Biochemická diagnostika genetických porúch

CHARAKTERIZÁCIA

Diagnostika prebieha na úrovni metabolitov, enzýmov a proteínov. Je základným prístupom pri

odhalení dedičných metabolických porúch (DMP), ktoré sú spôsobené mutáciou génov a rezultujúcim

funkčným deficitom enzýmov, transportných proteínov a receptorov.

INCIDENCIA A DEDIČNOSŤ DMPCelkový výskyt v zmiešanej populácii sa odhaduje až na 0,2% a  frekvencia jednotlivých chorôb býva

1: 200000 až 1: 5000. V SR je častý výskyt cystickej fibrózy, fenylketonúrie, alkaptonúrie, kongenitálnej

adrenálnej hyperplazie (CAH), deficitu dehydrogenázy pre stredne dlhé reťazce (MCAD), X-viazanej

adrenoleukodystrofie a deficitu myoadenylátdeaminázy (AMPD). Až u 90% DMP je dedičnosť

autozómovo-recesívna, u 5% viazaná na X-chromozóm, u 2% mitochondriálna-maternálna a u 2-3%

autozómovo-dominantná.

ROZDELENIE DMP

Podľa metabolických celkov na poruchy: metabolizmu, transportu AMK a detoxikácie amoniaku;

metabolizmu a transportu sacharidov; metabolizmu lipoproteínov; transportu, oxidácie karboxylových

kyselín a ketogenézy; metabolizmu nukleotidov; metabolizmu porfirínov; metabolizmu vitamínov;

metabolizmu minerálov; metabolizmu neurotransmiterov; syntézy izoprénov, sterolov, plazmalogénov

a glykoproteínov.

Podľa kompartmentu na poruchy: mitochondriové, lyzozómové, peroxizómové , Golgiho aparátu

PREČO A AKO SA DMP MANIFESTUJÚHromadenie metabolitov pred defektom vedie k využitiu alternatívnych metabolických ciest a k tvorbe

toxických látok a inhibítorov (napríklad sukcinylacetón, metylmalonát). Často sa zníži využitie alebo

tvorba energeticky významných substrátov (glukóza, galaktóza, glykogén, mastné kyseliny, ketolátky,

AMK), nastáva deplécia alternatívnych substrátov a dostaví sa rozvrat vnútorného prostredia. V iných

prípadoch zlyhajú významné detoxikačné cesty (syntéza močoviny, konjugovaného bilirubínu) a

vzrastu niekoľkonásobne hladiny toxických látok. V bunkách svalov a vnútorných orgánov môže dôjsť

k hromadeniu biopolymérov, ktoré narušia fyziologické bunkové funkcie (lyzozómové tesaurizmózy).

Iný typ porúch je podmienený nedostatočnou syntézou funkčne významných molekúl ako sú

cholesterol, žlčové kyseliny, plazmalogény a steroidné hormóny. Klinická manifestácia môže zahŕňať

ťažké multiorgánové poškodenie a zlyhanie, poškodenie jednotlivých orgánov (encefalopatie,

hepatopatie, myopatie, kardiomyopatie, tubulárne poruchy), kómu, rozvrat vnútorného prostredia,

malformácie, stigmatizácie, psychomotorickú retardáciu, kŕče, neurologické a psychické poruchy,

senzorické poruchy, GIT poruchy a časté infekcie.

Najčastejšie situácie v dedičných poruchách metabolizmu sú znázornené na schéme.

AKÉ BIOCHEMICKÉ METÓDY SA V DIAGNOSTIKE DMP VYUŽÍVAJÚ

V SR je celopopulačný skríningový program pre záchyt fenylketonúrie, kongenitálnej adernálnej hyperplázii -

CAH a kongenitálnej hypotyreózy. V diagnostike DMP sa využijú aj rutinné biochemické vyšetrenia, ktoré

však spravidla nie sú postačujúce na určenie diagnózy. Niektoré ochorenia možno zachytiť aplikáciou

jednoduchých orientačných vyšetrení moča, ktoré poukážu na zvýšený odpad metabolitu ako napríklad

kyseliny homogentisovej alebo skupiny látok – sacharidov, disulfidov, mukopolysacharidov. Významnú

diagnostickú hodnotu môžu mať aj tenkovrstvové chromatografie (TLC). Vo väčšine prípadov ja však

nevyhnutná aplikácia špeciálnych analytických metód, ktoré umožnia zachytenie a identifikáciu zvýšeného

množstva metabolitov, respektíve prítomnosť aj malých množstiev patologických metabolitov. Výhodou

týchto analytických prístupov je, že umožňujú identifikáciu širokej škály metabolitov s analogickými

fyzikálno-chemickými vlastnosťami (aminokyseliny, mastné kyseliny, organické kyseliny, puríny a podobne).

Medzi tieto metódy patrí vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC), plynová chromatografia (GC),

hmotnostná spektrometria (MS), ktorá môže byť spriahnutá so separačnou metódou LC alebo GC.

V poslednom období sa v metabolomike, či už v populačných skríningových programoch alebo pri

selektívnom záchyte a identifikácii metabolitov využíva tzv. tandemová hmotnostná spektrometria (MS/MS)

a elektrosprayová ionizačná hmotnostná spektrometria (ESI/MS). Prevaha metabolických ochorení je

podmienená deficitom enzýmových aktivít. Vyšetrenie aktivít enzýmov, ktoré sú prítomné v dobre

dostupnom biologickom materiály - v leukocytoch, amniocytoch, erytrocytoch patrí v diagnostike DMP

taktiež medzi bežné vyšetrenia.

