臨床免疫，40f3）：288－293，2003 40：288

態における意義

B細胞のTLR9を介する

サイトカイン，ケモカイン

産生－

加藤 厚●■ 松本健治…

らにより明らかにきれた1）．このDNA分画はMY－1

と命名され インターフェロン（IFN）誘導活性を

有し，NK活性を増強させることから抗腫瘍粟と

して国内で臨床試験も行われた2）．この現象は画

期的な発見ではあったが，DNA自身に免疫活性

があるという現象を世界に受け入れられるまで

には時間がかかり，世界的に注目を浴びること

となったのは1995年にKriegらの報告がなされて

からであった．粕iegらはDNAがシトシン（C）．

グアニン（G）が並ぶCpGモチーフと呼ばれる配列

を有する時にのみ免疫活性を惹起することを韓

苦したサ．またCpGモチーフのシトシン残碁をメ

チル化することにより不治化されることが明ら

かとなった．このCpGモチーフは細菌など下等

動物では高頻度に認められるが，哺乳類ではほ

とんど認められない．またわずかに存在する哺

乳類におけるCpGモチーフのほとんどはシトシ

ン残基がメチル化を受けているために，哺乳類

は自己DNAには反応せず，細菌のDNAを認識し，

病原体を排除する免疫システムを有していると

考えられている．細菌由来DNAを認識するメカ

ニズムについてはTLRの発見により明らかにされ

てきた．

TLR9は細菌由来DNAのレセプター

細菌などの感染による初期防御反応はマクロ

ファージや樹状細胞（dendriticcell：DC）の貪食

KeyWords：To］Hikereceptor，CpGODN，IL－12．1P－ 10．IgEproductiom

は じめに

免疫応答は感染時に細菌などを認識し初期防

御反応として働く自然免疫と，抗原提示細胞に

よって提示された抗原特異的に働く獲得免疫（適

応免疫）の2種類に大別される．近年発見された

Toll－1ikereeeptor（TLR）を介する反応は自然

疫系のみならず，獲得免疫にも働きかけること

から注目を受けている．とくにTLR9を介する刺

激はインターフェロンなどの抗ウイルス蛋白の

産生のみならず，T細胞非依存的にB細胞を括

件化させる能力を有し，lgE産生を伴わないIgG

の転生を促進することから，そのリガンドであ

るCpGOl）Nは¶1アジエバンドとして臨床応用

が期待されている．本稿においてはTIR9を介す

る刺激によってB細胞から産生されるサイトカ

イン・ケモカインをアレルギー治療という観点

から概説する．

細菌由来DNAが抗腫瘍活性成分

BCGは結核のワクチンとして使用されている

が．1970年代に抗腫瘍活性もあることが報告さ

れた．その後1980年代に入り，BCG中の抗腫瘍

活性成分はDNA分画に存在することがTokunaga

＊CpGODNinducescytokineandchemokineproductionviaTLR9inhumanBlymphocyte． 頼AtsushiKATO＆KenjiMATSUMOTO，M．D．．Ph．D．：国立成育医療センター研究所免疫アレルギー研究部〔面154－

B567東京都世川谷区太子堂3－35r31］；DepartmentofAllergy＆lmmunology，NatlOnalResearchIns血teforChild Health＆Development，Tbkyo154J567，JAPAN

