Area Tematica 2 Bioterapie dei tumoriSottoprogetto NUOVE MOLECOLE DELL’INFIAMMAZIONE:

TRASFERIMENTO DAL LABORATORIO AL LETTO DEL PAZIENTE

Convegno ACC Roma , 10 Febbraio 2009

IRCCS Humanitas

IRCCS INT Milano

IRCCS Bari

Univ. Milano Bicocca

IRCCS HSR-MI

Osp. Riuniti BG

Univ. Tor Vergata

IRCCS Istituto Clinico Humanitas, Milano – Alberto Mantovani

NUOVE MOLECOLE DELL’INFIAMMAZIONE: TRASFERIMENTO DAL LABORATORIO AL LETTO DEL PAZIENTE

An integration to: - Hanahan and Weinberg Cell, 2000- Mantovani et al. Nature 2008

An inflammatorymicroenvironment

Inflammatory leukocytes, cytokines, chemokines, enzymes,reactive stroma,  neo‐angiogenesis

IRCCS Humanitas, Milano

Bersaglio Mediatori infiammatori espressi nel micro-ambiente tumorale : PTX3, recettori per chemochine (CX3CR1), modulatori dell’infiammazione (TIR8)

Obbiettivo • Definizione del ruolo della proteina di fase acuta PTX3 nella prevenzionedi infezioni fungine in pazienti con neoplasie ematologiche

• Definizione del ruolo del recettore per chemochina CX3CR1 nelladisseminazione dell’adeno- carcinoma del pancreas

Obbiettivotraslazionale

• Valutare il potenziale profilattico/terapeutico di PTX3 in pazienti con neoplasie ematologiche a rischio di infezioni opportuniste.

• Utilizzo del recettore CX3CR1 per identificare i pazienti con adeno-carcinoma del pancreas a piu’ alto rischio di recidiva locale dopo chirurgia

Identificazione di mediatori infiammatori da utilizzarsi quali potenziali biomarcatoridiagnostici/prognostici e co-adiuvatori delle terapie anti-tumorali convenzionali

PTX3CRP/SAP

IL-6 DC, Mø, EC, PMN

Liver

short pentraxins long pentraxins

Microbial sensing,tissue damage

Inflammatorycytokines

(Bottazzi et al Curr Opinion Immunol, 2006)

OPSONIZATION,AGGLUTINATION,

COMPLEMENT ACTIVATION,INNATE RESISTANCE TO

PATHOGENS

TUNINGINFLAMMATION

EDITINGSELF-NONSELF

DISCRIMINATION

EXTRACELLULARMATRIX AND

FAMALEFERTILITY

PENTRAXINS, MULTIFUNCTIONAL SOLUBLE PATTERN RECOGNITION RECEPTORS

DIAGNOSTIC MARKER ?

Blood PTX3 levels in AML at diagnosis, end of first chemotherapy cycle and during infection.

PTX3

CRP

Blood levels of PTX3 during the course of therapy in patients with AML and during fungal infections

05

1015

A c u t e M y e lo id L e u k e m ia sN = 3 6

D ia g n o s is E n d o f 1 s t c h e m o t h e r a p y c y c le

I n f e c t io n

PCR

(mg/

dL)

020

4060

8010

012

0

A c u te M y e lo id L e u k e m iaN = 3 6

D ia g n o s is E n d o f 1 s t c h e m o th e r a p y c y c le

In fe c t io n

p = 0 .0 1 0

PTX

-3 n

g/m

l

1. PTX3 levels at diagnosis are more elevated compared to healthy subjects.

2. Levels at the end of the first cycle of chemotherapy are significantly enhanced compared to values at diagnosis.Thisincrease can be reasonably interpreted as a direct release of PTX3 by neoplastic cells, consequent to therapy or via induction of cytokines activating paracrine circuits of PTX3 release.

3. Both PTX3 and PCR levels are markedly elevated when patients experience an infection, most frequently by fungi.

Prospective study in 62 patients. This study will allow us to correlate:1. PTX3 values and the clinical response to therapy 2. the potential protective role of PTX3 against the

development of fungal infections

Unit: Rambaldi, Ospedali Riuniti Bergamo

Plasmatic levels of PTX3 correlates with evolution of disease and response to antifungal treatment.

