BIOTEKNOLOGI LAPORAN
Transcript of BIOTEKNOLOGI LAPORAN
I. PENDAHULUANI.1 Latar Belakang
Bioteknologi berasal dari dua kata, yaitu ‘bio’ yang berarti makhuk
hidup dan ‘teknologi’ yang berarti cara untuk memproduksi barang. Dengan
definisi tersebut bioteknologi bukan merupakan sesuatu yang baru. Nenek
moyang kita telah memanfaatkan mikroba untuk membuat produk-produk
berguna seperti tempe, oncom, tape, arak, terasi, kecap, yogurt, dan nata de
coco .Hampir semua antibiotik berasal dari mikroba, demikian pula enzim-
enzim yang dipakai untuk membuat sirop fruktosa hingga pencuci pakaian.
Bioteknologi adalah penggunaan biokimia, mikrobiologi, dan
rekayasa genetika secara terpadu, untuk menghasilkan barang atau lainnya
bagi kepentingan manusia.Biokimia mempelajari struktur kimiawi organisme.
Rekayasa genetika adalah aplikasi genetik dengan mentransplantasi gen dari
satu organisme ke organisme lain.
Pada masa sekarang ini bioteknologi berkembang sangat pesat,
terutama di negara negara maju. Kemajuan ini ditandai dengan ditemukannya
berbagai macam teknologi semisal rekayasa genetika, kultur jaringan, DNA
rekombinan, pengembangbiakan sel induk, kloning, dan lain-lain.
Bioteknologi merupakan cabang ilmu yang mempelajari pemanfaatan
makhluk hidup (bakteri, jamur, virus) maupun produk dari makhluk hidup
(enzim, alkohol) dalam proses produksi untuk menghasilkan barang dan jasa.
Penggunaan biokimia, mikrobiologi, dan rekayasa genetika bertujuan untuk
menghasilkan barang atau lainnya bagi kepentingan manusia. Dengan kata
lain, bioteknologi adalah ilmu terapan yang menggabungkan berbagai cabang
ilmu dalam proses produksi barang dan jasa (Merck, 2005).
Pada bioteknologi juga dipelajari mengenai teknik ekstraksi DNA.
Ekstraksi DNA adalah langkah pertama yang sangat penting dalam langkah –
langkah kerja analisis DNA sequencing. Metode untuk isolasi asam nukleat
sering dikerjakan menggunakan penghancuran mekanik atau metode
kimiawi, yang kadang – kadang juga ter otomatisasi. Baik metode ekstraksi
manual maupun otomatis yang digunakan, kita harus berhati-hati untuk
meminimalisir degradasi DNA, dengan menghindari ekspos terhadap panas,
cahaya, freeze-thaw yang berulang - ulang dan vortex. Selanjutnya,
laboratorium harus diatur sedemikian rupa untuk meminimalisir
kemungkinan kontaminasi silang diantara sample (Brown 1992).
Dengan banyaknya fungsi DNA bagi kehidupan manusia, maka
dilakukanlah modul praktikum tentang Visualisasi DNA agar praktikan lebih
mengerti apa itu DNA dan fungsinya.
I.2 Tujuan
Melatih praktikan untuk dapat cara mengekstraksi DNA secara
sederhana.
Melatih praktikan untuk dapat melihat presipitasi DNA dari hasil
ekstraksi.
Melatih praktikan untuk dapat melakukan analisa hasil ekstraksi DNA.
II. TINJAUAN PUSTAKA
2.1 DNA
DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi
untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler.
DNA terdapat pada nukleus, mitokondria dan kloroplas. Perbedaan di antara
ketiganya adalah: DNA nukleus berbentuk linear dan berasosiasi sangat erat
dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk
sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu, DNA mitokondria
dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal
dari garis ibu (Semagn, K., Bjornstad, A., Ndjiondjop, M.N, 2006).
DNA merupakan persenyawaan kimia yang paling penting pada makhluk
hidup, yang membawa keterangan genetik dari sel khususnya atau dari makhluk
dalam keseluruhannya dari satu generasi ke generasi berikutnya. Molekul DNA
terdapat pada nukleus, mitokondria, plastida dan sentriol. Molekul DNA pada
nucleus memiliki bentuk sebagai benang lurus dan tidak bercabang, sedangkan
DNA yang terletak pada mitokondria dan plastida berbentuk lingkaran.
