carbohidratos

226LABORATORIODEANATOMIAPATOLOGICA

1.INTRODUCCIONALESTUDIOHISTOOUIMICODELOSHIDRATOS

DECARBONO

Loshidratosdecarbonooglcidossonpolialcoholesoxidados(polihidroxialdehdosypolihdroxicetonas)queestncompuestosporcarbono,oxgenoehidrgeno,estosdosenidnticaproporcinaladelagua,esdecir2:1.Estaltimacondicinnoestotalmenteindispensablepuestoquealgunassustanciasseclasificanhoydacomohidratosdecarbonoenausenciadeeiiayenbaseasuparecidoestructuraiconstos.

Lospolisacridossonglcidosdemolculamuyvoluminosa,formadaporlacondensacindemuchasmolculasdemonosacridos(msdediez),coniacorrespondienteprdidademolculasdeaguayconstituyenelgrupodehidratosdecarbonodemayorintersparaeltcnicodelaboratorio.Entreellos,y

ademsdelospolisacrdossimplescomoelglucgeno,destacanlosdoscompleios.

2.POLISACAFIIDOSCOMPLEJOS

Sesubdividenentresgrandesgrupos:mucopolisacridos,mucoprotenasymucolpdos.

2.1.Mucopoiisacridos

Losmucopolisacridospuedendividirseendosgrupos:

MUCOPOLISACARIDOSNEUTROS

Constituidosporunazcar(generalmentegalactosa)yacetilglucosamina,queconfrecuenciasehaHanunidosaunaproteinaformandoglucoprotenasomucoprotenas.EstassustanciassonPASpositivasy,porloanteriormenteexpuesto,secomportandemanerasemejantealasmucoprotenas.

MUCOPOLISCAFIIDOSACIDOS

Porhidrlisisoriginansiempre,ademsdemonosacrdos,hexosaminas(glcidosaminados),avecescidournico(monosacridoconungrupocarboxlicoenposicin6:cidogucurnico,cidogalacturnico,etc.)ycasisiemprecidosulfricoofosfrico,Elmucopolisacrdocidomssimpleese!cidohialurnico(fig.13.1),queconstadeunidadesdedisacridopolimerizadas(cidoDglucurnicoyNacetilglucoamna).

Losmucoposacrdoscidos(MPA)seclasifican,asuvez,en:a)MPAsencillos,carboxmucopolisacridosomucopolisacridosnosulfatados,yb)MPAcomplejososulfatados(sulfomucopoisacridos).

a)Mucopolisacridoscidosnosulfatados

(carboximucopolisacridos)

Entreellosdebendiferenciarse:

Carboximucopo/isacrfdosepite/ia/esosia/omucinas,ricasencidoslicocomoradicalencombinacinconlosgruposcarboxlicospropios.Casi

todasellas:lahialuron'napH2.5,serentealanl_Carboxr'muepuedenCorrnicoson

vos,reaccicdelhierroc

Distincinyuaruuxm

ISTOQUIMICADEHIDRATOSDECARBONOOGLUCIDOS227

Figura13.1'.Frmuladelcidohialurnico.

todas ellas son lbiles frente a la neuraminidasa y resistentes a la accin de la hialuronidasa. Adems son PAS positivas, reaccionan conelazulalcinapH2.5,setienconelmtododelhierrocoloidalysonmetacromticasfrentealazuldetoluidina.

Carboximucopo/isacridoscon/untivos,ricosencidohexurnicoyque

puedencontenercidosilico.PorsuelevadaproporcindecidohialurnicosonIbilesfrentealahialuronidasa.TodosellossonPASnegativos,reaccionanfrentealazulalcinapH2.5,secoloreanconelmtododelhierrocoloidalysonmetacromticosfrentealazuldetoludina.

b)Mucopolisacridoscidossulfatados(sulfomucopolisacridos)

AIigualqueloscarboximucopolisacridos,puedendividirseen:a)epiteliales(sulfomucinasepiteliales),yb)conjuntivos.

_ Mucopo/isacridos cidos su/fatados epite/ia/es. Contienen steres sulfav tados y son resistentes a la accin de la hialuronidasa. Selocalizanenlasglndulassalivaressubmandibularesyenlasclulascaliciformesdelcolon.

Este grupo de sulfomucopolisacridos es por lo general PAS negativo, reacciona frente al azul alcin a pH 1, se tie con la fucsinaaldehdoyesmetacromticofrentealazuldetoluidina.

