目次

第１章 要旨 ............................................... 1

第２章 Abstract ............................................ 2

第３章 序論 ............................................... 3

第１節 背景 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

第１項 おから . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

第２項 糖アルコール . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

第３項 キシリトール . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

第４項 キシリトールの製造 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

第５項 発酵生産の利点 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

第２節 目的 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

第４章 本論 .............................................. 11

第１節 実験内容 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

第１項 HPLCの展開 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

第２項 溶媒の検討 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

第３項 キシリトールを含む食品の分析 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

第４項 培地組成の検討 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

第５項 キシリトール生産菌の検索 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

第６項 生産性の検討 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

第７項 検鏡観察 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

第８項 溶存酸素の検討 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

第９項 キシリトールの精製 (1) ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

i

第１０項 キシリトールの精製 (2) ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

第１１項 ジャーファーメンター培養 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

第１２項 菌体外酵素反応 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

第１３項 菌体内酵素反応 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

第１４項 結晶の定性分析 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

第２節 結果と考察 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

第１項 溶媒の検討 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

第２項 キシリトールを含む食品の分析 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

第３項 培地組成の検討 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

第４項 キシリトール生産菌の検索 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

第５項 生産性の検討 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

第６項 検鏡観察 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

第７項 溶存酸素の検討 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

第８項 キシリトールの精製 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

第９項 ジャーファーメンター培養 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

第１０項 菌体外酵素反応 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

第１１項 菌体内酵素反応 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

第１２項 結晶の定性分析 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

第５章 参考文献 .......................................... 44

第６章 謝辞 .............................................. 46

ii

第１章 要旨 糖アルコールは糖鎖の長さで違いがある第一世代と、糖そのものが違

う第二世代がある。キシリトールは後者に属し、ブドウ糖や砂糖と同程

度の甘味、保湿性、吸熱性、冷感性、非う触性などという性質がある。

近年ではその甘味性からガムや飴などの甘味代替品として多く使用さ

れているほか、保湿性の高さから化粧品や入浴剤、更には吸熱作用があ

ることから着心地のさわやかなシャツやストッキングなどにも利用さ

れている。

豆乳と比べて食物繊維やカルシウムを豊富に含んでおり、産業廃棄物

として年間約 80 万 t 処分されているおからを培地とし、微生物により

キシリトールを発酵生産することを検討した。5%キシロースに、おから

を 20%加えた培地 (おから培地 )に乳酸菌や乾燥酵母などの各種の菌を接

種 し 、 培 養 (30 ℃ ・ 148 時 間 ) し た 。 そ の 結 果 、 産 膜 酵 母

(M2-22,M2-42,M2-45)のみがキシリトールを生産していた。キシリトー

ルは前処理を行った後、高速液体クロマトグラフィー（ HPLC）ODS カ

ラ ム , 展 開 溶 媒 酢 酸 エ チ ル ： エ タ ノ ー ル ： ア セ ト ニ ト リ ル ： 水 ＝

30:30:23:17 で分析した。

次に 3 種類の産膜酵母のみを培養した結果、M2-45 が も生産性が高

いことがわかった。そこで大量培養するため、M2-45 を使用し、ジャー

ファーメンターを用いて培養 (30℃・200rpm・0.83vvm・504 時間 )した。

培養途中、培地内のキシロース濃度が 0%近くまで落ちたので定期的に

キシロース水を培地全体のキシロース濃度を 5%になるように添加した。

キシリトール濃度が 5.23%に達した培養液から精製を試みた。培養液

は、クロロホルムとジエチルエーテルで除淡白、脱脂後、この濾液をエ

バポレーターで濃縮した。その濃縮液に 5 倍量のエタノールを加え 4℃

で静置させ結晶ができるのを待った。結晶が確認できたら吸引濾過し、

結晶と濾液に分離した。そしてこの結晶とキシリトール標準物質を赤外

吸収スペクトルで比較確認した結果指紋領域が一致していた。よって今

回精製した結晶はキシリトールと証明することができた。

Page - 1

第２章 Abstract The sugar alcohol can be categorize in to two generation groups the

first generation is differentiated depend on the length of the sugar

chain. The second generation is differentiated depend on the

structure up sugar. The xylitol belongs to the latter. The xylitol has

the same degree of sweetness as glucose and sugar and the characters,

such as the cooling senses and non-tooth caries. The ”okara” tofu

clees is disposed of as industrial waste 800,000t a year. So it was

examined to produce xylitols by the microorganism fermenting. The

bacterium was inoculated to the medium which was prepared by

adding Xyrlose(5%w/v) and “okara” tofu refuse(20%w/v) into the

water. It was cultured(30℃･148 hour).As a result, production fi lm

yeast (M2-22, M2-42,M2-45) produced xylitols. The xylitol was

analyzed by HPLC(ODS column・ development solvent ethyl acetate:

ethanol: methyl cyanide: water = 30:30:23:17). M2-45 was cultured at

large quantitiy. By using the jar-fermenter (30℃･200rpm･0.83v.v.m･

504 hour). When the level of the xylitol had become 5.23%, the

crystallization was carried out. The culture solution was treated to

remore the protein and fat by using chloroform and diethyl ether, and,

it was concentrated. The ethanol at f ive times the volume of a

concentrated l iquid was added. The precipitation was washed,

concentrated with the ethanol, to re crystallize. This crystal and the

xylitol were compared by using the infrared absorption spectrum.