Clin．Immunol．，Sept．2003

作用による分解・消化を含む自然免疫反応が担っ

ている．この貪食作用において異物の認識に関

与している分子がTLRである．細菌などの微生物

には哺乳類に存在しない分子構造（pathogenas－

sociatedmolecularpatterns：PAMPs）が認めら

れ，TLRはこのPAMPsを認識して自然免疫を活

性化していると考えられている．TLRは現在ヒト

において10種類報告されており，それぞれが特

有のPAMPsを認識する4）．TLIuはグラム陽性菌

由来のリボプロテインを，TLR3はウイルス由来

の2本鎖RNAを，TLR4はグラム陰性菌由来のLPS

を，そしてTLR5は細菌の鞭毛を認識することが

報告されている．このうち，TLR9が細菌由来DNA

および非メチル化CpGモチーフを有する合成オ

リゴヌクレオチド（CpGODN）の認識レセプター

であることが明らかとなった5〉．TLR9を介した免

疫反応は自然免疫系を活性化させ細菌などに対

する防御反応を惹起するだけでなくThl反応を誘

導することから，感染症，癌，アレルギーなど

で臨床応用が期待されている．

TLR9の発現糸田胞

ヒトと他の動物におけるTLRの発現の分布は異

なっていることが知られている．ヒトにおける

TLR9の発現細胞はB細胞とDCであると報告さ

れている．マウスではマクロファージにTLR9が

発現しているため，マクロファージを用いたTLR9

の研究が多く行われている．しかしヒトにおい

てマクロファージにはTLR9を発現していないの

で注意が必要である．また，DCは大きくmyeloid

DC（MDC）とplasmacytoidDC（PDC）の2種類に

分類されるが，ヒトにおいてTLR9を発現してい

るのはPDCのみである6－．すなわちヒトにおいて

はCpGODNはB細胞かPDCを介してアジエバン

ド作用を示すと考えられる．

TLR9のシグナル

TLR9を介したシグナルは他のTLRを介したシ

グナルと同様にMyD88，IRAK，TRAF6を介して

NF－KBやAP－1といった転写因子を活性化すること

が知られている．しかしながら，他のTLRが細胞

表面に発現しているのに対し，TLR9は細胞内に

発現している．細菌を細胞内に取り込み破壊さ

40：289

れて出てきた細菌由来DNAと反応するために細

胞内に発現しているのではないかと考えられて

いる．一方，細胞外に存在するDNAはDNAレセ

プターを介してCpGモチーフと無関係に取り込

まれることがわかってきた7．そして取り込まれ

たDNAはCpGモチーフを有するもののみTLR9と

会合し，シグナルを伝えていくと考えられてい

る．したがって，TLR9を介する反応は細胞内へ

の取込みにかかる分だけ他のTLRリガンドに比べ

反応が遅いようにみえる．

CpGODNの種類と反応性

DNAは投与されると生体内のDNaseによって

すみやかに分解されてしまう．そこで安定化の

ため研究に用いるCpGODNにはphosphorothioate

化したODN（通称Sオリゴ）が使用されている．

Sオリゴは核酸のリン酸基部位にある酸素元素を

硫黄元素に置換することによりDNase活性を受

けにくくなっており，生体内での安定性が高い

ことからアンチセンス製斉【Jにも利用されている．

すべての塩基がSオリゴ化されているCpGODN

はB／K－brpeCpGODN（CpGLB／K）と呼ばれてい

る畠）9〉．CpG－B／KはB細胞に作用し，増殖能を向

上させること，抗体産生を促進することが知ら

れている，また，CD40，CD80およびCD86など

の共刺激分子や主要組織適合性抗原複合体（MHC）

のタイプⅢなどの発現も誘導することが知られて

いる．CpG－B／KはPDCにも作用しCD40，CD80

およぴCD86などの共刺激分子ヤCCR7などケモ

カインレセプターの発現も誘導するが，TypeIIFN

（IFN－α／β）の誘導は非常に弱い10）．一方，CpGモ

チーフを有する塩基を通常のホスホジュステラー

ゼで結合し，その5′，3′側にSオリゴ化したグア

ノシン（G）を複数結合させたCpGODNはA／D－type

CpGODN（CpG－A／D）と呼ばれている8）9）．cpG－

A／DはPDCに作用し強力にTypeIIFNを誘導する

がB細胞にはほとんど作用しない．最近になっ

てB細胞にもPDCにも強力に作用し，両CpG

ODNの特徴を有するC－typeCpGODNが合成さ

れたことも報告された川．以上のことから，CpG

ODNと反応する異なったレセプターの存在が示

唆されるが，TLR9KOマウスやTLRのアソシエー

ション分子であるMyD88KOマウスにおいては

臨味免疫 第40巻 節3号 40：290

lgM・MemoryB Naive B Swit¢h－MemoけB

ぎぎ合さ■・㌣ ご ご・丁・ き葺 CellNo．

Tl＿Rl

TLR2

Tm

TLR4

TLR5

TLR6

TLR7

TU18

TLR9

mlO

β・儀式11r

図1ヒトB細胞サブセットにおけるTLRの発現 ヒト末梢血からCD191B細胞を単離後，ソーティングによりナイーブB細胞（CD27），TgMメモ リーB細胞（CD27＋，IgG，IgA）．スイッチメモリーB細胞（CD27＋，lgM，IgD）を分離し， 各細胞数あたりのTLRの発現をm－PCRによって確認を行った． （文献】4）より改変）

