Capítulo 5

Embriogênese Somática

Dr. André Luis Wendt dos Santos1

Msc. Renata Barros Ribeiro2

Dr. Vanildo Silveira3

Dra. Claudete Santa-Catarina4

Dra. Neusa Steiner5

Dr. Miguel Pedro Guerra6

Dr. Eny Iochevet Segal Floh7

1- Universidade Nilton Lins, Laboratório de Biotecnologia Vegetal. Av. Prof. Nilton

Lins, 3259 – Parque das Laranjeiras, CEP 69058-040, Manaus-AM.

2- Universidade Nilton Lins, Laboratório de Biotecnologia Vegetal. Av. Prof. Nilton

Lins, 3259 – Parque das Laranjeiras, CEP 69058-040, Manaus-AM.

3- Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Centro de Biociências e

Biotecnologia, Laboratório de Biotecnologia (LBT) – Av. Alberto Lamego 2000,

Parque Califórnia – CEP 28013-602 – Campos dos Goyatacazes, Rj.

4- Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Centro de Biociências e

Biotecnologia, Laboratório de Biotecnologia (LBT) – Av. Alberto Lamego 2000,

Parque Califórnia – CEP 28013-602 – Campos dos Goyatacazes, Rj.

5- Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Departamento

de Fitotecnia, Laboratório de Fisiologia do Desenvolvimento e Genética Vegetal – Rod.

Admar Gonzaga, km 3, Itacorubi, CEP 88034-001, Florianopolis-SC.

6- Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Departamento

de Fitotecnia, Laboratório de Fisiologia do Desenvolvimento e Genética Vegetal – Rod.

Admar Gonzaga, km 3, Itacorubi, CEP 88034-001, Florianopolis-SC.

7- Universidade de São Paulo, Instituto de Biociências, Departamento de Botânica,

Laboratório de Biologia Celular de Plantas, Rua do Matão, 227 – Cidade Universitária,

CEP 05422-970, São Paulo, SP.

Introdução

Os recursos florestais envolvendo espécies arbóreas nativas têm sido amplamente

explorados, ao longo do tempo, de maneira extrativista. Poucos foram os plantios de

reposição realizados com espécies nativas, sendo que os incentivos florestais têm sido

em geral, direcionados para reflorestamentos com espécies exóticas. Em médio e longo

prazo será inevitável a necessidade de um programa de utilização e reposição das

espécies nativas, com finalidades de proteção e de produção, especialmente para aquelas

produtoras de madeiras nobres e/ou outros produtos comerciais, como é o caso do pau-

rosa (Aniba rosaeodora Ducke). Programas desta natureza, entretanto, têm esbarrado

em vários entraves, especialmente quando se utilizam os métodos de propagação

tradicionais.

A baixa produção de sementes de pau-rosa aliada à elevada perda de viabilidade

das mesmas pela ação de pássaros, insetos e roedores, consistem numa limitação na

produção de mudas e conseqüentemente, dificulta ainda mais a recomposição das

populações naturais e estabelecimentos de plantios ex situ (OHASHI, ROSA e

SANTANA, 1995). Em pau-rosa, o desenvolvimento de protocolos de propagação

vegetativa baseados em micropropagação in vitro e por estaquia gerou resultados

insatisfatórios (HANDA, SAMPAIO e QUISEN, 2005). Neste contexto, o

desenvolvimento de técnicas biotecnológicas, como aquelas baseadas na embriogênese

somática, representa uma importante estratégia para a propagação em larga escala desta

espécie, visando a aplicação em futuros programas de conservação de germoplasma e

reflorestamento.

A biotecnologia aplicada a espécies arbóreas pode ser considerada uma

importante estratégia de desenvolvimento tecnológico, quando empregada em conjunto

aos programas de melhoramento genético convencional. Novas descobertas nas áreas de

cultura de tecidos vegetais, para clonagem florestal, técnicas de transformação genética,

biologia molecular, genômica e proteômica, podem fornecer uma extensa plataforma

para o melhoramento de características até pouco tempo impraticáveis via métodos de

melhoramento convencional.

As técnicas biotecnológicas podem promover excelentes oportunidades para a

compreensão da genômica funcional, por meio do estudo de genes associados com

características de alto valor agregado, e na transferência destes genes para espécies

arbóreas de importância sócio-econômicas. Neste contexto, as diferentes biotecnologias

podem garantir o desenvolvimento de genótipos aptos a atender a demanda mundial por

produtos florestais, enquanto preservam o meio ambiente para as futuras gerações.

Recentes pesquisas têm descrito uma gama de biotecnologias aplicadas a

espécies arbóreas, especialmente no que diz respeito à micropropagação e à inserção de

características de interesse através de técnicas de transformação genética (MERKLE e

NAIRN, 2005; NEHRA et al, 2005). A micropropagação é de grande importância na

propagação clonal de espécies arbóreas, sendo utilizada diretamente no “scale-up” de

espécies florestais de interesse para futuros programas de conservação de germoplasma,

propagação e reflorestamento e/ou para a obtenção de plantas geneticamente

modificadas. Dentre as técnicas de micropropagação aplicadas a espécies florestais, a

embriogênese somática é a mais utilizada (JAIN, GUPTA E NEWTON, 1995). A

embriogênese somática é um processo no qual através da técnica de cultivo in vitro,

células isoladas ou um pequeno grupo de células somáticas dão origem a embriões, num

processo morfogenético que se aproxima da sequência de eventos representativos da

embriogênese zigótica (TAUTORUS, FOWKE e DUNSTAN, 1991).

Em espécies florestais nativas, como é o caso do pau-rosa, a embriogênese

somática assume importância significativa para a propagação clonal, uma vez que os

métodos tradicionais de propagação vegetativa, como aqueles baseados na estaquia ou

de micropropagação in vitro por gemas vegetativas, são de difícil domínio e aplicação.

Uma das causas é a relação inversa entre a idade das plantas matrizes e a capacidade de

enraizamento das estacas, bem como os altos índices de contaminação endógenos. Neste

sentido, tem-se empregado técnicas para o rejuvenescimento, buscando um retardo ou

reversão do processo de maturação, visando a propagação vegetativa de árvores adultas

que possuam caracteres superiores. Contudo, o sucesso destas técnicas tem sido

limitado, e para várias espécies, como em Pinus sp e Eucalyptus sp. a propagação

vegetativa por meio da estaquia ou enxertia requer muito tempo e apresenta respostas

insatisfatórias (HÖGBERG et al, 1998).

A modulação da embriogênese somática em espécies arbóreas pode ser obtida em

um sistema tecnológico de dois ciclos básicos (Figura 1). Ciclo de indução e

multiplicação que se inicia com a indução de culturas embriogênicas em meios de

culturas contendo auxinas, principalmente o ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), e

compreende a fase de multiplicação, em meios contendo auxinas em baixas

concentrações. Com a retirada da auxina do meio de cultura, as culturas embriogênicas

são direcionadas a um ciclo de maturação. Como produtos deste ciclo são obtidos

embriões somáticos maduros passíveis de germinação in vitro e ex vitro ou podem

ainda, ser utilizados para produção de sementes sintéticas (GUERRA, TORRES e

TEIXEIRA, 1999; STEINER et al, 2008).

Figura 1. Modulação da embriogênese somática em espécies arbóreas, com dois ciclos, o de

indução e multiplicação e o de maturação.

Fonte: Steiner et al (2008).

Comparativamente às demais técnicas de micropropagação, a embriogênese

somática apresenta as seguintes vantagens: a) permite a obtenção de uma grande

quantidade de propágulos (embriões somáticos); b) o sistema possibilita um alto grau de

automatização, permitindo baixar os custos por unidade produzida, através da utilização

de biorreatores; c) os embriões somáticos podem ser produzidos de forma sincronizada,

com alto grau de uniformização e pureza genética; d) pode ser utilizada como uma

ferramenta integrada a programas de melhoramento genético florestal, em especial

quando associada à técnica de criopreservação (Figura 2), produzindo as sementes

sintéticas, além de serem apropriados para a criopreservação e produção de metabólitos

secundários (GUERRA, TORRES e TEIXEIRA, 1999; MERKLE e DEAN, 2000).

Figura 2. Estratégia para integração da embriogênese somática em um programa de

melhoramento genético clássico de espécies arbóreas.

Fonte: Steiner et al (2008).

Finalmente, salienta-se que a embriogênese somática tem contribuído para

garantir a propagação de espécies lenhosas de difícil propagação por métodos

convencionais, especialmente para aquelas espécies caracterizadas por um longo

período de maturação e baixa viabilidade de sementes como é o caso do pau-rosa. Esta

estratégia permite a utilização em programas de conservação de germoplasma, na

restauração de áreas degradadas, como também em programas de melhoramento pela

facilidade de aplicação de técnicas de transformação genética e de criopreservação

(VIANA, MAZZA e MANTELL, 1999). O estabelecimento de novas estratégias de

conservação das espécies florestais nativas exige também informações sobre a biologia

reprodutiva e a ecologia. As limitações impostas pela falta de estudos básicos sobre a

ontogênese dos embriões zigóticos, sistemas de cultura de embriões zigóticos,

embriogênese somática e micropropagação, nos seus aspectos fisiológicos e

bioquímicos complementados com a caracterização molecular, com freqüência tornam

os pouco eficazes os protocolos de regeneração in vitro utilizados.

