Diagnostik bei neuromuskulären Erkrankungen - dgm.org · Neue Methoden der Genetik 7. DGM Fach-...
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Neue Methoden der Genetik
7. DGM Fach- und Informationstag für Muskelkranke 2014
1. Juni 2014 – Dr. Sabine Uhrig
Diagnostik bei
neuromuskulären
Erkrankungen
2
Grundlagen | Neuromuskuläre Erkrankungen | Diagnostik
AGENDA
Menschliche Muskulatur
3
Bild: www.freynutrition.de
656 Muskeln
30-50% der Gesamtkörpermasse
Arten von Muskulatur
glatt (Organe)
quergestreift (Herz, Skelettmusk.)
Funktion der
Skelettmuskulatur
Bewegung und Stabilität
Wärmehaushalt
Grundlagen | Neuromuskuläre Erkrankungen | Diagnostik
Menschliche Muskulatur
4
Bild: www.fitness-uebung.de
Grundlagen | Neuromuskuläre Erkrankungen | Diagnostik
Signalübertragung
5
unteres Motoneuron
Bild: www.natural-bb.de
Grundlagen | Neuromuskuläre Erkrankungen | Diagnostik
Grundlagen | Neuromuskuläre Erkrankungen | Diagnostik
Chromosomen
46, XX 46, XY
22 Autosomenpaare, 2 Geschlechtschromosomen
6
Grundlagen | Neuromuskuläre Erkrankungen | Diagnostik
Chromosomen
Bild: http://www.genome.gov/Images/EdKit/bio2c_large.gif
7
Autosomal rezessiver Erbgang
8
Hintergrund
Charakteristik
Beide Eltern gesund aber heterozygote Anlageträger
25% der Kinder betroffen
Grundlagen | Neuromuskuläre Erkrankungen | Diagnostik
Autosomal dominanter Erbgang
9
Hintergrund
Charakteristik
Ein verändertes Allel führt direkt zur Erkrankung
Ein betroffener Elternteil, 50% der Kinder krank
Grundlagen | Neuromuskuläre Erkrankungen | Diagnostik
X-chromosomal rezessiver Erbgang
10
Hintergrund
Charakteristik
Weibliche Familienmitglieder meist gesund aber Trägerin
(Fast) nur männliche Familienmitglieder betroffen
Grundlagen | Neuromuskuläre Erkrankungen | Diagnostik
Y X X X
X X X X X Y Y X
11
Grundlagen | Neuromuskuläre Erkrankungen | Diagnostik
AGENDA
Muskelbeteiligung bei
Muskeldystrophien
12 Grundlagen | Neuromuskuläre Erkrankungen | Diagnostik
Bild: http://www.stemrx.in/mosdis.html
Vorstellung ausgewählter
Krankheitsbilder
13
Muskeldystrophien Duchenne´sche Muskeldystropie (DMD)
Gliedergürtel-Muskeldystrophien (LGMD)
Atrophie Spinale Muskelatrophie (SMA)
Myotonie Myotone Dystrophie Typ 1
(Morbus Cruschmann-Steinert)
Grundlagen | Neuromuskuläre Erkrankungen | Diagnostik
Duchenne´sche Muskeldystropie
(DMD) 1/3
14
Bilder: www.thieme.de und http://drugster.info/ail/pathography/462/
Grundlagen | Neuromuskuläre Erkrankungen | Diagnostik
Krankheitsbeginn: Frühe Kindheit
Symptome:
Progressiver Muskelschwund
Leichte intellektuelle Beeinträchtigung
(~ 30 %)
Gelenkkontrakturen
Charakteristische Haltung
Pseudohypertrophie der Waden
Gowers Zeichen
Verlust
Gehfähigkeit: oft vor dem 13. Lebensjahr
Duchenne´sche Muskeldystropie
(DMD) 2/3
Grundlagen | Neuromuskuläre Erkrankungen | Diagnostik
Statistik: ~1 : 3.500 (Jungen)
Vererbung: X-chromosomal-rezessiv
de-novo Mutationen
15
Genetik:
Genort DMD-Gen: Xp21.2
großes Gen mit 79 Exons
> 1.000 Mutationen beschrieben
60 % Deletionen
5-10 % Duplikationen
30-35 % Punktmutationen
Duchenne´sche Muskeldystropie
(DMD) 3/3
