BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE LEZIONE n° 5 siRNA CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL...
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BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE
LEZIONE n° 5siRNA
CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO
AA 2008-09Adriana Maggi
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Nuovi target farmacologici: GLI ACIDI NUCLEICI
Duplicazione
DNA duplicato
DNA RNA
TrascrizioneMaturazioneMetabolismo
Traduzione
PROTEINA
FARMACI TRADIZIONALI
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ACIDI NUCLEICI COME TERAPEUTICI
1. ANTISENSO: desossinucleotidi complementari con l’m-
RNA
2. ANTIGENE: desossinucleotidi complementari al DNA
3. RIBOZIMA: ribonucleotidi catalalitici complementari a
RNA
4. APTAMERI: desossi e ribonucleotidi complementari a una
sequenza aminoacidica (competono
con l’RNA nella interazione tra RNA e
proteina)
5. DECOY: DNA complementare a sequenze
aminoacidiche (competono con
sequenze di DNA nell’interazione DNA-
proteina)
6. siRNA: RNA complementari a sequenze specifiche
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RNA Interference: il processo attraverso il quale un RNA a doppio filamento interferisce con l’espressione genica:sia inducendo la degradazione di RNA complementare che bloccandone la traduzione
http://www.nature.com/focus/rnai/animations/index.html
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The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006
"for their discovery of RNA interference - gene silencing by double-stranded RNA"
Andrew Z. Fire Craig C. MelloStanford University University
of Massachusetts b. 1959 b. 1960
In 1998 Fire and Mello described the presence of si RNA in C.elegans
Nel 2001 Tuschl et al. dimostrano che una piccola sequnza di RNA puo’ interferire in modo specifico con la trascrizione
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Interferenza basata su RNA (RNA interference)
Attori:
Micro RNA (miRNA) precursori a forcina
Ribonucleasi DICER
Small interfering RNA (Si) (2 nt 3’ protrundenti)
RISC RNA RNA driven interference silencing complex che comrende: Argonaute, la proteina che srotola il doppio filamento e la ribonucleasi che taglia la sequenza senso 8° 10-11 nt risptto al terminale 5’.
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Il complesso RISC attivato riconosce sequenze complementari di RNA, le lega e degrada: questo puo’ avvenire diverse volte in quanto l’RNA antisenso, protetto dal complesso proteico è stabile e in cellule che si dividono lentamente puo’ agire per 3-7 giorni.
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Risc unwinds dsRNA,the ribonuclease in the Ribonuclese complex hydrolizes new targets
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Nature Reviews Genetics 2007, 8:884
LOCI NATURALI CHE GENERANO siRNA
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RNA-directed DNA methylation (descritta in vegetali)
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RNA interference-mediated heterochromatin assembly
siRNAs are thought to guide histone methyltransferases (HMTs) to the chromatin to modify histone H3 on lysine 9 (H3K9). The methylated form of H3 is bound by Swi6 or HP1, which also associates with the methyltransferases, to maintain the silenced state. m, methyl group.
Marjori A. Matzke & James A. BirchlerNature Reviews Genetics 6, 24-35 (January 2005
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Attività di siRNA a livello del nucleo
Metilazione di citosine in frammenti di DNA complementari (descritta in vegetali)
Riorganizzazione della cromatina (descritto in lievito, cellule vegetali e di insetto: siRNA determinano la metilazione di istoni e la formazioe di eterocromatina)
Excisione programmata di DNA in eccesso (protozoi)
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siRNA sinteticoa doppio filamento
shRNA plasmidico
RNA lungo a doppio filamento
miRNA endogeno
20-25 NT
funzionemiRNA
Formazione del complesso RISC (RNA induced silencing complex)
Complesso RISC attivato
Blocco traduzione
funzionesiRNA
Formazione doppia elica con RNA complementare e attacco di endonucleasi
Amplificazione RNA-dip RNA polimerasi
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si RNA – caratteristiche
RNA a doppia elica di 21-23 ntPresenza di terminale 3’ più lungo di 2ntPresenza di gruppi OH in 3’Presenza 5’ fosfatoAlta stabilità nella porzione 5’ senso(ricco in GC)Bassa stabilità nella porzione 5’ antisenso(ricco UA)Bassa stabilità nella zona centrale dove deve avvenire l’attacco della endonucleasi2’ desossitimidina per proteggere siRNA da attività esonucleasiche
Non deve essere complementare a zone intronicheComplementare a una porzione di RNA a non più di 75 basi da codone di inizio trad.
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si RNA – caratteristiche
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In rosso: siRNA marcatoIn blu: nucleiIn verde la proteina GAPDH
CELLULE HELA
si RNA non specifico si RNA contro GAPDH
Trattamento: 48h
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siRNA come agenti terapeutici
LA DISTRIBUZIONE
Problematiche tipiche delle molecole di grandi dimensioni e che sono altamente polari
Degradabilità dovuta a Rnasi circolanti (RNA naturale puo’ essere utlizzato in cervello e polmoni)
Ideale per applicazione topica (occhi, derma, tumori localizzati)
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siRNA come agenti terapeutici
LA SOMMINISTRAZIONE
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siRNA come agenti terapeutici
LA SOMMINISTRAZIONE
1. Applicazione topica: instillazione di gocce, aerosol, iniezione intratumorale
2. Somministrazione sistemica: a. iv (molecole di circa 5nm riescono a passare le
membrane, fino a 200 nm passano solo capillari fenestrati : uso di nanocarrier)
b. RNA di sintesi modificati per migliorarne la farmacocinetica
c. Utilizzo di vettori virali e non per esprimere l’RNA a
della cellula bersaglio
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siRNA come agenti terapeutici
LA SOMMINISTRAZIONE
Modificazione delle molecole di siRNA per una distribuzione più efficiente
modificazioni per evitare le difese immunitarie (modificazione con 2’-o-metile nel filamento antisenso)
fosforotionati per bloccare esonucleasi
coniugazione con peptidi, colesterolo, PEG
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BIODISTRIBUZIONE
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Anton P. McCaffrey*, Leonard Meuse*,
Thu-Thao T. Pham*, Douglas S. Conklin†,
Gregory J. Hannon†, Mark A. Kay*
Nature, 2002
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siRNA IN STUDI CLINICI
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Similarità e differenze con oligonucleotidi antisenso
Similarità: - lunghezza- metodologia di delivery comune- induzione di silenziamento genico a livello post-trascrizionale- digestione di RNAm bersaglio da parte di endonucleasi- possibilità di stabilizzzione con basi
modificate- similarità nella biodistribuzione
Differenze: - doppio filamento verso singolo filamento- maggiore stabilità della molecola naturale- maggiore efficacia in cellule in coltura- meccanismo di azione mediato da RISC
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Riferimenti bibliografici
Chapman E and Carrington J. Specialization and evolution of endogenous small RNA pathways. Nature Rewievs Genetics 2007, 8:884
Iorns E et al. Utilizing RNA interference to enhance cancer drug discovery. Nature Rewievs Drug Discovery 2007, 6:556
Kawakami S. and Hashida M. Targeted delivery of small interefering RNA by systemic adminitrtion.Drug Metab. Pharmacokin 2007, 22: 142
Kathryn A. Whitehead, Robert Langer & Daniel G. Anderson Knocking down barriers: advances in siRNA delivery Nature Reviews Drug Discovery 8, 129-138 (February 2009)