Fases da embriogênese somática

Indução das culturas embriogênicas

Apesar dos inúmeros relatos já disponíveis sobre a indução e desenvolvimento

de embriões somáticos, ainda não existe um protocolo padrão para a indução de culturas

embriogênicas em plantas. A indução e controle da embriogênese somática são

dependentes da fonte de explante, do genótipo da planta doadora de explantes e do tipo

e concentração dos reguladores de crescimento adicionados ao meio de cultura

(GUERRA, TORRES e TEIXEIRA, 1999). Contudo, tem sido observado que o meio

condicionado de linhagens celulares embriogênicas e extratos de sementes, também

podem induzir e modular a embriogênese somática. Compostos ativos presentes no

meio condicionado e extratos de sementes incluem quitinases, proteínas

arabinogalactanas e lipoquitooligossacarideos (VON ARNOLD et al, 2002).

Em espécies arbóreas, a indução da embriogênse somática se dá normalmente

em meio de cultura suplementado com diferentes níveis e combinações dos reguladores

de crescimento auxina e citocinina, sacarose (30 – 90 mM) e de um agente geleificante

como o agar (0,7 - 0,9 % (p/v)), no escuro e sob temperatura constante. Contudo,

dependendo da espécie e mesmo do genótipo testado, as condições do meio de cultura

(estímulos químicos) e do ambiente (estímulos físicos) precisam ser aprimoradas para a

obtenção de altas taxas de indução (PULLMAN, CHOPRA, CHASE, 2006). No caso de

se utilizar com genótipos considerados elite, até mesmo a presença de reguladores de

crescimento pode ser omitida, tanto na indução como nas demais fases da embriogênese

somática (LELU et al, 1999; SILVEIRA et al, 2002).

Um dos pré-requisitos para a indução da embriogênese somática é a competência

das células presentes no explante para seguir a rota de desenvolvimento embrionário,

além da presença de estímulos químicos (reguladores de crescimento, carboidratos e

nitrogênio) e estímulos físicos (luminosidade e temperatura), que acionem a sinalização

para o desenvolvimento desta rota (GUERRA, TORRES e TEIXEIRA, 1999). Dentre

os estímulos químicos, a presença de reguladores de crescimento como a auxina 2,4-D

(ácido 2,4-diclorofenoxiacético) tem sido amplamente empregada para a indução de

culturas embriogênicas em espécies arbóreas (ASTARITA e GUERRA, 1998;

GUERRA, TORRES e TEIXEIRA, 1999; SILVEIRA et al, 2002; SANTA-

CATARINA, MACIEL e PEDROTTI, 2001; FLOH, SANTA-CATARINA e

SILVEIRA, 2007). O seu uso resulta na formação de agregados de células

embriogênicas a partir de células competentes para a rota de desenvolvimento

embrionário. Isto sugere que a suplementação com auxina é um fator essencial para que

células competentes expressem a sua totipotência endógena para o desenvolvimento de

embriões somáticos (KOMAMINE et al, 1992). Em Ocotea catharinensis, a

competência embriogênica de agregados celulares foram relacionados a expressão do

gene SERK (SANTA-CATARINA et al, 2004).

Apesar da possibilidade de se utilizar qualquer parte da planta como fonte de

explante para indução de culturas embriogênicas, a habilidade para diferenciar

estruturas embriogênicas é reduzida com o aumento da idade da planta doadora de

explante. Os primeiros sinais de organização de culturas embriogênicas começam

geralmente a partir da quarta semana de cultivo. Além da formação de culturas

embriogênicas, observa-se também a formação de culturas não-embriogênicas ou então

de tecidos com atividade meristemática que originam posteriormente gemas adventícias

(VON ARNOLD et al, 2002). Culturas embriogênicas e não-embriogênicas podem ser

facilmente diferenciadas pela aparência translúcida e mucilaginosa, característica de

culturas embriogênicas, e por características citoquímicas. Células que reagem

fortemente ao corante carmin acético e fracamente ao azul de Evans são consideradas

embriogenênicas e células com fraca reação ao primeiro e intermediária ao segundo são

células calosas, ou não-embriogênicas (GUERRA, TORRES e TEIXEIRA, 1999). Além

disso, análises bioquímicas das culturas embriogênicas e não-embriogênicas

demonstram o desenvolvimento de diferentes perfis protéicos (SILVEIRA et al, 2004;

SANTOS et al, 2008), no metabolismo de poliaminas (putrescina, espermidina e

espermina), e óxido nítrico (SILVEIRA et al, 2006; SANTA-CATARINA et al, 2007;

STEINER et al, 2007; FLOH, SANTA-CATARINA e SILVEIRA, 2007).

Algumas espécies da família Lauraceae já possuem protocolos estabelecidos

para indução de culturas embriogênicas como é o caso de Persea americana Mill.

(WITJAKSONO, LITZ e PLIEGO-ALFARO, 1999), Ocotea catharinensis (VIANA e

MANTELL, 1999) e Ocotea odorifera Mez. (SANTA-CATARINA, MACIEL e

PEDROTTI, 2001). Para A. rosaeodora já foi observada a indução de calo a partir de

embriões zigóticos germinados em meio MS (MURASHIGE e SKOOG, 1962)

suplementado com ácido naftaleno acético (ANA) e benzilaminopurina (BAP)

(HANDA, SAMPAIO e QUISEN, 2001). Até o presente momento, no Laboratório de

Biotecnologia Vegetal do Centro Universitário Nilton Lins foi possível a obtenção de

calos compactos e translúcidos possivelmente embriogênicos a partir de embriões

zigóticos maturos de A. rosaeodora cultivados em meio de cultura MS suplementado

com 100 μM de 2,4-D (Figura 3A). Resultados similares foram observados para outros

gêneros de Lauraceae, como O. catharinensis (VIANA e MANTELL, 1999) e O.

odorifera Mez. (SANTA-CATARINA, MACIEL e PEDROTTI, 2001). Assim como o

observado por Handa, Sampaio e Quisen (2005), a ausência ou o uso de baixas

concentrações de ácido indol acético (AIA) e 2,4-D (< 50 μM) resultam na germinação

in vitro dos embriões zigóticos de A. rosaeodora (Figura 3B).

Figura 3. Indução de calo e germinação in vitro de embriões zigóticos maturos de Aniba rosaeodora. A - Embrião zigótico com calo na região do hipocótilo após 60 dias de cultivo, em

meio de cultura MS suplementado com 100 µM de 2,4-D. seta: proliferação de tecido caloso

compacto e translúcido. B – Germinação in vitro de embrião zigótico cultivado em meio MS suplementado com 10 µM de 2,4-D e 0,15% (p/v) de carvão ativado.

Fonte: Handa et al (2005)

Manutenção das culturas embriogênicas

A fase de manutenção envolve a transferência das culturas embriogênicas para

um meio de cultura similar ao utilizado na fase de indução, em intervalos de 14 a 21

dias sob níveis constantes de reguladores de crescimento (BECWAR, NOLAND e

WANN, 1987). Por razões ainda desconhecidas, nem todas as culturas embriogênicas

induzidas são aptas a serem estabelecidas no meio de manutenção. Auxinas e

citocininas isoladas ou em combinação são normalmente utilizadas nesta fase, contudo

em concentrações inferiores às utilizadas durante a fase de indução (VON ARNOLD et

al, 2005). Durante a fase de manutenção, as culturas embriogênicas são formadas por

pró-embriões e agregados celulares desorganizados, sendo que a proporção entre ambas

as partes pode ser afetada durante o processo de repicagem das culturas. Isto pode levar

a formação de culturas predominantemente formadas por agregados celulares

desorganizados, e que levarão a baixa eficiência na fase seguinte (maturação) (VON

ARNOLD et al, 1995).

Durante a fase de multiplicação, ciclos repetitivos de proliferação celular podem

ser obtidos em meio semi-sólido ou então, em meio líquido através do estabelecimento

de suspensões celulares (GUERRA, TORRES e TEIXEIRA, 1999). As suspensões

celulares são iniciadas através da transferência de inóculos das culturas embriogênicas

para o meio de cultura líquido, que em geral são os mesmos utilizados para as culturas

semi-sólidas, mas sem a presença de agentes geleificantes, em frascos mantidos sob

agitação variando entre 115 a 150 rpm (TAUTORUS, FOWKE e DUNSTAN, 1991). A

densidade inicial do inóculo desempenha uma importante função no desenvolvimento

das suspensões celulares e a sua quantidade pode variar entre a espécie ou mesmo da

cultura embriogênica utilizada. Após o estabelecimento, as culturas são mantidas em

repicagens com intervalos de uma ou duas semanas, retirando-se alíquotas de 10 ml para

um frasco contendo um novo meio líquido. O uso de biorreatores e a possibilidade de

automação permitem nesta fase a produção massiva de embriões somáticos

geneticamente superiores a baixos custos de produção (VON ARNOLD et al, 2005) e

com menor taxa de contaminação (SILVEIRA et al, 2004).

Além disso, o uso de suspensões celulares é uma das abordagens disponíveis

para o estudo de parâmetros bioquímicos e fisiológicos das culturas embriogênicas

(SILVEIRA et al, 2004; SILVEIRA et al, 2006; SANTA-CATARINA et al, 2007;

STEINER et al, 2007), e para obtenção de compostos vegetais biologicamente ativos.

Métodos convencionais para incrementar a indução na produção destes compostos

incluem mudanças na composição nutricional do meio de cultura, condições físicas,

composição de reguladores de crescimento e uso de elicitores celulares. Neste contexto,

o estabelecimento de suspensões celulares pode ser uma opção valiosa para a produção

em larga escala de compostos vegetais biologicamente ativos e que são produzidos em

baixas quantidades na planta (VERPOORTE et al, 1994).

