Epoj 2 BOJHOCAHHTETCKH nPErJlEA CTpaHa 175

UDC: 616.155.392:615-615-277.3]-692

Dejstvo hlorambucila na limfocite Bperiferne krvi bolesnika sa hronicnomlimfocitnom leukemijom - ispitivanje

ultrastrukture celija

Goran Brajuskovic*, Siobodan Marjanovic', Andelija ~karo-Milic*

Vojoomedicinska akademija. *ZPSM - lnstit\lt za p:.\lologiju, tKlinika l.a

hematologiju, Beograd

HroniclIo lim/ocilna lellkemija (HLL) lipa B je mafigna bolesl koju karakreriJe progre­sivnG akumulacija zrelih. monak/ol/skill celija CD 5+ II rana) luz; celijskog cik/usa. UiSlra:;vGnjima palOfizioloJkih mehanizama 'lGsta"ka bolest;, kao i II savremel/im "10­dalitetima "jel/og leecllja posebllu pail/)Il priv/ati moguca II/oga procesa programira­ne celijske smrt; - apopfOze kao progllostickog parametra kad fiLL bolesllika. Bel. ob­zira 110 .'Iva dosligllllca savremene onko/agije. od sliog ulloaenja II/erapijli /952. godi­ne hlorambucil je OSlao lIojcesce primenji\'oll olltineoplaslicki agens u lecellju HLL.8"o1'na eksperilllcncna istrazivan1'a kaka ill vitro, taka i in vivo. palwzafa su mogllcllostc:ilOstatika do ifldukuje proces apoplOze neop/oslitna trallsformisanill celija. U lIasemradu pracel/ je efekClt hlorambuci/a "a limfacite B u 16 uzoraka periferne kli'i boleslli­ka sa klinitkom dijagnozom JILL. Analiza ultras'rllkJure leukemijskilt telijo je pokaza­la da vee; bra} celija 110 dejslva cilOstatika (hforambucifa) reaguje iii aktivisoll}em ce­lijske reakclje l1a sIres ifi procesom apoplOze.

K Ij u i' n ere i' i : leukemija, lilllfocHna, hrollicnai hlorambucilj limfociti

n; apoptoza; mikroskopija, clcktronska.

Uvod

Hronicna limfoeitna leukemija (HLL) tipa B je malig­na bolesl koju karakterise progresivna akumulacija zrelih,

mOlloklonskih celija CD 5+ u ranoj fazi celijskog ciklusa(I). Prvi antineoplaslicki agcns primcnjen u lecenju HLLbio je hlorambucil (Lcukeran). Alkilacija celijskih stmktura,pre svcga molek-u\a DNK, lci:i U osnovi antitumorske nktiv­nosti ovog leka. Bez obzila na sva dostignuca savrcmcne

onkologijc, od svog uvodenja u tcrapiju 1952. godinc hlo­rambucil je ostao najcesce primenjivan anlincoplasticki

agens u lecenju HLL (I).Apoptoza jc poscban tip cetijskc smrti koji se po svo­

joj prirodi i bioloskom zna~aju sustinski razlikujc od nekro~

ze. Eksperimcntna istrazivanja (kako in vitro. lake i in vivo)su pokazala da antineoplasticki agcnsi mogu da indukuju

apoptozu malignih celija (2).

Ovaj proces je poznat kao tcrapijom indukovana apop­

toza. Manji broj malignih celija i bez dejstva antineoplastic­

kih agensa umire procesom spontane apoptoze.

Dosadasnja ispitivanja su, takodc, pokazala da je spo­sobnost antineoplastickih agensa da indukuju proces apop­

toze neoplasticno transfonnisanih celija pozitivan prognos­ticki parametar u Iccenju malignosti (3).

