.A. and Pichersky E (1999). New perspectives in pollination biology:

Floral fragrances. A day in the life of a linalool molecule: Chemical

communication in a plant-pollinator system. Part 1: Linalool biosynthesis in

flowering plants. Plant Species Biology 14:95-120.

147. Ritland K. and Clegg M.T. (1987) Evolutionary analysis of plant DNA

sequences. Am Nat 130:$74-100

148. Rodriguez-Concepcion M.I.; Ahumada E.; Diez-Juez S.; Sauret-Gueto L.M.;

Lois F.; Gallego L.; Carretero-Paulet N.; Campos and Boronat A. (2001). 1-

deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase and plastid isoprenoid

biosynthesis during tomato fruit ripening. The Plant Journal: For Cell and

Molecular Biology 27:213-222.

149. Rodriguez-Concepcion, M.; Fores O.; Martinez-Garcia J.F.; Gonzalez V.;

Phillips M.A.; Ferrer A. and Boronat A. (2004). Distinct light-mediated

pathways regulate the biosynthesis and exchange of isoprenoid precursors

during Arabidopsis seedling development. Plant Cell 16:144-156.

150. Rohmer M.; Knani M.; Simonin P.; Sutter B. and Sahm H. (1993). Isoprenoid

biosynthesis in bacteria: A novel pathway for the early steps leading to

isopentenyl diphosphate. The Biochemical Journal 295:517-524.

151. Rota C.; Carraminand J.J.; Burillo J. and HERRERA A. (2004) In Vitro

Antimicrobial Activity of Essential Oils from Aromatic Plants against Selected

Foodborne Pathogens. J Food Prot. 2004; 67:1252–1256.

BIBLIOGRAFIA

88

152. Saeidnia S.;Gohari A.R.;Haddadi A.;Amin G.;Nikan M.;Hadjiakhoondi A.

(2014): Presence of monoterpene synthase in four Labiatae species and Solid-

Phase Microextraction- Gas chromatography-Mass Spectroscopy analysis of

their aroma profiles. Pharmacognosy Res; 138–142. doi: 10.4103/0974-

8490.129033

153. Said-Al Ahl H.; Hussein M.S.; Gendy A. S.H.; Tkachenko K.G. (2015).

Quality of Sage (Salvia officinalis L.) Essential Oil Grown in Egypt .

International Journal of Plant Science and Ecology Vol. 1, No. 4, 2015, pp.

119-123 http://www.aiscience.org/journal/ ijpse

154. Sambrook J.; Fritsch E.F.;& Maniatis,T. (1989). Molecular Cloning: A

Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor

Laboratory Press, ISBN 0-87969-309-6.

155. Saoealuck B.; Paisooksantivatana Y.; Eeimer B.C.; Choepongpang S. (2014):

Molecular Cloning and expression levels of the monoterpene synthase gene

(ZMM1) in cassumunar ginger (Zingiber Montanum (Koenig) Link Ex Dietr.).

Arch. Biol. Sci., Belgrade, 66(4). 1321 – 1331.

156. Sarac N. and Ugur A.(2008) The in vitro antimicrobial activities of the

essential oils of some Lamiaceae species from Turkey. J Med Food. 2008;

12(4): 902–907.

157. Savage T. J.; Hatch M.W.; and Croteau R. (1994) J. Biol. Chem. 269,4012–

4020.

158. Savage T.J.; Hume H.I.; Little S.D.; D.B.; and Croteau R. (1995) Arch.

Biochem. Biophys. 320,257–265

159. Savage T.J.; Hatch M.E. and Croteau R. (1994): Monoterpene Synthases of

Pinus contorta and Related Conifers. The Journal of Biological Chemistry.

Vol. 269. No. 6; 4012 – 4020

160. Schmiderer C.; Grausgruber-Gröger S.; Grassi P.; Steinborn R.; Novak J.

(2010) Influence of gibberellin and daminozide on the expression of terpene

synthases in common sage (Salvia officinalis). J Plant Physiol 2010;167:779–

86.

161. Schuhr C.A.; Radykewicz T.; Sagner S.; Latzel C.; Zenk M.H.; Arigoni D.;

Bacher A.; Rohdich F. and Eisenreich W. (2003). Quantitative assessment of

crosstalk between the two isoprenoid biosynthesis pathways in plants by NMR

spectroscopy. Phytochemistry Reviews 2:3-16.

162. Schwab W.; Fuchs C.; Huang F.C. (2013). Transformation of terpenes into

fine chemicals.

163. Senol F.S.; Orhan I.E.; Erdem S.A.; Kartal M.; Sener B.; Kan Y.; Celep F.;

Kahraman A. and Dogan M. (2011) Evaluation of Cholinesterase Inhibitory

and Antioxidant Activities of Wild and Cultivated Samples of Sage (Salvia

fruticosa) by Activity- Guided Fractionation. J Med Food. 2011; 14(11):1476-

83.

164. Shelton D.A.; Zabaras D.; Chohan S.; Eyllie S.G.; Baverstock P.R.; Leach

D.N. & Henry R.J. (2004): Isolation and partial characterization of a putative

monoterpene synthase from Melaleuca alternifolia. Plant Physiology and

Biochemistry. Vol. 42. No. 11; 875-882.

165. Shimada T.; Endo T.; Fujii H.; Hara M. and Omura M. (2005): Isolation and

characterization of (E)-beta-ocimene and 1,8 cineole synthases in Citrus

unshiu Marc. Plant Science. 168, 987-995


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Gohari%20AR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24761118

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Haddadi%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24761118

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Amin%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24761118

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Nikan%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24761118

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Hadjiakhoondi%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24761118


https://dx.doi.org/10.4103%2F0974-8490.129033

https://dx.doi.org/10.4103%2F0974-8490.129033

BIBLIOGRAFIA

89

166. Sonbol A.; Babakhani B. and Mehrabian A.R.(2006) Antimicrobial Activity of

Six Constituents of Essential Oil from Salvia. Z. Naturforsch. 2006; 61 c:

160–164.

167. Stagos D.; Portesis N.; Spanou C.; Mossialos D.; Aligiannis N.; Chaita E.;

Panagoulis C.; Reri E.; Skaltsounis L.; Tsatsakis A.M. and Kouretas D. (2012)

Correlation of total polyphenolic content with antioxidant and antibacterial

activity of 24 extracts from Greek domestic Lamiaceae species. Food Chem

Toxicol. 2012; 50(11):4115-24

168. Staudt M. and Seufert G. (1995). Light-dependent emission of monoterpenes

by holm oak (Quercus ilex L.). Naturwissenschaften 82:89-92.

169. Steele C.L.; Lewinsohn E.and Croteau R. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U.

S. A. 92, 4164–4168

170. Steinborn M.B.; Langner R. (2012) Arousal modulates temporal preparation

under increased time uncertainty: evidence from higher-order sequential foto-

reperiod effects. Acta Psychol (Amst) 139: 65–76, 2012.

171. Stesevic D.; Ristic M.; Nikolic V.; Nedovic M.; Cakovic D.; Satovic Z.

(2014). Chemotype Diversity of Indigenous Dalmatian Sage (Salvia officinalis

L.) Populations in Montenegro. Chemistry and Biodiversity Journal. Volume

11, Issue 1 January 2014 Pages 101–114. DOI: 10.1002/cbdv.201300233

172. Taberlet P.; Gielly L.; Pautou G. (1991). Universal primers for amplification

of three non-coding regions of chloroplast DNA. Plant Mol. Biol. 17: 1105–

1109.

173. Tenore G.C.; Ciampaglia R.; Arnold N.A.; Piozzi F.; Napolitano F.; Rigano D.

and Senatore F. (2011) Antimicrobial and antioxidant properties of the

essential oil of Salvia lanigera from Cyprus. Food Chem Toxicol. 2011;

49(1):238-43.

174. Terra D.L.; Lonzarich V.; Asquini E.; Navarini L.; Graziosi G.;Liverani

F.S.;Pallavicini A. (2013): Functional characterization of three Coffea arabica

L. monoterpene synthases: Insights into the enzymatic machinery of coffee

aroma. Phytochemistry. Vol. 89; 6 – 14

175. Tildesley N.T.J.; Kennedy D.O.; Perry E.K.; Ballard C.G.; Wesnes K.A. and

Scholeya A.B.(2005) Positive modulation of mood and cognitive performance

following administration of acute doses of Salvia lavandulaefolia essential oil

to healthy young volunteers. Physiol Behav. 2005; 83:699–709

176. Topcu G.; Turkmen Z.; Schilling J.K.; Kingston D.G.I.; Pezzuto J.M.&

Ulubelen A. (2008) Cytotoxic Activity of Some Anatolian Salvia. Extracts and

Isolated Abietane Diterpenoids, Pharmaceutical Biology, 46:3, 180-184, DOI:

10.1080/13880200701735411

177. Trapp S.C. and Croteau R.B. (2001). Genomic organization of plant terpene

synthases and molecular evolutionary implications. Genetics 158:811-832.

