ANÁLISE DA ATIVIDADE ANTIVIRAL DE COMPOSTOS DERIVADOS … · 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il)...
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PAOLA FARIA DA SILVEIRA
ANAacuteLISE DA ATIVIDADE ANTIVIRAL DE COMPOSTOS DERIVADOS
DE NAFTOQUINONAS NATURAIS E SINTEacuteTICAS SOBRE A
REPLICACcedilAtildeO DE Dengue virus EM MODELO IN VITRO
Ouro Preto MG
Abril de 2016
II
UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
INSTITUTO DE CIEcircNCIAS EXATAS E BIOLOacuteGICAS
DEPARTAMENTO DE CIEcircNCIAS BIOLOacuteGICAS
PROGRAMA DE POacuteS-GRADUACcedilAtildeO EM BIOTECNOLOGIA
ANAacuteLISE DA ATIVIDADE ANTIVIRAL DE COMPOSTOS DERIVADOS
DE NAFTOQUINONAS NATURAIS E SINTEacuteTICAS SOBRE A
REPLICACcedilAtildeO DE Dengue virus EM MODELO IN VITRO
Dissertaccedilatildeo submetida ao programa de Poacutes-
Graduaccedilatildeo do Nuacutecleo de Pesquisas em Ciecircncias
Bioloacutegicas da Universidade Federal de Ouro
Preto como parte integrante dos requisitos para
obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Mestre em Biotecnologia
aacuterea de concentraccedilatildeo Biotecnologia aplicada agrave
sauacutede humana e animal
Orientador Prof Dr Breno de Mello Silva
Co-orientador Prof Dr Geraldo Ceacutelio Brandatildeo
Ouro Preto MG
Abril de 2016
III
IV
V
LABORATOacuteRIO AUXIacuteLIO
Este trabalho foi realizado no Laboratoacuterio de Biologia e Tecnologia de Micro-organismos ndash
ICEBNUPEBUFOP com auxiacutelio da Coordenadoria de Aperfeiccediloamento de Pessoal de
Niacutevel Superior (CAPES) e Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP)
VI
EPIacuteGRAFE
ldquoA persistecircncia eacute o menor caminho do ecircxitordquo (Charles Chaplin)
ldquoO Senhor eacute meu Pastor e nada me faltaraacute () Ainda que eu andasse pelo
vale da sombra da morte natildeo temeria mal algum porque tu estaacutes comigo
a tua vara e o teu cajado me consolam () Certamente que a bondade e a
misericoacuterdia me seguiratildeo todos os dias da minha vida e habitarei na casa
do Senhor por longos diasrdquo (Salmos 23)
VII
AGRADECIMENTOS
Agradeccedilo primeiramente agrave Deus por ser o meu sustento e proteccedilatildeo
Aos meus pais Antocircnio e Sandra pelas oraccedilotildees esforccedilo carinho e dedicaccedilatildeo
E ao meu irmatildeo Joatildeo Paulo e minha Cunhada Naacutedia pelo apoio e torcida
Ao Prof Dr Breno de Mello Silva e Prof Dr Geraldo Ceacutelio Brandatildeo pela oportunidade e
orientaccedilatildeo durante o desenvolvimento do mestrado
Agrave toda equipe do LBTM em especial a Ana Claudia Cyntia e Erica pelo companheirismo
ajuda e incentivo
Aos meus amigos que fizeram parte de toda esta trajetoacuteria
Aos laboratoacuterios do NUPEB pela permissatildeo e ajuda no uso de diversos equipamentos
Agrave Universidade Federal de Ouro Preto por todas as oportunidades oferecidas
Agrave CAPES pelo apoio financeiro
Agrave todos aqueles que de alguma forma auxiliaram para o desenvolvimento e conclusatildeo deste
trabalho
VIII
RESUMO
O Dengue virus (DENV) possui quatro sorotipos diferentes (1-4) que satildeo principalmente
transmitidos pelo mosquito Aedes aegypti A infecccedilatildeo resulta na patogecircnese da dengue que eacute
uma epidemia de proporccedilotildees globais Apesar dos esforccedilos ainda natildeo existe uma vacina eficaz
contra os quatro sorotipos bem como drogas eficientes no tratamento de pacientes Portanto
vaacuterios estudos tem sido conduzidos na busca de faacutermacos com atividade antiviral contra o
DENV e outros Flavivirus Dentre os compostos estudados para este fim estatildeo as
naftoquinonas metaboacutelitos secundaacuterios produzidos por algas fungos plantas e animais Estes
compostos podem ser extraiacutedos principalmente a partir de plantas do gecircnero Tabebuia
(famiacutelia Bignoniaceae) satildeo caracterizados por apresentar atividade antiviral destacando-se a
szlig-lapachona potente inibidor da enzima transcriptase reversa dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria
(AMV) e leucemia murina de Rauscher (RLV) O objetivo deste trabalho foi testar oito
diferentes compostos derivados de naftoquinonas sinteacuteticas e naturais com potencial atividade
antiviral contra DENV Para isso uma triagem foi realizada por reduccedilatildeo de MTT (brometo de
3- (45-dimetiltiazol-2-il) -25-brometo difenil tetrazolina) para avaliar a atividade citotoacutexica
de oito compostos na linhagem celular BHK-21 resultando no caacutelculo da concentraccedilatildeo
citotoacutexica 50 (CC50) e as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas a serem utilizada em testes
subsequentes para os compostos A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 e A8 (lapachol β-lapachona 2-
Hidroxi-3-(ββ-dimetilvinil)-14-naftoquinona 2-Cloro-14-naftoquinona e 4 derivados de
lapachol) Em seguida ceacutelulas BHK-21 foram incubadas com os compostos em concentraccedilotildees
natildeo citotoacutexicas em diferentes diluiccedilotildees e infectadas com os sorotipos 1 e 2 DENV na
multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 5 e 2 para os sorotipos 1 e 2 respectivamente A
atividade antiviral foi testada atraveacutes da anaacutelise de reduccedilatildeo de MTT e pela titulaccedilatildeo de virus
liberados no sobrenadante Apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute
uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes
faacutermacos natildeo demonstraram atividade antiviral nas condiccedilotildees experimentais testadas
IX
ABSTRACT
The Dengue virus (DENV) has four different serotypes (1-4) that are primarily transmitted by
the mosquito Aedes aegypti Infection results in the pathogenesis of dengue which is an
epidemic of global proportions Despite these efforts there is still no effective vaccine against
the four serotypes as well as efficient drugs in the treatment of patients Therefore various
studies have been conducted in the search for drugs with antiviral activity against DENV and
other flaviviruses Among the studied compounds for this purpose are the naphthoquinones
secondary metabolites produced by algae fungi plants and animals These compounds can be
mainly extracted from plants of the genus Tabebuia (Bignoniaceae) are characterized by
having antiviral activity especially the szlig-lapachone potent inhibitor of the enzyme reverse
transcriptase of avian myeloblastosis virus (AMV) and murine leukemia Rauscher (RLV)
The aim of this study was to test eight different compounds derived from synthetic and
natural naphthoquinones with potential antiviral activity against DENV For this a screening
was performed by reduction of MTT (3- (45-dimethylthiazol-2-yl) -25-diphenyl bromide
tetrazolina) to assess the cytotoxic activity of the compounds eight BHK-21 cell line resulting
in the calculation of the cytotoxic concentration 50 (CC50) and non-cytotoxic
concentrations to be used in subsequent tests for compounds A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 and
A8 (lapachol β-lapachone 2-hydroxy -3- (β β-dimethylvinyl) -14-naphthoquinone 2-
chloro-14-naphthoquinone and derivatives lapachol 4) Then BHK-21 cells were incubated
with compounds at non-cytotoxic concentrations in different dilutions and infected with
serotypes 1 and 2 DENV at multiplicity of infection (MOI) of 5 and 2 for serotypes 1 and 2
respectively The antiviral activity was assayed by MTT reduction assay and the virus titer
released into the supernatant Although some compounds have shown reduced to one log unit
in the number of viral particles results indicate that these drugs did not show antiviral activity
in experimental conditions
X
SUMAacuteRIO
RESUMO VIII
ABSTRACT IX
LISTA DE FIGURAS XII
LISTA DE TABELAS XIII
1 INTRODUCcedilAtildeO 2
11 Flavivirus 2
12 Dengue virus 3
13 Epidemiologia 6
14 Naftoquinonas 8
3 OBJETIVOS 16
31 Objetivo Geral 16
32 Objetivos especiacuteficos 16
4 MATERIAL E MEacuteTODOS 18
41 Linhagens celulares 18
411 Ceacutelulas C636 18
412 Ceacutelulas BHK-21 18
42 Viacuterus 18
421 DENV 1 e DENV 2 18
422 Titulaccedilatildeo viral 19
43 Compostos de naftoquinonas 19
44 Ensaio de citotoxicidade 20
45 Avaliaccedilatildeo da viabilidade e crescimento celular por exclusatildeo de azul de tripan 21
46 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) 21
47 Ensaio Dose-resposta 22
48 Ensaio Virucida 23
49 Ensaio antiviral 23
410 Anaacutelise estatiacutestica 24
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO 26
51 Ensaio de citotoxicidade celular 26
52 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan 28
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) 31
54 Ensaio dose resposta 32
XI
55 Ensaio Virucida 36
56 Ensaio Antiviral 37
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao tratamento com
os compostos A1 A3 A4 e A5 40
6 CONCLUSAtildeO 44
7 PERSPECTIVAS 46
8 REFEREcircNCIAS 48
XII
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Estrutura da partiacutecula viral de Dengue viacuterus 4
Figura 2 Ciclo de multiplicaccedilatildeo de DENV 5
Figura 3 Distribuiccedilatildeo geograacutefica da Dengue 7
Figura 4 Estrutura quiacutemica da 12-naftoquinona (1) e 14-naftoquinona (2) 9
Figura 5 Estrutura quiacutemica do Lapachol (1) da α- Lapachona (2) e da β-Lapachona 10
Figura 6 Tabebuia avellanedae 11
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (Exemplo da curva dose resposta do composto A7) 28
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan 29
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas) 30
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas 31
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI 32
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 34
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 35
Figura 14 Ensaio virucida 36
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral 38
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados 39
Figura 17 Curva de crescimento celular 41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular 41
XIII
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Relaccedilatildeo de nome estrutura e coacutedigo dos compostos utilizados 20
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo da
concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) 28
Tabela 3 Ensaio virucida 37
Tabela 4 Ensaio Antiviral 38
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados 39
XIV
LISTA DE ABREVIATURAS
AMV ndash Mielobastose Aviaacuteria viacuterus (Avian Myeloblastosis virus )
CC50 ndash Concentraccedilatildeo Citotoacutexica 50
DENV ndash Dengue virus
DMEM ndash Meio baacutesico modificado por Dulbecco (Dulbeccos Modified Eagle Medium)
DMSO ndash Dimetilsulfoacutexido
ICTV ndash Comitecirc Inernacional de Taxonomia Viral
JEV ndash Viacuterus da Encefalite Japonesa (Japanese Encephalitis virus)
MOI ndash Multiplicidade de infecccedilatildeo viral
NS ndash Proteiacutenas natildeo estruturais
NT ndash Natildeo Tratado
OMS ndash Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede
RE ndash Retiacuteculo endoplasmaacutetico
RLV ndash Viacuterus da Leucemia Murina de Rauscher (Murine leukemia virus)
SFB ndash Soro Fetal Bovino
UFP ndash Unidades formadoras de placas
WNV ndash Viacuterus do Nilo Ocidental (West Nile virus)
YFV ndash Viacuterus da febre amarela (Yellow fever virus)
ZV ndash Zika virus
1
I INTRODUCcedilAtildeO
2
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Flavivirus
O Gecircnero Flavivirus pertencente agrave famiacutelia Flaviviridae inclui 53 espeacutecies
taxonomicamente reconhecidas (ICTV 2016) muitas das quais satildeo importantes patoacutegenos
humanos tais como o Dengue virus (DENV) Yellow fever virus (YFV - viacuterus da febre
amarela ndash protoacutetipo deste gecircnero) Japanese encephalitis virus (JEV - viacuterus da encefalite
japonesa) West Nile virus (WNV - virus do Nilo Ocidental) Zika virus (ZV) entre outros
(Villordo 2016) O nome flavivirus eacute derivado da palavra latina flavus que significa amarelo
significando a icteriacutecia causada pelo YFV Os sintomas da infecccedilatildeo por flavivirus pode variar
de leve febre e mal-estar a encefalite fatal e febre hemorraacutegica (Mukhopadhyay 2005)
Estes viacuterus regulam o metabolismo e a sobrevivecircncia das ceacutelulas infectadas
assegurando a sua proacutepria reproduccedilatildeo e propagaccedilatildeo O viacuterus da dengue tambeacutem provoca a
autofagia uma resposta homeostaacutetica geral que ajuda a ceacutelula infectada sobreviver e produzir
viacuterus (Datan 2016)
Os Flavivirus podem ser agrupados em complexos e sub-complexos antigecircnicos
baseados em criteacuterios soroloacutegicos ou em grupos clados e espeacutecies segundo a sua filogenia
molecular (Lindenbach 2007) A maioria dos membros deste gecircnero satildeo arbovirus (arthropod
borne virus) ou seja satildeo essencialmente transmitidos por Artroacutepodes (Mackenzie 2004)
onde 27 satildeo transmitidos por mosquitos 12 por carrapatos e 14 natildeo possuem vetor
conhecido Os viacuterus transmitidos pela fecircmea do gecircnero Aedes incluem DENV e YFV satildeo
viscerotroacutepicos e possuem primatas como reservatoacuterio natural (Gaunt 2001)
A patogenia da Dengue causada pelo DENV constitui uma das doenccedilas virais mais
importantes em seres humanos transmitidos por insetos e eacute responsaacutevel por cerca de 390
milhotildees de infecccedilotildees por ano O YFV por sua vez causador da febre amarela eacute endecircmico em
vaacuterios paiacuteses do continente Africano e da Ameacuterica do Sul resultando em 200000 casos e
30000 mortes na Aacutefrica mesmo com vacinas eficazes disponiacuteveis Outras doenccedilas causadas
por flaviviacuterus incluem a encefalite do Nilo Ocidental (West Nile virus) e febre Zika (Zika
virus) que satildeo consideradas doenccedilas emergentes com surtos importantes em todo o mundo
(Villordo 2016)
3
12 Dengue virus
Os DENV pertencem ao gecircnero flaviviacuterus e evoluiram em primatas natildeo-humanos a
partir de um ancestral comum Eacute composto por quatro sorotipos antigenicamente distintos
(DENV1-4) que co-circulam por todo o Sudeste da Aacutesia Aacutefrica e Ameacutericas (McArthur 2013)
e em outubro de 2013 foi anunciado um novo sorotipo circulante denominado entatildeo de DENV
5 (Normile 2013) A partiacutecula infecciosa eacute esfeacuterica com 40-50 nm de diacircmetro possuindo
um envelope de lipopolissacariacutedeo O genoma consiste em RNA de fita simples natildeo
segmentado e senso positivo de aproximadamente 11 kb de comprimento e possui uma uacutenica
janela aberta de leitura (start codon) (Guzman 2010) Apoacutes a traduccedilatildeo a uacutenica poliproteiacutena
formada eacute clivada por proteases virais e celulares em trecircs proteiacutenas estruturais que compotildeem
a partiacutecula viral C (capsideo) prM M (membrana e o seu precursor) e E (envelope) e sete
proteiacutenas natildeo estruturais essenciais para a replicaccedilatildeo viral (NS) (NS1 NS2a NS2b NS3
NS4a NS4b e NS5) (Robertson 2009)
A transmissatildeo do viacuterus ocorre atraveacutes da picada por fecircmeas infectadas de mosquitos
do gecircnero Aedes sendo responsaacutevel pelas maiores taxas de doenccedila e mortalidade entre os
membros do gecircnero Flavivirus (Mukhopadhyay 2005) No Brasil o Aedes aegypti eacute o
principal vetor de dengue enquanto o Aedes albopictus atua como um vector secundaacuterio
(Weaver 2010)
O diagnoacutestico soroloacutegico da Dengue se baseia na detecccedilatildeo de niacuteveis elevados de
anticorpos anti-Dengue-IgM ou anti-Dengue-IgG que reconhecem e se ligam ao antiacutegeno de
DENV A Glicoproteiacutena do envelope (E) uma proteiacutena estrutural de DENV eacute o alvo
antigecircnico mais importante destes anticorpos neutralizantes porque estaacute exposta na superfiacutecie
do viacuterus e medeia os receptores de ligaccedilatildeo e fusatildeo da ceacutelula hospedeira (Lee 2015)
Durante a infecccedilatildeo celular os virions de DENV se ligam agrave superfiacutecie da membrana
atraveacutes da glicoproteiacutena do envelope (E) a receptores especiacuteficos e satildeo internalizados por
endocitose Uma vez dentro do endossoma a acidificaccedilatildeo provocada pela ligaccedilatildeo de
lisossomos desencadeia uma trimerizaccedilatildeo irreversiacutevel da proteiacutena E que atua na fusatildeo das
membranas virais e endossomais celulares Apoacutes essa fusatildeo o nucleocapsideo eacute liberado no
citoplasma onde o mesmo eacute desnudado e a replicaccedilatildeo do genoma de RNA e montagem de
partiacuteculas eacute iniciada As partiacuteculas virais imaturas satildeo acumuladas no luacutemen do retiacuteculo
endoplasmaacutetico (RE) Essas partiacuteculas imaturas que contecircm proteiacutenas prM proteiacutena E
membrana lipiacutedica e nuacutecleo capsiacutedeo natildeo pode induzir a fusatildeo da ceacutelula hospedeira ou seja
4
neste estaacutegio elas natildeo satildeo infecciosas (Mukhopadhyay 2005) O processo de maturaccedilatildeo
desses viacuterus ocorre apoacutes a clivagem proteoliacutetica da proteiacutena precursora de membrana (prM)
transformando viacuterus inerte em partiacuteculas infecciosas (Li 2008) Partiacuteculas subvirais satildeo
tambeacutem produzidas no RE mas apenas contecircm as glicoproteiacutenas de membrana fazendo com
que estas partiacuteculas sejam natildeo infecciosas Os viacuterus maduros e as partiacuteculas sub-virais satildeo
liberados da ceacutelula hospedeira por exocitose (Mukhopadhyay 2005)
Na pele o DENV tende a infectar ceacutelulas dendriacuteticas imaturas Estas ceacutelulas infectadas
amadurecem e migram para os gacircnglios linfaacuteticos regionais ou locais onde apresentam
antiacutegenos virais agraves ceacutelulas T iniciando as respostas imunes Existe tambeacutem evidecircncia de
replicaccedilatildeo abundante de DENV em ceacutelulas do parecircnquima do fiacutegado e em macroacutefagos nos
gacircnglios linfaacuteticos fiacutegado e baccedilo bem como em monoacutecitos de sangue perifeacuterico (Guzman
2010)
Proteiacutena E
(diacutemero)
Proteiacutena
M
Proteiacutena C
ssRNA (+)
Figura 1 Estrutura da partiacutecula viral de Dengue viacuterus A partiacutecula viral eacute composta
por trecircs proteiacutenas estruturais proteiacutena de envelope (E) disposta em diacutemeros a proteiacutena
associada agrave membrana (M) e a proteiacutena do nucleocapsiacutedeo (C) O genoma de RNA fita-
simples de polaridade positiva se encontra dentro do nucleocapsiacutedeo (Adaptado de
httpviralzoneexpasyorgviralzoneall_by_species24html)
5
Figura 2 Ciclo de multiplicaccedilatildeo de DENV A Os viacuterus se ligam aos receptores na superfiacutecie da
ceacutelula e satildeo endocitados B Devido ao baixo pH dentro dos endossomas ocorre a fusatildeo de
membranas viral-celular mediada por proteiacutenas virais resultando na liberaccedilatildeo do RNA viral em um
processo chamado de desnudamento C O genoma viral eacute traduzido em uma uacutenica poliproteiacutena que
eacute processada por proteases do viacuterus e da ceacutelula hospedeira D O RNA eacute replicado por proteiacutenas
natildeo-estruturais do proacuteprio viacuterus E A montagem do viacuterus ocorre na membrana do Reticulo
endoplasmaacutetico no qual a proteiacutena do capsiacutedeo e o RNA viral satildeo envolvidos por glicoproteiacutenas e
pela membrana da organela para formar partiacuteculas virais imaturas F Partiacuteculas virais imaturas
utilizam a via secretora da ceacutelula hospedeira e sob o baixo pH do Complexo de Golgi a proteiacutena
precursora prM eacute clivada em proteiacutena M completando a maturaccedilatildeo do viacuterus GOs viacuterus maduros
satildeo entatildeo liberados das ceacutelulas por exocitose Os nuacutemeros indicados nas caixas coloridas referem-se
ao valor de pH dos respectivos compartimentos Imagem adaptada de PERERA 2009
Adsorccedilatildeo
Siacutentese e processamento
Fusatildeo e
Desnudamento
Replicaccedilatildeo do RNA
Montagem
Maturaccedilatildeo
Liberaccedilatildeo de
viacuterus
maduro
A
B
C
D
E
F
G
6
13 Epidemiologia
Ao longo das uacuteltimas deacutecadas a dengue se tornou a doenccedila viral transmitida por
mosquitos mais prevalente no mundo Estimativas de infecccedilatildeo pela OMS indicam que a
patologia eacute endecircmica em mais de 100 paiacuteses em todos os continentes exceto a Antaacutertida e
aflige principalmente paiacuteses pobres em recursos nas regiotildees tropicais e subtropicais (Perry
2011) Epidemias globais de DENV ocorreram ao longo das uacuteltimas deacutecadas em parte devido