Maturação das culturas embriogênicas

A maturação é a fase mais importante no processo da embriogênese. Nesta fase

o embrião passa por significativas alterações morfológicas e bioquímicas, mediadas por

um preciso controle genético, resultando na deposição de substâncias de reserva,

repressão da germinação e aquisição da tolerância a dessecação (BEWLEY e BLACK,

1994; CAIRNEY e PULLMAN, 2007).

Na embriogênese somática, uma porção significante das culturas celulares

induzidas em diferentes espécies são incapazes de produzir embriões somáticos

maduros, os quais não germinam e não convertem em plântulas normais, ou ainda, o

desenvolvimento e a maturação de embriões são interrompidos pela germinação

precoce, conduzindo o desenvolvimento de plântulas pouco desenvolvidas

(FISCHEROVA et al, 2008). Grandes esforços têm sido centrados no sentido de

resolver estes problemas, especialmente suplementando o meio de cultura com agentes

promotores do processo de maturação. Estes agentes possibilitam a progressão no

desenvolvimento dos embriões somáticos para as etapas posteriores da embriogênese

somática, simulando os eventos da embriogênese zigótica (STASOLLA e YEUNG,

2003; STEINER et al, 2005; SILVEIRA et al, 2006; SANTA-CATARINA et al, 2007;

FISCHEROVA et al, 2008).

A adição de agentes promotores da maturação, como reguladores de

crescimento, agentes osmóticos e açúcares, ao meio de cultura exercem efeitos

fundamentais nos aspectos morfológicos, bioquímicos e moleculares. Estes promotores

estão relacionados com a redução de crescimento, pela inibição da divisão celular e na

sincronização da maturação dos embriões somáticos. A adição de promotores da

maturação está relacionada com alterações na morfologia dos embriões somáticos

(SVOBODOVÁ et al, 1999; RAMAROSANDRATANA et al, 2001), no padrão de

expressão de genes associados com o desenvolvimento do embrião e qualidade das

plântulas germinadas (CAIRNEY e PULLMAN, 2007; FISCHEROVA et al, 2008), e

no metabolismo endógeno de substâncias de reserva e hormônios vegetais

(SALAJOVA, SALAJ e KORMUTAK, 1999; SILVEIRA et al, 2006; SANTA-

CATARINA et al, 2007). Dentre os reguladores de crescimento vegetais, o ácido

abcsícico (ABA) é o mais utilizado para a maturação dos embriões somáticos em

espécies arbóreas. Este regulador adicionado ao meio de cultura estimula a maturação,

promove o desenvolvimento normal dos embriões e a sua conversão em plântulas em

várias espécies (STASOLLA e YEUNG, 2003; FISCHEROVA et al, 2008; VAHDATI

et al, 2008).

O mecanismo preciso pelo qual o ABA atua no desenvolvimento do embrião

ainda não está totalmente elucidado, mas é claro que este composto, direta ou

indiretamente, regula a síntese de proteínas de reserva e proteínas LEA (late

embryogenesis abundant), ambas sintetizadas no final do desenvolvimento embrionário

(BEWLEY e BLACK, 1994; GARELLO et al, 2000). As proteínas LEA são

classificadas em cinco grupos em virtude da similaridade de suas seqüências de

aminoácidos (BOUDET et al, 2006). Elas apresentam baixa complexidade, uma grande

afinidade com as moléculas de água atuando na proteção à desidratação do embrião

(BOUDET et al, 2006). As proteínas de reserva são utilizadas como fonte de nitrogênio

no desenvolvimento e germinação do embrião, sendo divididas em quatro classes de

acordo com a sua solubilidade: (a) albuminas, solúveis em água ou em tampão de pH

neutro, (b) globulinas, solúveis em soluções salinas e insolúveis em água, (c) glutelinas,

solúveis em ácido diluído ou em soluções alcalinas e (d) prolaminas, solúveis em

álcoois. Na embriogênese somática a síntese protéica é influenciada pela adição de

ABA e agentes osmóticos ao meio de cultura. Os efeitos destes compostos,

provavelmente, são aditivos, no qual o ABA induz a síntese protéica e o agente

osmótico regula esta síntese em nível pós-transcricional. Em Picea abies, uma espécie

arbórea, foi observado que a remoção do ABA do meio de maturação resulta em

embriões anormais e rápido decréscimo na expressão da proteína PaVP1, uma proteína

relacionada com a competência embriogênica, indicando que o ABA exógeno é

fundamental para a maturação e o desenvolvimento normal do embrião (FISCHEROVA

et al, 2008).

Além do ABA, recentemente, as poliaminas também tem sido utilizadas para

promover a evolução morfogenética e induzir a maturação de culturas embriogênicas

em diferentes espécies (NIEMI et al, 2002; SILVEIRA et al, 2006; SANTA-

CATARINA et al, 2007; STEINER et al, 2007; STEINER et al, 2008) sendo a

espermidina e espermina, de fundamental importância no processo de maturação,

enquanto a putrescina, estaria relacionada com o crescimento celular.

A utilização de agentes osmóticos no meio de maturação tem contribuído para a

otimização dos sistemas de embriogênese somática, sendo o polietilenoglicol (PEG) o

agente osmótico preferido em relação aos agentes plasmolisantes (sacarose, sais,

manitol), devido ao seu caráter não-plasmolisante (SVOBODOVÁ et al, 1999;

STASOLLA e YEUNG, 2003). O estresse osmótico induzido por PEG com peso

molecular maior que 4000 é que mais se aproxima do estresse hídrico observado em

embriões sujeitos a condições de desidratação. Isto ocorre porque moléculas maiores de

PEG não passam pela parede celular enquanto a água é retirada, levando a uma redução

na potencial de turgor e um potencial osmótico intracelular mais negativo. Em resumo,

o PEG não é internalizado na células vegetais e quando é adicionado ao meio de cultura

gera o estresse hídrico nas células (SVOBODOVÁ et al, 1999).

Embora alguns trabalhos mostrem que o PEG isoladamente promova a

maturação (SVOBODOVÁ et al, 1999), outros estudos demonstram que a combinação

do PEG com outros promotores de maturação, principalmente o ABA, e também

agentes osmóticos de baixo peso molecular, como a maltose, é essencial para o aumento

na qualidade e quantidade de embriões somáticos obtidos após a fase de maturação

(KLIMASZEWSKA e SMITH, 1997; STASOLLA e YEUNG, 2003).

Compostos de baixo peso molecular (sais inorgânicos, aminoácidos e

carboidratos) têm sido utilizados no meio de cultura com o objetivo de aumentar a

maturação dos embriões somáticos. Dentre as fontes de carboidrato destacam-se os

dissacarídeos maltose e sacarose. Alternativamente, os hexitóis como, por exemplo, o

manitol e sorbitol, também são empregados na maturação de culturas embriogênicas.

A maltose é o carboidrato mais amplamente utilizado na maturação de culturas

embriogênicas, e ao ser adicionado ao meio de cultura de maturação pode atuar como

fonte de carbono e como agente osmótico (SHOJI et al, 2006), sendo quebrado

disponibilizando glicose, que é prontamente assimilável pelas células vegetais

(SALAJOVA, SALAJ e KORMUTAK, 1999). Freqüentemente, a utilização de maltose

é preferida em relação aos outros tipos de açúcares por promover um aumento no

número e na qualidade de embriões somáticos, conforme observado para algumas

espécies arbóreas como Pinus elliottii e P. taeda (SALAJOVA, SALAJ e

KORMUTAK, 1999), Hevea brasiliensis (BLANC et al, 2002), Prunus avium

(REIDIBOYM-TALLEUX et al, 1999) e Araucaria angustifolia (STEINER et al,

2008). Adicionalmente, esta substância mantém a pressão osmótica do meio alta e

constante, por longo período, devido a sua quebra mais lenta em relação à sacarose

(SHOJI et al, 2006).

A sacarose como um agente osmótico de baixo peso molecular apresenta

também um efeito positivo na fase de maturação em várias espécies (LIPAVSKÁ e

KONRÁDOVA, 2004). A sacarose desempenha uma rota importante na estabilização

de membranas, sendo o mais freqüente carboidrato observado em resposta a estresse

(HOEKSTRA e GOLOVINA, 1999).

As respostas ao uso de promotores de maturação nas culturas embriogênicas de

arbóreas é espécie-dependente, e em muitos casos é genótipo-dependente dentro da

mesma espécie. Neste sentido, é necessária a experimentação para determinar tipo e

concentração de promotor de maturação a ser utilizado. Em geral, as concentrações de

ABA variam entre 10 e 150 µM e o uso de PEG e carboidratos variam entre 2 e 10%.

Ressalta-se que a combinação de ABA, PEG e maltose, em diferentes concentrações, já

foi utilizada com sucesso na maturação de embriões somáticos em vários sistemas

vegetais, como observado para A. angustifolia (SANTOS et al, 2002, STEINER et al,

2008), P. taeda (LI et al, 1998) e P. nigra (SALAJOVA, SALAJ e KORMUTAK,

1999), sugerindo que a combinação de múltiplos compostos é fundamental para

promover a maturação de embriões somáticos. Até o momento não foram estabelecidos

estudos durante a fase de maturação em culturas embriogênicas de A. rosaeodora, uma

vez que os trabalhos estão centrados na fase de indução e multiplicação de culturas

embriogênicas nesta espécie.