Ispitivanja radena na sveze izolovanim limfocitima Biz peri ferne krvi bolesnika sa HLL. kao i ill vitro ispilivanja

na pril11arnim celijskim Iinijamu istog porckla su pokazalada untineoplasticki agcnsi indukuju proces apoptoze leukc­

mijskih celija.Postoje brojni eksperimentni dokazi da hlorambucil,

nudarabin, 2-hlorodeoksiadcnozin i drugi lekovi. u ill vitrouslovima, indukuju proces apoptozc cclija HLL, i 10 u do­zarna kojc Sli ekvivalentne anima u klinitkoj upotrebi (4-8).Cilj rada je ultrastmktuma analiza dejstva anlineoplastickog

Braju!kovic G, ct al. Vojno,anit Preg12003; 60(2): 175-180.

CTpaHa 176 BOJHOCAHHTETCKH nPErJlEJI 6poj 2

U ovim uzorcima pcrifcrne krvi bolcsnika bilo je teskoIJociti celije u pocetnim fazama procesa spontane apoptoze.Glavna ultrastruktuma karakteristika celija u pocctnoj faziprocesa apoploze je formiranje perifemo lokalizovanih ma­sa heterohromatina. Istovremeno, cclijc I-ILL takode karak­tcri~e proccs periferne kondcnzacije helcrohromatina. aultrastuktumom nivou uoeava se yeti broj celija smanjcnogvolumena sa izrazitom perifemom kondcnzacijom hromali­na (slika I). CcJije koje se nalaze u kasnim fazama procesaspontane apoptoze karakteriSc izrazita kondcnzacija i cito4

plazme i nukleusa. Ovi kondenzacioni procesi z.a posledicuirnaju smanj~nje celijskog volumena. ukleusi postaju sfe­ricni sa potpuno kondenzovanim hromatinom (slika 2).Formiranje apoploznih tcla. u analizovanim uzorcima peri­feme krvi bolesnika sa HLL. nije delcktovano.

~"",t ," . .....~"'-. '< "" ::, .... , ..

51.2- Cclija HLL u procesu spontanc apoplOlc(50000 x)

i ' .:-;~/: ..., ~Tct..Y~_

51. I - Zreli limrocili B iz perirerne krvi bolesnika saHLL (-> apoplozna ':clija) (10000 x)

(':elija HLL). Relko su prisulni pojedlnatni IlInrOClli T. Nu­klcusi celija HLL su umercno nepravilnog oblika sa \'eComkoli~inom periferno lociranog heterohromauna, U vcccm bra­ju nukleusa prismni su. marginalno lokallzovani. nuklcolusi.Retko je uoceno i prisustvo dva nukleolusa. Manjl broj Icu­kcmijskih celija poseduje svetle i sfcricne nukleusc. Citopla­zma ovih celija siromaSna je organclama i najcesce u vidu us­kog pojasa okrufuje krupne nukleuse. U njoJ sc nalaZi manjibroj mitohondrija i nekoliko cistemi hrapavog (granuiiranog)endoplazmatskog retikuluma (hER)(sltka I).

Metode

Rezultati

Uhrastrukturno ispitivanje uzoraka peri ferne krvi boles­nib sa prclhodno nclctcllom HLL, pre cirostatskog rretmana,ukazivalo je na predominantno prisustvo zrclih limfocita B

agensa hlorambucila n3 limfocite B iz perifeme krvi boles­nib sa HLL.

Analizovani su uzord perifeme krvi 16 bolesnika saHLL koji su leteni na Klinici za hematologiju VMA. (;el­voro bolesnika sa prethodno ncletenom HLL tinilo jc prvugrupu analizovanih bolesnika. dok je kod oSlalih bolesnik:1nakan inicijalnom terapijom postignute parcijalnc remisijesprovedena terapija odriavanja. Uzorci peri feme krvi bole­sojka 53 prclhodno neJeccnom HLL. uzimani pre primenccitostatskc terapije. tinili su kontrolnu grupu u nasoj studiji.Efckat hlorambucila na ultrastruktumom nivou pracen jckako n3 uzorcima pcrifcrne krvi bolesnika sa prethodno oe­

lecenom HLL. dobijenih treceg dana ad pOCctka primanjahcmioterapije. tako i 113 uzorcima peri ferne krvi bolesnikasa HLL Uslanju parcijalnc remisije 53 terapijom odrZavanja.