178. Tsumura Y.; Kawahara T.; Wickneswari R. (1996). Molecular phylogeny of

Dipterocarpaceae in south-east Asia using RFLP of PCR-amplified chloroplast

genes. _/ Theor. Appl. Genet. 93: 22_/29.

179. TurnerG.W. and Croteau R. (2004). Organization of monoterpene biosynthesis

in Mentha. Immunocytochemical localizations of geranyl diphosphate

synthase, limonene-6-hydroxylase, isopiperitenol dehydrogenase, and

pulegone reductase. Plant Physiology 136:4215-4227.

180. Turner G.W.; Gershenzon J. and Croteau R.B. (2000a). Development of

peltate glandular trichomes of peppermint. Plant Physiology 124:665-680.









BIBLIOGRAFIA

90

181. Velickovic D.T.; Randjelovic N.V.; Ristic M.S.; Velickovic A.S.; Smelcerovic

A.A. (2003). Chemical constituents and antimicrobial activity of the ethanol

extracts obtained from the flower, leaf and stem of Salvia officinalis L., J.

Serb. Chem. Soc. 68:17-24.

182. Velikova V.; Loreto F.; Tsonev T.; Brilli F. and Edreva A. (2006). Isoprene

prevents the negative consequences of high temperature stress in Platanus

orientalis leaves. Functional Plant Biology 33:1-10.

183. Vicario F.; Vendramin G.; Rossi P. (1995). Allozyme, chloroplast DNA and

RAPD markers for determining genetic relationships between Abies alba and

the relic population of Abies nebrodensis. Theor. Appl. Genet. 90:1012–1018.

184. Vukovic´-Gacˇic´ B.; Nikcˇevic´ S.; Beric´-Bjedov T.; Knezˇevic ´-Vukcˇevic´

J. and Simic´ D. (2006). Antimutagenic effect of essential oil of sage (Salvia

officinalis L.) and its monoterpenes against UV-induced mutations in

Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae. Food Chem. Toxicol. 2006;

44: 1730–1738.

185. Wagschal K.C.; Pyun H.J.; Coates R.M. and Croteau R. (1994) Arch.

Biochem. Biophys. 308,477–487

186. Wagschal K.; Savage T.J. and Croteau, R. (1991) Tetrahedron 47, 5933–5944

187. Walker J.B.; Sytsma K.J.; Treutlein J.; Winks M. (2004)Salvia(Lamiaceae) is

not monophyletic: Implications for the sys-tematic, radiations and ecological

specializations of Salvia and tribe Mentheae. Am J Bot. 91(7):1115–1125

188. Wang G. Z.; Matsuoka Y. and Tsunewaki K. (2000). Evolutionary features of

chondriome divergence inTriticum(wheat) and Aegilops shown by RFLP

analysis of mitochondrial DNAs. Theor. Appl. Genet. 100:221–231.

189. Whittington D.A.; Wise M.L.; Urbansky M.; Coates R.M.; Croteau R.B. and

Christianson D.W. (2002). Bornyl diphosphate synthase: Structure and

strategy for carbocation manipulation by a terpenoid cyclase. Proceedings of

the National Academy of Sciences of the United States of America 99:15375-

15380.

190. Wichtl M.; Brinckmann J.A.; Lindenmaier M.P. (2004) trans. Herbal Drugs

and Phytopharmaceuticals. 3rd ed. Stuttgart: Medpharm GmbH Scientific

Publishers; 2004.

191. Wise M.L.and Croteau R. (1998) in Comprehensive Natural Products

Chemistry: Isoprenoids (Cane, D. E., ed) Vol. 2, Elsevier Science, Oxford,UK,

in press

192. Wise M.L. and Croteau R. (1998) in Comprehensive Natural Products

Chemistry: Isoprenoids (Cane, D. E., ed) Vol. 2, Elsevier Science, Oxford,UK,

in press

193. Wise M.L.; Savage T.J.; Katahira E. and Croteau R. (1998). Monoterpene

synthases from common sage (Salvia officinalis). cDNA isolation,

characterization, and functional expression of (+)-sabinene synthase, 1,8-

cineole synthase, and (+)-bornyl diphosphate synthase. Journal of Biological

Chemistry 273:14891-14899.

194. Xie Z.; Kapteyn J.; Gang D.R. (2008) A systems biology investigation of the

MEP/terpenoid and shikimate/phenylpropanoid pathways points to multiple

levels of metabolic control in sweet basil glandular trichomes. Plant J 2008;54:

349–61

BIBLIOGRAFIA

91

195. Xu D.H.; Abe A.; Kanazawa A. (2001). Identification of sequence variations

by PCR-RFLP and its application to the evaluation of cpDNA diversity in wild

and cultivated soybeans. Theor. Appl. Genet. 102:683–688.

196. Yousefzadi M.; Sonboli A.; Ebrahimi S.N. and Hashemi S.H. (2007)

Antimicrobial Activity of Essential Oil and Major Constituents of Salvia

chloroleuca. Z. Naturforsch. 2007; 63c:337–340.

197. Yumrutas O.; Sokmen A.; Akpulat H.A.; Ozturk N.; Daferera D.; Sokmen M.

and Tepe B. (2012) Phenolic acid contents, essential oil compositions and

antioxidant activities of two varieties of Salvia euphratica from Turkey. Nat

Prod Res. 2012; 26 (19):1848-51.

198. Zapata F.;Fine P.V.A. (2013): Diversification of the monoterpene synthase

gene family (TPSb) in Protium, a highly diverse genus of tropical

trees.Molecular Phylogenetics and Evolution. Vol. 68, Issue 3; 432 – 442

199. Zhang M.; Liu J.; Li K.; Yu D. (2013). Identification and Characterization of a

Novel Monoterpene Synthase from Soybean Restricted to Neryl Diphosphate

Precursor. PLoS ONE 8(10): e75972. doi:10.1371/journal.pone.0075972

200. ZURAWSKI G.and CLEGG M.T. (1987) Evolution of higher-plant

chloroplast DNA-en- coded genes: implications for structure-function and

phylogenetic studies. Annu. Rev. Plant Physiol. 38:39 l-4 18




http://www.sciencedirect.com/science/journal/10557903/68/3

ANEKSE

92

ANEKS I

Përbërja e buferit të ekstraktimit të ADN-së sipas Doyle&Doyle 1987

50 mM Tris pH 8.0

50 Mm EDTA pH 8.0

0,4 M LiCl.

CTAB 1%

PVP 2%

TWEEN 20 2%

NaCl 1,1M

Përbërja e buferit të ekstraktimit CTAB.

20 mM EDTA

0,1 M Tris-HCl pH 8.0

14M NaCl

CTAB 2 % dhe β-merkapto etanol 0,4 %, i cili shtohet menjëherë para

përdorimit.

ANEKSE

93

ANEKS II

Përbërja e buferit të ekstraktimit (100 ml) të ARN-së:

10 ml buffer glicinë 10 X

20 ml 10% SDS (sodium dodecyl sulphate)

10 ml 10% NLS (N-lauryl sarcosine)

+60 ML H2O

ANEKSE

94

ANEKS III

Rezultatet e pike-ve bazuar në kromatogramat e analizuara me GC-FID të

sherbelës për çdo popullatë të marrë në studim:

Peak results : Kruja

System : SystemLAO

Method : alkolet 2

User : lao

Index Name

Time

[Min]

Quantity [%

Area]

Area

[%]

