Cloning and expression of flavone synthase II from Gerbera hybrids

8
Cloning and expression of ¯avone synthase II from Gerbera hybrids Stefan Martens * and Gert Forkmann Lehrstuhl fu Èr Zierp¯anzenbau, Technische Universita Èt Mu Ènchen, Am Hochanger 4, 85350 Freising, Germany Summary In Gerbera hybrids, ¯avone synthesis is controlled by the locus Fns. The responsible enzyme, ¯avone synthase II, belongs to the NADPH-dependent cytochrome P450 monooxygenases. From two different chemogenetic de®ned Gerbera lines with the dominant (fns + .) or recessive (fns fns) alleles at the locus Fns, a cytochrome P450 fragment (CypDDd7a) was isolated using a differential display technique with upstream primers based on the conserved heme-binding region of cytochrome P450 proteins. The full-length cDNA (CYP93B2) which contained the open-reading frame and part of the CypDDd7a sequence was isolated via 5¢-RACE and end-to-end PCR with gene speci®c primers. Northern blot analysis of total RNA of Gerbera hybrids indicated that the CYP93B2 gene was only transcribed in lines with the dominant allele fns + and that the transcript levels during ¯ower development are in agreement with the measured enzyme activity of FNS II and ¯avone accumulation. Microsomes from yeast cells expressing CYP93B2 catalysed the direct formation of [ 14 C]-¯avones from the respective [ 14 C]-¯avanones. Thus, CYP93B2 was shown to encode ¯avone synthase II. This is the ®rst report of the isolation and expression of a functional FNS II cDNA clone from any species. The comparison of amino acid sequences revealed that CYP93B2 had 54% identity with the sequence of CYP93B1, which has recently been reported as a (2S)-¯avanone 2-hydroxylase of Glycyrrhiza echinata L. Introduction Within the naturally occurring ¯avonoid compounds, ¯avones represent one of the most abundant and important classes. A soluble ¯avone-forming enzyme (¯avone synthase I; FNS I) has been described using parsley (Petroselinum hortense) cell suspension cultures. This enzyme was classi®ed as a 2-oxoglutarate-depen- dent dioxygenase (Britsch et al., 1981). In contrast, in a wide range of plant species the ¯avone synthase II (FNS II) was found to be the enzyme responsible for ¯avone formation. Using ¯avanones as substrate, ¯avones were formed by the introduction of a double bond between C-2 and C-3 (Figure 1) (Heller and Forkmann, 1994). Recently, the genetic control of FNS II activity by the gene Fns was described for the ®rst time (Martens and Forkmann, 1998). Biochemical studies (Kochs and Grisebach, 1987; Stich et al., 1988) identi®ed FNS II as a microsomal cytochrome P450 (P450) monooxygenase. This group of membrane-bound heme plant proteins, which interact with NADPH-cytochrome P450-reductase (CPR), form a superfamily which is involved in a range of oxidative reactions in the metabolism of secondary compounds. The respective pathways lead, for example, to important molecules such as lignins, coumarins, iso¯avonoids and ¯avonoids. Apart from this, the role of P450 reactions in detoxi®cation of xenobiotic com- pounds has often been reported (Bolwell et al., 1994; Durst and Nelson, 1995; Schuler, 1996). At present, more than 300 plant P450 sequences are registered to different databases and are classi®ed in approximately 46 gene families (D.R. Nelson, personal communication). In contrast to many other isolated clones coding for P450s with still unknown functions, the enzymatic reaction of several gene products belonging to the phenylpropanoid and ¯avonoid pathways has been described. Cinnamate 4-hydroxylase (C4H) belongs to the CYP73A and catalyses the hydroxylation of cinnamic acid (Hotze et al., 1995). The resulting 4-coumarate is the origin of the B-ring structure of ¯avonoids. Flavonoid 3¢- hydroxylase (F3¢H) and ¯avonoid 3¢, 5¢-hydroxylase (F3¢,5¢H) catalyze the B-ring hydroxylation of ¯avonoids (Heller and Forkmann, 1994). They are of enormous commercial importance to the horticultural industry and more recently with respect to the dietary intake of ef®cient antioxidants such as hydroxylated ¯avonoids (Bolwell et al., 1994). An F3¢H was cloned from Petunia (CYP75B2) and the function of the gene product was identi®ed (Brugliera et al., 1999). F3¢,5¢H was cloned from several sources and belongs to the CYP75A family (Holton et al., 1993). The gene of FNS II, which is also an important P450 enzyme of the ¯avonoid pathway, has, however, not been cloned until now. Based on the domain that contains the heme-binding cysteine, which is regarded as a ®ngerprint for P450 proteins (Gonzalez, 1989), and the chemogenetic and enzymatic data (Martens and Forkmann, 1998; Tyrach and Horn, 1997), PCR methods, which have been reported Received 23 June 1999; revised 11 October 1999; accepted 28 October 1999. *For correspondence (fax +49 8161 713886; e-mail [email protected]). The Plant Journal (1999) 20(5), 611±618 ã 1999 Blackwell Science Ltd 611