agrave diminuiccedilatildeo dos esforccedilos no controle de mosquitos Satildeo estimados mais de 50 milhotildees de
casos de dengue anualmente (Mukhopadhyay 2005)
A Dengue eacute uma doenccedila viral sistecircmica aguda que se estabeleceu em todo o mundo
em ambos os ciclos de transmissatildeo endecircmicas e epidecircmicas A infecccedilatildeo pelo DENV em seres
humanos eacute frequentemente inaparente mas pode levar a uma grande variedade de
manifestaccedilotildees cliacutenicas de febre leve a siacutendrome do choque da dengue potencialmente fatal A
imunidade vitaliacutecia desenvolvida apoacutes a infecccedilatildeo com um dos quatro tipos de viacuterus eacute
especiacutefica para cada tipo e a progressatildeo para uma doenccedila mais grave eacute frequente mas natildeo
exclusivamente relacionada com infecccedilatildeo secundaacuteria por tipos heteroacutelogos No entanto
enquanto a expansatildeo histoacuterica desta doenccedila eacute bem documentada o elevado fardo de
problemas de sauacutede atribuiacuteveis agrave dengue em grande parte do mundo tropical e sub-tropical
permanecem pouco enumerados (Bhatt 2013)
O Brasil eacute um paiacutes de grande extensatildeo (8512000 km2) situado em uma zona
predominantemente tropical com extensas aacutereas de florestas na regiatildeo amazocircnica bem como
restos de uma floresta tropical na costa leste sudeste e sul entre outros ecossistemas A maior
parte do paiacutes tem um clima tropical e uma grande diversidade de plantas e animais portanto
um local adequado para a ocorrecircncia de patologias causadas por viacuterus transmitidos por
artroacutepodes (Figueiredo 2000) Segundo o boletim epidemioloacutegico do ministeacuterio da sauacutede em
2016 jaacute foram registrados 170103 casos provaacuteveis de dengue no paiacutes ateacute a semana
epidemioloacutegica 5 Nesse periacuteodo a regiatildeo Sudeste registrou o maior nuacutemero de casos
provaacuteveis (96664 casos 568) Em Minas Gerais jaacute foram registradas 19 mortes em
decorrecircncia da Dengue entre 1deg de janeiro e 14 de marccedilo deste ano Outros 91 oacutebitos estatildeo
sob investigaccedilatildeo (BRASIL 2016)
7
Figura 3 Distribuiccedilatildeo geograacutefica da Dengue Aacutereas de risco de transmissatildeo em amarelo
(Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede Adaptado de httpwwwwhointen)
As manifestaccedilotildees da doenccedila foram descritas pela primeira vez apoacutes a Segunda Guerra
Mundial coincidente com o aumento da urbanizaccedilatildeo particularmente na Aacutesia (Weaver 2010)
Atualmente o DENV eacute hiperendecircmico em muitas regiotildees tropicais onde 2 ou mais sorotipos
circulam endemicamente Embora DENV foi provavelmente introduzido periodicamente para
as Ameacutericas atraveacutes de navios desde o seacuteculo 17 o surgimento de DENV no Hemisfeacuterio
Ocidental comeccedilou mais tarde devido a uma campanha de sucesso parcial para erradicar o
vetor A aegypti para controlar a febre amarela Esta campanha teve sucesso na maior parte
das Ameacutericas da deacutecada de 1950 agrave deacutecada de 1970 mas foi interrompida O vetor entatildeo
rapidamente recolonizou quase toda a regiatildeo neotropical e subtropicais e a invasatildeo do DENV
seguiu logo depois Em 1985 A albopictus foi introduzido nos EUA e no Brasil
proporcionando um vetor para a transmissatildeo secundaacuteria de DENV nas Ameacutericas (Hawley
1987)
Os mosquitos vetores principalmente A aegypti tornam-se infectados quando eles se
alimentam do sangue de seres humanos durante o periacuteodo de cinco dias da viremia A
infecccedilatildeo produz um amplo espectro da doenccedila cliacutenica e varia de assintomaacutetica a doenccedila febril
auto-limitante A dengue tambeacutem conhecida como ldquofebre osso quebradordquo devido agraves fortes
dores nas articulaccedilotildees e inclui sintomas de febre alta dores musculares articulares e erupccedilatildeo
cutacircnea Uma pequena porcentagem de indiviacuteduos pode apresentar a siacutendrome do choque da
8
dengue (dengue hemorraacutegica) com risco de vida grave O tratamento eacute amplamente favoraacutevel
usando de reidrataccedilatildeo oral ou intravenosa acompanhamento e atenccedilatildeo meacutedica adequada No
entanto uma das principais consequecircncias da doenccedila eacute a sua capacidade de sobrecarregar
instalaccedilotildees meacutedicas durante um surto e em paiacuteses onde os recursos de sauacutede jaacute estatildeo no
limite isso pode ter efeitos catastroacuteficos Prevenccedilatildeo e tratamento portanto se fazem
altamente necessaacuterios (Perry 2011)
A prevalecircncia global de DENV cresceu drasticamente nas uacuteltimas deacutecadas e ateacute o
momento natildeo haacute nenhum medicamento especiacutefico para combater a infecccedilatildeo as medidas de
prevenccedilatildeo mais eficazes satildeo voltadas para o controle do vetor (Silva 2011) Diante disso a
Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) elegeu o desenvolvimento de vacinas contra o viacuterus da
dengue como prioridade mundial (Kinney 2001) Por conseguinte a busca de substacircncias
naturais ou sinteacuteticas com atividade antiviral especiacutefica sem toxicidade para as ceacutelulas
normais em seres humanos eacute uma estrateacutegia desejada para evitar que a dengue se agrave e
ajudar a controlar a difusatildeo da doenccedila As vaacuterias fases do ciclo viral representam alvos
terapecircuticos individuais que podem ser exploradas (Costa 2013) Nesse sentido vaacuterios
grupos de pesquisa e organizaccedilotildees estatildeo trabalhando com diversas abordagens para o
desenvolvimento de compostos antivirais com atividade protetora contra dengue Dentre elas
uma vasta gama de produtos naturais incluindo plantas numa tentativa de isolar e
caracterizar novos compostos que podem inibir a replicaccedilatildeo do viacuterus ou tratar a infecccedilatildeo
viral Por essa razatildeo extratos e componentes da planta satildeo cada vez mais importantes como
fontes potenciais para agentes antivirais (Silva 2011)
14 Naftoquinonas
As quinonas satildeo compostos aromaacuteticos amplamente distribuiacutedos na natureza e podem
ser encontrados em vaacuterias famiacutelias de plantas bem como isolado de fungos algas e
bacteacuterias Elas satildeo classificadas em benzoquinonas antraquinonas e naftoquinonas de acordo
com as suas estruturas quiacutemicas Naftoquinonas satildeo compostos orgacircnicos altamente reativos
utilizados como corantes naturais ou sinteacuteticos cujas cores variam de amarelo para vermelho
Apresentam cadeia carbocircnica similar ao naftaleno e satildeo caracterizadas por seus dois grupos
carbonila na posiccedilatildeo 1 e 4 por isso satildeo nomeadas de 14-naftoquinonas Os grupos carbonila
tambeacutem podem estar presente na posiccedilatildeo 12 com menor incidecircncia (Loacutepez 2014)
9
Figura 4 Estrutura quiacutemica da 12-naftoquinona (1) e 14-naftoquinona (2)
Entre as quinonas estatildeo compostos biologicamente importantes tais como o grupo da
vitamina K e a coenzima Q (ubiquinona) Estes compostos tecircm um papel importante no
metabolismo celular especialmente como carreadores de eleacutetrons Aleacutem de quinonas que
possuam uma funccedilatildeo bioloacutegica outros compostos desta classe tecircm sido encontrados
mostrando atividade antibioacutetica Alguns deles estatildeo presentes na natureza mas a maior parte
satildeo obtidos sinteticamente entre eles 2-hidroxi-3-alquil-14-naftoquinonas que possuem
evidecircncias de serem ativos in vitro contra os parasitas da malaacuteria e como coccidiostaacuteticos
(Ambrogi 1970)
A atividade bioloacutegica de quinonas estaacute muitas vezes relacionada com o seu
comportamento eletroquiacutemico A capacidade de aceitar um ou dois eleacutetrons para formar o
acircnion radical correspondente ou dianion pode ser o motivo da induccedilatildeo da formaccedilatildeo de
espeacutecies reativas de oxigecircnio responsaacuteveis pelo estresse oxidativo nas ceacutelulas A capacidade
de aceitar eleacutetrons de naftoquinonas pode ser alterada por mudanccedilas de posiccedilatildeo do grupo
carbonila (12- 14-naftoquinonas) ou diferentes substituintes ou funccedilotildees associadas agrave porccedilatildeo
de naftoquinona (Francisco 2010)
As naftoquinonas satildeo largamente encontradas em plantas micro-organismos e alguns
animais Estes compostos tecircm sido amplamente utilizados em diversas culturas como corantes
para cosmeacuteticos tecidos alimentos (Brandelli 2004) e para fins medicinais incluindo
antitumoral (Oliveira 1990 Ferreira 1996) anti-inflamatoacuterios antimalaacuterico antiviral
(Fonseca 2003 Hussain 2007) atibacterianos e antifuacutengicos (Nagata 1998) Estas atividades
bioloacutegicas tecircm justificado o grande nuacutemero de trabalhos (aproximadamente 42 ateacute abril 2016
ndash Pubmed) encontrados na literatura que visa a siacutentese e avaliaccedilatildeo de qualquer das quinonas
naturais ou seus anaacutelogos como agentes farmacoloacutegicos potenciais (Rahmoun 2013)
10
O Lapachol foi descoberto e estudado desde o seacuteculo XIX Foi isolado primeiramente
do lenho da aacutervore argentina ldquolapachordquo Tabebuia avellanedae (Bignoniaceae) conhecida
como Ipecirc roxo Os estudos quiacutemicos foram desenvolvidos inicialmente em 1892 (Fonseca
2003) O lapachol foi descrito pela primeira vez por Paterno em 1821 tendo sua estrutura
quiacutemica estabelecida em 1896 por Hooker que o identificou como uma naftoquinona Esta
naftoquinona possui accedilatildeo antiinflamatoacuteria analgeacutesica antibioacutetica e anti-neoplaacutesica
reconhecida (Arauacutejo 2002)
A β-lapachona (34-di-hidro-22-dimetil-2H-naptho [12-b] pirano-56-diona) eacute uma
quinona obtida de fontes naturais derivada da aacutervore Lapacho (Tabebuia avellanedae) nativa
da Ameacuterica do Sul e Central A siacutentese e quiacutemica da β-lapachona e compostos relacionados
foi inicialmente investigado no final do seacuteculo XIX e iniacutecio do seacuteculo XX pelo quiacutemico
Samuel Hooker Apesar de alguns estudos cliacutenicos sobre a bioatividade de naftoquinonas
terem sido relatados no iniacutecio de 1940 foi o relatoacuterio do potencial da β-lapachona como um
agente anti-tripanossoma em 1977 que revitalizou o estudo e caracterizaccedilatildeo deste composto
natural A β-lapachona tambeacutem apresenta vaacuterias accedilotildees farmacoloacutegicas incluindo accedilatildeo
formaccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (Hussain 2007)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do Lapachol (1) da α- Lapachona (2) e da β-
Lapachona (Fonseca et al 2003 Ferreira et al 2010)
11
Figura 6 Tabebuia avellanedae (Hussain 2007)
A β-lapachona eacute uma substacircncia natural facilmente obtida a partir do lapachol Esta
naftoquinona eacute o grande destaque desta classe de substacircncias porque se encontra em testes
cliacutenicos de fase II para o tratamento do cacircncer de pacircncreas (Ferreira 2010) O mecanismo de
accedilatildeo da β-lapachona diferencia-se de outros antineoplaacutesicos por atuar na topoisomerase I
promovendo a recuperaccedilatildeo da capacidade de apoptose celular Alguns estudos reportam sua
accedilatildeo sineacutergica de potenciaccedilatildeo com o Taxolreg
promovendo a inibiccedilatildeo em diferentes pontos de
replicaccedilatildeo celular aleacutem de sua combinaccedilatildeo com outros tratamentos como a aplicaccedilatildeo de
radiaccedilatildeo ionizante (Cunha 2005)
Vaacuterios estudos jaacute foram publicados demonstrando a atividade antiviral de
naftoquinonas naturais e sinteacuteticas A β-lapachona inibe seletivamente a replicaccedilatildeo do viacuterus
HIV-1 atuando na inibiccedilatildeo da enzima LTR117 Da mesma forma este composto eacute um
potente inibidor da enzima transcriptase reversa dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e
leucemia murina de Rauscher (RLV) inibindo tambeacutem a DNA polimerase A accedilatildeo inibitoacuteria
sobre estas enzimas revelou-se especiacutefica se comparada com a de outros inibidores
conhecidos (Silva 2003)
O Lapachol jaacute demonstrou atividade contra certas cepas virais incluindo Herpes virus
tipos I e II Outras naftoquinonas jaacute mostraram eficaacutecia contra cepas de Influenza virus
Poliomielite virus e estomatite vesicular Supotildee-se que o mecanismo de accedilatildeo destas quinonas
seja atraveacutes da inibiccedilatildeo da transcriptase reversa de retroviacuterus e da RNA polimerase Eacute relatado
12
que lapachol diminui a replicaccedilatildeo do viacuterus em seres humanos mas ainda natildeo existem
resultados de testes cliacutenicos disponiacuteveis (Hussain 2007)
Na avaliaccedilatildeo da atividade antiviral do Lapachol in vitro verificou-se que esta
substacircncia eacute ativa contra viacuterus RNA atuando tanto sobre viacuterus envelopados quanto sobre
partiacuteculas sem esta estrutura em concentraccedilotildees de 5 a 10 microgmL e ainda apresentou uma
pequena atividade sobre HSV (Herpes simplex I) e Ad5 (Adeno tipo 5) mas nenhuma
atividade sobre CoxB4 (Coxsackie B4) Em trabalho posterior demonstrou-se que nem o
Lapachol nem diversos dos seus derivados apresentaram atividade antiviral in vitro sobre
Poliovirus tipo 1 Ecovirus 19 e Coxsackie B tipo 4 Apenas os derivados 12-naftoquinonicos
e um intermediaacuterio da siacutentese Hoocker foram ativos contra o Echovirus 19 (Fonseca 2003)
Costa et al (2013) relataram que piranonaftoquinonas isocircmeras do lapachol possuem
atividade de inibiccedilatildeo da replicaccedilatildeo de DENV-2 atuando sobre a atividade da ATPase de NS3
(proteiacutena natildeo estrutural de DENV)
A utilizaccedilatildeo de testes in vitro por meio de ensaios de viabilidade celular constitui o
primeiro passo para a avaliaccedilatildeo da compatibilidade bioloacutegica de uma substacircncia e pode
fornecer elementos importantes para a anaacutelise da biocompatibilidade dos diferentes materiais
Para ser considerado natildeo citotoacutexico no teste de citotoxicidade in vitro um produto natildeo deve
ocasionar a morte das ceacutelulas nem afetar suas funccedilotildees celulares A prova do MTT eacute um dos
indicadores colorimeacutetricos de viabilidade celular mais utilizados sendo capaz de avaliar a
funccedilatildeo celular mitocondrial de acordo com a reduccedilatildeo enzimaacutetica do sal de tetrazoacutelio pelas
desidrogenases mitocondriais nas ceacutelulas viaacutevies (Arauacutejo et al 2008) Supotildee-se que o
mecanismo responsaacutevel pela citotoxicidade apresentada pelas quinonas esteja relacionado
com o estresse oxidativo causado por esses compostos poreacutem a capacidade de alquilaccedilatildeo de
nucleoacutefilos celulares tambeacutem representa correlaccedilatildeo com tais efeitos bioloacutegicos (Goulart
2004)
13
II JUSTIFICATIVA
14
2 JUSTIFICATIVA
Aleacutem do controle do mosquito transmissor e do desenvolvimento de vacinas que tem
sido exaustivamente estudado nos uacuteltimos anos uma alternativa para o combate agrave dengue
seria o desenvolvimento de faacutermacos para reduzir a viremia ou mesmo para controlar a
resposta imune do hospedeiro agrave infecccedilatildeo que tem sido apontada como principal fator de risco
nos casos mais graves Em funccedilatildeo disso o nuacutemero de pesquisas visando o desenvolvimento
de drogas com accedilatildeo antiviral ou com accedilatildeo imunomodulatoacuteria tem aumentado
significativamente As naftoquinonas vecircm ganhando bastante importacircncia na pesquisa de
novas drogas antivirais devido agrave algumas atividades apresentadas A szlig-lapachona-orto-
naftoquinona por exemplo se mostrou um potente inibidor da enzima transcriptase reversa
dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e leucemia murina de Rauscher (RLV)
Diante da inexistecircncia de drogas com accedilatildeo anti DENV e o elevado nuacutemero e casos da
patogenia nos uacuteltimos anos a organizaccedilatildeo mundial da sauacutede classificou a Dengue como uma
epidemia de proporccedilotildees globais e um problema de sauacutede puacuteblica Como as naftoquinonas jaacute
demonstraram na literatura possuir um potencial efeito terapecircutico contra alguns viacuterus eacute
possiacutevel que estes compostos possam apresentar atividade antiviral contra DENV Portanto
este trabalho visou atraveacutes de ensaios de MTT e titulaccedilotildees virais em placa avaliar a potencial
atividade antiviral de oito compostos derivados de naftoquinonas naturais e sinteacuteticas
15
III OBJETIVOS
16
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar oito compostos (2 naturais e 6 sinteacuteticos) derivados de naftoquinonas como potenciais
agentes antivirais em ceacutelulas BHK-21 frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1 e 2
32 Objetivos especiacuteficos
1 Calcular o iacutendice de citotoxicidade e a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) dos compostos
atraveacutes de ensaio de reduccedilatildeo de MTT
2 Avaliar os efeitos dos compostos sobre o crescimento a viabilidade e o volume celular
pela teacutecnica de exclusatildeo do azul de tripan
3 Determinar a multiplicidade de infecccedilatildeo de DENV 1 e 2 a ser utilizada nos ensaios
antivirais
4 Avaliar a atividade antiviral dos compostos frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1
e 2 atraveacutes do ensaio de MTT
5 Verificar um possiacutevel efeito direto dos compostos agraves partiacuteculas virais de Dengue virus
6 Quantificar a produccedilatildeo de partiacuteculas virais infecciosas no sobrenadante de ceacutelulas
infectadas atraveacutes de titulaccedilatildeo viral pela contagem de unidades formadoras de placas
17
IV MATERIAL E MEacuteTODOS
18
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Linhagens celulares
411 Ceacutelulas C636
As ceacutelulas C636 satildeo ceacutelulas de linhagem contiacutenua de larvas de mosquito Aedes
albopictus Estas ceacutelulas foram utilizadas na produccedilatildeo de estoque viral de DENV sorotipos 1
e 2 para isso foram mantidas em meio de cultura Leibovitz-15 (L-15) (Cultilab)
suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (Cultilab) antibioacuteticos (Penicilina 100 UmL
Streptomicina 100 microgmL) e antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL) a 28degC
412 Ceacutelulas BHK-21
As ceacutelulas BHK-21 satildeo fibroblastos de linhagem contiacutenua derivados de rim de hamster
neonato Estas ceacutelulas foram utilizadas para os experimentos in vitro e para as titulaccedilotildees de
DENV 1 e 2 para isso foram mantidas em meio miacutenimo essencial modificado por Dulbecco
ndash DMEM (Cultilab) suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (SFB) com antibioacuteticos
(Penicilina 100 UmL Streptomicina 100 microgmL) e com antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL)
sendo mantidas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5
42 Viacuterus
421 DENV 1 e DENV 2
O Sorotipo 1 do Dengue virus (DENV-1) estirpe Mochizuki foi replicado em ceacutelulas
C636 para gerar estoques de trabalho durante 2 e 5 dias a 28degC O sobrenadante da cultura de
ceacutelulas infectadas foi recolhido e clarificado por centrifugaccedilatildeo a 4000 G durante 10 minutos agrave
4degC e entatildeo foi aliquotado e armazenado a -70 deg C como reserva de viacuterus ateacute agrave sua utilizaccedilatildeo
A replicaccedilatildeo geraccedilatildeo de estoque e titulaccedilatildeo do Sorotipo 2 do Dengue virus (DENV-2)
estirpe Nova Guineacute C ocorreu nos mesmos moldes do DENV-1
19
422 Titulaccedilatildeo viral
Os estoques virais foram diluiacutedos (10-1
a 10-7
) e inoculados em monocamadas de
ceacutelulas BHK-21 implantadas em placas de 6 poccedilos com confluecircncia de aproximadamente
60 (3x105 ceacutelulas por poccedilo) sendo um poccedilo natildeo infectado mantido para controle celular
Apoacutes uma hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus foram adicionados 3 mL de meio DMEM (Cultilab)
suplementado com 15 de SFB e contendo 15 de Carboximetilcelulose (CMC Synth) As
placas foram entatildeo incubadas a 37degC (CO2 a 5) por 96 horas As ceacutelulas foram entatildeo
fixadas com 2 mL de soluccedilatildeo de formol a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo
1 (pv) de cristal violeta em PBS para contagem das placas de lise O tiacutetulo viral foi
expresso atraveacutes do nuacutemero de unidades formadoras de placa por mL (UFPmL) segundo a
