КАБІНЕТ МІНІСТРІВ УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ БІОРЕСУРСІВ

В І ПРИРОДОКОРИСТУВАННЯ УКРАЇНИ

ННІ Рослинництва, екології і біотехнологій

Кафедра агробіотехнологій

Cільськогосподарська біотехнологія Методичні вказівки до виконання лабораторних робіт для студентів спеціальності

6.051401 «Екобіотехнологія»

Київ – 2014

2

УДК 606:63

Наведено основні методичні вказівки для виконання лабораторних робіт з дисципліни «Сільськогосподарська біотехнологія».

Розглянуто і схвалено на засіданні кафедри агробіотехнологій протокол № 5 від

5 грудня 2013 року.

Рекомендовано до друку Вченою радою ННІ рослинництва, екології і

біотехнологій, протокол № 4 від 19 грудня 2013 року.

Укладачі: О.В. Лобова, кандидат біологічних наук, доцент

О.О. Пилипчук, аспірант

Рецензент: Коломієць Ю.В., кандидат біологічних наук, доцент

Навчальне видання

Рекомендації до виконання лабораторних робіт для студентів спеціальності 6.051401

«Екобіотехнологія»

Укладачі: О.В. Лобова, кандидат біологічних наук, доцент

О.О. Пилипчук, аспірант

Відповідальний за випуск: к.б.н., доц. Лобова О.В.

3

Лабораторна робота № 1 Тема: Введення в культуру in vitro і культивування

ізольованих клітин і тканин рослин

1.1. Стерилізація обладнання та рослинних об’єктів для проведення робіт

з культурою ізольованих клітин і тканин рослин

Робота з культурою ізольованих клітин і тканин вимагає посуду, кількість й

розмаїтість якого залежить від мети та завдань досліджень, прогнозованих об’ємів,

сезонності тощо.

Для приготування живильних середовищ потрібні: мірні колби (0,05 – 3 л.);

хімічні склянки (0,05 – 1 л.); мірні циліндри (10 – 100 мл.); піпетки Мора (1 – 10

мл.); мікропіпетки градуйовані (0,01 – 2 мл.); самплери (автоматичні піпетки або

дозатори на 0,05; 0,2; 0,5; 0,005 мл.); скляні палички різного розміру; лійки різного

розміру; скляні бактеріальні фільтри або фільтри Зейтца з прокладками з

мембранних фільтрів “Сінпор”.

Посуд для зберігання живильних середовищ та вирощування ізольованих

експлантатів: колби плоскодонні; флакони (25 – 500 мл.); чашки Петрі; (скляні і

разові пластикові); пробірки біологічні.

Інструменти: пінцети анатомічні різного розміру; скальпелі; мікробіологічні

голки; ножиці медичні або загальнохірургічні; пальники спиртові; настільний

стерилізатор для дотримання стерильності інструментів під час роботи.

Матеріали: негігроскопічна вата і марля з метою виготовлення ватно –

марлевих пробок, ватних тампонів для піпеток й скляних трубок, дезинфекції та

стерилізації робочих поверхонь, інструментів, рук. Марлю використовують також

для фільтрування середовищ, під час стерилізації дрібного насіння (виготовляють

мішечки).

Для запобігання висихання середовищ використовують ватні пробки,

алюмінієву фольгу, клейкі стрічки.

Пробірки з культивованими експлантатами і рослинами-регенерантами

розміщають для зручності перенесення в штативи різних типів та розмірів.

Підготовка посуду для роботи в умовах in vitrо. Для біотехнологічних

досліджень використовують жаро- і кислотостійкий посуд із скла типу “Пірекс”, що

характеризується стійкістю до підвищених температур та механічних пошкоджень.

Посуд для приготування, збереження живильних середовищ і культивування

експлантатів ретельно миють.

Найпоширенішим і найнадійнішим способом очищення скляного посуду є

його обробка концентрованою сірчаною кислотою з біхроматом калію протягом 4 –

6 год з наступним промиванням значною кількістю проточної води протягом 5 – 10

хв та дворазовим споліскуванням дистильованою.

Приготування хромової суміші: 9,2 г розтертого кристалічного біхромату

(K2Cr2O7) поміщають в 100 мл концентрованої сірчаної кислоти (H2SO4) обережно

помішують і нагрівають у фарфоровій чашці (склянці) на водяній бані до

розчинення.

Після споліскування дистильованою водою посуд висушують у сушильній

шафі при +130°С і закривають ватними або целофановими ковпачками.

4

Стерилізація посуду і матеріалів. Посуд перед стерилізацією ретельно миють і

висушують. Культуральний посуд (колби, пробірки, чашки Петрі, флакони і т. п.)

перед заповненням їх живильним середовищем попередньо стерилізують сухим

жаром у сушильних шафах. Тривалість стерилізації: при +150°С – 2,5 год., +160°С –

2, +170°С – 1 год.

Слід зазначити, що вологий жар, порівняно із сухим, ефективніше вбиває

мікроорганізми та їх спори. Автоклавування здійснюють при 0,2 МПа (+133°С)

протягом 25 – 30 хв.

Стерилізація інструментів. Стерилізацію інструментів попередньо

здійснюють нагріванням сухим жаром у сушильній шафі при +140°С протягом 2 год

або кип’ятінням у воді.

У ламінарному боксі попередньо і в процесі роботи інструменти ще раз

стерилізують і поміщають у фарфорову склянку із 96% етиловим спиртом з

наступним фламбуванням у полум’ї пальника. Стерильний інструмент

використовують лише для одноразової маніпуляції.

Стерилізація ламінарної кімнати. Стерилізація операційної кімнати або

ламінарного боксу є обов’язковим процесом, в результаті якого повинні бути

усунені джерела можливої інфекції рослинних культур – бактерії, гриби тощо.

Стерилізація складається з двох етапів. На першому етапі приміщення

повинно утримуватися в належному порядку, тому його в першу чергу очищають

від пилу і бруду та дезинфікують.