Komponen basa nitrogen pada DNA terdiri dari Adenina (A), Timina (T), Sitosina
(C), Guanina (G) (Jamilah, 2005).
DNA bukanlah suatu molekul tunggal, nampaknya ia adalah sepasang
molekul yang digandeng oleh ikatan hidrogen: DNA tersusun sebagai untai
komplementer dengan ikatan hidrogen di antara mereka. Masing-masing untai
DNA adalah rantai kimia batu bata penyusun, yakni nukleotida, yang terdiri dari
empat tipe: Adenine (A), Cytosine (C), Guanine (G) dan Thymine (T). DNA
mengandung informasi genetika yang diwariskan oleh keturunan dari suatu
organisme; informasi ini ditentukan oleh barisan pasangan basa. Sebuah untai
DNA mengandung gen, sebagai cetak biru organisme. DNA membuat genom
organisme (Semagn, K., Bjornstad, A., Ndjiondjop, M.N, 2006).
DNA pertama kali berhasil dimurnikan pada tahun 1868 oleh ilmuwan
Swiss Friedrich Miescher , di Tubingen, Jerman yang menamainya nuclein
berdasarkan lokasinya di dalam inti sel. Namun demikian, penelitian terhadap
peranan DNA di dalam sel baru dimulai pada awal abad 20, bersamaan dengan
ditemukannya postulat genetika Mendel. DNA dan protein dianggap dua molekul
yang paling memungkinkan sebagai pembawa sifat genetis berdasarkan teori
tersebut. (Van Berkum, 1995).
Asam nukleat merupakan molekul makro yang memberi keterangan tiap
asam nukleat mempunyai urutan nukleotida yang unik sama seperti urutan asam
amino yang unik dari suatu protein tertentu karena asam nukleat merupakan rantai
polimer yang tersusun dari satuan monomer yang disebut nukleotida. James
Watson dan Francis Crick memenangkan Nobel di tahun 1962 mengenai model
penyatuan struktur DNA. Bersama dengan Rosalind Franklin dan Maurice
Wilkins, mereka menyatakan bahwa struktur DNA merupakan dua untaian
nukleotida yang disebut dengan double helix, dimana untaian tersebut tersusun
secara spiral dengan posisi gula dan gugus fosfat terletak di sisi luar dan basa-basa
nitrogen saling berpasangan di sisi dalam (menyambung kedua untaian tersebut
(Jamilah, 2005).
2.2 Ekstraksi DNA
Ekstraksi DNA adalah langkah pertama yang sangat penting dalam
analisis DNA sequencing. Kualitas secara keseluruhan, akurasi dan panjang
pembacaan urutan basa DNA dapat dipengaruhi secara signifikan oleh karakter
sample itu sendiri, dan metode yang dipakai untuk ekstraksi DNA. Mengisolasi
DNA dengan kualitas tinggi dari berbagai jenis sample memiliki tantangan
tersendiri, dan metode yang ideal akan beragam bergantung pada jenis
jaringan/tissue (termasuk darah), bagaimana ia diperoleh dari sumbernya, dan
bagaimana sample ditangani atau disimpan sebelum diekstrak. Metode untuk
isolasi asam nukleat sering dikerjakan menggunakan penghancuran mekanik atau
metode kimiawi, yang kadang-kadang juga terotomatisasi. Baik metode ekstraksi
manual maupun otomatis yang digunakan, kita harus berhati-hati untuk
meminimalisir degradasi DNA, dengan menghindari ekspos terhadap panas,
cahaya, freeze-thaw yang berulang-ulang dan vortex. Selanjutnya, laboratorium
harus diatur sedemikian rupa untuk meminimalisir kemungkinan kontaminasi
silang diantara sample (Peters, 1993).
DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang antiparalel dengan
komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan
pasangan basa. Pasangan basa pada DNA terdiri atas dua macam, yaitu basa purin
dan pirimidin. Basa purin terdiri atas adenin (A) dan guanin (G) yang memiliki
struktur cincin-ganda, sedangkan basa pirimidin terdiri atas sitosin (C) dan timin
(T) yang memiliki struktur cincin-tunggal. Ketika Guanin berikatan dengan
Sitosin, maka akan terbentuk tiga ikatan hidrogen, sedangkan ketika Adenin
berikatan dengan Timin maka hanya akan terbentuk dua ikatan hidrogen. Satu
komponen pembangun (building block) DNA terdiri atas satu gula pentosa, satu
gugus fosfat dan satu pasang basa yang disebut nukleotida (Michel Peyrard,
2004).
