T.C.

SÜLEYMAN DEMİREL ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

BITUMINARIA BITUMINOSA BİTKİSİ ÇÖZÜCÜ ÖZÜTLERİNİN FİTOKİMYASAL OLARAK DEĞERLENDİRİLMESİ

Tuba ÖRENÇ

Danışman Prof. Dr. Ayşegül ÖKSÜZ

YÜKSEK LİSANS TEZİ KİMYA ANABİLİM DALI

ISPARTA - 2017

© 2017 [Tuba ÖRENÇ]

TAAHHÜTNAME

Bu tezin akademik ve etik kurallara uygun olarak yazıldığını ve kullanılan tüm literatür bilgilerinin referans gösterilerek tezde yer aldığını beyan ederim.

Tuba ÖRENÇ

i

İÇİNDEKİLER

Sayfa İÇİNDEKİLER ..................................................................................................................................... i ÖZET .................................................................................................................................................. iii ABSTRACT ........................................................................................................................................ iv

TEŞEKKÜR ......................................................................................................................................... v

ŞEKİLLER DİZİNİ ........................................................................................................................... vi ÇİZELGELER DİZİNİ .................................................................................................................... vii SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ ................................................................................. viii 1. GİRİŞ .............................................................................................................................................. 1

2. KAYNAK ÖZETLERİ .................................................................................................................. 2

2.1. Fabaceae Familyasının Özellikleri.............................................................................. 2

2.2. Psoralea Cinsi ..................................................................................................................... 3

2.3. Bituminaria bituminosa (syn: Psoralea bituminosa) Türü ............................... 3

2.4. Bituminaria bituminosa İle İlgili Kaynak Özetleri ................................................ 4

2.5. Fenolik Bileşikler .............................................................................................................. 5

2.5.1. Fenolik bileşiklerin insan sağlığı üzerine etkileri ......................................... 6

3. MATERYAL VE YÖNTEM ...................................................................................................... 12

3.1. Materyaller ....................................................................................................................... 12

3.1.1. Çözücüler ve kimyasallar .................................................................................... 12

3.1.2. Bitkisel materyallerin toplanması ve teşhis edilmesi .............................. 12

3.2. Yöntemler ......................................................................................................................... 13

3.2.1. Çözücü özütleme yöntemleri ............................................................................. 13

3.2.2. Bitki özütlerinin fenolik ve flavonoit içeriklerinin belirlenmesi ......... 15

3.2.2.1. Toplam fenolik bileşik miktarının belirlenmesi ................................ 15

3.2.2.2. Toplam flavonoit bileşik miktarının belirlenmesi ............................ 15

3.2.2.3. Fenolik ve flavonoit içeriklerinin RP-HPLC ile belirlenmesi......... 16

3.2.3. Antioksidan kapasite tayin yöntemleri .......................................................... 18

3.2.3.1. Toplam antioksidan kapasitenin belirlenmesi ................................... 18

3.2.3.2. Serbest radikal süpürüm aktivitenin belirlenmesi ........................... 19

3.2.3.2.1. DPPH radikal süpürüm testi .............................................................. 19

3.2.3.2.2. ABTS radikal süpürüm testi .............................................................. 19

3.2.3.3. İndirgeme gücünün belirlenmesi ............................................................ 19

3.2.3.3.1. CUPRAC testi ........................................................................................... 19

3.2.3.3.2. FRAP testi ................................................................................................. 20

3.2.3.4. Şelatlama kapasitesinin belirlenmesi .................................................... 20

3.2.4. Enzim inhibisyon kapasite tayin yöntemleri ............................................... 20

3.2.4.1. Kolinesteraz inhibisyon aktivitenin belirlenmesi ............................. 20

3.2.4.2. Tirozinaz inhibisyon aktivitenin belirlenmesi ................................... 21

3.2.4.3. α-Amilaz inhibisyon aktivitenin belirlenmesi .................................... 21

3.2.4.4. α-Glukozidaz inhibisyon aktivitenin belirlenmesi ............................ 22

3.3. İstatistiksel Hesaplamalar .......................................................................................... 22

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA ....................................................................... 23

4.1. Bitki Çözücü Özüt Verimleri ...................................................................................... 23

4.2. Özütlerin Toplam Fenolik ve Flavonoit İçerikleri ............................................. 23

4.3. Özütlerin RP-HPLC ile Belirlenen Fenolik İçerikleri ........................................ 25

4.5. Özütlerin Toplam Antioksidan Kapasitesiteleri ................................................ 27

4.6. Özütlerin Serbest Radikal Süpürüm Kapasitesiteleri ...................................... 28

ii

4.7. Özütlerin İndirgeme Gücü Kapasiteleri................................................................. 30

4.8. Özütlerin Metal Şelatlama Kapasitesiteleri ......................................................... 33

4.9. Özütlerin Enzim İnhibisyon Kapasitesiteleri ...................................................... 34

4.10. Aktivite Testleri Arasındaki Korelasyon Katsayıları ..................................... 37

5. SONUÇ VE ÖNERİLER ............................................................................................................ 40

KAYNAKLAR .................................................................................................................................. 42

EKLER............................................................................................................................................... 47

EK A. Standart Fenoliklerin RP-HPLC Kromatogramları ............................................. 48

EK B. Bituminaria bituminosa Özütlerinin RP-HPLC Kromatogramları ................. 49

ÖZGEÇMİŞ ....................................................................................................................................... 52

iii

ÖZET

Yüksek Lisans Tezi

BITUMINARIA BITUMINOSA BİTKİSİ ÇÖZÜCÜ ÖZÜTLERİNİN FİTOKİMYASAL OLARAK DEĞERLENDİRİLMESİ

Tuba ÖRENÇ

Süleyman Demirel Üniversitesi

Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı

Danışman: Prof. Dr. Ayşegül ÖKSÜZ

Bu çalışmanın amacı, Bituminaria bituminosa bitkisi etil asetat, metil alkol ve su özütlerinin antioksidan ve enzim inhibitor aktivitelerini belirlemektir. Antioksidan aktivite, radikal süpürüm aktivite (DPPH ve ABTS), indirgeme gücü (CUPRAC ve FRAP), fosfomolibdenyum yöntemiyle toplam antioksidan aktivite ve metal şelatlama testleri gibi farklı yöntemler kullanılarak ddeğerlendirildi. Aynı zamanda, özütlerin tirozinaz, asetilkolin esteraz, bütirilkolin esteraz, -amilaz ve -glukozidaz enzimleri üzerine inhibisyon aktiviteleri de araştırıldı. Ayrıca, özütlerdeki antioksidan bileşikler (fenolikler ve flavonoitler) hem spektrofotometrik hem de ters fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografi (RP-HPLC) kullanılarak belirlendi.

Fosfomolibdenyum testinde, metil alkol özütü en yüksek aktiviteyi sergiledi (166.78 µmol troloks eşdeğer (TEs)/g kuru bitki). Su özütü, 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH·) ve 2,2-azino-bis(3-etilbenzotiyaazoloyin-6-sülfonik asit) (ABTS·+) katyon radikal üzerine en yüksek süpürüm aktivite gösterdi. Yine su özütü, bakır (II) iyonu (CUPRAC) ve demir (III) iyonu (FRAP) indirgeme gücü testlerinde de en yüksek aktiviteyi gösterdi (sırasıyla; 41.26 ve 46.82 µmol TEs/g kuru bitki). Özütler, kolinesterazlar ve tirozinaz enzimleri üzerine hiçbir inhibisyon etkisi göstermedi. Buna karşın, su özütünün (1233.86 µmol akarboz eşdeğer (ACEs)/g kuru bitki) α-glukosidaz enzim inhibisyon testinde; etil asetat özütünün (53.65 µmol ACEs/g kuru bitki) ise, α-amilaz enzimi üzerine daha güçlü bir inhibisyon etkisi sergilediği tespit edildi. Toplam fenolik bileşik miktarı bakımından en yüksek içeriğe su özütü sahipti (31.70 µmol gallik asit eşdeğer (GAEs)/g kuru bitki). Ancak metil alkol özütünün (5.29 µmol rutin eşdeğer (REs)/g kuru bitki) toplam flavonoit bileşik bakımından daha zengin olduğu bulundu. Ayrıca, su özütünün önemli miktarda rosmarinik asit, luteolin, kuarsetin ve rutin içerdiği tespit edildi. Bu sebeple, Bituminaria bituminosa bitkisinin yeni ve alternatif antioksidan ve enzim inhibitör ajanların kaynağı olarak kullanılabileceği söylenebilir.

Anahtar Kelimeler: Bituminaria bituminosa; Antioksidan aktivite; Enzim inhibitor aktivite; Fitokimya

2017, 52 sayfa

iv

ABSTRACT

M.Sc. Thesis

PHYTOCHEMICAL EVALUATION OF SOLVENT EXTRACTS FROM BITUMINARIA BITUMINOSA

Tuba ÖRENÇ

Süleyman Demirel University Graduate School of Natural and Applied Sciences

Department of Chemistry

Supervisor: Prof. Dr. Ayşegül ÖKSÜZ The aim of this study was to evaluate the in vitro antioxidant and enzyme inhibitory activities of ethyl acetate, methanol and water extracts of Bituminaria bituminosa. The antioxidant activity were evaluated using different assays, specifically free radical scavenging (DPPH and ABTS), reducing power (FRAP and CUPRAC), total antioxidant capacity (by phosphomolybdenum method) and metal chelating activity. Inhibitory activities of the extracts on tyrosinase, acetylcholineserase, butrylcholinesterase,-amylase, and -glucosidase were also investigated. In addition, antioxidant compounds (phenolics and flavonoids) in the extracts were determined both spectrophotometrically and by using reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC).

In phosphomolybdenum assay, the methanol extract showed the highest activity (166.78 µmol TEs/g dry plant). The water extract exhibited the highest scavenging activity on 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH·) and 2,2-azino-bis (3-ethylbenzothiazloine-6-sulphonic acid) (ABTS·+). Additionally, it also showed the highest activity in cupric ion reducing (CUPRAC) and ferric reducing antioxidant power (FRAP) assays (41.26 and 46.82 µmol TEs/g dry plant, respectively). The extracts did not show cholinesterase and tyrosinase inhibitory activity. However, α-glucosidase inhibitory assay was resulted in the superiority of water extract (1233.86 µmol ACEs/g dry plant). In the case of α-amylase inhibitory assay, the ethyl acetate extract showed the highest activity (53.65 µmol ACEs/g dry plant). The water extract had the highest phenolic content (31.70 µmol GAEs/g dry plant). On the other hand, the methanol extract was found rich in flavonoit compounds (5.29 µmol REs/g dry plant). The water extract contained considerable amounts of rosmarinic acid, luteolin, quercetin, and rutin. Therefore, Bituminaria bituminosa can be used as the source of new and alternative antioxidant and enzyme inhibitory agents.

Keywords: Bituminaria bituminosa; Antioxidant activity; Enzyme inhibitory activity; Phytochemistry

2017, 52 pages

v

TEŞEKKÜR

Bu araştırma için beni yönlendiren, karşılaştığım zorlukları bilgi ve tecrübesi ile aşmamda yardımcı olan ilk danışmanım Prof. Dr. Mustafa CENGİZ ve daha sonra danışmalığımı üstlenen Prof. Dr. Ayşegül ÖKSÜZ’e

Yüksek Lisans eğitimimin her aşamasında yardımlarından özellikle de Laboratuar çalışmalarındaki katkılarından ve tez yazım aşamasındaki desteklerinden dolayı Doç. Dr. Cengiz SARIKÜRKCÜ ve Dr. Mehmet Cemil ÜREN’e,

Tezde kullanılan bitkilerin botanik tanımlamalarını yapan Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü Öğretim elemanı Uzman Dr. Olcay CEYLAN’a,

Laboratuvar çalışmanlarının bir kısmının yapılmasında katkılarından dolayı Selçuk Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü öğretim üyesileri Prof. Dr. Abdurrahman AKTÜMSEK ve Doç. Dr. Gökhan ZENGİN ile Doktora öğrencisi Ramazan CEYLAN’a,

4483-YL2-15 No`lu Proje ile tezimi maddi olarak destekleyen Süleyman Demirel Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinasyon Birimine,

Tezimin her aşamasında beni yalnız bırakmayan değerli eşim Aşır ÖRENÇ’e, çocuklarım Hayrunnisa Bahar ve Leyla Hira’ya sonsuz sevgi ve saygılarımı sunarım.

Tuba ÖRENÇ ISPARTA, 2017

vi

ŞEKİLLER DİZİNİ

Sayfa

Şekil 2.1. Serbest radikallerin oluşumu ve sağlığa olumsuz etkileri ........................... 6

Şekil 3.1. Tez çalışmasında kullanılan Bituminaria bituminosa bitkisi ................... 12

Şekil 3.2. Etil asetat ve metil alkol özütlerinin hazırlanma aşamaları .................... 14

Şekil 3.3. Su özütünün hazırlanma aşamaları ................................................................... 14

Şekil 3.4. Standart gallik asit derişim-absorbans grafiği .............................................. 15

Şekil 3.5. Standart rutin derişim-absorbans grafiği ....................................................... 16

Şekil 4.1. B. bituminosa bitkisi çözücü özüt verimleri ................................................... 23

Şekil 4.2. B. bituminosa özütlerinin toplam fenolik bileşik içerikleri ...................... 24

Şekil 4.3. B. bituminosa özütlerinin toplam flavonoit bileşik içerikleri .................. 24

Şekil 4.4. B. bituminosa özütlerinde bulunan fenolik bileşiklerin yapıları ............ 25

Şekil 4.5. B. bituminosa özütlerinin toplam antioksidan aktiviteleri ....................... 27

Şekil 4.6. DPPH serbest radikal süpürüm tepkimesi ..................................................... 28

Şekil 4.7. B. bituminosa özütlerinin DPPH radikal süpürüm aktiviteleri ............... 29

Şekil 4.8. ABTS katyon radikal süpürüm tepkimesi ....................................................... 29

Şekil 4.9. B. bituminosa özütlerinin ABTS radikal süpürüm aktiviteleri ................ 30

Şekil 4.10. CUPRAC indirgeme gücü kapasite test tepkimesi ..................................... 31

Şekil 4.11. FRAP indirgeme gücü kapasite test tepkimesi ........................................... 31

Şekil 4.12. B. bituminosa özütlerinin CUPRAC indirgeme gücü kapasiteleri ........ 32

Şekil 4.13. B. bituminosa özütlerinin FRAP indirgeme gücü kapasiteleri .............. 33

Şekil 4.14. Fe(II)-ferrozin kompleks oluşum tepkimesi ............................................... 34

Şekil 4.15. B. bituminosa özütlerinin Fe(II) iyonları şelatlama kapasiteleri ......... 34

Şekil 4.16. B. bituminosa özütlerinin α-amilaz inhibisyon aktiviteleri ................... 35