Uzorci cele perircmc krvi bolesnika sa I ml Na-cilrata(kao untikoagulansom) su centrifugovani 15 minula na I()(X}obrtajalmin. Supernatant je odlivan, a u cpruvclu jc dodavan Iml 4%-og rastvorJ glUlaraldehida. Sloj leukocjtaje nakon 15minuta prebacivan u bocicu sa istim fiksativom (9). Uzorak jcse~en u kapi fiksativa na sitne komadc promera Imm1 i zatimjc prcbacen u isti fiksativ (4%-ni rastvor glutaraldchida u0.1 M Na-kakodilall1om pureru, pH 7,3) gdc je dram dva salana tcmcpcraturi ad 4°C. Posle dye do tri brlc promcne u ka­kodilalnom pufcm materijal je poslfiksiran u I%-om ra')tvomO~04 u a,IM Na-kakodialtnom pufem na 4°C u trajanju oddva tasa. Nakon dvc brze promene u Na-kakodilalnom pureruuzorci su prcko noei ostavljani u 4%-om raslVoru uranil aceta­ca, da bi se uvccao kontrasc marerijala. lsecci su porom spro­vedcni krol seriju alkohola (25%. 50%, 70%, 80%. 90% i100%), pa su 2 pUla po 10 minuta driani u propilcnoksidu ra­di dehidratacije i ,.prosvetljavanja·'. Materijal je proiimansmolom na sobnoj tcmpcraturi kroz tri razliCite meSavine pro­pilenoksida i smole Epon (3: I. I: I. 1:3). Uzorci su na laJ na­tin dovcdcni do tiSle smole Epon u kojoj su driani preko noeina sobnoj tcmepraturi. Nakon kalupljenja, u plastitnc kapsulc,izvrScna je polimerizacija smole na lemperaturi cd 60°C u lo­ku lri dana (10). Kalupi su seteni dijamantskim nozem naLKB-ovom uluamikrolomu HI. lsetci su sefeni do deblJ,"eod 30 do 50 nm i stavljani na bakame mrefice, presyuccneparafilmom. Dobijeni isccci su pozitivno "bojcni" 20 minutau 5%-om vodenom rastvoru umnil aceUHa. powm ispirnni rc­destilovallom vodom i sUSeni na vazduhu. OsuSeni preseci sutretirani Reinoldovim rastvorom olovo citrata u trajanju od 10minuta, a zatim su ispirani i ponovo su~ni (10). Osu~ni pre­scci analizovani su na Philipsovom elektronskom mikroskopuTEM 208 S.

"poj 2 BOJHOCAHHTETCKH nPErI1E,!\

.~~) ;:,..,9 "'.(:'-. '\0:, ",

*- ,. '\. '.\ >

. J: .,',....il't. ..f~

SI. 5 - Segment ':elije HLL iz uzorka perife",e krvi bo­

lesnika sa terapijom odtiavanja (<- Goldzijev kompleks)(JOOOOOx)

To su celijc smanjenog yolumena sa potpuno kondcn­lovaninl hipcrhromatinskim !'r~kleusill1a (slika 7b). Prj tomnc postoje morfolo~ki uo~ljive razlikc u tcrapijonl induko­vanam procesu apoptoze, zavisno ad ja~inc citostatskag trc­tmana (inicijalna Icrapija iIi tcrapija adrfavanja). Bez obzirana vrstu slimulusa, praces apopLOzc pokazujc stereolip 1110r­folaskih promena.

~kim karakteristikama potetnih faza procesa apoptoze, tj.sl11anjenim cclijskim volumcnom i kondenzacijom hromati­no (,lib 6).

U odrcdenom broju leukel11ijskih cclija dctektovano jei prisustYo bliskog kontakta mitohondrija sa cislcmom hER(MER). Kako tokom procesa apoptoze citoplazmatske or­ganele ostaju intaktne, uoecne su i apoptoznc cclije sa o~u­

vanim kompleksima mitohondrija i ciSlcmi hER-a (slika7a). Morfolo~ki. eeHje koje umiru \crapijom indukovammproccsom apoptoze nc razlikuju sc od celija koje umiruprocesom spontane apoptoze.