formula abaixo representada
Tiacutetulo viral (UFPmL) = N x FC x 10
N = nuacutemero de placas de lise contadas
FC = Fator de correccedilatildeo
= Inverso da diluiccedilatildeo na qual foram contadas as placas de lise
43 Compostos de naftoquinonas
Os compostos utilizados neste estudo foram fornecidos pelo Dr Geraldo Ceacutelio
Brandatildeo do laboratoacuterio de pesquisa da Escola de Farmaacutecia da Universidade Federal de Ouro
Preto
20
Tabela 1 Relaccedilatildeo de nome estrutura e coacutedigo dos compostos utilizados Na tabela estatildeo
presentes a relaccedilatildeo dos nomes dos compostos utilizados neste trabalho bem como sua
estrutura Os coacutedigos representantes de cada composto seratildeo utilizados no decorrer da escrita
Nome do composto Estrutura Coacutedigo
Lapachol
A1
β-lapachona
A2
2-Hidroxi-3-(ββ-dimetilvinil)-14-naftoquinona
A3
2-Cloro-14-naftoquinona
A4
Lapachol derivado 1
A5
Lapachol derivado 2 A6
Lapachol derivado 3 A7
Lapachol derivado 4 A8
44 Ensaio de citotoxicidade
Para avaliar a citotoxicidade dos compostos ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas foram incubadas com diferentes concentraccedilotildees dos compostos em triplicata num
volume de 200 microL de meio de cultura por poccedilo na presenccedila de 1 de SFB Os controles natildeo
tratados apresentaram adiccedilatildeo de 200 microL de meio de cultura As ceacutelulas foram entatildeo incubadas
durante 72 horas O meio foi removido e 28 microL de soluccedilatildeo de 5 mg mL MTT (brometo de 3-
21
[45-dimetil-tiazol-2-il]-25 difeniltertrazoacutelio) foi adicionado a cada poccedilo As placas foram re-
incubadas durante 1 hora e 30 minutos e entatildeo 122 microL de DMSO foi adicionado a cada poccedilo e
placas foram agitadas suavemente durante 15 minutos para dissolver os cristais de formazan
A absorbacircncia foi lida em um equipamento leitor de placas Victor X3 (PerkinElmer) a 490
nm A concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC 50) foi definida como a concentraccedilatildeo da amostra que
reduziu a viabilidade celular de 50 em comparaccedilatildeo com controles natildeo tratados Os dados
foram analisados utilizando o programa Prisma
45 Avaliaccedilatildeo da viabilidade e crescimento celular por exclusatildeo de azul de tripan
Ceacutelulas BHK-21 foram cultivadas em placas de 24 poccedilos (7x104 ceacutelulaspoccedilo) e apoacutes
24 horas foram tratadas com as concentraccedilotildees de uso de cada composto e incubadas por 72
horas na presenccedila de 1 de SFB A seguir as ceacutelulas foram tripsinizadas e incubadas com
azul de tripan e entatildeo foi utilizado um contador automatizado de ceacutelulas (Countess II FL
Automated Cell Counter ndash Thermo Fisher Scientific) para contagem das ceacutelulas e avaliaccedilatildeo da
porcentagem de viabilidade e diacircmetro celular do controle nos tempos de 0 24 e 96 horas e
avaliaccedilatildeo dos mesmos paracircmetros para os compostos no tempo de 96 horas (72 horas poacutes
tratamento)
Outra curva de multiplicaccedilatildeo celular foi feita para os compostos A1 A3 A4 e A5 onde as
ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos no momento da confecccedilatildeo da placa e
foram avaliados os mesmos paracircmetros nos tempos de 0 12 24 48 e 72 horas O
equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
46 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
Para determinar a menor Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) responsaacutevel pela letalidade
celular total 2x104 de ceacutelulas BHK-21 foram semeadas em placa de 96 poccedilos Apoacutes a
incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o
meio de cultura foi removido e as ceacutelulas foram expostas a diferentes diluiccedilotildees dos dois
sorotipos de DENV (100 microL de cada diluiccedilatildeo + 100 microL de meio DEMEM 1 SFB) As
diluiccedilotildees seriadas foram realizadas da suspensatildeo viral na razatildeo de 5 para o primeiro poccedilo e de
2 para os demais poccedilos Apoacutes 72 horas as ceacutelulas foram entatildeo fixadas com 200 microL de soluccedilatildeo
22
formalina a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo 1 (pv) de cristal violeta em
PBS para avaliaccedilatildeo da maior diluiccedilatildeo responsaacutevel pela letalidade de 100 das ceacutelulas
47 Ensaio Dose-resposta
Para cada composto foram realizados ensaios de dose-resposta para definiccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de cada composto capaz de promover a reduccedilatildeo na produccedilatildeo viral A atividade
antiviral foi avaliada tambeacutem pelo meacutetodo de MTT Ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas expostas a diferentes concentraccedilotildees dos extratos determinadas a partir das maiores
concentraccedilotildees em que natildeo foram observados efeitos citotoacutexicos As ceacutelulas foram tratadas
com as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de cada composto e em seguida infectadas com DENV
1 (MOI= 5) ou 2 (MOI= 2) Mantendo uma coluna para controle com DMSO uma coluna
para controle de viacuterus uma coluna para controle de citotoxicidade dos compostos e por fim
uma coluna para controle celular As ceacutelulas foram entatildeo incubadas durante 72 horas Apoacutes
este tempo procedeu-se a leitura pelo ensaio de MTT como descrito anteriormente Os dados
foram analisados levando-se em consideraccedilatildeo a leitura das absorbacircncias dos poccedilos dos
controles de viacuterus e do controle celular
Para realizacao destes experimentos os seguintes controles foram adotados
Controle de ceacutelulas poccedilos contendo somente ceacutelulas acrescidas do meio de cultura DMEM
1 SFB Utilizado para avaliar o comportamento das ceacutelulas sem que as mesmas tivessem
contato com qualquer interferente durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo Com isso os poccedilos
reservados para esse controle serviram de padratildeo para comparaccedilatildeo com aqueles em que fosse
observada atividade citotoacutexica ou citopaacutetica
Controle de viacuterus poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM 1 SFB
sem nenhum tratamento e de suspensatildeo de viacuterus Utilizando como referecircncia para anaacutelise da
atividade citopaacutetica provocada pelo viacuterus testado durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo das placas
23
Controle de viacuterus com DMSO Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura
DMEM 1 SFB e DMSO Foi utilizado para avaliar se havia influecircncia prejudicial do
solvente utilizado para diluiccedilatildeo das amostras no meio de cultivo das ceacutelulas e se o mesmo
poderia apresentar alguma potencial atividade antiviral aparente
Controle de citotoxicidade Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM
1 SFB e as quatro principais concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos Foi utilizado
para avaliar se haveria alguma possiacutevel atividade citotoacutexica das concentraccedilotildees dos compostos
em relaccedilatildeo agraves ceacutelulas
48 Ensaio Virucida
Para a realizaccedilatildeo deste ensaio aliacutequotas de 950 microL (diluiccedilatildeo de 20 vezes) do DENV 1 (tiacutetulo
6 x 107 UFPmL) foram incubadas com 50 microL de uma soluccedilatildeo de meio DMEM preparada
com 20x a concentraccedilatildeo natildeo citotoacutexica de cada composto A1 a A8 em banho-maria 37deg C
por 1 hora Apoacutes a incubaccedilatildeo as aliacutequotas foram imediatamente tituladas em ceacutelulas BHK-21
em placas de 6 poccedilos utilizando-se 3 diluiccedilotildees para cada incubaccedilatildeo (20x 20 x 10-1
e 20 x 10-
2) Foram titulados tambeacutem uma aliacutequota incubada apenas com meio DMEM sem nenhum
tratamento e outra aliacutequota incubada com DMSO (Dimetilsulfoacutexido) Estas foram tituladas
utilizando um controle e mais cinco diluiccedilotildees (20x 20 x 10-1
20 x 10-2
20 x 10-3
e 20 x 10-4
)
49 Ensaio antiviral
Neste ensaio ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em placas de 24 poccedilos no dia
seguinte foram tratadas durante 4 horas com as concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas de cada
composto em duplicata Apoacutes o preacute-tratamento as monocamadas foram infectadas com
DENV-1 a uma MOI=5 na presenccedila das concentraccedilotildees de uso respectivas de cada composto
Apoacutes 1 hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus as monocamadas foram lavadas duas vezes com PBS e
foi adicionado 500 microL por poccedilo de meio preparado com as mesmas concentraccedilotildees dos
diferentes compostos e mantidos durante 48 horas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5 Em
quatro poccedilos as ceacutelulas foram infectadas e natildeo tratadas e em outros quatro poccedilos as ceacutelulas
natildeo foram tratadas e nem infectadas (controle de ceacutelulas) destes uacuteltimos dois foram
tripsinizados e contados no momento da infecccedilatildeo e os outros dois apoacutes o teacutermino do ensaio
24
para avaliar o crescimento celular Decorridas as 48 horas o sobrenadante foi coletado e
centrifugado por 10 minutos a 4000 xG para separaccedilatildeo dos debris celulares e prontamente
titulado em placa de 6 poccedilos
410 Anaacutelise estatiacutestica
Os valores de CC50 foram obtidos a partir de anaacutelise de regressatildeo linear das curvas de
concentraccedilatildeocitotoxicidade A anaacutelise estatiacutestica dos dados foi realizada pelo programa
GraphPad Prism software Uma anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi utilizada para determinar
as diferenccedilas estatiacutesticas seguida do poacutes teste de Tukey A significacircncia estatiacutestica foi fixada
em p lt005
25
V RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
26
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Ensaio de citotoxicidade celular
Para avaliar a viabilidade da linhagem celular BHK-21 frente ao tratamento com oito
diferentes concentraccedilotildees dos compostos (A1 a A8) realizou-se um ensaio de MTT (brometo
de 3-[45-dimetil-tiazol-2-il]-25-difeniltetrazoacutelio) Este ensaio tem o objetivo de quantificar
espectrofotometricamente o crescimento celular a viabilidade e proliferaccedilatildeo podendo ser
utilizado como um indicador direto de citotoxicidade Trata-se de um ensaio colorimeacutetrico
para medir a atividade da redutase mitocondrial em ceacutelulas vivas Ele se baseia na reduccedilatildeo do
sal amarelo tetrazoacutelio (permeaacutevel agrave membrana celular) para cristais de formazan azuis
puacuterpura por ceacutelulas metabolicamente ativas a quantidade de formazan gerada medida por
espectrofotometria eacute proporcional ao nuacutemero de ceacutelulas viaacuteveis
A CC50 foi calculada plotando-se uma curva de porcentagem de viabilidade celular por
concentraccedilatildeo melhor representada na figura 7 pelo composto A7 e os resultados de CC50
para todos os compostos estatildeo representados na tabela 2 Foram feitos ensaios de
citotoxicidade com oito concentraccedilotildees diferentes sendo escolhida a maior concentraccedilatildeo que
natildeo apresentou citotoxicidade
Viabilidade Celular = [ ( A ndash B ) A ] x 100
Onde
A = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas natildeo tratadas
B = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas tratadas com
as respectivas concentraccedilotildees de cada composto
27
28
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (A curva dose resposta do composto A7 eacute a que
melhor representa a curva dose resposta esperada) Avaliou-se a viabilidade da linhagem
celular BHK-21 frente agrave diferentes concentraccedilotildees dos compostos realizando o ensaio de MTT
e determinando assim as concentraccedilotildees a serem utilizadas nos proacuteximos ensaios bem como
calculando a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) agrave partir da curva
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo
da concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50)
Composto Concentraccedilatildeo utilizada
[ ] microgmL
Concentraccedilatildeo citotoacutexica 50
(CC50) [ ] microgmL plusmn Desvio
Padratildeo
A1 ([ ]=1 mgmL) 00200 10010 plusmn 0014
A2 ([ ]=1 mgmL) 00025 09561 plusmn 0023
A3 ([ ]=1 mgmL) 00025 09988 plusmn 0017
A4 ([ ]=5 mgmL) 00125 10150 plusmn 0036
A5 ([ ]=10 mgmL) 00250 10590 plusmn 0047
A6 ([ ]=5 mgmL) 00250 08183 plusmn 0030
A7 ([ ]=5 mgmL) 00125 10280 plusmn 0052
A8 ([ ]=5 mgmL) 00125 09758 plusmn 0036
52 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan
Para corroborar o ensaio anterior de citotoxicidade utilizou -se o teste de viabilidade
celular pela teacutecnica da exclusatildeo do azul de tripan com a finalidade de determinar a
viabilidade das ceacutelulas Os procedimentos adotados no ensaio seguiram o manual do
equipamento contador automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL Automated Cell Counter) entatildeo
foi acrescentado agrave 10 microL da suspensatildeo celular 10 microL de azul de tripan (04) Apoacutes
homogeneizaccedilatildeo 10 microL da suspensatildeo foi colocada no local indicado da lacircmina proacutepria para
leitura e foi realizada a contagem sendo consideradas mortas (inviaacuteveis) as ceacutelulas que
incorporavam o corante e viaacuteveis as que excluiacuteam o azul de tripan
29
O equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
(A)
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan A avaliaccedilatildeo da
viabilidade celular foi realizada atraveacutes de um contador automaacutetico de ceacutelulas Este
equipamento possibilita explorar ferramentas de fotografia e avaliar alguns paracircmetros
importantes (A) fotografia das ceacutelulas (B) Zoom na fotografia das ceacutelulas com marcaccedilotildees
(em verde para ceacutelulas vivas e vermelho para mortas) e (D) contagem das ceacutelulas totais
ceacutelulas vivas e mortas graacutefico e meacutedia dos diacircmetros celulares das ceacutelulas vivas e mortas
(B)
(C)
30
O crescimento celular de ceacutelulas natildeo tratadas foi avaliado nos tempos de 0h (momento
da confecccedilatildeo da placa) 24h (momento de tratamento com os compostos) e 96 horas
(Momento em que todas as ceacutelulas foram tripsinizadas e contadas) para avaliar o perfil do
crescimento celular em ceacutelulas natildeo tratadas Foi observado um crescimento celular no periacuteodo
de 24 horas onde as ceacutelulas estavam incubadas com meio acrescido de 10 SFB Em 24
horas o meio foi trocado por 1 SFB e acrescido das substacircncias testes nas menores diluiccedilotildees
natildeo citotoacutexicas determinadas pelo ensaio do MTT Em 96 horas pode ser observado um
decaimento no nuacutemero de ceacutelulas vivas provavelmente devido ao crescimento celular (morte
por confluecircncia)
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas)
(A) (B)
31
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas (A)
Contagem de ceacutelulas vivas (B) Percentual de ceacutelulas viaacuteveis (Viabilidade celular ) e (C)
Meacutedia do diacircmetro apresentado pelas ceacutelulas vivas
Em 96 horas as ceacutelulas natildeo tratadas bem como as ceacutelulas tratadas por 72 horas com as
concentraccedilotildees de uso dos compostos foram tripsinizadas e avaliadas quanto ao nuacutemero de
ceacutelulas vivas viabilidade e diacircmetro celular apresentados na figura 10
Segundo se observa natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo aparente que possa demonstrar que
as concentraccedilotildees de uso dos compostos tenham causado alguma atividade citotoacutexica
corroborando assim os ensaios de citotoxicidade anteriores
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
A infectividade de um viacuterus depende de vaacuterios fatores entre eles da proporccedilatildeo de
partiacuteculas virais completas ou infecciosas da suscetibilidade da ceacutelula hospedeira e da
chance desta partiacutecula encontrar o receptor e penetrar na ceacutelula Quando ceacutelulas suscetiacuteveis
satildeo misturadas com uma suspensatildeo de viacuterus estas podem receber uma duas trecircs ou dez
partiacuteculas virais ou nenhuma Isto depende da proporccedilatildeo entre a quantidade de viacuterus
infecciosos presente no inoculo e a quantidade de ceacutelulas utilizada Esta relaccedilatildeo eacute denominada
de multiplicidade de infecccedilatildeo ou MOI Uma MOI=1 indica que a infecccedilatildeo foi feita em
principio com 1 viacuterus ou 1 dose infectante por ceacutelula
A determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo dos Dengue virus 1 e 2 a serem
utilizadas nos proacuteximos ensaios foi feita a partir da infecccedilatildeo de ceacutelulas BHK-21 por diferentes
(C)
32
concentraccedilotildees de viacuterus e revelaccedilatildeo com cristal violeta Escolheu-se a maior diluiccedilatildeo viral que
possibilitou a letalidade total das ceacutelulas (faixa onde todas as ceacutelulas estatildeo mortas utilizando
menor concentraccedilatildeo de viacuterus) As faixas escolhidas foram entatildeo calculadas levando-se em
consideraccedilatildeo o nuacutemero de ceacutelulas presentes no poccedilo e o nuacutemero de partiacuteculas virais que foram
adicionadas (Faixa3 para DENV2 e 2 para DENV1) Figura 11 Foi estipulado portanto a
Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 2 para DENV 2 e 5 para DENV 1
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI A partir da infecccedilatildeo da linhagem celular BHK-21 em
placa de 96 poccedilos com diferentes diluiccedilotildees de DENV foi determinado que a Multiplicidade
de infecccedilatildeo para o Dengue viacuterus sorotipos 1 e 2 seria de 5 e 2 respectivamente (colunas 2 -
DENV1 e 3 - DENV2)
54 Ensaio dose resposta
Apoacutes a determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas ideais realizou-se um
ensaio dose resposta tratando as ceacutelulas com oito concentraccedilotildees agrave partir das concentraccedilotildees natildeo
citotoacutexicas escolhidas para cada composto e em seguida infectando com DENV sorotipos 1 e
2 nas MOIs estipuladas anteriormente (5 e 2 respectivamente) A porcentagem do efeito
protetor conferida agraves ceacutelulas para cada concentraccedilatildeo de amostra testada foi calculada da
seguinte forma
33
EP = [ (A ndash B) (C ndash B) ] x 100
Onde
A Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas tratadas e infectadas
B Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e infectadas
C Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e natildeo infectadas
Este ensaio tem por objetivo identificar a resposta celular agrave infecccedilatildeo frente ao
tratamento com os compostos em diferentes concentraccedilotildees Assim como o ensaio de
toxicidade este ensaio feito utilizando a teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT permite o teste de vaacuterias
concentraccedilotildees diferentes em um menor tempo e com baixo gasto de material
34
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV1
(MOI=5)
35
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV2
(MOI=2)
36
Takegami et al (1998) demonstraram atividade de furanonaftoquinonas contra o viacuterus
da Encefalite Japonesa (Flavivirus) utilizando a concentraccedilatildeo de 3microgmL poreacutem para os
compostos apresentados avaliados pela teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT nenhuma das
concentraccedilotildees apresentadas produziu efeito antiviral significativo em relaccedilatildeo ao controle
celular como observado nas figuras 12 e 13
Apesar da teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT ser interessante como triagem de atividade
antiviral permitindo o teste de vaacuterias concentraccedilotildees dos compostos em menor tempo e
utilizando uma quantidade razoaacutevel de materiais optou-se por utilizar as maiores
concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas encontradas avaliando sua atividade antiviral por outras
teacutecnicas Como natildeo foi avaliada atividade antiviral preacutevia para nenhum dos compostos frente
agrave infecccedilatildeo por DENV1 e 2 foi selecionado o Dengue virus 1 para dar prosseguimento aos
ensaios
55 Ensaio Virucida
O ensaio virucida foi realizado para avaliar um potencial efeito dos compostos
diretamente sobre a partiacutecula viral Este ensaio eacute importante pois possibilita elucidar se o
composto pode produzir algum efeito sobre a partiacutecula viral impedindo que esta possa infectar
as ceacutelulas
Figura 14 Ensaio virucida Neste ensaio as aliacutequotas de DENV1 foram incubadas com as
concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos e titulados (NT) Controle natildeo tratado
37
Tabela 3 Ensaio virucida Caacutelculo do tiacutetulo viral (UFPmL) e porcentagem representante de
cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 254 x 105 100
DMSO 263 x 105 10335
A1 199 x 105 7835
A2 205 x 105 8071
A3 237 x 105 9311
A4 775 x 104 3049
A5 153 x 105 6024
A6 219 x 105 8602
A7 243 x 105 9547
A8 254 x 105 100
Lagrota et al (1988) demonstraram atividade de 2-HO-3-N-benzil-N(N-benzil-2-
etilamina) -14-naftoquinona sobre a partiacutecula viral de enterovirus De forma contraacuteria apesar
de se verificar a reduccedilatildeo de quase uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais
para o composto A4 natildeo considerou-se esta uma alteraccedilatildeo significativa pois devido agrave
magnitude do nuacutemero de UFPs se trata de uma alteraccedilatildeo muito pequena Portanto os
compostos avaliados neste trabalho natildeo produziram atividade virucida aparente frente ao
tratamento com as concentraccedilotildees de uso
56 Ensaio Antiviral
O sobrenadante de ceacutelulas tratadas previamente e infectadas por DENV1 coletado 48
horas poacutes infecccedilatildeo foi avaliado quanto agrave produccedilatildeo viral de partiacuteculas infecciosas pela
contagem de placas de lise e caacutelculo de Unidades Formadoras de Placa (Titulaccedilatildeo viral em
placa ndash UFPmL)
38
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral Sobrenadante de ceacutelulas tratadas e infectadas por DENV1
coletado apoacutes 48 horas e titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado
Tabela 4 Ensaio Antiviral Coleta do sobrenadante de ceacutelulas infectadas por DENV1 Tiacutetulo
viral (UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o
controle natildeo tratado como 100
Ao perceber um aumento no tiacutetulo viral frente ao tratamento com os compostos A1
A2 e A3 e uma reduccedilatildeo frente ao tratamento com A4 A5 e A6 foram escolhidos dois
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 119 x 105 10000
A1 235 x 105 19748
A2 228 x 105 19160
A3 318 x 105 26723
A4 128 x 104 1076
A5 186 x 103 156
A6 190 x 104 1597
A7 280 x 104 2353
A8 350 x 104 2941
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
40
Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
II
UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
INSTITUTO DE CIEcircNCIAS EXATAS E BIOLOacuteGICAS
DEPARTAMENTO DE CIEcircNCIAS BIOLOacuteGICAS
PROGRAMA DE POacuteS-GRADUACcedilAtildeO EM BIOTECNOLOGIA
ANAacuteLISE DA ATIVIDADE ANTIVIRAL DE COMPOSTOS DERIVADOS
DE NAFTOQUINONAS NATURAIS E SINTEacuteTICAS SOBRE A
REPLICACcedilAtildeO DE Dengue virus EM MODELO IN VITRO
Dissertaccedilatildeo submetida ao programa de Poacutes-
Graduaccedilatildeo do Nuacutecleo de Pesquisas em Ciecircncias
Bioloacutegicas da Universidade Federal de Ouro
Preto como parte integrante dos requisitos para
obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Mestre em Biotecnologia
aacuterea de concentraccedilatildeo Biotecnologia aplicada agrave
sauacutede humana e animal
Orientador Prof Dr Breno de Mello Silva
Co-orientador Prof Dr Geraldo Ceacutelio Brandatildeo
Ouro Preto MG
Abril de 2016
III
IV
V
LABORATOacuteRIO AUXIacuteLIO
Este trabalho foi realizado no Laboratoacuterio de Biologia e Tecnologia de Micro-organismos ndash
ICEBNUPEBUFOP com auxiacutelio da Coordenadoria de Aperfeiccediloamento de Pessoal de
Niacutevel Superior (CAPES) e Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP)
VI
EPIacuteGRAFE
ldquoA persistecircncia eacute o menor caminho do ecircxitordquo (Charles Chaplin)
ldquoO Senhor eacute meu Pastor e nada me faltaraacute () Ainda que eu andasse pelo
vale da sombra da morte natildeo temeria mal algum porque tu estaacutes comigo
a tua vara e o teu cajado me consolam () Certamente que a bondade e a
misericoacuterdia me seguiratildeo todos os dias da minha vida e habitarei na casa
do Senhor por longos diasrdquo (Salmos 23)
VII
AGRADECIMENTOS
Agradeccedilo primeiramente agrave Deus por ser o meu sustento e proteccedilatildeo
Aos meus pais Antocircnio e Sandra pelas oraccedilotildees esforccedilo carinho e dedicaccedilatildeo
E ao meu irmatildeo Joatildeo Paulo e minha Cunhada Naacutedia pelo apoio e torcida
Ao Prof Dr Breno de Mello Silva e Prof Dr Geraldo Ceacutelio Brandatildeo pela oportunidade e
orientaccedilatildeo durante o desenvolvimento do mestrado
Agrave toda equipe do LBTM em especial a Ana Claudia Cyntia e Erica pelo companheirismo
ajuda e incentivo
Aos meus amigos que fizeram parte de toda esta trajetoacuteria
Aos laboratoacuterios do NUPEB pela permissatildeo e ajuda no uso de diversos equipamentos
Agrave Universidade Federal de Ouro Preto por todas as oportunidades oferecidas
Agrave CAPES pelo apoio financeiro
Agrave todos aqueles que de alguma forma auxiliaram para o desenvolvimento e conclusatildeo deste
trabalho
VIII
RESUMO
O Dengue virus (DENV) possui quatro sorotipos diferentes (1-4) que satildeo principalmente
transmitidos pelo mosquito Aedes aegypti A infecccedilatildeo resulta na patogecircnese da dengue que eacute
uma epidemia de proporccedilotildees globais Apesar dos esforccedilos ainda natildeo existe uma vacina eficaz
contra os quatro sorotipos bem como drogas eficientes no tratamento de pacientes Portanto
vaacuterios estudos tem sido conduzidos na busca de faacutermacos com atividade antiviral contra o
DENV e outros Flavivirus Dentre os compostos estudados para este fim estatildeo as
naftoquinonas metaboacutelitos secundaacuterios produzidos por algas fungos plantas e animais Estes
compostos podem ser extraiacutedos principalmente a partir de plantas do gecircnero Tabebuia
(famiacutelia Bignoniaceae) satildeo caracterizados por apresentar atividade antiviral destacando-se a
szlig-lapachona potente inibidor da enzima transcriptase reversa dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria
(AMV) e leucemia murina de Rauscher (RLV) O objetivo deste trabalho foi testar oito
diferentes compostos derivados de naftoquinonas sinteacuteticas e naturais com potencial atividade
antiviral contra DENV Para isso uma triagem foi realizada por reduccedilatildeo de MTT (brometo de
3- (45-dimetiltiazol-2-il) -25-brometo difenil tetrazolina) para avaliar a atividade citotoacutexica
de oito compostos na linhagem celular BHK-21 resultando no caacutelculo da concentraccedilatildeo
citotoacutexica 50 (CC50) e as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas a serem utilizada em testes
subsequentes para os compostos A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 e A8 (lapachol β-lapachona 2-
Hidroxi-3-(ββ-dimetilvinil)-14-naftoquinona 2-Cloro-14-naftoquinona e 4 derivados de
lapachol) Em seguida ceacutelulas BHK-21 foram incubadas com os compostos em concentraccedilotildees
natildeo citotoacutexicas em diferentes diluiccedilotildees e infectadas com os sorotipos 1 e 2 DENV na
multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 5 e 2 para os sorotipos 1 e 2 respectivamente A
atividade antiviral foi testada atraveacutes da anaacutelise de reduccedilatildeo de MTT e pela titulaccedilatildeo de virus
liberados no sobrenadante Apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute
uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes
faacutermacos natildeo demonstraram atividade antiviral nas condiccedilotildees experimentais testadas
IX
ABSTRACT
The Dengue virus (DENV) has four different serotypes (1-4) that are primarily transmitted by
the mosquito Aedes aegypti Infection results in the pathogenesis of dengue which is an
epidemic of global proportions Despite these efforts there is still no effective vaccine against
the four serotypes as well as efficient drugs in the treatment of patients Therefore various
studies have been conducted in the search for drugs with antiviral activity against DENV and
other flaviviruses Among the studied compounds for this purpose are the naphthoquinones
secondary metabolites produced by algae fungi plants and animals These compounds can be
mainly extracted from plants of the genus Tabebuia (Bignoniaceae) are characterized by
having antiviral activity especially the szlig-lapachone potent inhibitor of the enzyme reverse
transcriptase of avian myeloblastosis virus (AMV) and murine leukemia Rauscher (RLV)
The aim of this study was to test eight different compounds derived from synthetic and
natural naphthoquinones with potential antiviral activity against DENV For this a screening
was performed by reduction of MTT (3- (45-dimethylthiazol-2-yl) -25-diphenyl bromide
tetrazolina) to assess the cytotoxic activity of the compounds eight BHK-21 cell line resulting
in the calculation of the cytotoxic concentration 50 (CC50) and non-cytotoxic
concentrations to be used in subsequent tests for compounds A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 and
A8 (lapachol β-lapachone 2-hydroxy -3- (β β-dimethylvinyl) -14-naphthoquinone 2-
chloro-14-naphthoquinone and derivatives lapachol 4) Then BHK-21 cells were incubated
with compounds at non-cytotoxic concentrations in different dilutions and infected with
serotypes 1 and 2 DENV at multiplicity of infection (MOI) of 5 and 2 for serotypes 1 and 2
respectively The antiviral activity was assayed by MTT reduction assay and the virus titer
released into the supernatant Although some compounds have shown reduced to one log unit
in the number of viral particles results indicate that these drugs did not show antiviral activity
in experimental conditions
X
SUMAacuteRIO
RESUMO VIII
ABSTRACT IX
LISTA DE FIGURAS XII
LISTA DE TABELAS XIII
1 INTRODUCcedilAtildeO 2
11 Flavivirus 2
12 Dengue virus 3
13 Epidemiologia 6
14 Naftoquinonas 8
3 OBJETIVOS 16
31 Objetivo Geral 16
32 Objetivos especiacuteficos 16
4 MATERIAL E MEacuteTODOS 18
41 Linhagens celulares 18
411 Ceacutelulas C636 18
412 Ceacutelulas BHK-21 18
42 Viacuterus 18
421 DENV 1 e DENV 2 18
422 Titulaccedilatildeo viral 19
43 Compostos de naftoquinonas 19
44 Ensaio de citotoxicidade 20
45 Avaliaccedilatildeo da viabilidade e crescimento celular por exclusatildeo de azul de tripan 21
46 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) 21
47 Ensaio Dose-resposta 22
48 Ensaio Virucida 23
49 Ensaio antiviral 23
410 Anaacutelise estatiacutestica 24
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO 26
51 Ensaio de citotoxicidade celular 26
52 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan 28
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) 31
54 Ensaio dose resposta 32
XI
55 Ensaio Virucida 36
56 Ensaio Antiviral 37
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao tratamento com
os compostos A1 A3 A4 e A5 40
6 CONCLUSAtildeO 44
7 PERSPECTIVAS 46
8 REFEREcircNCIAS 48
XII
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Estrutura da partiacutecula viral de Dengue viacuterus 4
Figura 2 Ciclo de multiplicaccedilatildeo de DENV 5
Figura 3 Distribuiccedilatildeo geograacutefica da Dengue 7
Figura 4 Estrutura quiacutemica da 12-naftoquinona (1) e 14-naftoquinona (2) 9
Figura 5 Estrutura quiacutemica do Lapachol (1) da α- Lapachona (2) e da β-Lapachona 10
Figura 6 Tabebuia avellanedae 11
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (Exemplo da curva dose resposta do composto A7) 28
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan 29
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas) 30
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas 31
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI 32
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 34
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 35
Figura 14 Ensaio virucida 36
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral 38
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados 39
Figura 17 Curva de crescimento celular 41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular 41
XIII
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Relaccedilatildeo de nome estrutura e coacutedigo dos compostos utilizados 20
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo da
concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) 28
Tabela 3 Ensaio virucida 37
Tabela 4 Ensaio Antiviral 38
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados 39
XIV
LISTA DE ABREVIATURAS
AMV ndash Mielobastose Aviaacuteria viacuterus (Avian Myeloblastosis virus )
CC50 ndash Concentraccedilatildeo Citotoacutexica 50
DENV ndash Dengue virus
DMEM ndash Meio baacutesico modificado por Dulbecco (Dulbeccos Modified Eagle Medium)
DMSO ndash Dimetilsulfoacutexido
ICTV ndash Comitecirc Inernacional de Taxonomia Viral
JEV ndash Viacuterus da Encefalite Japonesa (Japanese Encephalitis virus)
MOI ndash Multiplicidade de infecccedilatildeo viral
NS ndash Proteiacutenas natildeo estruturais
NT ndash Natildeo Tratado
OMS ndash Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede
RE ndash Retiacuteculo endoplasmaacutetico
RLV ndash Viacuterus da Leucemia Murina de Rauscher (Murine leukemia virus)
SFB ndash Soro Fetal Bovino
UFP ndash Unidades formadoras de placas
WNV ndash Viacuterus do Nilo Ocidental (West Nile virus)
YFV ndash Viacuterus da febre amarela (Yellow fever virus)
ZV ndash Zika virus
1
I INTRODUCcedilAtildeO
2
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Flavivirus
O Gecircnero Flavivirus pertencente agrave famiacutelia Flaviviridae inclui 53 espeacutecies
taxonomicamente reconhecidas (ICTV 2016) muitas das quais satildeo importantes patoacutegenos
humanos tais como o Dengue virus (DENV) Yellow fever virus (YFV - viacuterus da febre
amarela ndash protoacutetipo deste gecircnero) Japanese encephalitis virus (JEV - viacuterus da encefalite
japonesa) West Nile virus (WNV - virus do Nilo Ocidental) Zika virus (ZV) entre outros
(Villordo 2016) O nome flavivirus eacute derivado da palavra latina flavus que significa amarelo
significando a icteriacutecia causada pelo YFV Os sintomas da infecccedilatildeo por flavivirus pode variar
de leve febre e mal-estar a encefalite fatal e febre hemorraacutegica (Mukhopadhyay 2005)
Estes viacuterus regulam o metabolismo e a sobrevivecircncia das ceacutelulas infectadas
assegurando a sua proacutepria reproduccedilatildeo e propagaccedilatildeo O viacuterus da dengue tambeacutem provoca a
autofagia uma resposta homeostaacutetica geral que ajuda a ceacutelula infectada sobreviver e produzir
viacuterus (Datan 2016)
Os Flavivirus podem ser agrupados em complexos e sub-complexos antigecircnicos
baseados em criteacuterios soroloacutegicos ou em grupos clados e espeacutecies segundo a sua filogenia
molecular (Lindenbach 2007) A maioria dos membros deste gecircnero satildeo arbovirus (arthropod
borne virus) ou seja satildeo essencialmente transmitidos por Artroacutepodes (Mackenzie 2004)
onde 27 satildeo transmitidos por mosquitos 12 por carrapatos e 14 natildeo possuem vetor
conhecido Os viacuterus transmitidos pela fecircmea do gecircnero Aedes incluem DENV e YFV satildeo
viscerotroacutepicos e possuem primatas como reservatoacuterio natural (Gaunt 2001)
A patogenia da Dengue causada pelo DENV constitui uma das doenccedilas virais mais
importantes em seres humanos transmitidos por insetos e eacute responsaacutevel por cerca de 390
milhotildees de infecccedilotildees por ano O YFV por sua vez causador da febre amarela eacute endecircmico em
vaacuterios paiacuteses do continente Africano e da Ameacuterica do Sul resultando em 200000 casos e
30000 mortes na Aacutefrica mesmo com vacinas eficazes disponiacuteveis Outras doenccedilas causadas
por flaviviacuterus incluem a encefalite do Nilo Ocidental (West Nile virus) e febre Zika (Zika
virus) que satildeo consideradas doenccedilas emergentes com surtos importantes em todo o mundo
(Villordo 2016)
3
12 Dengue virus
Os DENV pertencem ao gecircnero flaviviacuterus e evoluiram em primatas natildeo-humanos a
partir de um ancestral comum Eacute composto por quatro sorotipos antigenicamente distintos
(DENV1-4) que co-circulam por todo o Sudeste da Aacutesia Aacutefrica e Ameacutericas (McArthur 2013)
e em outubro de 2013 foi anunciado um novo sorotipo circulante denominado entatildeo de DENV
5 (Normile 2013) A partiacutecula infecciosa eacute esfeacuterica com 40-50 nm de diacircmetro possuindo
um envelope de lipopolissacariacutedeo O genoma consiste em RNA de fita simples natildeo
segmentado e senso positivo de aproximadamente 11 kb de comprimento e possui uma uacutenica
janela aberta de leitura (start codon) (Guzman 2010) Apoacutes a traduccedilatildeo a uacutenica poliproteiacutena
formada eacute clivada por proteases virais e celulares em trecircs proteiacutenas estruturais que compotildeem
a partiacutecula viral C (capsideo) prM M (membrana e o seu precursor) e E (envelope) e sete
proteiacutenas natildeo estruturais essenciais para a replicaccedilatildeo viral (NS) (NS1 NS2a NS2b NS3
NS4a NS4b e NS5) (Robertson 2009)
A transmissatildeo do viacuterus ocorre atraveacutes da picada por fecircmeas infectadas de mosquitos
do gecircnero Aedes sendo responsaacutevel pelas maiores taxas de doenccedila e mortalidade entre os
membros do gecircnero Flavivirus (Mukhopadhyay 2005) No Brasil o Aedes aegypti eacute o
principal vetor de dengue enquanto o Aedes albopictus atua como um vector secundaacuterio
(Weaver 2010)
O diagnoacutestico soroloacutegico da Dengue se baseia na detecccedilatildeo de niacuteveis elevados de
anticorpos anti-Dengue-IgM ou anti-Dengue-IgG que reconhecem e se ligam ao antiacutegeno de
DENV A Glicoproteiacutena do envelope (E) uma proteiacutena estrutural de DENV eacute o alvo
antigecircnico mais importante destes anticorpos neutralizantes porque estaacute exposta na superfiacutecie
do viacuterus e medeia os receptores de ligaccedilatildeo e fusatildeo da ceacutelula hospedeira (Lee 2015)
Durante a infecccedilatildeo celular os virions de DENV se ligam agrave superfiacutecie da membrana
atraveacutes da glicoproteiacutena do envelope (E) a receptores especiacuteficos e satildeo internalizados por
endocitose Uma vez dentro do endossoma a acidificaccedilatildeo provocada pela ligaccedilatildeo de
lisossomos desencadeia uma trimerizaccedilatildeo irreversiacutevel da proteiacutena E que atua na fusatildeo das
membranas virais e endossomais celulares Apoacutes essa fusatildeo o nucleocapsideo eacute liberado no
citoplasma onde o mesmo eacute desnudado e a replicaccedilatildeo do genoma de RNA e montagem de
partiacuteculas eacute iniciada As partiacuteculas virais imaturas satildeo acumuladas no luacutemen do retiacuteculo
endoplasmaacutetico (RE) Essas partiacuteculas imaturas que contecircm proteiacutenas prM proteiacutena E
membrana lipiacutedica e nuacutecleo capsiacutedeo natildeo pode induzir a fusatildeo da ceacutelula hospedeira ou seja
4
neste estaacutegio elas natildeo satildeo infecciosas (Mukhopadhyay 2005) O processo de maturaccedilatildeo
desses viacuterus ocorre apoacutes a clivagem proteoliacutetica da proteiacutena precursora de membrana (prM)
transformando viacuterus inerte em partiacuteculas infecciosas (Li 2008) Partiacuteculas subvirais satildeo
tambeacutem produzidas no RE mas apenas contecircm as glicoproteiacutenas de membrana fazendo com
que estas partiacuteculas sejam natildeo infecciosas Os viacuterus maduros e as partiacuteculas sub-virais satildeo
liberados da ceacutelula hospedeira por exocitose (Mukhopadhyay 2005)
Na pele o DENV tende a infectar ceacutelulas dendriacuteticas imaturas Estas ceacutelulas infectadas
amadurecem e migram para os gacircnglios linfaacuteticos regionais ou locais onde apresentam
antiacutegenos virais agraves ceacutelulas T iniciando as respostas imunes Existe tambeacutem evidecircncia de
replicaccedilatildeo abundante de DENV em ceacutelulas do parecircnquima do fiacutegado e em macroacutefagos nos
gacircnglios linfaacuteticos fiacutegado e baccedilo bem como em monoacutecitos de sangue perifeacuterico (Guzman
2010)
Proteiacutena E
(diacutemero)
Proteiacutena
M
Proteiacutena C
ssRNA (+)
Figura 1 Estrutura da partiacutecula viral de Dengue viacuterus A partiacutecula viral eacute composta
por trecircs proteiacutenas estruturais proteiacutena de envelope (E) disposta em diacutemeros a proteiacutena
associada agrave membrana (M) e a proteiacutena do nucleocapsiacutedeo (C) O genoma de RNA fita-
simples de polaridade positiva se encontra dentro do nucleocapsiacutedeo (Adaptado de
httpviralzoneexpasyorgviralzoneall_by_species24html)
5