Metode yang digunakan untuk mengisolasi DNA dari berbagai jenis
tanaman, organ tanaman, maupun jaringannya dapat dilakukan dengan berbagai
cara. Namun pada intinya terdapat tiga faktor utama yang sangat penting untuk
dalam melakukan purifikasi dan ekstraksi DNA secara maksimal. Pertama adalah
cara dalam menghomogenkan jaringan tanaman khususnya adalah dinding selnya.
Kedua adalah komposisi dari larutan buffer yang ditambahkan dalam penggerusan
jaringan tanaman dan yang ketiga adalah penghilangan enzim penghambat-
polisakarida (Michel Peyrard, 2004).
Ekstraksi merupakan suatu proses pemisahan suatu bahan dari
campurannya dengan menggunakan pelarut yang berbeda yang tidak saling
campur. Cara yang paling sederhana adalah dengan ekstraksi bertahap, yaitu
cukup dengan hanya menambahkan pelarut pengekstraksi yang tidak saling
campur dengan pelarut semula. Kemudian dikocok sehingga terjadi keseimbangan
konsentrasi zat yang akan diekstraksi dan dicapai suatu lapisan kemudian
didiamkan dan dipisahkan (Michel Peyrard, 2004).
2.3 Elektroforesis
Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul
bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan
listrik . Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel
yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan
listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika
molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian
dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka
molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif( Westermeier,
2004).
Elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan
memurnikan fragmen DNA. Secara teknis, elektroforesis merupakan istilah yang
diberikan untuk migrasi partikel yang bermuatan akibat diberikan arus listrik
searah atau DC (Direct Current). Teknik elektroforesis ditentukan oleh ciri
molekular ionik dan adanya muatan sebagai sifat fisik. Arah dan laju pergerakan
tergantung pada spot dan intensitas muatan ionik. Bufer elektroda digunakan
untuk konduktor arus dengan menjadi jembatan konduksi diantara dua elektroda
sehingga memungkinkan terjadinya aliran medan listrik. Teknik ini dapat
digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul
misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif
dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke
kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari
kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada
nisbah muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya
(Lewis, 2003).
Elektroferesis merupakan teknik pemisahan suatu partikel, spesies, ion
atau partikel koloid berdasarkan kemampuan berpindah melalui medium
konduktif, biasanya berupa larutan bufer, sebagai respon adanya suatu medan
listrik. Prinsip kerja dari elektroforesis adalah adanya pergerakan komponen
bermuatan positif (+) pada kutub negatif (-) serta komponen bermuatan negatif (-)
pada kutub positif (+). Pegerakan yang terjadi disebut "elektrokinetik" . Hasil
yang didapatkan dari elektroforesis adalaha elektroforegram yang memberikan
informasi mengenai seberapa cepat perpindahan komponen (tm) atau biasa disebut
kecepatan migrasi. Besaran yang digunakan sama dengan pada proses
kromatografi (Madhavan et al., 2008).
Menurut Peters (1993), berikut ini adalah macam-macam dari
elektroforesis :
1. Elektroforesis Kertas
Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas
sebagai fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak,
terutama ialah ion-ion kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi
konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas
tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang
digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorpsivitas
zat terlarut (Anonym, 2011).
2. Elektroforesis Gel
Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase
diam untuk memisahkan molekul-molekul. Awalnya elektoforesis gel dilakukan
dengan medium gel kanji (sebagai fase diam) untuk memisahkan biomolekul yang
lebih besar seperti protein-protein. Kemudian elektroforesis gel berkembang
dengan menjadikan agarosa dan poliakrilamida sebagai gel media. Dalam
elektroforesis gel terdapat dua material dasar yang disebut fase diam dan fase
bergerak (eluen). Fase diam berfungsi menyaring objek yang akan dipisah,
sementara fase bergerak berfungsi membawa objek yang akan dipisah. Sering kali
ditambahkan larutan penyangga pada fase bergerak untuk menjaga kestabilan
objek elektroforesis gel. Elektroda positif dan negatif diletakkan pada masing-
masing ujung aparat elektroforesis gel (Jamilah, 2005).