Page - 2

第３章 序論

第１節 背景

第１項 おから

おからは豆腐製造における副産物であり、全国豆腐油揚商工組合連合

会（東京都台東区）によると、豆腐製造業者が使う大豆は 1 年で 50 万

トン。水分を含んだおからは 70 万トンもできる。現在ではその多く (7・

8 割 )が産業廃棄物として廃棄されている。しかし、豆乳と比べて、食物

繊維やカルシウムを豊富に含んでおり、タンパク質や炭水化物、カリウ

ムにも富んだ食材として、健康食品の中でも大いに注目を集めている。

おからの食品成分についてまとめた。 (Table 1)

特に優れているのが食物繊維の量である。100g 中 11.5g は、ごぼうの

約 2 倍に当たる。おからの食物繊維であるセルロースは不溶性である。

このセルロースは腸のぜん動運動を促すことで便秘の解消にもなり、腸

内の残留物を掃除して大腸ガンの予防にもつながる。さらにおからには、

大豆のカルシウムが多く残っており、タンパク質についても、ゆで大豆

の約 40％が残っている。また炭水化物やカリウムもしっかり含んでおり、

この炭水化物もまた、腸内の健康維持に大きく貢献している。大豆の炭

水化物に含まれる豊富なオリゴ糖は胃で消化されずに腸に届き、腸内の

善玉菌の栄養源となる。

おからは、女性ホルモン (エストロゲン )に似た働きをするイソフラボ

ンを多く含み、更年期障害、骨粗鬆症、乳がんなどに効果があるといわ

れており、栄養だけでなく、優れた健康機能をもつ食材である。

大豆そのままでは栄養分を消化吸収しにくいため、おから、豆腐、納

豆、味噌などに加工されるが、ビタミンＡとＣ、含硫アミノ酸が不足し

ているので、野菜やご飯などの足りない栄養素を含んでいるものと一緒

に食べると良いと言われている。

Page - 3

Table 1 おからの栄養成分

エネルギー 111 kcal 89 kcalたんぱく質 6.1 g 4.8 g脂質 3.6 g 3.6 g炭水化物 13.8 g 9.7 gナトリウム 5 mg 4 mgカリウム 350 mg 230 mgカルシウム 81 mg 100 mgマグネシウム 40 mg 37 mgリン 99 mg 65 mg鉄 1.3 mg 1.2 m亜鉛 0.6 mg 0.6 mg銅 0.14 mg 0.17 mgビタミンE 3.7 mg 3.5 mgビタミンK 8 μg 6 μgビタミンB1 0.11 mg 0.11 mgビタミンB2 0.03 mg 0.04 mg葉酸 14 μg 12 μgコレステロール (0) (0)食物繊維 11.5 g 9.7 g（五訂増補食品成分表2007より）

新製法 旧来製法

g

第２項 糖アルコール

糖アルコールは甘いだけではなく、食品加工面、生理機能面で優れた

点がある。

体内で吸収されにくく低カロリー素材として使用されている。食品の

日持ちをよくしたり水分を保ったり、着色を抑えるための食品の品質改

良に幅広く利用されている。他にも、化粧品、医薬品、病者用などにも

利用されている。

糖アルコールは、一度に多量に摂取すると一時的にお腹がゆるくなっ

てしまうことがある。これは、消化・吸収されなかった糖アルコールは

大腸まで到達し、大腸内の浸透圧が上昇するためだと考えられている。

各糖アルコールの 1 回あたりの 大無作用量を (Table 2 参照 )

また、糖アルコールは大きく第一世代に第二世代に区分できる。(Fig.1

参照 )

第一世代は糖組成によって、甘味度、粘度などの特性が決定され食品

分野で幅広く利用されている。構成は、糖の鎖の長さの違いで特性が変

化する。 (Fig.2 参照 )

第二世代はノンカロリーで吸湿性が低く、第二世代は構成糖自体が異

Page - 4

なるため、それぞれの糖アルコールには特長的な機能があり、使用用途

が明確である。 (Fig.3 参照 )

Table 2 各糖アルコールの 1 回あたりの 大無作用量 (固形分 g/体重 1kg)