30

20

10

0Diagnosis 1 2 3 5

weeks after therapy

Plama PTX3

PTX

3 ng

/ml

PTX3 showed significantly higher plasmatic values in patients with infections. The response to antifungal therapy correlated with normalization of PTX3 values.

30

20

10

0

Healthy ALL ALL infection

PTX

3 ng

/mlUnit: Biondi, Uni. Bicocca, Milano

Plasma levels of PTX3 in tumor patients and PTX3 expression in tumor tissues

CD31 PTX3 CD68

Pre-therapy

Post therapy

IL-8

0

10

20

30

T0 T1 T2

pg/m

l med

ian

*

*

IL-6

050

100150200

T0 T1 T2

pg/m

l med

ian

*

*

0

20

40

60

T0 T1 T2

ng/m

l med

ian

Laparotomici Laparoscopici

** *

PTX3

Healthy Liver CRC Lipocancer

PTX3

Involvement of chemokine receptors in the perineuraldissemination of pancreatic cancer cells?

Nerve

Tumor

Nerve

Tumor

Nerve tropism of pancreatic cancer

Endothelial cells

Neural cells

CX3CL1

Mantovani/AllavenaIRCCS Humanitas, Milano

The receptor for CX3CL1 is upregulated in pancreatic cancer and isa significant risk factor for perineural dissemination and early localrecurrence

Normal Tumor

CX3CR1

Marchesi et al, Cancer Res. 2008

CX3CR1 expression correlates with neural invasion and local recurrence in resected pancreatic cancer patients

C

PanIN1 40X PanIN2, 30X PanIN 3, 30X

A B C

CX3CR1 expression in Pancreatic Intraepithelial Neoplasia (PanIN 1->3)

CX3CR1 expression in PanIN with increasing degrees of dysplasia (PanIN 1→3)

47

149

19

27 29

05

101520253035404550

PanIN 1 PanIN 2 PanIN 3

No.

of c

ases

A

B C

A vs B, p=0.0001A vs C, p<0.0001B vs C, p=0.11

CX3CR1 (++) (+)

Laghi, IRCCS Humanitas, Milano

IRCCS San Raffaele, Milano – Manfredi, Rovere

Bersaglio Identificare molecole dell’immunità innata che siano predittive del successo a lungo termine del trattamento neo-adjuvante per ilcarcinoma del colonretto

Obbiettivo • Valutare l’entità e le caretteristiche della morte cellulare in sede dineoplasia a seguito della terapia neoadiuvante

• Valutare le popolazioni dell’immunità innata e I loro prodotti nelle cellule circolanti e infiltranti la neoplasia a seguito della terapia neoadiuvante

Obbiettivotraslazionale

• Utilizzo dell’osservazione sulla morte cellulare per identificareprecocemente i pazienti responder

• Utilizzo della caratterizzazione delle cellule dell’immunità innata e loroprodotti per identificare precocemente i pazienti responder (e distinguerlidai pazienti non-responder)

CD

14

CD86 CD163

+1 +16Caratterizzazione monociti nel sangue periferico

Esempio di paziente che non modifica le caratteristiche dei monociti circolanti durante la CT+RT

Esempio di paziente chemodifica le caratteristiche dei monociti circolanti durante la CT+RT

CD163

Caratterizzazione infiltrato in sede di neoplasia

+1

+16 +1

Esempio di paziente con importante infiltrato macrofagico

Bersaglio Clasterina, una proteina multifunzionale implicata nel controllo dell’infiammazione e nella progressione dei tumori del colon retto.

Obiettivo •Ruolo di mediatori solubili del microambiente (IL-6, TGFβ) nell’induzionedell’isoforma secreta della Clasterina nel carcinoma del colon retto.• Definizione del ruolo della Clasterina secreta come nuova molecola ‘pro-survival’ implicata nella resistenza a trattamenti antineoplastici.

Obiettivotraslazionale

• Clasterina come nuovo target terapeutico coinvolto nella sensibilità al trattamento antineoplastico•Validazione clinica del metodo nelle feci e nel siero di pazienti oncologici a vario stadio di malattia.

