BIOQUIMICA FARMASEUTICA
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7/27/2019 BIOQUIMICA FARMASEUTICA
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ESCUELA SUPERIOR POLITCNICA DE CHIMBORAZO
FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA DE BIOQUMICA Y FARMACIA
EVALUACIN IN VITRO DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS
ALCALOIDES DEL AGUA DE COCCION DEL PROCESO DE
DESAMARGADO DEL CHOCHO (Lupinus mutabilis Sweet)
TESIS DE GRADO
PREVIA LA OBTENCIN DEL TTULO DE
BIOQUMICO FARMACUTICO
PRESENTADO POR
ADRIANA ISABEL RODRGUEZ BASANTES.
RIOBAMBA ECUADOR2009
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DEDICATORIA
A dos seres extraordinarios, mis padres
quienes con su apoyo, dedicacin, y
paciencia incondicional me motivaron a
culminar mi carrera, siendo pilares
fundamentales en mi educacin espiritual
y profesional.
A mi esposo por su comprensin.
A mis hijos por ser la luz de mi vida.
A mi abuelito, por brindarme su apoyo, y
por siempre creer en m.
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AGRADECIMIENTO
A la Escuela Superior Politcnica de Chimborazo
Al Instituto Nacional Autnomo de Investigaciones
Agropecuarias INIAP, en especial al Departamento de
Nutricin y Calidad de la Estacin Experimental Santa
Catalina y a travs de ste a la Ing. Elena Villacrs, Directora
del Proyecto PIC-05-2006-2-003 Evaluacin yaprovechamiento de la Actividad antibacterina y antifngica
de los alcaloides del chocho (Lupinus mutabilis Sweet), sobre
cepas ATCC; por todas las facilidades brindadas.
A la Secretara Nacional de Ciencia y Tecnologa SENACYT,
por el financiamiento para la realizacin del presente estudio.
Mi eterna gratitud y sincero agradecimiento a la Dra. Janneth
Gallegos, por su valiosa direccin durante el desarrollo y
culminacin de la presente investigacin.
A la Dra. Lourdes Cuadrado Merino, por su valiosacolaboracin incondicional brindada en el desarrollo de la
investigacin.
A la Dra. Susana Abdo, por el gran aporte brindado en la
elaboracin del trabajo.
Y a todas las personas que colaboraron de cualquier manera
para la culminacin de este trabajo de investigacin
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ESCUELA SUPERIOR POLITCNICA DE CHIMBORAZO
FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA DE BIOQUMICA Y FARMACIA
El Tribunal de Tesis certifica que: El trabajo de investigacin: EVALUACIN in
vitro DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS ALCALOIDES DEL
AGUA DE COCCION DEL PROCESO DESAMARGADO DEL CHOCHO
(Lupinus mutabilis Sweet), de responsabilidad de la seorita egresada Adriana
Isabel Rodrguez Basantes, ha sido prolijamente revisado por los Miembros del
Tribunal de Tesis, quedando autorizada su presentacin.
FIRMA FECHA
Dr. Edmundo Calua.DECANO FACULTAD CIENCIAS
Dr. Luis Guevara.DIRECTOR DE LA ESCUELA DEBIOQUMICA Y FARMACIA.
Dr(a)Janeth GallegosDIRECTORA DE TESIS
Dr(a).Susana AbdoMIEMBRO DE TRIBUNAL
Dr. Carlos Rodrguez.DIRECTOR DEL CENTRO DEDOCUMENTACION
NOTA DE TESIS ESCRITA ______________________
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Yo, Adriana Isabel Rodrguez Basantes, soyresponsable de las ideas, doctrinas y resultadosexpuestos en esta Tesis; y el patrimonio intelectual dela Tesis de Grado, pertenece a la ESCUELASUPERIOR POLITCNICA DE CHIMBORAZO
________________________________________
ADRIANA ISABEL RODRGUEZ BASANTES
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INTRODUCCIN
Es indudable que las plantas constituyen una fuente inagotable de una serie de
principios activos, muchos de los cuales han sido de gran utilidad en el tratamiento de
diversas patologas, las cuales son tan crticas como la falta de medicamentos, adems
de los altos precios de estos, en el mercado nacional e internacional que los hace
inalcanzable para aquellas personas de menores recursos econmicos, as como la gran
diversidad de manifestaciones adversas y el incremento de interacciones
medicamentosas. Igualmente, muchos de los usos de las plantas como parte de la
medicina tradicional, se encuentran a nivel de testimonios, por lo que se hace
indispensable el estudio sistematizado de las mismas por parte de las instituciones
cientficas con el objeto de validar los usos tradicionales.
El Lupinus mutabilis Sweet (chocho), es una leguminosa oriunda de los Andes
Sudamericanos, las semillas desamargadas y en cocimiento son utilizadas por el
poblador andino de nuestro pas como alimento y medicina.
Si bien es cierto que el gneroLupinus, ha sido muy estudiado desde el punto de vista
nutricional; sin embargo por su alto contenido de alcaloides no ha permitido el consumo
directo, debiendo previamente eliminarse estos. El producto lquido del desamargado ha
sido utilizado por pequeos agricultores para combatir a las garrapatas en el ganado
ovino y en camlidos, asimismo se utiliza como regulador del crecimiento o fertilizante
en los cultivos de maz, trigo, soja y papa.
En el proceso hdrico de desamargado se elimina el 99.92% de alcaloides, siendo su
contenido ms alto en el agua de coccin, por lo que al ser eliminadas estas sustancias
indiscriminadamente en los distintos cuerpos acuferos, contribuye al proceso de
contaminacin ambiental, volviendo muy complicado y costoso el proceso de
recuperacin de estas aguas. Ante esta problemtica se ha buscado alternativas para
reutilizar este residuo y elaborar productos benficos para el hombre, aprovechando las
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propiedades benficas que poseen los alcaloides quinolizidnicos presentes en el agua de
desamargado.
Adems no podemos dejar pasar por alto la gran incidencia que tienen en nuestro medio
las infecciones gastrointestinales, respiratorio-pulmonares, de mucosas y de la piel, por
lo que el control de los agentes implicados causales de estas enfermedades debe buscar
nuevas alternativas, y una de ellas es la investigacin de la actividad farmacolgica de
los metabolitos secundarios sintetizados por las plantas.
En este contexto, y en base a estudios preliminares que han demostrado las propiedades
que pueden ser explotadas a partir de los alcaloides quinolizidnicos, el objetivo de esta
investigacin fue evaluar in vitro la actividad antimicrobiana de los alcaloides del
chocho sobre cepas de microorganismos ATCC.
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CAPTULO I
1. MARCO TERICO
1.1. EL CHOCHO (Lupinus mutabilis Sweet)
El chocho o tarwi, es una leguminosa originaria de los Andes de Bolivia, Ecuador y
Per, tiene relevancia en la gastronoma de esos pases desde la poca prehispnica. Sualto contenido de protenas, mayor que el de la soja, lo hace una planta de inters para la
nutricin humana y animal. Segn los especialistas, su consumo en diversas
presentaciones (cremas, guisos, postres) ayuda a los nios en su crecimiento y
desarrollo cerebral, pues tiene calcio y aminocidos (21) (35).
FOTOGRAFA No. 1. EL CHOCHO (Lupinus mutabilis Sweet)
El gnero Lupinus consta de unas 200 especies distribuidas en Amrica, se cultiva entre
los 2500 a 3400 m.s.n.m., requiere entre 350-800 mm de precipitacin anual, siendo
cultivado exclusivamente en zonas secas, es susceptible al exceso de humedad, y
moderadamente susceptible a la sequa durante la floracin y envainado. No tolera las
heladas en la fase de formacin del racimo y madurez, aunque algunos ecotipos
cultivados a orillas del lago Titicaca, tienen una mayor resistencia al fro. Prefiere
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suelos francos y franco-arenosos, con balance adecuado de nutrientes, buen drenaje, y
pH que oscila entre 5 y 7. (41, 42).
1.1.1. TAXONOMIA deLupinus mutabilis Sweet.
Tronco : Cormofitas
Divisin : Embriofitas sifongamas
Sub Divisin : Angiosperma
Clase : Dicotiledneas
Sub Clase : Arquiclamideas
Orden : RosalesFamilia : Leguminosas
Sub Familia : Papilionceas
Gnero : Lupinus
Especie : mutabilis
Nombre Cientfico : Lupinus mutabilis Sweet
Nombre Comn : Tarwi, Chocho (52)
1.1.2. DESCRIPCIN BOTNICA DELupinus mutabilis Sweet.
1.1.2.1 Hojas
La hoja deLupinus es de forma digitada, generalmente compuesta por ocho fololos que
varan entre ovalados a lanceolados. En la base del pecolo existen pequeas hojas
estipulares, muchas veces rudimentarias (Fotografa No. 2). Se diferencia de otras
especies de Lupinus en que las hojas tienen menos vellosidades (31).
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FO
El color de las hojas pued
contenido de antocianina (1
1.1.2.2 Tallos y ramificac
La altura de la planta est
el tallo del chocho es gene
Su alto contenido de fib
combustin, sin embargotallo oscila entre verde os
oscuro (24, 31).
FO
El nmero de ramas vara
ramas fructferas tiene co
((24, 30, 31).
OGRAF A No. 2. HOJAS DEL CHOCHO
variar de amarillo verdoso a verde oscuro,
1, 12, 24, 31).
iones
eterminada por el eje principal que vara en
ralmente muy leoso y se puede utilizar co
ra y celulosa, hace que se lo emplee co
odra permitir un proceso de industrializacuro y castao. En las especies silvestres es
OGRAF A No. 3. TALLOS DEL CHOCHO
desde unas pocas hasta 52 ramas. El nmer
relacin positiva con una alta produccin
dependiendo del
tre 0,5 a 2,00 m,
o combustible.
mo material de
n. El color delrojizo a morado
de vainas y de
(Ticona, 1975),
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1.1.2.3 Flores e inflorescencia
El chocho pertenece a la subfamilia Papilionoideas por lo cual presenta una corola
grande de 1 a 2 cm, con cinco ptalos y compuesta por un estandarte, dos quillas y dos
alas (24, 31).
Segn el tipo de ramificacin que presente la planta, puede tener hasta tres floraciones
sucesivas. Blanco, (1980) menciona que en una sola planta pueden existir hasta 1000
flores (11, 12, 24, 39).
La coloracin de la flor vara entre el inicio de su formacin hasta la maduracin, de un
azul claro hasta uno muy intenso y de all se origina su nombre cientfico, mutabilis, es
decir que cambia. Los colores ms comunes son los diferentes tonos de azul e incluso
prpura; menos frecuentes son los colores blanco, crema, rosado y amarillo (Fotografa
No. 4) (11, 12, 24, 39).
FOTOGRAFA No. 4. FLORES E INFLORESCENCIAS DEL CHOCHO
1.1.2.4 Semilla.
Las semillas del chocho estn incluidas en nmero variable en una vaina de 5 a 12 cm y
varan de forma (redonda, ovalada a casi cuadrangular), miden entre 0,5 a 1,5 cm. Un
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kilogramo tiene 3500 a 5000 semillas. La variacin en tamao depende tanto de las
condiciones de crecimiento como del ecotipo o variedad (24, 29, 31).