3. Elektroforesis Kapiler
Elektroforesis kapiler adalah metode elektroforesis yang digunakan untuk
memisahkan asam amino, protein, lipid, karbohidrat, dan nukleotida dengan
resolusi tinggi yang dilakukan pada pipa kapiler berisi buffer. Metode ini mulai
digunakan secara luas pada akhir tahun 1940 untuk aplikasi dalam berbagai
bidang seperti bioteknologi, kimia, lingkungan, dan analisis farmasi.
Elektroforesis kapiler menggunakan listrik bertegangan tinggi yang menyebabkan
semua komponen ion atau molekul netral bergerak ke katoda. Deteksi dapat
dilakukan dengan teknik pendeteksian spektrometri atau elektrokimia. Teknik
pemisahan ini dipengaruhi oleh tegangan listrik, koefisien difusi, panjang, dan
diameter pipa kapiler, serta konsentrasi sampel. Metode ini memiliki efisiensi
danselektivitas yang baik namun boros listrik karena menggunakan tegangan
tinggi dan alatnya juga mahal (Jamilah, 2005).
2.4 DNA Ladder
DNA Ladder berfungsi sebagai DNA marker yaitu penanda untuk
membandingkan dengan DNA yang dipisahkan dengan metode elektroforesis.
DNA yang dipisahkan dapat dibandingkan ukuran DNA dengan membandingkan
posisi dari DNA yang terpisahkan dengan posisi DNA pada ladder. Posisi dari
DNA ditentukan berdasarkan jumlah pasang basa yang terdapat pada DNA. Jika
salah satu band DNA ladder memiliki posisi yang sama dengan band DNA yang
terpisahkan maka DNA tersebut memiliki ukuran yang sama dengan DNA
tersebut pada ladder. Namun, metode pembadingan menggunakan DNA ladder
tidak begitu akurat. Metode ini cukup membantu jika penelitian membutuhkan
data yang bersifat kualitatif (Vallvey et. al., 1997).
DNA ladder merupakan salah satu komponen elektoforesis, Dna ladder
digunakan untuk membandingkan ukuran panjang basa pada fragmen DNA
sampel. Pemendaran yang dihasilkan dihasilkan oleh pewarna ElBr dapat dilihat
menggunakan sinar UV (Jamilah, 2005).
Pada DNA ladder terdiri dari satu set fragmen DNA dengan ukuran yang
berbeda. Fragmen DNA dipisahkan dan divisualisasikan sebagai pita DNA pada
gel. Pita DNA dipisahkan bersama-sama terlihat seperti ladder (tangga) pada gel.
DNA ladder dalam elektroforesis gel digunakan untuk menentukan ukuran dan
jumlah fragmen tes DNA dari genom (Zubaidah, 2004).
DNA ladder yang ukurannya sudah diketahui dimasukkan juga ke dalam
gel untuk mengidentifikasi DNA. Agarose gel elektroforesis adalah suatu
prosedur yang terdiri dari pengisian DNA dalam agarose gel dan kemudian
menghubungkan arus listrik pada gel. Sebagai hasilnya, rantai DNA yang lebih
kecil bergerak lebih cepat dari pada rantai yang lebih besar melalui gel menuju
arus positif (Hays, 2005).