VYUŽITIE CHROMATOGRAFICKÝCH METÓD A ICH KOMBINÁCIE S HMOTNOSTNOU SPEKTROMETRIOU V DIAGNOSTIKE DMP

HPLC-vysokoúčinná kvapalinová chromatografia: Uplatňuje sa zvlášť vtedy, keď nemožno

použiť plynovú chromatografiu pre nízku prchavosť, tepelnú nestabilitu alebo nevyhovujúcu

separáciu metabolitov. Stacionárnu fázu predstavujú častice adsorbentu (silikagél, ionexy,

reverzné fázy), ktorými je naplnená krátka kolóna. Mobilná fáza je pretláčaná cez kolónu

pomocou účinných vysokotlakových čerpadiel. Zariadenie obsahuje dávkovač vzorky a rôzne

typy detektorov – UV fotometrický, fluorescenčný, elektrochemický a podobne. Separačná

metóda sa uplatňuje pri analýze aminokyselín, purínov, pyrimidínov a porfirínov.

GC-plynová chromatografia: predstavuje rutinnú a veľmi účinnú separačnú metódu pre tie

metabolity, ktoré možno bez porušenie ich štruktúry dostať do plynného stavu. Ide o fyzikálnu

metódu separácie metabolitov (moča, séra, plodovej vody) medzi mobilnú a stacionárnu fázu.

Ako nosný plyn sa využíva vodík alebo hélium, zvlášť pri spriahnutí s hmotnostnou

spektrometriou. Rozdeľovanie látok prebieha v kapilárnych kolónach 25 až 50m dlhých, s

vnútorným priemerom 0,1 – 0,3 mm umiestnených v pieckach s programovateľnou teplotou.

Postupný vzrast teploty umožňuje dosiahnutie plynného stavu látok a ich separáciu pri

vysokom tlaku nosného plynu. Každé takéto zariadenie obsahuje injektor vzorky, rôzne typy

detektorov (plameňový, ionizačný), avšak v diagnostike DMP je bezkonkurenčný hmotnostný

detektor, ktorý umožňuje zachytenie hmotnostných spektier delených látok. Metóda sa

uplatňuje pri analýze organických kyselín, mastných kyselín, cholesterolu a jeho derivátov,

steroidných hormónov, aminokyselín a acylkarnitínov.

MS-hmotnostná spektrometria: Ide o metódu identifikácie metabolitov na základe zistenia

hmotnosti iónov a ich zastúpenia v spektre, ktoré vzniká fragmentáciou (štiepením)

organických molekúl. Štiepenie molekúl sa dosiahne pri ich zrážke s elektrónmi (emitujú sa

žeravením katódy) s dostatočnou energiou v  ionizačnej komôrke. Hmotnostné spektrum je pri

definovaných podmienkach pre metabolit charakteristické. Okrem iónových fragmentov sú

v zázname často prítomné molekulové ióny, ktoré sú taktiež cenné pre zhodnotenie typu

a množstva prítomného metabolitu. Zariadenie obsahuje analyzátorovú časť (kvadrupól,

iónová pasca), ktorá má schopnosť rozdeliť ióny a detektor. Na vyhodnotenie záznamu

a identifikáciu molekúl slúži rozsiahly softvérový program s knižnicami spektier obsahujúcich

niekoľko tisíc látok. Identifikáciu metabolitov a diagnózu DMP však robí erudovaný pracovník,

vďaka syntéze mnohých údajov nadobudnutých dlhodobou skúsenosťou. Údaje o klinickom

stave pacienta a zmene iných vyšetrovaných parametrov sú nepostrádateľné pre vyslovenie

definitívnej diagnózy. Nakoľko DMP sa často vyznačujú veľkou variabilitou vo fenotypových

prejavoch (klinický stav i laboratórny nález) nezriedka sa diagnóza určí až pri opakovanom

vyšetrení.

Tam kde je potrebné pristúpiť k biopsiám tkanív, uprednostňujú sa v prípade dostupnosti

molekulárno-genetická diagnostika. Nie vždy je však táto alternatíva metodicky

a ekonomicky schodná. V mnohých prípadoch určenie diagnózy DMP vyžaduje vykonanie in

vivo funkčných testov a monitorovanie zmien v hladinách metabolitov.

Mnoho DMP sa prejavuje zmenami v profile organických kyselín a ich derivátov. Tak ako je to

znázornené na obrázku, organické kyseliny vznikajú pri metabolizme veľmi širokej škály látok.

Vo vzorke moča analyzovanej metódou GC/MS bežne pozorujeme prítomnosť 100 až 200

metabolitov. GC/MS analýza nám umožňuje na základe retenčných časov a hmotnosných

spektier identifikovať neznámu látku (A.: v zázname vľavo je kyselina fumarová, vpravo je

kyselina suberová). K tomuto účelu slúži aj monitorovanie dvoch iónov, ktoré sú pre danú

látku charakteristické a v niektorých prípadoch aj monitorovanie molekulového iónu (B.: v

zázname Q, C, M+ - m/z). Spektrá analyzovanej látky porovnávame s databázou knižníc spektier

a vyberáme z ponúk látku, ktorá môže zodpovedať danému metabolitu (C.: viď ponuku).

A. B. C.

E-1E-1 E-2E-2

SUBSTRÁTSUBSTRÁT

NÍZKO TOXICKÉ

ODPADOVÉ LÁTKY

NÍZKO TOXICKÉ

ODPADOVÉ LÁTKY

ATP

ENERGETICKÝ

METABOLIZMUS

ATP

ENERGETICKÝ

METABOLIZMUS

FYZIOLOGICKÝ METABOLIT

PATOLOGICKÝ METABOLIT

SUBSTRÁT SUBSTRÁT