両CpGODNの反応性がなくなることから，どち

らのCpGODNもTLR9を介して反応が伝わって

いると考えられている，現時点ではCpG－A／D，

CpG－B／Kによる作用の遠いが生じる機序は不明

である．次項からはB細胞に対する現象につい

て述べるため，CpG－B／Kを使用した研究につい

て紹介する．

TLR9とB細胞

ヒトB細胞に発現しているTLRはTLRl，6，7，

9，10であることが知られている12，．B細胞には

TLR9が発現しているため，CpGODNに対し反応

することは当然であるが，B細胞サブセット間

の反応性の差については不明であった．最近，

ナイーブB細胞はメモリーB細胞に比べCpG

ODNに対する反応性が著しく低いことが報告さ

れ，TLRの発現がB細胞のサブセット間で大き

く異なっていることが明らかとなった】3■．その後，

ナイーブB細胞はTLR9を含むすべてのTLRの発

現が非常に低いため，CpGODNに対する反応性

がほとんど認められないことが報告された（図1），

しかしナイーブB細胞はB細胞受容体（BCR）を

介した刺激を受けるとTLR9の発現が急速に誘導

され，CpGODNに対する応答性を有するように

なることも明らかとなった川．またB細胞特異

的と考えられているTIノRlOについても同様の現象

が見出された．一方，メモリーB細胞は恒常的

にTLR9を発現しているためにCpGODNに対し

て反応性が高いことが明らかとなった（図1）．

RestingB細胞においてもBCRおよびCD40を介し

た刺激でTLR9および10の誘導が認められる15）．

よってBCRを介したTLR9の誘導機構は獲得免疫

と自然免疫との架け席となっていることが示唆

された．

CpGODNによりB細胞が産生する

サイトカイン・ケモカイン

IgMからIgEへのクラススイッチにはIL・4と

CD40の共刺激が必要である．CpGODNはIgE産

生を抑制することが報告されている岬】7■，アレル

ギ】においてIgE産生を抑制することは重要であ

ることからCpGODNはアレルギ←治療薬として

有望であるといえよう．しかし，CpGODNはど

のようにしてIgE産生を抑制しているのであろう

か？本項ではCpGODNによりB細胞から産生

されるサイトカイン・ケモカインという観点か

Clin．Immunol．，Sept．2003 40：291

図2 CpGODNによるB細胞からのIgE産生抑制機構

らこの現象を考察したい．

CpGODNによりB細胞から産生されるサイト

カインでもっとも強く誘導を受けるものはIL6で

ある3）．Ⅰし6はB細胞の活性化と増殖を促し，抗

体産生の増強に関与していることが報告されて

いる．このことから，CpGODNによるIgM，IgG

の産生促進作用にはB細胞からのⅠし6のautocrine

が関与していると考えられる．またB細胞はCpG

ODNの作用によりル12が誘導されると報告され

ている18ノ．1L12はナイーブT細胞から1も1細胞へ

の分化を促進する作用を有し，IFN－γの産生に関

与している．誘導を受けたThl細胞はB細胞に作

用してIgE産生を抑制する可能性が考えられる．

しかし，B細胞から分泌するIL12のみではとく

にongoingのIgE産生の抑制作用は説明しにくい．

そこで筆者らはB細胞から産生されるケモカイ

ンについて検討を行った．

Thl細胞には細胞表面にCXCR3を発現してい

る．よってCXCR3ケモカインであるIFN－γinduc－

ibleproteinlO（IP－10）はThl細胞を特異的に遁走

させると考えられている．CpG－A／Dによる1PrlO

の誘導機構はPDCから分泌されたTyT）eIIFNに

より単球が分泌すると報告されているが，CpG－

B／KによるIP－10の誘導機構は不明であった19）．

そこで筆者らほB細胞がCpG－B／Kの刺激により

IP－10を分泌し，Thl細胞をB細胞に遁走させる

可能性を考え，ヒトB細胞celllineであるRPMI

822（ラ細胞とヒト末梢血B細胞を用いて検討を行っ

た．その結果，RPMI8226細胞とヒトB細胞は

CpG－B／Kの刺激により1P－10の産生を誘導するこ

とが明らかとなった（投稿中データ）．CpGODN

