Coliformes_Totais

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ETEC “PREFEITO ALBERTO FERES”

CURSO TÉCNICO EM QUÍMICA

MICROBIOLOGIA

Prof.ª Erika – Renato

3º E. T. Q. – Turma B

COLIFORMES TOTAIS NA ÁGUA

Data: 04/05/2010Grupo: Jessica nº 19

Luan nº 23Maira nº 25Richard nº 29

ARARAS – SP

2010



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SUMÁRIO:

Capa ...................................................................................................................................................................... 1

Sumário ............................................................................................................................................................... 2

PARTE I – TESTE PRESUNTIVO ................................................................................................................ 3

Objetivo

Procedimento

Resultados

Discussão

Conclusão

PARTE II – TESTE CONFIRMATIVO ......................................................................................................... 4

Introdução

Objetivo ............................................................................................................................................. 5

Procedimento

Resultados

Conclusão ............................................................................................................................................... 6

PARTE III – CONFIRMAÇÃO DE COLIFORMES FECAIS .................................................................. 6

Introdução

Objetivo

Procedimento ....................................................................................................................................... 7

Resultados

Conclusão ............................................................................................................................................. 8

Referências Bibliográficas



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PARTE I – TESTE PRESUNTIVO

OBJETIVO:

O teste presuntivo dos coliformes tem como característica e objetivo principal detectar apresença de coliformes na água. Nesse procedimento, usamos o caldo lauryl triptose, cujaconcentração inicial do meio em cada tubo depende do volume das amostras.

A pesquisa de coliformes é baseada nas características do grupo bastonete que produzemácidos e gás a partir da lactose, fazendo com que seja identificada ou não a presença de coliformes,devido a presença de gás no tubo de Duran após 24 horas na estufa bacteriológica á 35° C.

PROCEDIMENTO:

Preparar o meio de cultura (caldo lauryl triptose), utilizando 2,5 g para 70 ml de H2O d. Apóspreparar o caldo em um erlenmeyer de 250 ml, leve-o ao microondas por 30 segundos, tomandosempre cuidado para que não ocorra desnaturação protéica do caldo. Depois que o caldo atingir

temperatura ambiente, verifique e corrija o pH próximo de 7,0 (neutro).

Para início de nossa pesquisa de coliformes, vamos utilizar 5 tubos de ensaio e mais 5 tubos deDuran (um tubo de Duran para cada tubo de ensaio). Colocamos o tubo de Duran com a boca parabaixo dentro do tubo de ensaio.

Pipetamos com a pipeta volumétrica 10 ml do caldo e colocamos nos tubos de ensaio, estandocientes de que não pode haver ar no tubo de Duran, e sim o caldo lauryl triptose, depois disso, tampe otubo de ensaio com algodão para que possa ir á autoclave. Prepare as pipetas de 10 ml enrolando-ascom jornal e organizando-as na autoclave juntamente com o caldo preparado e pipetado dentro dostubos de ensaio.

Depois de esperar o tempo necessário para a autoclave esterilizar o material a ser trabalhado,cada grupo trabalhará com uma quantidade da água coletada á ser analisada, nesse caso 10 ml (mas asanálises devem ser feitas com 20 ml, 10 ml, 1 ml e 0,1 ml para obter o número mais provável decoliformes levando em consideração a presença de coliformes em determinada quantidade de tubos,considerando a concentração). Com o material esterilizado, bancada limpa com álcool etílico 70%,usando devidamente os EPI’s (máscara, luvas, óculos de segurança, jaleco etc.) e bico de Bunsenligado, vamos começar a preparar o nosso teste presuntivo.

Trabalhando sempre com o material perto do fogo, pipete do copo de Béquer 10 ml da amostra

de água; passe a pipeta próxima ao fogo; e coloque no tubo de ensaio que já contém o caldo; feche otubo; agite-o levemente e guarde-o na estante para tubo de ensaio. Faça o mesmo procedimento nosoutros tubos de ensaio.