Şekil 4.17. B. bituminosa özütlerinin α-glukozidaz inhibisyon aktiviteleri ........... 36

Şekil A.1. Standart fenolik bileşiklerin RP-HPLC kromatogramları ......................... 48

Şekil B.1. Bituminaria bituminosa etil asetat özütü RP-HPLC kromatogramı ...... 49

Şekil B.2. Bituminaria bituminosa metil alkol özütü RP-HPLC kromatogramı .... 50

Şekil B.3. Bituminaria bituminosa su özütü RP-HPLC kromatogramı ..................... 51

vii

ÇİZELGELER DİZİNİ

Sayfa

Çizelge 3.1. B. bituminosa özütlerindeki fenolik bileşiklerin HPLC programı ...... 17

Çizelge 3.2. Standart fenolik bileşiklere ait analitik karakteristikler ...................... 18

Çizelge 4.1. B. bituminosa özütlerinin HPLC analiz sonuçları ..................................... 26

Çizelge 4.2. Aktivite testleri arasındaki korelasyon katsayıları ................................ 37

Çizelge 4.3. B. bituminosa özütlerinde bulunan fitokimyasallar ile aktivite testleri arasındaki korelasyon katsayıları ................................................. 39

viii

SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ

µg Mikrogram µl Mikrolitre ACEs Akarboz eşdeğer BHA Bütillenmiş hidroksianisol BHT Bütillenmiş hidroksitoluen dk Dakika DPPH 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil EDTAEs Etilendiamin tetraasetik asit disodyum tuzu eşdeğer FCR Folin-Ciocalteu Reaktifi GAEs Gallik asit eşdeğer KAEs Kojik asit eşdeğer m Metre mg Miligram ml Mililitre mm Milimetre nm Nanometre REs Rutin eşdeğer RP-HPLC Ters faz yüksek performanslı sıvı kromatografisi TEs Troloks eşdeğer

1

1. GİRİŞ

Günümüzde endüstriyel proseslerde gıda maddelerinin depolanma

stabilitelerini artırmak için çoğunlukla, bütillenmiş hidroksianisol (BHA),

bütillenmiş hidroksitoluol (BHT), propilgallat (PG) ve tersiyer butilhidrokinon

(TBHQ) gibi sentetik antioksidanlar kullanılmaktadır. Ancak, antioksidan olarak

kullanılan kimyasalların muhtemel toksisiteleri nedeniyle, son yıllarda ilgi,

doğal antioksidanlar üzerinde yoğunlaşmıştır. Doğal antioksidanlar, insanların

yüzlerce yıldır tükettikleri veya gıdalara karıştırdıkları katkı maddeleri

olduğundan, bunlar tüketiciler tarafından da güvenilir olarak görülmektedir.

Bunun yanında özellikle son 25-30 yılda modern tıpta kullanılan sentetik

ilaçların tedavide istenilen başarıyı sağlayamamaları, genelde olumlu yönlerinin

az, fakat birçok olumsuz yan etkiye sahip olmalarından dolayı, günümüzde

alternatif tıp olarak anılan ve bitkilerden elde edilen özütlerle tedaviye karşı

gittikçe artan bir ilgi ortaya çıkmıştır. Bu bağlamda yapılacak çalışma önem

kazanmaktadır.

Bituminaria bituminosa bitkisi, Akdeniz'de yaygın olarak dağılım gösteren bir

yıllık yabani baklagillerdendir. Fabaceae familyasına ait olan bu tür yaygın

olarak "Arap bezelyesi" yada "perdeli yonca” olarak adlandırılmakta ve soya,

fasulye, bezelye, nohut, yonca ve fıstık gibi ekonomik bakımdan önemli tarımsal

ve gıda bitkileri sınıfına girmektedir (Permender vd., 2010).

Bu çalışma, Bituminaria bituminosa bitkisi çözücü özütlerinin (etil asetat, metil

alkol ve su) öncelikli olarak antioksidan aktivitelerinin belirlenmesini

amaçlamaktadır. Özütlerin antioksidan aktiviteleri serbest radikal giderim

(DPPH ve ABTS), indirgeme gücü (FRAP ve CUPRAC), demir (II) iyonları metal

şelatlama kapasitesi ve toplam antioksidan aktiviteyi (fosfomolibdenyum testi)

içeren farklı yöntemler kullanılarak belirlendi. Spektrofotometrik olarak toplam

antioksidan bileşenler (toplam fenolik ve toplam flavonoit) de tespit edildi.

Ayrıca, bu özütlerdeki fenolik bileşiklerin türü ve miktarı ters faz yüksek

performanslı sıvı kromatografisi (RP-HPLC) ile karakterize edildi.

2

2. KAYNAK ÖZETLERİ

2.1. Fabaceae Familyasının Özellikleri

Fabaceae familyası dünyada yaklaşık olarak 727-732 cins ve 19000-19700 türe

sahip olup, tropikal, subtropikal ve sıcak bölgelerde yayılış gösteren kozmopolit

bir familyadır. Familyada kserofit, sulu ve tırmanıcı bitkiler mevcuttur.

İnsanların günlük hayatta tükettiği besin değeri yüksek önemli yiyeceklerin

bulunduğu bir familya (baklagiller) olması, onu ekonomik açıdan da oldukça

önemli kılmaktadır (Heywood, 2007; Baldemir, 2010).

Fabaceae familyası Türkiye‘de ise 71 cinse ait yaklaşık 1013 tür içermekte olup

tür sayısı bakımından en büyük ikinci familyadır. Bu türlerin 400‘ü endemik

olup Türkiye Florasında endemizm oranı açısından %40 ile Fabaceae familyası

ikinci sıradadır (Erik ve Tarıkahya, 2004; Toksoy, 2013).

Fabaceae familyası insanlığın besin kaynağını oluşturan en önemli bitki

gruplarından birini oluşturur. Baklagiller eski devirlerden bu yana toplayıcılar

açısından ağaca tırmanmayı ya da yeri kazmayı gerektirmeden kolayca

toplanan, besleyici ve tok tutucu gıda çeşitleri olarak bilinir. Baklagiller kolayca

yetiştirilmelerinin yanı sıra uzun süre saklanabilme özellikleri nedeniyle de

tercih edilmiştir. Romalılar, kabuk içinde saklanmış yenebilen tanelerin tümüne

toplayıcılık anlamındaki legodan gelen 8 legumen adını vermişlerdir. Asya‘da ve

Doğu Akdeniz‘de çokça rastlanan tırmanıcı, sarılıcı baklagiller ilk evcilleştirilen,

tarıma alınan bitkiler arasındadır (Ertuğ, 2008; Toksoy, 2013).

Odunlu veya otsu bitkilerdir. Yapraklar alternan, genellikle stipullu, bipinnat,

pinnat, digitat, trifoliat veya basittir. Çiçekler aktinomorf veya zigomorf, hipogin

veya bazen perigin, genellikle hermafrodit; çiçek durumu rasemöz, başak,

şemsiyemsi veya tek çiçeklidir. Sepaller (4-) 5, tek kalan sepal daima öndedir.

Petaller (1-) 5, tomurcukta valvat veya kiremit dizilişli, serbest veya nadiren

birleşik. Stamenler 4 ya da daha çok sayıda olup, genellikle 10’dur. Hepsi tüp

şeklinde birleşik (monodelf), üst stamen serbest (diadelf) veya hepsi serbesttir.

Karpel tek, üst durumlu, plasentalanma parietal, meyve legumen ventral, dorsal

3

ya da açılmayan, bazen bir tohumlu lomentumlara ayrılmıştır. Tohum tek ya da

çok sayıdadır (Davis, 1970; Baldemir, 2010).

2.2. Psoralea Cinsi

Türkiye Florası’nda, Psoralea cinsi 3 tür ile temsil edilir (Davis, 1970; Toksoy,

2013). Bu türler sırasıyla; P. bituminosa, P. acaulis ve P. jaubertianum’dur.

Psoralea cinsi Güney Afrika’nın doğu ve güneyinde 5 türle temsil edilir; ayrıca

Angola ve Helena adalarında (şu an nesli tükenmiştir) yayılış göstermektedir.

Psoraleo, kaliks ve yaprakların siyah veya yarı-şeffaf salgılarla benekli olması

anlamına gelir. Çalı, ağaç veya ot formunda mevsimsel olarak kuru tropiklerde,

akdeniz ovalarında dağ ormanlarının kenarında bulunabilirler. Cins seyrek, az

bilinen ve tanımlanmamış birçok türden oluşur. Ayrıca süs bitkisi olarak da

kullanılmaktadır (Lewis vd., 2005; Toksoy, 2013).

2.3. Bituminaria bituminosa (syn: Psoralea bituminosa) Türü

Bituminaria bituminosa, Psoralea cinsi içerisinde yer alan çok yıllık bir türdür.

Anavatanı Akdeniz olmakla beraber, Türkiye, Güney Avrupa, Kırım, Batı Suriye,

Kıbrıs, Kafkasya, İsrail, Kuzey Afrika’da ve Portekiz, İspanya gibi ülkelerin doğal

vejetasyonunda da geniş bir yayılım göstermektedir (Davis, 1965). Bituminaria

bituminosa (syn: Psoralea bituminosa L.) halk arasında katran yoncası, demir

otu, katranlı yaban üçgülü gibi isimlerle de bilinmektedir. Bu bitkinin tarımı

sadece Kanarya Adaları ve Fas’ta yapılmaktadır. Genel olarak açık yerlerde, yol

kenarlarında, üst toprak tabakası kaybolmuş alanlarda, döküntü topraklı

yamaçlarda, ağaçlık ve ormanlık alanlarda ve 4.7 ile 8.5 arasındaki pH’da

yetişmektedir (Davis, 1965). Sıcak ve kurak yaz aylarında yeşil kalabilen bu tür

(Acar vd., 2001) Türkiye’de; Adana, Antalya, Çanakkale, Hatay, İstanbul, İzmir,

Muğla, Samsun, Sinop, Tekirdağ, Trabzon, Yozgat ve Zonguldak doğal florasında

yetişmektedir (Davis, 1965; Akçin vd., 2010; Engin ve Korkmaz, 1991; Kılınç

vd., 1998). Ülkemizde Bituminaria cinsinin B. acaulis ve B. jaubertina olmak

üzere 2 türü daha bulunmaktadır (Altun ve Tanker, 2000; Gülümser, 2011).

4

2.4. Bituminaria bituminosa İle İlgili Kaynak Özetleri

Bougue vd. (1998), Psoralea türlerinin kallus kültürlerinden daidzein

(izoflavon) maddesi izole etmişler ve doğal olarak yetişen aynı tür ile sonuçları

karşılaştırmışlardır. Sonuçta, kallus kültürlerinde doğal olanlarına oranla daha

yüksek diadzin olduğu rapor edilmiştir.

Altun ve Tanker (2000), P. bituminosa ve P. acaulis türlerinin kök ve toprak üstü

kısımlarında saponozit, kardiyoaktif heterozit, flavonit, antosiyanozit, tanen ve

kumarin bulunduğunu tespit etmişlerdir.

Ventura vd. (2004), B. bituminosa’nın farklı dönemlerine ait mineral madde

içeriklerini incelemişlerdir. Bu çalışmada, bitkinin kalsiyum (Ca) içeriğinin

%0.86–1.13, fosfor (P) içeriğinin %0.25-0.32, magnezyum (Mg) içeriğinin

%0.18-0.26, sodyum (Na) içeriğinin %0.22-0.30 ve potasyum (K) içeriğinin ise,

%0.26- 0.33 arasında değiştiği tespit edilmiştir.

Tava vd. (2007), Bituminaria bituminosa bitkisinde alkol, sesquiterpen ve

hidrokarbon gibi bileşiklerin bulunduğunu rapor etmişlerdir.

Azzouzi vd. (2014), B. bituminosa bitkisinde izoflavon (daidzin) ve flavon

(isoorientin) bileşiklerini ilk defa tespit ettiklerini rapor etmişlerdir. Ayrıca aynı

çalışmada, bitkinin n-bütanol özütünün DPPH radikal süpürüm aktivitesi ve

CUPRAC indirgeme gücü kapasitesi sırasıyla; IC50 değeri olarak 0.26 µg/ml ve

0.10 L/g olarak tespit edilmiştir.

Llorent-Martinez vd. (2015), yaptıkları çalışmada B. bituminosa bitkisindeki

fenolik bileşikleri, terpenoit saponinleri ve diğer minor bileşikleri

belirlemişlerdir.

Ayrıca birçok araştırmacı, B. bituminosa bitkisinin fitokimyası üzerine

araştırma yapmışlardır. Bu çalışmalarda, bitkinin uranokumarinler (daidzein,

angelisin ve psoralen) ve pterokarpanlar (eribradin C ve bitukarpin A) içerdiği

rapor edilmiştir (Maurich vd., 2004; Maurich vd., 2006; Pecetti vd., 2007; Rio

vd., 2010; Tesauro vd., 2010; Walker vd., 2012).

5

2.5. Fenolik Bileşikler

Fenolik bileşikler ve daha yaygın olarak kullanılan ismi ile polifenoller;

genellikle bir veya birden fazla hidroksil grup içeren bir aromatik halkaya sahip

farklı yapı ve fonksiyonlardaki sekonder bitki metabolitleridir. En basit fenolik

bileşik bir tane OH grup içeren fenoldür (Tanaka vd., 1998; Çopuroğlu, 2015).

Sekonder metabolitler bitkinin temel yaşamsal işlevleri ile doğrudan ilişkili

olmayan maddelerdir. Buna karşılık bitkinin temel yaşamsal işlevleri ile

doğrudan ilişkili primer metabolitler (protein, yağ, karbohidrat, nükleik asit)

kadar önemli olan kimyasallardır. İlk keşfedildiklerinde herhangi bir işlevinin

olmadığı ve bitkiler tarafından üretilen atık maddeler olduğu varsayılmıştır.

Ancak daha sonraları bu maddelerin bitkilerde; savunma, koruma, hayatta

kalma, neslin devamı, ortama uyum için geliştirilmiş oldukça karmaşık

mekanizmaların ürünleri olduğu anlaşılmıştır (Çopuroğlu, 2015).

Sekonder metabolitler primer metabolitlerin ana yolları olan krebs, glikoliz

süresince gerçekleşen yan basamaklardan sentezlenir. Sekonder metabolitlerin

sentezinde 4 temel yol; şikimat yolu, aminoasit yolu, poliket yolu ve izopren

yoludur.

Bütün bitkiler metabolizmalarında kendilerini zararlılara karşı korumak için

çok sayıda fenolik madde oluşturmaktadırlar. Bitki yaşamı için fenolik bileşikler

oldukça önemlidir. Özellikle mikrobiyal ataklara karşı korumada büyük öneme

sahiptir. Bitkisel fenolik bileşikler için önemli antioksidan, antitümöral, antiviral

ve antibiotik aktivitelere sahip oldukları sıklıkla belirtilmektedir. 8000 üzerinde

doğal olarak meydana gelen fenolik bileşik bilinmektedir (Scalbert vd., 2005).