III. MATERI DAN METODE
3.1 Waktu dan Tempat
Hari / Tanggal : Selasa, 26 April 2016
Waktu : 14.00 – 16.00 WIB
Tempat : Laboratorium Mikrobiologi Laut Gedung E FPIK
UNDIP
3.2 Alat dan Bahan
3.2.1 Alat Praktikum Visualissasi Ekstraksi DNA
Tabel 1.Alat PraktikumVisualisasi Ekstraksi DNA
No Nama Alat Gambar Fungsi
1 Tabung
Sentrifuge
50 mL
Sebagai tempat sampel ekstraksi
2 Gelas
Beaker
Sebagai wadah buffer lisis
3 Saringan Sebagai alat untuk menyaring
ekstrak sampel
4 Kertas
Saring
Sebagai alat untuk membantu
dalam proses penyaringan
5 Plastik
Ziplock
Sebagai tempat menghancurkan
sampel sebelum dilarutkan dengan
larutan buffer lisis
6 Label Sebagai alat untuk menandai
sampel
3.2.1.1 Alat Praktikum Elektroforesis
Tabel 2. AlatPraktikumPraktikum Elektroforesis
NO Nama Alat Gambar Fungsi
1 Perangkat
Gel
Elektrofor
esis
Sebagai alat dalam proses
elektroforesis
2 UV-
Iluminator
Sebagai alat untuk
memvisualisasikan DNA selalu
dicampur dengan loading dye /
dirunning dalam DNA
elektroforesis
3 Para film
Kertas
Sebagai wadah untuk loading dye
4 Micropipe
t
Sebagai alat untuk mengambil
loading dye dan
menghomogenkannya dengan
ekstrak sampel
3.2.2 Bahan Praktikum Visualisasi Ekstraksi DNA
Tabel 3.Bahan PraktikumVisualisasi Ekstraksi DNA
No Nama Gambar Fungsi
1 Shampo 10
mL
Bahan untuk membuat larutan
buffer lysis
2 Garam
iodium
Bahan untuk membuat larutan
buffer lysis
3 Strawberry Sampel yang akan digunakan
4 Pisang Sampel yang akan digunakan
5 Rumput
Laut
Sampel yang akan digunakan
6 Aquabides
90 mL
Bahan untuk membuat larutan
buffer lysis
7 Alkohol
95%
Untuk proses presipitasi
(pemekatan)
8 Enzim
(Pembersih
kacamata)
Bahan untuk membuat larutan
buffer lysis
3.2.2.1 Bahan Praktikum Elektroforesis
Tabel 4.Bahan Praktikum Elektroforesis
No Nama Gambar Fungsi
1 Gel
Agarose
Sebagai media untuk meletakkan
sampel saat dilakukan
elektroforesis
2 Loading
Dye
Sebagai pemberat agar tidak keluar
dari sumuran
3 Buffer TAE
1%
Sebagai penyangga dan media
penghanntar listrik yang tepat
4 DNA
Leader 4µl
Untuk dicampurkan di
elektroforesis
5 Ketiga
sampel
yang telah
diekstraksi
Sampel yang akan dielektroforesis
3.2 Metode
3.2.1 Visualisasi Ekstraksi DNA
Buat buffer lysis sebanyak 100 mL dengan mengambil 90 mL aquabides dan 10 mL detergent, serta ¼ sendok garam
Larutan buffer lysis diaduk sampai homogen dengan menggunakan
pengaduk
Sampel ekstraksi DNA (pisang, strawberry, rumput laut) dimasukkan
masing-masing pada plastik zip-lock yang berbeda
Sampel dihaluskan dengan diremas-remas
Setelah sampel ekstrak halus, buffer lysis sebanyak 10 mL dituangkan
kedalam plastik ziplock yang berisi ekstrak halus dan tutup kembali
plastik ziplock
Buffer lysis dan sampel ekstrak yang telah dihaluskan dihomogenkan
dengan meremas plastik selama 2-3 menit
3.2.2 Gel Elektroforesis
Setelah homogen, sampel dan buffer lysis yang telah bercampur
disaring denganmenggunakankertassaringdansaringanpadagelassteril.