Другим етапом обробки є стерилізація ультрафіолетом, для чого

використовують кварцові бактерицидні лампи з експозицією від 1 до 3 годин.

Для поверхневої стерилізації рослинних тканин використовують значну

кількість хімічних речовин, як правило тих, що містять активний хлор (гіпохлорид

натрію, хлорне вапно, гіпохлорид кальцію, хлорамін), двохлористу ртуть (сулему),

пероксид водню. Рідше використовують бром, сірчану кислоту, в особливих

випадках антибіотики.

Гіпохлоридом натрію (NaClO) стерилізують насіння та інші рослинні

тканини (0,5 – 5,0% розчином протягом) 1 – 20 хв. Річні стебла деяких хвойних

дерев стерилізують 5% розчином 30 – 60 с.

Стерилізацію ніжних тканин (листки та стебла сукулентів, поверхневі

меристеми) проводять слабким розчином (0,5%) протягом 5 хв. Пиляки після

полоскання у 95% етанолі стерилізують в 10% (за об’ємом) розчині NaClO протягом

10 – 15 хв.

Гіпохлорид кальцію [Ca(ClO)2] менш токсичний для тканин, ніж NaClO. У

концентрації 90 г/л застосовують для стерилізації бульбо- і коренеплодів (протягом

20 – 25 хв), пагонів деревних (15 – 30 хв), пагонів та стебел трав’янистих культур –

(10 – 15 хв).

Хлорамін діє на рослинні тканини слабше, ніж NaClO та Ca(ClO)2.

Всі розчини з активним хлором використовують один раз і готують

безпосередньо перед вживанням. Об'єкти після стерилізації промивають 2 – 3 рази

стерильною дистильованою водою.

Двохлориста ртуть (сулема) HgCl2 надзвичайно токсична, яку

використовують в низьких концентраціях та в оптимально вентильованому

5

приміщенні. В основному застосовують 0,1% розчин HgCl2, а також інші її сполуки,

зокрема мертіолят, діацид та фамосепт.

Після стерилізації у розчинах ртуті тканини промивають 4 – 5 разів

дистильованою H2О у кожній порції впродовж 10 – 15 хв. Розчин сулеми можна

використовувати кілька разів.

Етиловий спирт (С2Н5ОН) застосовують у концентрації 70 – 95% для

стерилізації і покращення дії інших стерилізуючих розчинів. Рослинні об’єкти

занурюють на кілька секунд у спирт, обпалюють у полум’ї спиртівки ( даний

прийом застосовують кілька разів залежно від щільності покривних тканин) і

поміщають у стерильну чашку Петрі.

Бром (Br) у вигляді 1% розчину застосовують для стерилізації лише сухого

насіння, оскільки бром токсичний і пошкоджує зародки, якщо вони мало захищені

(наприклад, у злакових). Після стерилізації бромною водою промивають

дистильованою.

Фенолом (С6Н5ОН) стерилізують плоди і кісточки плодових порід дерев

(персика, сливи, вишні) у вигляді 5% розчину протягом 5 хв.

Антибіотики порівняно нетоксичні для рослин, проте їх мало викорис-

товують внаслідок обмеженої бактеріологічної активності. Додавання розчинів

антибіотиків у живильне середовище ефективне у випадках, коли тканини

неможливо простерилізувати звичайними засобами внаслідок інфікування їх

внутрішніх областей спорами бактерій або грибів. З цією метою частіше

використовують пеніцилін, стрептоміцин, біоміцин, тетрациклін, окситетрациклін,

тераміцин, бацитрацин, ауреоміцин та ін. Оскільки антибіотики є термолабільними

речовинами, їх стерилізують лише методом фільтрування і додають до

охолодженого середовища. При використанні антибіотиків для стерилізації

необхідно ретельно підібрати концентрацію, яка б достатньо згубно діяла на

мікроорганізми, але не була токсичною для тканин (антибіотики в різних

концентраціях можуть стимулювати або пригнічувати ріст ізольованих культур).

Рослинні тканини після стерилізації тричі промивають у стерильній

дистильованій воді 10 – 20 хв у кожній порції і поміщають на живильне середовище

для рослин (насіння) або калюсогенезу (фрагменти стебла, листків, бульб,

коренеплодів). У деяких випадках, особливо при роботі з деревними культурами,

рекомендують попередню перевірку експлантата на інфікування сапрофітною

мікрофлорою. Для цього після стерилізації експлантанти поміщають на

безгормональне живильне середовище, яке містить лише мінеральні складові,

вітаміни, сахарозу і агар. Через 8 – 10 діб оцінюють стан тканини, відбирають

неінфіковані експлантанти і переносять їх на середовище з регуляторами росту. Цей

захід дозволяє культивувати лише стерильний матеріал і економити дефіцитні

складові середовища.

1.2. Приготування живильних середовищ для культивування

ізольованих клітин і тканин.

Основою створення живильних середовищ для вирощування культур тканин

рослин є суміші мінеральних солей (макро- і мікроелементів) і, оскільки живлення

культивованих тканин є гетеротрофним, джерело вуглецю вводять в склад

середовища у вигляді сахарози або глюкози.

6

Крім вуглецю, кисню і водню, для росту тканин необхідний азот у вигляді

нітратної або амонійної солі, фосфор – фосфату, сірка – сульфату та іони К+, Са

2+,

Mg2+

. Загальна концентрація мінеральних елементів найбільш висока у середовищах

Мурасіге і Скуга, Ніча, Гамборга та Шенка.

Для отримання і підтримання культур тканин та клітин використовують

фітогормони, приготування яких наведено в таблиці 1.

Таблиця 1

Клас

Назва Скоро-

чення

Мол.