1 UNKNOWN 3.06 0.01 0.008

2 UNKNOWN 3.14 0.01 0.013

3 UNKNOWN 3.29 0.01 0.008

4 UNKNOWN 3.4 0.03 0.027

5 UNKNOWN 3.51 0.01 0.006

6 UNKNOWN 3.57 0 0.001

7 UNKNOWN 3.64 0.58 0.584

8 UNKNOWN 3.69 0.23 0.229

9 UNKNOWN 3.78 0.13 0.133

10 UNKNOWN 4.2 0.01 0.007

11 UNKNOWN 4.62 0.01 0.007

12 UNKNOWN 4.88 0.05 0.046

13 UNKNOWN 4.99 0.33 0.328

14 UNKNOWN 5.3 9.42 9.416

15 UNKNOWN 5.61 7.93 7.927

16 UNKNOWN 6.13 0.08 0.078

17 UNKNOWN 6.25 1.34 1.336

18 UNKNOWN 6.59 0.86 0.855

19 UNKNOWN 6.97 0.02 0.015

20 UNKNOWN 7.49 1.39 1.389

21 UNKNOWN 7.87 13.92 13.916

22 UNKNOWN 7.99 0.25 0.251

23 UNKNOWN 8.11 0.01 0.014

24 UNKNOWN 8.34 0.02 0.021

25 UNKNOWN 8.71 0.12 0.125

26 UNKNOWN 9.04 0.03 0.026

27 UNKNOWN 9.62 0.07 0.072

28 UNKNOWN 10.37 26.32 26.315

29 UNKNOWN 10.67 5.86 5.861

30 UNKNOWN 10.72 0.02 0.02

31 UNKNOWN 10.81 0.05 0.048

32 UNKNOWN 11.64 16.94 16.936

33 UNKNOWN 11.88 0.06 0.065

34 UNKNOWN 12.05 0.08 0.081

35 UNKNOWN 12.24 0.02 0.024

36 UNKNOWN 12.65 1.56 1.561

ANEKSE

95

37 UNKNOWN 13.07 0.45 0.45

38 UNKNOWN 13.55 0.19 0.186

39 UNKNOWN 13.85 0.04 0.036

40 UNKNOWN 14.67 0.03 0.026

41 UNKNOWN 15.19 0.12 0.123

42 UNKNOWN 17.58 0.26 0.26

43 UNKNOWN 17.79 0.11 0.108

44 UNKNOWN 17.97 0.02 0.02

45 UNKNOWN 18.05 0.04 0.044

46 UNKNOWN 18.36 0.15 0.147

47 UNKNOWN 23.68 1.67 1.672

48 UNKNOWN 23.98 0.07 0.072

49 UNKNOWN 25.11 3.6 3.599

50 UNKNOWN 25.32 0.03 0.031

51 UNKNOWN 29.82 0.09 0.088

52 UNKNOWN 29.94 0.01 0.01

53 UNKNOWN 30.47 3.63 3.635

54 UNKNOWN 30.64 0.01 0.015

55 UNKNOWN 30.86 0.52 0.518

56 UNKNOWN 31.66 0.06 0.057

57 UNKNOWN 31.82 0.77 0.771

58 UNKNOWN 31.93 0.06 0.059

59 UNKNOWN 32.75 0.17 0.165

60 UNKNOWN 33.24 0.1 0.1

61 UNKNOWN 33.55 0.04 0.038

62 UNKNOWN 34.34 0.02 0.022

Total 100 100

Peak results: Torovica

System : SystemLAO

Method : alkolet 2

User : lao

Index Name

Time

[Min]

Quantity [%

Area] Area [%]

1 UNKNOWN 3.18 0 0.002

2 UNKNOWN 3.22 0 0.002

3 UNKNOWN 3.3 0.02 0.018

4 UNKNOWN 3.41 0.01 0.006

5 UNKNOWN 3.55 0.43 0.431

6 UNKNOWN 3.6 0.07 0.071

7 UNKNOWN 3.7 0.09 0.09

8 UNKNOWN 4.81 0.07 0.072

9 UNKNOWN 4.93 0.18 0.18

10 UNKNOWN 5 0.02 0.021

ANEKSE

96

11 UNKNOWN 5.2 3.72 3.724

12 UNKNOWN 5.54 6.21 6.206

13 UNKNOWN 5.7 0.01 0.006

14 UNKNOWN 6.09 0.15 0.152

15 UNKNOWN 6.2 0.88 0.877

16 UNKNOWN 6.54 0.99 0.99

17 UNKNOWN 6.94 0.02 0.022

18 UNKNOWN 7.19 0 0.005

19 UNKNOWN 7.27 0 0.003

20 UNKNOWN 7.32 0 0.004

21 UNKNOWN 7.47 1.28 1.277

22 UNKNOWN 7.81 13.86 13.86

23 UNKNOWN 7.96 0.03 0.029

24 UNKNOWN 8.07 0.05 0.048

25 UNKNOWN 8.69 0.13 0.131

26 UNKNOWN 9.03 0.03 0.028

27 UNKNOWN 9.37 0.01 0.01

28 UNKNOWN 9.61 0.08 0.079

29 UNKNOWN 9.76 0.04 0.037

30 UNKNOWN 10.36 31.16 31.163

31 UNKNOWN 10.64 5.73 5.732

32 UNKNOWN 10.7 0.04 0.037

33 UNKNOWN 10.79 0.05 0.051

34 UNKNOWN 10.94 0.01 0.008

35 UNKNOWN 11.64 21.55 21.548

36 UNKNOWN 11.79 0.02 0.025

37 UNKNOWN 11.87 0.07 0.073

38 UNKNOWN 12.04 0.08 0.085

39 UNKNOWN 12.23 0.04 0.038

40 UNKNOWN 12.39 0.01 0.006

41 UNKNOWN 12.66 2.44 2.444

42 UNKNOWN 13.07 0.56 0.556

43 UNKNOWN 13.34 0.02 0.017

44 UNKNOWN 13.53 0.21 0.215

45 UNKNOWN 13.6 0.16 0.159

46 UNKNOWN 13.84 0.1 0.098

47 UNKNOWN 14.16 0.01 0.008

48 UNKNOWN 14.52 0.01 0.009

49 UNKNOWN 14.66 0.04 0.042

50 UNKNOWN 15.05 0.01 0.009

51 UNKNOWN 15.18 0.08 0.083

52 UNKNOWN 15.51 0.01 0.013

53 UNKNOWN 15.87 0.02 0.019

ANEKSE

97

54 UNKNOWN 16.35 0.01 0.007

55 UNKNOWN 16.82 0.02 0.023

56 UNKNOWN 17.06 0.02 0.018

57 UNKNOWN 17.6 1.02 1.02

58 UNKNOWN 17.79 0.2 0.195

59 UNKNOWN 17.96 0.05 0.049

60 UNKNOWN 18.05 0.03 0.035

61 UNKNOWN 18.35 0.13 0.129

62 UNKNOWN 18.87 0.03 0.034

63 UNKNOWN 19.19 0.01 0.01

64 UNKNOWN 19.36 0.01 0.014

65 UNKNOWN 19.69 0.02 0.024

66 UNKNOWN 19.85 0.01 0.013

67 UNKNOWN 20.47 0.01 0.008

68 UNKNOWN 21.93 0.02 0.021

69 UNKNOWN 23.17 0.17 0.169

70 UNKNOWN 23.63 0.51 0.51

71 UNKNOWN 24 0.27 0.271

72 UNKNOWN 24.46 0.05 0.048

73 UNKNOWN 24.56 0 0.003

74 UNKNOWN 25.04 1.44 1.44

75 UNKNOWN 25.3 0.03 0.028

76 UNKNOWN 25.94 0.02 0.023

77 UNKNOWN 27.38 0.02 0.015

78 UNKNOWN 27.57 0.01 0.012

79 UNKNOWN 27.8 0.01 0.014

80 UNKNOWN 28.57 0.01 0.013

81 UNKNOWN 29.42 0.01 0.009

82 UNKNOWN 29.65 0.02 0.015

83 UNKNOWN 29.82 0.09 0.094

84 UNKNOWN 29.93 0.02 0.017

85 UNKNOWN 30.06 0.03 0.028

86 UNKNOWN 30.43 3.1 3.095

87 UNKNOWN 30.63 0.01 0.008

88 UNKNOWN 30.85 0.63 0.628

89 UNKNOWN 31.65 0.07 0.071

90 UNKNOWN 31.8 0.72 0.716

91 UNKNOWN 31.92 0.06 0.063

92 UNKNOWN 32.75 0.15 0.149

93 UNKNOWN 32.95 0.02 0.016

94 UNKNOWN 33.24 0.09 0.087

95 UNKNOWN 33.55 0.04 0.038

Total 100 100

ANEKSE

98

Peak results: Rubik

System : SystemLAO

Method : alkolet 2

User : lao

Index Name Time [Min]

Quantity [%

Area] Area [%]