Após a preparação dos tubos de ensaio, higienize a estufa bacteriológica com álcool etílico 70%,coloque os tubos de ensaio na estufa á 35° C durante 24 horas. Após esse tempo, faça a leitura dostubos, onde encontrar gás dentro do tubo de Duran significa que aquela amostra contém coliformes.Observe a imagem abaixo com gás no tubo de Duran, resultado positivo para coliformes. Os tubos queapós 24 horas não deram positivos para coliformes devem ser reincubados durante mais 24 parafazer uma nova leitura e uma segunda confirmação dos resultados.



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RESULTADOS:

Na leitura, podemos considerar que os tubos de 10 ml, 1 ml e 0,1 ml deram o resultado positivopara coliformes. Com isso, utilizamos os resultados para saber o Número mais Provável (NMP) decoliformes em 100 ml de água, seguindo a tabela de NMP de coliformes, ou estimando pela fórmula deThomas:

NMP/100 ml = Número de tubos positivos . 100 .ml de tubos negativos . ml de todos os tubos

Os resultados obtidos são:

10 ml 1 ml 0,1 ml5 + 5 + 0 + NMP = 240 coliformes5 + 0 + 0 + NMP = 23 coliformes

Comparando os resultados, podemos observar uma grande diferença de coliformes nasanálises. Isso pode ocorrer por determinados erros, onde são chamados de Erros Determinados, ouseja, erros que podem ser corrigidos; entre eles podemos citar a contaminação do meio, erro natécnica ou até mesmo erro na manipulação ou coleta da amostra.

Porém, os resultados encontrados podem nos mostrar que existem sim coliformes na águaatravés do teste presuntivo. Agora será necessário o teste confirmativo, para confirmar a presença decoliformes na água em estudo.

DISCUSSÃO:

Segue abaixo a tabela de NMP (Número mais provável de coliformes), onde foram encontrados

os nossos resultados:

Número de tubos positivos NMP por 100 ml Limite de confiança de 95%10 ml 1 ml 0,1 ml 100 ml Inferior Superior

5 0 0 23 7 705 5 0 240 68 750

CONCLUSÃO:

Com o teste presuntivo de coliformes, conseguimos observar que realmente existem coliformes

na água. Porém, não podemos afirmar que esses coliformes são fecais. Com resultado positivo nadetecção de coliformes na água coletada, vamos para o teste confirmativo para saber se essa água emestudo tem a presença de coliformes já que o caldo lauryl triptose não tem o objetivo de inibir ocrescimento de bactérias entéricas.

PARTE II – TESTE CONFIRMATIVO

INTRODUÇÃO:

O grupo de bactérias determinado coliformes totais são aquelas que não causam doenças, visto

que habitam o intestino de animais mamíferos inclusive o homem.As bactérias do grupo coliforme são consideradas os principais indicadores de contaminação



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fecal. O grupo coliforme é formado por um número de bactérias que inclui os generos Klebsiella,Escherichia, Serratia, Erwenia e Enterobactéria. Todas as bactérias coliformes são gran-negativasmanchadas, de hastes não esporuladas que estão associadas com as fezes de animais de sanguequente e com o solo. As bactérias coliformes fecais reproduzem-se ativamente a 44,5oC e são capazesde fermentar o açúcar.

O uso da bactéria coliforme fecal para indicar poluição sanitária mostra-se mais significativo

que o uso da bactéria coliforme "total", porque as bactérias fecais estão restritas ao trato intestinal deanimais de sangue quente. A determinação da concentração dos coliformes assume importância comoparâmetro indicador da possibilidade da existência de microorganismos patogênicos, responsáveispela transmissão de doenças de veiculação hídrica, tais como febre tifóide, febre paratifóide, desistiriabacilar e cólera. OBJETIVO:

O objetivo desse teste confirmativo é ter a certeza de que existem coliformes na água emestudo, já que o caldo lactosado bile verde brilhante, tem como objetivo de inibir o crescimento edesenvolvimento de bactérias, porém conservando e selecionando desta forma os coliformes.