Fenolik bileşikler bitkilerin meyve, sebze, tohum, çiçek, yaprak, dal ve

gövdelerinde bulunabilirler. Gıdalarda bulunan fenolik bileşikler en sıklıkla

meyvelerde gözükmekle birlikte meyvenin çeşidine bağlı olarak farklılıklar söz

konusudur. Ayrıca aynı meyve türünde; büyüme mevsimi, cins, çevresel ve

iklimsel koşullar, bitki hastalıkları, toprak çeşidi, coğrafik bölge, olgunluk gibi

etkenler fenolik bileşiğin içeriğini etkilemektedir. Örneğin; yeşil bir fasulye

6

çeşidinde yapılan çalışma ile farklı yetişme koşulları ilk yıl 0 mg/kg, bir sonra ki

yıl 42.9 mg/kg kuarsetin içeriği vermiştir (Uysal, 2012).

2.5.1. Fenolik bileşiklerin insan sağlığı üzerine etkileri

Meyve ve sebzeler özellikle içerdikleri fenolik bileşiklerin antioksidan ve

antimikrobiyal etkilerine bağlı olarak sağlık üzerine olumlu etkilerinden dolayı

fonksiyonel gıda olarak değerlendirilmektedir. Fenolik bileşiklere beslenme

fizyolojisi açısından olumlu etkileri nedeniyle “biyoflavonoit” adı verilmektedir

(Nizamlıoğlu ve Nas, 2010).

Serbest radikaller; bir veya daha fazla ortaklaşmamış elektron içeren atom,

molekül veya iyonlardır. UV ışınları, çevre kirliliği, sigara serbest radikallerin

sayısını arttırmaktadır. Serbest radikaller çok reaktiftir. Diğer atom veya

moleküllerle reaksiyona girebilir reaksiyon sonucu kanser, kalp krizi gibi

hastalıklara, hücre zarı hasarı, enzimlerde hasar, DNA yapısında bozulmalar,

kan kolesterolünün oksidasyonuna neden olmaktadırlar (Şekil 2.1). Serbest

radikallerle reaksiyona girip onları etkisiz hale getirerek pek çok hastalığa ve

erken yaşlanmaya neden olan zincir reaksiyonlarını önleyen, yok eden,

etkilerini azaltan maddeler antioksidanlardır (Uysal, 2012).

Şekil 2.1. Serbest radikallerin oluşumu ve sağlığa olumsuz etkileri (Uysal, 2012)

7

Fenolik bileşikler doğal antioksidan madde özelliği göstermektedirler. Fenolik

bileşikler serbest radikallerin neden olduğu reaksiyonları durdurarak veya

engelleyerek kanser, kalp hastalığı ve akciğer gibi pek çok hastalığın oluşumuna

engel olurlar (Uysal, 2012).

Kanser, kalp hastalıkları ve beyin damarlarına bağlı hastalıklarda ölüm oranı ve

tümör oluşumunun diyetteki meyve ve sebzelerin miktarıyla ters orantılı olduğu

belirtilmiştir. Bol miktarda meyve ve sebze tüketenlerde kan basıncının da

düştüğü, meyve ve sebzelerin bu etkiyi yapılarında bulunan antioksidanlarla

sağladıkları, bu antioksidan etkinin ise C ve E vitamini ile -karotenden çok

fenolik maddelerden kaynaklandığı kaydedilmiştir (Hertog, 1993; Wang vd.,

1996; Wetherilt, 1996; Baysal ve Yıldız, 2003).

Sebzelerde yaygın olarak bulunan başlıca fenoliklerin antioksidan

aktivitelerinin incelendiği bir araştırmada kateşin ve epikateşinin en güçlü

antioksidan aktiviteye sahip oldukları bulunmuştur. Ayrıca fenolik asitlerden

klorojenik asitin de kateşin ya da epikateşi’nin 1/3’ü kadar etki gösterdiği

belirtilmiştir.

Flavonoitler diyetimizdeki önemli fenolik bileşiklerden olup flavonoitlerin,

tansiyon düşürücü, antioksidan etki, endotel fonksiyonunu geliştirme, platelet

fonksiyonunu azaltma, enzimatik modülasyon ve anti-inflamator etkiye sahiptir

(Uysal, 2012).

Middleton ve Kandaswami (1994), 24 farklı enzim veya enzim sisteminde flavon

ve flavonollerin inhibe edici etkisini araştırmıştır. Bu enzimlerden bazıları hücre

çoğalması, plak agrigasyon, iltihaplanma ve bağışıklığı düzenleyen önemli

metabolik yollara katılmaktadır. Bu nedenle de flavonoitlerin etkilerinin,

bağışıklık sisteminde, kanserin farklı basamaklarında, hücre sisteminde

bulunması şaşırtıcı değildir.

Hollanda’da flavon ve kateşin alımı üzerine yapılan çalışmada toplam alımın ana

kaynağının %48 çay, daha sonra %29 soğan ve %7 elma olduğu belirlendikten

sonra, bu toplulukta ortalama flavon ve flavanol alımı 23 mg/gün (16 mg/gün

kuarsetin) olarak tespit edilmiştir. Ayrıca, kateşin ve flavon alımı ile koroner

8

kalp hastalıkları arasında ilişki bulunduğu tespit edilmiştir (Langseth, 1995;

Hollman vd., 1996).

Soya fasulyesinde bulunan en önemli izoflavonlar genistein ve daidzeindir. 17-

östradial gibi östrojenik sterollere yapıca benzediklerinden bu bileşiklere

fitoöstrojen denir. Bu bileşikler enzim faaliyetini durdurucu ve antioksidan

aktivitelere sahiptir. İzoflavonoitlerden genistein ve daidzein ani ateş basması,

uykusuzluk, migren ve eklem ağrıları gibi menopoz semptomları tedavisinde

kullanılabilir. Ayrıca kolesterol düşürücü ve kemik erimesini önleyici etkileri de

vardır. Çinliler düzenli olarak soya fasulyesi ve soya peyniri tüketmektedir.

Amerikalılara göre ½ kanser riski azalmaktadır (Başer, 2002).

Epidemiyolojik çalışmalarda çay tüketiminin kalp krizi, koroner kalp

hastalıkları, bazı kanserler ve karaciğer rahatsızlıkları riskini azalttığı

gösterilmiştir. Japon kadınlarında günde 5 bardak ya da daha çok çay içilmesi

meme kanseri riskini azalttığı gösterilmiştir. Yapılan çalışmalarda çay

tüketiminin osteoporoza karşı koruyucu olduğu gösterilmiştir (Uysal, 2012).

Epidemiyolojik çalışmalar Akdeniz diyetinin kardiovasküler hastalıkların ve

bazı kanser türlerinin görülme oranındaki düşüklükle bağlantılı olduğunu

göstermiştir. Palmerini vd. (2005), Akdeniz diyetindeki fenoliklerin antioksidan

özelliklere sahip ve serbest radikalleri süpürdüğünü rapor etmişlerdir. Akdeniz

diyeti; fenolik bileşikler gibi hastalıkların önlenmesinde önemli rol oynayan

antioksidanların varlığına bağlı olarak sağlık açısından önemlidir.

Resveratrol, kolesterol düşürücü, antiviral, antimikrobiyal, antikansorejen,

antioksidan gibi pek çok özelliğe sahiptir. 1992 yılında kalp-damar

hastalıklarının sıklığı ile şarap tüketimi arasındaki ters orantıyı gösteren

epidemiyolojik çalışmaların sayısında da belirgin bir artış olmuştur. Şarap

içindeki aktif bileşiğin resveratrol olduğu anlaşılmıştır. Araştırmalara göre,

resveratrol iyi kolesterol HDL’yi arttırıyor, kötü kolesterol LDL’nin damar

duvarındaki olumsuz etkilerini azaltıyor (Frémont, 2000).

9

Epikateşin’nin tansiyon düşürücü, damar endotelini geliştirme, platelet

reaktifitesini azaltma, insülin hassasiyetini geliştirme ve anti-inflamatuvar gibi

etkileri bulunmaktadır (Uysal, 2012).

Pierson ve Reddy (1982), bazı fenoliklerin (Gallik asit, p-hidroksibenzoik asit

esterleri gibi) Clostridium botulinum A ve B tipine karşı etkili olduğunu

saptamışlardır. Hidroksisinnamik asitlerde uygun koşullarda antimikrobiyal

etki göstermektedir. Örneğin p-kumarik asitin 100 ppm derişimde,

Saccharomyces cerevisia lag fazını uzatmaktadır. Ferulik asit 250 ppm derişimde

Saccharomyces cerevisia’yı inhibe etmektedir.

Yaban mersininin etanolik özütünün Saccharomyces bayanas ve Pseudomonas

fluorescens üzerine antimikrobiyal etki gösterdiği saptanmıştır. Yaban

mersinindeki bu etkinin prosiyanidinler, flavonoller ve benzoik asitten

kaynaklandığı anlaşılmıştır (Ceylan vd., 2017).

Bitkisel gıdalardaki bazı flavonoitlerin antiviral aktivitelerinden de söz

edilmektedir. Örneğin çilek tanenleri polio ve herpes virüslerini inaktif

edebilmektedir. Kırmızı şaraptaki kuarsetin ve diğer flavonoitler virüslerin

geniş bir oranını inaktif edebilir. Kuarsetin ayrıca akciğer kanser riskini azaltır

(Nizamlıoğlu ve Nas, 2010).

Koroner kalp hastalıkları batı toplumlarında başta gelen ölüm sebeplerindendir.

Arteriosklerozisin kökeni okside olmuş düşük yoğunluklu lipoprotein nedeniyle

olabileceğidir. Fenolik maddeler LDL peroksidasyonunu önlemektedir. Üzüm ve

şarapta bulunan fenolik bileşiklerin insanda kötü kolesterol olarak bilinen

LDL’yi düşürdüğünün tespit edilmesi tıp ve eczacılıkta büyük önem

taşımaktadır (Uysal, 2012).

Antosiyaninler, arterioskleroz, kanser riskini azaltma, kan dolaşımı

bozukluklarında ve bazı göz hastalıklarında tedavi edici niteliği bulunduğu

ortaya konulmuştur. Nar suyunun delfinidin, siyanidin, pelargonidin gibi

antosiyanidinlerden dolayı yüksek antioksidan kapasitesine sahip olduğu

bilinir. Nar damar üzerindeki hasrı engelleme, prostat kanseri ve kireçlenmeyi

önleme, ishal durdurma, normal oranda kan glikoz seviyesini koruma, doğal

10

tümörleri inhibe eden hücre kapasitelerinin arttırılması gibi etkileri sonucu

popülerdir. Aynı zamanda AIDS ve iltihaplanmaya karşı etkili olduğu

bulunmuştur. Proantosiyanidinleri ve kateşin gibi fenolik bileşikleri içeren

kızılcık ve kuşburnu antioksidan ve kanser önleyici etkileri yanında kabızlık

giderici, bağışıklık sistemini geliştirici, kilo verici ve kolesterolü düşürücü etkiye

de sahiptir (Başer, 2002).

Ülkemizde de yetişmekte olan sarı kantaron (Hypericum perforatum) bitkisinde

%6.5-15 arasında bulunan tanenlerin; antioksidan, antimikrobiyal ve antiviral

etkiye sahip oldukları bildirilmiştir. Türkiye’de bulunan 25 kadar söğüt (Salix)

türünün kurutulmuş dal kabuklarından elde edilen söğüt kabuğu %15 civarında

tanen içermekte olup yatıştırıcı, kuvvet verici, ateş düşürücü ve antiromatizmal

etkilere sahiptir (Nizamlıoğlu ve Nas, 2010).

Kansere karşı koruyucu yiyecekler; soya fasulyesi, greyfurt, nar, domates,

karnabahar ve soğandır. İki fincan siyah çay, 1 bardak kırmızı şarap, 7 bardak

portakal suyu, 20 bardak elma suyuna eşdeğerdir (Uysal, 2012).

Ulusal Kanser Enstitüsüne göre; 2-6 yaş arası çocuklar günlük 5 porsiyon

fenolik bileşikler yönünden zengin sebze ve meyve tüketmelidir. 6 yaşından

büyük çocuklar, aktif bayanlar ve 13-19 yaş arasındakiler 7 porsiyon sebze ve

meyve tüketmelidir. 13-19 yaş arası aktif erkek çocuklar ve adamlar günlük 9

porsiyon fenolik bileşikler yönünden zengin sebze ve meyve tüketmelidir

(Nizamlıoğlu ve Nas, 2010).

Dünya kanser araştırma fonu (WCRF) 217 çalışma üzerindeki gözlemlerini

yayınlamışlardır. Kanıtlar fenolik bileşikler yönünden zengin meyve ve sebze

tüketiminin kansere karşı koruduğunu göstermektedir. Çalışmaların %69-80

polifenoller yönünden zengin sebzelerin kansere karşı koruduğunu buldular.

:alışmaların %64’ü ise, polifenoller yönünden zengin meyvelerin kansere karşı

koruduğunu buldular. Yapılan çalışmalar meyve ve sebzelerden zengin diyetin

(Günlük 400 gramdan fazla) kanser riskini yaklaşık olarak %20 azaltabileceği

gösterilmiştir (Nizamlıoğlu ve Nas, 2010; Uysal, 2012).

11

Polifenollerin sağlığa olumlu etkilerinden yararlanmak için hayat tarzı haline

getirilen ömür boyu uygulanacak beslenme alışkanlıkları esas alınmalıdır.

Önemli olan koruyucu, önlem alıcı veya önleyici beslenme alışkanlıklarıdır. Bu

bileşiklerin bulunduğu meyveler birkaç kerelik yeme ile ilaç etkisi veya tedavi

edici etki yaratmayacaktır.

Gıda bileşeni olarak fenolik bileşikler; insan sağlığı açısından işlevleri, tat ve

koku oluşumundaki etkileri, renk oluşumu ve değişimine katılmaları,

antimikrobiyal ve antioksidatif etki göstermeleri ve enzim inhibisyonuna neden

olmaları gibi birçok açıdan önem taşımaktadır.

12

3. MATERYAL VE YÖNTEM

3.1. Materyaller

3.1.1. Çözücüler ve kimyasallar

Demir (II) klorür, Folin–Ciocalteu’s reaktifi (FCR) ve metil alkol E. Merck

(Darmstadt, Germany)’den; 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH), 5,5-ditiyo-bis-2-

nitrobenzoik asit (DTNB), AChE (Type-VI-S, EC 3.1.1.7), BChE (EC 3.1.1.8), 3,4-

dihidroksi-L-fenilalanin (L-DOPA), tirozinnaz, asetiltiyokolin iyodür (ATCI),

bütiriltiyokolin klorür (BTCl) ve fenolik standartlar Sigma (St. Louis, MO)’den

temin edildi. Kullanılan diğer tüm kimyasallar ve çözücüler analitik saflıktadır.