糖質 男性 女性

ソ ル ビト ー ル 0.15 0.3

エリスリトール 0.66 0.8

マ ル チト ー ル 0.3 0.3

キ シ リト ー ル 0.3 0.3

ラ ク チト ー ル － 0.37

第一世代 糖鎖の長さの違い

+

単糖 単糖+二糖 二糖 二～四糖 五糖以上

第二世代 糖そのものの違い

エリスリトール キシリトール マルチトール マンニトール ラクチトール

第一世代 糖鎖の長さの違い

+

単糖 単糖+二糖 二糖 二～四糖 五糖以上

第一世代 糖鎖の長さの違い

++

単糖 単糖+二糖 二糖 二～四糖 五糖以上

第二世代 糖そのものの違い

エリスリトール キシリトール マルチトール マンニトール ラクチトール

第二世代 糖そのものの違い

エリスリトール キシリトール マルチトール マンニトール ラクチトール

Fig. 1 第一世代と第二世代との違い

Page - 5

浸透性

保湿性

日持ち

甘味の立ち・キレ

糖組成

強い

粘度付与

照り・艶出し

皮膜

ボディ感

弱い

高糖化の方が効果が高い 低糖化の方が効果が高い

単糖 単糖+二糖 二糖 二～四糖 五糖以上

+

ソルビトール マルチトールシラップ

高糖化還元水飴 中糖化還元水飴 低糖化還元水飴

甘さ

浸透性

保湿性

日持ち

甘味の立ち・キレ

糖組成

強い

粘度付与

照り・艶出し

皮膜

ボディ感

弱い

高糖化の方が効果が高い 低糖化の方が効果が高い高糖化の方が効果が高い 低糖化の方が効果が高い

単糖 単糖+二糖 二糖 二～四糖 五糖以上

+++

ソルビトール マルチトールシラップ

高糖化還元水飴 中糖化還元水飴 低糖化還元水飴

甘さ

Fig. 2 第一世代糖アルコールの特徴

エリスリトール

キシリトール

ラクチトール

マンニトール

マルチトール

高い知名度虫歯にならない

カロリー0冷涼感

低甘味あっさり甘味質

良好な甘味質低カロリー

低吸湿性医薬用途

エリスリトール

キシリトール

ラクチトール

マンニトール

マルチトール

エリスリトール

キシリトール

ラクチトール

エリスリトールエリスリトール

キシリトール

ラクチトール

キシリトール

ラクチトール

マンニトール

マルチトール

マンニトール

マルチトール

高い知名度虫歯にならない

カロリー0冷涼感

低甘味あっさり甘味質

良好な甘味質低カロリー

低吸湿性医薬用途

Fig. 3 第二世代糖アルコールの特徴

Page - 6

第３項 キシリトール

キシリトールはブドウ糖や砂糖と同程度の甘味を呈する。また溶ける

ときに熱を吸収するため、独特の清涼感がある。さらに、熱や酸に強く

胃で吸収されにくいため、腸まで届いてビフィズス菌のエサとなり、大

腸菌やウェルシュ菌といった悪玉菌の増殖を抑える。

キシリトールは、キシロースのアルデヒド基をメチルアルコール基

（ -CH2OH）に変換した物質で、糖アルコールに属す。

キシロースは五炭糖（炭素原子 5 個の直鎖を持つ糖）の一種で、アル

デヒド基（ CHO）を持ち、高濃度ではタンパク質などと結合する。糖ア

ルコールは高濃度でもタンパク質などと結合しない。

ブドウ糖、果糖、ガラクトースなどの他の単糖の糖アルコールは低い

甘味しか呈さない。これが、糖アルコール中で、キシリトールが特に重

宝される理由である。

キシリトールは天然に広く存在し、多くの野菜や果物にも含まれてお

り、人体にも微量存在する。

代表的な野菜や果物の可食部 100 g 当たりのキシリトール含量を調

査したところ、イチゴ 362 mg、カリフラワー 360 mg、ラズベリー

268mg、チコリー 258mg、ナス 180mg、レタス 131 mg、ホウレン

ソウ 107 mg であった (Table 3)。

果物や野菜など、特に果汁や野菜汁を多量に摂取すると、尿中に多量

のキシリトールに加えて、微量のキシロースやアラビノース (五単糖の

一種で、アルデヒド基を持つ )が排泄される (食餌性ペントース尿症 )が、

これは病気ではない。

近年ではその甘味性からガムや飴などの甘味代替品として多く使用

されているほか、保湿性の高さから化粧品や入浴剤、更には吸熱作用が

あることから着心地のさわやかなシャツやストッキングなどにも利用

されている。

Page - 7

Table 3 キシリトールを含む食品

野 菜 ・果 物 名 含 有 量 (m g/ 1 0 0 g )

イ チ ゴ 36 2

カ リ フ ラ ワ ー 36 0

ラ ズ ベ リ ー 26 8

チ コ リ ー 25 8

ナ ス 18 0

レ タ ス 13 1

ホ ウ レ ン ソ ウ 10 7

可 食 部 10 0 g (乾 燥 重 量 )あ た り日 本 フ ィン ラ ン ドむ し 歯 予 防 研 究 会

第４項 キシリトールの製造

現在、キシリトールの工業生産は化学的還元により水素を添加する次

のような工程で行われている。

パルプの製造工程で出る廃液に 20～ 30％ 含まれているキシランと呼

ばれる多糖類 (多数のキシロースの直鎖状結合物 )をキシロースへ加水分

解。生じたキシロースに水素添加し、キシリトールが生産されている。

化学的還元による方法は環境負荷が高いことが問題となっており、これ

をより環境への負荷の少ない方法で生産するため、微生物による発酵生

産ができないかと考えた。

第５項 発酵生産の利点

微生物醗酵法は、細胞内の酵素を触媒としてキシリトールを精製する

もので、製造工程は常温常圧下で行われ、エネルギー消費も小さく、設

備も簡単である等の利点がある。

キシリトールは機能性食品添加物として重要であり、生物質を原料と

してキシリトールを精製するという点で、資源の再利用や循環経済の発

展に重要な意義がある

Page - 8

第２節 目的

代表的な糖アルコールのうち、有用性という観点から、カロリーに対

する甘味の比率が高いエリスリトール、マルチトール、キシリトールに

注目した。この比率が高ければ、同じカロリーを摂取しても、より甘味

を強く感じることになる。これらの糖アルコールの中で も比率が高い

エリスリトールは微生物発酵法により作られているため環境負荷が低

く、製法に問題は無いと判断して今回の研究では除外し、これの次に甘

みが強く、環境負荷の高い水素添加により作られているマルチトールと

キシリトールに注目した。この二つはカロリーと甘味の比が同程度であ

り、より一般的で広く存在するキシリトールを選択した。

微生物醗酵法は、細胞内の酵素を触媒としてキシリトールを精製する

もので、製造工程は常温常圧下で行われ、エネルギー消費も小さく、設

備も簡単である等の利点がある。

また、現在おからは産業廃棄物として年間 70~80 万トン廃棄されてい

ると言われている。おからは豆腐の副産物であるが栄養豊富で食品とし

ての価値は高く、非常に有用な資源であるとともに、培地としての利用

が可能であると考えられる。

上記のように、本研究により機能性食品添加物として重要なキシリト

ールの生産過程において、環境負荷やコストを低減し、さらに廃棄物と

して処理されるおからを原料としてキシリトールを生産するという点

で、資源の有効利用として重要な意義があると考え、本研究ではおから

を 培 地 に 使 用 し て キ シ リ ト ー ル を 発 酵 生 産 す る こ と を 目 的 と し た 。

(Fig.4 参照 )

Page - 9

キシリトール

廃棄

有効利用

おからの有効利用

キシリトール発酵生産

おから

Fig. 4 背景と目的

Page - 10

第４章 本論 第１節 実験内容

第１項 HPLCの展開

試薬

メタノール

エタノール

酢酸エチル

アセトニトリル

超純水

50v/v％エタノール

使用機器

超音波発振機： ULTRASONIC CLEANER BM599

本多電子株式会社

HPLC

NH2P-50 4E 4.6mm

示差屈折率検出器

褐色ビン

メンブレンフィルター (0.45μ m)

濾紙 (No.5B)

