Biologia Molecolare - GulisanoLab · E’ fondamentale che ad ogni divisione cellulare il DNA venga...
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Biologia Molecolare CDLM in CTF 2010-2011 – La Replicazione del DNA
Prospettiva Storica
La replicazione semidiscontinua
Differenze tra procarioti ed eucarioti
E’ fondamentale che ad ogni divisione cellulare il DNA venga COPIATO in modo che ogni cellula figlia abbia un corredo genetico identico a quello della cellula progenitrice.
La conseguenza principale della scoperta della struttura del DNA ad opera di Watson e Crick è stata la comprensione dei maccanismi di replicazione del DNA, che può essere definita SEMICONSERVATIVA e SEMIDISCONTINUA
Modello conservativo Modello semi-conservativo Modello distributivo
Una delle cellule figlie eredita la doppia elica parentale, l’altra quella appena sintetizzata
Entrambe le le cellule figlie ereditano un filamento parentale “vecchio” ed uno neosintetizzato
Entrambe le le cellule figlie ereditano un parti di filamento parentale “vecchio” e parti neosintetizzati
J. Cairns 1963 Autoradiografia usando timina marcata con trizio
Prospettiva Storica
La replicazione semidiscontinua
Differenze tra procarioti ed eucarioti
Il filamento stampo stabilisce quanle dei 4 possibili dNTP viene aggiunto
La catalisi avviene al gruppo 3’ libero del filamento nascente
Processo irreversibile per la idrolisi del pirofosfato
La replicazione inizia in corrispondenza di una specifica sequenza chiamata origine di replicazione. Alcune proteine si legano al DNA in corrispondenza dell’origine e cominciano a svolgerlo. A questo punto delle proteine iniziatrici possono accedere ad ognuno dei filamen< per iniziare la sintesi del nuovo DNA.
• La proteina deputata alla sintesi del DNA complementare ad uno stampo è la DNA POLIMERASI. Questo enzima catalizza l’aggiunta di nuovi nucleo<di ad una molecola di DNA quindi non NON è in grado di iniziare dal nulla la sintesi di una nuova molecola.
• Prima che la DNA polimerasi possa iniziare la sintesi un nuovo filamento deve intervenire l’enima PRIMASI, un enzima che sinte<zza un breve segmento di RNA sullo stampo del DNA. Su questo “innesco” (in inglese primer) la DNA polimerasi può aggiungere nuovi nucleo<di e con<nuora la sintesi.
• Poiche i primi nucleo<di, sinte<zza< dalla primasi, sono ribonucleo<di (RNA) vengono successivamente rimossi e sos<tui< con desossiribonucleo<di (DNA).
I procario< possiedono cinque <pi di DNA Polimerasi:
1) DNA Polimerasi I: implicata nella riparazione del DNA e nella rimozione degli inneschi dei frammen< di Okazaki. 2)DNA Polimerasi II: indoPa da danni al DNA per riparazione del danno indoPo. 3)DNA polimerasi III: l'enzima principale per la replicazione, aRva sia nella sintesi del filamento leading, sia in quella dei frammen< di Okazaki. 4)DNA Polimerasi IV-‐V: anch'esse coinvolte nella riparazione incline all'errore
Anche negli eucario< ci sono 5 DNA polimerasi. 1)DNA Polimerasi α: è una primasi (enzima che sinte<zza i primer di RNA) e procede inoltre all'allungamento dei primer con alcune cen<naia di deossiribonucleo<di. 2)DNA Polimerasi β: coinvolta nella riparazione del DNA 3)DNA Polimerasi γ: replica il DNA mitocondriale 4)DNA Polimerasi δ: l'enzima principale della replicazione eucario<ca. Sinte<zza sia il filamento leading, sia il filamento lagging. Riempie inoltre le interruzioni tra i frammen< di Okazaki. 5)DNA Polimerasi ε: stessa funzione della Polimerasi δ.
TuPe le DNA polimerasi conosciute sinte<zzano il nuovo filamento in direzione 5'-‐ 3'aggiungendo deossiribonucleo<di (dNTP) al gruppo 3'-‐OH del [deossiribosio] del nucleo<de precedente. Su un filamento la replicazione può procedere nello stesso verso in cui si sposta la DNA polimerasi, ed il processo è con<nuo. Nell’altro filamento questo non è possibile e deve avvenire in modo discon<nuo.
Nel filamento LAGGING si generano dei frammen< di DNA (frammen< di Okazaki) che vengono succesivamente “incolla<” tra loro per ricostruire un filamento con<nuo.
La rimozione degli inneschi è un processo sequenziale -‐ Rimozione del’innesco di RNA (RNAsi H) -‐ Rimozione di alcuni nucleo<di alle estremità (5’esonucleasi) -‐ Sintesi del frammento mancante (DNA polimerasi) -‐ Saldatura del taglio (ligasi)