Alkohol 95% sebanyak 30 mL dituangkan pada tabung sentrifuge
bervolume 50 mL menggunakan pipet gondok
Cairan sari ekstrak dituangkan pada tabung sentrifuge, kemudian tuang
alkohol dan homogenkan
Saringan diaduk secara perlahan hingga sari cairan ekstrak menetes ke
tabung sentrifuge
Sisa ampas ekstrak kemudian dibuang
Hasil ekstraksi kemudian disiapkan untuk selanjutnya akan dianalisa
menggunakan gel elektroforesis
Gel agarose 1% disiapkan pada perangkat gel elektroforesis
Gel agarose 1% diletakkan pada mesin elektroforesis dan ditambahkan
buffer TAE 1x hingga terendam
Sebanyak 1mL loading dye dan 3mL sampel dicampurkan hingga
homogeny menggunakan mikropipet
DNA akan mulai mengalami presipitasi sehingga akan muncul
benang-benang halus kemudian amati hingga beberapa menit
Kemudian loading dye dan sampel dimasukkan kedalam sumur gel
agarose
Proses elektroforesis dilakukan dengan mengalirkan listrik sebesar 100
volt selama 30 menit
Kemudian gel diamati menggunakanmesin UV-transluminator
Selesai
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
IV.1 Hasil
IV.1.1 Ekstraksi DNA
(Gambar 1. Hasil ekstraksi DNA dari sampel strawberry)
(Gambar 2. Hasil ekstraksi DNA dari sampel rumput laut)
(Gambar 3. Hasil ekstraksi DNA dari sampel pisang)
IV.1.2 Gel Elektroforesis
(Gambar 4. Sumuran gel agarose)
(Gambar 5. Hasil visualisasi)
4.2 Pembahasan
4.2.1 Ekstraksi DNA
Dalam praktikum ekstraksi DNA kali ini menggunakan beberapa
bahan yaitu strawberry, rumput laut, dan pisang. Dari beberapa bahan yng
digunakan seperti strawberry, rumput laut, dan pisang memilki sifat yang
lunak, Sehingga mudah untuk dihancurkan tanpa menggunakan alat.
Dengan sifatnya yang lunak maka proses pengahncuran dapat
menggunakan dengan cara di remas menggunakan tangan saja. Pada
proses ekstraksi DNA menggunakan metode ekstraksi sederhana,
disamping mudah dan tidak terlalu mahal juga hasil tidak terlalu lama.
Tekhnik ekstraksi DNA memerlukan lisis buffer yang dalam
praktikum ini menggunakan bahan shampoo dengan fungsi sebagai
katalisator yan mempercepat proses ekstraksi. Kemudiam dilanjutkan
dengan ekstraksi protein dengan menggunakan larutan alkohol 95%. Lalu
ditambahkan enzim untuk bisa mengikat protein-protein yang terdapat
dalam DNA kedua buah tersebut. Kemurnian DNA dapat diketahui dengan
menggunakan elektroforesis untuk mengetahui keutuhan relative DNA
tersebut. Fungsi shampo dalam isolasi DNA dalam proses isolasi DNA
adalah untuk melisiskan barier (penghalang) sel secara kimia sebagai
pengganti senyawa kimia yang mampu merusak dinding dan membran sel
antara lain lisozim yang dapat mendegesti senyawa polimerik yang akan
menyebabkan kekakuan sel dan Etil Endiamintetra Asetat (EDTA) yang
berfungsi untuk menghilangkan ion Mg2+ yang penting untuk
mempertahankan keseluruhan struktur selubung sel, serta menghambat
enzim-enzim seluler yang dapat merusak DNA (ion Mg2+ merupakan
kofaktor penting bagi DNAse yang biasa memakan DNA).
Ada 5 tahap untuk melakukan isolasi DNA, yaitu: isolasi sel,
pelisisan dinding dan membran sel, pengekstraksian dalam larutan, Pada
isolasi DNA kedua buah tersebutdidapatkan hasil, DNA naik keatas
setelah diberi alcohol dengan warna dari DNA itu sendiri berwarna bening
dan berupa benang-benang putih.
Ekstrak sel tersebut ditambahkan protease, fungsi protease adalah
mendegradasi protein dan ditambahkan RNase menggunakan pembersih
kacamata yang berfungsi untuk mendegradasi RNA, sehingga yang tinggal
adalah DNA. Larutan DNA kemudian di presipitasi dengan dilarutkan lagi
menggunakan alkohol.
Pada proses penghancuran jaringan sampel yang terjadi di awal
proses isolasi DNA, terjadi pelepasan senyawa polifenol dan polisakarida.
Polisakarida mengalami kompresipitasi dengan asam nukleat saat
presipitasi dengan penambahan alkohol sehingga terbentuk suatu matriks
seperti lem dalam jumlah berlebihan sedangkan senyawa polifenol yang
teroksidasi akan mengadakan ikatan kovalen dengan DNA yang
membentuk suatu senyawa kompleks berwarna kecokelatan.