50ml メスフラスコ

1ml シリンジ

カラムの交換

始めにメタノール、エタノールを超音波発振機により脱気 (20 分間 )し

た。脱気済みのメタノールを移動相に設置し、 HPLC の電源をつけ、ポ

ンプを動かし、ドレンバルブを開け、メタノールをパージ (10ml/1 分、1

分間 )した。パージ後、ポンプを停止させ、カラムの出口側からはずした。

出口側に栓をし、入り口側もはずした。ポンプを動かしていない状態で

移動相をメタノールからエタノールに変換した。ポンプの中からカラム

の入り口までのメタノールがエタノールになるようにエタノールを流

した (1ml/1 分、約 10 分間 )。エタノールに置換されたら RI カラムを入

り口側からつけ、ポンプを動かし、出口側から流液が出てきたらポンプ

を止め、出口側も検出器に接続した。

Page - 11

移動相の調製

酢酸エチル：エタノール：アセトニトリル：超純水＝ 30： 30： 23： 17

の比率で調製し、それを褐色ビンに移し攪拌後、20 分間超音波処理し脱

気を行った。これを HPLC 用移動相とした。

移動相の交換

ポンプが停止していることを確認し、エタノールから糖アルコール検

出用の移動相 (脱気済み )に交換した。交換したらドレンバルブを開け、

ポンプのスイッチを入れ、パージ (1ml/1 分、 1 分間 )した。

検出機の安定化

検出機を安定化させるために検出機のパージを 20 分間した。この間

に 10 秒間ごとにパージのオン、オフを数回繰り返し検出機内の空気を

抜いた。パージを解除しゼロ合わせをした。感度が安定しない場合はこ

の操作を繰り返した。

出力機の設定

年、月日、時間、 ATT、チャートスピードを設定した。次にゼロ合わ

せを行いテストランし、ノイズの確認をした。

試料の前処理

50ml ビーカーに試料を 0.5～ 5.0g 秤量した。約 30ml の 50v/v％エタ

ノールを添加し、超音波抽出 (30 分間 )を行った。 (液性が酸性の場合は

10w/v％ NaOH で中和した )50％エタノールで 50ml にメスアップした。

(不要物がある場合は No.5B の濾紙で濾過した )メンブレンフィルターで

濾過し、 HPLC 溶液とした。

糖アルコールの測定

1ml シリンジに HPLC 用の針を取り付け、シリンジの中をエタノール

で洗浄してから、試料で共洗いをして、試料を 20μ l 以上とり、 20μ l

ループにすべて注入した。注入後速やかにロードからインジェクトに切

り替え、試料を流した。インジェクトのままだと移動相が漏れ出してき

たため、20 秒間インジェクトし試料をすべて流してからロードに戻した。

45 分間流しすべてピークを出してベースラインを 5 分間保持したら測

Page - 12

定を停止した。

カラムの洗浄

ポンプを停止させてから、移動相をエタノールに置換した。ドレンバ

ルブを開け、ポンプのスイッチを入れ、パージ (1ml/1 分、 1 分間 )した。

ポンプを停止し、ドレンバルブを閉じてから、再びポンプを動かし 20

分間流し、カラム内を洗浄した。

第２項 溶媒の検討

試料

キシロース

キシリトール

試薬

酢酸エチル

エタノール

アセトニトリル

超純水

溶媒 1 アセトニトリル :超純水 =75:25 でキシロース・キシリトールの

混合液を流した。

溶媒 2 アセトニトリル : 超純水 =85:15 でキシロース・キシリトール

の混合液を流した。

溶媒 3 酢酸エチル :エタノール :アセトニトリル :超純水＝ 30:30:23:17

でキシロース・キシリトールの混合液を流した。

第３項 キシリトールを含む食品の分析

試料

イチゴ (栃木県産とちおとめ、アメリカ産イチゴ )

カリフラワー (徳島県産 )

ホウレンソウ (群馬県産 )

試薬

10%(w/v)NaOH

Page - 13

使用器具

フードプロセッサー

超音波発震機 (ULTRASONIC CLEANER)

メスフラスコ

No.5B の濾紙

メンブレンフィルター

HPLC

方法

試料の前処理

キシリトールを含む食品 (イチゴ・カリフラワー・ホウレンソウ )につ

いて分析を行った。

試料をフードプロセッサーで破砕し、イチゴ 3.0558g ホウレンソウ

3.0361g カリフラワー 3.0337 に蒸留水 30ml を加えて、30 分間超音波処

理 (酸性の場合、10%(w/v)NaOH で中和 )したものを No.5B の濾紙で濾過

して、濾液を 50ml のメスフラスコに受け、蒸留水を加えて 50ml とし

た。これをメンブレンフィルター (0.45μ m)で濾過したものを HPLC 用

試験液とし、キシリトールの分析を行った。

Page - 14

第４項 培地組成の検討

試料

キノコ (京都府産丹波しめじ )

白菜キムチ (韓国産 )

ダノン BIO(ダノンジャパン株式会社 )

試薬

おから培地

5%キシロース水

使用器具

オートクレーブ

シャーレ

5%キシロース水 (蒸留水 100ml にキシロース 5g を溶かし、 121℃で

15 分間オートクレーブ滅菌した )に、20%,50%,100%のおからを添加した

培地にキノコ・キムチ・ヨーグルトをそれぞれ 2g 加えて 25℃で 7 日間

培養し、コロニーの有無や培地の状態を比較した。

また、おからの有無による生育や生産性の違いを調べるため、5%キシ

ロースにおからを 20%加えた培地と、5%キシロースのみの培地で菌株を

培養し、目視にて生育の違いを、 HPLC でキシリトール濃度を測定し、

比較を行った。

第５項 キシリトール生産菌の検索

試料

キノコ (京都府産丹波しめじ )

白菜キムチ (韓国産 )

ダノン BIO(ダノンジャパン株式会社 )

プロバイオティクス乳酸菌飲料 (ホワイト食品工業株式会社 )

糠床

みそ (H19 授業で造ったもの )

ヤクルト (株式会社愛知ヤクルト工場 )

野菜の戦士 (大塚チルド食品株式会社 )

M2-22(ハナミズキ由来 )*

Page - 15

M2-42(ツツジ由来 )*

M2-45(ツツジ由来 )*

*卒研醸造１班提供

実験方法

20%おから培地に試料を約 2g 接種し、 30℃で 7 日間培養した。おか

ら培地での生育を確認した。

第６項 生産性の検討

試料

M2-22

M2-42

M2-45

使用器具

HPLC

M2-22、 M2-42、 M2-45 の 3 つの菌株にキシリトール生産が見られた

ため、これらの菌株についてキシリトールの生産性を比較するため、同

条件下で培養し、培養後のキシリトール濃度を HPLC 測定することで、

キシリトールの生産性を比較した。

第７項 検鏡観察

試料

M2-22

M2-42

M2-45

使用器具

ガラスプレート

倒立顕微鏡

M2-22、 M2-42、 M2-45 の菌について、形態観察を行った。菌体を生

理食塩水に懸濁させ、これを一滴ガラスプレートにのせ、倒立顕微鏡を

用いて形態観察を行った。

Page - 16

第８項 溶存酸素の検討

試薬

20%おから培地

5%キシロース水

50ml,100ml,150ml の液量の異なる 20%おから培地で培養し、培養後

のキシリトール濃度を測定することにより、酸素供給量の検討を行った。

50ml 培地にはおから 10g に 5%キシロース水を 40ml、 100ml 培地に

はおから 20g に 5%キシロース水を 80ml、 150ml 培地にはおから 30g

に 5%キシロース水 120ml を添加した。

第９項 キシリトールの精製 (1)

