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EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA EM CANA-DE-AÇÚCAR ( Saccharum spp. L.)
Cassiana de Oliveira1, Roberson Dibax2, Aurea Ferriani Portes3, João Carlos Bespalhok Filho4. 1 Acadêmica do curso de Tecnologia em Bioprocessos e Biotecnologia da Universidade Tuiuti do Paraná (Curitiba, PR); 2 Doutor em Agronomia pela Universidade Federal do Paraná, Pesquisador da Universidade Federal do Paraná (Curitiba, PR); 3 Doutora em Agronomia pela Universidade Federal do Paraná, Profª co-orientadora da Universidade Tuiuti do Paraná (Curitiba, PR); 4 Doutor em Agricultura pela Nagoya University, Prof. orientador da Universidade Federal do Paraná (Curitiba, PR). Endereço para correspondência: João Carlos Bespalhok Filho: [email protected] ___________________________________________________________________________
RESUMO: A cana-de-açúcar tem grande importância econômica já que pode ser usada como
matéria prima para a fabricação de rapadura, melado, aguardente, açúcar e etanol. Devido este
fator, cada vez mais o melhoramento genético vem sendo estudado, para tanto é preciso de
protocolos eficientes para sua multiplicação in vitro. O objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito
da auxina 2,4-D sobre a indução de calos embriogênicos para a variedade RB855453. Além disso,
avaliar diferentes concentrações de 2,4-D na manutenção dos calos embriogênicos e verificar se
houve formação de brotações com a citocinina BAP para a variedade RB855156. As culturas
foram mantidas em sala de crescimento com temperatura de 25 ± 2 °C. Os resultados foram
satisfatórios e revelaram que todos os tratamentos com 2,4-D têm a capacidade de formar calos
embriogênicos. Observou-se que em 40 dias de cultivo estes calos embriogênicos ainda
apresentam capacidade de formar brotações e todos os tratamentos utilizados formaram brotações.
Quanto ao aumento da quantidade de massa embriogênica, percebeu-se que não há necessidade de
grande quantidade de auxina na manutenção dos calos embriogênicos, já que todos os tratamentos
tiveram, em média, o mesmo crescimento.
PALAVRAS-CHAVE: fitorreguladores, 2,4-D, BAP, embriogênese indireta.
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ABSTRACT : The sugarcane has great economic importance since it can be used as raw material
for the manufacture of brown sugar, molasses, brandy, sugar and ethanol. Because of this factor,
more breeding is being studied, for both protocols is necessary for its efficient in vitro
multiplication. The aim of this study was to evaluate the effect of 2,4-D on embryogenic callus
induction for variety RB855453. Moreover, to evaluate different concentrations of 2,4-D in the
maintenance of embryogenic callus and see if there shoot formation with BAP for variety
RB855156. Cultures were maintained in a growth chamber with a temperature of 25 ± 2 ° C. The
results were satisfactory and showed that all treatments with 2,4-D have the capacity to form
embryogenic callus. It was observed that in 40 days of these embryogenic calli still have the
ability to form shoots and all treatments formed shoots. As for the increased amount of
embryogenic mass, it was noted that there is need for large amounts of auxin in the maintenance
of embryogenic callus, since all treatments had, on average, the same growth
KEYWORDS: phytoregulators, 2,4-D, BAP, indirect embryogenesis.
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INTRODUÇÃO A cana-de-açúcar (Saccharum spp. L.) é uma gramínea perene de clima tropical que
tem um aspecto importante, tanto social quanto econômico no Brasil, já que é utilizada para a
produção de açúcar, álcool, alimentos, entre outros produtos (SILVA, et al., 2009). Em
decorrência disso, sua multiplicação deve ser rápida e livre de doenças, o que ocorre na
micropropagação.
Um dos caminhos do cultivo in vitro é a embriogênese somática indireta, que envolve
a formação de embriões a partir de tecidos somáticos (RAEMARKERS et al., 1995). As
células somáticas não são naturalmente embriogênicas, o que torna necessário uma fase de
indução para que essas células adquiram competência embriogênica (NAMASIVAYAM,
2007). Esta via, portanto, requer a desdiferenciação das células, ou seja, o desenvolvimento de
calos que vão originar células embriogênicas determinadas com a capacidade de totipotência.
Diversos fatores estão envolvidos neste processo como a utilização de reguladores de
crescimento, o efeito do genótipo, o tipo de explante, os meios de cultura e as condições de
cultivo (SILVA et al., 2009).