Figura 2 Ciclo de multiplicaccedilatildeo de DENV A Os viacuterus se ligam aos receptores na superfiacutecie da
ceacutelula e satildeo endocitados B Devido ao baixo pH dentro dos endossomas ocorre a fusatildeo de
membranas viral-celular mediada por proteiacutenas virais resultando na liberaccedilatildeo do RNA viral em um
processo chamado de desnudamento C O genoma viral eacute traduzido em uma uacutenica poliproteiacutena que
eacute processada por proteases do viacuterus e da ceacutelula hospedeira D O RNA eacute replicado por proteiacutenas
natildeo-estruturais do proacuteprio viacuterus E A montagem do viacuterus ocorre na membrana do Reticulo
endoplasmaacutetico no qual a proteiacutena do capsiacutedeo e o RNA viral satildeo envolvidos por glicoproteiacutenas e
pela membrana da organela para formar partiacuteculas virais imaturas F Partiacuteculas virais imaturas
utilizam a via secretora da ceacutelula hospedeira e sob o baixo pH do Complexo de Golgi a proteiacutena
precursora prM eacute clivada em proteiacutena M completando a maturaccedilatildeo do viacuterus GOs viacuterus maduros
satildeo entatildeo liberados das ceacutelulas por exocitose Os nuacutemeros indicados nas caixas coloridas referem-se
ao valor de pH dos respectivos compartimentos Imagem adaptada de PERERA 2009
Adsorccedilatildeo
Siacutentese e processamento
Fusatildeo e
Desnudamento
Replicaccedilatildeo do RNA
Montagem
Maturaccedilatildeo
Liberaccedilatildeo de
viacuterus
maduro
A
B
C
D
E
F
G
6
13 Epidemiologia
Ao longo das uacuteltimas deacutecadas a dengue se tornou a doenccedila viral transmitida por
mosquitos mais prevalente no mundo Estimativas de infecccedilatildeo pela OMS indicam que a
patologia eacute endecircmica em mais de 100 paiacuteses em todos os continentes exceto a Antaacutertida e
aflige principalmente paiacuteses pobres em recursos nas regiotildees tropicais e subtropicais (Perry
2011) Epidemias globais de DENV ocorreram ao longo das uacuteltimas deacutecadas em parte devido
agrave diminuiccedilatildeo dos esforccedilos no controle de mosquitos Satildeo estimados mais de 50 milhotildees de
casos de dengue anualmente (Mukhopadhyay 2005)
A Dengue eacute uma doenccedila viral sistecircmica aguda que se estabeleceu em todo o mundo
em ambos os ciclos de transmissatildeo endecircmicas e epidecircmicas A infecccedilatildeo pelo DENV em seres
humanos eacute frequentemente inaparente mas pode levar a uma grande variedade de
manifestaccedilotildees cliacutenicas de febre leve a siacutendrome do choque da dengue potencialmente fatal A
imunidade vitaliacutecia desenvolvida apoacutes a infecccedilatildeo com um dos quatro tipos de viacuterus eacute
especiacutefica para cada tipo e a progressatildeo para uma doenccedila mais grave eacute frequente mas natildeo
exclusivamente relacionada com infecccedilatildeo secundaacuteria por tipos heteroacutelogos No entanto
enquanto a expansatildeo histoacuterica desta doenccedila eacute bem documentada o elevado fardo de
problemas de sauacutede atribuiacuteveis agrave dengue em grande parte do mundo tropical e sub-tropical
permanecem pouco enumerados (Bhatt 2013)
O Brasil eacute um paiacutes de grande extensatildeo (8512000 km2) situado em uma zona
predominantemente tropical com extensas aacutereas de florestas na regiatildeo amazocircnica bem como
restos de uma floresta tropical na costa leste sudeste e sul entre outros ecossistemas A maior
parte do paiacutes tem um clima tropical e uma grande diversidade de plantas e animais portanto
um local adequado para a ocorrecircncia de patologias causadas por viacuterus transmitidos por
artroacutepodes (Figueiredo 2000) Segundo o boletim epidemioloacutegico do ministeacuterio da sauacutede em
2016 jaacute foram registrados 170103 casos provaacuteveis de dengue no paiacutes ateacute a semana
epidemioloacutegica 5 Nesse periacuteodo a regiatildeo Sudeste registrou o maior nuacutemero de casos
provaacuteveis (96664 casos 568) Em Minas Gerais jaacute foram registradas 19 mortes em
decorrecircncia da Dengue entre 1deg de janeiro e 14 de marccedilo deste ano Outros 91 oacutebitos estatildeo
sob investigaccedilatildeo (BRASIL 2016)
7
Figura 3 Distribuiccedilatildeo geograacutefica da Dengue Aacutereas de risco de transmissatildeo em amarelo
(Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede Adaptado de httpwwwwhointen)
As manifestaccedilotildees da doenccedila foram descritas pela primeira vez apoacutes a Segunda Guerra
Mundial coincidente com o aumento da urbanizaccedilatildeo particularmente na Aacutesia (Weaver 2010)
Atualmente o DENV eacute hiperendecircmico em muitas regiotildees tropicais onde 2 ou mais sorotipos
circulam endemicamente Embora DENV foi provavelmente introduzido periodicamente para
as Ameacutericas atraveacutes de navios desde o seacuteculo 17 o surgimento de DENV no Hemisfeacuterio
Ocidental comeccedilou mais tarde devido a uma campanha de sucesso parcial para erradicar o
vetor A aegypti para controlar a febre amarela Esta campanha teve sucesso na maior parte
das Ameacutericas da deacutecada de 1950 agrave deacutecada de 1970 mas foi interrompida O vetor entatildeo
rapidamente recolonizou quase toda a regiatildeo neotropical e subtropicais e a invasatildeo do DENV
seguiu logo depois Em 1985 A albopictus foi introduzido nos EUA e no Brasil
proporcionando um vetor para a transmissatildeo secundaacuteria de DENV nas Ameacutericas (Hawley
1987)
Os mosquitos vetores principalmente A aegypti tornam-se infectados quando eles se
alimentam do sangue de seres humanos durante o periacuteodo de cinco dias da viremia A
infecccedilatildeo produz um amplo espectro da doenccedila cliacutenica e varia de assintomaacutetica a doenccedila febril
auto-limitante A dengue tambeacutem conhecida como ldquofebre osso quebradordquo devido agraves fortes
dores nas articulaccedilotildees e inclui sintomas de febre alta dores musculares articulares e erupccedilatildeo
cutacircnea Uma pequena porcentagem de indiviacuteduos pode apresentar a siacutendrome do choque da
8
dengue (dengue hemorraacutegica) com risco de vida grave O tratamento eacute amplamente favoraacutevel
usando de reidrataccedilatildeo oral ou intravenosa acompanhamento e atenccedilatildeo meacutedica adequada No
entanto uma das principais consequecircncias da doenccedila eacute a sua capacidade de sobrecarregar
instalaccedilotildees meacutedicas durante um surto e em paiacuteses onde os recursos de sauacutede jaacute estatildeo no
limite isso pode ter efeitos catastroacuteficos Prevenccedilatildeo e tratamento portanto se fazem
altamente necessaacuterios (Perry 2011)
A prevalecircncia global de DENV cresceu drasticamente nas uacuteltimas deacutecadas e ateacute o
momento natildeo haacute nenhum medicamento especiacutefico para combater a infecccedilatildeo as medidas de
prevenccedilatildeo mais eficazes satildeo voltadas para o controle do vetor (Silva 2011) Diante disso a
Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) elegeu o desenvolvimento de vacinas contra o viacuterus da
dengue como prioridade mundial (Kinney 2001) Por conseguinte a busca de substacircncias
naturais ou sinteacuteticas com atividade antiviral especiacutefica sem toxicidade para as ceacutelulas
normais em seres humanos eacute uma estrateacutegia desejada para evitar que a dengue se agrave e
ajudar a controlar a difusatildeo da doenccedila As vaacuterias fases do ciclo viral representam alvos
terapecircuticos individuais que podem ser exploradas (Costa 2013) Nesse sentido vaacuterios
grupos de pesquisa e organizaccedilotildees estatildeo trabalhando com diversas abordagens para o
desenvolvimento de compostos antivirais com atividade protetora contra dengue Dentre elas
uma vasta gama de produtos naturais incluindo plantas numa tentativa de isolar e
caracterizar novos compostos que podem inibir a replicaccedilatildeo do viacuterus ou tratar a infecccedilatildeo
viral Por essa razatildeo extratos e componentes da planta satildeo cada vez mais importantes como
fontes potenciais para agentes antivirais (Silva 2011)
14 Naftoquinonas
As quinonas satildeo compostos aromaacuteticos amplamente distribuiacutedos na natureza e podem
ser encontrados em vaacuterias famiacutelias de plantas bem como isolado de fungos algas e
bacteacuterias Elas satildeo classificadas em benzoquinonas antraquinonas e naftoquinonas de acordo
com as suas estruturas quiacutemicas Naftoquinonas satildeo compostos orgacircnicos altamente reativos
utilizados como corantes naturais ou sinteacuteticos cujas cores variam de amarelo para vermelho
Apresentam cadeia carbocircnica similar ao naftaleno e satildeo caracterizadas por seus dois grupos
carbonila na posiccedilatildeo 1 e 4 por isso satildeo nomeadas de 14-naftoquinonas Os grupos carbonila
tambeacutem podem estar presente na posiccedilatildeo 12 com menor incidecircncia (Loacutepez 2014)
9
Figura 4 Estrutura quiacutemica da 12-naftoquinona (1) e 14-naftoquinona (2)
Entre as quinonas estatildeo compostos biologicamente importantes tais como o grupo da
vitamina K e a coenzima Q (ubiquinona) Estes compostos tecircm um papel importante no
metabolismo celular especialmente como carreadores de eleacutetrons Aleacutem de quinonas que
possuam uma funccedilatildeo bioloacutegica outros compostos desta classe tecircm sido encontrados
mostrando atividade antibioacutetica Alguns deles estatildeo presentes na natureza mas a maior parte
satildeo obtidos sinteticamente entre eles 2-hidroxi-3-alquil-14-naftoquinonas que possuem
evidecircncias de serem ativos in vitro contra os parasitas da malaacuteria e como coccidiostaacuteticos
(Ambrogi 1970)
A atividade bioloacutegica de quinonas estaacute muitas vezes relacionada com o seu
comportamento eletroquiacutemico A capacidade de aceitar um ou dois eleacutetrons para formar o
acircnion radical correspondente ou dianion pode ser o motivo da induccedilatildeo da formaccedilatildeo de
espeacutecies reativas de oxigecircnio responsaacuteveis pelo estresse oxidativo nas ceacutelulas A capacidade
de aceitar eleacutetrons de naftoquinonas pode ser alterada por mudanccedilas de posiccedilatildeo do grupo
carbonila (12- 14-naftoquinonas) ou diferentes substituintes ou funccedilotildees associadas agrave porccedilatildeo
de naftoquinona (Francisco 2010)
As naftoquinonas satildeo largamente encontradas em plantas micro-organismos e alguns
animais Estes compostos tecircm sido amplamente utilizados em diversas culturas como corantes
para cosmeacuteticos tecidos alimentos (Brandelli 2004) e para fins medicinais incluindo
antitumoral (Oliveira 1990 Ferreira 1996) anti-inflamatoacuterios antimalaacuterico antiviral
(Fonseca 2003 Hussain 2007) atibacterianos e antifuacutengicos (Nagata 1998) Estas atividades
bioloacutegicas tecircm justificado o grande nuacutemero de trabalhos (aproximadamente 42 ateacute abril 2016
ndash Pubmed) encontrados na literatura que visa a siacutentese e avaliaccedilatildeo de qualquer das quinonas
naturais ou seus anaacutelogos como agentes farmacoloacutegicos potenciais (Rahmoun 2013)
10
O Lapachol foi descoberto e estudado desde o seacuteculo XIX Foi isolado primeiramente
do lenho da aacutervore argentina ldquolapachordquo Tabebuia avellanedae (Bignoniaceae) conhecida
como Ipecirc roxo Os estudos quiacutemicos foram desenvolvidos inicialmente em 1892 (Fonseca
2003) O lapachol foi descrito pela primeira vez por Paterno em 1821 tendo sua estrutura
quiacutemica estabelecida em 1896 por Hooker que o identificou como uma naftoquinona Esta
naftoquinona possui accedilatildeo antiinflamatoacuteria analgeacutesica antibioacutetica e anti-neoplaacutesica
reconhecida (Arauacutejo 2002)
A β-lapachona (34-di-hidro-22-dimetil-2H-naptho [12-b] pirano-56-diona) eacute uma
quinona obtida de fontes naturais derivada da aacutervore Lapacho (Tabebuia avellanedae) nativa
da Ameacuterica do Sul e Central A siacutentese e quiacutemica da β-lapachona e compostos relacionados
foi inicialmente investigado no final do seacuteculo XIX e iniacutecio do seacuteculo XX pelo quiacutemico
Samuel Hooker Apesar de alguns estudos cliacutenicos sobre a bioatividade de naftoquinonas
terem sido relatados no iniacutecio de 1940 foi o relatoacuterio do potencial da β-lapachona como um
agente anti-tripanossoma em 1977 que revitalizou o estudo e caracterizaccedilatildeo deste composto
natural A β-lapachona tambeacutem apresenta vaacuterias accedilotildees farmacoloacutegicas incluindo accedilatildeo
formaccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (Hussain 2007)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do Lapachol (1) da α- Lapachona (2) e da β-
Lapachona (Fonseca et al 2003 Ferreira et al 2010)
11
Figura 6 Tabebuia avellanedae (Hussain 2007)
A β-lapachona eacute uma substacircncia natural facilmente obtida a partir do lapachol Esta
naftoquinona eacute o grande destaque desta classe de substacircncias porque se encontra em testes
cliacutenicos de fase II para o tratamento do cacircncer de pacircncreas (Ferreira 2010) O mecanismo de
accedilatildeo da β-lapachona diferencia-se de outros antineoplaacutesicos por atuar na topoisomerase I
promovendo a recuperaccedilatildeo da capacidade de apoptose celular Alguns estudos reportam sua
accedilatildeo sineacutergica de potenciaccedilatildeo com o Taxolreg
promovendo a inibiccedilatildeo em diferentes pontos de
replicaccedilatildeo celular aleacutem de sua combinaccedilatildeo com outros tratamentos como a aplicaccedilatildeo de
radiaccedilatildeo ionizante (Cunha 2005)
Vaacuterios estudos jaacute foram publicados demonstrando a atividade antiviral de
naftoquinonas naturais e sinteacuteticas A β-lapachona inibe seletivamente a replicaccedilatildeo do viacuterus
HIV-1 atuando na inibiccedilatildeo da enzima LTR117 Da mesma forma este composto eacute um
potente inibidor da enzima transcriptase reversa dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e
leucemia murina de Rauscher (RLV) inibindo tambeacutem a DNA polimerase A accedilatildeo inibitoacuteria
sobre estas enzimas revelou-se especiacutefica se comparada com a de outros inibidores
conhecidos (Silva 2003)
O Lapachol jaacute demonstrou atividade contra certas cepas virais incluindo Herpes virus
tipos I e II Outras naftoquinonas jaacute mostraram eficaacutecia contra cepas de Influenza virus
Poliomielite virus e estomatite vesicular Supotildee-se que o mecanismo de accedilatildeo destas quinonas
seja atraveacutes da inibiccedilatildeo da transcriptase reversa de retroviacuterus e da RNA polimerase Eacute relatado
12
que lapachol diminui a replicaccedilatildeo do viacuterus em seres humanos mas ainda natildeo existem
resultados de testes cliacutenicos disponiacuteveis (Hussain 2007)
Na avaliaccedilatildeo da atividade antiviral do Lapachol in vitro verificou-se que esta
substacircncia eacute ativa contra viacuterus RNA atuando tanto sobre viacuterus envelopados quanto sobre
partiacuteculas sem esta estrutura em concentraccedilotildees de 5 a 10 microgmL e ainda apresentou uma
pequena atividade sobre HSV (Herpes simplex I) e Ad5 (Adeno tipo 5) mas nenhuma
atividade sobre CoxB4 (Coxsackie B4) Em trabalho posterior demonstrou-se que nem o
Lapachol nem diversos dos seus derivados apresentaram atividade antiviral in vitro sobre
Poliovirus tipo 1 Ecovirus 19 e Coxsackie B tipo 4 Apenas os derivados 12-naftoquinonicos
e um intermediaacuterio da siacutentese Hoocker foram ativos contra o Echovirus 19 (Fonseca 2003)
Costa et al (2013) relataram que piranonaftoquinonas isocircmeras do lapachol possuem
atividade de inibiccedilatildeo da replicaccedilatildeo de DENV-2 atuando sobre a atividade da ATPase de NS3
(proteiacutena natildeo estrutural de DENV)
A utilizaccedilatildeo de testes in vitro por meio de ensaios de viabilidade celular constitui o
primeiro passo para a avaliaccedilatildeo da compatibilidade bioloacutegica de uma substacircncia e pode
fornecer elementos importantes para a anaacutelise da biocompatibilidade dos diferentes materiais
Para ser considerado natildeo citotoacutexico no teste de citotoxicidade in vitro um produto natildeo deve
ocasionar a morte das ceacutelulas nem afetar suas funccedilotildees celulares A prova do MTT eacute um dos
indicadores colorimeacutetricos de viabilidade celular mais utilizados sendo capaz de avaliar a
funccedilatildeo celular mitocondrial de acordo com a reduccedilatildeo enzimaacutetica do sal de tetrazoacutelio pelas
desidrogenases mitocondriais nas ceacutelulas viaacutevies (Arauacutejo et al 2008) Supotildee-se que o
mecanismo responsaacutevel pela citotoxicidade apresentada pelas quinonas esteja relacionado
com o estresse oxidativo causado por esses compostos poreacutem a capacidade de alquilaccedilatildeo de
nucleoacutefilos celulares tambeacutem representa correlaccedilatildeo com tais efeitos bioloacutegicos (Goulart
2004)
13
II JUSTIFICATIVA
14
2 JUSTIFICATIVA
Aleacutem do controle do mosquito transmissor e do desenvolvimento de vacinas que tem
sido exaustivamente estudado nos uacuteltimos anos uma alternativa para o combate agrave dengue
seria o desenvolvimento de faacutermacos para reduzir a viremia ou mesmo para controlar a
resposta imune do hospedeiro agrave infecccedilatildeo que tem sido apontada como principal fator de risco
nos casos mais graves Em funccedilatildeo disso o nuacutemero de pesquisas visando o desenvolvimento
de drogas com accedilatildeo antiviral ou com accedilatildeo imunomodulatoacuteria tem aumentado
significativamente As naftoquinonas vecircm ganhando bastante importacircncia na pesquisa de
novas drogas antivirais devido agrave algumas atividades apresentadas A szlig-lapachona-orto-
naftoquinona por exemplo se mostrou um potente inibidor da enzima transcriptase reversa
dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e leucemia murina de Rauscher (RLV)
Diante da inexistecircncia de drogas com accedilatildeo anti DENV e o elevado nuacutemero e casos da
patogenia nos uacuteltimos anos a organizaccedilatildeo mundial da sauacutede classificou a Dengue como uma
epidemia de proporccedilotildees globais e um problema de sauacutede puacuteblica Como as naftoquinonas jaacute
demonstraram na literatura possuir um potencial efeito terapecircutico contra alguns viacuterus eacute
possiacutevel que estes compostos possam apresentar atividade antiviral contra DENV Portanto
este trabalho visou atraveacutes de ensaios de MTT e titulaccedilotildees virais em placa avaliar a potencial
atividade antiviral de oito compostos derivados de naftoquinonas naturais e sinteacuteticas
15
III OBJETIVOS
16
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar oito compostos (2 naturais e 6 sinteacuteticos) derivados de naftoquinonas como potenciais
agentes antivirais em ceacutelulas BHK-21 frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1 e 2
32 Objetivos especiacuteficos
1 Calcular o iacutendice de citotoxicidade e a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) dos compostos
atraveacutes de ensaio de reduccedilatildeo de MTT
2 Avaliar os efeitos dos compostos sobre o crescimento a viabilidade e o volume celular
pela teacutecnica de exclusatildeo do azul de tripan
3 Determinar a multiplicidade de infecccedilatildeo de DENV 1 e 2 a ser utilizada nos ensaios
antivirais
4 Avaliar a atividade antiviral dos compostos frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1
e 2 atraveacutes do ensaio de MTT
5 Verificar um possiacutevel efeito direto dos compostos agraves partiacuteculas virais de Dengue virus
6 Quantificar a produccedilatildeo de partiacuteculas virais infecciosas no sobrenadante de ceacutelulas
infectadas atraveacutes de titulaccedilatildeo viral pela contagem de unidades formadoras de placas
17
IV MATERIAL E MEacuteTODOS
18
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Linhagens celulares
411 Ceacutelulas C636
As ceacutelulas C636 satildeo ceacutelulas de linhagem contiacutenua de larvas de mosquito Aedes
albopictus Estas ceacutelulas foram utilizadas na produccedilatildeo de estoque viral de DENV sorotipos 1
e 2 para isso foram mantidas em meio de cultura Leibovitz-15 (L-15) (Cultilab)
suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (Cultilab) antibioacuteticos (Penicilina 100 UmL
Streptomicina 100 microgmL) e antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL) a 28degC
412 Ceacutelulas BHK-21
As ceacutelulas BHK-21 satildeo fibroblastos de linhagem contiacutenua derivados de rim de hamster