試料

溶存酸素の検討で培養した 50ml 培地培養液 (84ml)

試薬

クロロホルム

ジエチルエーテル

99.5%エタノール

使用器具

分液ロート

ロート台

100ml ビーカー

エバポレーター

溶存酸素の検討で培養した 50ml 培地 (84ml)を活性炭濾過した。それ

に対しクロロホルム、ジエチルエーテル各 15ml ずつ加えた。分液ロー

トに移して、シェイクし発生した気体を定期的に抜いた。気体が発生し

なくなったら、溶液が分離するまで静置した。

目的の上層以外は廃棄し、そこへジエチルエーテル 20ml を加えた。

数回シェイクして気体を抜く。同様の作業を 4～ 5 回繰り返した。気体

が発生しなくなったら、溶液が分離するまで静置した。上層を濾過し、

その濾液 (62.5ml)をエバポレーターで濃縮した (11ml)。ここから 100μ l

Page - 17

とり、99.5%エタノールを 900μ l 加え攪拌後、冷蔵庫で静置させた。こ

れを濃縮液 1 とした。残りの濾液に 5 倍量の 99.5%エタノールを加え攪

拌し、濾過した。その濾液を再びエバポレーターにかけ、液量が約 2ml

になるまで濃縮を行い、容器に移し冷蔵庫で静置させた。これを濃縮液

2 とした。濃縮液 1 と、濃縮液 2 をキシリトール生成の違いについて比

較した。

第１０項 キシリトールの精製 (2)

試料

培養液

試薬

クロロホルム

ジエチルエーテル

99.5%エタノール

使用器具

エバポレーター

乳糖濃度計

吸引ビン

アスピレーター

ヌッチェ

大量培養させキシリトール濃度が 5.23%になった培養液を、クロロホ

ルムとジエチルエーテルを使い除淡白、脱脂させた後、この濾液をエバ

ポレーターで濃縮した。その濃縮液に 5 倍量のエタノールを加え 4℃で

静置させ結晶ができるのを待った。結晶が確認できたら吸引濾過し結晶

と濾液に分け、濾液のほうは乳糖濃度計で測定し糖度が残っていた場合

再び同じ方法で結晶化させた。

Page - 18

活性炭濾過 50ml 培地

C4H1 0O

CHCl3 15ml

C4H1 0O 15ml

分液ロート

分離するまで

シェイク

気体の発生

Yes

No

上層のみ残す

分離するまで

シェイク

気体の発生 Yes

No

濃縮

No 13ml 程

Yes

残りの濃縮液 100μ l 採取

＋

5 倍量の C2H5OH

濾過

濃縮

濾過 C2H5OH

900μ l

それぞれ別の容器へ入れて

冷蔵庫内で保存し、違いを確

Fig. 5 キシリトールの精製方法

Page - 19

第１１項 ジャーファーメンター培養

使用菌株

M2-45(ツツジ由来酵母 )

試薬

YM 培地

おから

5%キシロース水

30%キシロース水

器具・装置

電子天秤

メスシリンダー

ジャーファーメンター： MDL100 型 1L(MDL-4CR)

(株 )丸菱バイオエンジ

300ml 三角フラスコ

白金耳

培地組成

前培養

YM 培地

ジャーファーメンター

おから (140g)

5%キシロース水 (560ml)

方法

前培養

300ml 三角フラスコに蒸留水 100ml、YM 培地 2.1g を溶かしオートク

レーブ滅菌した。

M2-45 を 100ml の滅菌した YM 培地に 1 白金耳接種し、 30℃で振と

う培養した。

ジャーファーメンター培養

おから 140g に 5%キシロースを 560ml 加え、培地とした。これをジ

ャーファーメンター (Fig.6)に入れて 121℃ 15 分間オートクレーブ滅菌

Page - 20

した。ここに M2-45 前培養液を全量加えて 30℃・ 200rpm で 12 日間培

養した。

比較のため、エアレーション (0.83v.v.m)を行い、エアレーション無し

の場合と同様に 30℃・200rpm で培養し、7 日ごとに 30％キシロース水

100ml(オートクレーブ済み )を加え 21 日間培養した。

Fig. 6 ジャーファーメンター

第１２項 菌体外酵素反応

酵素濃縮

試薬

1/100M 酢酸緩衝液

5%キシロース

5%リボース

5%アラビノース

試料

M2-45 培養物 12 日目

Page - 21

使用器具

No.2 濾紙

セロファンチューブ

タコ糸

スターラー

吸水シート

2l 三角フラスコ

ワッセルマン氏試験管

M2-45 培養物 12 日目を No.2 の濾紙で濾過した。これらの液を、それ

ぞれ片側を結んだセロファンチューブに入れ、もう一方をタコ糸で結ん

だ。これを 100 倍量の 1/100M 酢酸緩衝液に浸し、スターラーで撹拌し

ながら冷所に置いた。 1 日後にチューブを取り出し、吸水シートで包み

重しをのせ脱水した。

ワッセルマン氏試験管に 5%キシロース・リボース・アラビノースを

5ml・2 連で調整し、オートクレーブ (121℃ 15min)にかけた。酵素濃縮

させたものを、 1ml ずつ加え、 4℃、室温、 25℃、 37℃、 60℃で 7 日間

培養で酵素反応させた。反応後、キシリトールとキシロースの濃度を測

定した。

第１３項 菌体内酵素反応

試薬

0.5%yeast ex.