1 UNKNOWN 3.02 0 0.002

2 UNKNOWN 3.1 0.01 0.007

3 UNKNOWN 3.17 0 0.002

4 UNKNOWN 3.24 0.01 0.008

5 UNKNOWN 3.34 0.05 0.053

6 UNKNOWN 3.42 0.01 0.009

7 UNKNOWN 3.46 0.01 0.009

8 UNKNOWN 3.51 0 0.005

9 UNKNOWN 3.61 1.21 1.21

10 UNKNOWN 3.74 0.21 0.212

11 UNKNOWN 4.06 0.01 0.005

12 UNKNOWN 4.14 0 0.004

13 UNKNOWN 4.56 0 0.004

14 UNKNOWN 4.82 0.15 0.151

15 UNKNOWN 4.94 0.42 0.419

16 UNKNOWN 5.27 5.86 5.857

17 UNKNOWN 5.66 11.43 11.432

18 UNKNOWN 5.74 0.01 0.008

19 UNKNOWN 5.86 0.01 0.008

20 UNKNOWN 6.13 0.15 0.153

21 UNKNOWN 6.23 1.05 1.049

22 UNKNOWN 6.58 1.21 1.209

23 UNKNOWN 6.94 0.03 0.027

24 UNKNOWN 7.19 0.02 0.019

25 UNKNOWN 7.55 1.36 1.358

26 UNKNOWN 7.92 12.46 12.46

27 UNKNOWN 8.11 0.07 0.069

28 UNKNOWN 8.69 0.09 0.086

29 UNKNOWN 9.02 0.01 0.006

30 UNKNOWN 9.37 0.02 0.018

31 UNKNOWN 9.59 0.07 0.075

32 UNKNOWN 9.75 0.05 0.046

33 UNKNOWN 10.61 27.52 27.519

34 UNKNOWN 10.83 3.42 3.422

35 UNKNOWN 10.92 0.03 0.029

36 UNKNOWN 11.04 0.03 0.03

ANEKSE

99

37 UNKNOWN 11.29 0.03 0.026

38 UNKNOWN 11.98 22.93 22.925

39 UNKNOWN 12.09 0.07 0.07

40 UNKNOWN 12.22 0.13 0.128

41 UNKNOWN 12.36 0.02 0.025

42 UNKNOWN 12.43 0.02 0.017

43 UNKNOWN 12.81 1.85 1.847

44 UNKNOWN 12.92 0.01 0.009

45 UNKNOWN 13.19 0.49 0.493

46 UNKNOWN 13.42 0.02 0.022

47 UNKNOWN 13.61 0.19 0.193

48 UNKNOWN 13.72 0.09 0.086

49 UNKNOWN 13.93 0.2 0.198

50 UNKNOWN 14.2 0.01 0.006

51 UNKNOWN 14.54 0.01 0.011

52 UNKNOWN 14.7 0.04 0.041

53 UNKNOWN 14.81 0 0.002

54 UNKNOWN 15.07 0.01 0.007

55 UNKNOWN 15.22 0.08 0.076

56 UNKNOWN 15.34 0.01 0.006

57 UNKNOWN 15.53 0.02 0.017

58 UNKNOWN 15.88 0.02 0.019

59 UNKNOWN 16.36 0.01 0.011

60 UNKNOWN 16.83 0.01 0.015

61 UNKNOWN 17.07 0.01 0.006

62 UNKNOWN 17.67 0.95 0.949

63 UNKNOWN 17.82 0.17 0.169

64 UNKNOWN 17.98 0.04 0.039

65 UNKNOWN 18.07 0.03 0.026

66 UNKNOWN 18.38 0.12 0.123

67 UNKNOWN 18.9 0.05 0.051

68 UNKNOWN 19.2 0.04 0.04

69 UNKNOWN 19.36 0.01 0.014

70 UNKNOWN 19.69 0.02 0.019

71 UNKNOWN 21.94 0.01 0.01

72 UNKNOWN 23.2 0.14 0.14

73 UNKNOWN 23.34 0 0.003

74 UNKNOWN 23.63 0.15 0.154

75 UNKNOWN 24.04 0.2 0.197

76 UNKNOWN 24.29 0.01 0.009

77 UNKNOWN 24.47 0.09 0.092

78 UNKNOWN 25.08 0.94 0.938

79 UNKNOWN 25.31 0.03 0.027

ANEKSE

100

80 UNKNOWN 26.47 0.01 0.008

81 UNKNOWN 27.56 0.01 0.007

82 UNKNOWN 29.68 0.02 0.017

83 UNKNOWN 29.82 0.04 0.042

84 UNKNOWN 30.11 0.04 0.035

85 UNKNOWN 30.55 2.3 2.296

86 UNKNOWN 30.69 0 0.004

87 UNKNOWN 30.93 0.56 0.564

88 UNKNOWN 31.66 0.06 0.059

89 UNKNOWN 31.87 0.55 0.551

90 UNKNOWN 31.96 0.03 0.027

91 UNKNOWN 32.76 0.06 0.057

92 UNKNOWN 32.95 0.01 0.013

93 UNKNOWN 33.25 0.04 0.038

94 UNKNOWN 33.56 0.03 0.032

95 UNKNOWN 34.75 0.01 0.008

Total 100 100

Peak results: Malësi e Madhe (Grishaj)

System : SystemLAO

Method : alkolet 2

User : lao


Quantity [%

Area]

Area

[%]

1 UNKNOWN 3.09 0 0.001

2 UNKNOWN 3.17 0.01 0.007

3 UNKNOWN 3.25 0 0.005

4 UNKNOWN 3.31 0.01 0.006

5 UNKNOWN 3.41 0.03 0.027

6 UNKNOWN 3.53 0.01 0.007

7 UNKNOWN 3.58 0 0.005

8 UNKNOWN 3.67 0.47 0.467

9 UNKNOWN 3.71 0.09 0.089

10 UNKNOWN 3.81 0.1 0.096

11 UNKNOWN 4.21 0 0.002

12 UNKNOWN 4.63 0 0.002

13 UNKNOWN 4.9 0.02 0.024

14 UNKNOWN 5.01 0.25 0.25

15 UNKNOWN 5.34 4.01 4.008

16 UNKNOWN 5.72 7.31 7.31

ANEKSE

101

17 UNKNOWN 5.92 0 0.003

18 UNKNOWN 6.04 0 0.003

19 UNKNOWN 6.15 0.04 0.036

20 UNKNOWN 6.3 0.94 0.935

21 UNKNOWN 6.67 1.41 1.405

22 UNKNOWN 7.01 0.08 0.077

23 UNKNOWN 7.25 0 0.004

24 UNKNOWN 7.38 0.05 0.046

25 UNKNOWN 7.48 0.11 0.105

26 UNKNOWN 8.05 10.47 10.472

27 UNKNOWN 8.2 0.02 0.021

28 UNKNOWN 8.39 0.01 0.006

29 UNKNOWN 8.77 0.23 0.23

30 UNKNOWN 9.08 0.01 0.007

31 UNKNOWN 9.86 0.24 0.235

32 UNKNOWN 10.62 16.83 16.83

33 UNKNOWN 10.91 15.7 15.697

34 UNKNOWN 11.16 6.66 6.661

35 UNKNOWN 12.22 22.89 22.886

36 UNKNOWN 12.3 0.11 0.113

37 UNKNOWN 12.39 0.02 0.015

38 UNKNOWN 12.51 0.02 0.023

39 UNKNOWN 12.59 0.01 0.012

40 UNKNOWN 13.03 2.68 2.677

41 UNKNOWN 13.34 0.54 0.54

42 UNKNOWN 13.74 0.2 0.199

43 UNKNOWN 13.87 0.16 0.164

44 UNKNOWN 14.03 0.03 0.029

45 UNKNOWN 14.09 0.02 0.024

46 UNKNOWN 14.29 0.02 0.016

47 UNKNOWN 14.43 0.01 0.01

48 UNKNOWN 14.62 0.01 0.015

49 UNKNOWN 14.78 0.03 0.033

50 UNKNOWN 14.88 0 0.004

51 UNKNOWN 15.15 0.02 0.022

52 UNKNOWN 15.29 0.05 0.051

53 UNKNOWN 15.41 0 0.005

54 UNKNOWN 15.6 0.02 0.021

55 UNKNOWN 15.92 0.03 0.025

56 UNKNOWN 16.16 0.01 0.012

57 UNKNOWN 16.45 0.02 0.02

58 UNKNOWN 16.55 0.01 0.013

59 UNKNOWN 16.76 0.01 0.007

60 UNKNOWN 16.91 0.04 0.038

61 UNKNOWN 17.14 0.01 0.009

62 UNKNOWN 17.79 1.64 1.636

63 UNKNOWN 17.89 0.13 0.128

ANEKSE

102

64 UNKNOWN 18.05 0.07 0.07

65 UNKNOWN 18.13 0.03 0.03

66 UNKNOWN 18.44 0.08 0.084

67 UNKNOWN 18.95 0.02 0.023

68 UNKNOWN 19.24 0.01 0.006

69 UNKNOWN 19.39 0.02 0.017

70 UNKNOWN 19.71 0.02 0.021

71 UNKNOWN 19.9 0.01 0.011

72 UNKNOWN 20.16 0.01 0.012

73 UNKNOWN 20.33 0.01 0.014

74 UNKNOWN 20.51 0.01 0.009

75 UNKNOWN 21.73 0.02 0.016

76 UNKNOWN 21.96 0.02 0.019

77 UNKNOWN 23.13 0.03 0.03

78 UNKNOWN 23.33 0.27 0.275

79 UNKNOWN 23.77 0.98 0.983

80 UNKNOWN 24.2 0.56 0.561

81 UNKNOWN 24.5 0.01 0.013

82 UNKNOWN 25.17 1.23 1.232

83 UNKNOWN 25.36 0.03 0.025

84 UNKNOWN 25.96 0.02 0.015

85 UNKNOWN 26.77 0.02 0.023

86 UNKNOWN 27.4 0.01 0.01

87 UNKNOWN 27.82 0.02 0.015

88 UNKNOWN 27.91 0.01 0.012

89 UNKNOWN 28.58 0.01 0.008

90 UNKNOWN 29.44 0.01 0.009

91 UNKNOWN 29.69 0.01 0.005

92 UNKNOWN 29.85 0.09 0.092

93 UNKNOWN 29.97 0.01 0.011

94 UNKNOWN 30.58 1.86 1.862

95 UNKNOWN 30.93 0.24 0.244

96 UNKNOWN 31.69 0.03 0.035

97 UNKNOWN 31.84 0.2 0.201

98 UNKNOWN 31.95 0.03 0.031

99 UNKNOWN 32.79 0.08 0.081

100 UNKNOWN 33.26 0.05 0.046

101 UNKNOWN 33.57 0.01 0.011

102 UNKNOWN 33.88 0.01 0.011

Total 100 100

ANEKSE

103

Peak results: Balldren

System : SystemLAO

Method : alkolet 2

User : lao

Index Name

Time

[Min]