SI. 4 - Nukleus ':elije HLL iz uzorka peri feme krvibolesnika 3. dana terapije sa dubokom invaginaeijom

nukleusnog ovoja (40 000 x)

U veccl11 bra]u nuklcusa uocava se i pojava hipCr1roli­sanih nukleolusa i dilatacija perinukleusnog proslora (slikc3. i 4). Citoplazmu ':elija HLL brakleri~e veti broj sintet­skih organcla, narocito pojava Goldzijevog aparata i sekun­darnih Iizosoma (slika 5). Goldzijev aparat nije uo~en u cc­lijama HLL iz konirolilih uzoraka. Takode, u odnosu nauzorkc pcrifcrnc krvi bolesnika sa HLL pre primene hlo­rambucila, dClcktovan je i Yeci broj celija HLL sa morfolo-

Lcukcmijske cclije U ostalim uzorcima periferne krvi

bolesnika sa IILL karakleri,u nukleusi nepravilnog oblikasa povecanom kolitlnom hctcrohromatina, U odnosu na leu­kemijske celije u kontrolnim uzorcirna - pre lretmana hlo­r:tmbucilom (,lib 3).

ISlovrcmcno, u cunasu na uzorkc peri feme krvi bolcs­

nika pre tcrapije, dctcktovan je povecan braj nuklcusa izra­zito ncpravilnog oblika koji jc posledica brojnih invaginaci­ja nuklcusnog oYoja i fOfmiranih nuklcusnih pseudoinkluli­ja (slika 4).

Crpalla 178 BaJHaCAHIITETCK~1 nPErJlEL\

51. 7. - Celije HLL u lerapijom indukovanom proeesu apoploze

a) Apoptozna <elija u kojoj je deleklovano prisuslvO MER-a (---7 MER)(72 500 x)b) Apoptozna <elija smanjenog volumena (50 000 x)

6poj 2

Diskusija

Elcklronskomikroskopska analiza uzoraka perifernekrvi bolesnika sa klinitkom dijagnozom HLL tipa B je po­kazala da dominanlnu celiju leukoeitnog sloja (buffy COlli)

predslavlja limfoeit B. Uotene morfolo!ke karakteristikecelija odgovaraju ultrastruklumoj slid zrclih oblika mono­nuklcara. odnosno zrclih limfocita B (II, 12). Ovakav clck­

tronskomikroskopski nalazje u skladu sa klini~kim karaktc­ristikama HLL, lj. progrcsivnom akumulacijom zrelih Iim­focil3 B.

UhrastTukturnom analizam uloraka perifeme krvj 00­lesnika sa prethodno neletenom HLL treccg dana citostal­

ske terapijc i bolesnika koji se nalaze u stanju parcijalneremisije (uz terapiju odrfavanja) pracen je efekal hlorambu­cila oa leukemijske celije.

Uporedivanjem uzoraka peri feme krvi bolesnika pre inakan treceg d3na CitOSI:1tskog trctmana uoecne su morfolo­~ke razlike koje mogu biti posledica dejstva hlorambucila.Leukemijske celije, koje ne umiru procesom apoploze, tre­ceg dana tcrapijc posrduju nukleuse izrazito nepravilnogoblika. ave promene u obliku nukleusa obezbeduju pove­canje kontaktne poy~ine, a time i Yeti promet infonnacijaizmedu citoplazme i nukleusa. Kontakt se pospe~uje i poja­yom uskih i dubokih invaginacija nukleusnog oyoja.