La semilla est recubierta por un tegumento endurecido que puede constituir hasta el
10% del peso total. Los colores del grano incluyen blanco, amarillo, gris, ocre, pardo,
castao, marrn y colores combinados como marmoleado, media luna, ceja y salpicado
(Fotografa No.5) (Gross, 1982) (24, 29, 31).
FOTOGRAFA No. 5. SEMILLAS DE CHOCHO DE DIFERENTES ECOTIPOS
La gentica en la herencia del color de la semilla es bastante compleja y existen genes
tanto para el color principal, como para cada una de las combinaciones (Blanco, 1980)
(24, 29, 31).
1.1.2.5 Races y ndulos
Como leguminosa, el chocho tiene una raz pivotante vigorosa y profunda que puede
extenderse hasta 3 m de profundidad.
En la raz se desarrolla un proceso de simbiosis con bacterias nitrificantes que forman
ndulos de variados tamaos (1 a 3 cm). En suelos con presencia de bacterias, la
formacin de ndulos se inicia a partir del quinto da despus de la germinacin (Meza
1974), los ndulos pueden alcanzar un dimetro hasta de 3 cm; se localizan
principalmente en la raz primaria, por encima de la ramificacin radicular, e incluso en
las races secundarias (Fotografa No.6), (Lange y Parker, 1960) (24, 34, 31).
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FOTOGRAFA No. 6. RACES Y NDULOS DEL CHOCHO
Bernal, (1982) encontr cepas de Rhizobium lupini con gran efectividad y su presencia
en el eje central de la raz estuvo altamente correlacionada con plantas ms vigorosas y
productivas. Estas bacterias tienen la propiedad de fijar nitrgeno de la atmsfera en el
suelo, las plantas pueden utilizar este nitrgeno como abono natural (29,31).
1.1.3 COMPOSICIN QUMICA
1.1.3.1 Composicin qumica y valor nutricional
En los ensayos sobre los componentes qumicos del grano de Lupinus mutabilis Sweeta
veces se encuentran ambigedades, incoherencias y hasta contradicciones, mismas que
dificultan una evolucin de los datos (Tabla No. 1). Diferencias que pueden deberse a
la variabilidad gentica y a la influencia ambiental. La semilla cruda de chocho tiene un
promedio del 19 % en aceite, lo que constituye un atractivo econmico (14).
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TABLA No. 1 COMPOSICIN POR 100 g DE PORCIN COMESTIBLE DEL CHOCHO
Composicin chocho cocidocon cscara
chochocrudo
sin cscara
chochoharina
Energa Kcal. 151 277 458Agua g 69.7 46.3 37.0
Protena g 11.6 17.3 49.6Grasa g 8.6 17.5 27.9
Carbohidratos g 9.6 17.3 12.9Fibra g 5.3 3.8 7.9
Ceniza g 0.6 1.6 2.6Calcio mg 30 54 93
Fsforo mg 123 262 440Hierro mg 1.4 2.3 1.38Tiamina mg 0.01 0.60 .
Riboflavina mg 0.34 0.4 -Niacina mg 0.95 2.10 .
cido ascrbico 0.00 4.6 .FUENTE: CAICEDO C. (2000)
1.1.3.2 Protenas solubles en agua.
El contenido de protenas en el chocho es tan alto como en los granos de soja. Las
globulinas corresponden a la mayor fraccin proteica, siendo la albmina la restante.
Las globulinas presentan un amplio punto isoelctrico entre pH 4 6 con solubilidad
mnima de nitrgeno entre 10 20 % (14,24).
El comportamiento de las protenas en cuanto a la solubilidad es muy diverso y depende
del nmero de grupos polares y apolares y de su ordenacin en la molcula.
En general, las protenas slo son solubles en disolventes fuertemente polares, como
por ejemplo agua, glicerol, formamida, dimetil-formamida, cido frmico, en
disolventes menos polares, como por ejemplo el etanol, solo en caso excepcionales hay
una notable solubilidad. La solubilidad en agua depende del pH y la presencia de sal
(25, 27).
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Las sales neutras tienen en general una doble influencia sobre la solubilidad de las
protenas a concentraciones bajas (0,5-1 mol/L), actan como consecuencia de la
disminucin de las interacciones electrostticas protena-protena, aumentando la
solubilidad (12,13,24)
La capacidad de imbibicin es para las protenas insolubles lo que la hidratacin para
las protenas solubles. Por penetracin de agua en la estructura, se produce un aumento
de volumen y otras modificaciones de las propiedades fsicas (29).
1.1.3.3 Lpidos.
El Lupinus mutabilis Sweet tiene un elevado contenido de grasa (18 - 25 %), lo que
hace factible para la extraccin de aceite a nivel industrial (17, 24, 29).
Los lpidos constan de cidos grasos insaturados y su composicin es semejante a la del
man, aproximadamente la mitad de estos constan de cido oleico (36.154.6%),
existiendo un 22.3 - 43.9% de cido linoleico y el 2.1 - 2.7 % le corresponde al cido
linolnico. El aceite delLupinus albus contiene pequeas cantidades de cido ercico,
mientras que la semilla delLupinus mutabilis Sweetno lo contiene. (17, 24, 29).
1.1.3.3.1 cidos Grasos.
El cido graso que predomina en el chocho, man y soja es el cido oleico, siendo as
que su concentracin en la semilla de chocho se aproxima al 40.40% (Tabla No. 2).
La concentracin de cido linolnico en la semilla del Lupinus mutabilis es baja,
caracterstica que favorece la conservacin del aceite ya que este se oxida rpidamente y
podra originar cambios indeseables en el sabor del aceite (17, 24, 29).
La composicin de cidos grasos, a diferencia de los aminocidos, depende fuertemente
de las influencias ambientales, de manera que puedan presentarse considerables
variaciones segn las localizaciones y los aos (17, 24, 29).
TABLA No. 2 COMPOSICIN DEL CONTENIDO DE CIDOS GRASOS EN CHOCHO, MAN YSOJA
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cidos GrasosLupinus mutabilis Sweet
Man SojaAmargo Semidulce
Mirstico
Palmtico
Palmitoleco
Esterico
Oleico
Linoleico
Linolnico
Araqudico
Behmico
Cuociente P/S a
0.60
13.40
0.20
5.70
40.40
37.10
2.90
0.20
0.20
2.00
0.30
9.80
0.40
7.80
53.90
25.90
2.60
0.60
0.50
1.5
0.10
11.00
-----
3.0
55.00
28.00
1.00
1.50
3.50
----
----
11.00
-----
4.00
22.00
55.00
8.00
0.40
0.30
------a P/S: Poliinsaturados/saturadosFUENTE: VILLACRS, E; CAICEDO, C; PERALTA, E. 1998. DISFRUTE COCINANDO CON CHOCHO.
RECETARIO. PRONALEG. EESC-INIAP-FUNDACYT. P-BID-206. JUNIO. QUITO, ECUADOR. 48 P.
1.1.3.4 Fibra.
El contenido de fibra representa ms del 6%, se debe principalmente a la cubierta
seminal que comprende el 10% del peso de la semilla (17, 24, 29).
1.1.3.5 Aminocidos
La distribucin de los aminocidos es relativamente estable, presenta mayor contenido
de triptfano y tirosina frente a la soja y el frjol (Tabla No. 3), los aminocidos
azufrados como la metionina son los primeros limitantes, pero se puede equilibrar este
dficit combinando el chocho especialmente con cereales ya que estos en cambio sondeficientes en lisina (17, 24, 29).
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TABLA No. 3 CONTENIDO DE AMINOCIDOS EN CHOCHO, SOJA, FRJOL Y MAN
Aminocidos Chocho Soja Frjol Man
Isoleucina
LeucinaLisinaMetioninaCistinaFenilalaninaTirosinaTreoninaTriptfanoValinaArgininaHistidinaAlaninaAcido AsprticoAcido GlutmicoGlicinaProlinaSerina
274
4493314787231221228110252594163221685
1372259257317
284
4863997983
30919624180
300452158266731
1169261343320
262
4764506653
326158248----287355177262748924237223347
211
4002217278
31124416365
261697148243712
1141349272299
Total aminocidos 6051 6157 5662 5887Total aminocidos Esenciales 2183 2457 2389 2026
FUENTE: VILLACRS, E; CAICEDO, C; PERALTA, E. 1998. DISFRUTE COCINANDO CON CHOCHO. RECETARIO. PRONALEG. EESC-INIAP-FUNDACYT. P-BID-206. JUNIO. QUITO, ECUADOR. 48 P.
1.1.3.6 Minerales solubles en agua
El contenido de sustancias minerales en el chocho se asemeja al de otras semillas de
leguminosas (Tabla No. 4). nicamente el contenido de fsforo y magnesio es un poco
ms elevado. La semilla de lupino representa, en total, una valiosa fuente de magnesio,
fsforo y potasio para el hombre.
Dado que el calcio se encuentra principalmente en la cscara, mientras que el fsforo se
halla en el ncleo. Hay que tener presente que la relacin calcio-fsforo se altera tras el
descascarado del grano (17, 24, 29).
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TABLA No. 5 CONTENIDO DE VITAMINAS EN LA SEMILLA CRUDA DE CHOCHO
Vitaminas mg/100g
-caroteno 0.09
Tiamina 0.51Riboflavina 0.42
Niacina 4.1
FUENTE: GROSS, (1982)
1.1.3.9 Sustancias Antinutricionales.
Como en todas las semillas leguminosas, tambin en el grano de chocho se hallaalgunas sustancias antinutritivas, que limitan el uso directo de grano crudo en
alimentacin humana y animal (14, 17, 24, 28,32).
Entre las sustancias antinutritivas del chocho se citan:
Inhibidores de proteasas, que tienen la propiedad de inhibir la actividad
proteoltica de ciertas enzimas.
Hemaglutininas, que son protenas que coagulan o aglutinan los glbulos rojos y
reaccionan como una especie de anticuerpo.
Glucsidos cianogenticos, que liberan cido cianhdrico por accin enzimtica,
sin embargo su concentracin en el chocho no tiene importancia desde el punto
de vista toxicolgico.
Alcaloides que constituye el principal obstculo para la utilizacin directa, ya
que su alto contenido determina que los granos sean txicos y amargos (14, 17,
24)
1.1.4 PROPIEDADES Y USOS DE LAS SEMILLAS DEL LUPINO
El grano desamargado tiene una infinidad de usos:
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Consumo humano: En fresco se puede utilizar en ceviche, sopas (crema de
chocho); guisos, postres y refrescos (jugo de papaya con harina de chocho).
(Anexo No.1)
Industrialmente: La harina de chocho puede ser usada en panificacin, tiene la
ventaja de mejorar considerablemente el valor proteico y calrico el producto;
asimismo permite una ms larga conservacin del pan debido a la retrogradacin
del almidn, obtenindose un mayor volumen por las propiedades emulgentes
que tiene la lecitina del chocho dulce (37,45)
Uso Medicinal: Los alcaloides (espartena, lupinina, lupanidina, etc) se emplean
para controlar ectoparsitos y parsitos intestinales de los animales.