の投与はB細胞やPDCからのII：12の産生を誘導

し，分化したml細胞をIP－10によってB細胞に

遮走させることにより，IgE産生を抑制する可能

性が示唆される（図2）．

ごく最近になってCpGODNがB細胞に作用し

て転写因子であるT－betを直接誘導し，ILAとCD40

によるIgGl，IgE産生作用を抑制することが報告

された20）．またCpGODNによるTbetの誘導は

IFN－†，STHrl非依存的であるが，B細胞からCpG

ODNの刺激により分泌されるⅠし12によって相乗

的に作用することも報告された（図2）．以上のこ

とから，B細胞から分泌するサイトカイン・ケ

モカインがIgE産生抑制作用に重要な役割を担っ

ているといえよう．

CpGODNとアレルギー

CpGODNはThlアジエバンドとして抗体製剤

との併用療法や単独でアレルギー治療薬として

の研究が動物試験や吉光〃f如試験を中心に数多く

40：292

行われている1617．マウス0VA吸入アレルギーモ

デルの試験においては，CpGODN投与により抗

原吸入後の気道過敏性の売進ならびにBAL中への

好酸球浸潤反応が強力に抑制することが報告さ

れている．またこのモデルでは，CpGODNによ

り1gE産生が抑制されIgG2a産生が上昇すること

も認められている．サイトカイン産生について

も，CpGODNほOVAによるIL－5．II；13などのTh2

サイトカイン産生作用を抑制し，ル12，IFN－†な

mlサイトカインの産生を増強することが報告

されている．また，抗原とCpGODNの結合体は

よl）強力な抗原特異白ml反応をひき起こすこと

が明らかにされている2））22）．CpGODNはこのよ

うに強力な活性を有することから副作用の危険

性が危倶されていた．筆者らはCpGODNの薬効

と副作用を検討することを目的とし，ヒト末梢

血単核球（PBMC）を用いてCpGODNによって誘

導される遺伝子群をLPSと比較して網羅的な遺伝

子発現解析を行った．その結果，CpGODNによ

りOASl，MXlなど，抗ウイルス活性を示す遺伝

子やIP－10などのTも1連走性ケモカインの強力な上

昇を確認したが，mF（X，Ⅰし1β，COX－2など炎症

性遺伝子の誘導はLPSと比べると非常に弱いこと

が明らかとなった23）．よってCpGODNはヒトに

おいて炎症を惹起しないという点で安全に投与

できる製剤になると期待される．

CpGODNの臨床試験

CpGODNは現在欧米においてColeyPharma－

CeuticalGroup（Coley社）とDynavax社によりそ

れぞれ臨床試験が開始されている．Coley社は痛

や感染症の抗体製剤とCpGODNの併用療法を中

心に，また7レルギ一分野についてはAventis

Pharma社と協同でCpGODNそのものの製剤化

を目指して臨床試験が行われている．一方，

Dynavax社は抗原CpGODN複合体の製剤化を

目指して臨床試験が行われている．とくにAmb

al－immunostimulatoryoligonucleotideconJu－

gate（AIC）はブタクサアレルゲンにCpGODNを

結合させてある製剤でブタクサ花粉症に有望で

あると期待されている．いずれの早期臨床試験

の結果でも重篤な副作用が報告されていないこ

とから，今後行われる臨床試験の結果が気にな

臨床免疫第40巻第3号

るところである24）．

おわ り に

CpGODNはモデル動物研究において優れた効

果を示すことが多数報告されてきている．また

今まで不明であったCpGODNによるIgE産生抑

制作用についても明らかになりつつある．近年

になってと卜臨床試験の結果も報告され始め，

短期的には安全性に問題はないとの結果が示さ れ始めている．本年度の米国喘息・アレルギー・

免疫学会においても，〟Cの臨床試験の結果が注

目されており，創Cの投与によりブタクサ花粉シー

ズンにおけるQOLが著しく上昇することが報告

されていた．驚くべきことに，AICを投与した翌

年の花粉シーズンに新たな〟Cの投与がなかった

のにもかかわらずQOLが非常によかったことが

報告されており，CpGODNによるアレルギー疾

患の治療効果は長期間持続する可能性が示唆さ れた．わが国では春になるとスギ花粉を防ぐた