PROCEDIMENTO:

Após a leitura do teste presuntivo, prepare o caldo lactosado bile verde brilhante, pesando 8 gdo meio de cultura e diluindo-o. Corrigir o pH para 7,2 (neutro). Coloque durante 30 segundos nomicroondas tomando extremo cuidado para que não derrame o caldo causando uma desnaturaçãoprotéica.

Coloque o caldo na autoclave, juntamente com os tubos que deram positivos para a presençade coliformes no teste presuntivo. Aguarde a esterilização. Higienize a bancada para que não ocorra

contaminação do meio.

Depois do material esterilizado, procure trabalhar sempre próximo ao fogo. Com a alça deplatina, transfira uma alíquota de cada tubo positivo do teste presuntivo para os novos tubos deensaio com tubos de Durham com o novo caldo que determinará os coliformes presentes na água emestudo.

Incubar os novos tubos com o caldo lactosado bile verde brilhante para o teste confirmativo naestufa bacteriológica, durante 48 horas a 35° C. Depois, fazer a leitura como positivos os tubos deDurham com gás, usando a tabela NMP de coliformes para obtenção do resultado de coliformes em100 ml, ou estimar utilizando a fórmula de Thomas.

RESULTADOS:

Os resultados do teste confirmativo estão selecionados abaixo:

10 ml 1 ml Total de tubos5 + 5 + 10 NMP = 240 coliformes por 100 ml5 + 0 + 5 NMP = 23 coliformes por 100 ml

OBSERVAÇÃO: Nesta análise, não foram utilizado os tubos de 0,1 ml, pois do teste presuntivo todosderam negativo para coliformes, e para a confirmação, foram utilizados somente tubos que haviam

obtido o resultado positivo para coliformes no teste anterior.



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Tubo de Durham com resultado positivo paracoliformes.

Resultado positivo para coliformes encontrandonos tubos de Durham presença de gás (setas).

Com relação à análise do teste presuntivo e do comparativo, podemos observar que o númerode coliformes não se alterou. Mas devemos levar em conta que esses são resultados prováveis quepodem ter um limite de confiança de 95%. Devemos lembrar também que alguns erros do testepresuntivo ou confirmativo, podem ter ocasionado um resultado ainda menos preciso.

CONCLUSÃO:

Neste teste confirmativo, conseguimos identificar coliformes na água em estudo na mesmaquantidade de coliformes por 100 ml no teste presuntivo. Porém, devemos levar em conta o ErroDeterminado que pode ser gerados por vários fatores citados na primeira parte desse mesmorelatório.

PARTE III – CONFIRMAÇÃO DE COLIFORMES FECAIS

INTRODUÇÃO:

Um outro grupo de bactérias freqüentemente relacionado à água é o grupo dos coliformes. Oscoliformes fecais vivem no intestino dos animais como bois, porcos, cachorros, gatos, homens etc, semlhes causar prejuízos. Eles são adquiridos quando penetram pela pele ou quando são ingeridosjuntamente com a água ou alimentos contaminados e são constantemente liberados em grandequantidade, junto com as fezes.

Quando se faz a análise da água e se encontra contaminação por coliformes fecais significa quenaquele local houve descarga de esgoto em período recente, o que aumenta a probabilidade de haverali ovos e larvas de parasitas intestinais, visto que, estas formas também podem ser eliminadas com asfezes.

Desse modo, a presença de coliformes fecais, que são mais facilmente detectáveis em examesde rotina de laboratório do que as formas parasitárias, indica que a água não deve ser utilizada,porque há um risco aumentado de contaminação.

OBJETIVO:

É necessário distinguir os coliformes fecais dos demais coliformes. Os coliformes fecais temcomo ambiente natural locais com temperaturas elevadas, portanto, na estufa bacteriológica eles

serão capazes de crescer a 44,5° C. Nesse teste, iremos avaliar o número de coliformes fecais.