Ocasionalmente los agricultores utilizan el agua de coccin del tarwi como
laxante y para el control de plagas en plantas (24)
Uso Agronmico: En el estado de floracin la planta se incorpora a la tierra
como abono verde, con buenos resultados mejorando la cantidad de materia
orgnica, estructura y retencin de humedad del suelo (24, 44)
Por su contenido de alcaloides se siembra a menudo como cerco vivo o para
separar parcelas de diferentes cultivos, evitando el dao que pudieran causar los
animales.
Como combustible: Los residuos de la cosecha (tallos secos) se usan como
combustible por su gran cantidad de celulosa que proporciona un buen poder
calorfico. (24, 49)
El cultivo tiene potencial productivo y perspectivas de uso como oleaginosa, fuente de
protena, fijador de nitrgeno y productor de alcaloides con uso en sanidad animal y
vegetal. (24, 49)
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1.2 ALCALOIDES.
1.2.1 GENERALIDADES.
En el siglo XIX se lograron verdaderos adelantos en la farmacologa, con el sucesivo
aporte de remedios procedentes de plantas, este avance haba sido precedido por los
trabajos del sueco Carl Scheele, quien logr aislar los cidos orgnicos de las plantas, y
del joven boticario Friedrich Wilhelm Sertrner (1783-1841) que con sus audaces y
llamativos experimentos descubri en 1816 el principio activo ms importante del opio
de la amapola, la morfina cuyos cristales dieron lugar al principium somnferum(que
Gay-Lussac llamara luego morfina, por el dios griego Morfeo) que Osler llam Lamedicina de Dios, porque revolucion la lucha contra el dolor; al igual que otros
compuestos orgnicos obtenidos de las plantas, fue llamada alcaloide, trmino
acuado en 1818 por Wilhelm Meissner y se aplic a los compuestos de origen vegetal
con propiedades alcalinas, y que recuerdan la reaccin de los minerales con carcter
bsico (45, 49)
No existe una definicin sencilla de alcaloides, si se consideran las distintas diferenciasen cuanto a estructura y propiedades de los 6000 compuestos descritos en este grupo. La
dificultad principal radica en establecer el lmite de separacin de los alcaloides de otros
compuestos orgnicos nitrogenados de origen natural. Se considera como alcaloide Un
compuesto orgnico de origen natural (generalmente vegetal), nitrogenado (el nitrgeno
se encuentra generalmente intracclico), derivados generalmente de aminocidos, de
carcter ms o menos bsico, de distribucin restringida, con propiedades
farmacolgicas importantes a dosis bajas y que responden a reacciones comunes de
precipitacin. De acuerdo a las caractersticas de esta definicin, algunos autores han
dividido a los alcaloides en cuatro clases (Figura No.1) (6, 17)
Alcaloides verdaderos
Protoalcaloides
Pseudoalcaloides
Alcaloides imperfectos
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Alcaloides Verdaderos c
de alcaloide: son formad
intracclico, son de carcte
sal.
Protoalcaloides son amina
productos del metabolismo
Pseudoalcaloides presenta
pero no son derivados de a
Alcaloides imperfectos so
especficos para alcaloides
FIGURA No. 1 ASPECTOS BI
En cuanto a su estado natu
todos los rganos de la pla
nicotina, pilocarpina), en fl
peletiarina, coniina), en se
en la raz (emetina y cefali
mplen estrictamente con las caractersticas
os a partir de aminocidos, tienen siemp
r bsico y existen en la naturaleza normalme
s simples con nitrgeno extracclico, de car
de los aminocidos.
n algunas de las caractersticas de la definic
inocidos.
n derivados de bases pricas, no precipitan
(6, 17, 32)
GENTICOS PARA LA CLASIFICACI N DE LOS
ral, los alcaloides son esencialmente sustan
nta, pueden encontrarse mayoritariamente e
ores (escopolamina, atropina), en frutos (alc
illa (piperina, arecolina), en corteza (quinin
a) (6, 17).
de la definicin
re un nitrgeno
nte en estado de
ter bsico y son
in de alcaloide,
on los reactivos
LCALOIDES
ias presentes en
hojas (cocana,
aloides del opio,
a, tubocurarina),
-
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1.2.2. FUNCIN DE LOS ALCALOIDES EN LAS PLANTAS
La funcin de los alcaloides en las plantas no es aun clara, existen algunas sugerencias
sobre el rol que juegan estas sustancias en los vegetales como:
Sirven como productos de desecho o almacenamiento del nitrgeno sobrante,
esta funcin es equivalente a la del cido rico o de la urea en los animales.
Debido a que en su mayora, los alcaloides son asociados con cidos orgnicos
que le facilita el transporte en la planta, pueden servir como productos de
almacenamiento del nitrgeno no metabolizado o para transporte del mismo; en
el caso de las Solanaceas midriticas, los steres del tropano se forman en las
races y son transportados a las partes areas donde pueden ser hidrolizados.
La microqumica ha permitido mostrar en forma general, que los alcaloides son
localizados en los tejidos perifricos de los diferentes rganos de la planta, es
decir en el recubrimiento de las semillas, corteza del tallo, raz o fruto y en la
epidermis de la hoja; esto nos permite pensar que los alcaloides cumplen una
importante funcin como es la de proteger a la planta, por su sabor amargo de
estos, del ataque de insectos (6, 17, 32, 45).
Los alcaloides pueden servir de reguladores del crecimiento, se ha demostrado
que los alcaloides derivados de la putrescina se incrementan notablemente
durante la germinacin de algunas plantas como la cebada, cuando se encuentran
en suelos deficientes de potasio (6, 17, 32, 45).
Mediante tcnicas biotecnolgicas, las plantas que normalmente acumulan
alcaloides en las partes areas, como es el caso de laNicotiana yDaturas, se han
producido sin alcaloides, la prdida de alcaloides en el vstago, no impide el
desarrollo de la planta, lo cual sugiere que los alcaloides no son esenciales para
los vegetales Si bien, la presencia de alcaloides no es vital para la planta, estos
deben de participar en secuencias metablicas y no son solamente productos de
desecho del metabolismo (6, 17, 32, 45).
-
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1.2.3. PROPIEDADES FSICO-QUMICAS DE LOS ALCALOIDES.
Algunas bases no oxigenadas son lquidas a temperatura ambiente, los alcaloides bases
son normalmente slidos cristalizables, raramente coloreados. Casi siempre estn
dotados de poder rotatorio especfico y las bases cristalizadas tienen puntos de fusin
netos, sin descomposicin por debajo de 200 C (2, 15, 56)
Por regla general, los alcaloides bases son muy poco solubles en agua, solubles en
disolventes orgnicos apolares o poco polares y solubles en alcoholes de ms elevada
graduacin (2, 15, 56).
El carcter bsico de los alcaloides es muy variable, dependiendo esta propiedad de la
disponibilidad del doblete libre del nitrgeno.
Los agrupamientos electroflicos adyacentes al tomo de nitrgeno, disminuyen la
basicidad y los de carcter contrario la aumentan. El sistema heterocclico puede
permitir una basicidad muy variable. En el caso del pirrol o del indol, el doblete del
nitrgeno participa en la aromaticidad, por lo que no son bsicos (2, 15, 56).
Por su carcter bsico, los alcaloides forman sales con cidos minerales u orgnicos,
stas son hidrosolubles, insolubles en disolventes orgnicos apolares y solubles en
alcoholes. La formacin de sales, estabiliza la molcula, por lo que comercialmente los
alcaloides se encuentran al estado de sales (2, 15, 56).
Los alcaloides son sustancias interesantes, por sus actividades farmacolgicas que se
ejercen sobre los ms variados terrenos: SNC, SNV (simptico y parasimptico),cardiovascular, anestesia, tumores, enfermedades parasitarias, etc. (2, 15, 56).
1.2.4. ALCALOIDES QUINOLIZIDNICOS
En el gneroLupinus los alcaloides quinolizidnicos se sintetizan en los cloroplastos de
las hojas y son transportados va floema a otros rganos de la planta para su
almacenamiento en tejido epidrmico y subepidrmico de hojas tallos y principalmentesemillas (75). Las semillas de lupinus de la variedad dulce tienen bajos contenidos de
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alcaloides (59), son una buena fuente de nutrientes, debido al contenido de protenas,
lpidos, fibra diettica, minerales y vitaminas (38).
Los alcaloides quinolizidnicos poseen un heterociclo nitrogenado bicclico,
quinolizidina y se encuentra tanto en los alcaloides indlicos como en los que derivan
del metabolismo de la tirosina (32).
Las quinolizidinas autnticas son aquellas que se derivan de la lisina, y se pueden
dividir en bicclicas como la lupanina, tricclicas como la cisticina o tetracclicas como
la espartena (49).
Ms de 150 especies de lupinus son conocidos en la naturaleza. Los alcaloides
quinolizidnicos estn ampliamente distribuidos entre las leguminosasLotoideas, siendo
los lupinos los ms ricos en este tipo de alcaloides (49).
Cho y Martn, (1971), citado por Gross, (1982), aislaron casi 60 diferentes alcaloides en
mas de 180 especies de leguminosas. En Lupinus mutabilis se han encontrado 25
alcaloides quinolizidnicos de los cuales 19 se han identificado hasta la presente (Tabla
6) (3, 49).
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TABLA No. 6 COMPOSICIN RELATIVA DE ALCALOIDES EN LA SEMILLA DE Lupinusmutabilis.
AlcaloidesComposicin Relativa
de Alcaloides (%)
Espartena 7,39
K2 ( no identificada) 0,07
Ammodendrina 0,23
K5 (no identificada) 0,16
N-Metilangustifolia 3,46
Angustifolia + 17 oxoespartena 0,60
Isolupanina 0,29
K9 (no identificada) 57,5
4- hidroxilupanina 8,65
Multiflorita 0,14
17- Oxolupanina 0,09
Anagirina 0,03
13-Hidroxilupanina 14,9
4,13- dehidroxilupanina 2,12
K17- K19 (no identificada) 0,09
13- tigloiloxilupanina 0,28
Monoangeloil + ester de la monogloil 0,45
de la 4,13 dehidroxilupanina 0,08
K24 (no identificada) 0,21
13 Benzoiloxilupanina 1,15
13-cis-cinnammoiloxilupanina 0,39
13-trans-cinnammoilxilupanina 99,39
13-angeloiloxilupanina 1,57
Contenido total de alcaloides en la semilla 3,10
FUENTE: GROSS (1982)
Estudios realizados por Pealoza, (1988) indican que las principales fracciones de
alcaloides del chocho son:
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TABLA No. 7 PRINCIPALES FRACCIONES DE ALCALOIDES DEL CHOCHO
Alcaloides Porcentaje %
Lupanina 60
13-Hidroxylupanina 15
Espartena 7,5
4-Hidroxylupanina 9
Isolupanina 3
FUENTE: JARRIN P. (2003)
1.2.5. BIOSNTESIS DE LOS ALCALOIDES
La biosntesis se basa casi siempre en los aminocidos: ornitina, lisina, fenilalanina,
tirosina, triptfano, histidina y cido antranlico, los que pueden reaccionar con otros
productos elementales del metabolismo general: acetato o mevalonato. La formacin del
heterocclico, es decir el establecimiento de una unin carbono-nitrgeno, se realiza por
un proceso Inter o intramolecular simple que implica la formacin de una base de Schiff
o por una reaccin de Mannich (9).