Mucopo/isacrdos cidos su/fatados con/untivos. Contienen cidos glucurnicos sulfatados como el codrotnsulfato, heparinsulfato y queratosulfato. Los ricos en condrotinsulfato son Ibiles frente a ia hialuronidasa, mientras que los que no lo contienenresistensuaccin.

Estegrupodemucopolisacridoseselqueposeeunmayorcarctercidoascomolamselevadaproporcinderadicalessulfatos,localizndoseelectvamenteeneltejidocartilaginoso,vlvulascardacas,aortaypiel.Engeneral.sonPASnegativos,reaccionanconelazulalcinapH0.5,secoloreanconelhierrocoloidalyfucsinaaldehldoysonmetacromticosfrentealazuldetoluidina.

c)Distincinentresulfomucopolisacridos

ycarboximucopolisacridos

Puederealizarsegenricamentepormetilacinysaponificacin.

Lametilacinconsisteenbloquearlosgruposcidossulfatadosycarboxiladospordesulfatacinyesterificacin,respectivamente,conIacorrespondienteprdidadelatincindelazulalcin.

Lasaponificacindeshacelaesterificacinenloscarboximucopolisacridos


restaurandoIacoloracinconazulalcin,mientrasquelossulfomucopolisacridosnosecolorean.

2.2.Mucoprotenas

Son complejos de proteinas y polisacridos en los que predomina el primer componente. Son similares a las glucoproteinas, perosediferencianensumayorcontenidodehexosamina(superioraI4por100).

Estetipodesustancias,quesuelenasociarse,puedenserhalladasenclulasbetadelahpfisis,membranasbasales,rticulinayfibrasdecolgena.TodasellassonPASpositivasynoexperimentanmetacromasiafrentealazuldetoluidina.

2.3.Mucolipidos

Sonunamezcladepolisacridosycidosgrasoscomplejosqueseencuentrannormalmenteenformadecerebrsidosyganglisidos.SuelenserPASpositivosysetienselectivamenteconciertascoloraconesparagrasas.

3.REACCIONESHISTOQUIMICASBASADASENLA

DEMOSTRACIONDEGRUPOSCARBONILOFORMADOSSOBRELOSHIDRATOS_DECARBONOPOROXIDACIONPREVIA:TECNICASDELPASYDELAPLATAMETENAMINA

3.1.ReaccindePAS(PeriodicAcidSchiff)

Eslareaccinmscomnmenteutilizadaendebidoaque:

a)Esdeampliaaplicacineneldiagnsticohistopatolgicorutinario.

b)Puedecolorearnumerososcomponentesbioqumicos(hidratosdeca'r

bonoosustanciasrelacionadasconellos).

c)Siendounareaccinpocoespecfica,puedeconvertirseenenorme

menteselectivamedianteloscorrespondientescontroles.

Estatcnicafuedescubierta,deformaindependienteyprcticamentesimultnea,porHotchkiss.McManusyLillie(1948).

FUNDAMENTODELAREACCIONDELPAS

Consiste en oxidar los tejidos mediante el cido peridico para incrementar el nmero de grupos carbonilos (aldehdos o cetonas)presentesenellos,deformaquepuedanserdemostradosposteriormentemedianteelreactivodeSchiff.

Loshidratosdecarbonocontienengruposcarbonilosrelativamenteaislados.enunaproporcinaproximadadeunopormolculademonosacrido.Precisamenteporelloesnecesariooxidarlosconelfindeincrementardichosgrupos.queslopuedenserdetectadosporelreactivodeSchiffsiseencuentransituadosencarbonoscontiguosydelimitadosporgruposalcohlicosoamino.

=ara los grupos aldehdos que aparecen en posicin 1,2 glicol estas condiciones 5e cumplen exclusivamente tras la oxidacin de los correspondientesradicaiesi'::roxi|o.

Elagenteoxidanteesgeneralmenteelcidoperidico,aunqueenalgunavariantepuedeutilizarseelcidocrmico.

ReactivodeSchiff

Se obtiene a partir de la fucsina bsica, la cual es tratada con cido sulfuroso. hace desaparecer un doble enlace existente en el centrodelamolcula,lansformndoseenunasustanciaincoloracidosulfofucsnlcooreactivodeE:hiff(fig.13.2).

NH,

Figura13.2.FrmuladelreactivpdeSchiff.

Cuando el reactivo de Schiff reacciona con dos grupos aldehdicos contiguos Hanqueados por los correspondientes radicales OH,aparecedenuevoeIdobleenlace(grupocromforo)y,conl,lacoloracinrojofucsiacaracteristica.

