DIAGNOSIS OF BRUCELLOSIS - ACFS · 2018-11-22 ·...

มาตรฐานสนคาเกษตร

มกษ. 10402-2561

THAI AGRICULTURAL STANDARD

TAS 10402-2018

การชนสตรโรคบรเซลลา

DIAGNOSIS OF BRUCELLOSIS

สานกงานมาตรฐานสนคาเกษตรและอาหารแหงชาต กระทรวงเกษตรและสหกรณ

ICS 11.220 ISBN XXX-XXX-XXX-X

รางZ


มกษ. 10402-2561

THAI AGRICULTURAL STANDARD

TAS 10402-2018


DIAGNOSIS OF BRUCELLOSIS

สานกงานมาตรฐานสนคาเกษตรและอาหารแหงชาต

กระทรวงเกษตรและสหกรณ 50 ถนนพหลโยธน เขตจตจกร กรงเทพฯ 10900

โทรศพท 0 2561 2277 โทรสาร 0 2561 3357

www.acfs.go.th

ประกาศในราชกจจานเบกษา ฉบบประกาศและงานทวไป เลม 126 ตอนพเศษ 186 ง

วนท 28 ธนวาคม พทธศกราช 2556

(2)

คณะกรรมการวชาการพจารณามาตรฐานสนคาเกษตร

เรอง การชนสตรโรคบรเซลโลซส

1. อธบดกรมปศสตว หรอผทอธบดมอบหมาย ประธานกรรมการ นางสาวมนยา เอกทตร ทปรกษากรมปศสตว นางสาวเรขา คณตพนธ นายสตวแพทยชานาญการพเศษ

2. ผแทนกรมปศสตว กรรมการ

3. ผแทนสานกงานมาตรฐานสนคาเกษตรและอาหารแหงชาต กรรมการ นายชยศร มหนตชยสกล

นายสงขลา จลกะเศยน

4. ผแทนสานกควบคม ปองกน และบาบดโรคสตว กรมปศสตว กรรมการ

นางสาวชญาน เจนพานชย

นายโรจนชนะ ปรากฎชอ

นางสาวขวญชนก แกวปราณต

5. ผแทนสถาบนสขภาพสตวแหงชาต กรมปศสตว กรรมการ

นางสาวเรขา คณตพนธ

นายอสระ สรกนก

นางสาวลขณา รามรน

6. ผแทนคณะสตวแพทยศาสตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร กรรมการ

รองศาสตราจารยธระพล ศรนฤมตร

รองศาสตราจารยเกรยงศกด ไพรหรญกจ

7. ผแทนคณะสตวแพทยศาสตร มหาวทยาลยขอนแกน กรรมการ

ผชวยศาสตราจารยอรญ จนทรลน

ผชวยศาสตราจารยไชยพศร ธารงยศวทยากล

8. ผแทนคณะสตวแพทยศาสตร มหาวทยาลยมหดล กรรมการ

ผชวยศาสตราจารยวทวช วรยะรตน

นายกฤษฎา ใจชน

นางสาวขวญวลย มากลน

9. ผแทนสตวแพทยสภา กรรมการ

รองศาสตราจารยพพฒน อรณวภาส

10. ผแทนสมาคมโคเนอแหงประเทศไทย กรรมการ

นายสรชย เปยมคลา

นายมนส เรยบรอย

(3)

11. ผแทนสมาคมผเลยงโคนมไทย-โฮลสไตลฟรเชยน กรรมการ

12. ผแทนสมาคมผเลยงสกรแหงชาต กรรมการ

13. ผแทนสมาคมเวชศาสตรชนสตรทางสตวแพทยไทย กรรมการ

ผชวยศาสตราจารยคมกฤช เทยนคา

นายรชฎ ตนตเลศเจรญ

14. รองศาสตราจารยกตตศกด อจฉรยะขจร กรรมการ

ผทรงคณวฒดานการชนสตรโรค

15. ผแทนสานกกาหนดมาตรฐาน กรรมการและเลขานการ

สานกงานมาตรฐานสนคาเกษตรและอาหารแหงชาต นายพทกษ ชายสม นางสาวมนตรา ลกขณา

(4)

โรคบรเซลลา (Brucellosis) หรอโรคแทงตดตอ มสาเหตจากการตดเชอแบคทเรยบรเซลลา (Brucella spp.)