As auxinas são as principais reguladoras de crescimento utilizadas para a indução de
calos embriogênicos. A auxina natural ácido indolacético (AIA) é rapidamente oxidada in
vitro, por isso não é adequada para meios de cultura (REIS et al., 2007). Para substituir a AIA
é comumente utilizada a auxina sintética 2,4 diclorofenoxiacético (2,4-D). Depois que os
calos já adquiriram a capacidade da totipotência, é necessário a utilização de outros
reguladores no meio de cultura para que estas células se diferenciem em brotações. Para
promover essas brotações são necessárias as citocininas, que são hormônios que estimulam a
divisão celular, regulando o crescimento do vegetal. Dentre as citocininas, o 6-
bencilaminopurina (BAP) tem sido muito eficaz para promover a multiplicação em diversas
espécies (ROGALSKI et al., 2003).
No entanto, após muito tempo de subcultivos no meio de cultura com 2,4-D os calos
embriogênicos perdem a capacidade de formarem brotações. Neste sentido, este estudo
procura estabelecer o tempo em média que os calos embriogênicos continuam com essa
capacidade e a concentração adequada de 2,4-D para a formação de calos embriogênicos das
variedades RB855453 e RB855156.
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MATERIAL E MÉTODOS
O trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Micropropagação de Plantas do Setor de
Ciências Agrárias do Departamento de Fitotecnia e Fitossanitarismo da Universidade Federal
do Paraná, Curitiba, Brasil.
Todas as culturas in vitro respectivas a cada experimento foram mantidas em sala de
crescimento, sob luz fluorescente branca fria com densidade de fluxo fotossintético de 40
µmol.m-2.s-1, fotoperíodo de 16 h e temperatura de 25 ± 2°C. As culturas foram realizadas
em placas de Petri de 10 cm de diâmetro e 2 cm de altura, contendo 30 mL de meio de cultura
e vedadas com filme PVC, ou em frascos de vidro de 6 cm de diâmetro e 9 cm de altura,
contendo 40 mL de meio de cultura cada um e vedados com tampa de polipropileno rígido.
Todos os meios de cultura tiveram o pH ajustado em 5,7 e foram autoclavados durante 20 min
a 120°C.
O meio de cultura utilizado nestes experimentos foi o MS (MURASHIGE e SKOOG,
1962) modificado para cana-de-açúcar (MSC), suplementado com arginina, cisteína, ácido
cítrico e caseína hidrolisada (anexo 01), sendo diferentes apenas as concentrações dos
fitorreguladores usados.
INDUÇÃO DA EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA
Foram utilizadas folhas imaturas (cilindros de aproximadamente 2 x 10 cm) de cana-de-
açúcar da variedade RB855453. Os palmitos, contendo os meristemas apicais, foram levados
à câmara de fluxo laminar onde foi realizado a desinfecção por 1min em etanol 70% (v/v), em
seguida foram enxaguados com água estéril três vezes. Logo depois, ficaram por 20 min em
hipoclorito de sódio 2% (v/v) e lavados, novamente, em água estéril por três vezes.
Em uma placa de Petri, foram retiradas as folhas mais externas dos palmitos, com o
auxilio de um bisturi. Após este procedimento, foram feitos cortes transversais de
aproximadamente 3-5 mm nos palmitos para obtenção dos explantes. Em seguida, os
explantes foram embebidos em cisteína 50 mg.L-1 autoclavada a fim de minimizar a oxidação.
Os explantes foram colocados em meio de cultura com as seguintes concentrações de
2,4-D: 1; 3; 9 e 16 mg.L-1. Sendo, portanto, quatro tratamentos com dez repetições e com
cinco explantes por repetição. Os explantes foram incubados em sala de crescimento com
temperatura controlada descrita acima, porém, no escuro para diminuir a oxidação, durante 60
dias.
Nesta etapa, avaliou-se a formação e as características dos calos, com vista ao processo
embriogênico.
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MULTIPLICAÇÃO DOS CALOS
Para a multiplicação dos calos embriogênicos, foram comparadas as concentrações 0,
1, 2 e 3 mg.L-1 do mesmo fitorregulador (2,4-D), no entanto, a variedade usada foi a
RB855156. Foram feitas cinco repetições por tratamento, com dez explantes por placa. Os
calos utilizados nesta etapa já foram subcultivados por duas vezes em meio MSC com as
suplementações descritas e com 3 mg.L-1 de 2,4-D. Cada explante consistiu em um
aglomerado de calos de aproximadamente 4mm² e com peso aproximado de 13mg, e foram
repicados para o meio MSC já descrito com as concentrações de 2,4-D descritas.