маса

Прийняті

концентрації,

М

Приготування

вихідного розчину Примітка

Ау

кси

ни

2,4-

дихлорфенокс

и-

оцтова кислота

Індоліл-3-

оцтова

кислота

β-

індолілмасляна

кислота

α-нафтилоцтова

кислота

2,4-

Д

ІОК

ІМК

НОК

221,0

175,2

203,2

186,2

10-7

– 10-5

10-7

– 10-5

10-7

– 10-5

10-7

– 10-5

Ауксини

звичайно

титрують в

розчині

за допомогою

NaОН

ІОК здатна

легко

окиснюватись

клітинами

рослин; її

рідко доба-

вляють в сере-

довище для

культивування

в якості

єдиного

ауксину

Ци

токін

іни

6-бензиламіно-

пурин

N-ізопентеніл-

амінопурин

6-фурфурол-

аміно-

пурин (кінетин)

БАП

2-іП

К

225,2

203,3

215,2

10-7

– 10-5

10-7

– 10-5

10-7

– 10-5

Цитокініни

звичайно

розчиняють у

розведеному

водою

етиловому

спирті

Зеатин

термолабільний,

тому його

неможна

автоклавувати

Гіб

ерел

іни

Гіберелова

кислота

ГК 346,.4 10-7

– 5 10- 6

Легко

розчиняються

у воді

Термолабільні;

які

неможна

автоклавувати

Приготування маточних розчинів та живильних середовищ. Для економного

використання часу та зусиль готують концентровані розчини макро-, мікросолей,

вітамінів, гормонів (маточні розчини), які зберігають в холодильнику при

температурі +4°С не більше місяця. Розчини вітамінів можна заморожувати і

зберігати у невеликих кількостях протягом 2 тижнів.

Маточний розчин макросолей за MС, де їх концентрація збільшена у 10

разів.

Солі, г/500 мл маточного розчину:

NH4NO3 8,25

KNO3 9,5

CaCl2 x 2H2O 2,2

7

NaH2PO4 0,85

MgSO4 x 7H2O 1,85

На 1л середовища відбирають 100 мл маточного розчину.

Маточний розчин Fe-хелату за MС:

солі, г/200мл маточного розчину:

Na2EDTA x 2H2O 1,492

FeSO4 x 7H2O 1,112

На 1 л середовища відбирають 5 мл маточного розчину.

Вихідний розчин Fe-хелату (200 мл) готують, розчиняють послідовно 1,492 г

Na2EDTA x 2H2O і 1,112 г FeSO4 x 7H2O, після чого доводять його до кипіння.

Маточний розчин мікросолей за MS, де їх концентрація збільшена у 100

разів.

Солі, мг/100мл маточного розчину:

H3BO3 62

Na2MoO4 x 2H2O 2,5

KJ 8,3

MnSO4 x 4H2O 223

ZnSO4 x 7H2O 86

CuSO4 x 5H2O

CoCl2 x 6H2O

зважити по 10 мг кожної

солі і розчинити в 40 мл

води

На 1 л середовища відбирають 1 мл маточного розчину.

Маточний розчин вітамінів.

Вітаміни, мг/100 мл маточного розчину:

В1 (тіамін HCl) 10

В6 (піридоксин HCl) 50

РР(нікотинова кислота) 50

На 1 л середовища відбирають 1 мл маточного розчину. Розчини вітамінів (1,0 і 0,1

мг/мл) готують і безпосередньо розчиняють в бідистильованій воді.

Розчини ауксинів 2,4-Д, НОК, ІОК, ІМК і їх аналогів (наприклад,

концентрацію 1мг/мл) готують шляхом розчинення 100мг речовини в 0,5 – 2 мл

спирту, підігрівають та додають води до 100 мл. Кін, Зеа, 6-БАП розчиняють

попередньо у невеликій кількості 0,5н НCl і при нагріванні додають потрібну

кількість води.

Якщо у середовище необхідно внести абсцизову кислоту (АБК), то її

розчиняють в 70% етанолі і доводять до потрібного об’єму. Гіберелову кислоту

розчиняють безпосередньо у воді і додають у живильні середовища і

простерилізовують через мембранні фільтри. Кокосове молоко добавляють у

живильні середовища і попередньо підігрівають протягом 30 хв. при +60оС й

простерилізовують фільтруванням (діаметр мембранного фільтра 0,2 – 0,45 мкм).

8

Антибіотики, гербіциди та інші речовини, які повністю або частково

розкладаються при автоклавуванні, додають до живильних середовищ (40 – +50оС) у

вигляді профільтрованого (стерильного) розчину, попередньо довівши рН до 5,6 –

5,8.

Після приготування маточних розчинів готують живильні середовища,

приготування яких потребує особливої ретельності, для запобігання помилок

необхідно дотримуватись певної послідовності в роботі (табл. 2).

1. В мірну колбу (циліндр) наливають 250 – 300 мл дистильованої води і додають

точно відмірену кількість кожного розчину макро- й мікроелементів, вітамінів,

регуляторів росту.

2. Зважують необхідну кількість вуглеводів, гідролізату казеїну, пептона і т. п.

3. Наважку агару поміщають в термостійку склянку і заливають холодною

дистильованою водою для набухання, через 15 – 20 хв нагрівають й

помішують до повного розчинення агару (90 – 100оС).

4. Зливають обидва розчини, профільтровують через два шари марлі і доводять

до необхідного об’єму.

5. рН середовища встановлюють на рН-метрі, доводять його до потрібного

значення і додають (краплями) 0,1н КОН, 0,1н NaОН, або 0,1н НСl.

6. Розливають тепле середовище в простерилізовані сухим жаром колби чи

пробірки, закривають ватними пробками або фольгою і ретельно обгортають

навколо горловини склянки.

7. Стерилізують середовище в автоклаві під тиском 0,08 – 0,1 МПа

(t = 115 – 120°С) протягом 20 – 25 хв. Отримані таким шляхом живильні

середовища бажано використати протягом 7 – 12 діб.

8. У робочих зошитах записують склад і приготування живильного середовища,

роблять висновок щодо впливу живильного середовища на ростові процеси in

vitro.