Transcript of Cloning and expression of flavone synthase II from Gerbera hybrids

������� ��� �� ��� �� ����� ����� �� ���� �������������

����� ����� � ��� ��� ��������

��������� �� ���� ���������� ���������� �����������

�������� �� ��������� �� � ! " #�������� $�����%

�������

�� ������� ������ � ����� ���� � � ��������� �� ��

���� ��� !� � ��� ��� �"��� ����� ����� ���

����� �� �� #$%&'(������ ��������� &)*+

��������� ���� �,� ������� ���������

�-�� ������� ��� ,��� �� �������� .��/ 0 ��

�� �� .�� ��0 ���� �� �� ���� ���� � ���������

&)*+ ������� .���%%�1�0 ,� � ����� � ��� �

���������� �� ���� �����2� ,��� �� ���� �����

�� � �� �� ��� ��� ��(������� ����� ��

��������� &)*+ ������ !� ����(����� �%#$

.�3&45670 ,���� �������� �� ���(������ ���� ���

���� �� �� ���%%�1� 2��� ,� � ����� ��� *�(8$�9

��� ��(��(�� &�8 ,��� �� ���-� �����

#������ ���� ����� � �� ����� 8#$ �� ������� ������

�������� ���� �� �3&4567 �� ,� ���� ���� ����� ��

��� ,��� �� �������� ���� ��/��� ���� �� ���� �����

��� ������ ��,� �������� �� �� ������ ,���

�� �� ��� �"�� �������� �� �#� �� ��� �����

������������ ����� �� ���� �� � ��� �� ���

�3&4567 ������ � �� ����� ��������� �� :;)�<(�����

���� �� � ����� :;)�<(������� !�� � �3&4567 ,�

��,� �� ���� ����� ����� �� !�� � �� -� �

����� �� �� � ������� ��� �� ��� �� � ����������

�#� �� �%#$ ���� ���� ��� ��� !� ������� �� ��

����� ���� 2��� ����� ���� �3&4567 ��� *)=

������� ,��� �� 2��� �� �3&456;� ,���� ��

������ �� ������ � � .7�0(������� 7(��������

�� ������ ��� �� ����� >

������������

������ ��� ������ � ���� �������� ���������

������� ������� ��� �� ��� ���� �������� ���

�������� ������ � ����� ������������� ������

������� �������� �� � ! �" ��� ���� ��� ���� �����

����� �&����������� ��������" � ���������� ������

#��� ������ $�� ����%�� �� � &��'���������������

���� ���'������� �(��� � �� ���� )*+)"� �� ������� �� �

$��� ���� �� ���� ��� ��� ��� ������ �������� �� �� !

��" $�� ����� �� �� ��� ������ ��������� �� ������

��������� ,���� ��������� �� ��������� ������� $��

����� �� ��� ������ ���� �� � ����� ���� ���$���

-�& ��� -�. ������ )" �/�� ��� ��0����� )**1"�

2� ����� ��� ������ ���� �� � ! �� � ������ �� ���

���� #�� $�� ��� ���� �� ��� %�� ���� �3����� ���

��0����� )**+"� (�� ���� � ������� �4� �� ���

5����� �� )*+6� !�� � �� ���� )*++" ������%�� � ! �� ��

� �� ����� ��� ���� 7189 �7189" �����'��������

#��� ���� �� ������������� ���� ���� ��������

$�� � ����� � $��� �:7/� ��� ���� 7189���� ����

�-72"� ��� � ��������� $�� � �� ������� �� � ����

�� �'������� �� ����� �� ��� ��������� �� �� �����

��������� #�� ���� ���� ����$��� ���� �� �'�����

�� �������� ��� ��� �� � �� ������� ��������

������������ ��� ���������� ���� ��� ����� ��� ��

�� 7189 �� ����� �� ����'�% ����� �� '�������� ���

������ ��� ����� ���� ������ �(�$� �� ���� )**1�

:��� ��� ����� )**8� ! ���� )**;"� �� �������

��� ���� .99 ���� 7189 ��<��� �� �� �������� ��

�������� ��������� ��� �� ����%�� �� ����'������

1; ���� ������� �:�2� ����� ������ ������ �����"�

�� ������ �� ���� ���� ������� ���� ����� ��

7189� $��� ��� ��0��$� ��� ������ ��� ��������

�� ���� �� ����� ���� ���� �� �������� �� ���

������������� ��� �������� ����$��� ��� ����

��� ����� -�������� 1�����'���� �-1/" ������ ��

��� -=76.� ��� ������� ��� ����'������ �� ������

� �� �/���� �� ���� )**8"� #�� ������� 1� ������� �� ���

����� �� ��� (���� ��� ��� �� ���������� �������� .������'���� ��.�/" ��� �������� .�� 8������'������.��8�/" ������ ��� (���� ����'������ �� ����������/�� ��� ��0����� )**1"� #��� �� �� �������

���� �� ������� � �� ��� ���� ���� ������� ���

��� � ���� $��� ���� � �� ��� ������ ����0� ��

��% ���� �����'������ �� � �� ����'����� ���������

�(�$� �� ���� )**1"� �� �.�/ $�� ���� ��� 7������

�-=768(&" ��� ��� ��� ���� �� ��� ���� ���� � $��

������%�� �(����� �� ���� )***"� �.��8�/ $�� ����

��� ����� ��� �� ��� ������ �� ��� -=768� �����

�/���� �� ���� )**."� #�� ���� �� � ! ��� $�� � �� ���

�� �������� 7189 ������ �� ��� �������� ����$���

���� ��$���� ��� ���� ���� ���� ��$�

(���� �� ��� ������ ���� ������� ��� ������������

�������� $�� � �� ������ �� � %������� �� 7189

������� �5������� )*+*"� ��� ��� ���������� ���

�������� ���� �3����� ��� ��0����� )**+� #�� �

��� /��� )**6"� 7-2 �������� $�� � ���� ���� ������

2� ����� &. >��� )***� ������ )) ? ���� )***� � ����� &+ ? ���� )***�@�� ��������� � ���' A1* +);) 6).++;������ ������B�$������������ ������"�

��� &���� '������ �)***" 7+�8"� ;))C;)+

�)*** (� 0$� ! ��� � D�� ;))

�� ����� ����� ��� �� ������ 7189 ����� �/���� �� ����

)**.� ! ����� ��� E��� )**+"� $�� ��$ ����� �� �� �

����� ��� �� ��� ��� � ����� �� ��� � ! �� 7189 ����

��� $������ �������

�� ���� ��� �� ��� %�� �� ����� ��� �� �����

�� � : � �� ����� � ! �� $�� � ������� ������

��������� �� ��� �������� ����$�� ��� �� ��� ��� �����

�'������� �� ������

8 ���

(�������� � � 5���� �)*� ������� ����+���

+����������% �, �����+ &� " ������

7������ ��� ���� � ������� $��� �������� $������ ����

���$�� ���� ��� �������� �� ������� �� ������ �� ���

���� #��� � ! �� � ������ $�� ��� ������ �� ���� $��� ���

�������� ��� ���A �" ��� ��� �� ���� $��� � ������

���� ��� ��"� ��������� �� ����� ��� $������

F2�����G ��� ������ � ������ �� � ! �� $�� ����� ��

�� ���� ���� ����������� ����� %�� ���� ����� &"�

���� ����� ���� ���������� ���� ���� ��� ���� �����

�� ������ �� ������ ���� �� ��� �3����� ��� ��0�����

)**+"� #���� $� ������ �2 � ���������� �������

��� ���� ���� ������ �� $������ ���� $��� ��� ��������

��� ��A ��� ������� $��� � ������ ���� �� ����� ��

���������� ������ �::�2#�7-2"�

#�� ::�2#�7-2 ����� � ������ ������ %�� ���

����������� �'������ ������ � �� ���� $�� ����

��%�� ��� �������� ?�� 7-2 ���� � �������� ����

��������� ����� � �� ��� ��� �� 0��$� ��0����� 7189

��<��� ��� �� ���� ������ ����$��� ��� ������� 7189

%������� ��� ���� � 8� ��� .� 7-2 ������ #�� ���

���������� �� -��::�6� ������ ."� ��������� ��� .�������� ����� ����� �� � 7189 : � ������� ��� ���

������������ ����� �� %�� ���� ���� �61 ����� � ���"

��� � )+;�� ���������� ������ #�� ����� $�� ��

� ���� � $��� ��� ��������� ���� �� ��� ����������

������ ���

��� ���� ��+ � ����� �, ������� � 5���� -% ))+.�

����� ��� ������� ��%��� ��� ���������� �'����

���� �� ��� �������� 7189 �������� #��� ��� ���� $��

������������ �� �������� ���������� �� )) ������ �� ��$�

���������� ��� �� ����� �� $������� /�����������

���� ���� ������� � ��������� �� ���� 2 � �����

-��::�6� : � ���� ������ � )�6 0� ���� ��� ������

�� ������ �� ��%��� $������ ���� ��� ������ $��� ���

�������� ��� ���A �" ��� ��� �� ���� ��� ������ $���

� ������ ���� �� ��� � �� #��� �� ������ $�� � �� ���

������ ��� �������� �� ������������ ����� ��� ��

���� ��� ������ 1"� -�� ��������� $��� � ! �� � ������ ���

������ � ��������� ��� ��'���� ��� �� ��� -��::�6�

���� ��� ���0�� �� ����� 1 ��� ���� �� ���� ������ 1"�

(�������� � ��� �/��+ �)*� ����� � ��� 5���� &� "

�)*�

�� ��� �������� �� ��� 8����� : � ���� ��� 8��2�-E�� ���<�� $�� ����� ���� ���� ���� ��� �% �����

�5!76C*� ��� E'�������� �� �����" ��� -��::�6�

$�� ���� ��� ���� �$� 7-2 ����� � )�1 0� �������

�-��#�H (�#�� ����� ." $�� ������� �� ������ ��

������� $��� ������� ������� #�� �������� �������

����� �������� ���� ��������� ����� � �� ��� ��� ��

0��$� ��0����� 7189 ��<��� ��� �� ���� ������ ����

$��� � ���� ����� ��� ������� ������������ ����� ���

����� ; E������� �������� �� ������� ��� ����������

����� 7 #��� ��� ����� � ! �� � ������ ��� ������ � �������� ��$������ ����� F2�����G�I���� �� ���� ��� ���� ��� 0"� ��������� �� ����� (�� �������������� � ������ �$����" ��� ������ ������ ����" ��������� ����� ���� �� 3����� ��� ��0���� �)**+"�

;)& 0���� ������� ��+ $��� #��1����

�(� 0$� ! ��� � D��� ��� &���� '������� �)***"� 7+� ;))C;)+

��� ���� � .� �������� �% 7-2 ���� �5!7*" �� �����

#������� ��� -��#�H (�#� ��� ��������� ��� 8�������� ����� ����� �� ��� $������ 7189 : � �1;9

����� � ���" ������� $��� � &.�� ����� �����

2, ������� � ��� 5���� &� " �)*� �� %����

#� �������� $�� � ��� ����� ������ �� �� ���� �� ���

������� ����� �� ��������� 7-2 $��� ���� ��� �%

����� �-��� !)/J2� ��� E'�������� �� �����" $��

������� ���� ������ ��� ����� �� ��� �������� 7189

����� ����� �-=7*.(&�?2�� ����� ." ���� ��� �����

�'������� �� �� ��=E!&" $������ �� ����� ��� �� ���

���������� 8� ������������ ���0��� ��<��� �� #��� $���� ����� �� ���� �� ���� ���� ��������� 8� ����������� ��<��� �� ��� ������ ����� ����� ������ ����

�'������� �� ����� �7����� �� ���� )**;"� � ! �� � ������

$�� ���� ��� �� �� ����� �� ����� ������ ��� �����

����� � I ! ) ��������� $��� -=7*.(&�?2� ��� ��� ��

�� ����� ���������� ��� ��� ������������� �����

����� � I ! ) ������ 8"� #�� ���� � $�� � $�� �����

��� ��������� � �2" �� � �������� $�� ������%�� ��

�������� ���" �� ��� �������� ������ ������� �� ��

����������� $��� �� �������� ������ ,��� ���

���� ���������� ��� �� ������� �� ����� ��� �E2�" ���

�<���������� �D�K" �� �� ��� �������� �� ��� ���� ����

�������� ������ �D�" ��� 6� 1��������'������� ����� ���

���$�"� #���� ����� ����������� ���� ��� �������

$������ 7189 : � ���� �� ��� ����� � ! ���

0�3����� � ��� 5���� &� " �)*� ����� �� ���������

#*0 ((

#�� ������� ��� �������� )�6 0� : � $��� � �����

���� ������ ���� �?2�" �� )8.;��� #�� ?2� ����

�� � ��������� �� 8)) ����� � �� ������� �� �

���� ��� ��� �� ���� �� 8+�& 0:�� #�� ���� ��

����� � �� ��<��� � �������� ��� ��� ��� �������

����� � ��� �� ��� ������������ ����� ��� ��� L��J

5"5'�:JE"#�#J!"M� $�� � �� ������� �� �� �������� ��

�'���� ������� ��� � ��������� ��������� �� �'�

�� ��� ��������� ������� �� �� ��� � ������

� � ����� ��� �� ��� 8� �������� ��� �� ���� ����-�������� �� ��� ���� �� ����� � �� ��<��� � $���

0��$� 7189 ��<��� �� ������ ���� ��� ������� : �

������ �� ��� -=7*. ������ 3������ ��� �������

: � �� ����� ��������� �� ��� � ���� ��������

��<��� � �� � �&!"��������� &�����'���� ��&/"