Quantity [%

Area]

Area

[%]

1 UNKNOWN 3.24 0 0.005

2 UNKNOWN 3.29 0 0.002

3 UNKNOWN 3.35 0.02 0.018

4 UNKNOWN 3.47 0.01 0.006

5 UNKNOWN 3.53 0 0.002

6 UNKNOWN 3.6 0.97 0.973

7 UNKNOWN 3.65 0.2 0.197

8 UNKNOWN 3.75 0.19 0.19

9 UNKNOWN 4.24 0.05 0.051

10 UNKNOWN 4.84 0.04 0.036

11 UNKNOWN 4.96 0.05 0.051

12 UNKNOWN 5.03 0.05 0.053

13 UNKNOWN 5.24 4.46 4.457

14 UNKNOWN 5.54 2.21 2.214

15 UNKNOWN 5.65 0.01 0.01

16 UNKNOWN 5.88 0.02 0.019

17 UNKNOWN 6.13 0.16 0.157

18 UNKNOWN 6.25 2.38 2.376

19 UNKNOWN 6.57 0.97 0.97

20 UNKNOWN 6.97 0.06 0.06

21 UNKNOWN 7.35 0.11 0.109

22 UNKNOWN 7.5 0.95 0.947

23 UNKNOWN 7.85 12.99 12.986

24 UNKNOWN 7.98 0.27 0.271

25 UNKNOWN 8.1 0.01 0.008

26 UNKNOWN 8.34 0.04 0.038

27 UNKNOWN 8.71 0.4 0.4

28 UNKNOWN 9.03 0.02 0.019

29 UNKNOWN 9.62 0.04 0.038

30 UNKNOWN 9.78 0.09 0.09

31 UNKNOWN 10.43 32.91 32.909

32 UNKNOWN 10.74 8.45 8.45

33 UNKNOWN 10.85 0.01 0.013

34 UNKNOWN 11.61 10.98 10.977

35 UNKNOWN 11.8 0.02 0.024

36 UNKNOWN 11.88 0.04 0.039

37 UNKNOWN 12.05 0.08 0.083

38 UNKNOWN 12.25 0.02 0.02

39 UNKNOWN 12.64 1.21 1.212

ANEKSE

104

40 UNKNOWN 13.08 0.45 0.451

41 UNKNOWN 13.54 0.2 0.198

42 UNKNOWN 13.62 0.11 0.11

43 UNKNOWN 13.85 0.02 0.024

44 UNKNOWN 14.53 0.01 0.01

45 UNKNOWN 14.67 0.02 0.016

46 UNKNOWN 15.06 0.01 0.013

47 UNKNOWN 15.19 0.14 0.144

48 UNKNOWN 16.83 0.01 0.011

49 UNKNOWN 17.58 0.09 0.09

50 UNKNOWN 17.79 0.08 0.076

51 UNKNOWN 18.05 0.05 0.051

52 UNKNOWN 18.36 0.17 0.172

53 UNKNOWN 20.29 0.02 0.02

54 UNKNOWN 21.93 0.04 0.038

55 UNKNOWN 23.1 0.02 0.019

56 UNKNOWN 23.69 2.07 2.074

57 UNKNOWN 23.98 0.02 0.023

58 UNKNOWN 24.47 0.03 0.03

59 UNKNOWN 25.19 7.62 7.616

60 UNKNOWN 25.35 0.07 0.075

61 UNKNOWN 25.95 0.03 0.033

62 UNKNOWN 26.29 0.01 0.015

63 UNKNOWN 26.75 0.04 0.038

64 UNKNOWN 27.39 0.02 0.02

65 UNKNOWN 27.81 0.04 0.041

66 UNKNOWN 29.82 0.07 0.067

67 UNKNOWN 30.54 6.04 6.043

68 UNKNOWN 30.67 0.02 0.019

69 UNKNOWN 30.9 0.84 0.839

70 UNKNOWN 31.15 0.02 0.019

71 UNKNOWN 31.66 0.07 0.069

72 UNKNOWN 31.82 0.79 0.787

73 UNKNOWN 31.93 0.04 0.039

74 UNKNOWN 32.75 0.11 0.107

75 UNKNOWN 33.24 0.05 0.054

76 UNKNOWN 33.55 0.05 0.053

77 UNKNOWN 34.35 0.02 0.015

Total 100 100

ANEKSE

105

Peak results: Shkodër

System : SystemLAO

Method : alkolet 2

User : lao


Quantity [%

Area]

Area

[%]

1 UNKNOWN 3.13 0.02 0.019

2 UNKNOWN 3.32 0.03 0.034

3 UNKNOWN 3.57 0.66 0.661

4 UNKNOWN 3.72 0.12 0.117

5 UNKNOWN 4.82 0.03 0.028

6 UNKNOWN 4.94 0.29 0.285

7 UNKNOWN 5.22 4.51 4.512

8 UNKNOWN 5.57 8.1 8.097

9 UNKNOWN 5.71 0.01 0.007

10 UNKNOWN 5.86 0.01 0.008

11 UNKNOWN 6.1 0.14 0.137

12 UNKNOWN 6.56 1.41 1.408

13 UNKNOWN 6.95 0.06 0.056

14 UNKNOWN 7.2 0 0.004

15 UNKNOWN 7.48 1.04 1.039

16 UNKNOWN 7.84 12.77 12.769

17 UNKNOWN 7.96 0.03 0.032

18 UNKNOWN 8.08 0.02 0.019

19 UNKNOWN 8.32 0.01 0.005

20 UNKNOWN 8.69 0.21 0.206

21 UNKNOWN 9.02 0.05 0.055

22 UNKNOWN 9.37 0.01 0.013

23 UNKNOWN 9.6 0.09 0.095

24 UNKNOWN 9.76 0.12 0.116

25 UNKNOWN 10.38 30.32 30.324

26 UNKNOWN 10.69 6.45 6.455

27 UNKNOWN 10.83 0.04 0.043

28 UNKNOWN 11.15 0.03 0.032

29 UNKNOWN 11.69 21.31 21.307

30 UNKNOWN 11.9 0.07 0.073

31 UNKNOWN 12.06 0.07 0.068

32 UNKNOWN 12.25 0.04 0.038

33 UNKNOWN 12.69 2.45 2.446

34 UNKNOWN 12.87 0.01 0.006

35 UNKNOWN 13.09 0.49 0.492

36 UNKNOWN 13.63 0.33 0.33

ANEKSE

106

37 UNKNOWN 13.86 0.05 0.051

38 UNKNOWN 14.17 0.02 0.016

39 UNKNOWN 14.31 0.01 0.01

40 UNKNOWN 14.52 0.01 0.012

41 UNKNOWN 14.67 0.04 0.036

42 UNKNOWN 15.19 0.07 0.07

43 UNKNOWN 15.52 0.02 0.025

44 UNKNOWN 15.84 0.02 0.022

45 UNKNOWN 16.07 0.01 0.009

46 UNKNOWN 16.36 0.01 0.014

47 UNKNOWN 16.48 0.02 0.02

48 UNKNOWN 16.82 0.03 0.032

49 UNKNOWN 17.62 1.44 1.442

50 UNKNOWN 17.79 0.11 0.108

51 UNKNOWN 17.96 0.06 0.063

52 UNKNOWN 18.37 0.06 0.063

53 UNKNOWN 18.89 0.01 0.014

54 UNKNOWN 19.36 0.02 0.015

55 UNKNOWN 19.67 0.02 0.018

56 UNKNOWN 19.85 0.01 0.008

57 UNKNOWN 20.12 0.01 0.011

58 UNKNOWN 20.31 0.01 0.01

59 UNKNOWN 20.47 0.01 0.01

60 UNKNOWN 21.69 0.01 0.013

61 UNKNOWN 21.91 0.02 0.017

62 UNKNOWN 23.2 0.28 0.275

63 UNKNOWN 23.64 0.88 0.876

64 UNKNOWN 24.03 0.52 0.519

65 UNKNOWN 24.45 0.02 0.021

66 UNKNOWN 25.02 1.1 1.103

67 UNKNOWN 25.29 0.02 0.024

68 UNKNOWN 25.92 0.02 0.019

69 UNKNOWN 26.73 0.02 0.017

70 UNKNOWN 27.37 0.02 0.017

71 UNKNOWN 27.79 0.03 0.026

72 UNKNOWN 28.29 0.34 0.344

73 UNKNOWN 28.94 0.44 0.438

74 UNKNOWN 29.15 0.23 0.235

75 UNKNOWN 29.4 0.04 0.039

76 UNKNOWN 29.6 0.03 0.031

77 UNKNOWN 29.8 0.11 0.115

78 UNKNOWN 30.39 1.77 1.774

79 UNKNOWN 30.61 0.01 0.005

ANEKSE

107

80 UNKNOWN 30.81 0.23 0.228

81 UNKNOWN 31.75 0.22 0.222

82 UNKNOWN 31.89 0.03 0.034

83 UNKNOWN 32.73 0.09 0.089

84 UNKNOWN 33.23 0.05 0.045

85 UNKNOWN 33.54 0.01 0.011

86 UNKNOWN 33.86 0.01 0.01

87 UNKNOWN 34.6 0.04 0.039

Total 100 100

Peak results:Valbona

System : SystemLAO

Method : alkolet 2

User : lao

Index Name

Time

[Min]