Germinação de embriões somáticos

O endosperma das sementes de angiospermas e o megametófito das

gimnospermas, ricos em nutrientes, e que circundam o embrião zigótico durante a

germinação está ausente nos embriões somáticos (CAIRNEY e PULLMAN, 2007).

Alguns estudos sobre as condições e nutrientes presentes nas estruturas associadas ao

desenvolvimento dos embriões zigóticos têm sido realizados com o objetivo de

determinar os requerimentos necessários ao meio de cultura durante a germinação dos

embriões somáticos (PULLMAN e BUCHANAN, 2003; KLIMASZEWSKA et al,

2004). Desta forma, a qualidade dos embriões somáticos tem sido determinada por meio

de estudos comparativos com os embriões zigóticos (PULLMAN et al, 2003a,

PULLMAN, CHOPRA e CHASE, 2006, SILVEIRA et al, 2008). Foi observado, por

exemplo, que o conteúdo de proteínas de reserva é em torno de 30-50% menor e os

teores de umidade são, em geral, mais elevados em embriões somáticos comparado aos

embriões zigóticos maduros (NEHRA et al, 2005).

Somente embriões somáticos maduros com morfologia normal e que

armazenaram suficiente conteúdo de substâncias de reserva adquirem tolerância à

dessecação desenvolvem-se em plântulas normais (VON ARNOLD et al, 2005). Para a

germinação de embriões somáticos produzidos a partir de diferentes sistemas

embriogênicos os pré-tratamentos de armazenamento a frio, desidratação e acido

giberélico (GA3), bem como a germinação de embriões somáticos em meio líquido têm

sido utilizados. A desidratação prévia de embriões somáticos aumentou as taxas de

germinação e o vigor das plântulas regeneradas em várias espécies, como Castanea

sativa (CORREDOIRA et al, 2008), O. catharinensis (VIANA, 1998), Carya illinoensis

(WETZSTEIN et al, 1996) e trigo (BLACK et al, 1999). O pré-tratamento de

desidratação é considerado um estímulo que desencadeia mecanismos de tolerância à

dessecação, por meio da redução de turgor e alterações no balanço osmótico dos

embriões somáticos. Esta condição provocaria rápidas mudanças bioquímicas, as quais

incluem a síntese de proteínas relacionadas com a tolerância à dessecação, promovendo

a maturação completa dos embriões somáticos (MALABADI e NATARAJA, 2006).

As condições de cultura in vitro especialmente durante a etapa de maturação

afetam a germinação do embrião e o crescimento da plântula, sugerindo que os

componentes do meio de cultura utilizado nesta fase têm relação direta com a obtenção

de embriões somáticos de alta qualidade e a subseqüente capacidade de germinação

(PULLMAN et al, 2003a). Em P. abies, o incremento no tempo de exposição dos

embriões somáticos ao ABA e à luz, reduziu a sua conversão em plântulas (HODBERG

et al, 2001). Para esta mesma espécie foram determinados critérios de seleção como, por

exemplo, o comprimento do epicótilo e presença de raízes laterais, os quais foram

considerados parâmetros importantes para a transferência e o desenvolvimento ex vitro

das plântulas. Desta forma, as plântulas somáticas selecionadas apresentaram

crescimento ex vitro similar ao desenvolvimento das zigóticas (HODBERG,

BOZHKOV e VON ARNOLD, 2003). Em Larix leptolepsis, a freqüência de

germinação dos embriões somáticos foi influenciada pela concentração do agente

gelificante presente no meio de maturação. Embriões somáticos provenientes do meio

contendo ABA (60 µM) e agente gelificante (0,6 e 0,8%), respectivamente,

apresentaram alta freqüência de germinação (33,4 e 35,5%) comparativamente ao meio

de cultura que continha baixas concentrações destes componentes (KIM e MOON,

2007).

Em geral, plântulas originadas a partir de embriões somáticos são menores

comparativamente àquelas provenientes de embriões zigóticos. Contudo em alguns

casos, auxinas e citocininas podem estimular a germinação e alterações no meio de

cultura basal, como a suplementação com glutamina e caseína hidrolisada, em geral são

necessárias (VON ARNOLD et al, 2002). São utilizados baixos conteúdos da

combinação de benzilaminopurina (BA) e/ou GA3, ou ainda meios de cultura isentos de

fitorreguladores. Contudo, para algumas espécies a variação somaclonal é um problema.

Em geral, o uso de 2,4-D e/ou uma prolongada submissão de culturas embriogênicas a

este fitorregulador em etapas iniciais da embriogênese são responsáveis pela indução de

variação genética e epigenética (VON ARNOLD et al, 2005). Assim, a conversão dos

embriões somáticos é considerada um passo crítico durante todo o processo de

embriogênese somática. Muitos sistemas biológicos mostram-se promissores para a

propagação clonal por meio da embriogênese somática, porém os embriões somáticos

apresentam, geralmente, baixas taxas de conversão em plântulas. Isto se deve ao fato de

que muitos sistemas embriogênicos, aparentemente, produzem embriões somáticos que

não estão completamente maduros, o que resulta em baixa germinação e crescimento

inicial lento das plântulas. Em soja, os embriões somáticos de seis cultivares

apresentaram uma freqüência de conversão de 27 a 45% (LI e GRABAU, 1996). Em

Acca sellowiana a maior taxa de conversão de embriões somáticos em plântulas foi

25,9% (CANGAHUALA-INOCENTE et al, 2007).

Existem duas estratégias importantes que podem melhorar a etapa de

germinação (PULLMAN et al, 2003b): (i) avançar no conhecimento das condições

ideais para o desenvolvimento dos embriões somáticos completamente maduros, e (ii)

melhorar o processo de germinação através de mudanças na composição do meio de

cultura e condições de cultivo in vitro. Ambos os processos precisam ser melhor

estudados, especialmente em espécies lenhosas. A compreensão dos eventos que

controlam a maturação e qualidade dos embriões somáticos poderá melhorar a

germinação e a conversão em plântulas e, igualmente, possibilitar a utilização da

tecnologia de sementes sintéticas como alternativa na propagação de espécies arbóreas.

Criopreservacão

A preservação dos recursos genéticos mundiais é atualmente o principal objetivo

dentre as estratégias de conservação da biodiversidade (COATES e DIXON, 2007). Nos

últimos anos, técnicas in vitro têm sido amplamente utilizadas para a conservação de

espécies ameaçadas, e esta é a provável tendência para outras espécies ameaçadas de

extinção (SARASAN et al, 2006). O valor potencial da criopreservação como uma

ferramenta para conservação de germoplama de plantas é enfatizada por diversos

autores (ENGELMANN, 1997; STACEY, LYNCH e BENSON, 1999; ENGELMANN,

2004; GONZALEZ-ARNAO et al, 2008). A criopreservação é considerada uma opção

segura e de baixo custo para a conservação de germoplasma em longo prazo de

materiais vegetais com atributos únicos ou específicos, incluindo as espécies que

apresentam sementes recalcitrantes ou aquelas que são propagadas vegetativamente

(ENGELMANN, 2004). Esta técnica utiliza espaço físico mínimo e requerimentos de

manutenção que não causam alterações genéticas no material vegetal (SAKAI, 1997).

Além disso, a criopreservação é uma estratégia ex situ de conservar a diversidade alélica

existente, permitindo a sua futura utilização (PANIS, 2006).

Os principais progressos realizados em criobiologia ocorreram durante a

segunda metade do século passado, e muitos destes progressos resultaram de estudos

empíricos. Contudo, nos últimos anos, os avanços têm sido estimulados por meio do

desenvolvimento da fundamentação teórica sobre a criopreservação (PANIS, 2006). A

criopreservação pode ser definida como a conservação de material biológico em

nitrogênio liquido (-196º C), ou em fase de vapor (-150º C) (LAMBARDI et al, 2001), e

permite a manutenção da viabilidade celular pela paralisação do seu metabolismo em

temperaturas ultra-baixas, sem que ocorra dano irreversível aos tecidos (ENGELMAN,

2004). Protocolos de criopreservação incluem o emprego de componentes criogênicos

(agentes crioprotetores e baixa temperatura) e não criogênicos (tratamento pré e pós-

armazenamento dos explantes). Existem duas estratégias principais de criopreservação,

as quais diferem em seus mecanismos físicos de atuação: clássicas e convencionais e

aquelas baseadas no processo de vitrificação. Há também protocolos que incluem o

encapsulamento do explante, incluindo agentes crioprotetores e posterior desidratação

antes do congelamento (DING et al, 2008).

O estado da água e o equilíbrio osmótico relacionados aos movimentos de

entrada e saída de água da célula são parâmetros de particular importância para

criopreservação (MAZUR, 2004). O principal desafio do processo de criopreservação é

atingir o congelamento sem que ocorra a formação de cristais de gelo intracelular

(SANTOS, 2000). A formação de cristais de gelo causaria a ruptura das membranas e

estas perderiam a função de semi-permeabilidade e compartimentalização, culminando

em colapso celular e danos irreversíveis (ENGELMANN, 1997). Os principais estresses

as quais as células são submetidas nestas condições correspondem ao estresse osmótico

ou de desidratação, estresse oxidativo e as alterações no pH intracelular. A desidratação

resultaria em aumento da concentração de solutos, interrupções de trocas iônicas. Por

sua vez o estresse oxidativo afeta os arranjos metabólicos, aumento da produção de

radicais livres e oxidação de lipídios, influenciando diretamente as membranas celulares

(DUMET e BENSON, 2000).