Таблиця 2

Маточні розчини для приготування живильних середовищ

Вихідний

компонент

Наважка Необхідний об’єм

розчину для

приготування 1 л

середовища

за Мурасіге-

Скугом

за Уайтом

Макроелементи, г/л

NH4NO3 16,5 –

100мл

KNO3 19.0 0,8

Ca(NO3)24H2O – 2,0

CaCl2 б/в 3,3 –

MgSO4 7H2O 3,7 3,6

KH2PO4 1,7 –

Na2EДТО 0,37 0,37

FeSO4 7H2O 0,28 0,28

KCl – 0,65

9

1.3. Одержання стерильних експлантів із насіння пшениці, соняшнику

Мета роботи. Підбирають концентрацію стерилізуючого розчину та час

стерилізації насіння кабачків, які забезпечують найвищу ефективність цього

процесу. Отримують стерильне насіння і вирощують з нього асептичні рослини.

Матеріали і обладнання. Мильний розчин, 70% розчин етилового спирту,

стаканчики із стерильною водою, концентрований розчин “Білизни”, стаканчики для

стерилізуючих розчинів, мірний циліндр, насіння кабачків, пробірки з

безгормональним середовищем МС для рослин, чашки Петрі зі стерильним

фільтрувальним папером, стерильні чашки Петрі, марля, пінцети, скальпелі,

спиртівка, етиловий спирт для стерилізації інструментів, ламінар-бокс.

Хід роботи:

1. Готують розчин “Білизни” з концентрацією:

1 частина препарату і 2 води (1:2)

2. Стерильним пінцетом переносять мішечки з насінням у стаканчики з відповідною

концентрацією стерилізуючого розчину і витримують відповідний час.

3. Простерилізоване насіння промивають тричі по 10 хв. у стерильній ди-

стильованій воді. Для цього стерильним пінцетом переносять мішечки із склянки зі

стерилізуючим розчином у склянку із стерильною дистильованою водою.

Витримують 10 хв. Промивання повторюють 3 рази, використовують нову порцію

води.

4. Мішечки з промитим насінням стерильним пінцетом переносять у стерильну

чашку Петрі з проавтоклавованими паперовими фільтрами, щоб забрати надлишок

води.

5. Стерильним пінцетом переносять насіння на безгормональне живильне

середовище у пробірки. Підписують пробірку з зазначенням середовища, виду або

NaH2PO4 H2O – 0,165

Na2SO б/в – 2,00

Мікроелементи, мг/100мл

Н3BO3 620 150

1 мл

MnSO4 4H2O 2230 –

ZnSO4 7H2O – 150

ZnSO4 4H2O 860 –

KJ 83 –

Na2MoO4 2H2O 25 25

CuSO4 5H2O 2,5 4

CoCl2 6H2O 2,5 –

MnCl2 4H2O – 530

Вітаміни, мг/л

Тіамін HCl (В1) 10 10

1 мл

Нікотинова к-та

(РР)

50 50

Піридоксин HCl

(В6)

50 10

10

сорту рослин і дати посадки.

6. Пробірки з насінням поміщають у термостат при температурі 25±1°С.

7. Через 4 – 6 діб перевіряють чистоту посіву і схожість насіння.

8. Після проростання насіння пробірки переносять у термостат з освітленням 400

лк і температурою 25°±1°С.

9. Результати досліджень записують в таблицю 3.

Таблиця 3 Концентрація

розчину

“Білизни” за

об’ємом

Тривалість

стерилізації,

хв

Загальна

кількість

насіння,

шт

Кількість

інфікованого

насіння через

7 діб

Схожість насіння Ефектив

ність

стериліза-

ції (%)

шт % шт %

Лабораторна робота № 2 Тема: Культивування калюсних тканин

2.1. Отримання первинного калюсу з різних експлантатів асептичних рослин

Мета роботи. Навчитись добирати тканини експлантатів та умови культивування

для індукції дедиференціації та калюсоутворення.

Матеріали і обладнання. Рослини різних видів, мильний розчин, концентрований

розчин “Білизни”, склянки для стерилізуючих розчинів, мірний циліндр, стерильна

дистильована вода, пробірки з живильним середовищем, чашки Петрі зі стерильним

фільтрувальним папером, стерильні чашки Петрі, нейлон, пінцети, скальпелі, очні

скальпелі, леза, препарувальні голки, спиртівка, спирт, бінокулярний мікроскоп,

ламінар-бокс.

Хід роботи

Експлантатами слугуть асептичні рослини, отримані з насіння в умовах in vitro

(тютюн, горох, гвоздика, соняшник, помідори).

1. Стерильним пінцетом виймають рослину з пробірки і кладуть в стерильну

чашку Петрі.

2. Притримують пінцетом, стерильним скальпелем розрізають рослину на

експлантати: черешки, листкові пластинки, фрагменти стебла, кореня. На

листках роблять додаткові надрізи на центральній жилці.

3. Експлантати культивують на калюсогенному середовищі у флакончиках, які

підписують з найменуванням типу експлантата (черешок, листок, стебло,

корінь).

4. Культивують у темряві при +25 – 26,5°С. Їх субкультивування проводять

через кожні 3 – 4 тижні і визначають частоту калюсогенезу як відношення

кількості експлантатів з калюсом до загальної кількості висаджених

експлантатів у відсотках.

Отримані дані записують у табл.1.

Таблиця 1

11

Тестування середовищ для індукції калюсогенезу з листкових, черешкових,

кореневих та стеблових експлантатів Ж

иви

льн

е

сер

едо

ви

ще

Типи

експлан

татів

Кіл

ькіс

ть

експ

лан

та

тів, ш

т

Дата

висадки

Дата

індукції

Проц

ент

кал

юсо

ген

езу Стан

калюсу

*

*Стан калюсу оцінюють за такою схемою:

+ + + – білий життєздатний калюс, наростає;

+ + - – калюс у доброму стані, жовтий;

+ - - – в’ялий, темно-жовтий калюс;

- - - – темно-коричневий, нежиттєздатний калюс;

Культивування: первинний калюс з різних тканин експлантатів згаданих

рослин отримують на модифікованих середовищах MС (табл. 2) .