neonato Estas ceacutelulas foram utilizadas para os experimentos in vitro e para as titulaccedilotildees de
DENV 1 e 2 para isso foram mantidas em meio miacutenimo essencial modificado por Dulbecco
ndash DMEM (Cultilab) suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (SFB) com antibioacuteticos
(Penicilina 100 UmL Streptomicina 100 microgmL) e com antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL)
sendo mantidas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5
42 Viacuterus
421 DENV 1 e DENV 2
O Sorotipo 1 do Dengue virus (DENV-1) estirpe Mochizuki foi replicado em ceacutelulas
C636 para gerar estoques de trabalho durante 2 e 5 dias a 28degC O sobrenadante da cultura de
ceacutelulas infectadas foi recolhido e clarificado por centrifugaccedilatildeo a 4000 G durante 10 minutos agrave
4degC e entatildeo foi aliquotado e armazenado a -70 deg C como reserva de viacuterus ateacute agrave sua utilizaccedilatildeo
A replicaccedilatildeo geraccedilatildeo de estoque e titulaccedilatildeo do Sorotipo 2 do Dengue virus (DENV-2)
estirpe Nova Guineacute C ocorreu nos mesmos moldes do DENV-1
19
422 Titulaccedilatildeo viral
Os estoques virais foram diluiacutedos (10-1
a 10-7
) e inoculados em monocamadas de
ceacutelulas BHK-21 implantadas em placas de 6 poccedilos com confluecircncia de aproximadamente
60 (3x105 ceacutelulas por poccedilo) sendo um poccedilo natildeo infectado mantido para controle celular
Apoacutes uma hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus foram adicionados 3 mL de meio DMEM (Cultilab)
suplementado com 15 de SFB e contendo 15 de Carboximetilcelulose (CMC Synth) As
placas foram entatildeo incubadas a 37degC (CO2 a 5) por 96 horas As ceacutelulas foram entatildeo
fixadas com 2 mL de soluccedilatildeo de formol a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo
1 (pv) de cristal violeta em PBS para contagem das placas de lise O tiacutetulo viral foi
expresso atraveacutes do nuacutemero de unidades formadoras de placa por mL (UFPmL) segundo a
formula abaixo representada
Tiacutetulo viral (UFPmL) = N x FC x 10
N = nuacutemero de placas de lise contadas
FC = Fator de correccedilatildeo
= Inverso da diluiccedilatildeo na qual foram contadas as placas de lise
43 Compostos de naftoquinonas
Os compostos utilizados neste estudo foram fornecidos pelo Dr Geraldo Ceacutelio
Brandatildeo do laboratoacuterio de pesquisa da Escola de Farmaacutecia da Universidade Federal de Ouro
Preto
20
Tabela 1 Relaccedilatildeo de nome estrutura e coacutedigo dos compostos utilizados Na tabela estatildeo
presentes a relaccedilatildeo dos nomes dos compostos utilizados neste trabalho bem como sua
estrutura Os coacutedigos representantes de cada composto seratildeo utilizados no decorrer da escrita
Nome do composto Estrutura Coacutedigo
Lapachol
A1
β-lapachona
A2
2-Hidroxi-3-(ββ-dimetilvinil)-14-naftoquinona
A3
2-Cloro-14-naftoquinona
A4
Lapachol derivado 1
A5
Lapachol derivado 2 A6
Lapachol derivado 3 A7
Lapachol derivado 4 A8
44 Ensaio de citotoxicidade
Para avaliar a citotoxicidade dos compostos ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas foram incubadas com diferentes concentraccedilotildees dos compostos em triplicata num
volume de 200 microL de meio de cultura por poccedilo na presenccedila de 1 de SFB Os controles natildeo
tratados apresentaram adiccedilatildeo de 200 microL de meio de cultura As ceacutelulas foram entatildeo incubadas
durante 72 horas O meio foi removido e 28 microL de soluccedilatildeo de 5 mg mL MTT (brometo de 3-
21
[45-dimetil-tiazol-2-il]-25 difeniltertrazoacutelio) foi adicionado a cada poccedilo As placas foram re-
incubadas durante 1 hora e 30 minutos e entatildeo 122 microL de DMSO foi adicionado a cada poccedilo e
placas foram agitadas suavemente durante 15 minutos para dissolver os cristais de formazan
A absorbacircncia foi lida em um equipamento leitor de placas Victor X3 (PerkinElmer) a 490
nm A concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC 50) foi definida como a concentraccedilatildeo da amostra que
reduziu a viabilidade celular de 50 em comparaccedilatildeo com controles natildeo tratados Os dados
foram analisados utilizando o programa Prisma
45 Avaliaccedilatildeo da viabilidade e crescimento celular por exclusatildeo de azul de tripan
Ceacutelulas BHK-21 foram cultivadas em placas de 24 poccedilos (7x104 ceacutelulaspoccedilo) e apoacutes
24 horas foram tratadas com as concentraccedilotildees de uso de cada composto e incubadas por 72
horas na presenccedila de 1 de SFB A seguir as ceacutelulas foram tripsinizadas e incubadas com
azul de tripan e entatildeo foi utilizado um contador automatizado de ceacutelulas (Countess II FL
Automated Cell Counter ndash Thermo Fisher Scientific) para contagem das ceacutelulas e avaliaccedilatildeo da
porcentagem de viabilidade e diacircmetro celular do controle nos tempos de 0 24 e 96 horas e
avaliaccedilatildeo dos mesmos paracircmetros para os compostos no tempo de 96 horas (72 horas poacutes
tratamento)
Outra curva de multiplicaccedilatildeo celular foi feita para os compostos A1 A3 A4 e A5 onde as
ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos no momento da confecccedilatildeo da placa e
foram avaliados os mesmos paracircmetros nos tempos de 0 12 24 48 e 72 horas O
equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
46 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
Para determinar a menor Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) responsaacutevel pela letalidade
celular total 2x104 de ceacutelulas BHK-21 foram semeadas em placa de 96 poccedilos Apoacutes a
incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o
meio de cultura foi removido e as ceacutelulas foram expostas a diferentes diluiccedilotildees dos dois
sorotipos de DENV (100 microL de cada diluiccedilatildeo + 100 microL de meio DEMEM 1 SFB) As
diluiccedilotildees seriadas foram realizadas da suspensatildeo viral na razatildeo de 5 para o primeiro poccedilo e de
2 para os demais poccedilos Apoacutes 72 horas as ceacutelulas foram entatildeo fixadas com 200 microL de soluccedilatildeo
22
formalina a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo 1 (pv) de cristal violeta em
PBS para avaliaccedilatildeo da maior diluiccedilatildeo responsaacutevel pela letalidade de 100 das ceacutelulas
47 Ensaio Dose-resposta
Para cada composto foram realizados ensaios de dose-resposta para definiccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de cada composto capaz de promover a reduccedilatildeo na produccedilatildeo viral A atividade
antiviral foi avaliada tambeacutem pelo meacutetodo de MTT Ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas expostas a diferentes concentraccedilotildees dos extratos determinadas a partir das maiores
concentraccedilotildees em que natildeo foram observados efeitos citotoacutexicos As ceacutelulas foram tratadas
com as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de cada composto e em seguida infectadas com DENV
1 (MOI= 5) ou 2 (MOI= 2) Mantendo uma coluna para controle com DMSO uma coluna
para controle de viacuterus uma coluna para controle de citotoxicidade dos compostos e por fim
uma coluna para controle celular As ceacutelulas foram entatildeo incubadas durante 72 horas Apoacutes
este tempo procedeu-se a leitura pelo ensaio de MTT como descrito anteriormente Os dados
foram analisados levando-se em consideraccedilatildeo a leitura das absorbacircncias dos poccedilos dos
controles de viacuterus e do controle celular
Para realizacao destes experimentos os seguintes controles foram adotados
Controle de ceacutelulas poccedilos contendo somente ceacutelulas acrescidas do meio de cultura DMEM
1 SFB Utilizado para avaliar o comportamento das ceacutelulas sem que as mesmas tivessem
contato com qualquer interferente durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo Com isso os poccedilos
reservados para esse controle serviram de padratildeo para comparaccedilatildeo com aqueles em que fosse
observada atividade citotoacutexica ou citopaacutetica
Controle de viacuterus poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM 1 SFB
sem nenhum tratamento e de suspensatildeo de viacuterus Utilizando como referecircncia para anaacutelise da
atividade citopaacutetica provocada pelo viacuterus testado durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo das placas
23
Controle de viacuterus com DMSO Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura
DMEM 1 SFB e DMSO Foi utilizado para avaliar se havia influecircncia prejudicial do
solvente utilizado para diluiccedilatildeo das amostras no meio de cultivo das ceacutelulas e se o mesmo
poderia apresentar alguma potencial atividade antiviral aparente
Controle de citotoxicidade Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM
1 SFB e as quatro principais concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos Foi utilizado
para avaliar se haveria alguma possiacutevel atividade citotoacutexica das concentraccedilotildees dos compostos
em relaccedilatildeo agraves ceacutelulas
48 Ensaio Virucida
Para a realizaccedilatildeo deste ensaio aliacutequotas de 950 microL (diluiccedilatildeo de 20 vezes) do DENV 1 (tiacutetulo
6 x 107 UFPmL) foram incubadas com 50 microL de uma soluccedilatildeo de meio DMEM preparada
com 20x a concentraccedilatildeo natildeo citotoacutexica de cada composto A1 a A8 em banho-maria 37deg C
por 1 hora Apoacutes a incubaccedilatildeo as aliacutequotas foram imediatamente tituladas em ceacutelulas BHK-21
em placas de 6 poccedilos utilizando-se 3 diluiccedilotildees para cada incubaccedilatildeo (20x 20 x 10-1
e 20 x 10-
2) Foram titulados tambeacutem uma aliacutequota incubada apenas com meio DMEM sem nenhum
tratamento e outra aliacutequota incubada com DMSO (Dimetilsulfoacutexido) Estas foram tituladas
utilizando um controle e mais cinco diluiccedilotildees (20x 20 x 10-1
20 x 10-2
20 x 10-3
e 20 x 10-4
)
49 Ensaio antiviral
Neste ensaio ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em placas de 24 poccedilos no dia
seguinte foram tratadas durante 4 horas com as concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas de cada
composto em duplicata Apoacutes o preacute-tratamento as monocamadas foram infectadas com
DENV-1 a uma MOI=5 na presenccedila das concentraccedilotildees de uso respectivas de cada composto
Apoacutes 1 hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus as monocamadas foram lavadas duas vezes com PBS e
foi adicionado 500 microL por poccedilo de meio preparado com as mesmas concentraccedilotildees dos
diferentes compostos e mantidos durante 48 horas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5 Em
quatro poccedilos as ceacutelulas foram infectadas e natildeo tratadas e em outros quatro poccedilos as ceacutelulas
natildeo foram tratadas e nem infectadas (controle de ceacutelulas) destes uacuteltimos dois foram
tripsinizados e contados no momento da infecccedilatildeo e os outros dois apoacutes o teacutermino do ensaio
24
para avaliar o crescimento celular Decorridas as 48 horas o sobrenadante foi coletado e
centrifugado por 10 minutos a 4000 xG para separaccedilatildeo dos debris celulares e prontamente
titulado em placa de 6 poccedilos
410 Anaacutelise estatiacutestica
Os valores de CC50 foram obtidos a partir de anaacutelise de regressatildeo linear das curvas de
concentraccedilatildeocitotoxicidade A anaacutelise estatiacutestica dos dados foi realizada pelo programa
GraphPad Prism software Uma anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi utilizada para determinar
as diferenccedilas estatiacutesticas seguida do poacutes teste de Tukey A significacircncia estatiacutestica foi fixada
em p lt005
25
V RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
26
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Ensaio de citotoxicidade celular
Para avaliar a viabilidade da linhagem celular BHK-21 frente ao tratamento com oito
diferentes concentraccedilotildees dos compostos (A1 a A8) realizou-se um ensaio de MTT (brometo
de 3-[45-dimetil-tiazol-2-il]-25-difeniltetrazoacutelio) Este ensaio tem o objetivo de quantificar
espectrofotometricamente o crescimento celular a viabilidade e proliferaccedilatildeo podendo ser
utilizado como um indicador direto de citotoxicidade Trata-se de um ensaio colorimeacutetrico
para medir a atividade da redutase mitocondrial em ceacutelulas vivas Ele se baseia na reduccedilatildeo do
sal amarelo tetrazoacutelio (permeaacutevel agrave membrana celular) para cristais de formazan azuis
puacuterpura por ceacutelulas metabolicamente ativas a quantidade de formazan gerada medida por
espectrofotometria eacute proporcional ao nuacutemero de ceacutelulas viaacuteveis
A CC50 foi calculada plotando-se uma curva de porcentagem de viabilidade celular por
concentraccedilatildeo melhor representada na figura 7 pelo composto A7 e os resultados de CC50
para todos os compostos estatildeo representados na tabela 2 Foram feitos ensaios de
citotoxicidade com oito concentraccedilotildees diferentes sendo escolhida a maior concentraccedilatildeo que
natildeo apresentou citotoxicidade
Viabilidade Celular = [ ( A ndash B ) A ] x 100
Onde
A = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas natildeo tratadas
B = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas tratadas com
as respectivas concentraccedilotildees de cada composto
27
28
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (A curva dose resposta do composto A7 eacute a que
melhor representa a curva dose resposta esperada) Avaliou-se a viabilidade da linhagem
celular BHK-21 frente agrave diferentes concentraccedilotildees dos compostos realizando o ensaio de MTT
e determinando assim as concentraccedilotildees a serem utilizadas nos proacuteximos ensaios bem como
calculando a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) agrave partir da curva
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo
da concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50)
Composto Concentraccedilatildeo utilizada
[ ] microgmL
Concentraccedilatildeo citotoacutexica 50
(CC50) [ ] microgmL plusmn Desvio
Padratildeo
A1 ([ ]=1 mgmL) 00200 10010 plusmn 0014
A2 ([ ]=1 mgmL) 00025 09561 plusmn 0023
A3 ([ ]=1 mgmL) 00025 09988 plusmn 0017
A4 ([ ]=5 mgmL) 00125 10150 plusmn 0036
A5 ([ ]=10 mgmL) 00250 10590 plusmn 0047
A6 ([ ]=5 mgmL) 00250 08183 plusmn 0030
A7 ([ ]=5 mgmL) 00125 10280 plusmn 0052
A8 ([ ]=5 mgmL) 00125 09758 plusmn 0036
52 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan
Para corroborar o ensaio anterior de citotoxicidade utilizou -se o teste de viabilidade
celular pela teacutecnica da exclusatildeo do azul de tripan com a finalidade de determinar a
viabilidade das ceacutelulas Os procedimentos adotados no ensaio seguiram o manual do
equipamento contador automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL Automated Cell Counter) entatildeo
foi acrescentado agrave 10 microL da suspensatildeo celular 10 microL de azul de tripan (04) Apoacutes
homogeneizaccedilatildeo 10 microL da suspensatildeo foi colocada no local indicado da lacircmina proacutepria para
leitura e foi realizada a contagem sendo consideradas mortas (inviaacuteveis) as ceacutelulas que
incorporavam o corante e viaacuteveis as que excluiacuteam o azul de tripan
29
O equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
(A)
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan A avaliaccedilatildeo da
viabilidade celular foi realizada atraveacutes de um contador automaacutetico de ceacutelulas Este
equipamento possibilita explorar ferramentas de fotografia e avaliar alguns paracircmetros
importantes (A) fotografia das ceacutelulas (B) Zoom na fotografia das ceacutelulas com marcaccedilotildees
(em verde para ceacutelulas vivas e vermelho para mortas) e (D) contagem das ceacutelulas totais
ceacutelulas vivas e mortas graacutefico e meacutedia dos diacircmetros celulares das ceacutelulas vivas e mortas
(B)
(C)
30
O crescimento celular de ceacutelulas natildeo tratadas foi avaliado nos tempos de 0h (momento
da confecccedilatildeo da placa) 24h (momento de tratamento com os compostos) e 96 horas
(Momento em que todas as ceacutelulas foram tripsinizadas e contadas) para avaliar o perfil do
crescimento celular em ceacutelulas natildeo tratadas Foi observado um crescimento celular no periacuteodo
de 24 horas onde as ceacutelulas estavam incubadas com meio acrescido de 10 SFB Em 24
horas o meio foi trocado por 1 SFB e acrescido das substacircncias testes nas menores diluiccedilotildees
natildeo citotoacutexicas determinadas pelo ensaio do MTT Em 96 horas pode ser observado um
decaimento no nuacutemero de ceacutelulas vivas provavelmente devido ao crescimento celular (morte
por confluecircncia)
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas)
(A) (B)
31
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas (A)
Contagem de ceacutelulas vivas (B) Percentual de ceacutelulas viaacuteveis (Viabilidade celular ) e (C)
Meacutedia do diacircmetro apresentado pelas ceacutelulas vivas
Em 96 horas as ceacutelulas natildeo tratadas bem como as ceacutelulas tratadas por 72 horas com as
concentraccedilotildees de uso dos compostos foram tripsinizadas e avaliadas quanto ao nuacutemero de
ceacutelulas vivas viabilidade e diacircmetro celular apresentados na figura 10
Segundo se observa natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo aparente que possa demonstrar que
as concentraccedilotildees de uso dos compostos tenham causado alguma atividade citotoacutexica
corroborando assim os ensaios de citotoxicidade anteriores
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
A infectividade de um viacuterus depende de vaacuterios fatores entre eles da proporccedilatildeo de
partiacuteculas virais completas ou infecciosas da suscetibilidade da ceacutelula hospedeira e da
chance desta partiacutecula encontrar o receptor e penetrar na ceacutelula Quando ceacutelulas suscetiacuteveis
satildeo misturadas com uma suspensatildeo de viacuterus estas podem receber uma duas trecircs ou dez
partiacuteculas virais ou nenhuma Isto depende da proporccedilatildeo entre a quantidade de viacuterus
infecciosos presente no inoculo e a quantidade de ceacutelulas utilizada Esta relaccedilatildeo eacute denominada
de multiplicidade de infecccedilatildeo ou MOI Uma MOI=1 indica que a infecccedilatildeo foi feita em
principio com 1 viacuterus ou 1 dose infectante por ceacutelula
A determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo dos Dengue virus 1 e 2 a serem
utilizadas nos proacuteximos ensaios foi feita a partir da infecccedilatildeo de ceacutelulas BHK-21 por diferentes
(C)
32
concentraccedilotildees de viacuterus e revelaccedilatildeo com cristal violeta Escolheu-se a maior diluiccedilatildeo viral que
possibilitou a letalidade total das ceacutelulas (faixa onde todas as ceacutelulas estatildeo mortas utilizando
menor concentraccedilatildeo de viacuterus) As faixas escolhidas foram entatildeo calculadas levando-se em
consideraccedilatildeo o nuacutemero de ceacutelulas presentes no poccedilo e o nuacutemero de partiacuteculas virais que foram
adicionadas (Faixa3 para DENV2 e 2 para DENV1) Figura 11 Foi estipulado portanto a
Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 2 para DENV 2 e 5 para DENV 1
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI A partir da infecccedilatildeo da linhagem celular BHK-21 em
placa de 96 poccedilos com diferentes diluiccedilotildees de DENV foi determinado que a Multiplicidade
de infecccedilatildeo para o Dengue viacuterus sorotipos 1 e 2 seria de 5 e 2 respectivamente (colunas 2 -
DENV1 e 3 - DENV2)
54 Ensaio dose resposta
Apoacutes a determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas ideais realizou-se um
ensaio dose resposta tratando as ceacutelulas com oito concentraccedilotildees agrave partir das concentraccedilotildees natildeo
citotoacutexicas escolhidas para cada composto e em seguida infectando com DENV sorotipos 1 e
2 nas MOIs estipuladas anteriormente (5 e 2 respectivamente) A porcentagem do efeito
protetor conferida agraves ceacutelulas para cada concentraccedilatildeo de amostra testada foi calculada da
seguinte forma
33
EP = [ (A ndash B) (C ndash B) ] x 100
Onde
A Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas tratadas e infectadas
B Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e infectadas
C Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e natildeo infectadas