เปนโรคท กอใหเกดความสญเสยทางเศรษฐกจตออตสาหกรรมการเลยงปศสตว โรคบรเซลลา

เปนโรคระบาดสตวตามพระราชบญญตโรคระบาดสตว พ.ศ. 2558 และเปนโรคทอยในบญชรายชอ

โรคระบาดสตวบกขององคการโรคระบาดสตวระหวางประเทศ (World Organisation for Animal Health;

OIE) ดงนนประเทศไทยจงตองมวธการชนสตรโรคบรเซลลาทสอดคลองกบมาตรฐาน OIE เพอใหไดผล

การชนสตรโรคท ถกตองและเปนทยอมรบ คณะกรรมการมาตรฐานสนคาเกษตรจงเหนควรจดทา

มาตรฐานสนคาเกษตร เรอง การชนสตรโรคบรเซลลา

มาตรฐานสนคาเกษตรน กาหนดขนโดยใชเอกสารตอไปนเปนแนวทาง

มนยา เอกทตร. 2552. โรคบรเซลโลสสและการชนสตรในประเทศไทย. พมพครงท 1. สถาบน

สขภาพสตวแหงชาต, กรงเทพฯ.

World Organisation for Animal Health (OIE). 2009. Chapter 2.4.3 Bovine Brucellosis. Paris.

World Organisation for Animal Health (OIE). 2016. Chapter 2.1.4 Brucellosis (Brucella abortus, B. melitensis and B. suis) (Infection with B. abortus, B. melitensis and B. suis). Paris.

มกษ. 10402-2561

1



1. ขอบขาย

มาตรฐานสนคาเกษตรน กาหนดการชนสตรโรคบรเซลลาในโค กระบอ แพะ แกะ และสกร ครอบคลม

ตงแตตวอยางเพอการชนสตร การตรวจรอยโรค การเพาะแยกและตรวจจาแนกเชอแบคทเรย การตรวจหา

สารพนธกรรม และการตรวจหาการตอบสนองทางภมคมกน

2. นยาม

ความหมายของคาทใชในมาตรฐานสนคาเกษตรน มดงตอไปน

2.1 โรคบรเซลลา (Brucellosis) หมายถง โรคในสตวและคนทมสาเหตจากการตดเชอแบคทเรย Brucella spp.

ซงในมาตรฐานนครอบคลมเชอ B. abortus, B. melitensis และ B. suis

2.2 โคและกระบอ (cattle and buffalo) หมายถง สตวเคยวเอองขนาดใหญ (large ruminant) ในวงศ Bovidae

2.3 แพะและแกะ (goat and sheep) หมายถง สตวเคยวเอ องขนาดเลก (small ruminant) ในวงศ Bovidae

วงศยอย Caprinae

2.4 สกร (pig) หมายถง สตวในวงศ Suidae

2.5 การชนสตรโรค (diagnosis) หมายถง การตรวจสอบเพอหาสาเหตหรอหลกฐานขอเทจจรงประกอบ

การวนจฉยโรค

2.6 ตวอยางควบคมผลบวก (positive control sample) หมายถง ตวอยางทมเชอ สวนประกอบของเชอ

หรอแอนตบอดตอเชอ ซงเมอนาไปผานกระบวนการทดสอบตามขนตอนตางๆ เชนเดยวกบตวอยาง

ทตองการทดสอบแลวใหผลบวก

2.7 ตวอยางควบคมผลลบ (negative control sample) หมายถง ตวอยางทไมมเชอ สวนประกอบของเชอ

หรอแอนตบอดตอเชอ ซงเมอนาไปผานกระบวนการทดสอบตามขนตอนตางๆ เชนเดยวกบตวอยาง

ทตองการทดสอบแลวใหผลลบ

2.8 รอยโรค (lesion) หมายถง พยาธสภาพหรอลกษณะผดปกตทปรากฏในเนอเยอหรออวยวะ

มกษ. 10402-2561

2

3. ขอกาหนด

การชนสตรโรคบรเซลลา ใหเปนไปตามตารางท 1 สาหรบรายละเอยดขนตอนการปฏบตของแตละวธ

อาจแตกตางกนในหองปฏบตการแตละแหง และตองเปนวธชนสตรทประกาศโดยองคการโรคระบาดสตว

ระหวางประเทศ (World Organisation for Animal Health; OIE) หรอเผยแพรในวารสารทางวชาการ