Ova r:lzmena signala je dodarno olak~ana i uveca­njem nukleusno-citoplazmalske konlaktne povr~ine for­miranjem nukleusnih pseudoinkluzija. Pojava pseudoin­kluzija nije delcktovana u limfocilima B iz uzoraka peri­ferne krvi bolesnika sa HLL pre primanja citoslatske tera­pije. Pojava nukleusnih pscudoinkluzija jc godinama poz­nata reakcija cclija na dcjstvo razlicitih vrsta lekova (13).Posledicu pojacane razmene signala izmedu nuklcusa i ci­toplazme predstavljaju i vidljive dilalacije pcrinuklcusinihprostora. Nuklcuse leukemijskih celija karaktcri~e i prisu­stvo, najccSce periferno lociranih, promincnlnih nukleolu-

sa sa vecim brojem vidljivih fibrilskih cenUlra. Hipertrofi­sani nuklcolusi prcdslavljaju morfolo~ku odliku intenziv­ne sinleze rRNK (14).

Citoplazma leukemijskih celija kojc ne umiru proce­som apoplolC. takode, pokazuje ll1orfolo~kc znakc intenziv­nije sintetske aklivnosti. U odnosu na citoplazmu Icukemij­skih celija u uzorcima peri ferne krvi bolesnika pre primcnccitostatskog trelmana. prisutan je povccan broj sintetskihorganela narocito poliribosoma i cistemi hER-a.

U odrcdenorn broju cclija deteklovano je i prisustvokontakta mitohondrije i cisterne hER-a. Formiranje MER-aje posledica poja~anih encrgctskih pOlreba celija u uslovimaintenzivne metabolitkc aktivnosti, narocito sinteze proteina(15). Leukemijske <elije karakteri!e i pojava Goldiijevihkompleksa, cije prisustvo nije detcktovano u kontrolnojgrupi analizovanih uloraka. Morfolo~ki z-naci melabolickeaktivnosti. koji se detektuju kod leukemijskih <elija. pred­stavljaju njiho\'u reakciju na dcjstvo antineoplastickogagensa. U uslovima njegovog dejstv3 celije se nalaze u sta­nju stresa. Jcdna od celijskih rcakcija na takve uslovc je sc­Icktivna aktivacija prolcina loplolnog Slrcsa (heat siwekproleill - hsp) - hsp 90 i hsp 70.

Aktivisani hsp protcini utitu na intenziviranje pro­cesa proteinske sintczc i uvccanje metaboli~ke aktivnostisame celije (16, 17). Opisani ultrastrukturni nalaz intcn·zivne merabolitke aktivnosri. kad leukemijskih celija ko­jc ne umiru procesom apoploze. najvi~e odgovara morfo­lo!koj sliei celija kod kojih je aktivirana celijska reakeijana sires.

Posebno je analizovan cfekat hlorambucila nn indukci­ju procesa apoptoze. odnosno morfoloske o<lIike lerapijomindukovanog procesa celijskog umiranja. Analiza ovih uzo­raka je pokazala da bitnih morfoloskih razlika izmedu leu­kcmijskih celija koje umiru procesom spontane i proccsomterapijom indukovane npoptoze ncma. Rezultali nase ultrns­trukturnc analize Icrapijom indukov3nog procesa apoploze

Iipoj 2 BOJHOCAHI1TETCKI1 nPErnEjl CTpaHa 179

idu u prilog lvrdnji da je jednom pokrenu( mchanizam pro­

ccs:J. apoptoze daljc nezavistan od vrste i jacinc stimulusakojim je imlukovan.

TokoJ1l programirane celijske smrti - apoptozc, cito­plazmatske organelc uglavnom ostaju intaktnc. Medutim.kondenz3cioni procesi imuju odrcden efckat i na mitoholl­drijc. Kondcnzacija mitohondrija detektovana je kad cclijaHLL koje umiru ternpijom indukovanim procesom apoptozcu analizovanim uzor~ima peri ferne krvi obolelih. Podaci 0

ultrastruktumim promcnanm rnilohondrija apotpoznih cclijapostaju narocito znacajni nakan objavljivanja Tezuhala ck­spcrimentnog rada Genina i saradnika 2000. godinc (18).Rczuhati njihovog istraiivanja pokazuju da su upravo mito­hondrijc glavni cilj u celiji u 2 hloro-deoksiadenozinom in­dukovanom procesu apoptozc celija I·ILL (18). Smanjcl~e

volumena mitohondrija i kondcnzacija njenog matriksa de­leklovana je i u drugim vrSlam,\ celija koje umiru proccsomapoptoze.