めにマスクをつけて歩いている姿が走者してき ている，CpGODNの臨床研究が進むことにより，

花粉シーズンにおいてもマスクをつけている光 景がみあたらなくなる状況が近い将来訪れるか もしれない．

文 献

1）TokunagaT，YamamotoH，ShimadaS，eta】．Anti－

tumoractivityofdeoxyribonucleicacidfraction

＆omMycobacteritJmbovisBCG．T．lsohtion．physi－

COChemicalcharacterization，andantitumoractiv・

ity．JNatlCancerInst1984；72：955．

2）TokunagaT．YamamotoT，YamamotoS．HowBCG

ledtothediscoveryofimmunostlmulatoryDNA．

JpnJInfeetDis1999；52：1．

3）KriegAM，YiAX，MatsonS，etal．CpGmotifsin

bacterialt）NAtriggerdirectB－CellactivatlOn．Na・

ture1995；374：546．

4）TakedaK，KaishoT．AkiraS．ToIl－1ikereceptors．

An11uRevImmuno12003；21：335．

5）HemmiH，TakeuchiO，KawaiT．etal，AToll－1ike

receptorrecognizesbacterialDNA，Nature2000；

408：740，

6）ltoT，AmakawaR，KaisllOT，etal．1nterferonlXand

Clin．Immunol．，Sept．2（氾3

interleukin－12areinduceddiuerentLalIybyTolt・llke

receptor71igandsinhumanblooddendrlticce11

Subsets．JExpMed2002：195：1507，

7）LiangH．ReiehCF．PisetskyDS，etal．Theroleof

CellsurfacereceptorsintheactlVatlOnOfhumanB

eel】s by T）hosphorothioate oligonucleotides．J

Immuno】2昭）：165：1438．

8）KnegAゝt．CpGmotifsinbacterialDNAandtheir

immunee触ts．AnnuRevlmmuno12002；20：709．

9 GurselM．VerthelyiD，GurselI．etal．DifEerential

aJldcom匹tltlVeaCtlVationofhumanimmunecells

bydistlnCtClassesofCpGoligodeoxynucleotlde．J

kukocBio12002；71：813．

10KrugA，TowarowskiA，BritschS，etal．To11－1ike

receptorexpressionrevealsCpGDNAasaunlque

rnierobialstlmulusforplasmacytoiddendriticcells

WhichsynergizeswithCD401igandtoinducehigh

amountsofIL－12．EurJImmuno12001；31：3026．

11）HartmannG，BattianyJ，PoeckH，etal．Rational

designofnewCpGoligonucleotldesthatcombine

BcellactlVationwithhighIFN－αinductlOninplas－

macytoiddendritlCCells．EurJImmuno12003；33：

1633．

12）HornungV，RothenfusserS，BrItSChS，etal．Quanr

titativeexpressionoftoll－1ikereceptorl－10mRNA

incellularsubsetsofhumanperlpheralbloodmono－

nuclearcellsandsensitivitytoCpGoligodeoxy－