Mediante estudios de espectrofotometra se ha podido concluir que, para un correcto desarrollo de_la reaccin, es necesario que ambos grupos aldehidos se encuentren a una distancia cifrada entre 1 y 1.1 nm, similar a 1a que separa a los cos radicales bencnicosdeIafucsina.

PROCEDIMIENTOTECNICO

Fijacin:formoltamponadoal10por100,lquidodeCarnoyuliquidodeBouin.

Soluciones:

a)Acidoperidicoal0.5por100.

b)ReactivodeSchiff:

Puedeadquirirsecomercialmenteofabricarsesegnelsiguienteprocedimiento:

Fucsinabsica(61.42510)1gnAQuadestila1nda...................................200|'I1L

230LABORATORIODEANATOMlAPATOLOGICA'

Llevarhastaebullicin'elaguadestiladayaadirlafucsina.Disolveryenfriara50C,filtraryaadir:

Metabisulfatosdicoanhdro......................19Acidoclorhdrco20mL

Dejarenreposo24horas(lasolucindebetomaruncolorrosaplido)yfiltraratravsdecarbnactivado,locualdebedecolOrarla.

Almacenarenrefrigerador.

c)Baodocidosulfuroso:

Acidoclorhdrico1NSmLMetabisulfitosdicoal10por100BmLAguadestilada...................................100mL

d]HematoxilinadoHarris.

Mododeoperar:

Desparafinarehidratar,

Acidoperydcoal0.5por100,5minutos.

Lavadoenaguadestilada.

ReactivedeSchiff,15a30minutos.

Aclararentrescambiosdebaosulfuroso.2minutosencadauno.Lavarenaguacorrientedurante5minutos.

HematoxilinadeHarris,30l60segundos.

Lavarenaguacorrientedurante5minutos.

Deshidratar,aclararymontar.

Resultados

_NcleosAzul

lMaten'alPASpositivo..........Rojooscuroamagenta{.fucsina)

COMPUESTOSPAS(+)

Polisacridossimples:glucgeno,celulosa,etc.

2.Mucopolisacridosneutros(fig.13.3,veasepginasencolor):pre

sentessobretodoenglndulasdeBrunnerdelduodeno,epiteliogstricoycpsulasbacterianas.l.

3.Mucoprotenas,queincluyen:ciertasmucinasdeltubodigestivoydel

rbolrespiratorioobronquial,tiroglobulina,TSH,gonadotrofi'nas,cuerposdeRusselldelasclulasplasmticasymegacarioctos.

4.Glucoprotenasdelsuero,membranabasal(fig.13.4,

nasenyfibrasderetiulina.

5.Glucolipidoscomoganglisidosycerebrsidos.l

6*Determnadospigmentos,comopigmentoceroideyciertasIipofuc

SInaS.

COMPUESTOSPAS()'OUE,SINEMBARGO,SONHIDRATOSDECARBONO

Mucopolisacridoscidos:quetienenbloqueadoslosenlaces1ly2glicolporgruposo*COOHynopuedenseroxidadosporelcidoperidico.

IISTOOUIMICADEHIDRATOSDECARBONOOGLUCIDOS231

COLORACIONESDECONTRASTE

Sondiversas:

1.Siseesperaunresultadodbilmentepositivodelatcnica,seutilizar

uncontrastecitoplsmcoconamarillodeMarsobienelsimplecontrastenuclearconhematoxilinadeHarris.

2.Siseesperaunresultadofuertementepositivo,podrcolorearsecon

azuldetoluidina,picrocarmndendigooverdedemetilo.

CONTROLESDELATECNICADELPAS

ComopuedecomprobarseenlosresultadosdelatcnicadelPAS,suespecilcidadesrelativay,portanto,esimprescindiblerealizarpreparacionestestigoo:iecontrolqueconfirmenlosresultadosobtenidos.Paraellosuelensermuytileslastcnicasdebloqueo,talescomoladelbloqueodegruposaldehidosengeneralyladeacetilacinespecificaparagrupos12glicol.

a)Tcryiadebloqueoparagruposaldehdosengeneral

Serealizatratandolosgruposaldehdospresenteseneltejido,traslaoxidacinconcidoperydico,conunasol'ucnal5por100decidoacticosaturadocondimedona(5,5'dimetil1,3ciclohexadona)entre1y16horasa60QC,paraseguirconlavadodelapreparacinconaguadestiladaycontinuarconeIPASnormal.UnicamenteseteirelmaterialPASpositivoformadoaexpensasdegruposaldehdossituadosenposicin12glicol.

b)Tcnicadebloqueomedianteacetilacinparagrupos1.2glicol

Se fundamenta en Ia negatividad de la reaccin del PAS despus de la acetiiacin de los grupos 1,2 glicol presentes en los hidratos de carbono. Este proceso es total o parcialmente reversible por saponificacin ulterior mediante tratamiento con hidrxido potsico.