Considerando a superação dos parâmetros acima citados, o processo de

criopreservação é, em princípio, aplicável a quaisquer tecidos que tenham capacidade de

regeneração. Tal processo foi utilizado com sucesso em diversas espécies vegetais, por

meio do emprego de culturas embriogênicas, ápices, gemas axilares, embriões

somáticos e zigóticos (ENGELMANN, 1997; SANTOS, 2000). Estas fontes de

explantes permitem diversas possibilidades de aplicação desta técnica (SARASAN et al,

2006). Além disso, a criopreservação associada à tecnica de embriogênese somática

permite a integração de um sistema de conservação in situ e ex situ. Neste caso, os

materiais que são utilizados em programas de melhoramento podem ser re-introduzidos

em áreas degradadas, assim como os materiais provenientes de remanescentes podem

servir como fonte de diversidade genética (GUERRA et al, 2008).

Para espécies lenhosas a utilização da criopreservação foi reportada utilizando

culturas embriogênicas de Mangifera indica (WU et al, 2007), A. angustifolia

(DEMARCHI, 2003), Cedrus libani (KHURI et al, 2000), e sementes e meristemas

apicais de Cedrella fissilis (NUNES et al, 2003). Em palmeiras, a utilização da

criopreservação foi reportada utilizando meristemas apicais de Phoenix dactylifera

(BAGNIOL e ENGELMANN, 1991), plúmula de Cocos nucifera (HORNUNG,

DOMAS e LYNCH, 2001), embriões somáticos de Elaeis guineensis (ENGELMANN

et al, 1994) e embriões zigóticos de Bactrys gasipaes (STEINMACHER et al, 2007).

O sucesso do protocolo de criopreservação depende da tolerância e sensibilidade

do material vegetal em suportar o acúmulo de estresse, durante as sucessivas etapas do

processo de criopreservação. Ao escolher o protocolo e o tratamento crioprotetor é

importante considerar a origem do germoplasma (temperado ou tropical), o estado

fisiológico (dormente ou ativo), a tolerância ao estresse abiótico (frio e dessecação) bem

como a operacionalização que incluem fatores técnicos e práticos (REED,

SCHUMACHER e DUMET, 2005).

2.6 Sementes sintéticas

Técnicas avançadas de cultura de tecidos vegetais e suas aplicações para a

micropropagação de plantas obtiveram significativos progressos nas últimas duas

décadas para uma ampla diversidade de espécies. Entre estes avanços, a automatização

por meio, principalmente, do emprego de sistemas de imersão temporária (SITs),

permitiu o ´scale-up` da micropropagação massal (UTOMO et al, 2008), quando

associada à técnica de embriogênese somática e de sementes sintéticas. O ciclo de

produção de culturas embriogênicas por meio do emprego de suspensões celulares é

relativamente curto e pode ser utilizado como uma alternativa à produção de sementes,

especialmente em espécies que apresentam longo ciclo reprodutivo ou com sementes

recalcitrantes (AQUEA et al, 2008).

Uma aplicação importante dos embriões somáticos é seu uso na produção de

sementes sintéticas (MERKLE, PARROTT e WILLIAMS, 1995), as quais promovem a

rápida multiplicação de plantas via embriogênese somática (UTOMO et al, 2008).

Sementes sintéticas ou artificiais são análogas às sementes zigóticas e consistem de um

embrião circundado por uma cápsula de hidrogel biodegradável. Esta cápsula serve de

proteção ao embrião somático contra danos mecânicos durante a armazenagem,

transporte e semeadura (ONISHI, SAKAMOTO e HIROSAWA, 1994), podendo agir

também como endosperma artificial quando for constituída, ademais do hidrogel, de

fontes de carbono, nutrientes minerais, vitaminas e fitorreguladores (MALABADI e

VAN STADEN, 2005). O alginato de sódio é o principal composto empregado para o

encapsulamento em virtude de suas propriedades gelificantes, baixo custo, facilidade de

uso e da ausência de toxicidade (GUERRA, TORRES e TEIXEIRA, 1999).

Vários autores (REDENBAUGH, 1990; GRAY et al, 1995; GUERRA,

TORRES e TEIXEIRA, 1999) apontam que as principais vantagens desta tecnologia

estão associadas aos seguintes aspectos: a) baixo custo considerando os grandes

volumes produzidos; b) permitir a automatização associada ao emprego de biorreatores;

c) permitir o armazenamento; d) permitir a semeadura direta a campo; e) diminuição os

custos de produção uma vez que podem ser eliminadas as etapas realizadas em

estruturas de sementeira e viveiros.

Dentre os métodos para a produção de sementes sintéticas, o mais empregado é a

geleificação ionotrópica de alginato de sódio por íons cálcio. Esta tecnologia foi

desenvolvida inicialmente por Redenbaugh et al (1986), os quais verificaram que os

hidrogéis formados pelo alginato de sódio ou de potássio e complexados em cloreto de

cálcio podiam ser empregados para a confecção das cápsulas. A partir disto surgiram

inúmeros estudos com esta tecnologia, incluindo o controle da maturação dos embriões

zigóticos e somáticos, a produções de embriões em biorreatores, o encapsulamento e a

desidratação dos embriões somáticos (GRAY, STEPAN-SARKISSIAN e FOWLER,

1987).

A definição original de semente sintética foi formulada a partir do uso de um

único embrião somático encapsulado, o qual poderia ser manipulado como uma semente

zigótica, permitindo, desta forma, o transporte, o armazenamento e a semeadura em

ambiente in vivo ou ex vitro e, finalmente, desenvolver em uma planta completa ou

“conversão". No entanto, esta definição limitou-se a obtenção de semente sintética

associada ao uso de um embrião somático, isto é, um propágulo bipolar regenerado a

partir da embriogênese somática que poderia ser contida em uma cápsula, que permitiria

a manipulação e a semeadura (STANDARDI e PICCIONI, 1998).

A tecnologia de sementes sintéticas passou a ser empregada como uma

ferramenta chave no processo de multiplicação massal de plantas e tem recebido

considerável atenção com base na sua eficácia e na redução de custos do sistema de

propagação clonal (PATTNAIK e CHAND, 2000). A consolidação de protocolos onde

os fatores de economia e tempo estão diretamente ligados ao sucesso da produção em

escala de propágulos (REDENBAUGH et al, 1986, GUERRA et al, 2001). Os mais bem

sucedidos casos de produção de semente sintética e regeneração de plantas já foram

documentados para as mais diversas espécies de cereais, hortaliças, frutíferas,

ornamentais, aromáticas e coníferas (PATTNAIK e CHAND, 2000).

Várias inovações têm sido aplicadas à técnica de encapsulamento, tais como o

estabelecimento do sistema de encapsulamento em cápsulas farmacêuticas (DUPUIS et

al, 1994). Patel et al (2000) sugeriram outra inovação que consiste em suspender o

material vegetal em solução de carboximetilcelulose e complexar em CaCl2 sobre uma

solução de alginato de sódio em agitação, resultando na formação de uma cápsula com

matriz interna líquida (Figura 4). Esta técnica foi testada em cenoura, por estes mesmos

autores, e resultou em 100% de emissão de radícula das unidades encapsuladas.

Figura 4. Representação esquemática para a confecção de sementes sintéticas e unidades

encapsuláveis por meio de diferentes sistemas: (1) alginato de sódio complexado em CaCl2 (ONISHI et al, 1994); (2) cápsula do tipo dupla camada, interna de carboximetilcelulose ou

amido complexandos de “dentro para fora” em CaCl2 e camada externa de alginato de cálcio

(PATEL et al, 2000) e; (3) cápsulas farmacêuticas (DUPUIS et al, 1994) com matriz de alginato ou amido.

Fonte: Patel et al (2000)

Unidades encapsuláveis

A técnica de unidade encapsulável (UE) foi inicialmente reportada por Onishi

Mashiko e Okamoto (1992) a partir de embriões de aipo (Apium graveolens)

encapsulados, os quais mantiveram a habilidade de conversão em condições não

estéreis. Sakamoto, Onishi e Hirosawa (1995) ampliou os limites da aplicação desta

tecnologia ao propor a utilização de meristemas e gemas apicais caulinares como UE

em uma matriz de gelificação capazes de serem convertidas em plântulas normais.

Para se enquadrar no conceito de UE estes propágulos devem apresentar as

seguintes características gerais: a) o tamanho da unidade deve estar dentro dos limites

do encapsulamento (até 8 mm) e deve ser livre de calo, ou tecido do explante materno;

b) o excesso de crescimento dos brotos deve ser suprimido até a formação endógena de

raízes adventícias; e c) devem possuir uma vigorosa habilidade de conversão em

condições ambientais normais; e d) apresentar tolerância contra o estresse na

manipulação dos propágulos (ONISHI, MASHIKO e OKAMOTO, 1992;

SAKAMOTO, ONISHI e HIROSAWA, 1995). Uma das vantagens desta técnica é a

eliminação de etapas da cultura in vitro por possibilitar o enraizamento em condições ex

vitro (SINGH et al, 2006). Desta forma, é possível a aclimatização e o crescimento

inicial diretamente em substratos ou com adaptações para suportar as condições de

campo e, principalmente, permitir o armazenamento e transporte dos propágulos com

alta viabilidade (STANDARDI e PICCIONI, 1998).