Таблиця 2 Середовища для дедиференціації різних типів тканин експлантатів

з асептичних рослин, мг/л

Складові

середовища

Експлантати з рослин

тютю

ну

тютю

ну

горох

у

гвозд

ики

сон

яш

ни

ка

кар

топ

лі

сон

яш

ни

ка

пш

ени

ці

Макроелементи MС MС MС MС MС MС MС MС

Мікроелементи MС MС MС MС MС MС MС MС

Fe-хелат MС MС MС MС MС MС MС MС

Вітамін В1 MС MС MС MС MС MС MС MС

Вітамін В6 – – 1,0 0,5 0,5 0,8 1,0 0,5

Гідролізат

казеїну

– – – 500,0 – – – –

Мезоінозит 100,0 100,0 100,0 100,0 20,0 20,0 50,0 100,0

БАП – – – – 10,0 – 0,2 –

Кінетин 0,04 0,1 0,2 1,0 – – – –

2,4-Д 0,1 0,1 5,0 2,0 – 2,0 – 0,5-

1,0

НОК – – – 2,0 2,0 – 2,0-

3,0

–

ІОК 3,0 – – – – – – –

Сахароза 30000 30000 25000 25000 20000 20000 20000 25000

Агар-агар 7 г/л

12

2.2. Отримання калюсної тканини з проростків кукурудзи звичайної

(Zea mays L.)

Хід роботи

Експлантатами слугують проростки кукурудзи.

1. Проростки кукурудзи промивають в теплому мильному розчині протягом 5

хв.

2. Відмивають від залишків мила водопровідною водою.

3. Споліскують дистильованою водою.

4. В ламінар-боксі занурюють на 30 с у 70% етанол.

5. Переносять у розчин „Білизни” (концентрацією 1:3 за об’ємом) і витримують

15 – 20 хв за постійного перемішування.

6. Тричі по 10 хв відмивають від залишків стерилянту стерильною

дистильованою водою.

7. Переносять у стерильні чашки Петрі з фільтрувальним папером для

забирання надлишку води з проростків.

8. Стерильним скальпелем розрізають проросток на експлантати і переносять на

живильне середовище для диференціювання.

Культивування здійснюють на середовищі MС з додаванням вітамінів за Уайтом,

мезоінозиту 100 мг/л, гідролізата казеїну 300 мг/л, сахарози 20 мг/л, 2,4-Д в

концентрації 5 – 10 мг/л або 2,4-Д + кінетину в концентраціях

5 – 10 мг/л + 1 мг/л. Культивують на світлі за температури 22 – 24°С протягом 2

тижнів.

Лабораторна робота № 3 Тема: Одержання рослин-генераторів

3.1. Розмноження рослин шляхом вичленення апікальної меристеми з метою

оздоровлення від вірусної інфекції

Хід роботи

1. Готують живильне середовище Мурасіге і Скуга. 2. Вичленення меристеми проводять у боксі з ламінарним потоком повітря. Кінець стебла (4 –

5 мм) відрізають і поміщають у поле зору мікроскопа. Під мікроскопічним контролем

пінцетом із спеціальним пристроєм відрізають 0,2 – 0,5 мм апікальної частини стебла і

відокремлюють кінцеву неклітинну недиференційовану масу – близько 0,1 мм від

верхнього кінця.

3. У стерильних умовах пробірки із стерильним живильним середовищем

відкривають і нахиляють під кутом 45° й, користуючись стерильним пінцетом,

меристему занурюють у живильне середовище. Пробірки закривають ватними

пробками і переносять в термальну кімнату із температурою повітря +25 –

35°С та цілодобовим освітленням люмінесцентними лампами. Через 2 – 3

тижні із меристеми виростає рослина.

4. Вирощені із меристеми рослини в стерильних умовах виймають із пробірок і

живцюють таким чином, щоб кожний із живців мав точку росту.

5. Одержані живці висаджують у живильне середовище, з яких через 1 – 2 тижні

виростають рослини.

6. Формулюють висновки щодо ефективності даного методу і його значення для

оздоровлення та розмноження рослин.

13

3.2. Виділення, культивування апікальних меристем та клональне

мікророзмноження винограду звичайного (Vitis vinifera L.)

Клональне мікророзмноження винограду включає наступні методи:

1) вегетативне розмноження шляхом укорінювання верхівок пагонів, а також

одновічкових експлантатів, які були отримані за повторного живцювання рослин,

розмножених in vitro (коефіцієнт ромноження 1:4), 2) культивування вічок і верхівок

пагонів з утворенням із них численних пагонів на твердому середовищі з

цитокінінами (коефіцієнт розмноження 1:10), 3) проліферація пазушних вічок на

рідкому живильному середовищі з цитокінінами (коефіцієнт розмноження 1:30).

Найвисокопродуктивнішим є спосіб проліферації пазушних вічок (рис. 4.2).

Мета роботи. Виділення апікальних меристем винограду.

Матеріали і обладнання. Зелені пагони винограду, бінокулярна лупа, скальпелі,

леза, пробірки із стерильним живильним середовищем. Хід роботи

1. Із зелених пагонів рослин відокремлюють верхівки розміром 2 – 3 см.

2. У ламінар-боксі верхівки пагонів занурюють у стакан із 70% етиловим

спиртом і витримують 30 – 40 с.

3. Потім верхівки переносять стерильним пінцетом у стакан із гіпохлоридом

натрію на 8 – 10 хв.

4. Простерилізовані пагони промивають у стерильній дистильованій воді 4 – 5

раз протягом 10 – 15 хв.

5. За допомогою бінокулярної лупи скальпелем видаляють апікальні меристеми з

листковими зачатками розміром 0,5 – 0,8 мм.