0.5%polypeptone

5%キシロース

5%リボース

5%アラビノース

生理食塩水

試料

ジャーファーメンター 19 日間培養液 (M2-45)

使用器具

ワッセルマン氏試験管

Page - 22

ファルコンチューブ

遠心機

振とう培養機

各 5% キ シ ロ ー ス ・ リ ボ ー ス ・ ア ラ ビ ノ ー ス に 0.5%yeast ex. ・

polypeptone 加え、オートクレーブ (121℃ 15min)した。

ジャーファーメンター培養 19 日目の培地をファルコンチューブに

10ml 取り、 3000rpm 10min 遠心にかけた。上清を捨て、生理食塩水を

加えて撹拌し遠心した。同様の操作を 2 回繰り返し、菌体の洗浄を行っ

た。上清を除去し培地を加え、菌体が培地に混ざるように上層のみ懸濁

し、 4℃、 15℃、 25℃、 37℃、 60℃ 7 日間培養した。培養後、キシリト

ールとキシロースの濃度を測定した。

第１４項 結晶の定性分析

試料

結晶 (サンプル )

キシリトール (標準物質 )

試薬

臭化カリウム (KBr)

使用機器

めのう乳鉢

乳棒

ピンセット

錠剤成型器

ホルダー

フーリエ変換赤外分光光度計 (FT-IR Spectrometer PARAGON1000)

今回、赤外線吸収スペクトル法により結晶成分の同定を行った。

分子はそれぞれ固有の振動をしている。赤外線吸収スペクトル法は、

その分子に波長を変化させた赤外線 (inhurared;IR)を連続的に照射して

いくと、主として分子固有のスペクトルが得られる。この赤外線吸収ス

ペクトルから分子の構造などを解析する方法である。

赤外線の吸収される波長は分子の官能基に固有なため、測定対象分子

Page - 23

に含まれている官能基がわかる。特に特性基としてヒドロキシ基 (O-H)、

カルボニル基 (C=O)、あるいはニトロ基 (NO2)などは特徴ある強い吸収を

示すため、アルコール類の定性は容易であるとされている。

M2-45 を 21 日間ジャーファーメンター培養したものを濾過・濃縮し

た液中に生じた結晶について同定を行った。

「第 2 版 機器分析のてびき」赤外線吸収スペクトル法を参考に、KBr

法の手順に従い実験を行った。

はじめに、KBr をめのう乳鉢 (大 )で粉砕した (KBr は吸湿性があるため、

粉砕中に吸湿しないように手早く行った )。この KBr 粉末を少量使い、

めのう乳鉢を共洗いした。粉砕した KBr を、錠剤成型器で円盤状に成型

し、ブランク錠剤とした。

次に、試料 0.5~2mg をめのう乳鉢で十分に粉砕した。これに KBr 粉

末 150~200mg をその半量ずつ加えてすりつぶし、十分に粉砕した。粉

砕した試料は、錠剤成型器で円盤状に成型した。

成型した試料を赤外分光光度計にセットし 400～ 4000nm の波長で測

定を行った。

以下の事項に注意して実験を行った。

① KBr が純粋で乾燥したものであれば、全波長領域にわたって試料の吸

収のみが現れる。 KBr が湿っているおそれのある場合、 110℃で一昼夜

乾燥して使用する。乾燥した KBr は、デシケータ内で保存する。

② 乳鉢ですりつぶすとき、試料および KBr の粉末粒度はできるだけ小

さくし、試料が均一に KBr 中に分散していることが必要である。粒度が

小さいほど散乱光は少なく、吸光度は大となり、鋭いスペクトルが得ら

れる。

③ 錠剤の扱いは必ずピンセットで行い、手でつかんではいけない。

④ 錠剤を保存するときには薬包紙に包み、デシケータ内で保存する。

⑤ 錠剤に気泡が入っている場合や、不透明なものではよいスペクトルは

得られない。なお、もう一度プレスしなおすと、透明になることもある。

⑥ 錠剤成型器の組み立ては丁寧に、慎重に行うこと。斜めの加圧によっ

て破損することが多いので注意する。

⑦ プレスの加圧は徐々に行わなければならない。

⑧ 錠剤の成型に用いる受け棒、錠剤枠、加圧棒、はさびやすいので、錠

剤成型後、水洗して KBr を除去したのち十分に水分をとり、ワセリンな

どを塗布して保存する。

Page - 24

第２節 結果と考察

第１項 溶媒の検討

溶媒 1 ではキシロース・キシリトールのピークが分離できず、溶媒 2

でもキシロース・キシリトールのピークがうまく分離できなかった。し

かし、溶媒 3 ではキシロース・キシリトールのピークが完全に分離する

ことができた (Fig.7~9 参照 )。以上のことから、溶媒 3(酢酸エチル :エタ

ノール :アセトニトリル :水 =30:30:23:17)を移動相とした。

Fig. 7 アセトニトリル :水 =70:30 キシリトールキシロース混合 0.3%

Page - 25

Fig. 8 アセトニトリル：水＝ 85:15

Fig. 9 酢酸エチル：エタノール：アセトニトリル：水＝ 30:30:23:17

キシリトール･キシロース混合 0.3%

Page - 26

第２項 キシリトールを含む食品の分析

キシリトールを多く含むとされている食品を HPLC により分析した結

果、イチゴとホウレンソウからはキシリトールと思われるピークが確認

されたが、カリフラワーからはピークの確認ができなかった。(Fig.10~15

参照 )