ทเปนทยอมรบระดบระหวางประเทศ หรอมการประเมนความใชได (validation) แลววามความไว (sensitivity)

และความจาเพาะ (specificity) ในระดบทยอมรบได

ตารางท 1 วธการชนสตรโรคบรเซลลา

รายการ วธการชนสตร

1. ตวอยางเพอการชนสตร ตรวจสอบและบนทกขอมลของตวอยางทไดรบ ดงน

1.1 ตวอยางทใชในการชนสตรโรคบรเซลลา

1.1.1 โคและกระบอ ใหเกบตวอยางอยางใดอยางหนง หรอหลายอยางรวมกน

ดงตอไปน

1) อวยวะ เชน ตอมนาเหลอง มาม เตานม มดลก อณฑะ

2) เยอหมตวออน (fetal membranes)

3) ลกสตวทแทง หรอ ของเหลวในกระเพาะอาหาร ปอด มาม จากลกสตวทแทง

4) สารคดหลงจากชองคลอด (vaginal discharge)

5) นานม

6) ซรม

7) นาเชอ

8) ของเหลวหรอหนองจากขออกเสบ

9) ผลตภณฑจากนานม

1.1.2 แพะและแกะ ใหเกบตวอยาง ตามขอ 1.1.1

1.1.3 สกร ใหเกบตวอยาง ตามขอ 1.1.1

1.2 การเกบตวอยางตองปองกนการปนเปอนจากเชอจลชพจากสงแวดลอม

1.3 เกบรกษาตวอยางทอณหภม 4-10˚C นาตวอยางสงหองปฏบตการภายใน 12 h

หากไมสามารถสงตวอยางภายในวนท เกบตวอยางได ใหแชแขงตวอยางใน

นาแขงแหง หรอตแช ทอณหภม -20˚C หรอตากวา แลวนาสงหองปฏบตการ

ในวนถดไป

มกษ. 10402-2561

3


2. การตรวจรอยโรค 2.1 ตรวจสภาพของสตวเพอดรอยโรค อยางใดอยางหนง หรอหลายอยางรวมกน

ดงตอไปน

1) อณฑะอกเสบ

2) มดลกอกเสบ

3) ขออกเสบ

4) ตอมนาเหลองบวมโต

5) เตานมอกเสบ กรณทสงสยการตดเชอบรเซลลาในแพะและแกะ และบนทกผล

เพอใชประกอบการยนยนผลการชนสตรโรค

2.2 ผปฏบตการชนสตรซาก ควรระมดระวงสขอนามยและใชอปกรณปองกน

การตดเชอบรเซลลาทเหมาะสมขณะปฏบตงาน

3. การตรวจหา

และจาแนกเชอบรเซลลา

(agent identification)

ดวยวธการยอมส

(staining methods)

3.1 นาตวอยางอวยวะหรอตวอยางทเปนของเหลว เชน รก สารคดหลงจากชองคลอด

หรอของเหลวในกระเพาะอาหารของลกสตวทแทง ปายบนแผนสไลด

3.2 ตรงตวอยางดวยความรอน

3.3 ยอมสแผนสไลดดวยวธ Stamp’s modification of the Ziehl–Neelsen’s method

3.4 ตรวจตวอยางดวยกลองจลทรรศนแสงสวาง จะพบเชอบรเซลลามลกษณะเปน

coccobacilli หรอแทงสนๆ (short rods) อาจพบอยเปนเซลลเดยว หรอเซลลค

หรอเปนกลม และตดสบานเยน



ดวยวธการเพาะแยกเชอ

(culture)

4.1 นาตวอยางไปเพาะบนอาหารเลยงเชอจาเพาะชนดแขง 2 เพลต และ/หรอ

อาหารเลยงเชอ selective biphasic 2 ขวด

4.2 สงเกตลกษณะโคโลนบนอาหารเลยงเชอชนดแขง ตงแต 4-10 วน หลงเพาะเชอ

หรอสงเกตความขนในอาหารเลยงเชอชนดเหลว ตงแต 4-30 วน หลงเพาะเชอ

4.3 โคโลนของเชอบรเซลลามลกษณะกลม ขนาดเสนผานศนยกลาง 1-2 mm

ขอบเรยบ เมอมองผานอาหารเล ยงเชอกบแสงไฟ จะพบโคโลนโปรงแสง และม

สนาผ งออน รวมทงเมอมองจากดานบน จะพบลกษณะโคโลนนน (convex) มสขาว

ระยะตอมาโคโลนจะขยายใหญขนและมสขน

มกษ. 10402-2561

4




ดวยวธการตรวจระบ

และจาแนกชนด รวมทง

typing (identification

and typing)