6. Меристеми з листковими зачатками ставлять у стерильну чашку Петрі із

зволоженим фільтрувальним папером.

7. Виділені меристеми пінцетом розташовують на містки-підтримки з

фільтрувального паперу в біологічні пробірки або безпосередньо занурюють в

рідке середовище у конічні колби, які містять по 2 – 3 мм середовища.

8. В кожну пробірку або колбу висаджують по одній меристемі.

9. Культивують при температурі +23 – 28°С і освітленні 800 – 1000 лк, через

тиждень збільшують освітлення до 2 – 5 тис. лк.

Склад живильного середовища для культивування

апікальних меристем винограду звичайного

Макроелементи МС 100 мл/л

Мікроелементи МС 1 мл/л

Вітаміни Уайта 1 мл/л

Fe-хелат 5 мл/л

μ-Інозит 75 мг/л

6-БАП 2 мг/л

Аденін 80 мг/л

Сахароза 30 г /л

рН 5,0-5,2

14

Лабораторна робота № 4

Тема: Культивування культури ізольованих клітин

і тканин у селекції рослин

4.1. Одержання гаплоїдів з жіночого гаметофіту (гіногенез) рослин

Хід роботи

Практикам відомі деякі способи одержання гаплоїдних рослин з жіночого

гаметофіту.

1. Затримка у запиленні, яка призводить до поділу яйцеклітини без

запліднення.

2. Запліднення пилком іншого виду рослин або пилком, ядра якого вбиті

великими дозами опромінення.

Надзвичайно важливе значення відіграють компоненти насіннєвого зачатку, з

яких розвивається зародок. Найуспішнішим вважають стан зародкового мішка, за

якого повністю відбувається віддиференціювання гаплоїдних елементів

(яйцеклітини, двох синергід і трьох антиподів), потенційна тотипотентність яких

може бути реалізована у вигляді зародків або калюсної тканини. Технологія

одержання гіногенетичних гаплоїдів розроблена і використовується для цукрових

буряків, соняшнику, пшениці та інших культур.

У покритонасінних рослин мегаспорогенез розвиток насіннєвого зачатку і

зародкового мішка проходить відносно швидко – за кілька діб і навіть годин з однієї

материнської археспоріальної клітини нуцелуса шляхом 5 – 6 поділів утворюється

готовий до запилення зародковий мішок.

Мета роботи. Одержати гаплоїдні рослини з жіночого гаметофіту.

Матеріали і обладнання. Квіткові бруньки цукрових буряків, стерилізуючі розчини

(70% етанол, розчин діациду), стерильна дистильована вода, стерильні пінцети,

ланцети, живильні середовища, мікроскоп, ламінар-бокс.

Хід роботи

1. За 2 – 3 доби до початку цвітіння проводять кастрацію материнської рослини –

видаляють маточку.

2. Стовпчик маточки стерилізують розчином діоциду з наступним трьохразовим

промиванням в стерильній воді.

3. Стерильним пінцетом стовпчик маточки переносять у пробірки на живильне

середовище для індукції органогенезу.

4. Пробірки з рослинним матеріалом культивувують в світловій культуральній

кімнаті при температурі +27°С та фотоперіоді

14 годин.

5. Через 25 – 30 діб проводять візуальне визначення частоти утворення калюсу

та морфологічних структур на експлантатах (табл. 1).

15

Таблиця 1

Загальна

кількість

експлантатів,

шт

Кількість

асептичних

експлантатів, шт

Кількість

експлантатів, що

утворили калюс,

шт

Кількість

морфогенних

структур, шт

Лабораторна робота № 5 Тема: Використання біохімічного аналізу в

клітинній інженерії рослин

5.1. Визначення активності нітратредуктази в калюсній тканині і експлантат

in vitro та in vivo

Мета роботи: визначити активність нітратредуктази

Матеріали і обладнання: водяна баня, ФЕК або СФ; фарфоровая ступка, 0,05 М

калій-фосфатний буфер, рН 7,5; нітрат натрію -0,01 М; н-пропанол 1%-вий (за

об'ємом).

Хід роботи

1. При визначенні активності НР in vivo наважку матеріалу (0,1 г) інкубують в

реакційній суміші об'ємом 5 мл наступного складу: 0,05 М калій-фосфатний

буфер рН 7,5, нітрат натрію - 0,01 М, н-пропанол 1,0%-вий.

2. Інкубацію проводять в темряві при струшуванні на водяній бані протягом 1

год.

3. Для визначення нітритів відбирають аліквоту об'ємом 2 мл і додають по 0,5 мл

сульфанілової кислоти і №1-нафтилетилендіамінів.

4. Через 15 хв кількість утворених нітритів визначають спектрофотометрично при

548 нм або на ФЕК.

5. При визначення активності НР in vitro рослинний матеріал 1 г розтирають в

ступці або гомогенізують з 5 мл 0,05 М фосфатного буферу (рН 8,0), потім

переносять в цетрифужну пробірку і центрифугують протягом 20 хв при 15000

об/хв.

6. Після центрифугування беруть 2 мл ферментного розчину, переносять в

пробірки, додають 1 мл 0,1 KNO3 і 1 мл 0,028 М розчину НАД Н, який

приготовлений на 0,05 М фосфатному буфері, вміст пробірки перемішують і

пробірку поміщають на водяну баню на 30 хв при 72 °С.

7. Після закінчення інкубації дію фермента зупиняють додаванням в пробірку 1

мл 10% оцтової кислоти.

8. Для осадження білків в пробірку додають 3 мл насиченого розчину сульфату

амонію.

9. Одночасно проводять контрольне визначення. Для цього беруть в пробірку 2

мл ферментного розчину, додають 1 мл 0,1 KNO3 і 1 мл 0,028 М розчину НАД

Н і відразу вносять 1 мл 10% оцтової кислоти, а потім додають 3 мл насиченого

розчину сульфатамонію.