Este ensaio tem por objetivo identificar a resposta celular agrave infecccedilatildeo frente ao
tratamento com os compostos em diferentes concentraccedilotildees Assim como o ensaio de
toxicidade este ensaio feito utilizando a teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT permite o teste de vaacuterias
concentraccedilotildees diferentes em um menor tempo e com baixo gasto de material
34
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV1
(MOI=5)
35
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV2
(MOI=2)
36
Takegami et al (1998) demonstraram atividade de furanonaftoquinonas contra o viacuterus
da Encefalite Japonesa (Flavivirus) utilizando a concentraccedilatildeo de 3microgmL poreacutem para os
compostos apresentados avaliados pela teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT nenhuma das
concentraccedilotildees apresentadas produziu efeito antiviral significativo em relaccedilatildeo ao controle
celular como observado nas figuras 12 e 13
Apesar da teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT ser interessante como triagem de atividade
antiviral permitindo o teste de vaacuterias concentraccedilotildees dos compostos em menor tempo e
utilizando uma quantidade razoaacutevel de materiais optou-se por utilizar as maiores
concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas encontradas avaliando sua atividade antiviral por outras
teacutecnicas Como natildeo foi avaliada atividade antiviral preacutevia para nenhum dos compostos frente
agrave infecccedilatildeo por DENV1 e 2 foi selecionado o Dengue virus 1 para dar prosseguimento aos
ensaios
55 Ensaio Virucida
O ensaio virucida foi realizado para avaliar um potencial efeito dos compostos
diretamente sobre a partiacutecula viral Este ensaio eacute importante pois possibilita elucidar se o
composto pode produzir algum efeito sobre a partiacutecula viral impedindo que esta possa infectar
as ceacutelulas
Figura 14 Ensaio virucida Neste ensaio as aliacutequotas de DENV1 foram incubadas com as
concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos e titulados (NT) Controle natildeo tratado
37
Tabela 3 Ensaio virucida Caacutelculo do tiacutetulo viral (UFPmL) e porcentagem representante de
cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 254 x 105 100
DMSO 263 x 105 10335
A1 199 x 105 7835
A2 205 x 105 8071
A3 237 x 105 9311
A4 775 x 104 3049
A5 153 x 105 6024
A6 219 x 105 8602
A7 243 x 105 9547
A8 254 x 105 100
Lagrota et al (1988) demonstraram atividade de 2-HO-3-N-benzil-N(N-benzil-2-
etilamina) -14-naftoquinona sobre a partiacutecula viral de enterovirus De forma contraacuteria apesar
de se verificar a reduccedilatildeo de quase uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais
para o composto A4 natildeo considerou-se esta uma alteraccedilatildeo significativa pois devido agrave
magnitude do nuacutemero de UFPs se trata de uma alteraccedilatildeo muito pequena Portanto os
compostos avaliados neste trabalho natildeo produziram atividade virucida aparente frente ao
tratamento com as concentraccedilotildees de uso
56 Ensaio Antiviral
O sobrenadante de ceacutelulas tratadas previamente e infectadas por DENV1 coletado 48
horas poacutes infecccedilatildeo foi avaliado quanto agrave produccedilatildeo viral de partiacuteculas infecciosas pela
contagem de placas de lise e caacutelculo de Unidades Formadoras de Placa (Titulaccedilatildeo viral em
placa ndash UFPmL)
38
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral Sobrenadante de ceacutelulas tratadas e infectadas por DENV1
coletado apoacutes 48 horas e titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado
Tabela 4 Ensaio Antiviral Coleta do sobrenadante de ceacutelulas infectadas por DENV1 Tiacutetulo
viral (UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o
controle natildeo tratado como 100
Ao perceber um aumento no tiacutetulo viral frente ao tratamento com os compostos A1
A2 e A3 e uma reduccedilatildeo frente ao tratamento com A4 A5 e A6 foram escolhidos dois
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 119 x 105 10000
A1 235 x 105 19748
A2 228 x 105 19160
A3 318 x 105 26723
A4 128 x 104 1076
A5 186 x 103 156
A6 190 x 104 1597
A7 280 x 104 2353
A8 350 x 104 2941
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
40
Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
III
IV
V
LABORATOacuteRIO AUXIacuteLIO
Este trabalho foi realizado no Laboratoacuterio de Biologia e Tecnologia de Micro-organismos ndash
ICEBNUPEBUFOP com auxiacutelio da Coordenadoria de Aperfeiccediloamento de Pessoal de
Niacutevel Superior (CAPES) e Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP)
VI
EPIacuteGRAFE
ldquoA persistecircncia eacute o menor caminho do ecircxitordquo (Charles Chaplin)
ldquoO Senhor eacute meu Pastor e nada me faltaraacute () Ainda que eu andasse pelo
vale da sombra da morte natildeo temeria mal algum porque tu estaacutes comigo
a tua vara e o teu cajado me consolam () Certamente que a bondade e a
misericoacuterdia me seguiratildeo todos os dias da minha vida e habitarei na casa
do Senhor por longos diasrdquo (Salmos 23)
VII
AGRADECIMENTOS
Agradeccedilo primeiramente agrave Deus por ser o meu sustento e proteccedilatildeo
Aos meus pais Antocircnio e Sandra pelas oraccedilotildees esforccedilo carinho e dedicaccedilatildeo
E ao meu irmatildeo Joatildeo Paulo e minha Cunhada Naacutedia pelo apoio e torcida
Ao Prof Dr Breno de Mello Silva e Prof Dr Geraldo Ceacutelio Brandatildeo pela oportunidade e
orientaccedilatildeo durante o desenvolvimento do mestrado
Agrave toda equipe do LBTM em especial a Ana Claudia Cyntia e Erica pelo companheirismo
ajuda e incentivo
Aos meus amigos que fizeram parte de toda esta trajetoacuteria
Aos laboratoacuterios do NUPEB pela permissatildeo e ajuda no uso de diversos equipamentos
Agrave Universidade Federal de Ouro Preto por todas as oportunidades oferecidas
Agrave CAPES pelo apoio financeiro
Agrave todos aqueles que de alguma forma auxiliaram para o desenvolvimento e conclusatildeo deste
trabalho
VIII
RESUMO
O Dengue virus (DENV) possui quatro sorotipos diferentes (1-4) que satildeo principalmente
transmitidos pelo mosquito Aedes aegypti A infecccedilatildeo resulta na patogecircnese da dengue que eacute
uma epidemia de proporccedilotildees globais Apesar dos esforccedilos ainda natildeo existe uma vacina eficaz
contra os quatro sorotipos bem como drogas eficientes no tratamento de pacientes Portanto
vaacuterios estudos tem sido conduzidos na busca de faacutermacos com atividade antiviral contra o
DENV e outros Flavivirus Dentre os compostos estudados para este fim estatildeo as
naftoquinonas metaboacutelitos secundaacuterios produzidos por algas fungos plantas e animais Estes
compostos podem ser extraiacutedos principalmente a partir de plantas do gecircnero Tabebuia
(famiacutelia Bignoniaceae) satildeo caracterizados por apresentar atividade antiviral destacando-se a
szlig-lapachona potente inibidor da enzima transcriptase reversa dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria
(AMV) e leucemia murina de Rauscher (RLV) O objetivo deste trabalho foi testar oito
diferentes compostos derivados de naftoquinonas sinteacuteticas e naturais com potencial atividade
antiviral contra DENV Para isso uma triagem foi realizada por reduccedilatildeo de MTT (brometo de
3- (45-dimetiltiazol-2-il) -25-brometo difenil tetrazolina) para avaliar a atividade citotoacutexica
de oito compostos na linhagem celular BHK-21 resultando no caacutelculo da concentraccedilatildeo
citotoacutexica 50 (CC50) e as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas a serem utilizada em testes
subsequentes para os compostos A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 e A8 (lapachol β-lapachona 2-
Hidroxi-3-(ββ-dimetilvinil)-14-naftoquinona 2-Cloro-14-naftoquinona e 4 derivados de
lapachol) Em seguida ceacutelulas BHK-21 foram incubadas com os compostos em concentraccedilotildees
natildeo citotoacutexicas em diferentes diluiccedilotildees e infectadas com os sorotipos 1 e 2 DENV na
multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 5 e 2 para os sorotipos 1 e 2 respectivamente A
atividade antiviral foi testada atraveacutes da anaacutelise de reduccedilatildeo de MTT e pela titulaccedilatildeo de virus
liberados no sobrenadante Apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute
uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes
faacutermacos natildeo demonstraram atividade antiviral nas condiccedilotildees experimentais testadas
IX
ABSTRACT
The Dengue virus (DENV) has four different serotypes (1-4) that are primarily transmitted by
the mosquito Aedes aegypti Infection results in the pathogenesis of dengue which is an
epidemic of global proportions Despite these efforts there is still no effective vaccine against
the four serotypes as well as efficient drugs in the treatment of patients Therefore various
studies have been conducted in the search for drugs with antiviral activity against DENV and
other flaviviruses Among the studied compounds for this purpose are the naphthoquinones
secondary metabolites produced by algae fungi plants and animals These compounds can be
mainly extracted from plants of the genus Tabebuia (Bignoniaceae) are characterized by
having antiviral activity especially the szlig-lapachone potent inhibitor of the enzyme reverse
transcriptase of avian myeloblastosis virus (AMV) and murine leukemia Rauscher (RLV)
The aim of this study was to test eight different compounds derived from synthetic and
natural naphthoquinones with potential antiviral activity against DENV For this a screening
was performed by reduction of MTT (3- (45-dimethylthiazol-2-yl) -25-diphenyl bromide
tetrazolina) to assess the cytotoxic activity of the compounds eight BHK-21 cell line resulting
in the calculation of the cytotoxic concentration 50 (CC50) and non-cytotoxic
concentrations to be used in subsequent tests for compounds A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 and
A8 (lapachol β-lapachone 2-hydroxy -3- (β β-dimethylvinyl) -14-naphthoquinone 2-
chloro-14-naphthoquinone and derivatives lapachol 4) Then BHK-21 cells were incubated
with compounds at non-cytotoxic concentrations in different dilutions and infected with
serotypes 1 and 2 DENV at multiplicity of infection (MOI) of 5 and 2 for serotypes 1 and 2
respectively The antiviral activity was assayed by MTT reduction assay and the virus titer
released into the supernatant Although some compounds have shown reduced to one log unit
in the number of viral particles results indicate that these drugs did not show antiviral activity
in experimental conditions
X
SUMAacuteRIO
RESUMO VIII
ABSTRACT IX
LISTA DE FIGURAS XII
LISTA DE TABELAS XIII
1 INTRODUCcedilAtildeO 2
11 Flavivirus 2
12 Dengue virus 3
13 Epidemiologia 6
14 Naftoquinonas 8
3 OBJETIVOS 16
31 Objetivo Geral 16
32 Objetivos especiacuteficos 16
4 MATERIAL E MEacuteTODOS 18
41 Linhagens celulares 18
411 Ceacutelulas C636 18
412 Ceacutelulas BHK-21 18
42 Viacuterus 18
421 DENV 1 e DENV 2 18
422 Titulaccedilatildeo viral 19
43 Compostos de naftoquinonas 19
44 Ensaio de citotoxicidade 20
45 Avaliaccedilatildeo da viabilidade e crescimento celular por exclusatildeo de azul de tripan 21
46 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) 21
47 Ensaio Dose-resposta 22
48 Ensaio Virucida 23
49 Ensaio antiviral 23
410 Anaacutelise estatiacutestica 24
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO 26
51 Ensaio de citotoxicidade celular 26
52 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan 28
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) 31
54 Ensaio dose resposta 32
XI
55 Ensaio Virucida 36
56 Ensaio Antiviral 37
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao tratamento com
os compostos A1 A3 A4 e A5 40
6 CONCLUSAtildeO 44
7 PERSPECTIVAS 46
8 REFEREcircNCIAS 48
XII
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Estrutura da partiacutecula viral de Dengue viacuterus 4
Figura 2 Ciclo de multiplicaccedilatildeo de DENV 5
Figura 3 Distribuiccedilatildeo geograacutefica da Dengue 7
Figura 4 Estrutura quiacutemica da 12-naftoquinona (1) e 14-naftoquinona (2) 9
Figura 5 Estrutura quiacutemica do Lapachol (1) da α- Lapachona (2) e da β-Lapachona 10
Figura 6 Tabebuia avellanedae 11
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (Exemplo da curva dose resposta do composto A7) 28
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan 29
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas) 30
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas 31
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI 32
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 34
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 35
Figura 14 Ensaio virucida 36
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral 38
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados 39
Figura 17 Curva de crescimento celular 41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular 41
XIII
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Relaccedilatildeo de nome estrutura e coacutedigo dos compostos utilizados 20
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo da
concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) 28
Tabela 3 Ensaio virucida 37
Tabela 4 Ensaio Antiviral 38
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados 39
XIV
LISTA DE ABREVIATURAS
AMV ndash Mielobastose Aviaacuteria viacuterus (Avian Myeloblastosis virus )
CC50 ndash Concentraccedilatildeo Citotoacutexica 50
DENV ndash Dengue virus
DMEM ndash Meio baacutesico modificado por Dulbecco (Dulbeccos Modified Eagle Medium)
DMSO ndash Dimetilsulfoacutexido
ICTV ndash Comitecirc Inernacional de Taxonomia Viral
JEV ndash Viacuterus da Encefalite Japonesa (Japanese Encephalitis virus)
MOI ndash Multiplicidade de infecccedilatildeo viral
NS ndash Proteiacutenas natildeo estruturais
NT ndash Natildeo Tratado
OMS ndash Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede
RE ndash Retiacuteculo endoplasmaacutetico
RLV ndash Viacuterus da Leucemia Murina de Rauscher (Murine leukemia virus)
SFB ndash Soro Fetal Bovino
UFP ndash Unidades formadoras de placas
WNV ndash Viacuterus do Nilo Ocidental (West Nile virus)
YFV ndash Viacuterus da febre amarela (Yellow fever virus)
ZV ndash Zika virus
1
I INTRODUCcedilAtildeO
2
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Flavivirus
O Gecircnero Flavivirus pertencente agrave famiacutelia Flaviviridae inclui 53 espeacutecies
taxonomicamente reconhecidas (ICTV 2016) muitas das quais satildeo importantes patoacutegenos
humanos tais como o Dengue virus (DENV) Yellow fever virus (YFV - viacuterus da febre
amarela ndash protoacutetipo deste gecircnero) Japanese encephalitis virus (JEV - viacuterus da encefalite
japonesa) West Nile virus (WNV - virus do Nilo Ocidental) Zika virus (ZV) entre outros
(Villordo 2016) O nome flavivirus eacute derivado da palavra latina flavus que significa amarelo
significando a icteriacutecia causada pelo YFV Os sintomas da infecccedilatildeo por flavivirus pode variar
de leve febre e mal-estar a encefalite fatal e febre hemorraacutegica (Mukhopadhyay 2005)
Estes viacuterus regulam o metabolismo e a sobrevivecircncia das ceacutelulas infectadas
assegurando a sua proacutepria reproduccedilatildeo e propagaccedilatildeo O viacuterus da dengue tambeacutem provoca a
autofagia uma resposta homeostaacutetica geral que ajuda a ceacutelula infectada sobreviver e produzir
viacuterus (Datan 2016)
Os Flavivirus podem ser agrupados em complexos e sub-complexos antigecircnicos
baseados em criteacuterios soroloacutegicos ou em grupos clados e espeacutecies segundo a sua filogenia
molecular (Lindenbach 2007) A maioria dos membros deste gecircnero satildeo arbovirus (arthropod
borne virus) ou seja satildeo essencialmente transmitidos por Artroacutepodes (Mackenzie 2004)
onde 27 satildeo transmitidos por mosquitos 12 por carrapatos e 14 natildeo possuem vetor
conhecido Os viacuterus transmitidos pela fecircmea do gecircnero Aedes incluem DENV e YFV satildeo
viscerotroacutepicos e possuem primatas como reservatoacuterio natural (Gaunt 2001)
A patogenia da Dengue causada pelo DENV constitui uma das doenccedilas virais mais
importantes em seres humanos transmitidos por insetos e eacute responsaacutevel por cerca de 390
milhotildees de infecccedilotildees por ano O YFV por sua vez causador da febre amarela eacute endecircmico em
vaacuterios paiacuteses do continente Africano e da Ameacuterica do Sul resultando em 200000 casos e
30000 mortes na Aacutefrica mesmo com vacinas eficazes disponiacuteveis Outras doenccedilas causadas
por flaviviacuterus incluem a encefalite do Nilo Ocidental (West Nile virus) e febre Zika (Zika
virus) que satildeo consideradas doenccedilas emergentes com surtos importantes em todo o mundo
(Villordo 2016)
3
12 Dengue virus
Os DENV pertencem ao gecircnero flaviviacuterus e evoluiram em primatas natildeo-humanos a
partir de um ancestral comum Eacute composto por quatro sorotipos antigenicamente distintos
(DENV1-4) que co-circulam por todo o Sudeste da Aacutesia Aacutefrica e Ameacutericas (McArthur 2013)
e em outubro de 2013 foi anunciado um novo sorotipo circulante denominado entatildeo de DENV
5 (Normile 2013) A partiacutecula infecciosa eacute esfeacuterica com 40-50 nm de diacircmetro possuindo
um envelope de lipopolissacariacutedeo O genoma consiste em RNA de fita simples natildeo
segmentado e senso positivo de aproximadamente 11 kb de comprimento e possui uma uacutenica
janela aberta de leitura (start codon) (Guzman 2010) Apoacutes a traduccedilatildeo a uacutenica poliproteiacutena
formada eacute clivada por proteases virais e celulares em trecircs proteiacutenas estruturais que compotildeem
a partiacutecula viral C (capsideo) prM M (membrana e o seu precursor) e E (envelope) e sete
proteiacutenas natildeo estruturais essenciais para a replicaccedilatildeo viral (NS) (NS1 NS2a NS2b NS3
NS4a NS4b e NS5) (Robertson 2009)
A transmissatildeo do viacuterus ocorre atraveacutes da picada por fecircmeas infectadas de mosquitos
do gecircnero Aedes sendo responsaacutevel pelas maiores taxas de doenccedila e mortalidade entre os
membros do gecircnero Flavivirus (Mukhopadhyay 2005) No Brasil o Aedes aegypti eacute o
principal vetor de dengue enquanto o Aedes albopictus atua como um vector secundaacuterio
(Weaver 2010)
O diagnoacutestico soroloacutegico da Dengue se baseia na detecccedilatildeo de niacuteveis elevados de
anticorpos anti-Dengue-IgM ou anti-Dengue-IgG que reconhecem e se ligam ao antiacutegeno de
DENV A Glicoproteiacutena do envelope (E) uma proteiacutena estrutural de DENV eacute o alvo
antigecircnico mais importante destes anticorpos neutralizantes porque estaacute exposta na superfiacutecie
do viacuterus e medeia os receptores de ligaccedilatildeo e fusatildeo da ceacutelula hospedeira (Lee 2015)
Durante a infecccedilatildeo celular os virions de DENV se ligam agrave superfiacutecie da membrana
atraveacutes da glicoproteiacutena do envelope (E) a receptores especiacuteficos e satildeo internalizados por
endocitose Uma vez dentro do endossoma a acidificaccedilatildeo provocada pela ligaccedilatildeo de
lisossomos desencadeia uma trimerizaccedilatildeo irreversiacutevel da proteiacutena E que atua na fusatildeo das
membranas virais e endossomais celulares Apoacutes essa fusatildeo o nucleocapsideo eacute liberado no
citoplasma onde o mesmo eacute desnudado e a replicaccedilatildeo do genoma de RNA e montagem de
partiacuteculas eacute iniciada As partiacuteculas virais imaturas satildeo acumuladas no luacutemen do retiacuteculo
endoplasmaacutetico (RE) Essas partiacuteculas imaturas que contecircm proteiacutenas prM proteiacutena E
membrana lipiacutedica e nuacutecleo capsiacutedeo natildeo pode induzir a fusatildeo da ceacutelula hospedeira ou seja
4
neste estaacutegio elas natildeo satildeo infecciosas (Mukhopadhyay 2005) O processo de maturaccedilatildeo
desses viacuterus ocorre apoacutes a clivagem proteoliacutetica da proteiacutena precursora de membrana (prM)
transformando viacuterus inerte em partiacuteculas infecciosas (Li 2008) Partiacuteculas subvirais satildeo
tambeacutem produzidas no RE mas apenas contecircm as glicoproteiacutenas de membrana fazendo com
que estas partiacuteculas sejam natildeo infecciosas Os viacuterus maduros e as partiacuteculas sub-virais satildeo
liberados da ceacutelula hospedeira por exocitose (Mukhopadhyay 2005)