Pojedini 3UWri ovu pojavu nazivaju mitohondrijskapiknoza i smatraju jc ranim dogadajcm tokom procesa apop­toze (\9). Bel. obzira na vrstu stimulusa. mi\ohondrija je

kljucna organela u procesu celijskog umiranja po tipu iJPOP­toze. Kontrolisano oslobadanje citohroma C iz mitohondrijau citosol je neophodan uslov za otpocinjanje egzekutorneraze proccsa apoplOze (20). Upr<lvo zbog toga Koemer i S3­

radnici mitohondriju nazivaju celularnim regulatorom zivo­til i smrti (21). Do danas nijc poznato da Ii uoeena konden­zacija mitohondrija uttee na praees oslobaOanja citohromaC iz milOhondrija u citosol (19).

Zakljucak

Analiza ultrastnJkturc leukcmijskih celija pokazala jeda veci broj celija na dejslvo cilostatika (hlorambucila) rca­guje aktivisanjem celijske rcakcije n3 stres iIi indukcijomprocesa apoptoze.

LITERATURA

I. LaglleatLr L, Delforge A. Broil D, De BruYII C,S"yckmalls P. Chronic lymphocytic leukemic B cellsbut not normal B cells are rescued from <Ipoptosis bycontact with normal bone marrow stromal cells. Blood1998; 91 (7): 2387-96.

2. Thompson ell. Apoptosis in the pathogenesis and treat­ment or disease. Science 1995; 267(5203): 1456-62.

3. Hickman AJ. ApOplOSis induced by aniticancer drugs.Cancer Metastasis Rev 1992; 11(2): 121-39.

4. Begleiter A, Lee K, Israels LG, Mowat MR, JollnstolllB. Chlorambucil induced apoptosis in chronic lym­phocytic leukemia (eLL) and its relationship to clinicalefficacy. Leukemia 1994: 8(Suppl I): SI03-6.

5. ShenkermGII C, Klaper R, Ness-Abmmof R, VislllitzkyV, lema R, Ellis M. et al. Induction of apOlosis bychlorodcoxyadcnosinc and dexamethasone in B­chronic Iymphocylic leukemia. Leuk Lymphoma 1997;28( 1-2): 153-7.

6. Castejoll R, Vargas JA, Briz M, Berrocal E, Romero Y,Cea-Banacloche Je, et al. Induction of apoptosis by 2­chlorodcoxyadcnosine in B cell chronic lymphocyticleukemia. Leukemia 1997; 11(8); 1253-7.

7. Tosi P, Zin:ani PL. Pellacalll A, Ottaviall E, Magag­noli M, Tum S. Loxoribinc afrects fludarabinc activityon rreshly isol:Hcd B-chronic lymphocytic leukemiacells. Leuk Lymphoma 1997: 26(3-4): 343-8.

8. Morabito F, Srelitallo C. Cal/ea I, Dattola A. COllSoleC, Pucci G, et al. In vitro drug-induced cytotoxicitypredicts clinical response to fludarabine in B-cellchronic lymphocytic leukemia. Br J HaemalOl 1998;102(2): 528-31.

9. Mills AE, Emms M, Licata SC. A simple technique forpreparation of bone marrow or peripheral blood buffy

coat cells ror electron microscopy. Ulstrastruct Pathol1990; 14(2): 173-6.

10. Sevells L, Johannessen JV. Embedding. Sectioning andStaining. In: Johannessen JV. cdilOr. Eleclrone Micros­copy in Human Medicine. Vol 1. New York: McGraw­Hill International Book Company: 1978. p. 116-84.

11. O/oil I, RoMieil P, Toro I. Cell types. In: Oloil I. editor.Ultrastructure of Lymphoid Organs: an Elee­tron-Microcopic Alias. Budapest: Ak~\dcmiai Kiado;1975. p. 11-71.