3.1.2. Bitkisel materyallerin toplanması ve teşhis edilmesi

Bituminaria bituminosa bitkisi (Şekil 3.1), 24 Haziran 2015 tarihinde

Kahramanmaraş ili Andırın ilçesi Gökçeli köyü Sarımsak dağından toplandı (906

m, 37°33'21.00"K 36°21'53.00"D, Herbaryum No: MUH 2114). Bitkinin

taksonomik tanımlaması Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi, Fen Fakültesi,

Biyoloji Bölümü Botanik Anabilim Dalı Öğretim elemanı Uzman Dr. Olcay

CEYLAN tarafından yapıldı. Bitkinin toprak üstü kısımları (Bitkinin çiçek, dal ve

yapraklarını kapsayan ve toprak üstünde kalan kısımları) gölgede

kurutulduktan sonra çözücü özütlerinin hazırlanmasında kullanılmak üzere

blendır ile parçalanarak küçük tane boyutuna getirildi.

Şekil 3.1. Tez çalışmasında kullanılan Bituminaria bituminosa bitkisi

13

3.2. Yöntemler

3.2.1. Çözücü özütleme yöntemleri

B. bituminosa bitkisi çözücü özütlerinin elde edilmesinde farklı polariteye sahip

çözücüler tercih edilerek aşağıdaki şekilde özütleme işlemi uygulandı

(Sarikurkcu vd., 2014):

1. Etil asetat özütlemesi: Kurutulmuş ve belli bir tane boyutuna getirilmiş

bitki örneklerinin 20 gramı sohxlet haznesine yerleştirildi ve etil asetat

ile 5 saat sohxlet özütlemesi uygulandı. Özütler beyaz bant süzgeç

kağıdından süzüldükten sonra çözücü vakum altında döner

buharlaştırıcıda 40 C’de uzaklaştırıldı ve özütler analiz edilinceye kadar

+4 C’de saklandı (Şekil 3.2).

2. Metil alkol özütlemesi: Kurutulmuş ve belli bir tane boyutuna getirilmiş

bitki örneklerinin 20 gramı sohxlet haznesine yerleştirildi ve bu kez

metil alkol ile 5 saat sohxlet özütlemesi uygulandı. Özütler beyaz bant

süzgeç kağıdından süzüldükten sonra çözücü vakum altında döner

buharlaştırıcıda 40 C’de uzaklaştırıldı ve özütler analiz edilinceye kadar

+4 C’de saklandı (Şekil 3.2).

3. Su özütlemesi: Kurutulmuş ve belli bir tane boyutuna getirilmiş bitki

örneklerinin 20 gramı 500 ml kaynar saf su ile 30 dakika muamele edildi.

Özütler beyaz bant süzgeç kağıdından süzüldükten sonra -18 C’de

donduruldu. Daha sonra -50 C’de liyofilize (suyu uzaklaştırıldı) edildi

ve analiz edilinceye kadar +4 C’de saklandı (Şekil 3.3).

Etil asetat ve metil alkol özütleri tekrar metil alkolde çözündürüldü ve beyaz

bant süzgeç kağıdından süzülerek 2 mg/ml derişimde stok çözeltiler hazırlandı.

Su özütü ise saf suda çözündürüldü ve bu özütten de 2 mg/ml derişimde stok

çözelti hazırlandı. Tüm testlerde hazırlanan bu çözeltiler kullanıldı.

14

Şekil 3.2. Etil asetat ve metil alkol özütlerinin hazırlanma aşamaları

Şekil 3.3. Su özütünün hazırlanma aşamaları

15

3.2.2. Bitki özütlerinin fenolik ve flavonoit içeriklerinin belirlenmesi

3.2.2.1. Toplam fenolik bileşik miktarının belirlenmesi

Özütlerin toplam fenolik bileşik miktarları Folin-Ciocalteu Reaktifi (FCR)

kullanılarak gallik asit eşdeğer olarak belirlendi (Sarikurkcu vd., 2013; Zengin

vd., 2014). İçerisinde özüt çözeltisi (0.25 ml) bulunan test tüplerine FCR reaktifi

(1 ml, 1:9 seyreltilmiş) ilave edildi ve 3 dakika sonrada bu karışıma Na2CO3

çözeltisi (0.75 ml, %1) eklendi. Son karışım 2 saat süresince oda sıcaklığında

inkübasyona bırakıldı ve ara sıra çalkalandı. Özütlerin 760 nm’deki absorbans

ölçümleri yapıldı ve toplam fenolik bileşik miktarları, Şekil 3.4’deki standart

gallik asit grafiğinden elde edilen aşağıdaki eşitlik kullanılarak gallik asit

eşdeğer olarak hesaplandı (µmol GAEs/ g kuru bitki).

Absorbans=7.2412 [µmol gallik asit] - 0.0124 (R² = 0.9991)

Şekil 3.4. Standart gallik asit derişim-absorbans grafiği

3.2.2.2. Toplam flavonoit bileşik miktarının belirlenmesi

Özütlerin toplam flavonoit bileşik miktarları AlCl3 yöntemiyle belirlendi

(Sarikurkcu vd., 2013; Zengin vd., 2014). İçerisinde özüt çözeltisi (1 ml) bulunan

test tüplerine metil alkolde hazırlanmış AlCl3 çözeltisi (1 ml, %2) ilave edildi ve

y = 7.2412x - 0.0124R² = 0.9991

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0.00 0.03 0.06 0.09 0.12

Ab

sorb

an

s (7

60

nm

)

Derişim (µmol)

16

oda sıcaklığında 10 dakika inkübasyona bırakıldı. Kör örnek olarak özüt

çözeltisi (1 ml) ve metil alkol (1 ml) içeren bir karışım hazırlandı. Örneklerin

415 nm’deki absorbans ölçümleri yapıldı. Örneklerin flavonoit bileşik

miktarları, örnekler için ölçülen absorbans değerlerinden her bir özüt için

hazırlanan kör karışıma ait absorbans değerleri çıkartılarak ve Şekil 3.5’teki

standart rutin grafiğinden elde edilen aşağıdaki eşitlik kullanılarak rutin

eşdeğer olarak hesaplandı (µmol REs/ g kuru bitki):

Absorbans=22.426 [µmol rutin] - 0.0204 (R² = 0.9993)

Şekil 3.5. Standart rutin derişim-absorbans grafiği

3.2.2.3. Fenolik ve flavonoit içeriklerinin RP-HPLC ile belirlenmesi

B. bituminosa bitkisi çözücü özütlerinin fenolik bileşik miktarları ters faz yüksek

performanslı sıvı kromotografisiyle (RP-HPLC, Shimadzu Scientific Instruments,

Tokyo, Japan) tespit edildi. Fenolik bileşiklerin belirlenmesi ve miktarlarının

tayin edilmesinde LC-10ADvp pompa, Diod Array Detektör, CTO-10Avp kolon

ısıtıcı, SCL-10Avp system kontrolörü, DGU-14A degazör ve SIL-10ADvp

otomatik örnekleyici (Shimadzu Scientific Instruments, Columbia, MD)

kullanılarak belirlendi. Ayırımlar 30 C’de Agilent® Eclipse XDB C-18 ters faz

kolon (250 mm x4.6 mm, 5 µm tanecik boyut) üzerinde gerçekleştirildi. Elüatlar

y = 22.426x - 0.0204R² = 0.9993

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10

Ab

sorb

an

s (4

15

nm

)

Derişim (µmol)

17

280 nm’de tespit edildi. İki farklı mobil faz kullanıldı. Bunlardan A: %3’lük

asetik asit ve B: Metil alkoldür. Analiz için örnekler metil alkol içerisinde

çözündürüldü ve bu çözelti (20 µl) kolona enjekte edildi. 0.8 ml/dk akış hızında

Çizelge 3.1’deki elüsyon gradient programı uygulandı.

(-)-Epikateşin, (+)-kateşin, apigenin, benzoik asit, kafeik asit, klorojenik asit,

eriyodiktiol, ferulik asit, gallik asit, hesperidin, kamferol, luteolin, o-kumarik

asit, p-kumarik asit, p-hidroksibenzoik asit, protokateşik asit, kuarsetin,

rosmarinic asit, rutin, sinapinik asit, şiringik asit, trans-sinnamik asit ve vanillin

içeren toplam 23 fenolik bileşik standart olarak kullanıldı. Özütlerdeki fenolik

bileşiklerin tanımlanması ve miktarlarının belirlenmesi, standartlarla

karşılaştırma yapılarak tespit edildi (Sarikurkcu vd., 2014; Üren, 2015).

Özütlerin içerdiği her bir fenolik bileşik miktarı, ilgili fenolik standarttan elde

edilen kalibrasyon grafiği kullanılarak hesaplandı (µg/g kuru bitki). Analizde

kullanılan standart fenoliklere ait analitik karekteristikler Çizelge 3.2’ de verildi.

Ayrıca fenolik standartların RP-HPLC kromatogramı EKLER kısmında Şekil

A.1’de verildi.

Çizelge 3.1. B. bituminosa özütlerindeki fenolik bileşiklerin HPLC programı

Süre (dk)

Derişim A (%3 Asetik asit)

Derişim B (Metil alkol)

0.01 100 -

0.10 93 7

20.0 72 28

28.0 75 25

35.0 70 30

50.0 70 30

60.0 67 33

62.0 58 42

70.0 50 50

73.0 30 70

75.0 20 80

80.0 100 -

81.0 93 7

18

Çizelge 3.2. Standart fenolik bileşiklere ait analitik karakteristikler

No Alıkonma zamanı (dk)

Fenolikler ve Flavonoitler

Analitik karakteristikler

Linearite (mg/L)

r² LOD (mg/L)

LOQ (mg/L)

1 5.2 Gallik asit 0.20-25.0 0.9993 0.075 0.227 2 8.7 Protokateşik asit 0.20-25.0 0.9991 0.086 0.260 3 12.3 (+)-Kateşin 0.90-113 0.9988 0.172 0.522 4 13.5 p-Hidroksibenzoik asit 0.20-25.0 0.9994 0.007 0.020 5 15.1 Klorojenik asit 0.35-45.0 0.9988 0.080 0.241 6 17.6 Kafeik asit 0.16-21.0 0.9993 0.054 0.162 7 19.1 (-)-Epikateşin 0.50-66.0 0.9990 0.170 0.514 8 19.9 Şiringik asit 0.05-12.0 0.9995 0.030 0.090 9 20.8 Vanilin 0.08-10.0 0.9995 0.020 0.060 10 24.5 p-Kumarik asit 0.04-6.0 0.9996 0.066 0.199 11 27.8 Ferulik asit 0.12-17.0 0.9993 0.004 0.011 12 29.2 Sinapinik asit 0.12-17.0 0.9993 0.017 0.053 13 33.8 Benzoik asit 0.85-55.0 0.9998 0.111 0.335 14 39.4 o-Kumarik asit 0.24-32.0 0.9988 0.023 0.069 15 44.1 Rutin 0.40-56.0 0.9989 1.113 3.373 16 49.7 Hesperidin 0.43-55.0 0.9992 1.080 3.280 17 54.9 Rosmarinik asit 0.02-7.0 0.9998 0.148 0.447 18 57.3 Eriyodiktiol 0.33-21.0 0.9998 0.140 0.410 19 65.9 trans-Sinnamik asit 0.02-7.0 0.9998 0.148 0.447 20 71.4 Kuarsetin 0.40-55.0 0.9999 0.013 0.040 21 74.3 Luteolin 0.13-17.0 0.9999 0.020 0.060 22 76.8 Kamferol 0.05-15.0 0.9996 0.021 0.062 23 77.2 Apigenin 0.17-11.0 0.9997 0.034 0.104

3.2.3. Antioksidan kapasite tayin yöntemleri

3.2.3.1. Toplam antioksidan kapasitenin belirlenmesi

Örneklerin toplam antioksidan aktiviteleri fosfomolibdenyum yöntemiyle

belirlendi (Zengin vd., 2014; Üren, 2015). İçerisinde örnek çözeltisi (0.1 ml)

bulunan test tüplerine 3 ml reaktif çözeltisi (0.6 M sülfürik asit, 28 mM sodyum

fosfat ve 4 mM amonyum molibdat) ilave edildi. Test tüpleri 95 °C’de 90 dk

inkübe edildikten sonra oda sıcaklığına kadar soğutuldu ve köre karşı (kör, 3 ml

reaktif çözelti ve 0.1 ml çözücü içermektedir) 695 nm’deki absorbans ölçümleri

yapıldı. Örneklerin toplam antioksidan kapasiteleri standart troloks eşdeğer

(TEs) olarak hesaplandı (µmol TEs/g kuru bitki).

19

3.2.3.2. Serbest radikal süpürüm aktivitenin belirlenmesi

3.2.3.2.1. DPPH radikal süpürüm testi

Örneklerin serbest radikal giderim aktiviteleri 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil

(DPPH) serbest radikali kullanılarak belirlendi (Sarikurkcu, 2011; Zengin vd.,

2014; Üren, 2015). İçerisinde örnek çözeltisi (1 ml) bulunan test tüplerine metil

alkolde hazırlanmış DPPH çözeltisi (1 ml, 0.4 mM) ilave edildi. Kontrol için test

tüpüne özüt yerine 1 ml metil alkol/su konuldu. Örnekler oda sıcaklığında ve

karanlıkta 30 dakika inkübasyona bırakıldıktan sonra 517 nm’deki absorbans

ölçümleri yapıldı. Örneklerin DPPH radikalini süpürüm aktiviteleri troloks

eşdeğer olarak hesaplandı (µmol TEs/g kuru bitki).

3.2.3.2.2. ABTS radikal süpürüm testi

Bu testte ABTS.+ radikal katyonu, 7.4 mM ABTS çözeltisi ile 2.45 mM potasyum

persülfat çözeltisinin tepkimesiyle elde edildi. Bu karışımının 12-16 saat

karanlıkta bekletilerek aktif radikal oluşması sağlandı. Deneyden önce ABTS

katyon radikal çözeltisi, 734 nm’de absorbansı 1.381±0.020 olacak şekilde metil

alkol ile seyreltildi. Örnek çözeltilerinden 1 ml alındı ve 2 ml ABTS solusyonu ile

karıştırıldı. Tüpler ağızları kapalı bir biçimde oda sıcaklığında 30 dakika

bekletildikten sonra örneklerin 734 nm’deki absorbans ölçümleri yapıldı (Re

vd., 1999; Üren, 2015). Örneklerin ABTS katyon radikali süpürüm aktiviteleri

troloks eşdeğer olarak hesaplandı (µmol TEs/g kuru bitki).