Quantity [%

Area]

Area

[%]

1 UNKNOWN 6.2 0.02 0.021

2 UNKNOWN 6.3 0.05 0.0502

3 UNKNOWN 6.6. 0.22 0.202

4 UNKNOWN 6.9 0.04 0.041

5 UNKNOWN 8.5 0.13 0.1304

6 UNKNOWN 9 2.93 2.931

7 UNKNOWN 9.1 0.2 0.21

8 UNKNOWN 10.3 0.04 0.0405

9 UNKNOWN 10.7 3.93 3.9304

10 UNKNOWN 12.4 1.42 1.4205

11 UNKNOWN 13 0.05 0.051

12 UNKNOWN 13.2 0.02 0.02101

13 UNKNOWN 15 0.69 0.697

14 UNKNOWN 15.3 0.09 0.098

15 UNKNOWN 16.1 0.43 0.4303

16 UNKNOWN 17.3 1.3 1.3021

17 UNKNOWN 17.9 8.4 8.41

18 UNKNOWN 19.1 0.06 0.061

19 UNKNOWN 19.3 0.03 0.03201

20 UNKNOWN 19.9 0.5 0.5027

21 UNKNOWN 20.2 0.04 0.0402

22 UNKNOWN 21.5 0.92 0.921

23 UNKNOWN 22.3 0.16 0.167

24 UNKNOWN 28.3 0.05 0.055

ANEKSE

108

25 UNKNOWN 28.5 0.02 0.022

26 UNKNOWN 29.3 0.02 0.0214

27 UNKNOWN 29.5 0.04 0.045

28 UNKNOWN 29.9 0.02 0.0223

29 UNKNOWN 31.9 32.43 32.432

30 UNKNOWN 32 0.05 0.0552

31 UNKNOWN 32.6 0.09 0.092

32 UNKNOWN 32.7 0.03 0.037

33 UNKNOWN 32.9 0.11 0.112

34 UNKNOWN 33 7.67 7.676

35 UNKNOWN 34.2 0.03 0.034

36 UNKNOWN 34.6 0.03 0.032

37 UNKNOWN 35.3 0.02 0.022

38 UNKNOWN 35.6 0.03 0.0315

39 UNKNOWN 36.4 0.07 0.0787

40 UNKNOWN 37.7 16.02 16.022

41 UNKNOWN 37.9 0.13 0.132

42 UNKNOWN 39.3 0.43 0.435

43 UNKNOWN 39.6 0.02 0.0213

44 UNKNOWN 39.9 0.03 0.0314

45 UNKNOWN 40.9 0.12 0.1224

46 UNKNOWN 41.6 0.04 0.0413

47 UNKNOWN 41.8 0.16 1.1675

48 UNKNOWN 42.1 0.03 0.0333

49 UNKNOWN 42.6 0.06 0.0694

50 UNKNOWN 42.8 0.04 0.0445

51 UNKNOWN 43.1 0.45 0.456

52 UNKNOWN 43.2 3.74 3.743

53 UNKNOWN 43.4 0.03 0.0314

54 UNKNOWN 43.6 0.06 0.0622

55 UNKNOWN 43.9 0.11 0.113

56 UNKNOWN 44.1 0.04 0.0414

57 UNKNOWN 44.8 0.03 0.0313

58 UNKNOWN 45.4 0.03 0.032

59 UNKNOWN 46 0.15 0.156

60 UNKNOWN 46.2 0.25 0.2542

61 UNKNOWN 46.6 0.15 0.155

62 UNKNOWN 46.9 0.05 0.053

63 UNKNOWN 47.4 0.12 0.1231

64 UNKNOWN 47.5 0.16 0.1614

65 UNKNOWN 47.7 5.39 5.397

66 UNKNOWN 48.3 0.04 0.0423

67 UNKNOWN 48.6 0.06 0.0625

ANEKSE

109

68 UNKNOWN 49 0.71 0.713

69 UNKNOWN 49.1 0.51 0.514

70 UNKNOWN 49.3 2.14 2.141

71 UNKNOWN 49.6 0.07 0.0713

72 UNKNOWN 50.7 0.08 0.0865

73 UNKNOWN 51 0.04 0.0434

74 UNKNOWN 51.2 0.03 0.0323

75 UNKNOWN 52.7 0.09 0.0996

76 UNKNOWN 52.9 0.05 0.0513

77 UNKNOWN 54.4 0.1 0.121

78 UNKNOWN 55.3 0.03 0.0322

79 UNKNOWN 56.2 0.03 0.0314

80 UNKNOWN 56.9 0.04 0.043

81 UNKNOWN 57.3 0.02 0.0232

82 UNKNOWN 57.6 0.07 0.0765

83 UNKNOWN 59.4 0.02 0.0223

84 UNKNOWN 61.8 0.1 0.132

85 UNKNOWN 64.9 0.02 0.0232

86 UNKNOWN 65.9 0.12 0.124

87 UNKNOWN 67 0.04 0.0423

88 UNKNOWN 67.6 0.1 0.131

89 UNKNOWN 68.6 0.09 0.09605

90 UNKNOWN 68.9 0.31 0.315

91 UNKNOWN 69.6 0.04 0.0434

92 UNKNOWN 69.9 0.14 0.1421

93 UNKNOWN 70.9 2.62 2.623

94 UNKNOWN 74.1 0.03 0.034

95 UNKNOWN 75.7 0.05 0.0545

96 UNKNOWN 75.9 0.06 0.06703

97 UNKNOWN 76.1 0.03 0.0324

98 UNKNOWN 76.5 0.1 0.114

99 UNKNOWN 80.5 0.14 0.144

100 UNKNOWN 81.1 0.05 0.0535

101 UNKNOWN 82.9 0.04 0.0443

102 UNKNOWN 84.7 0.06 0.0622

103 UNKNOWN 97.7 0.5 0.531

Total 100 100

ANEKSE

110

Peak results: Lezha

System : SystemLAO

Method : alkolet 2

User : lao


Quantity [%

Area]

Area

[%]

1 UNKNOWN 5.934 0.09 0.0948

2 UNKNOWN 6.23 0.25 0.2482

3 UNKNOWN 6.515 0.05 0.0468

4 UNKNOWN 7.805 0.2 0.1819

5 UNKNOWN 8.158 4.2 4.1872

6 UNKNOWN 9.404 5.1 5.1361

7 UNKNOWN 10.613 2.4 2.435

8 UNKNOWN 10.929 0.07 0.0687

9 UNKNOWN 12.108 1.9 1.9597

10 UNKNOWN 12.346 0.1 0.1196

11 UNKNOWN 12.815 0.43 0.4293

12 UNKNOWN 13.466 1.8 1.8049

13 UNKNOWN 13.861 16.17 16.1669

14 UNKNOWN 14.434 0.09 0.0967

15 UNKNOWN 14.997 0.65 0.6555

16 UNKNOWN 15.861 0.58 0.5799

17 UNKNOWN 16.273 0.32 0.3232

18 UNKNOWN 21.131 22.95 22.949

19 UNKNOWN 21.289 0.21 0.2063

20 UNKNOWN 21.42 0.09 0.0943

21 UNKNOWN 21.667 4.2 4.1918

22 UNKNOWN 21.932 0.05 0.0461

23 UNKNOWN 23.249 0.07 0.067

24 UNKNOWN 23.92 0.09 0.0908

25 UNKNOWN 24.277 17.9 17.9174

26 UNKNOWN 24.344 0.41 0.4095

27 UNKNOWN 24.812 0.1 0.1035

28 UNKNOWN 25.407 0.05 0.0463

29 UNKNOWN 25.906 1.64 1.639

30 UNKNOWN 26.163 0.07 0.0682

31 UNKNOWN 26.409 0.52 0.5191

32 UNKNOWN 26.63 5.2 5.2301

33 UNKNOWN 26.756 0.09 0.0875

34 UNKNOWN 26.897 0.3 0.281

35 UNKNOWN 27.152 0.06 0.0562

36 UNKNOWN 27.838 0.17 0.1726

ANEKSE

111

37 UNKNOWN 28.044 0.23 0.233

38 UNKNOWN 28.368 0.24 0.2427

39 UNKNOWN 28.5 0.09 0.0994

40 UNKNOWN 28.779 4.3 4.2617

41 UNKNOWN 29.089 0.61 0.6057

42 UNKNOWN 29.234 0.75 0.7545

43 UNKNOWN 29.37 2.4 2.3969

44 UNKNOWN 30.216 0.05 0.0494

45 UNKNOWN 31.061 0.12 0.1192

46 UNKNOWN 31.226 0.05 0.0516

47 UNKNOWN 31.871 0.09 0.0974

48 UNKNOWN 33.235 0.08 0.0791

49 UNKNOWN 37.303 0.1 0.1029

50 UNKNOWN 38.089 0.05 0.0549

51 UNKNOWN 38.483 0.09 0.0981

52 UNKNOWN 38.697 0.2 0.1994

53 UNKNOWN 39.145 0.19 0.1915

54 UNKNOWN 39.524 1.46 1.4583

55 UNKNOWN 42.037 0.08 0.0757

56 UNKNOWN 42.36 0.06 0.059

57 UNKNOWN 44.819 0.06 0.0594

Total 100 100

Peak results: Lohe

System : SystemLAO

Method : alkolet 2

User : lao


Quantity [%

Area]