El heterocclico nitrogenado, quinolizidina se encuentra tanto en alcaloides indlicos
como en los que derivan del metabolismo de la tirosina (2, 15, 56)
Las quinolizidinas autnticas (derivadas de la lisina), se localizan en las leguminosas
lotoideas y se pueden subdividir en bicclicas como la lupanina, tricclicas como la
citosina o tetracclicas como la espartena. La biosntesis de estos alcaloides es compleja
(Figura No.2). (2, 15, 29, 56)
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FIGURA No. 2
1.2.6. PROPIEDADESALCALOIDES Q
Los principales alcaloides
espartena (14%), 4-hidr
(3%), 13-hidroxilupanina (
Estos compuestos poseen
bsico formando por loinsolubles en agua, poco s
poseen oxgeno en su est
contienen oxgeno como l
17, 29, 48).
BIOSNTESIS DE ALCALOIDES QUINOLIZIDNIC
F SICO QU MICAS GENERALEINOLIZID NICOS.
presentes en el chocho son los siguientes:
xilupanina (10%), isolupanina (3%), n-
1%) (2, 17, 29, 48).
propiedades alcalinas debido a la presen
general ncleos heterocclicos. Estos enlubles en alcohol y solubles en ter y clorof
uctura y son slidos no voltiles, sin emb
espartena, siendo esta lquida a temperat
S
DE LOS
upanina (46%),
etilangustifolina
ia de nitrgeno
orma libre sonrmo, la mayora
argo algunos no
ra ambiente (2,
-
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1.2.6.1. PROPIEDADESQUINOLIZID NI
1.2.6.1.1. LUPANINA
La lupanina es el alcaloid
frmula estructural C15H2
g/mol, es soluble en agua,
17, 29, 56)
FIGURA No.
Se puede encontrar la d y
pueden ser identificadas p
forma racmica es encontr
La d-lupanina es un lquid
entre 40 a 44 C, con punto
1.5444, soluble en agua,
puede ser determinada por
C, dehidrocloruro pf. 162
etc (36).
La l-lupanina es un aceite
formar compuestos como
otras sales que podran tend- lupanina (33).
F SICO QU MICAS DE LOSOS.
que se encuentra en mayor concentracin
N2O (Figura No. 3), tiene un peso mole
cloroformo, ter y alcohol e insoluble en te
3. ESTRUCTURA MOLECULAR DE LA LUPANINA
l-lupanina as como tambin sus mezclas,
r la presencia de una de las formas ptica
da en los lupinos blancos.
espeso cristalino con agujas higroscpicas,
de ebullicin entre 190 a 193 C, ndice de r
loroformo, ter y alcohol e insoluble en
el gran nmero de derivados: monohidroclo
-167 C, monohidrobromuro pf: 127 C, pi
viscoso, con un punto de ebullicin entre 18
monohidroyoduro pf. 183-185 C, perclora
er similares puntos de fusin a sus derivado
ALCALOIDES
n el chocho, su
ular de 248.36
r de petrleo (2,
las mismas que
ente activas. La
punto de fusin
efraccin igual a
ter de petrleo;
ruro pf. 217-269
rato pf. 211 C,
6-188 C, puede
o pf. 213 C, y
s anlogos de la
-
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La lupanina tiene actividad
contra lepidpteros y co
moduladoras, inhibe la s
tRNA, adems posee activ
(14, 52).
1.2.6.1.2. ESPARTE NA
Su frmula estructural es
unidos en forma terciaria, t
lquido oleoso, espeso, in
Tiene un peso especfico
insoluble en agua, alcohol,
FIGURA No.
La espartena es un gangli
la despolarizacin de la
excitacin ganglionar, asdisminuye la excitabilidad
de las contracciones. Sus
digestivos, hipotensin ort
La espartena tiene sus ef
sntesis y formacin del
actividad, oxitotcica, uter
respiratorio (51).
antibacteriana, nematicida, puede utilizarse
epteros, tambin produce inhibicin de
tesis de protenas, inhibe la fase de elon
idad antiarrtmica, hipotensora, y actividad
15H26N2, los dos tomos de nitrgeno de la
ienen un peso molecular de 234 g/mol, (Figu
oloro con olor dbil a anilina y sabor sum
e 1.02 a 20 C y hierve a 311 C en corri
ter, y cloroformo, con reaccin alcalina (19
ESTRUCTURA MOLECULAR DE LA ESPARTEN
pljico poco potente, bloqueando la transmi
embrana postsinptica: despus de una fa
la el miocardio de la influencia neuro-veel tejido nodal, la conductibilidad y la frecu
efectos secundarios son poco importantes
sttica (36).
ctos txicos al inhibir los canales de K+,
NAt, es un depresor del sistema nervios
tnica, antiarrtmica, diurtica, hipoglicemi
omo insecticida
las actividades
acin de Phe
hipoglicemiante
espartena estn
ra No. 4). Es un
amente amargo.
nte alcalina. Es
, 26).
sin por impedir
se transitoria de
getativa central,encia y amplitud
como trastornos
dems inhibe la
o central, posee
nte, estimulante
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1.2.6.1.3. HIDROXILUPANINA
La hidroxilupanina tiene la siguiente frmula estructural C15H24N2O2, con un peso
molecular igual a 264 g/mol. Los compuestos salinos ms representativos de la
hidroxilupanina son: Hidrocloruro pf. 275 C, cloruro arico pf. 210 C, picrobromato
pf. 174-175C, hidroyoduro monohidratado pf. 91-93 C, tiocianato monohidratado pf.
125 C. (51)
Se han identificado dos formas ismeras de la hidroxilupanina como unidades qumicas
representativas, dependiendo de la localizacin del grupo hidroxilo (OH)- en la
estructura bsica de la molcula, estas son: 4-hidroxilupanina (Figura No. 5) y la 13-hidroxilupanina (Figura No. 6) (29, 42).
FIGURA No. 5 4-HIDROXILUPANINA FIGURA No. 6 13-HIDROXILUPANINA
1.2.6.1.4. ANGUSTIFOLINA.
La angustifolina inhibe el crecimiento bacteriano de Bacilo subtillis, Bacilo
thuringiensis yE. coli, participa en la inhibicin de las actividades moduladoras y en la
biosntesis de las protenas. La angustifolina posee actividades similares a las de la
espartena, Lupanina, Angustifolina, 13-hidroxilupanina, Lupinina, 17-oxoespartena,
13-tigloiloxilupanina. La anagirina produce mal formaciones congnitas en terneros
(54).
1.3. APLICACIONES POTENCIALES DE LOS ALCALOIDES DEL LUPINO
El principal propsito de los alcaloides del chocho es la defensa de la planta contra
insectos, herbvoros y patgenos microbianos.
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Ocasionalmente los agricultores utilizan esta propiedad para el control de plagas,
ectoparsitos y parsitos intestinales de los animales, tienen efectos txicos y
mutagnicos en conejos, nemtodos, abejas, caracoles, langostas, gusanos y escarabajos
(54).
Los alcaloides del lupino tienen una significante actividad biolgica que puede ser
explotada en el campo de la farmacia, agricultura, e industria (52, 54).
La Lupanina, Espartena, 13-Hidroxilupanina, Angustifolina, inhiben el crecimiento de
Staphylococcus aureus, Bacilo subtilis, E. coli. Los dos primeros alcaloides poseen
actividad antifngica mientras que la lupinina, lupanina, 13-oxoespartena y espartena,
tienen actividad insecticida, reprimiendo en los insectos el deseo de alimentacin, desta manera eliminan su supervivencia (52).
La Espartena tiene utilidad prctica comercial, gracias a sus aplicaciones en medicina y
en el campo industrial. En el campo mdico, la espartena tiene accin cardiovascular,
es agente dilatador de las coronarias y analgsico, cardiotnico, oxitotcico (32).
En el rea industrial, tiene utilidad en la elaboracin de polmeros pticamente activos,
como catalizador de la polimerizacin del etileno y en la telomerizacin (obtencin depolmeros de bajo peso molecular) del etileno con otras olefinas (26, 28).
Desde el punto de vista farmacolgico, el lupino tambin tiene inters pues algunos de
sus componentes, principalmente los alcaloides, presentan efecto secretagogo de
insulina. En medicina tradicional se les ha atribuido actividad hipoglucemiante que
clsicamente se ha considerado debida a la presencia de los alcaloides, tambin con
actividad hipocolesterolemiante. Igualmente se le atribuyen propiedades
antiinflamatorias y preventivas del cncer por los flavonoides y hepatoprotectoras por
sus saponinas (26, 28).
El efecto hipoglucmico se ha comprobado para algunas especies de lupino
administrados por va oral en animales con diabetes inducida experimentalmente
(conejo, rata, ratn). Igualmente en conejos diabticos y con niveles de colesterol
elevados, se comprob como la adicin de semillas de lupino a su alimentacin produjo
una disminucin de la hiperglucemia postprandial y del colesterol (26, 28, 48).
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Los principios activos responsables de la actividad hipoglucemiante podran ser adems
de los alcaloides, los compuestos de naturaleza saponnica presentes en el extracto de
lupinus, pues muchos de ellos han demostrado ser capaces de inhibir la gluconeognesis
heptica y la glucogenlisis y adems son capaces de activar la produccin de insulina o
inducir un incremento en el metabolismo perifrico de la glucosa (26, 28).
Por otra parte se ha comprobado que este extracto es capaz de normalizar los sistemas
de destoxificacin del organismo, anormalmente alterados en animales diabticos (26,
28, 48).
La actividad de la espartena se ha estudiado tambin en humanos sanos y en pacientes
diabticos insulino-dependientes y con diabetes tipo 2. La administracin intravenosadel sulfato de espartena en personas sanas incrementa la secrecin de insulina basal o
inducida por glucosa y, en pacientes con diabetes tipo 1 aumenta la secrecin de
glucagn. En diabticos tipo 2, la espartena estimula la secrecin de las clulas beta,
produciendo una cada en los niveles plasmticos de glucosa (26, 28).
Recientemente (2004) se ha estudiado el efecto sobre la secrecin de insulina de tres
alcaloides aislados de lupinos: lupanina, 13-alfa-OH lupanina y 17-oxo-lupanina as
como un compuesto derivado sinttico: 2-tionospartena, comprobndose in vitro, un
incremento en la liberacin de insulina inducida por glucosa. La intensidad del efecto
depende de la concentracin de glucosa en el medio y se debe, al menos en parte, al
bloqueo de canales de Ksensibles a ATP en clulas beta (2, 11, 27, 29).
Los autores del trabajo sugieren que la administracin de los alcaloides de lupino puede
disminuir el riesgo de hipoglucemia que se produce con algunos hipoglucemiantes
orales que, estimulan la secrecin de insulina en presencia de bajas concentraciones deglucosa. (26, 28).
1.4. TOXICIDAD DE LOS ALCALOIDES DEL CHOCHO
La toxicidad de estos compuestos ha sido demostrada a dosis muy altas tanto en
animales como en seres humanos. Han ocurrido casos aislados de envenenamiento con
semillas de lupino. Dosis comprendidas entre 11 a 25 mg/Kg de peso corporal en nios
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y dosis de 25 a 46 mg/Kg de peso corporal en adultos producen graves intoxicaciones
(11, 29).