3.2.3.3. İndirgeme gücünün belirlenmesi

3.2.3.3.1. CUPRAC testi

Örneklerin Cu2+/Cu+ indirgeme potansiyelleri literatürde belirtilen CUPRAC

yöntemiyle analiz edildi (Apak vd., 2006; Zengin vd., 2014; Üren, 2015).

İçerisinde örnek çözeltisi (0.5 ml) bulunan test tüplerine sırasıyla; CuCl2 (1 ml,

10 mM), amonyum asetat (1 ml, 1 M, pH:7.0) ve neokuproin (1 ml, 7.5 mM)

çözeltileri eklendi. Tüpler ağızları kapalı bir biçimde oda sıcaklığında karanlıkta

30 dakika bekletildikten sonra 450 nm’deki absorbans ölçümleri yapıldı.

20

Örneklerin CUPRAC indirgeme potansiyelleri troloks eşdeğer olarak hesaplandı

(µmol TEs/g kuru bitki).

3.2.3.3.2. FRAP testi

Örneklerin Fe3+/Fe2+ indirgeme potansiyelleri FRAP yöntemiyle belirlendi

(Zengin vd., 2014; Üren, 2015). Asetat tamponu (0.3 M, pH: 3.6), 40 mM HCl

içinde hazırlanan 2,4,6-tris(2-piridil)-s-triazin (TPTZ) (10 mM) ve FeCl3 (20

mM) çözeltilerinin hacimce 10:1:1 oranında karıştırılması ile oluşturulan FRAP

reaktifi (2 ml), içerisinde örnek çözeltisi (0.1 ml) bulunan test tüplerine eklendi

ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübasyona bırakıldı. Karışımların 593 nm’deki

absorbans ölçümleri yapıldı. Örneklerin FRAP indirgeme potansiyelleri troloks

eşdeğer olarak hesaplandı (µmol TEs/g kuru bitki).

3.2.3.4. Şelatlama kapasitesinin belirlenmesi

Örneklerin Fe2+ iyonlarını şelatlama kapasiteleri literatürde belirtilen yönteme

göre belirlendi (Zengin vd., 2014; Üren, 2015). İçerisinde özüt çözeltisi (2 ml)

bulunan test tüplerine FeCl2 (0.05 ml, 2 mM) çözeltisi ilave edildi. Tepkime

ferrozin (0.2 ml, 5 mM) ilavesiyle başlatıldı. Karışım karıştırıldıktan sonra oda

sıcaklığında 10 dakika inkübasyona bırakıldı. Ferrozin yerine metil alkol/su (0.2

ml) kullanılarak herbir örnek için kör numune hazırlandı. Daha sonra hem kör

hem de örneklerin 562 nm’deki absorbans ölçümleri yapıldı. Örneklerin

şelatlama kapasiteleri örnekler için ölçülen absorbans değerlerinden her bir

örnek için hazırlanan kör karışıma ait absorbans değerleri çıkartılarak

etilendiamin tetra asetik asit disodyum (EDTA) tuzu eşdeğer olarak hesaplandı

(µmol EDTAEs/g kuru bitki).

3.2.4. Enzim inhibisyon kapasite tayin yöntemleri

3.2.4.1. Kolinesteraz inhibisyon aktivitenin belirlenmesi

Kolinesteraz inhibisyon aktivite testleri Ellman yöntemi kullanılarak 96

kuyucuklu mikroplakalarda gerçekleştirildi (Ellman vd., 1961; Kocak, 2016).

İçerisinde örnek çözeltisi (50 µl) bulunan mikroplaka kuyucuklarına 125 µl

DTNB (5,5-Ditiyo-bis(2-nitrobenzoik) acid), 25 µl asetiltiyokolin iyodür (ATCI)

21

veya butiriltiyokolin iyodür (BTCI) çözeltisi ilave edildi. Daha sonra bu karışıma

tris-HCl tamponunda (pH: 8.0) hazırlanmış 25 µl asetilkolin esteraz (AChE) veya

bütirilkolin esteraz (BChE) enzim çözeltisi eklendi. Enzim çözelsisi yerine tris-

HCl tamponu kullanılarak herbir örnek için kör numune hazırlandı. Tüm

örnekler 25 C sıcaklıkta 15 dakika inkübasyona bırakıldıktan sonra hem kör

hem de örneklerin 405 nm’deki absorbans ölçümleri yapıldı. Örneklerin

asetilkolin esteraz ve bütirilkolin esteraz inhibisyon aktiviteleri örnekler için

ölçülen absorbans değerlerinden her bir örnek için hazırlanan kör karışıma ait

absorbans değerleri çıkartılarak galantamine eşdeğer olarak hesaplandı (µmol

GALAEs/g kuru bitki).

3.2.4.2. Tirozinaz inhibisyon aktivitenin belirlenmesi

Tirozinaz inhibisyon aktivite testleri L-DOPA molekülünün substrat olarak

kullanıldığı dopakrom yöntemiyle 96 kuyucuklu mikroplakalarda

gerçekleştirildi (Orhan vd., 2014; Kocak, 2016). İçerisinde örnek çözeltisi (25 µl)

bulunan mikroplaka kuyucuklarına 100 µl fosfat tamponu (pH:6.8) ve bu

tamponda hazırlanmış 40 µl trozinaz enzim çözeltisi ilave edildi. Enzim çözeltisi

yerine fosfat tamponu kullanılarak herbir örnek için kör numune hazırlandı.

Tüm örnekler 25 C sıcaklıkta 15 dakika inkübasyona bırakıldıktan sonra hem

kör hem de örneklerin 492 nm’deki absorbans ölçümleri yapıldı. Örneklerin

trozinaz inhibisyon aktiviteleri örnekler için ölçülen absorbans değerlerinden

her bir örnek için hazırlanan kör karışıma ait absorbans değerleri çıkartılarak

kojik asit eşdeğer olarak hesaplandı (µmol KAEs/g kuru bitki).

3.2.4.3. α-Amilaz inhibisyon aktivitenin belirlenmesi

α-Amilaz inhibisyon aktivite testleri Caraway-Somogyi iyot/potasyum iyodür

(I2/KI) yöntemi kullanılarak 96 kuyucuklu mikroplakalarda gerçekleştirildi

(Zengin vd., 2014; Kocak, 2016). İçerisinde örnek çözeltisi (25 µl) bulunan

mikroplaka kuyucuklarına 50 µl nişasta çözeltisi ve fosfat tamponunda (pH: 6.9)

hazırlanmış 25 µl α-amilaz çözeltisi ilave edildi. Enzim çözelsisi yerine fosfat

tamponu kullanılarak herbir örnek için kör numune hazırlandı. Tüm örnekler

25 C sıcaklıkta 15 dakika inkübasyona bırakıldıktan sonra tüm örnekler

22

üzerine 25 µl HCl çözeltisi (1 M) eklenerek tepkime durduruldu. Daha sonra tüm

örnekler üzerine 100 µl iyot-potasyum iyodür çözeltisi (I2/KI) eklenerek hem

kör hem de örneklerin 630 nm’deki absorbans ölçümleri yapıldı. Örneklerin α-

amilaz inhibisyon aktiviteleri örnekler için ölçülen absorbans değerlerinden her

bir örnek için hazırlanan kör karışıma ait absorbans değerleri çıkartılarak

akarboz eşdeğer olarak hesaplandı (µmol ACEs/g kuru bitki).

3.2.4.4. α-Glukozidaz inhibisyon aktivitenin belirlenmesi

α-Glukozidaz inhibisyon aktivite testleri PNPG (4-nitrofenil-α-D-glukopiranozit)

molekülünün substrat olarak kullanıldığı bir yöntemle 96 kuyucuklu

mikroplakalarda gerçekleştirildi (Sarikurkcu vd., 2014; Kocak, 2016). İçerisinde

örnek çözeltisi (50 µl) bulunan mikroplaka kuyucuklarına 50 µl glutatyon, 50 µl

PNPG ve fosfat tamponunda (pH: 6.9) hazırlanmış 50 µl α-glukozidaz çözeltisi

ilave edildi. Enzim çözeltisi yerine fosfat tamponu kullanılarak herbir örnek için

kör numune hazırlandı. Tüm örnekler 25 C sıcaklıkta 15 dakika inkübasyona

bırakıldıktan sonra üzerlerine 50 µl Na2CO3 (0.2 M) eklenerek hem kör hem de

örneklerin 400 nm’deki absorbans ölçümleri yapıldı. Örneklerin α-glukozidaz

inhibisyon aktiviteleri örnekler için ölçülen absorbans değerlerinden her bir

örnek için hazırlanan kör karışıma ait absorbans değerleri çıkartılarak akarboz

eşdeğer olarak hesaplandı (µmol ACEs/g kuru bitki).

3.3. İstatistiksel Hesaplamalar

Bütün testler üç tekrarlı deneyler yapılarak gerçekleştirildi ve sonuçlar üç

tekrarlı deneylerin ortalaması ve standart sapması olarak verildi. Sonuçlar

arasındaki anlamlılık testleri SPSS v22. programı kullanılarak ANOVA varyans

analizi yardımıyla %95 güven aralığı seçilmek suretiyle (α=0.05) Tukey testiyle

belirlendi. Testler arasındaki korelasyon analizleri Pearson korelasyon testi

kullanılarak gerçekleştirildi.

23

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA

4.1. Bitki Çözücü Özüt Verimleri

Öncelikli olarak B. bituminosa bitkisinden farklı polaritede çözücüler

kullanılarak özütler hazırlandı. Özütleme işlemlerinde çözücü olarak etil asetat,

metil alkol ve su kullanıldı. Etil asetat ve metil alkol özütlemesi sohxlet

aparatıyla yapılırken; su özütlemesi demleme yöntemiyle gerçekleştirildi.

Çözücü özüt verimleri Şekil 4.1’de verildi. En yüksek özütleme verimi su

(%8.70) ile elde edilirken en düşük verim etil asetat (%1.19) çözücüsünden

sağlandı. Metil alkol özüt verimi ise %4.10 olarak tespit edildi.

Şekil 4.1. B. bituminosa bitkisi çözücü özüt verimleri

4.2. Özütlerin Toplam Fenolik ve Flavonoit İçerikleri

Fenolik ve flavonoit türü bileşikler kimyasal yapılarında hidroksil grupları

bulundurmaktadırlar. Bu nedenle, bu bileşikler kolaylıkla hidrojen radikali

verebilirler ve bu durum kendilerine radikal süpürme özelliği kazandırmaktadır

ve antioksidan aktiviteye doğrudan katkı sağlamaktadırlar.

Özütlerin toplam fenolik ve flavonoit içerikleri arasında istatistiksel olarak

anlamlı bir farklılık gözlendi (p<0.05). Toplam fenolik bileşik açısından su

1.19

4.10

8.70

0

2

4

6

8

10

Etil asetat Metil alkol Su

Ve

rim

(%

, w/

w)

24

özütünün (31.70 µmol GAEs/g kuru bitki), toplam flavonoit bileşik açısından ise

metil alkol özütünün (5.29 µmol REs/g kuru bitki) diğer özütlere oranla daha

zengin olduğu tespit edildi (Şekil 4.2, 4.3).

Şekil 4.2. B. bituminosa özütlerinin toplam fenolik bileşik içerikleri

Şekil 4.3. B. bituminosa özütlerinin toplam flavonoit bileşik içerikleri

17.35c

24.79b

31.70a

0

7

14

21

28

35

Etil asetat Metil alkol Su

(µm

ol

GA

Es/

g k

uru

bit

ki)

0.31c

5.29a

3.17b

0

1

2

3

4

5

6

Etil asetat Metil alkol Su

(µm

ol

RE

s/g

ku

ru b

itk

i)

25

4.3. Özütlerin RP-HPLC ile Belirlenen Fenolik İçerikleri

B. bituminosa bitkisinin etil asetat, metil alkol ve su özütlerinde 23 adet fenolik

ve flavonoit türü bileşik RP-HPLC ile tespit edilmeye çalışıldı. Analiz sonuçları

Çizelge 4.3’te ve özütlere ait kromatogramlar ise, EKLER kısmında Şekiller B.1,

B.2 ve B.3’te verildi.

Çizelge 4.3’ten de görüldüğü gibi özütler içerisinde kafeik asit, klorojenik asit,

eriyodiktiol, ferulik asit, gallik asit, hesperidin, kamferol, luteolin, o-kumarik

asit, p-kumarik asit, p-hidroksibenzoik asit, protokateşik asit, sinapinik asit ve

vanillin bileşikleri tespit edilemedi. Sadece Şekil 4.4’te kimyasal formülleri

verilen (-)-epikateşin, apigenin, benzoik asit, kuarsetin, luteolin, rosmarinik asit,

rutin, şiringik asit ve trans-sinnamik asit belirlendi. Özütlerin ihtiva ettiği

fenolik bileşik miktarlarının istatistiksel olarak anlamlı farklılığa sahip olduğu

tespit edildi (p<0.05).

Şekil 4.4. B. bituminosa özütlerinde bulunan fenolik bileşiklerin yapıları

26

Etil asetat özütünün tüm tespit edilen fenolikler açısından diğer özütlere oranla

daha fakir olduğu görüldü. Su özütünün yüksek miktarda benzoik asit, luteolin,

kuarsetin, rutin, şiringik asit ve trans-sinnamik asit içerdiği tespit edildi

(sırasıyla; 152.68, 95.25, 98.05, 155.48, 50.43 ve 16.81 µg/g kuru bitki).

Bununla birlikte metil alkol özütünün (-)-epikateşin, apigenin ve rosmarinik asit

bakımından zengin olduğu görüldü (sırasıyla; 151.90, 90.09 ve 242.02 µg/g

kuru bitki). Ayrıca, özütlerin fenolik standartlar arasında rosmarinik asit

bakımında en yüksek miktarda olduğu belirlendi (Çizelge 4.3).