16 Grundlagen | Neuromuskuläre Erkrankungen | Diagnostik
Bild: nach Torella et al, JMD 2010
Gliedergürtel-Muskeldystrophien
(LGMD) 1/3
17
Bild: A. Ferbert&W. Kress; medgen 2009, 21:332-336
Grundlagen | Neuromuskuläre Erkrankungen | Diagnostik
Krankheitsbeginn: variabel meist 15 – 30 Jahre
Symptome:
proximal betonte Paresen
Schwierigkeiten beim Aufstehen
Progredienz der Paresen über
2 Jahrzehnte
Verlust
Gehfähigkeit: variabel; oft langsamer Verlauf mit
Verlust der Gehfähigkeit
18 Grundlagen | Neuromuskuläre Erkrankungen | Diagnostik
Gliedergürtel-Muskeldystrophien
(LGMD) 2/3
Statistik: 1:14 500 – 1:123 000
Vererbung: autosomal-dominant
autosomal-rezessiv
Genetik:
Heterogen
24 Gene bekannt
zusätzlich mehr als 25 Genorte
LGMD1 – autosomal-
dominant
LGMD2 – autosomal-
rezessiv
In der Regel Punktmutationen
bzw. kleinere Deletionen die
durch Sequenzanalyse detektiert
werden können
Gliedergürtel-Muskeldystrophien
(LGMD) 3/3
19 Grundlagen | Neuromuskuläre Erkrankungen | Diagnostik
autosomal-dominant
autosomal-rezessiv
Spinale Muskelatrophie (SMA) 1/3
20
Bild: S. Rudnik-Schöneborn & K. Zerres; medgen 2009 21:349-357
Grundlagen | Neuromuskuläre Erkrankungen | Diagnostik
Krankheitsbeginn: ab 1. Monat (Typ I)
bis > 30 Jahre (Typ IV)
Symptome:
Typ I – Sitzen nicht möglich,
Muskelhypotonie
gutes Kontaktverhalten,
differenzierte Fein-Motorik,
fehlende Reflexe, respiratorische
Insuffizienz, Skoliose
Typ II – Sitzen möglich, kein freies
Laufen
Typ III – Freies Laufen möglich
Typ IV – variable Progredienz
Verlust
Gehfähigkeit: keine Gehfähigkeit erlernt (Typ I)
bis zu normaler Gehfähigkeit (Typ IV)
21 Grundlagen | Neuromuskuläre Erkrankungen | Diagnostik
Spinale Muskelatrophie (SMA) 2/3
Statistik:
1 : 6.000 – 1 : 10.000
Heterozygoten-
frequenz 1 : 50
Vererbung: autosomal-rezessiv
Genetik:
Genort SMN1-Gen: 5q13.3
95 % Deletionen von
Exon 7 und 8 des SMN1-
Gens
3-4 % Punktmutationen
im SMN1-Gen
Spinale Muskelatrophie (SMA) 3/3
22 Grundlagen | Neuromuskuläre Erkrankungen | Diagnostik
Myotone Dystrophie Typ 1
(Morbus Cruschmann-Steinert) 1/2
23
Bild: http://medgen.genetics.utah.edu/
Grundlagen | Neuromuskuläre Erkrankungen | Diagnostik
Krankheitsbeginn: variabel , vorgeburtlich (congenital) –
spätes Alter, klassische Form 30 – 40 LJ
Symptome:
Muskelschwäche
Myotonie (= Muskelsteifigkeit)
Facies myopathica
Stirnglatze
Katarakt
Herzbeteiligung
Endokrine Störungen
Intelligenzminderung
Wesensänderungen
Verlust
Gehfähigkeit: variabel
24 Grundlagen | Neuromuskuläre Erkrankungen | Diagnostik
Myotone Dystrophie Typ 1
(Morbus Cruschmann-Steinert) 2/2
Statistik: 1 : 10.000 – 1 : 20.000
Vererbung: autosomal-dominant
* 5 – 34 Kopien gesunde Normalpersonen; 35 – 49 Kopien gesunde Personen, aber instabil (Keimbahn!);
50 – 150 Kopien sorgen für milde Zeichen der MD; 100 – 1.000 Kopien zeigen klassische Form der MD;
über 2.000 Kopien kongenitale MD
Genetik:
Genort DMPK-Gen:
19q13.2-q13.3
CTG-Trinukleotid-Repeat*
Antizipation
Erhöhung der Kopienzahl
in der Keimbahn bei
maternaler Übertragung,
d.h. früheres Auftreten der
Erkrankung in
Folgegenerationen
Warum ist der Nachweis der Mutation
so wichtig?