O uso de propágulos unipolares derivados das culturas in vitro, especialmente

em espécies micropropagadas por outras rotas morfogenéticas que não a embriogênese

somática foi abordada por STANDARDI e PICCIONI (1998). Para estes autores, três

tipos de propágulos podem ser utilizados: 1) propágulo unipolar natural, que são os

microbulbos, microtubérculos, microbrotos e rizomas; 2) segmentos de brotos, ou

micro-estacas, que são os segmentos nodais contendo a gema apical ou axilar e; 3)

propágulos diferenciais, que são os tecidos e órgãos imaturos, tais como os

meristemóides, agregados de células e primórdios de gemas. Todas estas estruturas,

também podem ser consideradas como UE quando apresenta tamanho adequado para

manipulação, viabilidade de conservação e de conversão em plântula completa.

No encapsulamento de brotações de bananeira (Musa sp.) obteve-se 100% de

conversão em plântulas (GANAPATHI et al, 1992). Contudo, esta conversão se deu em

condições in vitro e na presença de meio de cultura indutivo, aspectos estes que também

foram observados em microbrotos encapsulados de bananeira cv. Grand Naine

(SANDÓVAL-YUGAR, 2002). A tecnologia de UE a partir de microbrotos de

bromélias e os estudos dos efeitos da adição de fitorreguladores e de carvão ativado na

sobrevivência ex vitro das UE foram testados por Rech-Filho (2004) (Figura 5). A

formação de UE permitiu com sucesso o estabelecimento ex vitro e promoveu um

incremento no número de folhas nas plântulas aclimatizadas de bromélia, quando

comparadas com o uso de microbrotos não encapsulados.

Figura 5. Representação esquemática do protocolo de indução e confecção de unidades

encapsuláveis de plantas desenvolvidas no Laboratório de Fisiologia do Desenvolvimento e

Genética Vegetal/CCA/UFSC.

Fonte: Rech-Filho (2004)

Considerações finais

Durante os últimos anos, o aumento no consumo de madeira e produtos

derivados de espécies florestais tem exigido cada vez mais do setor florestal um

aumento de produtividade. Contudo, este aumento de produtividade não pode estar mais

associado com a exploração de áreas contendo populações nativas ou então utilizando

espécies em risco de extinção. O uso de ferramentas biotecnológicas como a

embriogênese somática (ES) possibilitará ao setor florestal o aumento de produtividade

necessário a atender as demandas do mercado, além de possibilitar o uso sustentável e a

conservação ex situ de espécies ameaçadas e/ou em risco de extinção. Apesar de

incipientes, os trabalhos já realizados com A. rosaeodora demonstram um grande

potencial para aplicação da tecnologia de ES nesta espécie. Neste sentido, os protocolos

já estabelecidos para ES em outras espécies da família Lauraceae podem ser utilizados

como ponto de partida para o desenvolvimento de um protocolo eficiente para

micropropagação e conservação ex situ de genótipos elite de A. rosaeodora.

Referências

AQUEA, F. et al. Synthetic seed production from somatic embryos of Pinus radiate.

Biotechnol Lett DOI 10.1007/s10529-008-9754-x. 2008.

ASTARITA, L.V.; GUERRA, M.P. Early somatic embryogenesis in Araucaria

angustifolia – induction and maintenance of embryonal-suspensor mass cultures. Braz.

J. Plant. Physiol. v. 10, p. 113-118, 1998.

BAGNIOL, S.; ENGELMANN, F. Effects of pregrowth and freezing conditions on the

resistance of meristems of date palm (Phoenix dactylifera L. var. Bou Sthammi Noir) to

freezing in liquid nitrogen. Cryo-Lett, v. 12, p. 249-286, 1991.

BECWAR, M.R.; NOLAND, T.L.; WANN, S.R. A method for quantification of the

level of somatic embryogenesis among Norway spruce callus lines. Plant. Cell. Rep., v.

6, p. 35-38, 1987.

BEWLEY, J.D.; BLACK, M. Seeds: Physiology of Development and Germination.

London: Plenum Press New York, 1994. 445 p.

BLACK, M. et al. Water content, raffinose, and dehydrins in the induction of

desiccation tolerance in immature wheat embryos. Plant. Physiol., v. 120, p. 463-471,

1999.

BLANC, G. et al. Differential carboydrate metabolism conducts morphogenesis in

embryogenic callus of Hevea brasiliensis (Müll.Arg.). J. Exp. Bot., v. 53, p. 1453-

1462, 2002.

BOUDET,J. et al. Comparative analysis of the heat stable proteome of radicles of

Medicago truncatuala seeds during germination identifies late embryogenesis abundant

proteins associated with desiccation tolerance. Plant Physiology, v.140, n.4, p.1418-

1436,2006.

CAIRNEY, J.; PULLMAN, G.S. The cellular and molecular biology of conifer

embryogenesis. New. Phytol., v. 176, p. 511-536, 2007.

CANGAHUALA-INOCENTE, G.C. et al. Improvements in somatic embryogenesis

protocol in Feijoa (Acca sellowiana (Berg) Burret): Induction, conversion and synthetic

seeds. Sci. Hort., v. 111, p. 228-234, 2007.

COATES, D.J.; DIXON, K.W. Current perspectives in plant conservation biology.

Aust. J. Bot., v. 55, p. 187-193, 2007.

CORREDOIRA, E. et al. Improved germination of somatic embryos and plant recovery

of European chestnut. In: Vitro Cell Dev. Biol-Plant., v. 44, p. 1-9, 2008.

DEMARCHI, G. Criopreservação de culturas embriogênicas de Araucaria

angustifolia Bert O. Kuntze. 60 f. 2003. Dissertação (Mestrado)--Universidade Federal

Santa Catarina, Santa Catarina, 2003.

DING, F. et al. Vitrification–cryopreservation, an efficient method for eliminating

Candidatus Liberobacter asiaticus, the citrus Huanglongbing pathogen, from in vitro

adult shoot tips. Plant. Cell. Rep., v. 27, p. 241-250, 2008.

DUMET, D.; BENSON, E.E. The use of physical and biochemical studies to elucidate

and reduce cryopreservation-induced damage in hydrated/desiccated plant germplasm.

In: Cryopreservation of Tropical Germoplasm. Japanese International Research

Center of Agricultural Sciences, Tsukuba, Japan/International Plant Research Institute,

Rome, Italy, 2000. p. 103-108.

DUPUIS, J.M. et al. Pharmaceutical capsules as a coating system for artificial seeds.

Bio.Tech., v. 12, p. 389, 1994.

ENGELMANN, F. et al. Cryopreservation of several tropical plant species using

encapsulation/dehydration of apices. In: Terzi, M. et al. 2000. Current development of

cryopreservation for the conservation of plant genetic resources. Cah. Agric., n. 9, p.

237-245, 1994.

______. In vitro conservation methods. In: CALLOW, J.A.; FORD-LLOYD, B.V.;

NEWBURY, H.J. (Eds). Biotechonology and Plant Genetic Resources. CAB

International, 1997. P. 119-161.

______. Plant Cryopreservation: Progress and prospects. In Vitro Cell Dev. Biol-

Plant., v.40, p. 427-433, 2004.

FISCHEROVA, L. et al. Expression of the gene encoding transcription factor PaVP1

differs in Picea abies embryogenic lines depending on their ability to develop somatic

embryos. Plant. Cell. Rep., v. 27, p. 435-441, 2008.

FLOH, E.I.S.; SANTA-CATARINA, C.; SILVEIRA, V. Marcadores bioquímicos e

moleculares para estudos da morfogênese in vitro. Rev. Bras. Hort. Orn., v. 13, p.

1992-2001, 2007.

GANAPATHI, T.R. et al. Propagation of banana through encapsulated shoot tips.

Plant. Cell. Rep., v. 11, p. 571-575, 1992.

GARELLO, G. et al. Abscisic acid-regulated responses of dormant and non-dormant

embryos of Helianthus annuus: Role of ABA-inducible proteins. Plant. Physiol.

Biochem., v. 38, n. 6, p. 473-482, 2000.

GONZALEZ-ARNAO, M.T. et al. Development and large scale application of

cryopreservation techniques for shoot and somatic embryo cultures of tropical crops.

Plant. Cell. Tiss. Organ. Cult., v. 92, p. 1-13, 2008.

GRAY, D.J. et al. Somatic embryogenesis and the technology of synthetic seed. In:

BAJAJ, Y.P.S. (Ed). Biotechnology in Agriculture and Forestry, Somatic

Embryogenesis and Synthetic Seed. Berlin, Heidelberg: Springer, 1995. v. 30, p. 127-

151.

GRAY, D.J.; STEPAN-SARKISSIAN, A. FOWLER, M.W. Biochemistry of forest tree

speciesmin culture In: BONGA, J.M. DURZAN, D.J. (Eds). Cell and Tissue culture in

Forestry. Dordrechet. Martinus Nijhoff Pu, 1987. v. 2, p. 31-60.

GUERRA, M.P.; TORRES, A.C.; TEIXEIRA, J.B. Embriogênese somática e sementes

sintéticas. In: TORRES, A.C.; CALDAS, L.S.; BUSO, J.A. (Eds.). Cultura de tecidos

e transformação genética de plantas. Brasília: Ed. Embrapa, 1999. p. 533-568. v. 2.

______. et al. Evolução, ontogênese e diversidade genética em Araucaria angustifolia.

In: BARBIERI, R.L. (Org). Evolução de Plantas Cultivadas. Pelotas: EMBRAPA,

2008. (In press).