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PROCEDIMENTO: Preparar o caldo Escherichia coli (EC), diluindo-o. Corrigir o pH para 6,9 (ácido-neutro).

Aquecer no microondas durante 30 segundos tomando cuidado para que não ocorra desnaturaçãoprotéica. Leve-o para a autoclave juntamente com os outros materiais necessário para esterilização.Trabalhando sempre perto do fogo, transfira com a ajuda de uma alça de platina, uma pequena porçãode cada tubo positivo para os tubos contendo o caldo EC com os tubinhos de Durham.

Incubar durante 24 na temperatura 44,5° C. Fazer a leitura identificando como positivo os

tubos de gás. Utilize a tabela de NMP de coliformes para saber a quantidade mais próxima decoliformes em 100 ml, ou estimar pela fórmula de Thomas.

RESULTADOS: Os 10 tubos de 10 ml e os 5 tubos de 1 ml deram resultados positivos para coliformes fecais. Os

valores estão representados na tabela abaixo:

10 ml 1 ml Total de tubos5 + 5 + 10 NMP = 240 coliformes fecais por 100 ml5 + - 5 NMP = 23 coliformes fecais por 100 ml

DISCUSSÃO:Art. 4.º Para os fins a que se destina esta Norma, são adotadas as seguintes definições: VI - coliformes totais (bactérias do grupo coliforme) – bacilos gram-negativos, aeróbios ou

anaeróbios facultativos, não formadores de esporos, oxidase-negativos, capazes de desenvolver napresença de sais biliares ou agentes tensoativos que fermentam a lactose com produção de ácido, gáse aldeído a 35,0 ± 0,5ºC em 24-48 horas, e que podem apresentar atividade da enzima ß-galactosidase.A maioria das bactérias do grupo coliforme pertence aos gêneros Escherichia, Citrobacter , Klebsiella

e Enterobacter , embora vários outros gêneros e espécies pertençam ao grupo; VII - coliformes termotolerantes – subgrupo das bactérias do grupo coliforme que fermentam a

lactose a 44,5 ± 0,2ºC em 24 horas; tendo como principal representante a Escherichia coli, de origemexclusivamente fecal;

Art.11. A água potável deve estar em conformidade com o padrão microbiológico conformetabela 1, a seguir:



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CONCLUSÃO:

Na identificação de coliformes fecais, podemos concluir que todos os coliformes á cada 100 mlsão coliformes fecais, tendo no primeiro resultado 240 coliformes fecais/100 ml e no segundoresultado 23 coliformes fecais/100 ml.

Talvez durante a manipulação dos caldos e das amostras, podem ter ocorrido algum tipo de

contaminação microbiológica. Conseguimos então identificar a presença de diferentes coliformes noteste presuntivo e confirmatório; no teste de coliformes fecais, conseguimos concluir que todos oscoliformes encontrados desde o inicio da análise eram coliformes fecais.

Como mostra o Art. 11. da portaria 518/2004 – Ministério da Saúde, em nenhum momentopode existir presença de coliformes fecais na água, desde a saída do tratamento até a distribuição daágua, ou seja, essa água não faz parte da classe 1 de água, própria para consumo humano. Podemostambém abranger esses resultados pela turbidez e quantidade de coliformes na água.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

Ministério da Saúde. Portaria 518/2004.<http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/portaria_518_2004.pdf>Acesso: 30 de Maio de 2010.

UNESP <http://www.ibb.unesp.br/departamentos/Educacao/Trabalhos/obichoquemedeu/bacteria_coliformes_fecais.htm> Acesso: 30 de Maio de 2010.

Laboratório de Ensino de Ciências e Tecnologia da USP

< http://www.darwin.futuro.usp.br/site/ecologia/quadroteorico/c_coliformes.htm>Acesso: 30 de Maio de 2010.

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