nucleotldes，Jlmmuno12002；168：4531．

13てBerLnaSCOniNL，TraggiaiE，LanzavecchiaA．Main－

（enanceofserologicalmemorybypolyclonalactiva－

tlOnOfhumanmemoryBcells．Science2002；298：

2199．

14）BernasconiNLOnaiN，LanzavecchiaA．Arolefor

Ton－1ikere⊂eptOrSinacquiredimmunity：up－regu－

1ationofTLR9byBCRtriggeringinnaiveBceus

andconstitutiveexpressioninmemoryBcells．

Blood2003；101：45（氾．

15）BourkeE，BosisioD，Go】ayJ．etal．TheToll－1ike

receptorrepertoireofhumanBlymphocytes：in－

＊

40：293

duciblearLdseleぐtlVeeXpreSSionofTLR9andTLRlO

innomalandtranstormedcetls，Blood2003；102

（2）：956．

16）ParkY，ChangYS．LeeSll＼etal．Theenhanced

e任ectofahexa皿erlCdeox）TlboguaJlOSinerunCOn－

jugationtoCpGoligodeoprT）uCleotidesonprotec－

t10nagalnStallergicasthmaJA］）ergyClinImTIlunO1

2001；108：570．

17）VasilakosJP，SmithRM，GibsonSJ，etal．Adjuvant

activitleSOfimmuneresponsemodi丘erRB4B：COrn

parisonwithCpGODN．Cel＝mmuno】2000；204：

64．

18）KlinmanDM，YiAX．BeaucageSL，etal．CpGmo－

tlfspresentinbaetenaDNArapidlyinducelympho－

CyteStOSeCreteinterleukin6，inter】eukin12，and

interferonY．ProぐNatlAcadSciUSA1996；93：2879．

19）Blackwe11SE，KnegAM．CpGLAAindueedmonocyte

lFN－Y－indueiblepTOtein－10product】Onisregulated

byplasmacytoiddendriticcell－derivedIFN－α．J

Immuno12003；170：4061．

20）LiuN，OhnishiN，NiL，eta】．CpGdireetlyinduces

T－betexpressionandinhibitsIgγ1andIgESWitch－

inginBcells．NatImmuno12003；4（7）：687．

21）ShirotaH，SanoK．HirasawaN，etal．Bcellscap－

turlngantigencon）ugatedwithCpGoligodeoxy－

nucleotidesinduceThlcellsbyelaboratlnglL－12，

JImmuno12002；169：787．

22）¶gheH，TakabayashiK．SchwartzD．etal．ConJu－

gatlOnOfimmunostimulatoryDNAtotheshortrag－

weedallergenambalenhancesitsimmunogenic－

ityand reducesitsallergenicity．JAllergyClin

Imm11nO12000；106：124．

23）KatoA，Hc，mmaT，BatchelorJ．etal，TnteIイeron－C（／

βreceptor－mediatedselectiveinduetlOnOfagene

ClusterbyCpGoligodeoxynucleotide2006．BMC

Immuno12003；4：8．

24）KriegAM．FromAtoZonCpG．TrendsImmuno】

2002；23：64．