5.1 การตรวจระบและจาแนกเชอบรเซลลา โดยการทดสอบรวมกนหลายอยาง

เชน ดลกษณะโคโลน การเจรญเตบโต ลกษณะของเชอหลงการยอมสแกรมหรอ

Stamp’s staining การทดสอบทางชวเคม (urease และ oxidase tests) และ

การทดสอบ slide agglutination test กบ polyclonal anti-Brucella serum

5.2 การตรวจระบและจาแนกชนด (species) และ biovar ของเชอบรเซลลา

โดยการทา phage sensitivity หรอ phage lysis และการทดสอบ agglutination

กบ anti-A, -M หรอ -R monospecific sera รวมทงการทดสอบความตองการ

CO2 ในการเจรญเตบโต การสราง H2S และการเจรญเตบโตบนอาหารเลยงเชอ

ทมส basic fuchsin และ thionin

5 .3 การ typing ใหสงเชอบ รเซลลาชนดเรยบไปยงหองปฏบตการอางอง

เชน สถาบนสขภาพสตวแหงชาต กรมปศสตว



ดวยวธ polymerase

chain reaction (PCR)

6.1 วธ PCR มขนตอนดงน

- สกดดเอนเอ

- เพมจานวนดเอนเอเปาหมายแบบทวคณโดยใชไพรเมอรจาเพาะใหมจานวน

มากพอทจะตรวจพบได

- แยกแถบดเอนเอดวยวธอเลกโทรโฟรซส (electrophoresis)

- ตรวจหาลาดบสารพนธกรรมเพอยนยนความจาเพาะของแถบดเอนเอ



สายพนธวคซน

(identification of

vaccine strains)

ใชวธ PCR โดยใชไพรเมอรจาเพาะตอเชอสายพนธวคซน หรอดการเจรญเตบโต

ห ล งจากก ารเพ าะแยก เชอ เพ อ แยกสาย พ น ธ วค ซน B. abortus S19 ,

B. melitensis Rev.1 และ B. abortus RB51


การตอบสนองทาง

ภมคมกน (detection of

immune response)

ดวยวธ rose bengal test

(RBT)

8.1 วธ RBT เปน buffered Brucella antigen tests โดยมหลกการของการทดสอบ

คอ แอนตบอดในตวอยางซรมจบกบแอนตเจนของเชอบรเซลลาในภาวะทเปนกรด

8.2 นาตวอยางซรมมาผสมกบแอนตเจนของเชอบรเซลลาทยอมส rose bengal

ในอตราสวนทเทากน คนใหเขากนบนเพลต

8.3 อานผลจากปฏกรยาการเกาะกลม (agglutination) ท 4 min ซงมลกษณะ

คลายตะกอนละเอยด/หยาบ สามารถมองเหนไดชดเจนดวยตาเปลา

มกษ. 10402-2561

5




ภมคมกนดวยวธ

fluorescence

polarisation assay

(FPA)

9.1 วธ FPA มหลกการของการทดสอบ คอ การตรวจหาแอนตบอดในตวอยาง

ซรม โดยใชแอนตเจนของเชอบรเซลลาทเคลอบดวยสารเรองแสง (fluorescein

isothiocyanate; FITC) และตรวจวดระดบการเรองแสงโดยใชเครอง fluorescence

polarisation analyser

8.2 นาตวอยางซรมมาเจอจางในระดบความเขมขนตางๆ และอานคาการกระจาย

ของแสง (light scatter) ของตวอยางซรมดวยเครอง fluorescence polarisation

analyser ครงท 1

9.3 ผสมแอนตเจนของเชอบรเซลลากบตวอยางซรม (จากขอ 9.2) ท งไว 2 min

และอานคาการกระจายของแสงของตวอยางซรมดวยเครอง fluorescence

polarisation analyser ครงท 2

9.4 แปลผลโดยการนาผลตางระหวางคาการกระจายของแสง ครงท 2 และครงท 1

ไปเปรยบเทยบกบคา threshold level ทหองปฏบตการไดทดสอบความใชได

(validation) แลว




complement fixation

test (CFT)