16

10. Після осадження білків рідину в контрольній і дослідній пробірках, фільтрують

через фільтри в сухі стакани і в фільтратах визначають вміст нітритів.

Кількість нітритів визначають за різницею між вмістом нітритів в дослідній і

контро льній пробах.

11. Для визначення кількості нітритів 5 мл одержаного екстракту переносять в

пробірку і додають 0,6 мл 06% розчину сульфанілової кислоти в 2 н НС1 і

0,2 мл 0,6% розчину α-нафтиламіну в 2 н НС1. Через 30 хв після стабілізації

забарвлення розчину проводять колориметрування при 540 нм.

Лабораторна робота № 6 Тема: Проведення аналізу ДНК

6.1. Виділення плаз мідної ДНК із бактеріальних Мета роботи: віділити плазмідну ДНК клітиніз бактеріальних клітин.

Хід роботи

1. 1,5 мл нічної культури переносять у пробірку, охолоджують на водяній бані і

центрифугують протягом 3 хв. При 8000 g, ретельно видаляють супернатант

(надосад). Залишок нічної культури зберігають при 4 °С.

2. До осаду додають 200 мкл холодного буферу для лізису, який містить

глюкозу - 50 мМ, Тріс - 25 мМ (рН 8,0), ЕЦТО - 10 мМ, лізоцим - 4 мг/мл.

Лізоцим у вигляді порошку дод іють у розчинів останню чергу. Осад ретельно

суспендують і інкубують протягом 20 хв на льодяній бані.

3. Додають 400 мкл свіжоприготовленого, охолодженого на льоду розчину, який

містить 0,2 н МаОН, 1%-ний НДС. Закривають пробірку кришкою і

перемішують, перевертаючи .'і - 4 рази (безвзбовтування). Залишають

пробірку на льодяній бані на 5 хв.

4. Суспензія повинна посвітлішати і стати більш в'язкою.

5. Додають 300 мл холодного розчину ацетату калік (рН 4,8), різко струшують і

інкубують на льодяні бані протягом 15 хв. Центрифугують протягом 5 хв,

потім переливають супернатантв чисту пробірку.

6. Додають 500 мкл ізопропанола і інкубують протягом 15 хв при кімнатній

температурі. Центрифугують протягом 5 хв, видаляють супернатант, ретельно

висушують осад.

7. Осад розчиняють в 100 мкл ТЕ-буфера, який містить 10 мМ Тріс (рН 8,0), 1

мМ ЕДТО (рН 8,0), і додають розчмн РНКази А (10 мг/мл) до кінцевої

концентрації 100 мкг/мл. Вихідний розчин РНКази в ТЕ-буфері попередньо

інкубують протягом 15 хв на киплячій бані.

8. Додають рівний об'єм суміші фенол:хлороформ (1:1). Попередньо фенол

переганяють і насичують 0,1 М Тріс (рН 9) на киплячій бані. Струшують 2 - 3

хв і потім центрифугують протягом 5 хв. Відбирають водну фракцію. Операцію

повторюють до повного зникнення інтерфази.

9. До водної фракції додають 5 М розчин №С1 до кінцевої концентрації 0,3 М, а

потім 2 об'єми етанола. Виморожують при температурі 20 °С протягом 30 -

40 хв, відокремлюють осад центрифугуванням. Висушують пробірку і

розчиняють ДНК в 50 - 100 мкл ТЕ-буфера.

17

6.2. Виділення ядер і ядерної ДНК з рослинних тканин

Мета роботи: оволодіти методикою виділення ДНК.

Матеріали і обладнання: термостат, водяна баня, лабораторна центрифуга,

ступка, рослини-регенеранти (калюс), міні центрифуга, автоматичні піпетки.

Хід роботи

1. Готують буферний розчин, склад якого:5М сечовина; 0,1 ЕДТО; 0,1Мтріс-

НС1рН 8,0.

2. Зважують 5 - 10 г листків або калюсної тканини, поміщають в фарфорову

ступку.

3. Розтерають тканину в ступці з рідким азотом, потім додають 20 мл

буферного розчину приготованого раніше.

4. Проводять подальшу гомогенізацію, додаючи 1 мл насиченого водою фенолу

та 2 мл 20 % додецилсульфату натрію.

5. Залишають для лізису при кімнатній температурі на 15-20 хвилин,

центрифугують суміш при 5000 об/хв протягом 30 хвилин.

6. Переносять водний шар в пробірку та проводять двократну депротеїнізацію

сумішшю, яка містить: 75% фенол; 24% хлороформ; 1% ізоаміловий спирт.

Центрифугують протягом 3 хвилин при 1600g.

7. ДНК осаджують, додаючи до водної фази два об'єми етанолу і охолоджують

при -20°С протягом 30 хвилин.

8. Центрифугують суміш протягом 10 хвилин при 4000g.

9. Заливають рідину і розчиняють осад ДНК в ТЕ буфері склад якого: 10 мМ

тріс-НСІ, рН-7,6; 1 мМ ЕДТО, рН-8,0; рН буферу 7,6.

Лабораторна робота № 7 Тема: Використання біохімічних маркерів для

оціювання стійкості сільськогосподарських рослин

до стресів 7.1. Визначення пероксидазної активності в рослинах

Пероксидаза – фермент, який каталізує окиснення ферментів, ароматичних

амінів та інших сполук за допомогою пероксиду водню або органічних пероксидів.

Метод базується на вимірюванні оптичної густини продуктів реакції, які утворилися

в результаті окиснення гваякола за певний проміжок часу.

Мета роботи. Визначити активність пероксидаз спектрофотометричним методом.

Матеріали і обладнання. 0,15 М фосфатний буфер з рН 5,4, 0,15% розчин

пероксиду водню, розчин гваякола (183 мг гваякола на 25 мл води), СФ або ФЕК,

рослинний матеріал.