Dipartimento di Biopatologia, Università di Roma Tor VergataLuigi Spagnoli e Sabina Pucci

AUMENTO DELL’ESPRESSIONE DI IL-6 e CLASTERINA SECRETA (sCLU) NELLA TUMORIGENESI DEL COLON

sCLU : NUOVO MARCATORE PROGNOSTICO IN SITU E CIRCOLANTE

IL-6 CD68

IL-6 E MICROAMBIENTE: ESPRESSIONE NELLE CELLULE EPITELIALI TUMORALI E NEI TAM (CD68+)

pT3N1

T

N

T

pT3N0

L’AUMENTO DELL’ESPRESSIONE DI IL-6 e sCLU NEL CARCINOMA DEL COLON CORRELA CON L’AGGRESSIVITÀ TUMORALE (N0 verso N1)T: CARCINOMA DEL COLON; N: MUCOSA SANA.

sClu

T

N

T

pT3N0

pT3N1

IL-6

I LIVELLI DI CLASTERINA SECRETA AUMENTANO SIGNIFICATIVAMENTE NEI SIERI (A) E NEGLI ESTRATTI FECALI

(B) DEI PAZIENTI CON CANCRO DEL COLON (K)

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

5,5

K C

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

K

K (n =35)

C (n = 25)

C

Ap = 0,0002

K (n =25)

C (n = 27)

p = 0,018

B

IL-6 INDUCE UN AUMENTO DI sCLU IN CELLULE DI CARCINOMA DEL COLON (CACO-2) FAVORENDO I

MECCANISMI DI SOPRAVVIVENZA DEL CLONE NEOPLASTICO

Nt 4h 24h

Ku-70

Bax IP

Bax

IL TRATTAMENTO CON IL-6 INIBISCE LA FUNZIONE PRO-APOPTOTICA DI BAX AUMENTANDO IL LEGAME TRA BAX e KU70 (Bax IP).

β2m

M Nt 6h 24h

200bp

012345

un 6h 24h

Clu

0123456

pre-Clu nClu sClu

Un

IL-6 24hUn IL-6

24h

sClu

nClu

pClu

IL TRATTAMENTO CON IL-6 INDUCE UN AUMENTO DEI LIVELLI DI CLASTERINA.mRNA (A); PROTEINA (B).M: MARKER DI PESO MOLECOLARE; NT/UN: CACO2 CELLS NON TRATTATE; 6h, 24h: TRATTAMENTO CON IL-6.

B

A

Area Tematica2

Bioterapie dei tumori

Sottoprogetto NUOVE MOLECOLE DELL’INFIAMMAZIONE: TRASFERIMENTO DAL LABORATORIO AL LETTO DEL PAZIENTE

Fondazione IRCCS Istituto Nazionale Tumori MilanoSilvana CanevariMariagrazia Borrello

Fondazione IRCCS

Promozione mediata da oncogeni di un microambiente infiammatorio nel carcinoma tiroideo e ovarico

Fondazione IRCCS Istituto Nazionale Tumori Milano

Bersaglio Promozione mediata da oncogeni di un microambiente infiammatorio neicarcinomi della tiroide e dell’ovaio

Obbiettivo • Caratterizzare il programma pro-infiammatorio e pro-invasivo indotto dagli oncogeni aventi un ruolo causale nella patogenesi dei PTC (RET/PTC, TRK e BRAF).• Identificare marcatori specifici associati al diverso grado di malignità deicarcinomi papillari della tiroide (PTC)

• Analizzare se le precedenti osservazioni (punti 1 e 2) possano essere estese al carcinomi ovarico (EOC) nella cui patogenesi sono coinvolte molecole infiammatorie

Obbiettivotraslazionale

• Valutare l’utilizzo dei marcatori identificati nel PTC e nel EOC per diagnosi differenziale e/o quali bersagli molecolari per nuove terapie

Fondazione IRCCS

Fondazione IRCCS

▼ ▼BRAF

NONE

NORMAL

RASRET

/PTC

(4) (11) (26) (5) (9)

BRAF

NONE

NORMAL

RASRET

/PTC

(4) (11) (26) (5) (9)