�-=7*.()� �0���� �� ���� )**+� 5��(��0 � ������ ���

�(99).+9" ��� � �� � �$�%�%������ ��������" $��� ��

�������� ���� �� ��� ������ �� 81N ������ ;"�

-����<����� ���� ��� $�� ����� -=7*.(& �:�

����� ������ ������ �����"� 7��������� �������

����� ��� ���� �� ����� � �� ��<��� �� �� � ���� ��

����� 5 !�<��� � ��� ��� �� 7189 ���������� �������� ��� $�������-������� ������O ��������� ��������� ��� ������ � ������ �'���� ������������ ��� ������������ ������

����� ) E'������� �� ��� ���� ����-��::�6� ���� ���� ��� �� ����������������� ��� �� ��� ����� �� $������������� $��� �������������

#������ �%������ (( ���� ��� 5���� �%���+� ;).

�(� 0$� ! ��� � D��� ��� &���� '������� �)***"� 7+� ;))C;)+

���� 7189� ������� �� ��� ������������� ���

�������� ����$�� �� ���$� �� ����� 6� �� ��� ���� ����

���� -=7*.(& �� ��� ����� �� ��� �&!"��������� &�

����'���� ���� �� ���� 7189��

%� �� ���

�� �� ����� ��������� ���� ��� ���� &99999

�� ����� ���������� ��� �'��� �� ����� ��� ���� ��

���� )9N ���� ���� ��� ������ �� ���� �:��� �� ����

)**1"� 3��� �� ����� ���� ����� �� �� � ����� ��

�������� ��������� ?�� ���� �� �������� �����

������ �� ��� ������� $�� � �� $��������� ���

$�� � � � ��� ��� �� ��� ��$�� �� ����� �����

���� ��� ��� ��� ��� �� ���� ���� ���� ���� �� � ��

������ ����� ��� ���� �����$���� )**1"� #��� ���

� � �� ���$ �������� �/������ )*6+"� ���������� ��

��$� �������� �5��� ��� 4����� )**)� ! ����

3�� ����� )*.;"� ���� ��� �� ��������� ������ �� ����

)*+;� 7���� �� ���� )*+;� 2������ �� ���� )*+;"� �����

�������� �� �������� ���� �C���� ����� �����

�/����� ��� 5���� )**1"� ���� ���� �������� ��

����� ��� ����� ����� �(�P �� �� ���� )**+"� ��� ��

����� ���� �� �3������� ��� 4����$���� )**1"�

(� ���� �� ��� ������� � �� �������� �� �� ��������

���� ��� �� ����� �� $�� � ���� �� ����� ��

������� �� ���� �������� ��� ����� �� ��� ������

��� ��� �� ��� ��� ���� � ��� ��� ��� �� ���

��� �� ���� #��� $�0 ��� ���� ��� %�� �� �����

����� ��� �'������� �� ��� � ! �� �����

���� � ::�2#�7-2 ������� $� ��� ������ %��

���������� �'������ ������ �� $�� � ��� $�� ������%��

�� � 7189 ��<��� � �-��::�6�"� ���� ���� 2 �� ��

�������� ��������� �� $������ ������ $�� ������� ��

����� �������� ������������ ��� ��� �� ���� ��� ��

���� $��� ��� �������� ��� ���A �"� �� � ������ ����

��� ��"� $�� � � 0 � ! �� � ������� �� ������������ $��

������ 3������ ��� ���� ���� �� ��� ���� ��� ����

����� ��$� ���������� ��������� �� ��� �������

������ � ������ ��� ������ � ��������� ���� �����

������ &"� #������� ��� ���� ���������� �� ���

-��::�6� : � ��� ��� �� �'������� ������ �'�

�� ��� �� � ! ���

#�� $������ 7189 ������ : � $�� �������� ����� 8�2�-E �� ���<�� ��� ���������� 7-2� �� �'�� ���� ���

������� 7189 : � ��<��� � ��� ���� ������� �� 7189

��<��� ��� ,��� �������� $��� 0��$� 7189 ���

������� ��� ���$�� � ���� ������� $��� -=7*.()� �

7189 ������� ��� �� ���������� ����������� �����

�� �� $�%�%������ ��������� #��� ��� $�� ������%�� ��

�� ��� �&!"��������� &�����'����� #�� �'������ ����

���� � ������� ��� �������� �� � ������ ��� &�

����'���������� �&�?/� �2" ��� �<���������� ���

�2� ���� ������ #�� ������ �� $�� ��� ����� ���

&�?/� �2 ���� � �� �������� �� ��� ���� ���� ������

����� ��0���� �� ���� )**+"� (� $4 �������� -��� ����

����� * 2���� ���������� �� ��� ������ ����� �� � ! �� : � ����'������ �� ������#�� : � ����� -=7*.(&�?2� $�� ���� ���� ����� �'������� �� ���=E!& �� I ! )�-=7*.(&�?2�"� E����� �'�� �� �� ������������������ �� I ! )" ��� ����� ��������� $��� -=7*.(& $�� ������� ������� ����� �� � ! �� � ������ ����� �)1-"���������� �� �������� ���������� $��� �������������

����� ? �������� �� -=7*.() ��� -=7*.(&�-������� ����� � ��� �� ���� ���� �� ������0� ��� ����������������������� �� ���� ���� �� �����

;)1 0���� ������� ��+ $��� #��1����

�(� 0$� ! ��� � D��� ��� &���� '������� �)***"� 7+� ;))C;)+

������� �� $� �� ������� ��� �� �� ���� )*+1"� �� �� ���

$� 0��$� ���� &�?/���������� ����� &�?/� �2" $�� ���

��� � ��������� �� -��� ���������� ������������

�4�� �� ��� ����� )*+6"� #������� $� �������� ����

-=7*.() ���� �� ��� �&!"��������� &�����'����

$�� � �� ������� �� ���� ����$��� �� ������� ������

����� �'������� �� ��� ��� -=7*.(& ��� ���� �� ����

���� ��� ���� ��� ��� ��������� ���� �� ��� ������

������ �� � ��� � �������� �� �� ��� ��� �2 $������

��� ���� � ��������� �� ��������� ������ ������ �����

E2� ��� D�K �� ��� ��������� �� �� ��� �������� �� ���

���� ���� �������� #��� ���� ��� ��� ������� ���� ���

���� $�� � $�� �� ������� $��� ��� ��������� ������

� ������ ��� ������� � �� ������� �� $������ �����

����� ��� %�� �� ����� ����� �� : � ����� �� � !