Хід роботи

1. Наважку листків або калюсу (500 мг) розтирають в ступці з невеликою

кількістю фосфатного буферу і переносять в мірну колбу на 25 мл і доводять

фосфатним буфером до мітки, через 10 хв відстоювання екстракт

центрифугують при 4000 об/хв протягом 10 хв.

2. В кювету спектрофотометра з робочою довжиною 1 см вносять 0,5 мл

субстрату, 1,5 мл 0,15 М буферного розчину (рН 5,4),

18

0,5 мл ферментативної витяжки (центрифугата) і 0,5 мл

0,15%-вого розчину пероксиду водню.

3. Попередньо встановлюють в нульовому положенні стрілку амперметра

приладу за контрольною кюветою, в яку вносять компоненти реакційної

суміші, але замість пероксиду водню – таку ж кількість води (0,5 мл).

4. Перше вимірювання роблять через 20 с. Облік проводять декілька раз через 20

с протягом 2 хв. Оптичну густину вимірють при 470 нм.

5. Активність пероксидази (А) виражають в відносних одиницях на 1 г сирої

маси за формулою:

6. (D2 – D1) V V2 60

А = ,

(t2 – t1) V1 н

де D1 – оптична густина розчину на початку досліду, D2 – оптична густина розчину

на кінець досліду, t1 і t2 – час початку і кінця досліду, с, н – маса наважки, г, V –

загальний вихідний об’єм витяжки, мл, V1 – об’єм, взятий для проведення реакції,

мл, V2 – загальний об’єм речовини в кюветі, мл, 60 – коефіцієнт переводу в хвилини.

7.2 . Визначення активності поліфенолоксидази в рослинах

Поліфенолоксидаза – фермент, який каталізує окиснення орто-дифенолів в

присутності кисню з утворенням води і орто-хінонів. Механізм дії ферменту

базується на можливості утворення комплексів міді ферменту з киснем.

Мета роботи. Визначити активність поліфенолоксидази.

Матеріали і обладнання. Проростки рослин, калюсна тканина, ФЕК або СФ, різні

субстрати, які характеризуються певним спектром максимального поглинання:

пірокатехін 366 – 420 нм, ДОФА (діоксифенілаланін) 436 – 475 нм, хлорогенова

кислота 328 – 400 нм, розчин пірокатехіна 0,05 М, фосфатний буфер 1,15 М, рН 7,4,

ферментна витяжка.

Хід роботи

1. Наважку рослинного матеріалу 500 – 1000 мг розтирають в ступці в

фосфатному буфері (рН 7,0 – 7,4), переносять в мірну колбу на 25 мл,

доводять до мітки і центрифугують.

2. Визначення з пірокатехіном проводять за довжини хвилі 420 нм.

3. В кювету спектрофотометра або ФЕКа товщиною 1 см поміщають 0,5 мл

ферментного препарату, 2,0 мл фосфатного буферу рН 7,4 і 0,5 мл розчина

пірокатехіна, який додають останнім з першою краплею й включають

секундомір. Вимірювання проводять протягом хвилини з інтервалом в 20 с.

4. В контрольну кювету замість пірокатехіна додають воду.

5. Результати виражають або за зміною оптичної густини за 1 хв на 1 г сирої

маси або 1 мг білка, або в кількості окисненого субстрату за 1 хв на 1 мг білка.

19

Література

1. Биотехнология растений: культура клеток / Под ред. Р.Г. Бутенко // Пер. с англ.

Негрука В.И. – М. – 1989. – 274 с.

2. Биохимический анализ в клеточной инженерии растений. – К. – 1988. –

49 с.

3. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза

растений. – М.: Наука, 1964. – 272с .

4. Бутенко Р.Г. Некоторые физиологические проблемы при культивировании in vitro

картофеля // Регуляция роста и развития картофеля. – М., 1990. –

С. 88 – 98.

5. Кушнір Г.П., Сарнацька В.В. Мікроклональне розмноження рослин. – К.: Наук.

думка, 2005. – 450 с.

6. Лутова Л.А., Проворов Н.А., Тиходеев О.Н. и др. Генетика развития растений. –

СПб: Наука, 2000. – 359 с.

7. Маруненко И.М., Кучко А.А., Олейник Т.Н. Методические рекомендации для

получения исходного селекционного материала картофеля с помощью методов

клеточной селекции. – К. – 1991. – 26 с.

8. Мезенцев А.В. Методические указания по регенрации и размножению люцерны с

использыванием культуры тканей, клеток и протопластов. – М. – 1980. – 24 с.

9. Мельничук М.Д., Новак Т.В., Кунах В.А. Біотехнологія рослин. – К.:

ПоліграфКонсалтинг, – 2003. – 520 с.

10. Мельничук М.Д., Григорюк І.П., Н.В.Новак, Кляченко О.Л., Коломієць Ю.В. та

ін. Біотехнологія рослин. Практикум. – К.:ТОВ «Аграр Медіа Груп», 2011. – 216

с.

20

ЗМІСТ

Лабораторна робота № 1 ..................................................................................... 3

Тема: Введення в культуру in vitro і культивування ізольованих клітин і тканин

рослин ........................................................................................................................... 3

Лабораторна робота № 2 ................................................................................... 10

Тема: Культивування калюсних тканин .................................................................. 10

Лабораторна робота № 3 ................................................................................... 12

Тема: Одержання рослин-генераторів ..................................................................... 12

Лабораторна робота № 4 ................................................................................... 14

Тема: Культивування культури ізольованих клітин і тканин у селекції рослин 14

Лабораторна робота № 5 ................................................................................... 15

Тема: Використання біохімічного аналізу в клітинній інженерії рослин ........... 15

Лабораторна робота № 6 ................................................................................... 16

Тема: Проведення аналізу ДНК ............................................................................... 16

Лабораторна робота № 7 ................................................................................... 17

Тема: Використання біохімічних маркерів для оціювання стійкості

сільськогосподарських рослин до стресів .............................................................. 17

Література …..………………………………………………………………………19