Hal ini dapat menyebabkan DNA menjadi kental, sulit larut secara
sempurna dan sulit di pipet meskipun telah dilarutkan dalam larutan
buffer. Akan tetapi jika ditinjau dari sudut pandang media, DNA yang baik
adalah DNA yang serupa pintalan benang.
Faktor penambahan garam ke dalam larutan shampo pada proses
isolasi DNA bertujuan untuk melarutkan DNA hal itu karena ion Na+
yang dikandung oleh garam mampu memblokir (membentuk ikatan)
dengan kutub negatif fosfat DNA, yaitu kutub yang bisa menyebabkan
molekul-molekul saling tolak menolak satu sama lain sehinggga pada saat
ion Na+ membentuk ikatan dengan kutub negatif fosfat DNA, DNA akan
terkumpul. Dari pernyataan tersebut maka dapat disimpulkan yaitu: selain
digunakan untuk menghilangkan protein, karbohidrat dan menjaga
kesetabilan pH lysing buffer, garam juga berfungsi pada saat proses
pemekatan DNA.
Konsentrasi DNA yang terpresipitasi tergantung dari beberapa
hal,misalnya keenceran sumber DNA yang digunakan. Semakin encer
filtrat, maka DNA yang terpresipitasi akan semakin sedikit. Dari sampel
yang telah diekstraksi DNA, sampel pisang gagal dan tidak terbentuk
benang-benang DNA. Hal tersebut dikarenakan saat proses penghalusan
sampel kurang lembut. Sedangkan pada sampel strawberry dan sampel
ikan terbentuk benang-benang DNA setelah dipresipitasi dengan alkohol.
Pada saat proses penambahan alkohol, larutan akan seperti terbalik
untuk beberapa saat, dan akhirnya alkohol akan berada di bagian atas
tabung, sementara filtrat berada di bagian dasar tabung. Sifat itu karena
alkohol memiliki densitas (kerapatan) yang lebih kecil dibandingkan air.
DNA akan tampak nyata sebagai strands (unting) putih atau suatu bahan
yang kental dengan gelembung udara yang terperangkap di dalamnya.
Gelembung ini yang akan menyebabkan DNA naik ke bagian atas larutan.
IV.1.3 Gel Elektroforesis
Pada gel elektroforesis menggunakan gel agarose 1% dan buffer
TAE 1x. Gel agarose sendir berfungsi sebagai media untuk memisahkan
DNA berukuran lebih dari 100bp. Sedangkan buffer TAE 1x berfungsi
sebagai penyangga dan media penghantar listrik yang tepat. Pada saat
proses gel agarose dan buffer TAE sudah tercetak di perangkat gel
elektoforesis, maka sampel dapat dimasukkan. Proses elektroforesis
sendiri dilakukan dengan cara mengalirkan sebesar 100 VOH selama 50
menit.
Prinsip dalam gel elektroforesis adalah pemisahan terhadap
campuran bahan dengan muatan listrik yang berbeda-beda. Hasil dari
ekstraksi DNA berupa benang-benang DNA yang kemudian diambil
sebanyak 4µl dan dicampurkan dengan loading dye sebanyak 1µl dengan
menggunakan bantuan mikropipet. Fungsi Loading dye adalah sebagai
pemberat dari benang-benang DNA agar tidak berceceran saat masuk
kedalam gel agarose. Pada saat proses elektroforesis selesai, hasil dari
sequence DNA dapat dilihat di UV-Transluminator. Tetapi, pada
praktikum sift 2 mendapatkan hasil yang gagal. Hal tersebut karena hasil
tidak muncul saat dilihat di UV-Transluminator. Hasil yang gagal dapat
disebabkan oleh berbagai faktor seperti faktor human error atau kesalahan
praktikan sendiri pada saat melakukan ektraksi DNA danpada saat
memindahkan sampel ke gel agarose sehingga hasilnya tidak muncul.
V. PENUTUP
V.1Kesimpulan
Pada praktikum ini metode yang digunakan dalam proses ekstraksi
DNA yaitu Metode Konvensional.
Proses presipitasi ekstraksi DNA menggunakan larutan alkohol yang
dituangkan ke dalam sampel yang telah dihaluskan untuk mendapatkan
2 macam fraksi yang terpisah (supernatan pada bagian atas dan pelet
pada bagian bawah).