25 Grundlagen | Neuromuskuläre Erkrankungen | Diagnostik
Sicherung der Diagnose beim Betroffenen:
Möglichkeit genauere Prognose zu erstellen
Möglichkeit auch andere Organe (Herz / Auge etc.) in
Vorsorgeuntersuchungen einzubeziehen
Art der Mutation kann für gentherapeutische Ansätze wichtig sein
Aussage über Wiederholungsrisiko bei Kinderwunsch des Betroffenen
1
Familienabklärung dadurch möglich :
Möglichkeit auf Testung hinsichtlich Anlageträgerschaft (auch
prädiktive Testung - d.h. Testung bevor Krankheitszeichen auftreten)
Vorsorgeuntersuchungen von Familienangehörigen (z.B. entwickeln bei
DMD ~ 20% Konduktorinnen Herzrhythmusstörungen/ Kardiomyopathien)
je nach Erbgang Aussage über Wiederholungsrisiko bei weiterem
Kinderwunsch
bei aut-rez Erbgang Testung des Partners bei Kinderwunsch möglich
2
26
Grundlagen | Neuromuskuläre Erkrankungen | Diagnostik
AGENDA
Die aktuelle Diagnostik verzichtet
größtenteils auf die Genetik
27
Symptome
Ursache
Diagnose
Therapie
Grundlagen | Neuromuskuläre Erkrankungen | Diagnostik
Diagnostik bei Muskeldystrophien
28
5. Genetik
3. Elektromyografie (EMG)
2. Labor (CK)
1. Anamnese
4. Muskelbiopsie (Immunhistochemie)
Grundlagen | Neuromuskuläre Erkrankungen | Diagnostik
Bild: http://www.baur-institut.de/uploads/pics/muskelhisto_muskeldystrophie_01.jpg
Unsere Vision
29
Jeder Patient wird zu Beginn
der Diagnostik
genetisch untersucht
Grundlagen | Neuromuskuläre Erkrankungen | Diagnostik
Die genetische Diagnose kann eine
verbesserte Therapie ermöglichen
30
Symptome
Ursache
umfassende
Diagnose
gezielte
Therapie
Grundlagen | Neuromuskuläre Erkrankungen | Diagnostik
Die Fragestellung bestimmt das
passende Werkzeug der Diagnostik
31
Panel-Diagnostik
[NGS]
• Paralleles
Sequenzieren aller
Genen die mit
einer Krankheit
assoziiert sind
• Hohe Qualität
• Zeit- und Kosten-
effizient
• Hohe Wahrschein-
lichkeit die
ursächliche
Variante zu finden
• Häufige Updates
Einzelgen-Diagnostik
[Sanger]
• Etablierte
Methode
• Nur für einzelne
Gene möglich
• Zeit- und Kosten-
intensiv
• Geringe Chance
die genetische
Variante zu finden
Grundlagen | Neuromuskuläre Erkrankungen | Diagnostik
32
Bild: aus Shendure and Ji (2008) Nat Biotech 26:1135-1145
Sanger Sequenzierung
Grundlagen | Neuromuskuläre Erkrankungen | Diagnostik
Grenzen der Einzelgendiagnostik
33
Vorteile am Beispiel
des NMD-Panels
– 229 Gene
Diagnostik-
Panel
NMD
Einzelgen-
diagnostik
(Theorie)
Einzelgen-
diagnostik
(Praxis)
Untersuchte Gene 229 Gene
(parallel)
229 Gene
(nacheinander) 2-3 Gene
Erfolgsrate ~ 30%
~ 30%
< 10%
Kosten 3.500 € 350.000 € 4.500 €
Bearbeitungszeit 2 - 4 Monate 15 – 20 Jahre 2 - 4 Monate
Grundlagen | Neuromuskuläre Erkrankungen | Diagnostik
Die Fragestellung bestimmt das
passende Werkzeug der Diagnostik
34
Panel-Diagnostik
[NGS]
• Paralleles
Sequenzieren aller
Genen die mit
einer Krankheit
assoziiert sind
• Hohe Qualität
• Zeit- und Kosten-
effizient
• Hohe Wahrschein-
lichkeit die
ursächliche
Variante zu finden
• Häufige Updates
Einzelgen-Diagnostik
[Sanger]
• Etablierte
Methode
• Nur für einzelne
Gene möglich
• Zeit- und Kosten-
intensiv
• Geringe Chance
die genetische
Variante zu finden
Grundlagen | Neuromuskuläre Erkrankungen | Diagnostik
Diagnostische Routine:
Arbeitsablauf einer Panel-Analyse
35
Diagnostik
Befundung
Schritt 5
Labor
Validierung
von
Varianten
Schritt 4
Diagnostik
Auswahl der
wahrsch.