10.1 วธ CFT มหลกการของการทดสอบ คอ การตรวจหาแอนตบอดในตวอยาง

ซรม โดยแอนตบอดทจาเพาะจบกบแอนตเจนของเชอบรเซลลา เกดเปน

แอนตบอด-แอนตเจนเชงซอน (antibody-antigen complex) และคอมพลเมนต

(complement) ทเตมลงไปจะจบกบแอนตบอด-แอนตเจนเชงซอน ปฏกรยา

ทเกดข นจะมองเหนไดดวยการเตมเมดเลอดแดงทผานกระบวนการทาใหไวตอ

การกระตน (sensitised red blood cell) สวนคอมพลเมนตทไมไดทาปฏกรยาจะ

จบกบเมดเลอดแดง ทาใหเมดเลอดแดงแตก ทงน การแตกของเมดเลอดแดง

(hemolysis) ดไดจากสของฮโมโกลบนในของเหลวสวนบนและตะกอนของ

เมดเลอดแดง ซงจะเปนสดสวนกบระดบของแอนตบอดทจาเพาะในตวอยางซรม

10.2 อานผลการใหคะแนนตามรอยละของการแตกของเมดเลอดแดงในการทดสอบ

และเปลยนคะแนนดงกลาวเปนหนวยของ international complement fixation

test units per milliliter (ICFTU/ml)


การตอบสนองทางภมคมกน

ดวยวธ indirect enzyme-

linked immunosorbent

assay (I-ELISA)

11.1 วธ I-ELISA มหลกการของการทดสอบ คอ การตรวจหาแอนตบอดในตวอยาง

ซรมทจบกบแอนตเจนของเชอบรเซลลา ชนด smooth lipopolysaccharide (S-LPS)

และบงชการเกดปฏกรยา โดยใส antiglobulin-enzyme conjugates

11.2 วดคาการดดกลนแสงดวยเครองอานผลอไลซา (ELISA reader)

มกษ. 10402-2561

6





competitive enzyme-linked

immunosorbent assay

(C-ELISA)

12.1 วธ C-ELISA มหลกการของการทดสอบ คอ การตรวจหาแอนตบอดในตวอยาง

ซรม โดยการทแอนตบอดกบแอนตบอดโคลนเดยว (monoclonal antibody;

MAb) ทตดฉลากดวยเอนไซม แยงจบกบแอนตเจนของเชอบรเซลลา

12.2 วดคาการดดกลนแสงดวยเครองอานผลอไลซา (ELISA reader)


การตอบสนอง

ทางภมคมกนดวยวธ

serum agglutination test

(SAT)

13.1 วธ SAT มหลกการของการทดสอบ คอ การตรวจหาแอนตบอดในตวอยาง

ซรมทเกาะกลมกนกบแอนตเจนของเชอบรเซลลา และเกดปฏกรยาการเกาะกลม

13.2 นาตวอยางซรมมาผสมกบแอนตเจนของเชอบรเซลลา โดยมการเจอจาง

ตวอยางซรมแบบอนกรม คนใหเขากนในหลอดหรอเพลต

13.3 อานผลจากปฏกรยาการเกาะกลม




milk I-ELISA

วธ milk I-ELISA มหลกการเหมอนกบการทดสอบตวอยางซรมดวยวธ I-ELISA




milk ring test (MRT)

15.1 วธ milk ring test ใชตรวจในโคนมและกระบอนมเทานน และมหลกการ

ของการทดสอบ คอ การตรวจหาแอนตบอดในตวอยางนานม โดยใชแอนตเจน

ของเชอบรเซลลาทยอมส haematoxylin แอนตบอดทจาเพาะในตวอยางนานมจะจบ

กบแอนตเจนของเชอบรเซลลา

15.2 เตมตวอยางนานมในหลอด และเตมแอนตเจนของเชอบรเซลลา ผสมใหเขากน

15.3 อานผล โดยตวอยางทใหผลบวกจะพบวงแหวนสมวงในสวนบนของนานม

DIAGNOSIS OF BRUCELLOSIS - ACFS · 2018-11-22 ·...

Documents

Transcript of DIAGNOSIS OF BRUCELLOSIS - ACFS · 2018-11-22 ·...