Area

[%]

1 UNKNOWN 2.378 0.22 0.2224

2 UNKNOWN 2.528 4.5 4.4689

3 UNKNOWN 3.103 6.02 6.0187

4 UNKNOWN 3.725 2.85 2.8472

5 UNKNOWN 3.937 0.18 0.1826

6 UNKNOWN 4.66 1.23 1.2296

7 UNKNOWN 5.027 0.36 0.3618

8 UNKNOWN 5.427 2.4 2.3949

9 UNKNOWN 5.667 10.92 10.9175

10 UNKNOWN 6.42 0.61 0.6094

11 UNKNOWN 6.997 0.56 0.558

12 UNKNOWN 7.253 0.33 0.3293

13 UNKNOWN 10.625 29.2 29.1642

ANEKSE

112

14 UNKNOWN 11.038 3.65 3.649

15 UNKNOWN 11.467 0.13 0.1304

16 UNKNOWN 12.84 21.5 21.4837

17 UNKNOWN 13.29 0.4 0.3775

18 UNKNOWN 14.115 1.33 1.3269

19 UNKNOWN 14.395 4.05 4.0503

20 UNKNOWN 14.633 0.76 0.7561

21 UNKNOWN 16.012 5.8 5.777

22 UNKNOWN 16.712 2.7 2.6886

23 UNKNOWN 24.15 0.5 0.468

Total 100 100

Peak results: Shëngjin

System : SystemLAO

Method : alkolet 2

User : lao

Index Name Time [Min] Quantity [% Area] Area [%]

1 UNKNOWN 4.288 0.17 0.17445

2 UNKNOWN 4.409 3.33 3.32854

3 UNKNOWN 4.62 0.9 0.99141

4 UNKNOWN 4.659 6.24 6.23995

5 UNKNOWN 4.778 0.7 0.7618

6 UNKNOWN 4.953 1.5 1.46527

7 UNKNOWN 5.046 0.1 0.10331

8 UNKNOWN 5.092 2.09 2.08756

9 UNKNOWN 5.3 1.39 1.39918

10 UNKNOWN 5.365 0.11 0.11175

11 UNKNOWN 5.481 0.3 0.29466

12 UNKNOWN 5.659 0.26 0.25632

13 UNKNOWN 5.775 0.44 0.44094

14 UNKNOWN 5.835 3.53 3.52768

15 UNKNOWN 5.872 13.4 13.3696

16 UNKNOWN 5.972 0.27 0.26639

17 UNKNOWN 6.126 0.19 0.18582

18 UNKNOWN 6.288 0.45 0.43989

19 UNKNOWN 6.745 0.51 0.51036

20 UNKNOWN 6.919 0.6 0.59907

21 UNKNOWN 7.026 18.7 18.67534

22 UNKNOWN 7.197 2.5 2.53327

23 UNKNOWN 7.586 0.07 0.06855

24 UNKNOWN 7.672 21.97 21.97302

ANEKSE

113

25 UNKNOWN 8.031 3.89 3.88827

26 UNKNOWN 8.234 0.28 0.27808

27 UNKNOWN 8.473 0.09 0.09518

28 UNKNOWN 10.369 2.52 2.51957

29 UNKNOWN 10.506 0.12 0.12247

30 UNKNOWN 10.674 0.11 0.10883

31 UNKNOWN 12.327 0.12 0.12182

32 UNKNOWN 12.433 0.28 0.27678

33 UNKNOWN 13.506 4.75 4.74688

34 UNKNOWN 13.966 0.31 0.31219

35 UNKNOWN 14.362 6.36 6.35723

36 UNKNOWN 14.85 0.33 0.32996

Total 100 100

Peak results: Ulza

System : SystemLAO

Method : alkolet 2

User : lao

Index Name Time [Min] Quantity [% Area] Area [%]

1 UNKNOWN 6.66 0.3 0.29856

2 UNKNOWN 6.936 0.07 0.07138

3 UNKNOWN 8.924 0.17 0.17298

4 UNKNOWN 9.026 0.14 0.13905

5 UNKNOWN 9.31 2.77 2.76761

6 UNKNOWN 9.784 0.03 0.0288

7 UNKNOWN 9.865 6 6.00028

8 UNKNOWN 10.692 0.2 0.19648

9 UNKNOWN 10.846 1.5 1.52084

10 UNKNOWN 11.19 1.07 1.07107

11 UNKNOWN 11.793 0.1 0.10363

12 UNKNOWN 12.242 0.23 0.22879

13 UNKNOWN 12.535 0.37 0.36984

14 UNKNOWN 12.722 2.85 2.85392

15 UNKNOWN 12.86 8.37 8.37137

16 UNKNOWN 13.328 0.05 0.04882

17 UNKNOWN 13.829 0.42 0.42542

18 UNKNOWN 14.161 0.98 0.09826

19 UNKNOWN 14.351 0.03 0.02733

20 UNKNOWN 14.988 0.6 0.59711

21 UNKNOWN 15.377 0.6 0.5774

22 UNKNOWN 15.804 19.04 19.04142

23 UNKNOWN 16.137 2.3 2.29728

24 UNKNOWN 16.325 0.04 0.04006

ANEKSE

114

25 UNKNOWN 16.463 0.16 0.15641

26 UNKNOWN 16.83 0.05 0.05257

27 UNKNOWN 17.113 0.17 0.17165

28 UNKNOWN 17.412 27.6 27.64254

29 UNKNOWN 17.476 0.03 0.02822

30 UNKNOWN 17.735 0.07 0.07142

31 UNKNOWN 17.874 0.19 0.18828

32 UNKNOWN 17.958 0.32 0.32359

33 UNKNOWN 18.093 3.18 3.17986

34 UNKNOWN 18.464 0.41 0.40901

35 UNKNOWN 18.671 0.061 0.06086

36 UNKNOWN 18.931 0.16 0.1558

37 UNKNOWN 19.18 0.19 0.18912

38 UNKNOWN 19.535 1.21 1.21142

39 UNKNOWN 19.955 0.04 0.0448

40 UNKNOWN 20.159 0.02 0.02453

41 UNKNOWN 20.445 0.04 0.03941

42 UNKNOWN 20.562 0.02 0.02355

43 UNKNOWN 20.631 0.03 0.03354

44 UNKNOWN 20.728 0.03 0.03138

45 UNKNOWN 21.134 0.03 0.03156

46 UNKNOWN 21.84 0.032 0.03198

47 UNKNOWN 22.041 0.31 0.30563

48 UNKNOWN 22.538 2.65 2.64836

49 UNKNOWN 22.649 0.17 0.17154

50 UNKNOWN 22.685 0.08 0.08116

51 UNKNOWN 22.88 0.12 0.11559

52 UNKNOWN 23.239 0.07 0.07587

53 UNKNOWN 23.91 0.1 0.10418

54 UNKNOWN 24.516 0.15 0.15249

55 UNKNOWN 24.777 0.11 0.11281

56 UNKNOWN 24.865 0.04 0.04149

57 UNKNOWN 25.754 0.075 0.07498

58 UNKNOWN 25.875 0.1 0.10064

59 UNKNOWN 26.243 0.03 0.02869

60 UNKNOWN 26.762 0.03 0.02863

61 UNKNOWN 27.012 0.05 0.04852

62 UNKNOWN 27.522 4.5 4.52204

63 UNKNOWN 27.763 0.08 0.08153

64 UNKNOWN 27.895 0.2 0.1985

65 UNKNOWN 28.029 0.03 0.02832

66 UNKNOWN 28.148 0.23 0.23393

67 UNKNOWN 28.27 0.03 0.03051

ANEKSE

115

68 UNKNOWN 28.448 0.27 0.27091

69 UNKNOWN 28.709 8.03 8.02728

70 UNKNOWN 28.906 0.11 0.11063

71 UNKNOWN 29.293 0.16 0.16138

72 UNKNOWN 29.745 0.03 0.02549

73 UNKNOWN 29.825 0.03 0.02263

74 UNKNOWN 29.911 0.024 0.02388

75 UNKNOWN 29.988 0.15 0.14693

76 UNKNOWN 30.047 0.03 0.03236

77 UNKNOWN 30.562 0.06 0.05695

78 UNKNOWN 30.875 0.18 0.18474

Totali 100 100

Peak results: Fushë Milot

System : SystemLAO

Method : alkolet 2

User : lao


Quantity [%

Area]

Area

[%]