DNA yang telah diekstraksi akan terlihat seperti benang-benang putih
tipis yang bergerak ke atas larutan.
V.2Saran
Pahami terlebih dahulu materi yang akan digunakan pada saaat
praktikum
Praktikan lebih berhati-hati dan teliti dalam praktikum.
DAFTAR PUSTAKA
Brown, E. W. 1992. Character Regognition by Feature Point Extraction College
of Computer and Information Science.
Cooper (2000). The Cell - A Molecular Approach (edisi ke-2). Sunderland (MA):
Sinauer Associates. hlm. Heredity, Genes, and DNA. ISBN 0-87893-106-6.
DiaksespadahariSenin 15 Juni 2015pukul 24.00 WIB.
Hays, Lana. 2005.Introduction to DNA Extraction. DiaksespadahariSelasa 16 Juni
2015pukul 08.00 WIB.
Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Detergen, Penambahan Enzim, dan
Ekstrak Nanas (Ananas comusus (L) Merr) Terhadap Hasil Isolasi DNA
Berbagai Macam Buah Sebagai Topik Praktikum Matakuliah Genetika.
Skripsi tidak diterbitkan. Malang: Universitas Negeri Malang
Lewis, R. 2003. Human genetics: Concepts and applications. The McGraw-Hills
Company, Inc., Boston: xviii + 454 hlm.
Madhavan G, Oakley B, Kun L. 2008. Career Development in Bioengineering
and Biotechnology. New York: Springer+Business media, LLC.
Merck. Biotechnology Institute. 2005. What is biotechnology.
http://www.biotechinstitute.org/what_is/. DiaksespadahariSelasa 16 Juni
2015pukul 23.00 WIB
Peters P. 1993. Biotechnology: A Guide To Genetic Engineering. Wm C Brown:
AS.
Smith JE. 2004. Biotechnology : Studies in Biology. Ed ke-4. Cambridge: Inggris.
Van Berkum, P., R.E. Tully, and D.L. Keister. 1995. Non-pigmented and
bacteriochlorophyll-containing bradyrhizobia isolated from Aeschynomene
indica. Appl. & Env. Microbiol. 6: 623-629.
Zubaidah, Siti. 2004. Identifikasi, Variasi Genetik, Distribusi dan Upaya
Eliminasi Bakteri Penyebab CVPD (Citrus Vein Phloem Degeneration).
Desertasi tidak diterbitkan. Malang: Program Pasca Sarjana Universitas
Brawijaya.
DOKUMENTASI
Gambar 1. Alat dan bahan disiapkan Gambar 2. Sampel rumput laut yang
sudah dihancurkan.
Gambar 3. Sampel pisang yang sudah
dihancurkan.
Gambar 4. Sampel strawberry yang
sudah dihancurkan.
Gambar 5. Lysis buffer siap
digunakan.
Gambar 6. Sampel pisang
ditambahkan 10 ml lysis buffer.
Gambar 7. Sampel strawberry
ditambahkan 10 ml lysis buffer.Gambar 8. Sampel rumput laut
ditambahkan 10 ml lysis buffer.
Gambar 9. Sampel strawberry
disaring agar di dapat ekstraknya. Gambar 10. Sampel pisang disaring
agar di dapat ekstraknya.
Gambar 11. Hasil ekstrak ketiga
sampel masing-masing ditambahkan
alkohol sebanyak 30 ml.
Gambar 12. Hasil ekstraksi pada
sampel strawberry, terlihat pita bening
yang berarti terdapat pita DNA.
Gambar 13. Hasil ekstraksi pada
sampel pisang, tidak terlihat pita
bening (transparan) karena sampel
kurang halus.
Gambar 14. Hasil ekstraksi pada
sampel rumput laut, terlihat pita
bening (transparan) yang berarti
terdapat pita DNA.
Gambar 21. Pita DNA masing-
masing sampel diambil menggunakan
mikrotip sebanyak 4 µl.
Gambar 22.Sampel sebanyak4 µl dan
1 µl loading dye dihomogenkan
menggunakan mikropipet.
Gambar 23. Campuran loading dye
dan sampel dimasukkan ke dalam
sumur gel agarose.
Gambar 24. Proses elektroforesis
dilakukan dengan mengalirkan listrik
sebesar 100 volt selama 50 menit.