ursächlichen
Varianten
Schritt 3
Bioinformatik
De-Multiplexing
Mapping,
Variant calling,
Annotation
Schritt 2
Labor
Probenvorb. und
Sequenzierung
aller
relevanten Gene
Schritt 1
Grundlagen | Neuromuskuläre Erkrankungen | Diagnostik
Schritt 1: Aktuellste Sequenziertechnik
im Hochdurchsatz-Labor
36
Sequenzierung der Patienten-DNA in
hochspezialisiertem, zunehmend
automatisiertem Labor
Arbeitsinhalte
Routine:
DNA-Isolierung
Anreicherung der gesuchten Gene
Sequenzierung
Forschung & Entwicklung:
Protokoll-Weiterentwicklung
Inputmengen optimieren
optimale Anreicherung
Grundlagen | Neuromuskuläre Erkrankungen | Diagnostik
Schritt 2: Bioinformatische Auswertung
37
Bioinformatische Auswertung der
Sequenzierdaten in einem
vollautomatisierten Prozess
De-Multiplexing
Mapping
Variant Calling
Annotation
Variantenliste für Diagnostik
Feedback an das Labor (Qualität)
Erhebung statistischer Daten
Interpretation der Daten (R&D)
Grundlagen | Neuromuskuläre Erkrankungen | Diagnostik
Arbeitsinhalte
38
Interpretation der Variantenlisten durch
ein Expertenteam
Auswertung der genetischen Varianten
Beurteilung im medizinischen Kontext
Auftrag zur Validierung an Sanger-Labor
ggf. Anforderung von
Segregationen
Schritt 3: Biologisch-medizinische
Interpretation der Daten
Grundlagen | Neuromuskuläre Erkrankungen | Diagnostik
Arbeitsinhalte
39
Validierung von pathogenen Varianten
durch ein unabhängiges Verfahren
(Sanger-Sequenzierung)
Design von variantenspezifischen Primern
Sanger-Sequenzierung
Auswertung / Abgleich mit NGS-Daten
ggf. Anfordern einer weiteren
möglichen pathogenen Variante
Schritt 4: Bestätigung von Varianten
durch zweite biotechn. Methode
? !
Grundlagen | Neuromuskuläre Erkrankungen | Diagnostik
Arbeitsinhalte
40
Abschließende Interpretation der
validierten Varianten und Erstellung
eines medizinischen Befundes
Arbeitsinhalte
• Auswertung der bestätigten Varianten
• Erstellung eines med. Befundes
• 8-Augen-Prinzip
• verständlicher Befund an Arzt (2-3 Seiten)
Research & Development:
• Panel-Design
• Panel-Updates
• Veröffentlichungen
Schritt 5: Erstellung eines
medizinischen Befundes
!
Grundlagen | Neuromuskuläre Erkrankungen | Diagnostik
CeGaT bietet derzeit Panel-Diagnostik
für 9 NMD-Krankheitsbilder an
41
Panels N
eurom
uskuläre Erkrankungen
NMD01: Spinale Muskelatrophie (21 Gene)
NMD02: Charcot-Marie-Tooth und sensorische
Neuropathien (71 Gene)
NMD03: Kongenitale und distale Myopathien (55 Gene)
NMD04: Gliedergürtel-Muskeldystrophien (26 Gene)
NMD05: Muskeldystrophien (31 Gene)
NMD06: Kongenitale myasthene Syndrome und
Arthrogryposis (29 Gene)
NMD07: Myotonien (11 Gene)
NMD08: Metabolische Myopathien (27 Gene)
NMD10: Walker-Warburg-Syndrom (13 Gene)
Grundlagen | Neuromuskuläre Erkrankungen | Diagnostik
Statistik NMD Panels
(einzelne Subpanels)
42
23%
16% 61%
NMD-02 (Charcot-Marie-Tooth und
sensorische Neuropathien)
positiv unklar negativ
Gesamt: 111
26%
21%
53%
NMD-03 (kongenitale und distale
Myopathien)
positiv unklar negativ
Gesamt: 53
40%
21%
39%
NMD-04 (Gliedergürtel-
Muskeldystrophien)
positiv unklar negativ
Gesamt: 38
50%
14%
36%
NMD-05 (Muskeldystrophie)
positiv unklar negativ
Gesamt: 14
Grundlagen | Neuromuskuläre Erkrankungen | Diagnostik
Statistik NMD-Panels (gesamt)
43
28%
20%
52%
NMD (alle)
positiv unklar negativ
positiv 91 28%
unklar 66 20%
negativ 173 52%
gesamt 330
Grundlagen | Neuromuskuläre Erkrankungen | Diagnostik
CeGaT GmbH
Paul-Ehrlich-Str. 17
D-72076 Tübingen
Tel: +49 7071 / 56 54 400
Fax: +49 7071 / 56 54 422
www.cegat.de