Si no se ha realizado el bloqueo de los grupo aldehldos preexistentes como habitualmente ocurre en la prctica diaria, el primer problema que Se plantea en esta tcnica es la posibilidad de reacciones falsamente positivas debidas a la existencia de dichos grupos.

Entalcasodeberealizarseuncontrolnooxidandoeltejidotodolocoloredoenestapreparacinnosernenlaces1.2glicoloxidados,sinogruposaldehdosqueyaestabanpresentesantesdelaoxidacin.DespusserealizaunPASoxldandoysecomparanlosresultadosdeambaspreparaciones.

ElsegundoproblemaenlatcnicadelPASseplanteacuandosetratadedilerenciarsilosgruposaldehdosaparecidostraslaoxidacinlohanhechosobregruposalcohlicossituadosenposicin1,2glicolosilosoxidadoshansidogruposhidroxiaminoprimarios,hidroxiaminosecundarioseinclusohidroxicetonasnopresenteshabitualmenteenloshidratosdecarbonoquesonPASpositivos.Estadistincinpuederealizarsemedianteacetilacinreversibleysaponificacin.

O

IIAcetilaresintroducirunradicalacetiloCH3CCenuncompuestoorgnico.Elanhdridoacticoesunreactivoquetienegranaplicacinparaacetilar,


deformaqueconestereactivosebloqueantodoslosgruposalcohlicosengeneralexistenteseneltejido.

La reaccin se lleva a cabo frecuentemente en piridina, por lo que la mezcla ms usada para acetilaein contiene ambas sustancias(anhdridoacticoypiridinaanhidra).

Saponificaresromperunenlacedetiposterdeformaqueencondicionesidneasreaparezcaelgrupoqumicoqueexistaantesdelaacetilacin.

Deloexpuestosededucequelaacetilacinestotalmentereversibletrassaponificacinparalosgruposalcohlicosenposicin1,2glicol,totalmenteirreversibleparalosgruposhidroxiaminosecundariosymoderadamentereversiparaloshidroxiaminoprimarios.

'IETILACIONSAPONIFICACION


1.Mezclaparalaacetilacin:_

Anhdridoaclco13mLPiridinaanhidra..................................20mL

2.Mezclaparalasaponificacn.'

Hidrxdopotsco1Nensolucinacuosaoenalcoholde30".obien:

Alcoholde95'IGmLAmonaco20mLAguadeslilada...........................'........10mL

Mododeoperar:

a]Aceti/:cin:

1.Desparafinar.introducirloscortesenalcoholabsoluto,secarosypasarlos

alapridina.

2.Tratarcon1amezcladeacetilacin.a3758C.duranteuntiempoque

dependedelmateria!biolgico(30minutosa24horas).

3.Pasarloscortesalapridinadespus,alalcoholabsoluto.

4.Hdrmar.

b)Acetiacinsaponficacin:

1a4.Igualqueenelcasoanterior.

*STOQUIMICADEHIDRATOSDECARBONOOGLUCIDOS233

LotesdepreparacionesyresultadosenloscontrolesdelatcnicadelPAS

1.PreparacinenlaqueserealizaunPASnormal.

2. Preparacin en la que se hace un PAS sin oxidar para deteccin de grupos aldehdos preexistentes o un mtodo de boqueo especificoparadichosgrupos.

3.Unlotedeconesquellevasloacetilacin(negatividaddeloscompuestos

PAS[+1),

4.Unlotedecortesquellevaacetilacinmssaponifcacin.

Resultados:

Alaceti/ardesaparecentodoslosgruposPASmenoslosa/dehdospreexistentes.

Alacetilerysapam'fcar,losgruposalcohlicosenposicin1,2glicofquedancomo,agotan(recuperanlaPASpositividad).loshidroxiaminoprimariosreaparecenIuchomsdebi/menteylossecundariaspermanecenbloqueadosalsersu

acetilacnirreversible.

3,2.Tcnicadeiaplatametenamina

Radica reduccin que sobre las sales complejas de plata realizan los radicales carbonilo formados por oxidacin previa de los hidratosdecarbono,deformaquelaplatametlicaobtenidaprecipitasobreiasestructurasquesevanateir.