Los sntomas de envenenamiento son: midriasis, calambres, cianosis, parlisis
respiratoria, violentos dolores estomacales, vmitos e incluso coma (11, 29).
La reaccin toxicolgica frente a los alcaloides quinolizidnicos vara entre las
diferentes especies animales; Eichekbaum, (1927), citado por Gross, (1982), seala que
los peces en general y en especial las truchas Salmo gairdnerii muestran una elevada
sensibilidad a un exceso de estos compuestos (11, 29).
Entre las propiedades toxicolgicas de los alcaloides del chocho Lupinus mutabilis
Sweet, tambin se menciona su capacidad para inhibir la germinacin de varias semillas
(2, 11, 29).
1.5. ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA.
Un agente antimicrobiano, es un compuesto qumico que inhibe el crecimiento o mata a
los microorganismos. La contribucin de nuevos estudios acerca de sustancias que
posean actividad antimicrobiana es muy importante dado que en la actualidad se ha
creado resistencia a muchos compuestos y productos qumicos conocidos como
antibacterianos, adems stos agentes teraputicos son en su mayora responsables de
efectos colaterales indeseables para el ser humano (47, 48)
Se conoce que la presencia de metabolitos en las plantas est en relacin directa a su
bioactividad, por lo que es necesario para la seleccin de las mismas conocer sobre los
tipos de compuestos de un determinado taxn vegetal (37, 31).
Investigaciones en la bsqueda de metabolitos secundarios, a los que se les atribuye
actividades antibacterianas en vegetales superiores, demuestran que en la mayora de los
casos esta actividad farmacolgica es debida a la presencia de alcaloides bis-bencil-
isoquinolnicos, isoquinolnicos, complejos de indol, entre otros (24).
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El abuso de antimicrobianos en los hospitales como medida de profilaxis en las
operaciones quirrgicas est incrementando la resistencia antimicrobiana sin realmente
beneficiar en muchos casos al paciente (32, 53).
1.5.1. CONCENTRACIN MNIMA INHBITORIA (CMI)
La concentracin mnima inhibitoria se define como la mnima concentracin de
antimicrobiano (en g/mL 0 mg/mL) que inhibe el crecimiento visible de un
microorganismo despus de 24 horas de incubacin a 37oC. La CMI se ha establecido
como "gold Standard" frente a otros mtodos que evalan susceptibilidad
antimicrobiana; adems de confirmar resistencias inusuales, da respuestas definitivas
cuando el resultado obtenido por otros mtodos es indeterminado (3, 48, 53).
1.5.2. DESCRIPCIN DE LAS CEPAS MICROBIANAS
1.5.2.1. Staphylococcus aureus ATCC 13709
CLASIFICACIN.
Orden: Eubacteriales
Familia: Micrococaceae
Gnero: Staphylococcus
Especie: aureus
MORFOLOGA.
Los Staphylococcus son esferas facultativamente anaerobias, grampositivas, de 0.8 a 1.0
m de dimetro. En el pus se observan aisladas, apareadas, y en cmulos irregulares;
ocasionalmente forman cadenas cortas, rara vez de ms de cuatro cocos de longitud. El
agrupamiento caracterstico en racimos es notorio en grmenes que crecen en medios
slidos. (23, 53)
La pared de la clula estafiloccica contiene una columna vertebral de peptidoglucano,
y cidos teicoicos especficos de cada especie. Adems, S. aureus posee un componente
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antifagocitico de superficie, denominado protena A, que est unido a la capa de
peptidoglucano, pero tambin puede ser liberado parcialmente en forma extracelular.
(27, 53)
S.aureus es un coco Gram positivo, inmvil, que se presenta aislado, en pares, en
cadenas cortas o en racimos irregulares. Esta ltima disposicin es quiz la ms
caracterstica. (53)
S. aureus puede desarrollar resistencia a los antibiticos con sorprendente facilidad.
Por lo menos el 90% de las cepas de estafilococos hospitalarias son resistentes a la
penicilina, la cual es medida por una beta-lactamasa o penicilinasa. (53)
INFECCIONES EN HUMANOS
Los estafilococos estn entre los grmenes ms fciles de cultivar. El estado de portador
intermitente de S. aureus se considera que existe en el 30-50% de los individuos, y las
fosas nasales suelen ser el habitad de bacterias en portadores. El hecho de que los
individuos puedan transportar y diseminar S. aureus patgeno durante largo tiempo
indica que ellos, y la mayor parte de sus contactos tiene un grado importante de
inmunidad para el organismo. Solamente cuando las defensas normales del hospedero
faltan o estn comprometidas, el microorganismo tiene probabilidad de ser invasor. As
es como la enfermedad puede presentarse e lugares de lesin local, como quemaduras,
abrasin u otras heridas. Las anormalidades que originan inmunodepresin sistemtica y
predispone a enfermedades estafiloccicas incluyen diabetes, leucemia, insuficiencia
renal, teraputica. (55, 53)
Los estafilococos se han reconocido como causa de enfermedades pigenas desde los
primeros tiempos de la microbiologa; principalmente en infecciones postquirrgicas y
obsttricas graves, con frecuencia mortales. (55, 53)
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1.5.2.2.Escherichia coli ATCC 9637
CLASIFICACIN.
Familia: EnterobacteriaceaeGnero: Escherichia
Especie: coli
MORFOLOGA
Escherichia coli son bacilos de 1 a 3 m por 0.5 um, sus formas varan desde cocos a
pequeos bastoncillos, que se presentan solos, en pares, en cortas cadenas, agrupados:
en general mviles por flagelos peritricos, aunque existen variantes mviles no
flageladas. No forman esporas; y son Gram negativos. (55, 53)
En cultivos jvenes la forma cocobacilar es bastante frecuente y en los cultivos viejos se
presentan formas de un tamao mayor. Son aerbicos y anaerbicos facultativos,
produce dos tipos de fibras o cilos que rigen su capacidad patgena.
E. coli Produce un tipo de encima denominada bacteriocina que se sabe regula la flora
normal segn el principio de la antibiosis. (55, 53)
INFECCIONES EN HUMANOS.
E. coli Es un husped permanente del tracto intestinal del hombre y los animales y no es
considerado como un patgeno primario, por su abundancia en el tracto intestinal y sufacilidad de cultivo, se lo usa como ndice de potabilidad del agua para el consumo
humano; su presencia en el agua o los alimentos constituyen un indicador de
contaminacin fecal (55, 53)
Las infecciones causadas por E. coli, pueden ser divididas en extraintestinales e
intestinales (55, 53)
-
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Extraintestinales: resultado de un contacto de persona a persona, provocando
infecciones urinarias como: cistitis, pielitis, pielonefritis, esto ocurre probablemente por
la ntima asociacin entre el habitad normal de los microorganismos y el tracto urinario,
estas infecciones estn alrededor del 20% de todas las infecciones urinarias: en
pacientes tratados con drogas inmunosupresoras y antibiticos; E. coli puede producir
infecciones graves (55, 53)
E. coli es una bacteria que habita normalmente en el intestino del hombre y animales de
sangre caliente, y desempea un importante papel en la fisiologa del intestino. La
distribucin en el ambiente est determinada por su presencia en el intestino. Por ser un
habitante regular y normal del intestino se usa desde hace un siglo como "el mejor"indicador de contaminacin de los alimentos con materia fecal (55, 53)
1.5.2.3.Salmonella gallinarum ATCC 9184
CLASIFICACIN.
Familia: Enterobacteriaceae
Gnero: Salmonella
Especie: gallinarum
MORFOLOGA.
Algunos serotipos son siempre inmviles. S. gallinarum es serotipo de S. enteriditis.
Habitualmente son mviles. Forma bacilar de 1 a 3 um por 0.6 um, mviles por flagelos
pertricos; se presenta solo o en pares, no forma esporas ni cpsulas. Son agentes gran
negativos. (48).
INFECCIONES EN HUMANOS
S. gallinarum puede ser transportada por cualquier animal o pjaro domstico y por
algunos vertebrados de sangre caliente y sangre fra. Brotes de salmonelosis en el
hombre provienen de reservorios de tortugas caseras, polluelos, patitos, gallinas, ganado
y otros diversos animales domsticos. (48, 55).
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1.5.2.4.Klebsiella pneumoniae ATCC 10031
CLASIFICACIN.
Orden : Eubacteriales.
Familia : Enterobacteriaceae.
Gnero : Klebsiella.
Especie :pneumoniae.
MORFOLOGA.
K. pneumoniae son bacilos Gram negativos, no esporulados. Miden de 0.3 - 1 m de
dimetro y de 0.6 - 6.0 m de longitud, dispuestas en pares, solos, o en cadenas cortas.
(48, 55).
INFECCIONES EN HUMANOS.
Klebsiella pneumoniae es el agente etiolgico de un 3 por 100 de las neumonas deorigen bacteriano. Es causa comn de la neumona lobar adquirida en la comunidad,
particularmente frecuente en individuos alcohlicos, diabticos y en pacientes con
enfermedad obstructiva crnica; tambin se asocia a cuadros respiratorios severos como
bronconeumona y bronquitis. El gnero Klebsiella se asla de las infecciones del tracto
urinario y de las bacteriemias de origen nosocomial. Esta bacteria es resistente a muchos
antibiticos entre ellos la ampicilina (48, 55).
1.5.2.5.Mycobacterium smegmatis ATCC607
CLASIFICACIN.
Orden : Mycobacteriaceae.
Familia : Mycobacterium.
Gnero :Mycobacterium.Especie : smegmatis.
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MORFOLOGA.
Esta bacteria est clasificada dentro de las micobacterias de crecimiento rpido , con
pigmento irregular. M. smegmatis es un bacilo delgado de forma recta o ligeramente
curvada, su tamao suele ser de 1.0-10 m de largo por 0.2-0.7 m de ancho, no
forman esporas y no poseen flagelos ni cpsula. Cuando se tien de Gram, las
micobacterias lo hacen escasamente, comportndose como Gram positivas dbiles. Son
bacilos cido-alcohol resistente. (BAAR) (48, 55).
INFECCIONES EN HUMANOS.
Son bacterias saprfitas, se conoce muy poco acerca de sus factores de patogenicidad.
Por lo general, las micobacterias no tuberculosas son mucho menos txicas que M.
tuberculosis, aunque se encuentren en una concentracin elevada en el tejido infectado.
Este tipo de micobacterias producen la infeccin llamada micobacteriosis que
generalmente afectan a individuos que tienen sus mecanismos de defensa locales o
generales deteriorados. La puerta de entrada de los microorganismos es tanto area
como digestiva. (48, 55).
1.5.2.6.Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
CLASIFICACIN.
Orden : Eubacteriales.
Familia : Pseudomonodaceae.
Gnero : Pseudomonas.
Especie : aeruginosa.
MORFOLOGA.
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Son bacilos Gram negativos, miden de 1-3 m de longitud y 0.5-1 m de grosor. Son
mviles, presentan de 1-3 flagelos polares, y pueden estar rodeados de una
pseudocpsula, son aerobios no fermentadores de la glucosa, oxidasa negativa. (48, 55).