Çizelge 4.1. B. bituminosa özütlerinin HPLC analiz sonuçları

No Fenolikler ve Flavonoitler Derişim (µg/g kuru bitki) Etil asetat Metil alkol Su

1 Gallik asit* t** t t 2 Protokateşik asit t t t 3 (+)-Kateşin t t t 4 p-Hidroksibenzoik asit t t t 5 Klorojenik asit t t t 6 Kafeik asit t t t 7 (-)-Epikateşin t 151.90±14.14 t 8 Şiringik asit 1.98±0.05 c 40.63±0.18 b 50.43±2.83 a 9 Vanilin t t t 10 p-Kumarik asit t t t 11 Ferulik asit t t t 12 Sinapinik asit t t t 13 Benzoik asit 16.30±0.14 c 120.13±0.57 b 152.68±0.42 a 14 o-Kumarik asit t t t 15 Rutin 13.34±0.27 c 104.23±1.41 b 155.48±0.99 a 16 Hesperidin t t t 17 Rosmarinik asit 22.23±0.28 c 242.02±7.07 a 198.90±5.66 b 18 Eriyodiktiol t t t 19 trans-Sinnamik asit 2.96±0.28 c 7.07±0.85 b 16.81±0.71 a 20 Kuarsetin 17.29±0.98 c 68.90±3.54 b 98.05±2.83 a 21 Luteolin 8.90±0.07 c 37.10±0.28 b 95.25±4.24 a 22 Kamferol t t t 23 Apigenin 38.53±0.42 c 90.09±1.54 a 77.04±1.41 b

* Aynı satırdaki üstel farklı harfler, veriler arasındaki istatistiksel olarak anlamlı farklılığı göstermektedir (p < 0.05); ** t, tespit edilemedi

Yapılan literatür araştırmasına göre, B. bituminosa bitkisinin fitokimyası üzerine

daha önce çeşitli araştırma grupları tarafından incelemeler yapılmıştır. Bu

27

çalışmalara göre; furanokumarinler (angelisn ve psoralen) ve pterokarpanlar

(erybraine C, bitukarpin A) en göze çapan bileşiklerdir (Walker vd., 2012;

Tesauro vd., 2010; Pecetti vd., 2007; Maurich vd., 2006; Maurich vd., 2004;

Pistelli vd., 2003). Bu bileşiklere ilaveten yine bitkinin, flavonoitler, fenolik

asitler, lignanlar, saponinler ve uçucu bileşikler (çoğunlukla terpenoidler)

içerdikleri de bildirilmiştir (Llorent-Martinez vd., 2015; Azzouzi vd., 2014; Tava

vd., 2007).

4.5. Özütlerin Toplam Antioksidan Kapasitesiteleri

B. bituminosa bitkisi çözücü özütlerinin toplam antioksidan kapasiteleri

literatürde sıklıkla kullanılan fosfomolibdenyum yöntemleri kullanılarak

belirlendi. Bu yöntemin temelini, fosfomolibdenyum reaktifi içerisinde bulunan

Mo (VI) iyonlarının özütler içerisindeki antioksidan türler (indirgenler)

tarafından Mo (V)’e indirgenmesi oluşturmaktadır.

Şekil 4.5’te görüldüğü gibi, B. bituminosa bitkisi çözücü özütlerinin

fosfomolibdenyum yöntemiyle elde edilen toplam antioksidan aktiviteleri,

istatistiksel olarak anlamlı bir farklılıkla metil alkol (166.78 µmol TEs/g kuru

bitki)>su (153.01 µmol TEs/g kuru bitki)>etil asetat (112.42 µmol TEs/g kuru

bitki) şeklinde değiştiği tespit edildi (p<0.05).

Şekil 4.5. B. bituminosa özütlerinin toplam antioksidan aktiviteleri

112.42c

166.78a

153.01b

0

50

100

150

200

Etil asetat Metil alkol Su

(µm

ol

TE

s/g

ku

ru b

itk

i)

28

4.6. Özütlerin Serbest Radikal Süpürüm Kapasitesiteleri

B. bituminosa çözücü özütlerinin radikal süpürüm aktiviteleri, literatürde

sıklıkla tercih edilen 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) ve ABTS katyon

radikalleri kullanılarak belirlendi.

DPPH serbest radikal test sisteminde, oda sıcaklığında kararlı ve 517 nm’de

dalga boyu maksimumuna sahip olan DPPH serbest radikali, özütler varlığında

Şekil 4.6’daki tepkime gereğince özütlerdeki antioksidan türler tarafından

söndürülürler ve başlangıçtaki absorbansları tepkime süresince azalmaktadır

(Üren, 2015). Absorbanstaki bu azalmanın spektroskopik olarak takip

edilmesiyle çözücü özütlerinin DPPH serbest radikal süpürüm aktiviteleri

belirlendi ve sonuçlar standart troloks eşdeğer (TEs) olarak hesaplanarak Şekil

4.7’de verildi.

Şekil 4.6. DPPH serbest radikal süpürüm tepkimesi

Bu test sisteminde, su özütlerinin radikal süpürüm aktivitesi 29.41 μmol TEs/g

kuru bitki olarak hesaplandı. Bunu metil alkol ve etil asetat özütleri (sırasıyla;

14.08 ve 7.71 μmol TEs/g kuru bitki ) izledi. Şekil 4.7’den de açıkça görüleceği

üzere, su özütü, metil alkol özütününkinin 2 ve etil asetat özütünün 4 katı DPPH

serbest radikal süpürüm aktivite sergiledi. Bununla birlikte özütlerin radikal

süpürüm aktivitelerinin istatistiki olarak birbirinden farklı olduğu bulundu (p

<0.05).

29

Şekil 4.7. B. bituminosa özütlerinin DPPH radikal süpürüm aktiviteleri

B. bituminosa çözücü özütlerinin serbest radikal süpürüm aktivite testlerinin

belirlenmesinde ayrıca ABTS radikal katyon testi de yapıldı. ABTS katyon

radikali, Şekil 4.8’deki ABTS molekülü ile potasyum persülfatın tepkimesi

sonucu elde edildi ve radikalin absorbansı metil alkol/su ile seyreltilerek

0.7000 olacak şekilde ayarlandı ve testlerde bu şekliyle kullanıldı. Bu radikal

734 nm’de dalga boyu maksimumuna sahip olduğundan ortamda her hangi bir

antioksidan ya da antioksidan etkiye sahip bir tür bulunması durumunda ilgili

türlerden bir elektron alarak tekrar ABTS molekülüne dönüşmektedir. Özütler

varlığında, bu dönüşüm esnasında radikal sönecek ve absorbansta bir azalma

meydana gelmektedir. Bu azalmanın spektroskopik olarak takip edilmesiyle de

özütlerin ABTS katyon radikal süpürüm aktiviteleri belirlendi ve sonuçlar Şekil

4.9’da verildi.

Şekil 4.8. ABTS katyon radikal süpürüm tepkimesi

7.71c

14.08b

29.41a

0

7

14

21

28

35

Etil asetat Metil alkol Su

(µm

ol

TE

s/g

ku

ru b

itk

i)

30

Bu test sisteminde, su özütü (60.23 µmol TEs/g kuru bitki), ABTS katyon

radikali üzerinde oldukça kuvvetli bir süpürüm aktivite sergiledi. Daha sonra

bunu metil alkol özütü (59.68 μmol TEs/g kuru bitki) izledi. Metil alkol ve su

özütlerinin ABTS· + süpürüm potansiyelleri arasında istatistiksel olarak anlamlı

bir fark gözlenmedi (p> 0.05). Tıpkı DPPH serbest radikal testinde olduğu gibi,

etil asetat özütü en zayıf aktivite sergiledi (33.57 μmol TEs/g kuru bitki).

Şekil 4.9. B. bituminosa özütlerinin ABTS radikal süpürüm aktiviteleri

4.7. Özütlerin İndirgeme Gücü Kapasiteleri

Antioksidan kapasite tayin testlerinde indirgeme gücü kapasite belirleme

yöntemlerinin de kullanılması oldukça yaygındır. Literatürde indirgeme gücü

kapasitenin belirlenmesinde genellikle bakır(II) iyonunun kullanıldığı CUPRAC

ve demir(III) iyonunun kullanıldığı FRAP yöntemleri tercih edilmektedir. Bu

çalışmada da özütlere her iki test sistemi de uygulandı.

İndirgeme gücü kapasite belirlemede kullanılan yöntemlerin ilki olan CUPRAC

testinin esası özütler varlığında özütlerde bulunan indirgen türler tarafından

Cu(II)’nin Cu(I)’e indirgenmesine dayanmaktadır. CUPRAC metodunda Şekil

4.10’daki tepkime gereği, indirgen ajanların bakır(II)-neokuproin kompleksini

33.57b

59.68a 60.23a

0

10

20

30

40

50

60

70

Etil asetat Metil alkol Su

(µm

ol

TE

s/g

ku

ru b

itk

i)

31

bakır(I)-neukuproin kompleksine indirgenmesine bağlı olarak antioksidan

kapasite tayin edilmektedir (Üren, 2015).

Şekil 4.10. CUPRAC indirgeme gücü kapasite test tepkimesi

Diğer bir indirgeme gücü kapasitesi belirleme yöntemi ise FRAP yöntemidir. Bu

testte örnekler içerisindeki indirgenler aracılığıyla Şekil 4.11’deki tepkime

gereği Fe(III)-TPTZ kompleksi Fe(II)-TPTZ kompleksine indirgenerek koyu

mavi renkli bir bileşik oluşmaktadır. Yöntem, oluşan bu renkli kompleksin

absorbansının 593 nm’de ölçülmesi temeline dayanmaktadır.

Şekil 4.11. FRAP indirgeme gücü kapasite test tepkimesi

32

Bu çalışmada, CUPRAC ve FRAP yöntemleri kullanılarak B. bituminosa çözücü

özütlerinin indirgeme gücü kapasiteleri araştırıldı ve sonuçlar sırasıyla; Şekil

4.12 ve 4.13’te verildi.

Özütler her iki test sisteminde de benzer bir aktivite profili gösterdi. Su

özütünün hem CUPRAC hem de FRAP test sistemlerinde diğer özütlere nazaran

daha yüksek aktivite sergilediği tespit edildi (sırasıyla; 41.26 ve 46.82 µmol

TEs/g kuru bitki). Su özütünü metil alkol ve etil asetat özütleri izledi. Her iki test

sisteminden elde edilen veriler istatistiksel olarak anlamlı farklılık gösterdi (p

<0.05). Buna ilaveten FRAP testinde diğer özütlerin aksine su özütünün

indirgeme gücü kapasitesinin CUPRAC testindeki etkinliğinden biraz daha

yüksek olduğu görüldü (Şekil 4.12 ve 4.13).

Tıpkı DPPH serbest radikal süpürüm testinde olduğu gibi özellikle CUPRAC

testinde, su özütünün (41.26 µmol TEs/g kuru bitki) indirgeme gücü

kapasitesinin metil alkol (22.27 µmol TEs/g kuru bitki) özütününkinden 2 ve

etil asetat (10.96 µmol TEs/g kuru bitki) özütününkinden ise 4 kat daha fazla

olduğu belirlendi (p <0.05).

Şekil 4.12. B. bituminosa özütlerinin CUPRAC indirgeme gücü kapasiteleri

10.96c

22.27b

41.26a

0

10

20

30

40

50

Etil asetat Metil alkol Su

(µm

ol

TE

s/g

ku

ru b

itk

i)

33

Şekil 4.13. B. bituminosa özütlerinin FRAP indirgeme gücü kapasiteleri

4.8. Özütlerin Metal Şelatlama Kapasitesiteleri

Geçiş metallerinin radikal oluşumlarını katalitik olarak başlattığı

düşünüldüğünden antioksidan aktivitenin belirlenmesine yönelik çalışmalarda

örneklerin metal şelatlama kapasiteleri de tespit edilmektedir. Literatürde

sıklıkla örneklerin Cu(II) veya Fe(II) iyonları şelatlama yetenekleri

araştırılmaktadır. Bu tez çalışmasında da B. bituminosa çözücü özütlerinin

antioksidan aktivitelerini daha iyi değerlendirebilmek için Fe(II) iyonlarını

şelatlama yetenekleri de belirlendi. Bu yöntemin temelini Fe(II) iyonlarının

ferrozin molekülüyle olan kompleks oluşum tepkimesini örnekler içerisindeki

ilgili şelatlayıcı maddelerin ne derece inhibe ettiği üzerinedir (Şekil 4.14). Yani,

özüt içerisinde ne kadar çok şelatlayıcı ajan varsa Fe(II)-ferrozin kompleks

oluşumu o kadar az oluşacak ve buna bağlı olarak da o örneğin şelatlama

kapasitesi o derece yüksek olacaktır.

B. bituminosa çözücü özütlerinin Fe(II) iyonlarını şelatlama kapasiteleri Şekil 4.

15’te verildi. Şekilde de görülebileceği gibi, su özütü (9.63 µmol EDTAEs/g kuru

bitki) en yüksek metal şelatlama kapasitesine sahipken; etil asetat özütü ise, en

zayıf aktivite sergiledi (0.96 µmol EDTAEs/g kuru bitki). Özütlerin metal

7.02c

19.69b

46.82a

0

10

20

30

40

50

60

Etil asetat Metil alkol Su

(µm

ol

TE

s/g

ku

ru b

itk

i)

34

şelatlama kapasitelerinin istatistiksel olarak birbirinden farklı olduğu tespit

edildi (p <0.05).

Şekil 4.14. Fe(II)-ferrozin kompleks oluşum tepkimesi

Şekil 4.15. B. bituminosa özütlerinin Fe(II) iyonları şelatlama kapasiteleri

4.9. Özütlerin Enzim İnhibisyon Kapasitesiteleri

B. bituminosa özütlerinin asetilkolin ve bütirilkolin esteraz, trozinaz, α-amilaz ve

α-glukosidaz enzimleri üzerine inhibisyon aktiviteleri de araştırıldı.

0.96c

5.55b

9.63a

0

3

6

9

12

Etil asetat Metil alkol Su

(µm

ol

ED

TA

Es/

g k

uru

bit

ki)

35

Yapılan analizler sonucunda çözücü özütlerinin kolinesterazlar ve tirozinaz

enzimleri üzerinde herhangi bir inhibisyon etkisinin olmadığı tespit edilirken;

α-amilaz ve α-glukosidaz enzimleri üzerinde çeşitli derecelerde inhibisyon

aktivite sergilediği belirlendi. Özütlerin α-glukozidaz üzerindeki inhibisyon

aktivitesi, α-amilaz üzerindeki inhibitör aktivitelerinden daha yüksek bulundu.

Sonuçlar Şekil 4.16 ve 4.17’de verildi.

α-Amilaz inhibisyon testinde, etil asetat (53.65 µmol ACEs/g kuru bitki) özütü

en yüksek aktivite gösterdi (Şekil 4.16). Bunu sırasıyla metil alkol (53.65 µmol

ACEs/g kuru bitki) ve su (53.65 µmol ACEs/g kuru bitki) özütleri izledi

(p<0.05).

Bugüne kadar yaptığımız çalışmalardan edindiğimiz tecrübelere göre α-amilaz

inhibisyon testinde, düşük polar bileşiklere (örneğin etil asetat ve/veya aseton

özütleri) sahip özütler, polar fitokimyasalları ihtiva eden diğer özütlere kıyasla

daha fazla aktivite sergiledi. B. bituminosa bitkisi etil asetat özütünün α-amilaz

inhibisyon aktivitesinin yüksek oluşu daha yapılan çalışmalarla uyum içinde

olduğu söylenebilir (Sarikurkcu vd., 2015a; 2015b).