カリフラワーからキシリトールが検出されなかった、野菜によっては

季節により栄養成分に差が見られることがあり、今回使ったカリフラワ

ーはキシリトールの量が少なかったため、確認されなかったのではない

かと考えられる。

Page - 27

Fig.10 溶媒 3 未処理イチゴ

Page - 28

Fig. 11 溶媒 3 前処理済イチゴ

Page - 29

Fig. 12 溶媒 3 未処理ホウレンソウ

Page - 30

Fig. 13 溶媒 3 前処理済ホウレンソウ

Page - 31

Fig. 14 溶媒 3 未処理カリフラワー

Page - 32

Fig. 15 溶媒 3 前処理済カリフラワー

Page - 33

第３項 培地組成の検討

培養した結果、おから 100%培地では培地が乾燥した状態で、キノコ・

キムチ・ヨーグルトのいずれも菌の生育が見られなかった。

おから 50%培地では培地が乾燥した状態で、キムチ、ヨーグルトは菌の

生育が見られなかったが、キノコには赤い菌の生育が見られた。

おから 20%培地では水分を含んだ状態で、すべての菌の生育が見られた。

おから 100%培地では水を加えておらず、またおからの水分も蒸発し

てしまったため、生育に必要な水分が足りなくなってしまったことが考

えられる。

おから 50%培地でも、培地に加えた水をおからが吸ってしまい、また

乾燥しやすくなり、結果的に水分が不足してしまった。

水分が少ない場合、菌の生育が悪く、また撹拌や分析等を行う際にも

扱いにくくなるため、ある程度の水分量が必要であると考える。

おから 100%,50%培地では扱いにくく生育も良くないことから、おか

ら 20%培地を採用した。

しかし、おからを酸や酵素処理によって液状化することができればお

から 50%培地でも培養ができると考えられる。またヘミセルロースの分

解によりキシランが遊離すればキシロースが得られ、キシロースを添加

しなくてもキシリトールを生産することが出来る可能性が考えられる。

おから有りとおから無しの培地で培養し、キシリトール濃度を測定し

た結果、おから有りではキシロースが減少し、キシリトールが検出され

たが、おから無しではキシロースが多く残り、キシリトールは検出され

なかった (Table4 参照 )。このことから、培地中のおからが栄養成分とし

て菌の生育やキシリトール生産に有効であると考えられる。

Table 4 おからの有無による比較

おから有り おから無し

キシリトール 0.161 -

キシロース 4.862 10.728おから有り：5%キシロース水におからを20%加えた培地

おから無し：5%キシロース水のみの培地

Page - 34

第４項 キシリトール生産菌の検索

M2-22(ハナミズキ由来 )、 M2-42(ツツジ由来 )、 M2-45(ツツジ由来 )の

サンプル以外からはキシリトールの生産が見られなかった。M2-22(ハナ

ミズキ由来 )、 M2-42(ツツジ由来 )、 M2-45(ツツジ由来 )はキシリトール

の生産が見られた。

第５項 生産性の検討

M2-22(ハナミズキ由来 )、 M2-42(ツツジ由来 )、 M2-45(ツツジ由来 )の

振透培養を行ったところ、M2-45(ツツジ由来 )、M2-22(ハナミズキ由来 )、

M2-42(ツツジ由来 )の順に生産性が良かった。 Fig.16 参照

以上のことから、今回は M2-45(ツツジ由来 )を使用し以降の研究を行

った。

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0 4 8 12

培養日数（日）

キシリトール

濃度

(%)

M2-22M2-42M2-45

Fig. 16 生産性の検討

Page - 35

第６項 検鏡観察

M2-22、 M2-42、 M2-45 の検鏡観察を行った結果、 3 種の菌すべてが

卵型であり、発芽している細胞も確認できた。 (Fig.17~19 参照 )このこ

とから酵母の仲間であるのではないかと考えられる。

また培地表面に膜が発生していたが、酢酸臭がしなかったため、酢酸

菌ではなく産膜酵母であると考えられる。

Fig. 17 M2-45

Page - 36

Fig. 18 M2-42

Fig. 19 M2-22

Page - 37

第７項 溶存酸素の検討

液量の異なる培地で 14 日間培養した結果、それぞれの培地のキシリ

トール濃度及びキシロース濃度は以下の通りであった。

50ml 培地ではキシリトール 0.56%,キシロース 0.00%、 100ml 培地で

はキシリトール 0.54%,キシロース 0.47%、150ml 培地ではキシリトール

0.23%,キシロース 2.34%となった。 (Fig.20 参照 )

酸素は好気性微生物にとって必須元素である。しかし酸素は比較的水

に難溶で、 28℃のとき 1l の水に約 8mg 溶解する。培養の進行につれて

酸素消費量が増大するため、酸素の欠乏状態になりやすい。したがって、

酸素の培養液への供給速度を高めるために強制的な通気と機械的撹拌

を行うのが一般的である。撹拌操作は気泡を細分化して気液界面積を増

大させ酸素の供給速度を高めると同時に、培養液中の酸素、栄養成分、

代謝産物などの移動速度を高めて微生物の増殖を促進する。以上のこと

から液量の少ない培地でキシリトール生産が多かったと考える。 50ml

培地と 100ml 培地ではキシリトール生産量に差は無いが、残存している

キシロースの量に差があった。これは、液量が少なすぎても菌の活動に

影響が出る可能性が考えられる。

Page - 38

0

0.5

1

1.5

2

50 100 150

培地量(ml)

濃度(%) キシリトール

キシロース

Fig. 20 培地量による比較

第８項 キシリトールの精製

培養液を濃縮しキシリトールを結晶化した結果、結晶が 1.80g 得られ

た。

培養液中のキシリトール濃度は 5.23%であったので、キシリトールは

31.38g 含まれていると考えられる。そこから結晶として精製できたキシ

リトールは 1.80g であった。

培地の濾過をする過程で培地の固形成分に大量に残ってしまったこ

とが考えられる。

濾過を行った際に蒸留水を 1･2 回ほどかけて洗浄したが、洗浄がたら

ず濾紙に付着したキシリトールを完全に取りきることができなかった

ため、そのまま濾紙と共に廃棄してしまったのではないかと考えられる。

精製中のアルコール洗浄により、アルコールに多少流出してしまった

可能性が考えられる。

濃縮液を冷却することで結晶化した場合、キシリトールの結晶とキシ

リトール溶液となり、結晶化していないキシリトールを取り出すことが

できない。この溶液中に溶けているキシリトールは、本研究の中では精

製することができなかった。

Page - 39

結晶化した液中にまだ結晶化できなかったキシリトールが残ってい

たのではないかと考えられる。濃縮・冷却による結晶化のみではキシリ

トールを完全に精製することはできず、精製法の検討が必要である。

第９項 ジャーファーメンター培養

撹拌のみでの結果、培地のキシリトール濃度は 7 日目で 0.03%、12 日

目で 0.08%、19 日目には 0.21%まで上昇した。キシロース濃度は 7 日目

で 1.03%、12 日目で 1.23%、19 日目には 1.34%とやや上昇した。(Fig.21

参照 )

通気撹拌条件で、段階的にキシロースを添加しながら培養を行った結

果、培地のキシリトール濃度は 5 日目で 0.47%、6 日目で 0.50%、12 日

目で 2.56%、19 日目には 5.23%まで上昇した。キシロース濃度は 5 日目

で 2.74%、 6 日目で 0.78%、 12 日目で 0.77%と減少し、 19 日目には 0%

になった。 (Fig.22 参照 )

本実験では時間の関係で、キシリトール濃度が 5%を超えた時点で培

養を止めてしまったが、培養を続ければキシリトールの生産が継続する

と考えられる。

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

1.60

0 5 10 15 20

培養日数(日)

濃度(%)

キシリトール

キシロース

Fig. 21 通気なし撹拌条件ジャーファーメンター培養結果

Page - 40

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

0 5 10 15 20

培養日数(日)

