LEZIONE 4 Anno Accademico 2010/11 BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN...
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LEZIONE 4Anno Accademico 2010/11
BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHECORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO
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Le sfide per il futuro del progetto genoma umano
• comprendere le componenti strutturali e funzionali del genoma
• capire come le reti di geni e proteine contribuiscono alla definizione del fenotipo
• comprendere cosa determina le variazione nella trasmissione dei caratteri genetici
• identificare le varianti genetiche che contribuiscono al mantenimento dello stato di salute
• determinare strategie per identificare il rischio di malattia• stabilire strategie per l’identificazione del contributo del
genoma nella determinazione delle patologie e delle risposte alla terapia
• utilizzare le conoscenze genetiche per lo sviluppo di farmaci innovativi
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I farmaci attualmente sul mercato agiscono su circa 500 prodotti genici
Considerando che il genoma umano contiene circa 20-30.000 geni che codificano per proteine, il potenziale per lo sviluppo di nuovi farmaci è evidente
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GENOMATICA FUNZIONALE
Studio di funzione genica
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LA RICERCA DELLA FUNZIONE DEI GENI
La tradizione:
ricerca di di mutazioni per identificare perdite o acquisizione di funzioni
I metodi della genetica all’incontrario:
Generare nuovi organismi geneticamente modificati per studiare perdita o acquisizione di funzioni
Metodologie innovative:
Studio comparativo di popolazioni di prodotti genici
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La tradizione:
ricerca e analisi di mutazioni e polimorfismi (es RFLP; SNP) del genoma stesso
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Siti polimorfici
• 99.99 % della sequenza del DNA di due individui e’ identica
• la maggioranza delle differenze (0.01%) coinvolgono singole sostituzioni
Polimorfismi al taglio con enzimi di restrizione (RFLP)
Single nucleotide polymorphysm (SNP)
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Polimorfismi al taglio con enzimi di restrizione (RFLP)
Allele 1 Allele 2*
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Polimorfismi al taglio con enzimi di restrizione (RFLP)
associazione RLFP-patologia
Famiglia Patol.
sani
variab nella popol.
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The Lod (log of odds) score is used to calculate the probability of a pedigree arising randomly or by genetic linkage. The test was developed by Newton and Morton
In practice, linkage is declared if the LOD score is equal to or greater than 3 (i.e. the likelihood of observing the result if the two loci are not linked is less than 1 in 1000). On the other hand, linkage can be completely excluded if the LOD score is strictly below -2.
LOD = log Probability of birth sequence with a given linkage value
Probability of birth sequence with no linkage
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Studio di funzione genica Localizzazione posizionale di geni/malattia
Studio di linkage familiare con polimorfismi
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Inheritance pattern – dominant autosomal Entirely penetrant and fatal Frequency - about 1/10,000 live births Late onset - age 35 to 45 Because of late onset, many have children before symptoms appear
Families with a history of Huntington's disease :Indiana University maintains a National Research Roster for Huntington's Patients Large family with a history of Huntington's disease discovered living on shore of lake Maracaibo in Venezuela
For both families with a history of Huntington's disease: Blood samples taken from each member Permanent cell lines established Each family member analyzed by a neurologist for disease symptoms Paternity verified
Huntington, la malattia ideale per position cloning
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1981 - Gusella's group started with a group of anonymous probes that uncovered RFLPs - very few available.
the 12th probe they tried -called G8 - indicated linkage. Disease associated with the A haplotype in the American family and the C haplotype in the Venezuelan family.
LOD Scores 1983 - G8 (also called D4S10) mapped approximately 4 cM from the HD locus. It took 10 more years to clone the gene.