12. Johannessen JV. Leukemias. In: Johannessen JV, edi­tor. Electron Microscopy in Human Medicine. NewYork: McGraw-Hill Imcrnalional Book Company;1980. p. 279-353.

13. Cilodiolly FN. Nucleus. In: Clwdiolly FN, editor. UI­trastnJctural Pathology of the Cell and Matrix. London:Butterworths; 1988. p. 1-181.

14. Skaro~Milic A, Spasic P. A contribution to the study orthe cell nucleus in hun..an breast tumors. VojnosanilPrcgl 1983; 40(3): 190---3. (in Serbian)

IS. Cilodiolly FN. Mitochondria. In; Cilodiolly FN, editor.Ultrastructural Pathology or the Cell and Matrix. Lon­don: Butterworths; 1988. p. 191-328.

16. Morimoto RI. Heat shock: the role or transient induei­bile responses in cell damage. transformation, and dir­rcrcntiation. Cancer Cells 1991: 3(8): 295-301.

17. Morimoto RI, Sarge KD, Abrovaya K. Transcriptionalregulation or heat shock genes. A paradigm for induc­ible genomic responses. J Bioi Chem 1992: 267(31):: 21987-90.

18. Gellini D. Adachi S, Chao Q, Rose DW, Carrera CJ,Coualtl fiB. et al. Deoxyadenosinc analogs induce pro-

Crpalla 180 BOJHOCAHI1TETCKJ1 nPErJlEJ1 6poj 2

grammed cell death in chronic lymphocytic leukemiacells by damaging the DNA and by directly affectingthe mitochondria. Blood 2000; 96( 10): 3537-43.

19. Desagher S, MarThlOIl Jc. Mitochondria as the centralcontrol point of apopwsis. Trends Cell BioI 2000;10(9): 369-77.

20. Cryns V, Yuan J. Proleases to die for. Genes Dev 1998:12(11): 1551-70.

21. Kraemer G, Dallaporra Y. Resche-rigo/l M. The milO­chondrial death/life regulator in apoplOsis and necrosis.Annu Rev Physiol 1998; 60: 619-42.

Radje primljen27. V 2002. god.

Abstract

Brajuskovie G, Marjanovie S, Skaro-Milie A. Vojnosanit Pregl 2003; 60(2):: 175-180.

CHLORAMBUCIL EFFECT ON B LYMPHOCITES IN THE PERIPHERALBLOOD OF PATIENTS WITH CHRONIC LYMPHOCYTIC LEUKEMIA - CELL

ULTRASTRUCTURE INVESTIGATION

B type Chronic lymphocytic Leukemia (B-Cll) is a malignant disease character­ized by the progressive accumulation of morphologically mature, but immunologi­cally dysphunctional CD 5+ lymphocytes in the blood, bone marrow and lymphaticorgans in the early phase of the cell cycle. B-Cll is an example of human malig­nancy caused by alternations in the pathways of programmed cell death - apop­tosis. Recent investigations showed a probable role of apoptosis as a prognosticparamether in B-Cll patients. Since the introduction of chlorambucil in the therapyin 1952, besides all the achievements in modern oncology, chlorambucil remainedthe most common antineoplastic agent in the treatment of ClL. Numerous experi­mental studies, both in vitro and in vivo, showed the capability of ani ineoplasticagents to induce the process of apoptosis of neoplastically transformed cells. Inthis study the effect of chlorambucil on B Iymphocites was monitored in 16 samplesof peripheral blood tarlen from B-Cll diagnozed patients. According to the investi­gations performed in this study by ultrastructure analysis of B-Cll cells, it was con­cluded that chlorambucil either induced apoptosis in B-ClL cells, or activated cellresponse to the stress.

Key words: leukemia, lymphocytic, chronic; chlorambucil;B~lymphocytes; apoptosis; microscopy, electron.

Correspondence to: Gorall Brajuskovic, Vojnomedicinska akademija. ZPSM - Institut za patologiju; Crnotravska17, Beograd, Srbija i Crna Gora; Tei. +381 11662755, Ext. 31264.