INFECCIONES EN HUMANOS.
P. aeruginosa es un patgeno oportunista como tal infecta a pacientes con sus defensas
generales disminuidas.
A esta bacteria se le ha agente de infecciones: respiratorias, urinarias, oculares y
ticas, cutneas, bacteriemia, endocarditis, enfermedades menngeas, infecciones
gastrointestinales (48, 55).
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CAPTULO II
2. PARTE EXPERIMENTAL
2.1.LUGAR DE LA INVESTIGACIN.
La presente investigacin se llev a cabo en el Laboratorio de Microbiologa, de la
Facultad de Ciencias, Escuela de Bioqumica y Farmacia de la Escuela SuperiorPolitcnica de Chimborazo.
2.2.EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS.
2.2.1. EQUIPOS.
Autoclave
Balanza tcnica
Bao Mara.
Cmara de flujo laminar.
Centrfuga
Refrigeradora.
Reverbero
Rotavapor
Ultrasonido
2.2.2. MATERIALES.
Asa de platino.
Baln de500mL
Caja de guantes estriles
Calculadora.
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Embudos de separacin con tapa de 500 mL
Gradilla.
Mangueras.
Mechero
Papel filtro
Placas de silica gel
Probetas de 25, 100 y 1000 mL
Puntas estriles
Regla
Rollos de algodn
Trpode
Tubos de ensayo
Varillas de vidrio
Vasos de Precipitacin de 100, 500 y 1000 mL
2.2.3. REACTIVOS
Acetato de etilo
Acido clorhdrico 0,01N
cido Sulfrico 0,01N
Agar Muller Hinton
Agar sabourad 4%
Agua destilada
Amonaco
Dietilamina
Etanol 960 ter etlico
Reactivo de Dragendorff
Reactivo de Mayer
Reactivo de Wagner
Sulfato de sodio
2.2.4. MATERIAL BIOLGICO
Se utilizaron los siguientes microorganismos tipificados por la ATCC
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2.3. METODOLOGA
2.3.1. EXTRACTOS
Para el desarrollo de esta investigacin se utilizaron los siguientes productos, los
mismos que fueron suministrados por el Instituto Nacional Autnomo de
Investigaciones Agropecuarias (INIAP)
a) Liofilizado del agua de coccin
b) Liofilizado del agua de hidratacin
c) Aceite de lupanina 2%
d) Extracto crudo de alcaloides (lupanina 7,6%)
Adems se utiliz hojas y grano de chocho de la lnea INIAP 450 Andino, eco tipo de
origen ecuatoriano, el cual fue tratado a nivel de laboratorio para la obtencin de los
siguientes extractos:
e) Extracto etreo crudo de alcaloides totales a partir del agua de coccin
del grano deLupinus mutabilis Sweet( 300g /L por 1H)
f) Extracto alcohlico crudo de las hojas deLupinus mutabilis Sweet
N BACTERIA CDIGO
1 Staphylococcus aureus ATCC 13709
2 Escherichia coli ATCC 96373 Salmonella gallinarum ATCC 9184
4 Klebsiella pneumoniae ATCC 10031
5 Mycobacterium smegmatis ATCC 607
6 Pseudomona aeruginosa ATCC 27853
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2.3.2. PREPARACIN DE EXTRACTOS ALCALOIDALES
2.3.2.1.PROCEDIMIENTO
Extracto etreo crudo de alcaloides totales del grano de Lupinus mutabilis
Sweet : Granos enteros seleccionados se cocierondurante una hora, ( 300 g 1 L de
agua destilada),se filtro, el filtrado se alcaliniz con amonaco hasta pH 11, se dej
en reposo una hora, se extrajeron los alcaloides con ter etlico (1:1) y se recuper la
fase orgnica. (Anexo 2 ) (55, 60)
Extracto alcohlico crudo de las hojas de Lupinus mutabilis Sweet: Las hojasfrescas se secaron a 35 oC en una estufa, se macer en etanol de 96o se aplic en el
ultrasonido, se filtr, se adicion sulfato de sodio, se dej en eposo 24 horas luego
se filtr, y evaporo a sequedad. (Anexo 3)
2.3.3. IDENTIFICACIN DE ALCALODES.
En el material vegetal (liofilizado) del agua de coccin e hidratacin del proceso dedesamargado preparadas en el laboratorio, filtradas y no filtradas, extracto etreo crudo
de alcaloides totales del grano deLupinus mutabilis Sweet, yextracto alcohlico crudo
de las hojas de Lupinus mutabilis Sweet se realizaron pruebas cuantitativas de
Dragendorff, Mayer y Wagner para identificacin de los alcaloides. (37,58)
2.3.3.1.ANLISIS COMATOGRAFICO.
Soluciones de los liofilizados de las aguas de coccin e hidratacin del proceso de
desamargado de Lupinus mutabilis Sweet, y el material de control se analizaron por
cromatografa en capa fina empleando de 10 a 20 L de muestra, como adsorbente:
Silica gel 60 F254 (Merck); solventes: Acetato de etilo, hexano, Dietil amina (77,5: 17,5:
5,5) y revelador reactivo de Dragendorff.
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2.3.4. DETERMINACIN CUANTITATIVA DE ALCALOIDES
Se tom una alcuota de 0.2 mL de agua de desamargado de chocho, se agreg 0.6 g de
xido de aluminio, se mezcl bien y se aadi 0.2 mL de KOH al 15% y se agit hastaformar una pasta homognea, luego se transfiri a tubos de centrfuga y se agreg 6 mL
de cloroformo. Se agit hasta homogenizacin y se centrifug por 2 minutos (entre
1.500 y 3.000 rpm)
Se recibi la fase clorofrmica, se repitieron las extracciones por lo menos 10 veces,
hasta que 1 mL del ltimo extracto fue evaporado a sequedad, suspendido en 4 o 5 gotas
de cido sulfrico 0.01N, dando reaccin negativa con 3 o 4 gotas del reactivo de
Dragendorff.
Se recogi los lavados de todos los extractos, se evapor con calor suave sin llegar a
sequedad, dejando en la etapa final 1 mL, que desaparecer rpidamente al dejarlos en
un recipiente con agua fra. Se agreg 5 mL de cido sulfrico 0.01N, dos gotas de rojo
de metilo y se titul el exceso de cido con NaOH 0.01N. El contenido de alcaloides
sereport como lupanina considerando que: 1 mL de H2SO4 0.01N equivale a 2.48 mg
de Lupanina.
2.3.5. ENSAYO DE ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DE LOSEXTRACTOS ALCALOIDALES DEL Lupinus mutabilis Sweet(MTODO DE MITSCHER) (16)
2.3.5.1.PREPARACIN DE LAS MUESTRA PARA EL ENSAYO
a. Extractos Crudos y Totales
En un vial limpio, seco y estril, se codific el nombre del extracto de la planta. Con
precisin se pes 50 mg del extracto crudo o total y se disolvi en 500 L de DMSO. La
concentracin final de esta disolucin fue 100000 g/mL.
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Se realiz diluciones al dcimo, utilizando tubos de ensayo, secos, limpios y estriles a
los que se aadi 900 L de DMSO y 100 L del extracto de la concentracin anterior,
las concentracin finales fueron de de 10000g/mL, 1000g/mL, 100g/mL.
Se codificaron cajas Petri estriles, con el nombre del extracto y la concentracin final
(una caja para la concentracin 1000 g/mL, una caja para la concentracin 100 g/mL,
y una caja para la concentracin 10 g/mL), se pipete separadamente 100 L de las
disoluciones con los extractos a los tubos de ensayo que contenan 10 mL de TSA a 45oC.
Se mezcl con la ayuda de un vrtex e inmediatamente se pas a las cajas Petri
previamente codificadas con el nombre de los extractos y de cada una de las
concentraciones preparadas. Una vez que se solidific el medio de cultivo con los
extractos, se invirtieron las cajas Petri y se dejaron a temperatura ambiente por 18-24
horas.
b. Fracciones del Extracto Crudo
Se pes exactamente la cantidad de fraccin del extracto crudo a ensayarse y se disolvi
con agua, en tubos 100 X 13 limpios, secos y estriles, de tal manera que tenga una
concentracin inicial y un volumen, posible de realizar diluciones adicionales.
Utilizando tubos de ensayo 100 X 13 limpios y secos se realiz diluciones sucesivas
(Ejemplo: 100 L de extracto + 100 L de DMSO. Se codific las cajas Petri necesarias
con la identificacin de la fraccin y las concentraciones finales respectivas.
Se pipete separadamente 100 L de las disoluciones de la fraccin del extracto y se
pas a los tubos de ensayo con 10 mL de TSA a 45 oC. Se mezcl con la ayuda de un
vrtex e inmediatamente se pas a las cajas Petri previamente codificadas.
Las cajas Petri una vez solidificadas el medio de cultivo con las diluciones de los
extractos, se invirtieron y se dejaron a temperatura ambiente por 18-24 horas, se
realizaron blancos respectivos de reactivos y de DMSO.
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d. Preparacin de las suspensiones de los microorganismos
En tubos de 150 X 15 con 10 mL de solucin salina estril se llevaron a temperatura
ambiente y se codificaron con el nombre respectivo del microorganismo.
Los cultivos de los microorganismos para el ensayo deben estar visiblemente turbios, y
a partir de estos se prepararon las siguientes suspensiones en los tubos con solucin
salina estril (Anexo 6).
e. Estriado de los Microorganismos
A partir de las suspensiones bacterianas en la solucin salina, se tom una asada de cada
microorganismo en su turno y se estri en cada suspensin, desde el lmite hacia cerca
del centro de la caja Petri, los cultivos se incubaron a 37 oC por 24-48 horas.
d. Lectura de Resultados
La actividad antibitica se manifiesta por falta de crecimiento e la lnea de estriado.
Hay actividad antibitica cuando no hay crecimiento visible. La concentracin minina
inhibitoria (CMI) es la menor concentracin de las diluciones en la cual no hay
crecimiento del microorganismo. Las lecturas de los resultados se interpretaron de la
siguiente manera: A = Activo, P = Parcialmente activo, I = Inactivo.
Si el microorganismo fue morfolgicamente alterado, por ejemplo, si P. aeruginosa no
muestra su pigmento verde caracterstico, o si no crece bien, la caja puede ser registrada
como P. (actividad parcial).
N0 TIPO DE BACTERIA
CDIGO
ATCC MODO DE PREPARACIN
1 Staphylococcus aureus 13709 100 L de susp.bact. en 10 mL sln salina
2 Escherichia coli 9637 100 L de susp.bact. en 10 mL sln salina
3 Salmonella gallinarum 9184 100 L de susp.bact. en 10 mL sln salina
4 Klebsiella pneumoniae 10031 100 L de susp.bact. en 10 mL sln salina
5 Mycobacterium smegmatis 607 Sin diluir
6 Pseudomona aeruginosa 27853 1 L de susp.bact. en 10 mL sln salina
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Las cajas Petri de control deben tener la apariencia esperada (crecimiento en todas las
lneas en las cajas de control negativo y la potencia apropiada en las cajas de control
positivo de sulfato de estreptomicina), de no ser as, el experimento ha fallado y debi
ser repetido.