1986-87 DNA markers were used and D4S10 was localized by in situ hybridization and somatic cell genetics to chromosome region 4p16.3; Further linkage studies for isolating HDIdentification of Putative Coding Sequences Exon Trapping; Use trapped exons to identify candidate genes from cDNAs; Four transcripts were analyzed; IT15 - Huntingtin
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Gusella JF, Wexler NS, Conneally PM, Naylor SL, Anderson MSA, Tanzi RE, Walkins PC, et al (1983) A polymorphic DNA marker genetically linked to Huntington's disease. Nature 306:234-238
Huntingtin DNA, protein and uses thereof US Patent Issued on November 11, 1997 Inventor(s): Marcy E. MacDonald; Christine M. Ambrose; Mabel P. Duyao; James F. GusellaAssignee: The General Hospital CorporationApplication: No. 246982 filed on 1994-05-20
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Metodi di identificazione di SNP
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Siti polimorfici per singola sostituzione di base (SNP)
•di base
Nel genoma umano ci sono 200.000 SNP
all’interno di sequenze codificanti, alcuni di questi possono essere
marcatori di patologia
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/About/primer/snps.html
polimorfismo a singolo nucleotide
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Gli SNP sono la causa di circa il 90% della variabilità genetica umana ed in genere si trova uno SNP ogni 100-300 pb. 2/3 SNP vedono sostituita la C con T.
Siti polimorfici per singola sostituzione di base (SNP)
Individuo 1
Individuo 2
Perchè una variazione possa essere considerata un SNP deve essere presente in almeno l’1% della popolazione
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IBRIDAZIONE ALLELE-SPECIFICA
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REAZIONE DI ELONGAZIONE DI PRIMER FISSATO SU SUPPORTO SOLIDO
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Michiel J. T. van Eijk*, et al. NAR 2004
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AT CGTAGC
TA5’GC
3’
TG5’
AC 3’
DNA is denatured and mixed with oligonudeotides and ligase. The ligase joins pairs of oligonudeotides annealed head to tail if they are correctly base-paired at the junction. Radioactively labeled
oligonudeotides (*) are immobilized and detected by autoradiography only if ligated to biotinylated oligonucleotides (B)
that can be bound to streptavidin on a solid support.LANDEGREN, et al. Science 1998
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BANCHE DATI E IDENTIFICAZIONE DI SNP
dbSNP sono presenti (“annotati”) in diverse banche dati quali: PubMed,
genome project sequences, GenBank records,
the Entrez Gene database, and the dbSTS database of sequence tagged sites.
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Metodologie innovative:
Studio comparativo di popolazioni di prodotti genici
• genomatica comparativa
• generazione di arrays per lo studio comparato di espressione genica
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analisi basata sulla omologia di geni codificanti proteine a funzione nota
Genomatica comparativa:
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Ortologo e paralogo
• Ortologhi – geni omologi con la stessa funzione in organismi diversi
• Paraloghi – geni all’interno dello stessoorganismo derivanti da duplicazione genica
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Geni ortologhi o paraloghi
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ARRAY
MACROARRAY
MICROARRAY
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DNA microarray (o gene/genome chip, DNA chip, o gene array) è una collezione di depositi puntiformi di DNA, ciascun punto
rapresentante un singolo gene immobilizzati su un supporto (vetro,
plastica o silicone) mediante legami di tipo irreversibile.
Esempio di microarray con 40.000 oligo immobilizzati su supporto solido e ibridati con cDNA
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APPLICAZIONI DI ARRAY:
• SNP detection arrays – per identificare polimorfismi di singoli nucleotidi nel genoma di diverse popolazioni
• ibridazione genomica comparativa (Array CGH) – per identificare riarragiamenti coinvolgenti un numero significtativo di basi
• mRNA or gene expression profiling – per studiare i livelli di espressione di migliaia di geni simultaneamente
• Chromatin immunoprecipitation (chIP) studies – per determinare il legame di specifche proteine in porzioni specifiche del DNA (ChIP-on-chip technology)
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mRNA or gene expression profiling
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Clustered Image Maps
Drugs x CellsGenes x Cells
Genes x Drugs
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Database Microarray Experiment Sets Sample Profiles
Genomics and bioinformatics group NCI and NIH
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Studio di proteine che interagiscono con DNA
![Page 41: LEZIONE 4 Anno Accademico 2010/11 BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO.](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062418/5542eb4f497959361e8bf27e/html5/thumbnails/41.jpg)
ChIP-on-chip (o ChIP-chip) è una tecnica che combina la immunoprecipitazione di cromatina (chromatin immunoprecipitation)
"ChIP” con la tecnologia del micro array (“chip").
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Chip-on-chip analysis per lo studio delle interazioni DNA proteine
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read-outNormalizzazione dei dati
e analisi esplorativa dei dati
“estrazione delle informazioni”Sito DNA
arricchimento proteina di interesse