Şekil 4.16. B. bituminosa özütlerinin α-amilaz inhibisyon aktiviteleri

53.65a

42.64b

17.72c

0

10

20

30

40

50

60

Etil asetat Metil alkol Su

(µm

ol

AC

Es/

g k

uru

bit

ki)

36

Su özütünün (1233.86 µmol ACEs/g kuru bitki) α-glukozidaz inhibisyon

aktivitesi, istatistiksel olarak anlamlı bir farklılıkla diğer özütlere oranla daha

yüksek olarak tespit edildi (p<0.05). Benzer bir sonuç Sarikurkcu vd. (2015c)

tarafından da rapor edilmiştir. Bu çalışmada, Clinopodium vulgare subsp.

vulgare bitkisinin aseton, metil alkol ve su özütlerinin yüksek enzim inhibisyon

aktiviteye sahip oldukları belirlenmiştir. Dolayısıyla, polar fitokimyasalların α-

glukosidaz üzerinde apolar fitokimyasallara göre daha fazla inhibisyon

potansiyele sahip oldukları söylenebilir.

B. bituminosa çözücü özütlerinin enzim inhibisyon aktivitesi üzerine yapılan

literatür araştırmasında sadece tek bir çalışmaya rastlanmıştır (Tesauro vd.,

2010). Bu çalışmada, B. bituminosa’dan izole edilen doğal bir bileşik olan

eribraedin C'nin insan topoizomeraz I inhibisyon aktivitesi araştırılmıştır.

Ancak literatürde, bu türün kolinesterazlar, α-amilaz, α-glukosidaz ve tirozinaz

enzimleri üzerine herhangi bir rapora rastlanmamıştır. Dolayısıyla, bu bölümde

sunulan veriler, bu bitkiyle ilgili literatürün ilk kayıtları olarak kabul edilebilir.

Şekil 4.17. B. bituminosa özütlerinin α-glukozidaz inhibisyon aktiviteleri

566.96c 638.78b

1233.86a

0

300

600

900

1200

1500

Etil asetat Metil alkol Su

(µm

ol

AC

Es/

g k

uru

bit

ki)

37

4.10. Aktivite Testleri Arasındaki Korelasyon Katsayıları

Hem tüm aktivite testlerinden elde edilen veriler arasındaki tutarlılığı test

etmek hem de özütlerde tespit edilen fitokimyasalların bu testlerdeki

etkinliğinin belirlemek için Pearson korelasyon testleri uygulandı.

Öncelikle testler arasındaki korelasyonlar belirlendi ve sonuçlar Çizelge 4.4’te

verildi. Çizelgeden de görüleceği üzere, DPPH serbest radikal giderim aktivite ile

CUPRAC (R:0.996), FRAP (R:0.999, p<0.05), ve α-glukozidaz (R:0.982) enzim

inhibisyon aktivite; CUPRAC ile FRAP (R:0.998, p<0.05), şelatlama (R:0.984) ve

α-glukozidaz (R:0.961) enzim inhibisyon aktivite; FRAP ile şelatlama (R:0.971)

ve α-glukozidaz (R:0.976) enzim inhibisyon aktivite arasında güçlü pozitif bir

korelasyon tespit edildi.

Fosfomolibdat yöntemiyle antioksidan aktivite ve ABTS katyon radikal süpürüm

aktivite testleri ile diğer aktivite testleri arasında diğer testler arasındaki

korelasyonlara kıyasla yüksek bir korelasyon gözlenmedi (R<0.900). Sadece her

ikisi arasında bir pozitif yüksek korelasyon tespit edildi (R:0.965). Bununla

birlikte α-amilaz ile diğer tüm testler arasında negatif bir korelasyon gözlendi.

Gözlenen bu güçlü pozitif korelasyonlar; aralarında korelasyon bulunan

testlerdeki etkili olan antioksidan türlerin aynı olduğunu göstermektedir.

Çizelge 4.2. Aktivite testleri arasındaki korelasyon katsayıları (R) a

Testler Fosfomolibdat DPPH ABTS CUPRAC FRAP Selatlama α-Amilaz

DPPH 0.537 ABTS 0.965 0.739 CUPRAC 0.610 0.996 0.796 FRAP 0.560 0.999* 0.757 0.998* Selatlama 0.741 0.964 0.891 0.984 0.971 α-Amilaz -0.549 -0.999** -0.748 -0.997* -0.999** -0.968 α-Glukozidaz 0.367 0.982 0.597 0.961 0.976 0.896 -0.979 a Sunulan veriler Pearson korelasyon katsayısını (R) vermektedir

*Testler arasındaki anlamlı farklılığı göstermektedir (p<0.05)

**Testler arasındaki anlamlı farklılığı göstermektedir (p<0.01)

38

Testler üzerinde etkili olan bu antioksidan türlerin neler olduğunu bir başka

deyişle özütler içerisinde belirlenen fenolik ve flavonoit türü bileşiklerin bu

testler üzereinde ne derece etkili olduklarını tespit etmek amacıyla bu

bileşenler ile testler arasında yeniden bir Pearson korelasyon hesapları yapıldı

ve sonuçlar Çizelge 4.5’te verildi. Özütlerdeki toplam flavonoit bileşik miktarı ile

fosfomolibdenyum (R:0.982) ve ABTS (R:0.898) katyon radikal süpürüm

aktiviteleri arasında pozitif ve güçlü bir korelasyon gözlenirken; toplam fenolik

bileşik miktarı ile DPPH (R:0.968), CUPRAC (R:0.986), FRAP (R:0.974),

şelatlama (R:0.999, p<0.01) ve α-glukozidaz (R:0.902) enzim inhibisyon

aktivite arasında yine güçlü pozitif bir korelasyon tespit edildi. Özütlerde

bulunan fenolik ve flavonoit bileşikler arasında, apigenin, şiringik asit ve

rosmarinik asitin fosfomolibdenyum ve ABTS katyon radikal süpürüm testi

üzerinde oldukça etkili oldukları belirlendi (R değerleri sırasıyla; 0.999, p<0.01

ve 0.965; 0.905 ve 0.985; 0.998, p<0.05 ve 0.979). Rutin, trans-sinnamik asit,

kuarsetin, luteolin ve benzoik asit bileşiklerinin de DPPH, CUPRAC, FRAP,

şelatlama ve α-glukozidaz enzim inhibisyon aktivite testlerinde pozitif olumlu

katkılarının olduğu belirlendi (R>0.833). Özellikle trans-sinnamik asit-DPPH,

luteolin-FRAP, apigenin-fosfomolibdat ve toplam fenolik-şelatlama arasında

pozitif istatistiksel olarak anlamlı bir farlılıkla pozitif korelasyon belirlendi

(p<0.01). Benzer bir durum rosmarinik asit-fosfomolibdat, luteolin-DPPH,

luteolin-CUPRAC, trans-sinnamik asit-FRAP arasında da gözlendi (p<0.05).

39

Çiz

elge

4.3

. B. b

itu

min

osa

özü

tler

ind

e b

ulu

nan

fit

ok

imya

sall

ar il

e ak

tivi

te t

estl

eri

aras

ınd

aki k

ore

lasy

on

kat

sayı

ları

(R

) a

Fo

sfo

mo

lib

dat

0.8

89

0.5

67

0.8

19

0.5

40

0.8

20

0.9

98

*

0.9

05

0.9

99

**

0.7

33

0.9

82

a Su

nu

lan

ver

iler

Pea

rso

n k

ore

lasy

on

kat

say

ısın

ı (R

) ve

rmek

ted

ir

* Tes

tler

ara

sın

dak

i an

lam

lı f

ark

lılı

ğı g

öst

erm

ekte

dir

(p

<0

.05

) **

Tes

tler

ara

sın

dak

i an

lam

lı f

ark

lılı

ğı g

öst

erm

ekte

dir

(p

<0

.01

)

AB

TS

0.9

78

0.7

63

0.9

41

0.7

41

0.9

41

0.9

79

0.9

85

0.9

65

0.8

85

0.8

98

DP

PH

0.8

64

0.9

99

*

0.9

24

0.9

99

**

0.9

24

0.5

87

0.8

45

0.5

37

0.9

68

0.3

66

CU

PR

AC

0.9

05

0.9

99

*

0.9

54

0.9

96

0.9

54

0.6

56

0.8

89

0.6

10

0.9

86

0.4

47

FR

AP

0.8

78

0.9

99

**

0.9

34

0.9

99

*

0.9

34

0.6

09

0.8

59

0.5

60

0.9

74

0.3

92

Sela

tlam

a

0.9

67

0.9

73

0.9

92

0.9

65

0.9

92

0.7

80

0.9

56

0.7

41

0.9

99

**

0.6

00

α-G

luk

ozi

daz

0.7

53

0.9

74

0.8

34

0.9

81

0.8

34

0.4

22

0.7

27

0.3

67

0.9

02

0.1

83

α-A

mil

az

-0.8

71

-0.9

99

*

-0.9

29

-0.9

99

**

-0.9

29

-0.5

98

-0.8

52

-0.5

49

-0.9

71

-0.3

80

Fen

oli

k v

e F

lav

on

oit

ler

Ben

zoik

asi

t

Lu

teo

lin

Ku

arse

tin

tra

ns-

Sin

nam

ik a

sit

Ru

tin

Ro

smar

inik

asi

t

Şiri

ngi

k a

sit

Ap

igen

in

To

pla

m f

eno

lik

bil

eşik

To

pla

m f

lavo

no

it b

ileş

ik

40

5. SONUÇ VE ÖNERİLER

Bu tez çalışmasında Kahramanmaraş ili Andırın ilçesinden toplanan ve

Akdeniz'de yaygın olarak dağılım gösteren bir yıllık yabani baklagillerden olan

Fabaceae familyasına ait Bituminaria bituminosa bitkisinin etil asetat, metil

alkol ve su özütleri hazırlanarak bu özütlerin antioksidan ve enzim inhibisyon

aktiviteleri belirlendi. Bu bağlamda, özellikle antioksidan aktivite testlerinde tek

bir testle yetinilmeyip literatürde sıklıkla kullanılan testlerin birçoğu yapılarak

sonuçlar birlikte değerlendirildi. Aynı şekilde enzim inhibisyon aktivite

testlerinde de özütlerin, dünya çapında gittikçe yaygınlaşan Alzheimer

hastalığını tetikleyen kolinesterazlar, cilt-deri rahatsızlıklarına neden olan

trozinaz ve Tip 2 diyabet olarak adlandırılan şeker hastalıklarını tetikleyen α-

amilaz ve α-glukozidaz enzimlerinin inhibisyonları üzerindeki etkileri de

araştırıldı.

Yapılan analizler sonucunda, etil asetat özütünün α-amilaz enzim inhibisyon

aktivitesinin; metil alkol özütünün toplam flavonoit bileşik içeriğinin ve

fosfomolibdat yöntemiyle toplam antioksidan aktivitesinin; su özütünün ise

toplam fenolik içeriği ile DPPH, ABTS, CUPRAC, FRAP, şelatlama ve α-glukozidaz

enzim inhibisyon aktivitelerinin yüksek olduğu tespit edildi. Aynı zamanda bitki

özütlerinin antioksidan ve enzim inhibisyon aktivite testleri arasındaki

bağlantıyı belirlemek amacıyla Pearson korelasyon analizleri yapıldı. Özellikle

FRAP-DPPH (R:0.999) ve FRAP-CUPRAC (R:0.998) testleri arasında istatistiksel

olarak anlamlı pozitif güçlü bir korelasyon belirlendi (p<0.05). Benzer bir

durum fosfamolibdat yöntemiyle ABTS katyon radikal süpürük aktivite arasında

da gözlendi (R:0.965).

Bununla birlikte, özütler içerisindeki toplam fenolik ve flavonoit bileşikler önce

spektroskopik olarak daha sonrada bu bileşiklerin neler olduğunu tespit etmek

amacıyla RP-HPLC analizleri yapıldı. Özütlerin RP-HPLC analizlerinde, 23 farklı

fenolik ve flavonoit türü bileşik standart olarak kullanıldı. Bu bileşiklerden

apigenin, (-)-epikateşin, benzoik asit, kuarsetin, luteolin, rosmarinic asit, rutin,

şiringik asit ve trans-sinnamik asit özütlerde tespit edildi. Özütlerin genellikle

rosmarinik asit, rutin, benzoik asit ve kuarsetin bakımından zengin oldukları

41

belirlendi. Tespit edilen bu fenolik ve flavonoit türü bileşiklerin antioksidan ve

enzim inhibisyon aktivite testler üzerindeki etkilerini görmek amacıyla çözücü

özütlerinin Pearson korelasyon analizleri de yapıldı. Özellikle apigenin, şiringik

asit ve rosmarinik asitin fosfomolibdat ve ABTS testleri üzerinde etkili oldukları

tespit edildi. Diğer bileşiklerin ise α-amilaz testi hariç diğer testler de etkili

oldukları görüldü.

Tez çalışmasında değerlendirilen B. bituminosa bitkisi çözücü özütlerine yönelik

yapılan antioksidan ve enzim inhibisyon aktivite testlerinden elde edilen veriler

bu bitki üzerine bu konuda yapılmış ilk kayıtlar olarak litertürde yer alacaktır.

Yapılan analiz sonuçları birlikte değerlendirildiğinde özellikle metil alkol ve su

özütlerinin yüksek aktiviteye sahip oldukları görülmektedir. Ancak özütler

üzerinde bir toksitite analizleri yapılmadığından özütlerin bu şekilde

kullanılmasının doğru bir yaklaşım olmayacağı açıktır. Bu nedenle özellikle

özütler üzerinde toksitite analizlerinin ve imkan dahilinde in vivo şartlarda da

benzer aktivitelere sahip olup-olmadıklarının araştırılarak sonuçların birlikte

değerlendirilmesi daha doğru bir yaklaşım olacaktır.

42

KAYNAKLAR

Acar, Z., Ayan, İ., Gülser, C., 2001. Some Morphological and Nutritional Properties of Legumes under Natural Conditions. Pakistan Journal of Biological Sciences. 4(11), 1312-1315.

Akçin, A.A., Akçin, A., Kutbay, G., 2010. A Study on Flora of Çakmak Dam and its Surroundings (Çarşamba, Samsun/Turkey). Biological Diversity and Conservation, 3(1), 28-44.

Altun, M.L., Tanker, N., 2000. Psoralea bituminosa L. ve Psoralea acaulis Stev. Bitkilerinden Etken Bileşiklerin Kalitatif Analizi. Ankara Eczacılık Fakültesi Dergisi, 29(1), 1-8.

Apak, R., Guclu, K., Ozyurek, M., Karademir, S.E., Ercag, E., 2006. The Cupric Ion Reducing Antioxidant Capacity and Polyphenolic Content of Some Herbal Teas. International Journal of Food Sciences and Nutrition, 57, 292-304.

Azzouzi, S., Zaabat, N., Medjroubi, K., Akkal, S., Benlabed, K., Smati, F., Dijoux-Franca, M. G., 2014. Phytochemical and Biological Activities of Bituminaria bituminosa L. (Fabaceae). Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, 7, 481-484.