Após vinte dias avaliou-se a expansão em milímetros, peso e aspectos morfológicos
dos calos.
INDUÇÃO DE BROTAÇÕES
Para induzir as brotações foi usado o meio MS adicionado o fitorregulador BAP na
concentração de 0,5 mg.L-1. Cada explante constituiu em um aglomerado de calos de
aproximadamente 4mm² e com peso aproximado de 13mg da variedade RB855156. As
repetições foram feitas de acordo com o tratamento usado na multiplicação dos calos, ou seja,
cada tratamento com 2,4-D teve cinco repetições com dez aglomerados de calos por repetição.
Este tratamento ficou dez dias no escuro e dez dias sob iluminação na sala de crescimento.
Após vinte dias avaliou-se a formação de brotações.
DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
O delineamento estatístico utilizado foi inteiramente casualizado. Para comparação de
médias, os dados foram submetidos ao Testes de Tukey a 5% de probabilidade, pelo programa
estatístico Sisvar®.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A formação de estruturas globulares semelhantes a embriões somáticos (figura 01) foi
visualizada em todos os tratamentos. Percebeu-se que todas as concentrações do 2,4-D não
obtiveram diferença significativa ao avaliar a formação de calos embriogênicos pelo teste de
Tukey ao nível de 5% de probabilidade. Este resultado indica que as quantidades comparadas
deste fitorregulador para a formação de calos embriogênicos são suficientes e todas tiveram
resposta positiva na formação de calos embriogênicos da variedade RB855453.
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Figura 01. Calos embriogênicos de cana-de-açúcar. (A) A seta aponta para a parte indiferenciada da
massa. (B) A seta aponta para estruturas globulares semelhantes a embriões somáticos. Barra = 0,5
mm
Quanto à oxidação dos explantes, o tratamento contendo 9 mg.L-1 proporcionou a
maior taxa de oxidação (44%), no entanto quando aplicado o teste de Tukey percebeu-se que
os tratamentos não tiveram diferença significativa, como pode ser observado na figura 02.
Figura 02. Porcentagem da formação de calos embriogênicos e de oxidação dos explantes de cana-de-
açúcar da variedade RB855453 de acordo com a concentração da auxina 2,4-D. As médias seguidas de
letras iguais não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
Na primeira avaliação da multiplicação dos calos, após vinte dias, não foi observado
nenhuma regeneração e não houve aumento da massa embriogênica. Depois desta avaliação,
repicou-se de novo para novos meios de cultura com as mesmas quantidades de reguladores e
após vinte dias foi feita nova avaliação.
Já na segunda avaliação, ao pesar cada explante de todos os tratamentos, observou-se
que não houve diferença significativa entre os tratamentos 1, 2 e 3 mg.L-1 de 2,4-D, sendo as
porcentagens encontradas de, respectivamente, 99 %, 107 % e 97 %. No entanto, notou-se que
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também no tratamento com 0 mg.L-1 as massas embriogênicas tiveram um pequeno aumento
de tamanho comparado aos outros tratamentos, de 78%. Percebeu-se que todos os tratamentos
tiveram formação de embriões, até mesmo no tratamento controle. Esta formação de embriões
no tratamento controle pode ser explicado pela ação residual da auxina presente no meio de
cultura anterior. Contudo, Mesquita em 1999, também constatou que houve a formação de
calos em folhas de lechieira (Litchi chinensis) quando não houve suplementação de
reguladores de crescimento ao meio de cultura. Todos os explantes do tratamento sem o 2,4-D
apresentaram oxidação, por liberarem compostos fenólicos nas células danificadas com o
corte.
Ho e Vasil (1983), ao estudarem a formação de calos embriogênicos no clone 68-1067
de cana-de-açúcar, obtiveram resultados semelhantes aos encontrados neste estudo, onde
todos os tratamentos com a auxina tiveram formação de calos. Em 1995, Raemakers et al.
relataram que em monocotiledôneas, como a cana-de-açúcar, a embriogênese primária é
exclusivamente induzida em meio contendo auxinas, o que se comprovou neste estudo.
De acordo com Grattapaglia e Machado (1990), as auxinas como o 2,4-D são
essenciais para estimular a formação de calos, mesmo em baixas concentrações. Isto também
pode ser observado neste experimento, pois os três tratamentos com presença da auxina
tiveram formação de embriões.