Comoagentesoxidantesseempleanelcidocrmicoyelcidoperydicoque,comoessabido,oxidanexclusivamentelosenaces1,2ysimilares.

La sal de plata para reducir es ei complejo metenamina argntica, que es inestable y slo s'e mantiene como tal a pH alcalino entre8.3y9.2fueradestesedisociaensusdoscomponentes:hexametilenotetraminaeionesdeplata.

Portodoello,latcnicadeberealizarseconuncontrolcontinuodepH,demodoquelaprecipitacindelaplatamtalicanoocurraanticipadamente.

Por sus caractersticas especiales, est tcnica se emplea para visualizar membranas basa/es, sobre todo en el rin {glomeru|onefritis), compuestas en gran medida por hidratos de carbono del tipo glucoprotenas y que, por tanto, son adems PAS positivas.

234

LABORATORIODEANATOMIAPATOLOGICA


1.2.

Fillcin:formo!tamponadoal1l)por100.

Soiuciones:

Acidoperydicodel0.5al1por100enaguadestilada.Solucindeplatametonamina(frmuladeGomori):

a)Hexametilenotetraminaal3por100enaguadestiada.b)Nitratodeplataal5por100enaguadestilada.c)Boratodesodioal5por100enaguadestilada.

Solucnconcentrdadeplatametenamna:

:sta solucin debe preparano en este orden para evitar ia formacin de precipitados. Cuando se mezcla la solucin A con la B seformaunprecipitadoquedesaparecefcilmenteporagitacin.

_Solucindiluidaodettabalodeplatametenarnina:

Solucinconcentrada25mLAguadest|ada..............._................25mL

ElpHdelasolucindebeseralcalino,de8.5aproximadamente`

Clorurodeoroal0.2por100enaguadestilada.Timulfatosdicoai2por100enaguadestada.

Mododaoperar:

1.Desparainarehidratarloscorteshastaelaguadestilada.

2.concidoperydicodurante20minutos.

3.Laval'conaguadestilada,tresbaosconsecutivosde2minutoscadauno.4.incubalenlasolucindiiuidadeplatametenamina,durante2horasa60C,hastaqueloscortestenganuncolorpardoamarillento.Sedebencontroiaralmicroscopioloscortescada15minutospasadalaprimeramediahoradeincubacin.5.Lavarconaguadesiiiada,tresbaosconsecutivosde2minutoscadauno.6.Tratarloscortesconclorurodeorode20segundosa1minuto.7.Lavarenaguadestilada.B.Fijarcontiosulfatosdicode3a5minutos.9.Lavarenaguadestilada.

10.Realizarcontrastenuclear.

11.Lavarenaguadestilada.12.Deshidratar,aclararymontar.

Resultados

GmcgenmmucnasNegro_HongosNegraMembranasbasatesffig735)Negra

Fr'brasdereticufinayelsticasNegra

ISTOQUIMICADEH\DRATOSDECARBONOOGLUClDOS235

Figura13.5.Identificacindemembranasbasalesaniveilubulalyencapilaresglomeruiaresrenalesmediantelatcnicadeplatametenamina

4.TECNICASPARADETERMINARMUCOPOUSACAFIIDOSACIDOS

Losmucopolisacridoscidos(MPSA)sonunavariantedepolisacridosquenocontienengruposalcohlicosenposicin1,2giicol,sinogruposcidoscarboxlicososulfatados.Estehecholosdiferenciadelosmucopolisacridosneutros(MPSN)congruposhidroxiloenposicin1,2glicolyque,porconsiguiente,sonPAS(+).

REACCIONESGENERALESPARADETERMINARMPSACIDOS

Sonprincipalmentetres:

a)TcnicadelhidratodehierrocoloidaldeHale.b)Tcnicadeazulalcin.c)Reaccinmetacromtca.

4.1.TcnicadelhidratadehierrocoloidadeHale

Es una tcnica hstoqumica ntroducida por Hale en 1946. En su pnmera parte, especfica de esta tcnica, se liga el hierro frrico a los mucopolisacridos cidos mediante un mecanismo de atraccin electrosttica. La segunda parte, histoqumca, consiste enlarealizacinsucesivadelatcnicadelazuldePerlsparaelreveladodelosdepsitosfrrcos.

El reactivo principal de la tcnica es el hidrato de hierro coloidal, que puede adquirirse en el comercio o ser preparado en el laboratorioapartirdesolucindeclorurofrricoal29por100.'

Estereactivoesuncolodericoenmolculasdeagualigadaquehidratana

losionesferrcos(Fe+++)envirtuddelcarcterligeramentedipolardelaprimera.

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