______. et al. Somatic embryogenesis in Feijoa sellowiana: Genotype Response,

Auxinic shock and Synthetic Seeds. Rev. Bras. Fisiol. Veg., v.13, p. 117–128, 2001.

HANDA, L.; SAMPAIO, P.T.B.; QUISEN, R. Estabelecimento in vitro de explantes de

pau-rosa (Aniba rosaeodora Ducke). In: ENCONTRO LATINO-AMERICANO DE

BIOTECNOLOGIA VEGETAL, 4., 2002, Goiânia. Anais... Goiania: 2001. p. 97.

HANDA, L.; SAMPAIO, P.T.B.; QUISEN, R. Cultura in vitro de embriões e de gemas

de mudas de pau-rosa (Aniba rosaeodora Ducke). Acta Amazônica, v. 35, p. 29-33,

2005.

HODBERG, K.A.; BOZHKOV, P.V.; VON ARNOLD, S. Early selection improves

clonal performance and reduces intraclonal variation of Norway spruce plants

propagated by somatic embryogenesis. Tree Physiol., v. 23, p. 295-304, 2003.

HODBERG, K.A. et al. Critical factors affecting ex vitro performance of somatic

embryo plants of Picea abies. Scand. J. For. Res., v. 16, p. 295-304, 2001.

HOEKSTRA, F.A.; GOLOVINA, E.A. Membrane behaviour during dehydration:

implications for desiccation tolerance. Russ. J. Plant Physiol., v. 46, p. 295-306, 1999.

HÖGBERG, K.A. et al. Integration of somatic embryogenesis in a tree breeding

programe: a case study with Picea abies. Can. J. Forest Res., v. 28, p. 1536-1545,

1998.

HORNUNG, R.; DOMAS, R.; LYNCH, P.T. Cryopreservation of plumular explants of

coconut (Cocos nucifera L.) to support programmes for mass clonal propagation

trhough somatic embryogenesis. Cryo-Lett., v. 22, p. 211-220, 2001.

JAIN, S.M.; GUPTA, P.K.; NEWTON, R.J. (Eds). Somatic embryogenesis in woody

plants. Kluwer Academic Publishers: Dordrecht, 1995. 387 p. v. 1.

KHURI, S. et al. Conservation of the Cedrus libani populations in Lebanon: history,

current status and experimental application of somatic embryogenesis. Biodivers.

Conserv., v. 9, p. 1261-1273, 2000.

KIM, Y.W.; MOON, H.K. Enhancement of somatic embryogenesis and plant

regeneration in Japanese larch (Larix leptolepis). Plant Cell Tiss. Organ. Cult., v. 88,

p. 241-245, 2007.

KLIMASZEWSKA, K. et al. Accumulation pattern and identification of seed storage

proteins in zygotic embryos of Pinus strobus and in somatic embryos from different

maturation treatments. Physiol. Plant, v. 121, p. 682-690, 2004.

______; SMITH, D.R. Maturation of somatic embryos of Pinus strobus is promoted by

a high concentration of gellan gum. Physiol. Plant, v. 100, p. 949-957, 1997.

KOMAMINE, A. et al. Mechanisms of somatic embryogenesis in cell cultures.

Physiology, biochemistry and molecular biology. In Vitro Cell Dev. Biol., v. 28, p. 11-

14, 1992.

LAMBARDI, M. et al. Cryopreservation of woody species by vitrification of shoot tips

and embryogenic tissue. Acta Hortic., v. 560, p. 125-128, 2001.

LELU, M.A. et al. Somatic embyogenesis and plantlet development in Pinus silvestris

and Pinus pinaster on medium with and without growth regulators. Physiol. Plant, v.

105, p. 719-728, 1999.

LI, J.; GRABAU, E. Comparation of somatic embryogenesis and embryo conversion in

commercial soybean cultivars. Plant Cell Tiss. Org. Cult., v. 44, p. 87-89, 1996.

LI, X.Y. et al. Polyetilene glycol and maltose enhance somatic embryo maturation in

loblolly pine (Pinus taeda L.). In Vitro Cell Dev Biol-Plant, v. 34, p. 22-26, 1998.

LIPAVSKÁ, H.; KONRÁDOVA, H. Invited review: somatic embryogenesis in

conifers: the role of carbohydrate metabolism. In Vitro Cell Dev. Biol-Plant, v. 40, p.

23-30, 2004.

MALABADI, R.B.; NATARAJA, K. Cryopreservation and plant regeneration via

somatic embryogenesis using shoot apical domes of mature Pinus roxburghii Sarg.

trees. In Vitro Cell Dev. Biol-Plant, v. 42, p. 152-159, 2006.

MALABADI, R.B.; VAN STADEN, J. Storability and germination of sodium alginate

encapsulated somatic embryos derived from the vegetative shoot apices of mature Pinus

patula trees. Plant Cell Tiss Organ Cult., v. 82, p. 259-265, 2005.

MAZUR, P. Principles of cryobiology. In: FULLER, B.J.; LANE, N.; BENSON, E.E.

(Eds). Life in the Frozen State. CRC Press, 2004. p. 5-55.

MERKLE, S.A.; PARROTT, W.A.; WILLIAMS, E.G. Applications of somatic

embryogenesis and embryo cloning. In: Bhojwani, S.S. Plant Tissue Culture:

applications and limitations, developments in crops science. Elsevier: Amsterdam,

1995. p. 67–101.

______; DEAN, J.F.D. Forest biotechnology. Curr. Opin. Biotech., v. 11, p. 298-302,

2000.

______; NAIRN, C.J. Hardwood tree biotechnology. In Vitro Cell Dev-Plant, v. 41, p.

602-619, 2005.

MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and bio-assays with

tobacco tissue cultures. Physiol. Plant, v. 1, p. 437-496, 1962.

NEHRA, N.S. et al. Forest biotechnoloy: innovative methods, emerging opportunities.

In Vitro Cell Dev-Plant, v. 41, p. 701-717, 2005.

NIEMI, K. et al. Spermidine and methylglyoxal bis(guanylhydrazone) affect maturation

and endogenous polyamine content of Scots pine embryogenic cultures. J. Plant

Physiol., v. 159, p. 1155-1158, 2002.

NUNES, E.C. et al. In vitro conservation of Cedrela fissilis Vellozo (Meliaceae), a

native tree of the Brazilian Atlantic. Forest Biodivers. Conserv., v. 12, p. 837-848,

2003.

OHASHI, S.T.; ROSA, L.S.; SANTANA, J.A. Diagnóstico Florestal do pau-rosa

(Aniba rosaeodora Ducke) no Brasil. [s.l.]: Funatura/ITTO, 1995.

ONISHI, N.; MASHIKO, T.; OKAMOTO, A. Cultural system producing

encapsulatable units of sysnthetic seeds in celery. Acta Hortic., v. 319, p. 113-118,

1992.

______; SAKAMOTO, Y.; HIROSAWA, T. Synthetic seeds as an application of mass

production of somatic embryos. Plant Cell Tiss. Org. Cult., v. 39, p.137-145, 1994.

PANIS, B. Status of cryopreservation technologies in plants (crops and forest trees) In:

RUANE, J.; SONNINO, A. (Eds). The role of biotechnology in exploring and

protecting agricultural genetic resources. FAO, Roma, 2006. p. 61-78.

PATEL, A.V. et al. A novel encapsulation technique for the production of artificial

seeds. Plant Cell Rep., v. 19, p. 868-874, 2000.

PATTNAIK, S.; CHAND, P.K. Morphogenic responses of the alginate-encapsulated

axillary buds from in vitro shoot cultures of six mulberries. Plant Cell Tiss. Org. Cult.,

v. 60, p. 177-185, 2000.

PULLMAN, G.S. et al. Improving loblolly pine somatic embryo maturation:

comparison of somatic and zygotic embryo morphology, germination, and gene

expression. Plant Cell Rep., 21: 747–758. 2003b.

______ et al. Loblolly pine (Pinus taeda L.) somatic embryogenesis: maturation

improvements by metal analyses of zygotic and somatic embryos. Plant Sci., 164: 955-

969. 2003a.

______; BUCHANAN, M. Loblolly pine (Pinus taeda L.): stage-specific elemental

analyses of zygotic embryo and female gametophyte tissue. Plant Sci., 164: 943-954.

2003.

______; CHOPRA, R.; CHASE, K.M. Loblolly pine (Pinus taeda L.) somatic

embryogenesis: Improvements in embryogenic tissue initiation by supplementation of

medium with organic acids, Vitamins B12 and E. Plant Sci., v. 170, p. 648-658, 2006.

RAMAROSANDRATANA, A. et al. Effects of carbohydrate source, polyethylene

glycol and gellan gum concentration on embryonal-suspensor mass (ESM) proliferation

and maturation of maritime pine somatic embryos. In Vitro Cell Dev. Biol-Plant., v.

37, p. 29-34, 2001.

RECH-FILHO, A. Biorreatores de imersão temporária e unidades encapsuláveis

como ferramentas na consolidação de protocolos de micropropagação de

bromélias. 74 f. Dissertação (Mestrado)--Universidade Federal de Santa Catarina, Santa

Catarina, 2004.

REED, B.M.; SCHUMACHER, L.; DUMET, D. Evaluation of a modified

encapsulation–dehydration procedure incorporating sucrose pretreatments for the

cryopreservation of Ribes germplasm. In Vitro Cell Dev Biol-Plant, v. 41, p. 431-436,

2005.