濃度(%)

キシリトール

キシロース

Fig. 22 通気撹拌条件ジャーファーメンター培養結果

第１０項 菌体外酵素反応

M2-45 の各酵素濃縮液にキシロース、アラビノース、リボースを添加

し培養した結果、キシリトールとキシロースの濃度は、温度による違い

が見られなかった。 (Table5 参照 )

Table 5 菌体外酵素反応結果

4℃ 室温 25℃ 37℃ 60℃

キシリトール 8.107502 0.275985 0.280592 0.230509 0.335427

キシロース 53.60066 2.683902 5.762204 1.351637 1.598507

Page - 41

第１１項 菌体内酵素反応

M2-45 の菌体にキシロース、アラビノース、リボースを添加し培養し

た結果 (Table6 参照 )

菌体外酵素による反応に比べてキシリトール濃度、キシロース濃度と

もに高くなっていた。菌体内酵素の存在により、キシリトール生産がし

やすくなり、キシロースの消費量も押さえる事ができたのではないかと

考えられる。

時間の余裕が無かった為、今回は菌体の同定まで手が回らなかった。

しかし、検鏡した結果や産膜を生産することから酵母の類ではないかと

考えられる。

Table 6 菌体内酵素反応結果

4℃ 15℃ 25℃ 37℃ 60℃

キシリトール 0.532129 0.532081 0.532081 0.511927 0.493605

キシロース 5.531004 7.194105 6.19309 5.30294

第１２項 結晶の定性分析

培養液を濃縮して得た結晶とキシリトール標準物質の赤外線吸収ス

ペクトルを比較した結果、結晶のスペクトルとキシリトール標準物質の

スペクトルがほぼ一致した。この結果から、結晶はキシリトールである

と考えられる。 (Fig.23 参照 )

Page - 42

Fig. 23 赤外線吸収スペクトルの比較

Page - 43

第５章 参考文献 「五訂増補食品成分表 2007」

「酵素の科学」藤本大三郎 ,裳華房

「生物化学」吉川春寿 ,光生館

「第一世代の糖アルコール」日研化成株式会社

「第二世代の糖アルコール」日研化成株式会社

「第 2 版 機器分析のてびき (1)」小川雅彌 , (株 )化学同人

渡辺格 ,三浦謹一郎 :酢酸処理を基本とする糖の定量 ,

梅本博仁 ,中村聡 ,極限酵素の分子解剖・分子手術～アルカリキシラナー

ゼの構造 -活性相関解明と耐アルカリ性向上の試み～ ,BIO INDUSTRY

Vol.25,No.7,59~69.2008

須見洋行 , 柳沢泰任 , 岸本憲明 : オカラ発酵による水溶性ビタミン K の

生産 , Nippon Nogeikagaku Kaishi Vol.73, No.6, pp.599~604. 1999

浅野三夫 , 遠藤いずみ , 山内文男 : オカラから検出された塩基性 7S グロ

ブリンとその分離法 , Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi Vol.40, No.5,

323~330

Yoshikiyo Sakakibara and Badal C.Saha:Isolation of an Operon

Involved in Xylitol Metabolism from a Xylitol-Utilizing Pantoea

ananatis Mutant. , JOURNAL OF BIOSCIENCE AND

BIOENGINEERING Vol.106, No.4, 337-344. 2008

Akinori Matsushika, Seiya Watanabe, Tutomu Kodaki, Keisuke

Makino, and Shigeki Sawayama: Bioethanol Production from Xylose

by Recombinant Saccharomyces cerevisiae Expressing Xylose

Reductase, NADP+-dependent Xylitol Dehydorogenase,and

Xylulokinase. , JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING

Vol.105, No.3, 296-299. 2008

ELEONORA VANDESKA, SLOBODANKA KUZMANOVA, AND

Page - 44

THOMAS W.JEFFRIES: Xylitol Formation and Key Enzyme Activities

in Candida boidinii under Different Oxygen Transfer Rates. ,

JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING Vol.80, No.5,

513-516. 1995

Wen-Chang Liaw, Chee-Shan Chen, Wen-Shion Chang, and Kuan-Pin

Chen: Xylitol Production from Rice Straw Hemicellulose Hydrolyzate

by Polyacrylic Hydrogel Thin Films with Immobilized Candida

subtropicalis WF79., JOURNAL OF BIOSCIENCE AND

BIOENGINEERING Vol.105, No.2, 97-105. 2008

Hitomi Ohara, Michiko Owaki, and Kenji Sonomoto: Calculation of

Metabolic Flow of Xylose in Lactococcus lactis. , JOURNAL OF

BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING Vol.103, No.1, 92-94. 2007

Motoki Wakiyama, Koji Yoshihara, Sachio Hayashi, and Kazuyoshi

Ohta: Purification and Prooerties of an Extracellular β -Xylosidase

from Aspergillus japonicus and Sequence Analysis of the Encoding

Gene., JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING Vol.106,

No.4, 398-404. 2008

J.C.du Preez,B. van Driessel and B.A.Prior: FARMENTATION OF

D-XYLOSE BY CANDIDA SHEHATAE AND PICHIA STIPITIS AT

LOW DISSOLVED OXYGEN LEVELS., SEVENTH INTERNATIONAL

SYMPOSIUM ON YEASTS S129-130. 0749-503X/ 89/

Spec .Iss.0129-02 $05.00. 1989 by John Wiley & Sons Ltd.

Juichi YOSHITAKE, Hitoshi OHIWA, Mutsuo SHIMAMURA and

Tomio IMAI: Production of Polyalcohol by a Corynebacterium sp.Part

Ⅰ . Production of Pentitol from Aldopentose., Agr.Biol.Chem., Vol. 35,

No.6, p.905~911. 1971

化粧品成分ガイド

http: / /www.studio-sweets.com/cosme-guide4.html

Page - 45

第６章 謝辞 本研究の実施および論文の作成にあたり、終始懇切なるご指導を賜り

ました担当講師の大岩仁志先生を始めとする多くの先生ならびに学校

関係者の皆様および千葉県産業支援技術研究所の皆様に心から感謝申

し上げます。

また、本研究を行うにあたり菌株を御提供頂きました星野徹也先生、

醸造 1 班の皆様に感謝申し上げます。

Page - 46