Attivazione di un programma pro-infiammatorio da parte di

oncogeni diversi nei tumori papillari della tiroide

Moc

k

RET

/PTC

1s

TRK

T3

BR

AFV

600E

HR

ASG

12V0.0

0.5

1.0 CCL2

Rel

ativ

e Ex

pres

sion

Moc

k

RET

/PTC

1s

TR

KT3

BR

AFV

600E

HR

ASG

12V0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

CXCL8

345

Rel

ativ

e Ex

pres

sion

Moc

k

RET

/PTC

1s

TRK

T3

BR

AFV

600E

HR

ASG

12V0.0

0.5

1.0

1.5

2.0IL1B

Rel

ativ

e Ex

pres

sion

CCL2

CXCL8

IL1 beta

RET/

PTC

RET/

PTC

RET/

PTC

TRK

TRK

TRK

BRAF

BRAF

BRAF

RAS

RAS

RAS

MOC

KM

OCK

MOC

K

L’analisi bioinformatica di un dataset di tumori papillari della tiroide (PTC), geneticamente caratterizzati, suggerisce che tumori mutati per BRAF o RET/PTC condividono alterazioni di signaling (es: EGFR pathway)

Tramite transfezione con diversi oncogeni associati a PTC si sono identificati sia programmi pro-infiammatori comuni che oncogene-specifici

Fondazione IRCCS

Attivazione di un programma pro-infiammatorio da parte dioncogeni diversi nei tumori papillari della tiroide

EGFR e i suoi ligandi sono una via di segnalazione prevalente nel PTCEGFR e i suoi ligandi emergono tra le vie di segnalazione attive nel PTC e con potenzialità di cooperazione con gli oncogeni noti

Validazione tramite real-time PCR della convergenza di RET/PTC e BRAF su specifici vie di segnalazione utilizzando una casistica di PTC a statomutazionale noto

EGFR

05

1015

2025

HELA

NTHY

TPC1NIM

BCPAP K1

WROFTC13

3

8505

CHOTCH

KAT4BHT

KAT18HTC

/C3

Rel

ativ

e Ex

pres

sion

(hEG

FR) TGF ALPHA

05

101520253035

HELA

NTHY

TPC1NIM

BCPAP K1

WRO

FTC133

8505

CHOTCH

KAT4BHT

KAT18HTC

/C3R

elat

ive

Expr

essi

on (h

TGFA

)

RET

/PTC

1

BR

AFV

600E

BR

AFV

600E

BR

AFV

600E

BR

AFV

600E

BR

AFV

600E

BR

AFV

600E

RET

/PTC

1

BR

AFV

600E

BR

AFV

600E

BR

AFV

600E

BR

AFV

600E

BR

AFV

600E

BR

AFV

600E

BR

AFV

600E

BR

AFV

600E

EGF-R TGFb

Fondazione IRCCS

Cross-talk tra tirosin-chinasi recettoriali attivate e signaling da chemochinenel carcinoma dell’ovaio

L’inibizione della trans-fosforilazione di EGFR è accompagnata da una diminuzione di espressione proteica di CXCR4

Attività in corso in funzione dell’inibizione della trans-fosforilazione di EGFRValutazione dell’attività trascrizionale di NFκB, STAT- 3 and AP-1Analisi dell’epressione di IL-6, CXCL12 ed identificazione di citochine/chemochine dipendenti dal pathway di EGFR

TIME (hr) 24 48 24 48

Control Herbstatin (50 μM)

EGFR (Y1173)

CXCR4

OAW42 cells

Area Tematica 2 Bioterapie dei tumori

Sottoprogetto NUOVE MOLECOLE DELL’INFIAMMAZIONE: TRASFERIMENTO DAL LABORATORIO AL LETTO DEL PAZIENTE

IRCCS Istituto Tumori Giovanni Paolo II BariGirolamo RanieriUniversita’ di BariAngelo Vacca

Validazione di nuovi bersagli terapeutici dell’angiogenesi: i mastociti e il pathway PDGFBB/PDGFRbeta