1 UNKNOWN 3.03 0.04 0.042

2 UNKNOWN 4.07 0.2 0.23

3 UNKNOWN 5.5 0.4 0.43

4 UNKNOWN 6.1 0.04 0.039

5 UNKNOWN 8.32 0.5 0.52

6 UNKNOWN 9.91 0.2 0.166

7 UNKNOWN 10.659 3.4 3.4

8 UNKNOWN 11.09 6.3 6.3

9 UNKNOWN 12.007 1.4 1.4

10 UNKNOWN 12.151 0.1 0.143

11 UNKNOWN 12.238 0.1 0.078

12 UNKNOWN 12.382 1.2 1.24

13 UNKNOWN 13.051 2.3 2.3

14 UNKNOWN 13.325 0.9 0.92

15 UNKNOWN 13.768 11 10.8

16 UNKNOWN 13.965 0.1 0.121

17 UNKNOWN 14.348 1.3 1.31

18 UNKNOWN 14.758 0.7 0.72

19 UNKNOWN 14.924 0.5 0.52

20 UNKNOWN 15.146 0.1 0.06

21 UNKNOWN 15.374 0.04 0.038

22 UNKNOWN 15.465 0.1 0.095

23 UNKNOWN 15.835 0.4 0.4

ANEKSE

116

24 UNKNOWN 15.9 0.1 0.071

25 UNKNOWN 15.978 0.05 0.056

26 UNKNOWN 16.023 0.04 0.036

27 UNKNOWN 16.162 0.05 0.0532

28 UNKNOWN 16.28 22 21.7

29 UNKNOWN 16.531 3.7 3.7

30 UNKNOWN 16.865 0.05 0.054

31 UNKNOWN 17.243 0.1 0.062

32 UNKNOWN 17.405 26 26.1

33 UNKNOWN 18.45 3 3.2

34 UNKNOWN 19.143 0.01 0.012

35 UNKNOWN 19.874 0.06 0.0587

36 UNKNOWN 20.246 0.06 0.0645

37 UNKNOWN 20.567 0.1 0.097

38 UNKNOWN 21.854 0.1 0.0946

39 UNKNOWN 22.529 0.4 0.37

40 UNKNOWN 22.785 0.03 0.032

41 UNKNOWN 23.315 0.1 0.154

42 UNKNOWN 23.879 0.1 0.124

43 UNKNOWN 24.515 0.8 0.83

44 UNKNOWN 24.753 0.2 0.157

45 UNKNOWN 25.642 0.1 0.093

46 UNKNOWN 26.536 0.1 0.135

47 UNKNOWN 26.923 2 2.3

48 UNKNOWN 27.432 3.5 3.5

49 UNKNOWN 27.964 0.1 0.075

50 UNKNOWN 28.432 5.6 5.6

Total 100 100

Peak results: Postriba

System : SystemLAO

Method : alkolet 2

User : lao


Quantity [%

Area]

Area

[%]

1 UNKNOWN 4.234 0.06 0.065

2 UNKNOWN 5.328 0.08 0.079

3 UNKNOWN 5.782 0.11 0.113

4 UNKNOWN 6.187 0.1 0.125

5 UNKNOWN 6.749 0.06 0.057

6 UNKNOWN 7.256 0.13 0.128

7 UNKNOWN 7.846 0.03 0.0354

ANEKSE

117

8 UNKNOWN 8.093 0.07 0.0673

9 UNKNOWN 8.434 2.2 2.2

10 UNKNOWN 9.345 0.13 0.132

11 UNKNOWN 9.879 0.04 0.0435

12 UNKNOWN 10.404 4.1 4.1

13 UNKNOWN 10.654 2 2

14 UNKNOWN 11.833 0.94 0.94

15 UNKNOWN 12.022 2 2

16 UNKNOWN 13.325 2.4 2.41

17 UNKNOWN 13.758 9.4 9.4

18 UNKNOWN 13.964 0.4 0.43

19 UNKNOWN 14.549 0.3 0.28

20 UNKNOWN 14.758 0.3 0.3

21 UNKNOWN 15.837 0.2 0.2

22 UNKNOWN 16.221 36 36

23 UNKNOWN 16.626 4.7 4.7

24 UNKNOWN 17.361 17.6 17.6

25 UNKNOWN 18.428 1.6 1.6

26 UNKNOWN 19.194 0.3 0.32

27 UNKNOWN 20.672 1.3 1.34

28 UNKNOWN 20.869 0.15 0.147

29 UNKNOWN 21.132 0.03 0.03

30 UNKNOWN 21.578 0.1 0.098

31 UNKNOWN 22.506 1.5 1.5

32 UNKNOWN 22.782 0.12 0.117

33 UNKNOWN 23.154 0.06 0.0587

34 UNKNOWN 23.784 0.07 0.0664

35 UNKNOWN 23.967 0.15 0.152

36 UNKNOWN 24.325 0.12 0.117

37 UNKNOWN 24.765 0.4 0.357

38 UNKNOWN 24.907 0.12 0.117

39 UNKNOWN 25.302 0.1 0.093

40 UNKNOWN 25.564 0.1 0.121

41 UNKNOWN 25.783 0.07 0.0689

42 UNKNOWN 25.173 0.1 0.114

43 UNKNOWN 25.689 0.03 0.026

44 UNKNOWN 27.38 3.2 3.2

45 UNKNOWN 28.424 7 7

Total 100 100

118

PËRMBLEDHJE

Trembëdhjetë popullata natyrore të sherbelës së Shqipërisë së veriut u analizuan për të

vlerësuar diversitetin e gjeneve koduese të monoterpen-sintetazave dhe produkteve të

tyre monoterpenoidike. Metodologjia e ndjekur u bazua në shumëfishimin me PCR të

një fragmenti gjenik qëndror të MTP nga gADN dhe ARN totale, klonimin e tij në

plazmidin pTOPO2.1, transformimin në E.coli, dhe mbjelljen e baktereve për të

krijuar trembëdhjetë librari. Përzgjedhja e rekombinantëve dhe klonimi u kryen sipas

metodologjisë të kitit të Invitrogen. Meqënëse, përmasat e MTP-ve të shumëfishuara

nga modele të gADN dhe ARN totale ishin identike, çka do të thotë se rajoni i

shumëfishuar ishte kodues në të gjitha popullatat, u vendos të përzgjidhen për studim

të mëtejshëm popullatat më të veçanta. Meqënëse monoterpen-sintetazat kanë origjine

plastidike, u izolua cp-ADN nga të trembëdhjetë popullatat dhe me anën e primerave

intergjenike trnL/F (Ibrahim et al., 2012) u vlerësua bazuar në PCR-RFLP diversiteti i

rajonit të shumëfishuar. Paralelisht, u ekstraktuan vajrat esenciale dhe me anë të GC u

përcaktua përmbajtja e monoterpeneve në to. Rezultatet e të dy metodave të vlerësimit

të bazuara në cp-ADN dhe gaz-kromatografi, treguan se popullatat mund të

grupoheshin dhe se grupimi korrelonte, duke veçuar si më uniket popullatat e Krujës,

Torovicës dhe Postribës. Për këto tre popullata studimi vijoi duke izoluar (prej

librarive) plazmidet rekombinante nga katër koloni respektivisht për çdo popullatë,

për tu analizuar me anë të enzimave restriktive. Rezultatet treguan se profilet e

prerjeve të fragmenteve gjenike të MTP i dallojnë popullatat njëra nga tjetra. Të

dhënat e përshkruara më sipër u përdorën për ti grupuar popullatat sipas ngjashmërisë

me anë te softit PcoA dhe për të ndërtuar një sërë konkluzionesh të rëndësishme mbi

biodiversitetin e sherbelës së Shqipërisë së veriut.

Fjalëkyçe: monoterpene, PCR-RFLP, gaz-kromatografi, cp-ADN

ABSTRACT

Thirteen natural populations of sage of northen Albania were analyzed to evaluate the

diversity of monoterpene coding genes, and monoterpene composition of their

essential oils. Methodology was based on the PCR based amplification of a central

MTP gene fragment from gDNA and total ARN, cloning of amplicons at pTOPO2.1

plasmids, transformation to E.coli, and plating according to the manufacturers

instructions (Invitrogen), thus creating thirteen libraries. Since the dimensions of the

MTP amplicons from gDNA and total ARN were the same, meaning there were no

introns, work continued for the selection of the most unique populations. cpDNA

were isolated from 13 populations and intergenic primers trnL/F (Ibrahim et al., 2012)

were used to perform PCR-RFLPs. Simultaneosly, esencial oils were extracted and

GC were employed to analyse the quality and quantity of main monoterpene and

sesquiterpene components. Results from both methods, cp-DNA based and GC-

based,showed that populations could be grouped in similar way, leaving aside as the

most distinctive ones the populations of Kruja, Torovica and Postriba. For the last,

recombinant plasmids were isolated from four clones for each library, and restriction

digested. Results show differences among the three populations. Results from the

above work were used to group populations according to similarity based on PCoA

soft, and to build important conclusions on the biodiversity of sage from northern

Albania.

Keywords: monoterpene, PCR-RFLP, gas-chromatography, cp-ADN

DISERTACION - sites.google.com

Documents

Transcript of DISERTACION - sites.google.com