���

�� �������� � �� ���� �� ������ �� � ! �� ��� �&/�

���� ������ �� ��� ���� �� ��� �������������� ��

�0��� -/�-/ ����� ������� �� ��� �������� �� ���

���������� ����� ���� �3������ )**+"� �� $�� ���$�

���� ��� ����� ���� �� ��� ������ �� �� � ���������� ��

��� ����'����� ����������� ��� �� $�� ���$� ����

����� �$� �������� �� ����� ����� � ������ �� ?/

��� ��� ����I"�?/ ��� ��� �� ��� �������� ������'��

��������� -=7*.()" � ��� ����� ���� �� ��� �� ���

������� ���� ������� �� ����� ���� �� $��� ��� ���

��� ��� ��� ���������������� -=7*.(&" ��� � �

������ +"� � ����� ����� �� ��� �� ���� ���� ��� ��

��������� �� ��� �������� �� ����� �� -=7*.() ���

-=7*.(& ��� /��� ������ ������ �����"� � �����

�'�������� ��� ���� ����� �� ��� �� ���� �� ������ ��

� ! � �(��� �� )**9"�

!�<��� � ������� �� -=7*.(& $��� ���� -=7189�� ���

���� ��� ������ �� ��� -=7*. ��������� �������

������ ���������� �� ����� ��� ��� ��� ���� �� ��

� ! �� ���� ����� ."� �� ������ ��������� ������

����� 1 7��������� ������� �� ���� 7189 ������� �� ������������������� ����$���#�� ���������� ��� $�� �������� �� ��� ���� �� ��� ��'�� �� ���� ����� �������� $�� ��<��� �� �� 7189 ���� ������� �� ���������������� ��� �������� ����$��� #�� � ������ ������ ��-=76.�1 -����������� ������ �������� 1�����'���� �-1/" �Q.&8;."�-=76.�)& ������ ������� -1/ �,)**&&"� -=768�) &������ �%���+��������� .��8������'���� ��.��8�/" �Q&&818"� -=768�+ -����������������� �.��8�/ ��>9))+;&"� -=768(& &������ �%���+� �������� .������'���� ��.�/" ���)88.&&"� -=7+1�& �%�� ������� ���������������� 8�����'���� ��8/" ���)89++)"� -=7+1�. ��3��+�������%������� �8/ ���).*8.&"� -=7*.�) �� �. $�%���� ��, �:+.*;+� :+;.8)��� =)91*&"� -=7*.() $�%�%������ �������� �&!"��������� &�����'������&/" ��(99).+9"� -=7*.(& $������ ������ � ! �� ���)8;*6;"� -=7*.-)$�%���� ��, ���9&&1;&"� -=7*.-& $�%�%������ �������� ��(9&.;.;"�-=7*.-. -���� ��������� �>&1.+91"� -=7*.E) $�%���� ��, ���).81+8"�

����� @ 3����'��������� ��� �������������� �� ��������� ��������� �&!"��������� &�����'���� ��&/" ��� ������ �������� �� �� ! ��"����� ������#�� ������� �� ������ �� � ! �� ��� �&/ �� �����

#������ �%������ (( ���� ��� 5���� �%���+� ;)8

�(� 0$� ! ��� � D��� ��� &���� '������� �)***"� 7+� ;))C;)+

�� �� ����� �� )6 ����� � ���� $�� � �� �������� �� ���

���� ���������� ��� �������� �� ��� ������ �� ���

�� ����� ������� �3��0��� �� ���� )**1� !��� �� ����

)**9"� �� ���$�� �� ��� ���� ������� ������� � �����

����� �D77!7RRRR7" �� ��� ������ �=�����0� �� ����

)**."� ��������� ��� �'���� ������� �� 0�� ��5#:#�#J

!"" $�� ����� �� �� ����� ������� �� � -=7*.

������� #��� ������ ������ 0��$� �� L��J5"5'�:J

E"#�#J!"M� �� ������� �� �� �������� �� �'���� ������� ���

� ��������� #��� ���� ���� ���� ��� ���������� ����

���� � ������ �� ��� ��� ��� ������ 7189� �:��� ���

����� )**8"� #��� ���� �� �'�� ��� �� ������� ����

�����'���������� �! ���� )**;"� �� ��� ����� ���

7189 %������� �� ��� ���� ������� �����

�7�5R522R-75"� $�� � �� ����� ������� �� � 7189

������������ 7��������� ������� ���� ���� ���� � ! ��

��� �&/ �� ���� ����� ������ 6"� ��������� � ���

���������� ��� ��� �� ��� ���� �� � ! �� ��� ���

���� ������ �� ��� -=7*. ������ � ���������� $���

��� ���� 7189 ������� ��� ������������� ��� ���

�������� ����$�� �� ��� �� ��������

�� ������� $� ���� ���$� ���� -=7*.(& : �

�� ���� � ! �� �� 7189 �� ��� �������� ����$��

��������� �� ������ ��������"� #��� ������ ������

��� ���� �� � ���� �� �������� ������������ ���� ��

� ���� �� �� �������� S�� ���� �� ���� ����$�� ������

�� �������� ���������� �� � �� �������� �����������

�������� ������� �������� ��� ����� ��������� #����

���� ��$ 7189 ���� ����� �� ����� �� ��������

����� ��� �� ���� ��� ��������� �� ����� ���

������ �� ������� ��� � ! �� � ������� #�� ��� �

�������� �� ������ �������� �� �������� ���� �������

�� � ����� ��� �� ���� ��$ ��$� ���� ��� ��

������ � � $��� ���� �� � ����� �� ��� �� ����

������� �� �� ����� �'������� ��� ���� �������

������� �� ��� ���� ���� �� �� �������� ��������

��� ��� ��������� ��� ��� �� �������

9�������� �������

&���� ��������� %���� ������� ��+ �����+�

5����� �� ��%��� ����������� ��� ��������� ��A �" ��� ��������������� ��� ��������� �� ��" ���� �� $������ ������$�� �������� ��� ���������� ��� ��� ���� � ��������������� �#��� )� 3����� ��� ��0����� )**+� #�� � ��� /���)**6"� #�� ���� �� ������ F2�����G ���A �" $�� �������� ���#�� ��� �:� 4$�0�� ��� ��������"��� ���������� ���� �'�������� ��� ����� ����� � I! ) ���

��� �'������� �� �� �=E!& $�� ���� ����������� 5����������� ��������"�

(�������� ��+ ����%��� � 5*�

#��� 2 � ��� $������ ���� �� )) �������� ������ �� ������������� ������ &" $�� ������� � ����� �� 5������ �� ����)**." ����� &99�� �� ����� ���� ������� #�� �������� �� 2 ���� ��� ����� � �� : � $�� �� 0�� �� ������ �� �� ���������� ���� �������� ������ ��������� ����� ��� ��������)9 �� ���� 2 � �� ���" ����� ���������� ������ ��� ���/������ R �������� �������� (� ��� (���� �$����5�����" $�� ������� � ����� �� ������� �� ���<����!�����0 �� ���� )*+*"� .&7������� �� ����� $�� ������0������� 2��������� 4�� �������� (� ��"� 7����������������� ������������ $�� ������� �� 1&�- �� )9C);� �� 89N ��J�"��������� 8�!!7E� 8�:������G� �������� 9�8N �$J�" !:!��� )99���C) �������� ����� ���� : �� #�� ��������$�� $����� �$� � �� &�!!7E� 9�)N �$J�" !:! �� 1&�- ��)8���� �� � �� )�!!7E� 9�)N !:! �� ;8�- �� )9����K�����% ����� �� ��� ������������ ������ $�� ������� ������ ������������ �(�!)999� ��S�%�� 4�����$�� �0�����>����� ����$�� �� 0��� #� �� 2������� !�����������5�����"�

)��������� +�� ��% � �5*�

2����� ���� ������ $�� ������� $��� !���� ��� �� ��������� ������ �5�� � (2D� 7������ ,4" �� � ���� ����� �� &8 ����$��� ��� ������G� ����� ������ :��������� ������ ���������� �� ���������� ����� $�� ���� ��� � ����� �� ������� � �� D���� �� ��� �)**." $��� ���� ����� ��������� �����7189���� �% ������� ����� ��� ���� �� ���� ������#"����� �� ��� ���� �� ! ����� ��� E�� �)**+"� 2�����%��7-2 ���� �� $�� ���� ���� ��� �-2&�) �� �� ����� � #�-����� 4�� ����������"� 2������� �������� $�� ���E�� ���� �3������� ,!�"�

�/5�-2

$������ �������� �% ����� �5!76C*" $�� ���� �� ��� �����<��� � �� -��::�6� ��� $�� ���� �� � 8��2�-E $�� � $�� ���� ��� ��������� � ����� �� ��� ������ ���G� ����� ������ ����� ��� 0�� ��� 5�� ��(2D� #��� 2 � ��� ����� $������� ���� ��� ����� 5!76 �8���#-##-���5#5###--#-5�##-�.�" �� ��� ����� ���� ���% ����� ��� ������ ����������� ����� 8� �� ��� ������� #�# ���� � $�� ���� �� � �������

!��� ; :������� ���������� ��%��� $������ ���� ��� ������

$������ ����J ����� 5������� ?����

#�8+ ���A ��� #�� � ��� /�� �)**6"7���� �0� ��� ��� #�� � ��� /�� �)**6",���� ��� ��� #�� � ��� /�� �)**6"-���� ��� ��� #�� � ��� /�� �)**6"2����� ���A � #�� ���)16C)); ��� ��� #� 8+�!@

)16C))+ ��� ��� #� 8+�!@

)16C)&1 ���A � #� 8+�!@

)16C).6 ��� ��� #� 8+�!@

)16C).* ��� ��� #� 8+�!@

)16C)19 ���A � #� 8+�!@

)16C)1; ��� ��� #� 8+�!@

)16C)1+ ���A � #� 8+�!@

)16C)8* ��� ��� #� 8+�!@

@�!T ��� �������

;); 0���� ������� ��+ $��� #��1����

�(� 0$� ! ��� � D��� ��� &���� '������� �)***"� 7+� ;))C;)+

�� %������� 7-2 �� ��� ����� � �� ��� ������� �� �� �����5�� ��(2D" ��� 5!7+ �8����#55��-�-�-�-����#-#�--�.�"��� ��� �� ��� ���� 7-2� 8� �� ��� ������ %������� 7-2���� � $�� �����%�� $��� �,�7 �5�� ��(2D" ��� 5!7* �8��#-�--�-#5�5�5##-#-#-�#55�.�"�

)*� ��3������� ��+ ����%���

(��� ������ �� ��� : �� $�� ��<��� �� ����� � !�<������: � ��<��� ��� 0�� �������� (� ��"� L.8!M��#7 ��- �E� �$���� 5�����" ��� ��� �% ������ ������ ������3�5�(�?#E-/� E������� 5�����"� -������ ������� ����� : � ��� ������ ����� � �� ��<��� �� $�� ���� ��� �������� ?3�5� ����$�� �� 0��� �?'��� 3�� ��� ?'���� ,4"� ����� �������� ��� �������� �� ��<��� �� ������� ��� ���5��(��0� -D,!#�D� �#������� �� ���� )**1" $�� ���� ��� �������� $�� ��$� $��� ��� #2EEI�E� �7���� )**;" ������

������������ �, ������� �� %����

#�� ����� ����� �� -=7*.(& $�� ������� ���� ��� ����� �� ���=E!& �� ��� ���� �� ,��� �� ��� �)**1"� � %�� 7-2 $��������� �� ���� � �������� ������ �� ��� 7189 ?2� ���� ������� � 0�� ���������� 8� ���������� ��<��� ��� #�����$��� 7-2 ����� $�� ����O -��� !)/ �8�� ������� ��-�--�#5��#�-� -#--�.�" ��� -��� !)2 �8���5�#�5�--5�-#5--�#-��5���5-�.�"� #�� ��$�� ���� �������� � 6��/) ���� ���� ���� ���������� ���$�� �� ����#5 ���� ���� ��� ��� ��'� )9 ����� �� ��� ������ ����� #����$������ ���� $�� ��� �% �� ��� .� ���������� ����� ����� ����� #� �� ������ ��� ��� ����� �� ��� 7189 ���� ��� ������'������� �� ���� ��� ������ 2��2) ���� ��$������ �� ��������� �-2&�) ����������" $�� ����� #�� 7-2 ����% ����� $��������� $��� E'���� /��� ������� ������ ��' � ����� ����� ������ ���G� ����� ����� �(������� 3�������"�=���� ����� � I ! ) $�� ����� �� =75�� !5� ��� =75E

������� �� ��� ���� �� ,��� �� ��� �)**6"� #����������� $������ �� � ����%�� ������ � ����� ������ ����� 89 �� ���: � �5���� �� ���� )**&"� 3� ������ $�� ������ �� ��� ������������ �,��� �� ���� )**1"�

����% � #*0 (( ���%�� �������%

#�� ������� � ! �� ������ ������������ ������% ����� ������ ��� <�����% ����� ��� ������ ������������ $�� �������� �� ��� ���� �� 3����� ��� ��0���� �)**+"�

$����,������

�� $��� �0� �� ����0 -� ! ����� �D3, 3�P � ���" �� �� ��� �� ����� ��� 7189 ��� �% ::�2#�7-2 ��� �� /�� �5!� �������" �� ��� ������ ������� ��� �� ���� �� ��������� ��� $��� �� ����0 3� ��� ��� !� 5�P � �#, 3�P � ���" �������� ������ ����� �� ����� �'������� ��� :�2� ���� ������ -�������� �� !���������� -��� ���� 7189 ���� ������ ������ ��� 7189 ����� #��� $�0 $�� ���� �������� �� ���:���� �� ��� ������������ ���� �:�5"�

8����

$������ % � ���� $ � ���������� ' ��� A�2���� B �)*+1" EH ������� �H������ �G���� ���� ���������� ��� � ���� �� $�%�%�������������� D� &������ ��7+�������� &�%�����7�� ��� ;@� )69C)61�

$�� ��� ! � $���� ! ��� $���� � �)**+" ������% ����� �� � ��� ���� 7189 : � �� ����� �&!" ��������� &�����'���� �� � �� � �$�%�%������ �������� D� ���� ���"$�� � �������� � ������ �������� ��� ������ �������� ���#260 ����4 )5;� &+6C&*9�

6�C ��� ' � 6����� ' � '���� B � 8���� 6 ��� D���� $ �)**+"�������� ������� ��� ����� ������ �� ������ �����'������ ������ ��� ���� ������� �� �� ��� ��������� �� ���� ��������� �4 2���������8���� 51� )16C);.�

6��,��� � & � 6�"��� D ��� E��������� $ �)**1" 7��� ��� ���� 7189� &�%����������%� 51� )1*)C)89;�

6��� ��� > �)**9" 7��% ����� ��� ��� ��������� �� �������������� �� � &��'������������������ ���������� ����46������4 6�� �%�4 7@7� )8&C);9�

6��� ��� > � '���� F ��� ��� ����� ' �)*+)" -�������� ���������� �� ������� ������������ ��� ������ $��� �������� ������ ��� � ����� �� ������ �4 *���������45?�� 61&C689�

6�������� � � 6����(8,��� � � '������ ! $ ��� �� ��� B � �)***"�������� ��� ��� ��������� �� � �������� .������'���� : � ��� ���������� �� ��� /�) � �� �� 7������ �������&���� '4 ;4� 11)C18)�

%�� �� � � 6���� �� � � ������� B & ��� F���� % �)**1"��� ���� ��� �������� �� ���� ��� ���� 7189� ��&�����+���� � ��� ��� (������������ -�������� �-%�������� &� " �D� ���� 3�-� �� ���� ���"� D�����O >���D����� E����'�� ��� &.C.9�

%�� �� � ��� #� ��� % �)**8" :������� ��� �������� �� ����7189 ��� 7189 ��� ������ �� )��� ���������� ��+ )���(����������� �:���� �� ��� ?G4����� :�7�� ���"� D�����O ��������� )6)C)+6�

������� B > � F�� ��� D 9 � 8� �� > ��� B��� ���� F 6 �)*+;"�������� � �������� �� ��������� ����� �� 5�������������� �� ���� �������� ������ �� ������ *������ 57)�*9C*&�

���"� % � �� B��� $ � F��� � 8 $ ��� ���� ��� 8 ' �)**&"������� ������ �� ���� ��% ��� � ������������ �� ���� ������ ��� *���4 ���+� 5��4 7+� )1&8�

��������� � � 6������ � 9 ��� �������� & $ �)**." 2�������� �� �������� ������������ ����� ������ ����������� &����-���� *� .6*C.+6�

���"��"� � B �)*+*" #�� ��� �� ������ �� ��� ���� 7�189�� &��������4 5��4 )+� &1.C&++�

����� ! ��� D����� ! �)**)" !��0�� ��� ���0��� !���������� ����� ����� C I������� �� (�P ��������� ����84 -���4;+5� )6C..�

'������� B 6 �)*6+" #�� �� ������ ������� �� � ���$ ��$�������� �� ��%8��+����� ������� ���� ��� �� ���� -� �������&�%����������%� ;1� *)8C*)6�

'������� B 6 ��� ������ 8 B �)**1" ��������� ��� ���� ��� ����� #�������+�4 �+������ �� 5������� 0���� 9:�; �/������>�(�� ���"� D�����O -������ U /�� ��� 8+*C;)+�

'���� F ��� ��������� � �)**1" (����������� �� ���������� ����� #�������+�4 �+������ �� 5������� 0���� 9:�; �/������>�(�� ���"� D�����O -������ U /�� ��� 1**C8.;�

'������ ! $ � 6�������� � � > ��� % 8 � !������ 3 � '������ � % �������� B � ! � >�� � 3 � ������ 9 � ���� ��� ! F �������� �� 9 � �)**." -����� ��� �'������� �� ��� ����7189 ����� ������� ��$� ���� *������ 5??� &6;C&6*�

'��"� � � �����C ��� � ��� �����C ��� B �)**8" -�������� 1�����'���� ��� -����������� ������� ��� � ������� �� ������ ����� �'������� �� ���� ��� ���� 7189 ������� ������������ ������� $��� 7189 ��� ���� �� 2���������� �����#260 ����4 51)� .18C.89�

#������ �%������ (( ���� ��� 5���� �%���+� ;)6

�(� 0$� ! ��� � D��� ��� &���� '������� �)***"� 7+� ;))C;)+

D� ���� � ��� ����"� � �)*+6" (����������� �� ����'�� ����������'��O �������� ��������� �� ��� -��� ��������������'�� ��� �������'�� $��� �� ������ ��������� ���#��� %��� ���������� 3� ��������� �4 *���������4 )7��8)*C8&1�

D��� � � ��� ��� ����� ' �)*+6" ���� ���� ��� ��� ����������� � �:7/���������� ������ �������� ��� � ����� ���������� � *������������� )7�� .1.C.1+�

>����� & � $�������� > ��� &���� $ �)**." :���������� ��� ����� �� �� ����� �2 �� �� ����� �� ���������� ������O�%������� ��� ������������� *���4 ���+� 5��4 7;� .&;*C.&68�

��� ��� % �)**+" #�� ���� �������� �� �� ����� ������� �� ��� ����� 7189� -�� ������� 6������4 &�%����4 &��� -� ;7;�8C)1�

����� � � ��� ��������� � �)**+" 5����� ���� �� �������������� �� � ������ �� ��$�� �� $������ �������&�%����������%� )4� )*8.C)*8+�

�������� B�� 9 ��� D���� ,���� � �)**1" #�� ���� � �� ������������� �� �������� ������O ���� ������ �� �������������������� ��� �� �� �� ��� #�������+�4 �+������ ��5������� 0���� 9:�; �/������ >�(�� ���"� D�����O -������U /�� ��� ;)*C;8&�

��������� D � ������� D ��� G����� ! �)**1" #������������� ����� �� �� ����� ��� ���� 7189������%�� �� ��� ��������� ��� ��� �������� ������ '46������4 ;;?� );1C)68�

&��� 8 % � �)**;" �� ���� ����� �� ������ ���������� ������ ������ �������� -�� 4 � �4 6�����4 ;7� .86C.8+�

&������ % � >������ 6 � 6������ $ ��� H����� & �)**;" =�����'������� �� ����� ��� ���� 7189� �� ��������� ���'����������� ����4 2��%���4 717� 8)C;1�

&�� � # D � ��� �� B F ��� >���� � 8 �)*+;" � ���� �������������� ���� �� �'������� �� 5�������� �������� ��������������� 0������� 75� *66C*+9�

8������ B F � 6����� � � %I���I���� � $ � ��� � 8 F �D����� & > ��� 8���� 6 � �)*+;" ������� ���� ��'������� �� ��������� ����� �� 5��������4 *������ 575�;.&C;.8�

��������� B � ���� ��� 9 � ��� ������� � ! �)*+*" ���������-������4 � ���������% ������4 �$ =�0O -�� !���� /���D������� 7����

����� ! � ���������� � � ������� D ��� G����� ! �)**9" #�������������� ��� ���� ���� �������� ������� ����������� �� ��� ���� 7�189 �� �� ����� ��������2�6< '4 4� &.*)C&.*6�

�������� � 8 ��� 9��� B �)**+" ������% ����� �� �� �������� �� ��� ���� 7189� �� ������� �$�%���� ��, D�" ��������������� ������ �� �2 �� ���4 $��4 $����4 7*@� .)8C.&&�

�����(��������� 8 �)*.;" � ��� ���� � ����� �� ������������ �� ��� �� ��$� ���� '4 $����4 57� ))6C)69�

������� � $ �)**;" 7��� ��� ���� 7189 �����'���������-���4 5��4 &���� 0��4 ;*� &.8C&+1�

������ D � 9������� 8 ��� ��������� � �)*++" E�����-��� ��� 7�189������%� �� ���������� ��� ��� �0������P � ����������� .������'���� ��� ������������� �� ������ �������� 7������� &�%��� =�������>� 7@� &.6C&16�

!���� ��� B % � '����� � % B ��� ��� ��� ! B �)**1" -�����O�������� ��� ����������� �� ��������� ������ ��<��� ��������� ������ ��<��� � $��������� �������� ��� �% ����������� ��� $����� ����' ��� �� *���4 ���+� 5��4 7� 1;6.C1;+9�

!������ $ ��� '���� F �)**6" �������� � �� ��$� ��� ����������� �������� �� $������4 &���� 6���+4 ;;?� .66C.+)�

H����� & � F���(8�������� % � !�� ��� ' � � %�� �� � �8����� � � D�"���� � ��� &������ % �)**1"-��� ��������� �� � �������� ���� �������� 1�����'���� ���� �� �� ������ 4����� ��� ��� ���������� �� ��� ��S� ���� 7189 �� ��� �����������������$��� 2��4 '4 6������4 777� !�+1.C+89�

H����� & � �������� � � D�"���� � � %����� � ��� &������% �)**6" -������ ����� �'�������� ��� ��� ��������� �� ��� ������ �� �$� �������� ����� �����+� ��� �������� �:7/� ��� ���� 7189 ��� ����� $��� 7189 -=76.�8� '4 6���4 -���4717� )*)6;C)*)+;�

F����,��� 9 �)**1" ������ ��� �������� �� ��� #�������+�4�+������ �� 5������� 0���� 9:�; �/������ >�(�� ���"� D�����O-������ U /�� ��� &8*C..;�

3���"���� � � ����� D � ������� D � ���������� � � ������� D ���G����� ! �)**." ������� � �� ��� ������� � ��������$��� �������� �� ��<��� � �� ��� �������� �� �� � ���������� �� �� ����� ��� ���� 7�189�� '4 6������4;;)� ;8&C;86�

#�� �� ������ ��<��� � ������ �� ���� ���� ��� ���� ��������� �� ��� 5��(��0� ::(> ��� E3(D ��������� $��� ���

� ������ ����� ��)8;*6;�

;)+ 0���� ������� ��+ $��� #��1����

�(� 0$� ! ��� � D��� ��� &���� '������� �)***"� 7+� ;))C;)+