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CAPTULO III
3. RESULTADOS Y DISCUSIN
3.1 ANLISIS FITOQUMICO PRELIMINAR DEL EXTRACTOALCOHLICO DE LAS HOJAS Y DEL AGUA DE COCCIN DEL GRANODE CHOCHO (Lupinus mutabilis Sweet), OBTENIDO A NIVEL DE
LABORATORIO.
El anlisis fitoqumico preliminar que se realiz: a) extracto alcohlico de las hojas, b)
aguas de coccin del grano de chocho, determinndose que los alcaloides, triterpenos y
esteroides se encuentran cualitativamente en mayor proporcin en el grano de chocho
que en las hojas en relacin al resto de metabolitos secundarios. Algunos autores
sealan que la distribucin de los alcaloides es bastante selectiva, hallndose en mayor
concentracin en las primeras etapas de desarrollo de la planta en capas externas de
hojas, tallos y flores, y cuando la planta ha llegado a su madurez los alcaloides se
localizan principalmente en los tegumentos de las semillas. (Cuadro No.1). (11, 14, 31).
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CUADRO No. 1. ANLISIS FITOQUMICO DEL EXTRACTO ALCOHLICO DE LAS HOJAS Y DELAGUA DE COCCIN DEL GRANO DE Lupinus mutabilis Sweet. FACULTAD DECIENCIAS. ESPOCH. RIOBAMBA. AGOSTO 2008.
RESULTADOS
TIPO DECOMPUESTO
REACCIONESPRUEBAS
EXTRACTOALCOHOLICO DE LAS
HOJAS DE Lupinusmutabilis Sweet
AGUA DE COCCIN DELGRANO DE Lupinus
mutabilis Sweet
AlcaloidesWagnerMayerDragendorff (++) (+++)
Triterpenos y
Esteroides
Lieberman-
Burchard (++) (+++)
Azcares Reductores Fehling(++) (++)
Fenoles y Taninos FeCl3 (++) (++)
FlavonoidesShinodaEnsayo deAntocianidinas (+) (++)
Saponinas Ensayo de laespuma (+) (++)
Aminocidos Libres Ninhidrina(+) (++)
+++ cuando la presencia del metabolito secundario es abundante+ ++ cuando la presencia del metabolito es poco o escaso y cuando las reacciones han sido negativas, lo que indica ausencia del compuesto
Los alcaloides presentes en el gnero Lupinus son de tipo quinolizidnicos. Estos
metabolitos secundarios constituyen un mecanismo de defensa contra microorganismos
fitopatgenos, herbvoros y contra otras especies de plantas que causan competencia
(Wink, 1998) (11, 14, 31, 46).
Desde el punto de vista farmacolgico los alcaloides, las saponinas, flavonoides,
triterpenos y esteroides han mostrado diversas actividades biolgicas: antimicrobiana,
citotxica, antitumoral, ictiotxica, molusquecida, insecticida, antihelmntica,
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expectorante, diurtica, cardiovascular, antiinflamatoria, gastroprotectora, analgsica,
antipirtica, sedante, antihepatotxica, etc (6, 46).
De ah el inters de comprobar si los alcaloides de las aguas del proceso de coccin del
chocho poseen actividad antibacteriana.
3.2. ANLISIS CROMATOGRFICO DE LOS ALCALOIDES DE Lupinusmutabilis Sweet
El anlisis cromatogrfico se desarroll en:
a) Aguas del proceso de coccin del grano de Lupinus
b) Extracto etreo crudo obtenido de la extraccin bsica lquido- lquido de lasaguas de coccin del grano de Lupinus
c) Extracto crudo alcohlico de las hojas deL. mutabilis Sweet (Anexo 4)
Los productos proporcionados por el INIAP: a) Liofilizado del agua de coccin, b)
Liofilizado del agua de hidratacin, c) Aceite de Lupanina 2%, d) Extracto crudo de
alcaloides (Lupanina 7,6%); dieron positivos los ensayos de Mayer, Wagner,
Dragendorf, verificndose cualitativamente el contenido de alcaloides.
La cromatografa en capa fina para la determinacin de alcaloides revel la presencia de
Lupanina en los dos liofilizados, donde el valor terico referencial fue Rf 0,43 el cual
coincidi con el valor prctico Rf prctico (5).
La identificacin y cuantificacin de los alcaloides del chocho, es de gran importancia,
ya que la toxicidad y amargor del grano dependen del tipo y proporcin de estoscomponentes. Estudios realizados en el Laboratory of Food Chemistry and Mass
Spectrometry de la University of Milan, Italia verificaron que de los alcaloides
identificados, la lupanina es el mayor constituyente, pues alcanz el 2,5 % en el grano
crudo y el 11,5 % en el extracto. El segundo en importancia fue la espartena y
corresponde al 0,32 % en el grano crudo y 2,5 % en el extracto. Otros compuestos como
la 3--hidroxilupanina y 13-hidroxilupanina y tetrahidrorombifolina, se encontraron en
menor cantidad. Este ltimo alcaloide desaparece durante la purificacin y
concentracin del extracto (Anexo 5)
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De igual manera en el extracto etreo crudo del grano y en el extracto alcohlico crudo
de las hojas de Lupinus se identific la presencia de lupanina.
La cuantificacin de lupanina en el agua de coccin del grano de Lupinus revel una
concentracin de 36% (p/p), y en el agua de hidratacin 35% (p/p), adicionalmente el
extracto etreo crudo de alcaloides present 137 mg/g de lupanina.
3.3. ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA
La actividad antimicrobiana se ensay frente a los siguientes microorganismos:
Staphylococcus aureus ATCC 13709; Escherichia coli ATCC 9637; Salmonella
gallinarum ATCC 9184; Klebsiella pneumoniae ATCC 10031 Mycobacteriumsmegmatis ATCC 607; Pseudomona aeruginosa ATCC 27853
3.3.1. ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LIOFILIZADO DEL AGUA DECOCCION; LIOFILIZADO DEL AGUA DE HIDRATACIN; ACEITEDE LUPANINA 2%; EXTRACTO CRUDO DE ALCALOIDES(LUPANINA 7,6%) DE Lupinus mutabilis Sweet FRENTE A LOSMICROORGANISMOS UTILIZADOS
Los liofilizados del agua de coccin e hidratacin, el aceite de Lupanina 2% y el
extracto crudo de alcaloides (Lupanina 7,6%) en concentraciones de 1.000g/mL; 100
g/mL y 10 g/mL as como tambin concentraciones intermedias de estos ensayos, no
mostraron actividad frente a las cepas estndar utilizada. (Cuadro No.2).
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CUADRO No. 2. ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LIOFILIZADO DEL AGUA DE COCCION;LIOFILIZADO DEL AGUA DE HIDRATACIN; ACEITE DE LUPANINA 2%;EXTRACTO CRUDO DE ALCALOIDES (LUPANINA 7,6%) DE Lupinus mutabilisSweetFRENTE A LOS MICROORGANISMOS UTILIZADOS. SEPTIEMBRE 2008.
A = Activo, PA = Parcialmente activo, I = Inactivo
1. Staphylococcus aureus ATCC 13709
2. Escherichia coli ATCC 9637
3. Salmonella gallinarum ATCC 9184
4. Klebsiella pneumoniae ATCC 10031
5. Mycobacterium smegmatis ATCC 607
6. Pseudomona aeruginosa ATCC 27853
Se sugiere que las concentraciones ensayadas son demasiado bajas para activar
mecanismos inhibitorios de estos microorganismos, vale mencionar que pruebas
clsicas de identificacin de Dragendorff, Mayer, Wagner y cromatografas en capa fina
determinaron presencia de este principio activo en todas las soluciones testadas.
La eficacia antimicrobiana tambin pudo ser interferida por materia orgnica propias de
las semillas del alimento coincidiendo con los hallazgos de Tomlinson, S y Palombo, E.
PRODUCTOS DE ENSAYO CONCENTRACION
g/mL
MICROORGANISMOS
1 2 3 4 5 6
a) Liofilizado del agua de
coccin
b) Liofilizado del agua de
hidratacinc) Aceite de Lupanina 2%
d) Extracto crudo de
alcaloides (lupanina
7,6%)
1000 I
I I I I I
100 I I I I I I
10 I I I I I I
BLANCO -------- I I I I I I
DMSO 10000 I I I I I I
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CUADRO No. 4. ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DEL EXTRACTO ETREO CRUDO DE LOSALCALOIDES TOTALES DEL GRANO DE Lupinus mutabilis SweetFRENTE ALOS MICROORGANISMOS UTILIZADOS. SEPTIEMBRE 2008.
A = Activo, PA = Parcialmente activo, I = Inactivo
1. Staphylococcus aureus ATCC 13709
2. Escherichia coli ATCC 9637
3. Salmonella gallinarum ATCC 9184
4. Klebsiella pneumoniae ATCC 10031
5. Mycobacterium smegmatis ATCC 607
6. Pseudomona aeruginosa ATCC 27853
El extracto etreo crudo de alcaloides totales, a las dosis de desafo inhibi a los
microorganismos en estudio excepto a Pseudomona aeruginosa ATCC 27853 que fue
parcialmente inhibida a (5.000g/mL), siendo inhibida a las concentraciones ms altas,
lo cual hace pensar que la metodologa de extraccin y/o purificacin degrada a los
compuestos activos.
Al encontrarse actividad antibacteriana a la dosis de 5.000 g/mL del extracto etreo
crudo de los alcaloides totales del grano, coincidiendo con el estudio de Fuertes, R. et
al; se prob actividad con diluciones consecutivas 1:2 de (2.500 g/mL; 1.250 g/mL;
PRODUCTO DE
ENSAYO
CONCENTRACIONmg/mL
MICROORGANISMOS1 2 3 4 5 6
Extracto etreo
crudo del agua de
coccin del granode Lupinus
200 A A A A A A
100 A A A A A A
50 A A A A A PA
25 A A A A A I
12.5 A A A A A I
6.25 A A A A A I3.125 PA PA PA PA PA I
1.56 PA PA PA PA PA I
BLANCO -------- I I I I I I
DMSO 200 I I I I I I
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625 g/mL; 312,5 g/mL y 156,25 g/mL), encontrndose actividad frente a los
microorganismos en estudio. Se determin que la concentracin mnima inhibitoria
(MIC) fue de 625 g/mL para Staphylococcus aureus ATCC 13709; Escherichia coli
ATCC 9637; Salmonella gallinarum ATCC 9184; Klebsiella pneumoniae ATCC
10031 Mycobacterium smegmatis ATCC 607; y de 10.000 g/mL para Pseudomona
aeruginosa ATCC 27853. (Cuadro No.4) ( Anexo 9)
Sin embargo, estos extractos son inhibidores dbiles de acuerdo con Aligiannis et al,
quien propuso una clasificacin de materiales de planta basado en los resultados de MIC
(Inhibidores fuertes: MIC hasta 500 g / mL; inhibidores regulares: MIC entre 600 y
1.500 g/mL; inhibidores dbiles: MIC anterior 1.600 g / mL) (40,31,46).