Bersaglio •Mastociti dello stroma tumorale e loro prodotti angiogenetici :VEGF, Triptasi, Chimasi; fattori dell’angiogenesi: PDGF e VEGF e cellule stromali del microambiente (endotelio e macrofagi)

Obbiettivo • Definizione del ruolo angiogenetico dei mastociti nel microambiente tumoralee nella progressione neoplastica in modelli sperimentali e in pazienti affetti dacarcinomi del colon-retto e mammella

• Studio del ruolo del PDGF e recettore (PDGF-Rbeta) e del VEGF/ VEGF-R2 nella proliferazione, invasione e angiogenesi delle cellule di mieloma multiploe dei macrofagi associati

Obbiettivotraslazionale

• Valutazione dei livelli sierici e plasmatici di chimasi, triptasi e VEGF prima e dopo trattamenti di chemioterapia loco-regionale epatica in pazienti tumorali. Valutazione dell’efficacia anti-angiogenetica di Imatinib mesilato, Nafamostatmesilato, Tranilast.

• Inibizione delle vie di segnale a valle di PDGF/ PDGF-Rbeta e VEGF/ VEGFR-2 per inibire la progressione del mieloma multiplo

• Progettazione di un trial di fase I con dasatinib (e bortezomib) in pazienti conmieloma in recidiva o refrattario

IRCCS Istituto Tumori Giovanni Paolo II Bari - Universita’ di Bari

VEGFR2Real-Time RT-PCR

VEGFR2

bp

496

MediumZA 10 μM

ZA 30 μM

MMECs + Mev 10 μM

+ Mev 30 μM

medium

ZA 10 μM

ZA 30 μM

+ Mev 10 μM

+ Mev 30 μM

medium

ZA 10 μM

ZA 30 μM

+ Mev 10 μM

+ Mev 30 μM

medium

ZA 10 μM

ZA 30 μM

+ Mev 10 μM

+ Mev 30 μM

medium

ZA 10 μM

ZA 30 μM

+ Mev 10 μM

+ Mev 30 μM

VEGF165

bp

367

MediumZA 10 μM

ZA 30 μM

MMECs + Mev 10 μM

+ Mev 30 μMA

B

GAPDH

bp347

MediumZA 10 μM

ZA 30 μM

MMECs + Mev 10 μM

+ Mev 30 μM

%

-100-75

-25-50

0

P < .03P < .05

MMECs EA.hy 926 MMECs EA.hy 926

P < .05 P < .03

%

-100-75

-25-50

0

VEGF165

Scavelli – Vacca, Mol. Cancer Therap. 2007

Identificazione dell’acido zoledronico come molecola inibitoria del VEGF/VEGFR-2, e quindi anti-angiogenica nei pazienti con mieloma multiplo

A B C

VEGF165 alone plus ZA 30 µMConditioned medium of myeloma endothelial cells

Ranieri G. et al International Journal of Oncology 2009

Immunostaining with anti-VEGF ofmicrovessels (arrows) and mast cells (doublearrow) in highly vascularized poorlydifferentiated (G3) mast cell tumor

A) Immunostaining with anti FVIII-RA arrows indicate two microvessels among several pleomorphic bluedegranulated mast cells. B) Monomorphic blue granulated mast cells stained with

Undritz method for mast cells identificationSignificantly correlation between circulatingand cytosol levels of VEGF in mast celltumor model

P= 0.03

Mast cells positive to tryptase correlate to microvascular extension and VEGF levels in tumors

Fondazione IRCCSIST.Tumori MilanoS.Canevari

IRCCS HumanitasRozzano MilanoA. Mantovani

IRCCS FondazioneIST.Tumori MilanoMG. Borrello

IRCCS IST.TumoriGiovanni Paolo IIBari G.Ranieri

Universita’ di Bari A. Vacca

Univ. Milano BicoccaA. Biondi

Osp.Riuniti BergamoA. Rambaldi

IRCCS HSR Milano A. Manfredi

IRCCS HumanitasM. Montorsi

Univ. Tor VergataRoma S.Pucci

IRCCS HumanitasL. Laghi

NUOVE MOLECOLE DELL’INFIAMMAZIONE: TRASFERIMENTO DAL LABORATORIO AL LETTO DEL PAZIENTE