REDENBAUGH, K. Application of artificial seed to tropical crops. Hort. Sci., v. 25, p.

251-255, 1990.

______ et al. Synyhetic seeds: encapsulation of asexual plant embryos. Bio. Tech., v. 4,

p. 797-801, 1986.

REIDIBOYM-TALLEUX, L. et al. Improvement of somatic embryogenesis in wild

cherry (Prunus avium). Effect of maltose and ABA supplements. Plant Cell Tiss Org

Cult., v. 55, p. 199-209, 1999.

SAKAI, A. Potentially valuable cryogenic procedures for cryopreservation of cultured

plant meristems. In: RAZDAN, M,K,; COCKING, E.C. (Eds). Conservation of Plant

Genetic Resources In Vitro. Science Publishers, Enfield, USA, 1997. v.1, p. 53-66.

SAKAMOTO, Y.; ONISHI, N.; HIROSAWA, T. Delivery systems for tissue culture by

encapsulation. In: AITKEN-CHRISTIE, J.; KOZAI, T.; SMITH, M.L. (eds).

Automation and environmental control in plant tissue culture. Boston London:

Kluwer Academics Publishers, Dordrecht, 1995. p. 215-243.

SALAJOVA, T.; SALAJ, J.; KORMUTAK, A. Iniciation of embryogenic tissues and

plantlet regeneration from somatic embryos of Pinus nigra Arn. Plant Sci., v. 145, n. 1,

p. 34-40, 1999.

SANDÓVAL-YUGAR, E.W. Elucidação dos pontos de controle da morfogênese e

otimização de protocolos regenerativos in vitro de Musa sp. Cv. Grand Naine. 115 f.

Dissertação (Mestrado)--Universidade Federal de Santa Catarina, Santa Catarina, 2002.

SANTA-CATARINA, C.; MACIEL, S.C.; PEDROTTI, E.L. Germinação in vitro e

embriogênese somática a partir de embriões imaturos de canela sassafrás (Ocotea

odorifera Mez.). Rev. Bras. Bot., v. 24, n. 4, p. 501-510, 2001.

______ et al. Polyamine and nitric oxide levels correlate with morphogenetic evolution

in somatic embryogenesis of Ocotea catharinensis. Plant Cell Tiss. Org. Cult., v. 90,

p. 93-101, 2007.

______. Sek gene homolog expression, polyamines, amino acids associated with

somatic embryogenic competence of Ocotea catharinensis Mez. (Lauraceae). Plant

Cell Tiss Cult., v. 79, p. 53-61, 2004.

SANTOS, A.L.W. et al. Somatic embryogenesis in Araucaria angustifolia. Biol. Plant.,

v. 52, p. 195-199, 2008.

SANTOS, A.L.W. et al. Somatic embryogenesis in Paraná pine (Araucaria angustifolia

(Bert.) O. Kuntze). Braz. Arch. Biol. Tech., v. 45, p. 97-106, 2002.

SANTOS, I.R.I. Criopreservação: Potencial e perspectivas para a conservação de

germoplasma vegetal. Rev. Bras. Fisiol. Veg., v. 12, p. 71-84, 2000.

SANTOS, R.P. Avaliação da diversidade genética de populações naturais de Pau-

rosa (Aniba rosaeodora Ducke) por meio de marcadores moleculares RAPD. 2004.

83 f. Dissertação (Mestrado)--Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Programa

de Pós Graduação em Ciências de Florestas Tropicais, Manaus, 2004.

SARASAN, V. et al. Conservation in vitro of threatened plants – Progress in the past

decade. In Vitro Cell Dev Biol-Plant, v. 42, p. 206-214, 2006.

SHOJI, M. et al. Influence of osmotic pressure on somatic embryo maturation in Pinus

densiflora. J. For. Res., v. 11, p. 449-453, 2006.

SILVEIRA, V. et al. Biotechnology tolls in Araucaria angustifolia conservation and

improvement: inductive factors affecting somatic embryogenesis. Crop Breeding

Appl. Biotechnol., v. 3, p. 463-470, 2002.

______. Effect of plant growth regulators on the cellular growth and levels of

intracellular protein, starch and polyamines in embryogenic suspension cultures of

Pinus taeda. Plant Cell Tiss. Org. Cult., v. 69, p. 233-24, 2004.

______. Endogenous abscisic acid and protein contents during seed development of

Araucaria angustifolia. Biol Plant, v. 52, p. 101-104, 2008.

______. Polyamine effects on the endogenous polyamine contents, nitric oxide release,

growth and differentiation of embryogenic suspension cultures of Araucaria

angustifolia (Bert) O. Ktze. Plant Sci., v. 171, p. 91-98, 2006.

SINGH, A.K.; et al. Plant regeneration from alginate-encapsulated shoot tips of

Phyllanthus amarus schum and thonn, a medicinally important plant species. In Vitro

Cell Dev. Biol-Plant, v. 42, p. 109-113, 2006.

STACEY, G.N.; LYNCH, P.T.; BENSON, E.E. Plant gene banking: agriculture,

biotechnology and conservation. Agro Food Ind. Hi-Tech, v. 10, p. 9-14, 1999.

STANDARDI, A.; PICCIONI, E. Recent perspectives on synthetic seed technology

using nonembryogenic in vitro-derived explants. Inter. J. Plant Sci., v. 159, p. 968-

978, 1998.

STASOLLA, C.; YEUNG, E.C. Recent advances in conifer somatic embryogenesis:

improving somatic embryo quality. Plant Cell Tiss Org Cult, v. 74, p. 15-35, 2003.

STEINER, N. et al. Araucaria angustifolia Biotechnology - Review. Func. Plant. Sci.

Biotec., v. 2, p. 20-28, 2008.

______ et al. Carbon Source Affects Morphogenesis and Histodifferentiation of A.

angustifolia Embryogenic Cultures. Braz. Arch. Biol. Tech., v. 48, p. 895-903, 2005.

______ et al. Polyamine effects on growth and endogenous hormones levels in

Araucaria angustifolia embryogenic cultures. Plant Cell Tiss Org Cult, v. 89, p. 55-

62, 2007.

STEINMACHER, D.A. et al. Cryopreservation of peach palm zygotic embryos. Cryo-

Lett, v. 28, p.13-22, 2007.

SVOBODOVÁ, H. et al. Somatic embryogenesis in Norway spruce: anatomical study

of embryo development and influence of polyethylene glycol on maturation process.

Plant Physiol. Biochem., v. 37, p. 209-221, 1999.

TAUTORUS, T.E.; FOWKE, L.C.; DUNSTAN, D.I. Somatic embryogenesis in

conifers. Can. J. Bot., v. 69, p. 1873-1899, 1991.

UTOMO, H.S. et al. Synthetic seed as a potential direct delivery system of mass

produced somatic embryos in the coastal marsh plant smooth cordgrass (Spartina

alterniflora). Plant Cell Tiss Org Cult, v. 92, p. 281-291, 2008.

VAHDATI, K. et al. Effect of exogenous ABA on somatic embryo maturation and

germination in Persian walnut (Juglans regia L.). Plant Cell Tiss Organ Cult, v. 93, p.

163–171, 2008.

VERPOORTE, R. et al. Plant cell biotechnology for the production of secondary

metabolites. Pure Appl. Chem., v. 66, p. 2307-2310, 1994.

VIANA, A.M.; MAZZA, M.C.; MANTELL, S.H. Plant Conservation

Biotechnology:Applications of biotechnology for the conservation and sustainable

exploitation of plants from brazilian rain forest. In: BENSON, E. (Ed). Plant

Conservation Biotechnology. Dundee: Ed. University of Abertay, 1999. p. 277-299.

______. Somatic embryogenesis in Ocotea catharinensis Mez (Lauraceae). In:

MANTELL, S.H. et al. (Eds). Recent advances in biotechnology for conservation

and management. Stockholm: International Foundation for Science, 1998. p. 244-253.

______; MANTELL, S.H. Somatic embryogenesis of Ocotea catharinensis: an

endangered tree of the mata atlântica (South Brazil). In: JAIN, S.M.; GUPTA, P.K.;

NEWTON, R.J. (Eds). Somatic embryogenesis in woody plants. Dordrecht: Kluwer

Academic Publishers, 1999. p. 5-30.

VON ARNOLD et al. Developmental pathways of somatic embryogenesis. Plant Cell

Tiss Organ Cult, v. 69, p. 233-249, 2002.

______. Propagation of Norway spruce via somatic embryogenesis. Plant Cell Tiss

Org Cult, v. 81, p. 323–329, 2005.

WETZSTEIN, H.Y. et al. Carya illinoensis (Pecan). In: BAJAJ, Y.P.S. (Ed.).

Biotechnology in Agriculture and Forestry, Berlin, Springer, v. 35, Trees IV, p. 50-

75, 1996.

WITJAKSONO, R.E.; LITZ, R.E.; PLIEGO-ALFARO, F. Somatic embryogenesis of

avocado (Persea americana Mill.) In: Jain, S.M.; Gupta, P.K.; Newton, R.J. (eds).

Somatic embryogenesis in woody plants. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht,

1999. P. 197-214.

WU, Y.J. et al. Induction and cryopreservation of embryogenic cultures from nucelli

and immature cotyledon cuts of mango (Mangifera indica L. var Zihua). Plant Cell

Rep., v. 26, p. 161-168, 2007.