El extracto alcohlico de las hojas de Lupinus mutabilis Sweet a las concentraciones
desafo no presentaron actividad frente a los microorganismos ensayados, exepto con
Staphylococcus aureus ATCC 13709, que a 5.000 g/mL y 10.000 g/mL se manifest
una actividad parcial pero a la concentracin de 20.000 g/mL se present una total
inhibicin frente a este microorganismo. (Cuadro No. 5) (Anexo 8)
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CUADRO No. 5. ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DEL EXTRACTO CRUDO ALCOHLICO DELAS HOJAS DE Lupinus mutabilis Sweet FRENTE A LOSMICROORGANISMOS UTILIZADOS. SEPTIEMBRE 2008.
A = Activo, PA = Parcialmente activo, I = Inactivo
1. Staphylococcus aureus ATCC 13709
2. Escherichia coli ATCC 9637
3. Salmonella gallinarum ATCC 9184
4. Klebsiella pneumoniae ATCC 10031
5. Mycobacterium smegmatis ATCC 607
6. Pseudomona aeruginosa ATCC 27853
Segn Gross R. Von Baer E., en la determinacin de los contenidos de protena,
compuestos fenlicos, cido fenlico libre y taninos; se estableci que la inhibicin dela prueba del crecimiento de bacterias depende principalmente del contenido total de
compuestos fenlicos, lo cual descarta la posibilidad de la influencia de alcaloides en
los resultados (11, 31, 40, 46).
Otras investigaciones realizadas por Reinhard, H., et,al indican que los compuestos
fenlicos y en especial los isoflavonoides aislados del Lupinus argenteus podran
potenciar la actividad antibacteriana de los alcaloides y del cido linolnico (11, 31,46).
PRODUCTO DE ENSAYO
CONCENTRACION
mg/mL
MICROORGANISMOS
1 2 3 4 5 6
Extracto alcohlico
crudo de las hojas de
Lupinus
200 A I I I I I
100 PA I I I I I
50 PA I I I I I
25 PA I I I I I
12.5 PA I I I I I
6.25 PA I I I I I
3.125 I I I I I I
1.56 I I I I I I
BLANCO -------- I I I I I I
DMSO 200 I I I I I I
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La mayora de antibiticos de uso clnico se han obtenido de microorganismos
(bacterias, hongos, actinomicetos), pero debido a la gran diversidad de manifestaciones
adversas y el incremento de interacciones medicamentosas, en los ltimos 20 aos ha
surgido mayor inters por antimicrobianos obtenidos a partir de plantas.
CUADRO No. 6. ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DEL SULFATO DE ESTREPTOMICINA FRENTE
A LOS MICROORGANISMOS UTILIZADOS. SEPTIEMBRE 2008.
A = Activo, PA = Parcialmente activo, I = Inactivo
1. Staphylococcus aureus ATCC 13709
2. Escherichia coli ATCC 9637
3. Salmonella gallinarum ATCC 9184
4. Klebsiella pneumoniae ATCC 10031
5. Mycobacterium smegmatis ATCC 607
6. Pseudomona aeruginosa ATCC 27853
PRODUCTO DE ENSAYO
Sulfato de Estreptomicina
CONC
g/mL
MICROORGANISMOS
1 2 3 4 5 6
100 A A A A A A
50 A A A A A A
25 A A A A A A
12.5 A A A A A PA
6.25 A A A A A PA
3.125 PA PA PA PA PA I
1.56 PA PA PA PA PA I
BLANCO -------- I I I I I I
DMSO 100 I I I I I I
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CAPTULO IV
4. CONCLUSIONES
1. La cuantificacin de los alcaloides expresados como lupanina en el agua de
coccin del grano de Lupinus revel una concentracin de 36% (p/p), y en el
agua de hidratacin 35% (p/p), la coccin facilita una mayor liberacin de este
compuesto de inters farmacolgico. Pruebas cualitativas de Mayer, Wagner,Dragendorf, dieron positivos los ensayos verificndose cualitativamente el
contenido de alcaloides en el liofilizado del agua de coccin, liofilizado del agua
de hidratacin, aceite de Lupanina 2%, extracto crudo de alcaloides (Lupanina
7,6%)
2. Los alcaloides presentes en las agua de coccin e hidratacin, el aceite de
Lupanina 2%, el extracto crudo de alcaloides (Lupanina 7,6%) y los extractosobtenidos a nivel de laboratorio, a concentraciones de 10 g/mL; 100 g/mL y
1.000 g/mL as como tambin concentraciones intermedias de estos ensayos,
no mostraron actividad frente a Staphylococcus aureus ATCC 13709;
Escherichia coli ATCC 9637; Salmonella gallinarum ATCC 9184; Klebsiella
pneumoniae ATCC 10031 Mycobacterium smegmatis ATCC 607; Pseudomona
aeruginosa ATCC 27853, en las condiciones del presente ensayo, sugirindose
que las concentraciones ensayadas son demasiado bajas para activar mecanismos
inhibitorios de estos microorganismos.
3. El extracto etreo crudo de los alcaloides totales del grano de Lupinus mutabilis
Sweet empleado a una concentracin de desafo de 20.000 g/mL y diluciones
consecutivas hasta 156,25 g/mL, mostr actividad frente a los
microorganismos en estudio.
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4. Para el extracto etreo crudo de los alcaloides totales del grano de Lupinus
mutabilis Sweetse determin que la concentracin mnima inhibitoria (MIC) fue
de 625 g/mL para Staphylococcus aureus ATCC 13709; Escherichia coli
ATCC 9637; Salmonella gallinarum ATCC 9184; Klebsiella pneumoniae
ATCC 10031 Mycobacterium smegmatis ATCC 607; y de 10.000 g/mL para
Pseudomona aeruginosa ATCC 27853, deduciendo que os alcaloides del chocho
muestran actividad antimicrobiana a concentraciones muy atas en las
condiciones utilizadas en el presente ensayo, en relacin a 100 g/mL que es la
asociada a un buen nivel de potencial para aplicaciones de utilidad clnica. Por
todo lo expuesto anteriormente, los alcaloides de Lupinus mutabilis Sweet
pueden ser aprovechados para otro tipo de aplicaciones, y as evitar el eliminar
indiscriminadamente el residuo de los lavados del procesamiento del chocho.
5. El extracto alcohlico crudo de las hojas de Lupinus mutabilis Sweet present
actividad nicamente contra Staphylococcus aureus ATCC 13709 a 5.000
g/mL; y 10.000 g/mL manifest una parcial actividad, y a la concentracin
ms alta (20.000 g/mL) mostr una total inhibicin frente a este
microorganismo.
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CAPTULO V
5. RECOMENDACIONES
1. Se recomienda utilizar nuevas tcnicas de extraccin y purificacin para la
obtencin de los alcaloides del chocho con la finalidad que se garantice la mayor
concentracin de compuestos activos responsables de la accin antimicrobianadel Lupinus mutabilis Sweet.
2. Se debera realizar nuevas investigaciones con los alcaloides de Lupinus
mutabilis Sweet, ampliando el nmero de microorganismos causantes de
patologas comunes en nuestro medio.
3. Es necesario ampliar este estudio para evaluar otras posibles actividades que se
le atribuye a nivel popular, as como realizar estudios de toxicidad subcrnica y
crnica para obtener una mayor seguridad en el uso de los alcaloides de Lupinus
mutabilis Sweet.
4. A pesar que los alcaloides de Lupinus mutabilis Sweet muestran actividad
antimicrobiana a concentraciones muy altas en referencia a 100 g/mL que es la
relacionada a un alto nivel de potencia para usos farmacolgicos, y ante la
problemtica ambiental que representa la eliminacin indiscriminada del agua
del proceso de coccin y desamargado del chocho en los distintos cuerpos
acuferos, se debera utilizar estos alcaloides para elaborar productos benficos
para el hombre, aprovechando las propiedades farmacolgicas que poseen los
alcaloides quinolizidnicos frente a microorganismos patgenos de gran
incidencia en nuestro medio.
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CAPTULO VI
6. RESUMEN
En el laboratorio de Microbiologa de alimentos de la facultad de Ciencias de la Escuela
Superior Politcnica de Chimborazo se determin "in vito" la actividad antimicrobiana
de los liofilizados de las aguas de coccin e hidratacin del proceso de desamargado de
Lupinus mutabilis Sweet (chocho), frente a Staphylococcus aureus ATCC 13709;
Escherichia coli ATCC 9637; Salmonella gallinarum ATCC 9184; Klebsiella
pneumoniae ATCC 10031 Mycobacterium smegmatis ATCC 607; Pseudomona
aeruginosa ATCC 27853, la investigacin est enfocada a reducir la contaminacin
ambiental, utilizando los alcaloides presentes en las aguas causantes de la muerte de
especies vegetales en el lugar donde son vertidas por la gran toxicidad que presentan.
Cont con el financiamiento del INIAP, SENACYT, al realizar el anlisis de los
liofilizados se determin la actividad antimicrobiana utilizando como metodologa de
ensayo tcnicas de Mitscher et, al.
Las aguas a las concentraciones de 10 g/mL; 100 g/mL y 1000 g/mL no mostraron
actividad frente a Staphylococcus aureus ATCC 13709; Escherichia coli ATCC 9637;
Salmonella gallinarum ATCC 9184; Klebsiella pneumoniae ATCC 10031;
Mycobacterium smegmatis ATCC 607; Pseudomona aeruginosa ATCC 27853. Al no
obtener respuesta positiva en la evaluacin, se ensayaron dosis desafo de 5000 g/mL;
10000 g/mL y 20000 g/mL; las cuales manifestaron actividad antimicrobiana frentea Staphylococcus aureus ATCC 13709; Escherichia coli ATCC 9637; Salmonella
gallinarum ATCC 9184; Klebsiella pneumoniae ATCC 10031; Mycobacterium
smegmatis ATCC 607; Pseudomona aeruginosa ATCC 27853.
Luego del estudio realizado se concluy que los alcaloides del proceso de desamargado
no mostraron actividad a concentraciones segn el test de Mitscher et,al. las cuales son
consideradas de uso clnico. Por lo que se recomienda investigar nuevas tcnicas de
extraccin de alcaloides.
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SUMARY
At the Food Microbiology Lab of the Science Faculty of the Escuela SuperiorPolitcnica de Chimborazo, the anti-microbial activity in vitro of the leofilized of
cooking water and hydration of the-bittering process of Lupinus mutabilis Sweet
(chocho), in front of Staphylococcus aureus ATCC 13709; Escherichia coli ATCC
9637; Salmonella gallinarum ATCC 9184; Klebsiella pneumoniae ATCC 10031
Mycobacterium smegmatis ATCC 607;and Pseudomona aeruginosa ATCC 27853,was
determined. This investigation was focused on reducing the environmental pollution
using alkaloids present in water causing the death of vegetal species in the place whereit is poured because of its high toxity. It had the funding from INIAP and SENACYT.
Upon carrying out the liofilized analysis the microbial activity determined using as a
trial methodology Mitscher et al. techniques. Water at concentrations of 10 g/mL; 100
g/mL and 1000 g/mL did not show any activity against Staphylococcus aureus
ATCC 13709; Escherichia coli ATCC 9637; Salmonella gallinarum