Ao verificar a presença de brotações nestes tratamentos, percebeu-se que somente no
tratamento com 0 mg.L-1 de 2,4-D houve presença de pequenas brotações, o que comprova
que esta auxina não desempenha o papel de formar brotações e sim de formar calos
embriogênicos. O resultado destes tratamentos pode ser visto na figura 03, onde percebe-se
que no tratamento com 0 mg.L-1 de 2,4-D não houve formação de massa embriogênica e sim,
de pequenas brotações, enquanto que o tratamento com 3 mg.L-1 foi o que apresentou maior
formação de embriões e maior quantidade de massa.
Figura 03. Formação de calos embriogênicos e brotações da cana-de-açúcar, sob diferentes
concentrações de 2,4-D. Barra = 1 cm
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De acordo com Silveira et al., em 2004, a presença de reguladores de crescimento,
como o 2,4-D, no meio de cultura induz a multiplicação de células, o que pode ser
comprovado neste estudo já que houve aumento da massa embriogênica na presença desta
auxina.
Com a avaliação da regeneração, foi observado que todos os tratamentos apresentaram
mais de 80% de formação de brotações, enquanto que no tratamento com 0 mg.L-1 da auxina
houve apenas 4 % de brotação, como pode ser observado na figura 04.
Figura 04. Porcentagem de regeneração e de oxidação dos explantes de cana-de-açúcar de acordo com
a concentração da auxina 2,4-D. As médias seguidas de letras iguais não diferem entre si pelo teste de
Tukey a 5% de probabilidade.
O tratamento que veio do meio com 0 mg.L-1 de 2,4-D apresentou maior taxa de
oxidação. Watt e colabores (2009), depois de doze semanas de cultivo de calos embriogênicos
de cana-de-açúcar do genótipo 88H0019, estes apresentaram aumento do número de
embriões, provavelmente devido a exposição prolongada ao 2,4-D. Este resultado mostra que,
assim como neste experimento, após vários subcultivos os calos ainda apresentaram
capacidade embriogênica, ou seja, podem formar brotações.
Cidade et al. (2006) perceberam que após o terceiro mês de cultivo, na presença de
2,4-D, houve perda significativa da capacidade regenerativa dos calos para a variedade
RB739735. Este resultado mostra a necessidade de continuar este estudo, para verificar por
quanto tempo ainda a variedade RB855156 continua com sua capacidade regenerativa. Cidade
e colaboradores (2006) relatam ainda que estes resultados restringem a utilização de calos da
variedade RB739735 como tecidos-alvo para transformação genética aos três primeiros meses
de subcultivo, de forma que a baixa eficiência de regeneração, não comprometa a obtenção de
plantas a partir de células transformadas.
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CONCLUSÃO
A partir dos resultados de indução de embriogênese somática indireta pode-se concluir
que:
• Todos os tratamentos analisados com a auxina 2,4-D têm a capacidade de formar
calos embriogênicos para a variedade RB855453 de cana-de-açúcar.
• Após quatro subcultivos os calos embriogênicos ainda formavam brotações e todas as
quantidades comparadas tiveram a mesma taxa de formação de brotações.
• Não é necessária uma maior quantidade de auxina do que as testadas neste trabalho na
manutenção de calos embriogênicos da variedade RB855156, já que todos os tratamentos
tiveram, em média, a mesma quantidade de crescimento.
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Anexo 01. COMPOSIÇÃO DO MEIO DE CULTURA MSC (MURASHIGE e SKOOG, 1962) MODIFICADO PARA CANA-DE-AÇÚCAR
Componentes MS Subst. Inorgânicas (mg L-1)
NH4 NO3 1650 KNO3 1900 H3 BO3 6,2 KH2PO4 170
KI 0,83 Na2MoO4. 2 H2O 0,25
CoCl2. 6 H2O 0,025 CaCl2. 2 H2O 440
Mg SO4. 7 H2O 370 Mn SO4. H2O 16,90 ZnSO4. 7 H2O 8,6 CuSO4. 5 H2O 0,025 FeSO4. 7 H2O 27,80
Na2EDTA 37,30 K2SO4 KCl
(NH4)2 SO4 Subst. orgânicas Arginina (mg.L-1) 50
Ác. Nicotínico (mg.L-1) 0,5 Ác. Cítrico (mg.L-1) 0,15 Piridoxina (mg.L-1) 0,5
Glicina (mg.L-1) 2 Tiamina (mg.L-1) 1
Mio-inositol (mg.L-1) 100 Cisteína (mg.L-1) 50
Caseína Hidrolizada (mg.L-1) 500 Agar (g.L-1) 6
Sacarose (g.L-1) 30 pH 5,8