Baldemir, A., 2010. Türkiye'de Yetişen Endemik Ononis L. Türleri Üzerinde Farmasötik Botanik Yönünden Araştırmalar. Ankara Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, 243s, Ankara.

Başer, K.H.C., 2002. Fonksiyonel Gıdalar ve Nutrasötikler. 14. Bitkisel İlaç Hammaddeleri Toplantısı, 29-31 Mayıs 2002, Eskişehir, 29-31.

Baysal, T., Yıldız, H., 2003. Bitkisel Fenoliklerin Kullanım Olanakları ve İnsan Sağlığı Üzerine Etkileri. Gıda Mühendisliği Dergisi, 7(14), 29-35.

Bouque V. , Bourgaud F., Nguyen C., Guckert A., 1998. Production of Daidzein by Callus Cultures of Psoralea Species and Comparison with Plants. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 53, 35–40.

Ceylan, Ş., Saral, Ö., Özcan, M., Harşıt, B., 2017. Determination of Antioxidant and Antimicrobial Activities of Bilberry (Vaccinium myrtillus L.) Extracts in Different Solvents. Artvin Coruh University Journal of Forestry Faculty of Kastamonu University, 18(1), 21-27.

Çopuroğlu, M., 2015. Çözücü Prosesi ile Pamuk ve Haşhaş Saplarınının Özütlenmesi ve Fitokimyasal Olarak Karşılaştırılmalı Analizlerinin Yapılması. Doktora Tezi, Süleyman Demirel Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, 53s, Isparta.

43

Davis, P.H., Mill, C.D.F., Phill, D., Matthews, V.A., 1970. Flora of the Turkey and the East Aegean Islands, Ed.Davis P.H., 3, Edinburgh University Press, Edinburgh, 373-384.

Davis, P.H., 1965. Flora of Turkey and the East Aegean Islands. 1965-1988. 1(1965); 2 (1967); 3 (1970); 4 (1972); 5 (1975); 6 (1978); 7 (1982); 8 (1984); 9(1985);) Edinburgh University Press. Edinburgh.

Ellman, G.L., Courtney, K.D., Andres, V., Featherstone, R.M., 1961. A New and Rapid Colorimetric Determination of Acetylcholinesterase Activity. Biochemical Pharmacology, 7, 88–95.

Engin, K., Korkmaz, H., 1991. Bafra-Altınkaya Baraj Gölü Alanının Baraj Gövdesi Şahinkaya Boğazı Arasında Kalan Kesimin ve Yakın Çevresinin Florası. Ondokuz Mayıs Üniversitesi Fen Dergisi, 3(1), 278-309.

Erik, S., Tarikahya, B., 2004. Türkiye Florası Üzerine. Kebikeç, 17, 139–163.

Ertuğ, F., 2008. Anadolu'da Geçmişten Bugüne Baklagiller. I. Leguminosae Çalıştayı, 11-13 Nisan 2008, Şanlıurfa.

Frémont, L., 2000. Biological Effects of Resveratrol. Life Sciences, 66(8), 663-673.

Gülümser, E., 2011. Orta Karadeniz Bölgesinde Doğal Olarak Yetişen Bituminaria bituminosa L. (Syn. Psoralea bituminosa L.) Bitkisinin Tanımlanması ve Tarımsal Özelliklerinin Araştırılması. Ondokuz Mayıs Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, 86s, Samsun.

Hertog, M.G.L., Hollman, P.C.H., Katan, M.B., 1992. Content of Potentially Anticarcinogenic Flavonoids of 28 Vegetables and 9 Fruits Commonly Consumed in the Netherlands. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 40(12), 2379-2383.

Heywood, V.H., Brummitt, R.K., Culham, A., Seberg, O., 2007. Flowering Plant Families of The World, Firefly Books pres, Ontario, Canada, 185-188.

Kılınç, M., Kutbay, H.G., 1998. Samsun Kocadağ ve Çevresinin Florası. Ondokuz Mayıs Üniversitesi XIV. Ulusal Biyoloji Kongresi, 7-10 Eylül 1998, (1), 95-111.

Koçak, M.S., 2015. Üç Stachys Taksonun Bazı Biyolojik Aktivitelerinin Araştırılması. Süleyman Demirel Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Doktora Tezi, 105s, Isparta.

Langseth, L., 1995. Oxidants, Antioxidants, and Disease Prevention, ILSI Europe Brussels, 25s, Belgium.

Lewis, G., B. Schrire, B. Mackinder, M. Lock (eds), 2005. Legumes of the World. Royal Botanical Gardens, Kew, UK.

44

Llorent-Martinez, E.J., Spinola, V., Gouveia, S., Castilho, P.C., 2015. HPLC-ESI-MSn Characterization of Phenolic Compounds, Terpenoid Saponins, and Other Minor Compounds in Bituminaria bituminosa. Industrial Crops and Products, 69, 80-90.

Maurich, T., Iorio, M., Chimenti, D., Turchi, G., 2006. Erybraedin C and Bitucarpin A, Two Structurally Related Pterocarpans Purified from Bituminaria bituminosa, Induced Apoptosis in Human Colon Adenocarcinoma Cell Lines MMR- and p53-Proficient and -Deficient in a Dose-, Time-, and Structure-Dependent Fashion. Chemico-Biological Interactions, 159(2), 104-116.

Maurich, T., Pistelli, L., Turchi, G., 2004. Anti-Clastogenic Activity of Two Structurally Related Pterocarpans Purified from Bituminaria bituminosa in Cultured Human Lymphocytes. Mutation Research-Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 561 (1-2), 75-81.

Middleton, E. Kandaswami, C., 1994. Potential Health-Promoting Properties of Citrus Flavonoids. Food Technology, 48, 115-120.

Nizamlıoğlu, N.M., Nas, S., 2010. Meyve ve Sebzelerde Bulunan Fenolik Bileşikler; Yapıları ve Önemleri. Electronic Journal of Food Technologies, 5(1), 20-35.

Orhan, D.D., Senol, F.S., Hosbas, S., Orhan, I.E., 2014. Assessment of Cholinesterase and Tyrosinase İnhibitory and Antioxidant Properties of Viscum album L. Samples Collected from Different Host Plants and its Two Principal Substances. Industrial Crops and Products, 62, 341-349.

Palmerini, C.A., Carlini, E., Saccardi, C., Servili, M., Montedoro, G., Arienti, G., 2005. Activity of Olive Oil Phenols on Lymphomonocyte Cytosolic Calcium. The Journal of Nutritional Biochemistry, 16(2), 109-113.

Pecetti, L., Tava, A., Pagnotta, M.A., Russi, L., 2007. Variation in Forage Quality and Chemical Composition among Italian Accessions of Bituminaria bituminosa (L.) Stirt. Journal of the Science of Food and Agriculture, 87(6), 985-991.

Permender, R., Hema, C., Sushila, R., Dharmender, R., Vikash, K., 2010. Antidiabetic Potential of Fabaceae Family: an Overview. Current Nutrition & Food Science 6, 161–175.

Pierson, M.D., Reddy, N.R., 1982. Inhibition of Clostridium botulinum by Antioxidants and Related Phenolic Compounds in Comminuted Pork. Journal of Food Science, 47(6), 1926-1929.

Pistelli, L., Noccioli, C., Appendino, G., Bianchi, F., Sterner, O., Ballero, M., 2003. Pterocarpans from Bituminaria morisiana and Bituminaria bituminosa. Phytochemistry 64, 595-598.

45

Rio, J.A., Ortuno, A., Perez, I., Bennet, R.G., Real, D., Correal, E., 2010. Furanocoumarin Content in Bituminaria bituminosa Varieties and Cullen Species. Options Mediterraneennes, 92, 67-70.

Sarikurkcu, C. 2011. Antioxidant Activities of Solvent Extracts from Endemic Cyclamen mirabile Hildebr. Tubers and Leaves. African Journal of Biotechnology, 10(5), 831-839.

Sarikurkcu, C., Kocak, M.S., Tepe, B., Uren, M.C., 2015a. An Alternative Antioxidative and Enzyme Inhibitory Agent from Turkey: Robinia pseudoacacia L. Industrial Crops and Products, 78, 110-115.

Sarikurkcu, C., Ozer, M.S., Cakir, A., Eskici, M., Mete, E., 2013. GC/MS Evaluation and in vitro Antioxidant Activity of Essential Oil and Solvent Extracts of an Endemic Plant Used as Folk Remedy in Turkey: Phlomis bourgaei Boiss. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2013.

Sarikurkcu, C., Uren, M.C., Tepe, B., Cengiz, M., Kocak, M.S., 2014. Phenolic Content, Enzyme Inhibitory and Antioxidative Activity Potentials of Phlomis nissolii and P. pungens var. pungens. Industrial Crops and Products, 62, 333-340.

Sarikurkcu, C., Uren, M.C., Tepe, B., Cengiz, M., Kocak, M.S., 2015b. Phlomis armeniaca: Phenolic Compounds, Enzyme Inhibitory and Antioxidant Activities. Industrial Crops and Products, 78, 95-101.

Tanaka, M., Kuei, C.W., Nagashima, Y., Taguchi, T., 1998. Application of Antioxidative Maillrad Reaction Products from Histidine and Glucose to Sardine Products. Nippon Suisan Gakkaishi, 54, 1409-1414.

Tava, A., Pecetti, L., Ricci, M., Pagnottal, M. A., Russi, L., 2007. Volatile Compounds from Leaves and Flowers of Bituminaria bituminosa (L.) Stirt. (Fabaceae) from Italy. Flavour and Fragrance Journal, 22(5), 363-370.

Tesauro, C., Fiorani, P., D'Annessa, I., Chillemi, G., Turchi, G., Desideri, A., 2010. Erybraedin C, A Natural Compound from the Plant Bituminaria bituminosa, Inhibits Both the Cleavage and Religation Activities of Human Topoisomerase I. Biochemical Journal, 425, 531-539.

Toksoy, S., 2013. Psoralea L. (Fabaceae) Cinsinin Morfolojik, Moleküler ve Palinolojik Revizyonu. Sakarya Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, 92s. Sakarya.

Üren, M.C., 2015. Bazı Phlomis Türleri Üzerine Fitokimyasal Araştırma. Süleyman Demirel Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Doktora Tezi, 58s, Isparta.

Uysal, Ş. 2012. Fenolik Bileşikler. Selçuk Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Yüksek lisans Semineri, 25s, Konya.

46

Ventura, M.R., Castanon, J.I.R., Pieltain, M.C., Flores, M.P., 2004. Nutritive Value of Forage Shrubs: Bituminaria bituminosa, Rumex lunaria, Acacia salicina, Cassia sturtii and Adenocarpus foliosus. Small Ruminant Research, 52, 13–18.

Walker, D.J., Martinez-Fernandez, D., Correal, E., Romero-Espinar, P., del Rio, J. A., 2012. Accumulation of Furanocoumarins by Bituminaria bituminosa in Relation to Plant Development and Environmental Stress. Plant Physiology and Biochemistry, 54, 133-139.

Wang, H., Cao, G., Prior, R.L., 1996. Total Antioxidant Capacity of Fruits. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 44(3), 701-705.

Wetherilt, H., 1996. Beslenme ve Cilt Sağlığı. Gıda Teknolojisi, 1(6), 84-88.

Zengin, G., Cakmak, Y.S., Guler, G.O., Aktumsek, A., 2010. In Vitro Antioxidant Capacities and Fatty Acid Compositions of Three Centaurea Species Collected from Central Anatolia Region of Turkey. Food and Chemical Toxicology, 48(10), 2638-2641.

Zengin, G., Sarikurkcu, C., Aktumsek, A., Ceylan, R., 2014. Sideritis galatica Bornm.: A Source of Multifunctional Agents for the Management of Oxidative Damage, Alzheimer's's and Diabetes Mellitus. Journal of Functional Foods, 11, 538-547.

47

EKLER

EK A. Standart Fenoliklerin RP-HPLC Kromatogramları

EK B. Bituminaria bituminosa Çözücü Özütlerinin RP-HPLC Kromatogramları

48

EK A. Standart Fenoliklerin RP-HPLC Kromatogramları

Şekil A.1. Standart fenolik bileşiklerin RP-HPLC kromatogramları

(1. Gallik asit, 2. Protokateşik asit, 3. (+)-Kateşin, 4. p-Hidroksibenzoik asit, 5. Klorojenik asit, 6. Kafeik asit, 7. (-)-Epikateşin, 8. Şiringik asit, 9. Vanilin, 10. p-Kumarik asit, 11. Ferulik asit, 12. Sinapinik asit, 13. Benzoik asit, 14. o-Kumarik asit, 15. Rutin, 16. Hesperidin, 17. Rosmarinik asit, 18. Eriodiktiol, 19. Sinnamik asit, 20. Kuarsetin, 21. Luteolin, 22. Kamferol, 23. Apigenin)

49

EK B. Bituminaria bituminosa Özütlerinin RP-HPLC Kromatogramları

Şekil B.1. Bituminaria bituminosa etil asetat özütü RP-HPLC kromatogramı

50

Şekil B.2. Bituminaria bituminosa metil alkol özütü RP-HPLC kromatogramı

51

Şekil B.3. Bituminaria bituminosa su özütü RP-HPLC kromatogramı

52

ÖZGEÇMİŞ

Adı Soyadı : Tuba ÖRENÇ Doğum Yeri ve Yılı : İzmir, 1982 Medeni Hali : Evli Yabancı Dili : İngilizce Eğitim Durumu Lise : İzmir Kız Lisesi, 1999 Lisans : Süleyman Demirel Üniversitesi, Fen Edebiyat Fakültesi,

Kimya Bölümü, 2004. Yayınları Sarikurkcu, C., Cengiz, M., Uren, M.C., Ceylan, O., Orenc, T., Tepe, B., 2016.

Phenolic composition, enzyme inhibitory, and antioxidant activity of Bituminaria bituminosa. Food Science and Biotechnology, 25(5), 1299-1304.

Sarikurkcu, C., Orenc, T., Cengiz, M., Uren, M.C., 2016. Total phenolic and flavonoid contents, total antioxidant and metal chelating activities of Bituminaria bituminosa. Workshop and MC Meeting, 17-19 February, 2016, Antalya.

Orenc, T., Cengiz, M., Uren, M.C., Sarikurkcu, C., Koçak, S., 2016. Bituminaria bituminosa Bitkisinin Antiradikal ve İndirgeme Gücü Kapasitelerinin Araştırılması. 6. Kozmetik Kimyası, Üretimi ve Standardizasyonu Kongresi 26-28 Şubat 2016, Antalya.

Orenc, T., Sarikurkcu, C., Cengiz, M., 2016. Enzyme inhibition activity of Bituminaria bituminosa extracts. International Conference on Natural Science and Engineering (ICNASE’16). 19-20 March, 2016, Kilis.