Na pele o DENV tende a infectar ceacutelulas dendriacuteticas imaturas Estas ceacutelulas infectadas
amadurecem e migram para os gacircnglios linfaacuteticos regionais ou locais onde apresentam
antiacutegenos virais agraves ceacutelulas T iniciando as respostas imunes Existe tambeacutem evidecircncia de
replicaccedilatildeo abundante de DENV em ceacutelulas do parecircnquima do fiacutegado e em macroacutefagos nos
gacircnglios linfaacuteticos fiacutegado e baccedilo bem como em monoacutecitos de sangue perifeacuterico (Guzman
2010)
Proteiacutena E
(diacutemero)
Proteiacutena
M
Proteiacutena C
ssRNA (+)
Figura 1 Estrutura da partiacutecula viral de Dengue viacuterus A partiacutecula viral eacute composta
por trecircs proteiacutenas estruturais proteiacutena de envelope (E) disposta em diacutemeros a proteiacutena
associada agrave membrana (M) e a proteiacutena do nucleocapsiacutedeo (C) O genoma de RNA fita-
simples de polaridade positiva se encontra dentro do nucleocapsiacutedeo (Adaptado de
httpviralzoneexpasyorgviralzoneall_by_species24html)
5
Figura 2 Ciclo de multiplicaccedilatildeo de DENV A Os viacuterus se ligam aos receptores na superfiacutecie da
ceacutelula e satildeo endocitados B Devido ao baixo pH dentro dos endossomas ocorre a fusatildeo de
membranas viral-celular mediada por proteiacutenas virais resultando na liberaccedilatildeo do RNA viral em um
processo chamado de desnudamento C O genoma viral eacute traduzido em uma uacutenica poliproteiacutena que
eacute processada por proteases do viacuterus e da ceacutelula hospedeira D O RNA eacute replicado por proteiacutenas
natildeo-estruturais do proacuteprio viacuterus E A montagem do viacuterus ocorre na membrana do Reticulo
endoplasmaacutetico no qual a proteiacutena do capsiacutedeo e o RNA viral satildeo envolvidos por glicoproteiacutenas e
pela membrana da organela para formar partiacuteculas virais imaturas F Partiacuteculas virais imaturas
utilizam a via secretora da ceacutelula hospedeira e sob o baixo pH do Complexo de Golgi a proteiacutena
precursora prM eacute clivada em proteiacutena M completando a maturaccedilatildeo do viacuterus GOs viacuterus maduros
satildeo entatildeo liberados das ceacutelulas por exocitose Os nuacutemeros indicados nas caixas coloridas referem-se
ao valor de pH dos respectivos compartimentos Imagem adaptada de PERERA 2009
Adsorccedilatildeo
Siacutentese e processamento
Fusatildeo e
Desnudamento
Replicaccedilatildeo do RNA
Montagem
Maturaccedilatildeo
Liberaccedilatildeo de
viacuterus
maduro
A
B
C
D
E
F
G
6
13 Epidemiologia
Ao longo das uacuteltimas deacutecadas a dengue se tornou a doenccedila viral transmitida por
mosquitos mais prevalente no mundo Estimativas de infecccedilatildeo pela OMS indicam que a
patologia eacute endecircmica em mais de 100 paiacuteses em todos os continentes exceto a Antaacutertida e
aflige principalmente paiacuteses pobres em recursos nas regiotildees tropicais e subtropicais (Perry
2011) Epidemias globais de DENV ocorreram ao longo das uacuteltimas deacutecadas em parte devido
agrave diminuiccedilatildeo dos esforccedilos no controle de mosquitos Satildeo estimados mais de 50 milhotildees de
casos de dengue anualmente (Mukhopadhyay 2005)
A Dengue eacute uma doenccedila viral sistecircmica aguda que se estabeleceu em todo o mundo
em ambos os ciclos de transmissatildeo endecircmicas e epidecircmicas A infecccedilatildeo pelo DENV em seres
humanos eacute frequentemente inaparente mas pode levar a uma grande variedade de
manifestaccedilotildees cliacutenicas de febre leve a siacutendrome do choque da dengue potencialmente fatal A
imunidade vitaliacutecia desenvolvida apoacutes a infecccedilatildeo com um dos quatro tipos de viacuterus eacute
especiacutefica para cada tipo e a progressatildeo para uma doenccedila mais grave eacute frequente mas natildeo
exclusivamente relacionada com infecccedilatildeo secundaacuteria por tipos heteroacutelogos No entanto
enquanto a expansatildeo histoacuterica desta doenccedila eacute bem documentada o elevado fardo de
problemas de sauacutede atribuiacuteveis agrave dengue em grande parte do mundo tropical e sub-tropical
permanecem pouco enumerados (Bhatt 2013)
O Brasil eacute um paiacutes de grande extensatildeo (8512000 km2) situado em uma zona
predominantemente tropical com extensas aacutereas de florestas na regiatildeo amazocircnica bem como
restos de uma floresta tropical na costa leste sudeste e sul entre outros ecossistemas A maior
parte do paiacutes tem um clima tropical e uma grande diversidade de plantas e animais portanto
um local adequado para a ocorrecircncia de patologias causadas por viacuterus transmitidos por
artroacutepodes (Figueiredo 2000) Segundo o boletim epidemioloacutegico do ministeacuterio da sauacutede em
2016 jaacute foram registrados 170103 casos provaacuteveis de dengue no paiacutes ateacute a semana
epidemioloacutegica 5 Nesse periacuteodo a regiatildeo Sudeste registrou o maior nuacutemero de casos
provaacuteveis (96664 casos 568) Em Minas Gerais jaacute foram registradas 19 mortes em
decorrecircncia da Dengue entre 1deg de janeiro e 14 de marccedilo deste ano Outros 91 oacutebitos estatildeo
sob investigaccedilatildeo (BRASIL 2016)
7
Figura 3 Distribuiccedilatildeo geograacutefica da Dengue Aacutereas de risco de transmissatildeo em amarelo
(Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede Adaptado de httpwwwwhointen)
As manifestaccedilotildees da doenccedila foram descritas pela primeira vez apoacutes a Segunda Guerra
Mundial coincidente com o aumento da urbanizaccedilatildeo particularmente na Aacutesia (Weaver 2010)
Atualmente o DENV eacute hiperendecircmico em muitas regiotildees tropicais onde 2 ou mais sorotipos
circulam endemicamente Embora DENV foi provavelmente introduzido periodicamente para
as Ameacutericas atraveacutes de navios desde o seacuteculo 17 o surgimento de DENV no Hemisfeacuterio
Ocidental comeccedilou mais tarde devido a uma campanha de sucesso parcial para erradicar o
vetor A aegypti para controlar a febre amarela Esta campanha teve sucesso na maior parte
das Ameacutericas da deacutecada de 1950 agrave deacutecada de 1970 mas foi interrompida O vetor entatildeo
rapidamente recolonizou quase toda a regiatildeo neotropical e subtropicais e a invasatildeo do DENV
seguiu logo depois Em 1985 A albopictus foi introduzido nos EUA e no Brasil
proporcionando um vetor para a transmissatildeo secundaacuteria de DENV nas Ameacutericas (Hawley
1987)
Os mosquitos vetores principalmente A aegypti tornam-se infectados quando eles se
alimentam do sangue de seres humanos durante o periacuteodo de cinco dias da viremia A
infecccedilatildeo produz um amplo espectro da doenccedila cliacutenica e varia de assintomaacutetica a doenccedila febril
auto-limitante A dengue tambeacutem conhecida como ldquofebre osso quebradordquo devido agraves fortes
dores nas articulaccedilotildees e inclui sintomas de febre alta dores musculares articulares e erupccedilatildeo
cutacircnea Uma pequena porcentagem de indiviacuteduos pode apresentar a siacutendrome do choque da
8
dengue (dengue hemorraacutegica) com risco de vida grave O tratamento eacute amplamente favoraacutevel
usando de reidrataccedilatildeo oral ou intravenosa acompanhamento e atenccedilatildeo meacutedica adequada No
entanto uma das principais consequecircncias da doenccedila eacute a sua capacidade de sobrecarregar
instalaccedilotildees meacutedicas durante um surto e em paiacuteses onde os recursos de sauacutede jaacute estatildeo no
limite isso pode ter efeitos catastroacuteficos Prevenccedilatildeo e tratamento portanto se fazem
altamente necessaacuterios (Perry 2011)
A prevalecircncia global de DENV cresceu drasticamente nas uacuteltimas deacutecadas e ateacute o
momento natildeo haacute nenhum medicamento especiacutefico para combater a infecccedilatildeo as medidas de
prevenccedilatildeo mais eficazes satildeo voltadas para o controle do vetor (Silva 2011) Diante disso a
Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) elegeu o desenvolvimento de vacinas contra o viacuterus da
dengue como prioridade mundial (Kinney 2001) Por conseguinte a busca de substacircncias
naturais ou sinteacuteticas com atividade antiviral especiacutefica sem toxicidade para as ceacutelulas
normais em seres humanos eacute uma estrateacutegia desejada para evitar que a dengue se agrave e
ajudar a controlar a difusatildeo da doenccedila As vaacuterias fases do ciclo viral representam alvos
terapecircuticos individuais que podem ser exploradas (Costa 2013) Nesse sentido vaacuterios
grupos de pesquisa e organizaccedilotildees estatildeo trabalhando com diversas abordagens para o
desenvolvimento de compostos antivirais com atividade protetora contra dengue Dentre elas
uma vasta gama de produtos naturais incluindo plantas numa tentativa de isolar e
caracterizar novos compostos que podem inibir a replicaccedilatildeo do viacuterus ou tratar a infecccedilatildeo
viral Por essa razatildeo extratos e componentes da planta satildeo cada vez mais importantes como
fontes potenciais para agentes antivirais (Silva 2011)
14 Naftoquinonas
As quinonas satildeo compostos aromaacuteticos amplamente distribuiacutedos na natureza e podem
ser encontrados em vaacuterias famiacutelias de plantas bem como isolado de fungos algas e
bacteacuterias Elas satildeo classificadas em benzoquinonas antraquinonas e naftoquinonas de acordo
com as suas estruturas quiacutemicas Naftoquinonas satildeo compostos orgacircnicos altamente reativos
utilizados como corantes naturais ou sinteacuteticos cujas cores variam de amarelo para vermelho
Apresentam cadeia carbocircnica similar ao naftaleno e satildeo caracterizadas por seus dois grupos
carbonila na posiccedilatildeo 1 e 4 por isso satildeo nomeadas de 14-naftoquinonas Os grupos carbonila
tambeacutem podem estar presente na posiccedilatildeo 12 com menor incidecircncia (Loacutepez 2014)
9
Figura 4 Estrutura quiacutemica da 12-naftoquinona (1) e 14-naftoquinona (2)
Entre as quinonas estatildeo compostos biologicamente importantes tais como o grupo da
vitamina K e a coenzima Q (ubiquinona) Estes compostos tecircm um papel importante no
metabolismo celular especialmente como carreadores de eleacutetrons Aleacutem de quinonas que
possuam uma funccedilatildeo bioloacutegica outros compostos desta classe tecircm sido encontrados
mostrando atividade antibioacutetica Alguns deles estatildeo presentes na natureza mas a maior parte
satildeo obtidos sinteticamente entre eles 2-hidroxi-3-alquil-14-naftoquinonas que possuem
evidecircncias de serem ativos in vitro contra os parasitas da malaacuteria e como coccidiostaacuteticos
(Ambrogi 1970)
A atividade bioloacutegica de quinonas estaacute muitas vezes relacionada com o seu
comportamento eletroquiacutemico A capacidade de aceitar um ou dois eleacutetrons para formar o
acircnion radical correspondente ou dianion pode ser o motivo da induccedilatildeo da formaccedilatildeo de
espeacutecies reativas de oxigecircnio responsaacuteveis pelo estresse oxidativo nas ceacutelulas A capacidade
de aceitar eleacutetrons de naftoquinonas pode ser alterada por mudanccedilas de posiccedilatildeo do grupo
carbonila (12- 14-naftoquinonas) ou diferentes substituintes ou funccedilotildees associadas agrave porccedilatildeo
de naftoquinona (Francisco 2010)
As naftoquinonas satildeo largamente encontradas em plantas micro-organismos e alguns
animais Estes compostos tecircm sido amplamente utilizados em diversas culturas como corantes
para cosmeacuteticos tecidos alimentos (Brandelli 2004) e para fins medicinais incluindo
antitumoral (Oliveira 1990 Ferreira 1996) anti-inflamatoacuterios antimalaacuterico antiviral
(Fonseca 2003 Hussain 2007) atibacterianos e antifuacutengicos (Nagata 1998) Estas atividades
bioloacutegicas tecircm justificado o grande nuacutemero de trabalhos (aproximadamente 42 ateacute abril 2016
ndash Pubmed) encontrados na literatura que visa a siacutentese e avaliaccedilatildeo de qualquer das quinonas
naturais ou seus anaacutelogos como agentes farmacoloacutegicos potenciais (Rahmoun 2013)
10
O Lapachol foi descoberto e estudado desde o seacuteculo XIX Foi isolado primeiramente
do lenho da aacutervore argentina ldquolapachordquo Tabebuia avellanedae (Bignoniaceae) conhecida
como Ipecirc roxo Os estudos quiacutemicos foram desenvolvidos inicialmente em 1892 (Fonseca
2003) O lapachol foi descrito pela primeira vez por Paterno em 1821 tendo sua estrutura
quiacutemica estabelecida em 1896 por Hooker que o identificou como uma naftoquinona Esta
naftoquinona possui accedilatildeo antiinflamatoacuteria analgeacutesica antibioacutetica e anti-neoplaacutesica
reconhecida (Arauacutejo 2002)
A β-lapachona (34-di-hidro-22-dimetil-2H-naptho [12-b] pirano-56-diona) eacute uma
quinona obtida de fontes naturais derivada da aacutervore Lapacho (Tabebuia avellanedae) nativa
da Ameacuterica do Sul e Central A siacutentese e quiacutemica da β-lapachona e compostos relacionados
foi inicialmente investigado no final do seacuteculo XIX e iniacutecio do seacuteculo XX pelo quiacutemico
Samuel Hooker Apesar de alguns estudos cliacutenicos sobre a bioatividade de naftoquinonas
terem sido relatados no iniacutecio de 1940 foi o relatoacuterio do potencial da β-lapachona como um
agente anti-tripanossoma em 1977 que revitalizou o estudo e caracterizaccedilatildeo deste composto
natural A β-lapachona tambeacutem apresenta vaacuterias accedilotildees farmacoloacutegicas incluindo accedilatildeo
formaccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (Hussain 2007)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do Lapachol (1) da α- Lapachona (2) e da β-
Lapachona (Fonseca et al 2003 Ferreira et al 2010)
11
Figura 6 Tabebuia avellanedae (Hussain 2007)
A β-lapachona eacute uma substacircncia natural facilmente obtida a partir do lapachol Esta
naftoquinona eacute o grande destaque desta classe de substacircncias porque se encontra em testes
cliacutenicos de fase II para o tratamento do cacircncer de pacircncreas (Ferreira 2010) O mecanismo de
accedilatildeo da β-lapachona diferencia-se de outros antineoplaacutesicos por atuar na topoisomerase I
promovendo a recuperaccedilatildeo da capacidade de apoptose celular Alguns estudos reportam sua
accedilatildeo sineacutergica de potenciaccedilatildeo com o Taxolreg
promovendo a inibiccedilatildeo em diferentes pontos de
replicaccedilatildeo celular aleacutem de sua combinaccedilatildeo com outros tratamentos como a aplicaccedilatildeo de
radiaccedilatildeo ionizante (Cunha 2005)
Vaacuterios estudos jaacute foram publicados demonstrando a atividade antiviral de
naftoquinonas naturais e sinteacuteticas A β-lapachona inibe seletivamente a replicaccedilatildeo do viacuterus
HIV-1 atuando na inibiccedilatildeo da enzima LTR117 Da mesma forma este composto eacute um
potente inibidor da enzima transcriptase reversa dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e
leucemia murina de Rauscher (RLV) inibindo tambeacutem a DNA polimerase A accedilatildeo inibitoacuteria
sobre estas enzimas revelou-se especiacutefica se comparada com a de outros inibidores
conhecidos (Silva 2003)
O Lapachol jaacute demonstrou atividade contra certas cepas virais incluindo Herpes virus
tipos I e II Outras naftoquinonas jaacute mostraram eficaacutecia contra cepas de Influenza virus
Poliomielite virus e estomatite vesicular Supotildee-se que o mecanismo de accedilatildeo destas quinonas
seja atraveacutes da inibiccedilatildeo da transcriptase reversa de retroviacuterus e da RNA polimerase Eacute relatado
12
que lapachol diminui a replicaccedilatildeo do viacuterus em seres humanos mas ainda natildeo existem
resultados de testes cliacutenicos disponiacuteveis (Hussain 2007)
Na avaliaccedilatildeo da atividade antiviral do Lapachol in vitro verificou-se que esta
substacircncia eacute ativa contra viacuterus RNA atuando tanto sobre viacuterus envelopados quanto sobre
partiacuteculas sem esta estrutura em concentraccedilotildees de 5 a 10 microgmL e ainda apresentou uma
pequena atividade sobre HSV (Herpes simplex I) e Ad5 (Adeno tipo 5) mas nenhuma
atividade sobre CoxB4 (Coxsackie B4) Em trabalho posterior demonstrou-se que nem o
Lapachol nem diversos dos seus derivados apresentaram atividade antiviral in vitro sobre
Poliovirus tipo 1 Ecovirus 19 e Coxsackie B tipo 4 Apenas os derivados 12-naftoquinonicos
e um intermediaacuterio da siacutentese Hoocker foram ativos contra o Echovirus 19 (Fonseca 2003)
Costa et al (2013) relataram que piranonaftoquinonas isocircmeras do lapachol possuem
atividade de inibiccedilatildeo da replicaccedilatildeo de DENV-2 atuando sobre a atividade da ATPase de NS3
(proteiacutena natildeo estrutural de DENV)
A utilizaccedilatildeo de testes in vitro por meio de ensaios de viabilidade celular constitui o
primeiro passo para a avaliaccedilatildeo da compatibilidade bioloacutegica de uma substacircncia e pode
fornecer elementos importantes para a anaacutelise da biocompatibilidade dos diferentes materiais
Para ser considerado natildeo citotoacutexico no teste de citotoxicidade in vitro um produto natildeo deve
ocasionar a morte das ceacutelulas nem afetar suas funccedilotildees celulares A prova do MTT eacute um dos
indicadores colorimeacutetricos de viabilidade celular mais utilizados sendo capaz de avaliar a
funccedilatildeo celular mitocondrial de acordo com a reduccedilatildeo enzimaacutetica do sal de tetrazoacutelio pelas
desidrogenases mitocondriais nas ceacutelulas viaacutevies (Arauacutejo et al 2008) Supotildee-se que o
mecanismo responsaacutevel pela citotoxicidade apresentada pelas quinonas esteja relacionado
com o estresse oxidativo causado por esses compostos poreacutem a capacidade de alquilaccedilatildeo de
nucleoacutefilos celulares tambeacutem representa correlaccedilatildeo com tais efeitos bioloacutegicos (Goulart
2004)
13
II JUSTIFICATIVA
14
2 JUSTIFICATIVA
Aleacutem do controle do mosquito transmissor e do desenvolvimento de vacinas que tem
sido exaustivamente estudado nos uacuteltimos anos uma alternativa para o combate agrave dengue
seria o desenvolvimento de faacutermacos para reduzir a viremia ou mesmo para controlar a
resposta imune do hospedeiro agrave infecccedilatildeo que tem sido apontada como principal fator de risco
nos casos mais graves Em funccedilatildeo disso o nuacutemero de pesquisas visando o desenvolvimento
de drogas com accedilatildeo antiviral ou com accedilatildeo imunomodulatoacuteria tem aumentado
significativamente As naftoquinonas vecircm ganhando bastante importacircncia na pesquisa de
novas drogas antivirais devido agrave algumas atividades apresentadas A szlig-lapachona-orto-
naftoquinona por exemplo se mostrou um potente inibidor da enzima transcriptase reversa
dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e leucemia murina de Rauscher (RLV)
Diante da inexistecircncia de drogas com accedilatildeo anti DENV e o elevado nuacutemero e casos da
patogenia nos uacuteltimos anos a organizaccedilatildeo mundial da sauacutede classificou a Dengue como uma
epidemia de proporccedilotildees globais e um problema de sauacutede puacuteblica Como as naftoquinonas jaacute
demonstraram na literatura possuir um potencial efeito terapecircutico contra alguns viacuterus eacute
possiacutevel que estes compostos possam apresentar atividade antiviral contra DENV Portanto
este trabalho visou atraveacutes de ensaios de MTT e titulaccedilotildees virais em placa avaliar a potencial
atividade antiviral de oito compostos derivados de naftoquinonas naturais e sinteacuteticas
15
III OBJETIVOS
16
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar oito compostos (2 naturais e 6 sinteacuteticos) derivados de naftoquinonas como potenciais
agentes antivirais em ceacutelulas BHK-21 frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1 e 2
32 Objetivos especiacuteficos
1 Calcular o iacutendice de citotoxicidade e a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) dos compostos
atraveacutes de ensaio de reduccedilatildeo de MTT
2 Avaliar os efeitos dos compostos sobre o crescimento a viabilidade e o volume celular
pela teacutecnica de exclusatildeo do azul de tripan
3 Determinar a multiplicidade de infecccedilatildeo de DENV 1 e 2 a ser utilizada nos ensaios
antivirais
4 Avaliar a atividade antiviral dos compostos frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1
e 2 atraveacutes do ensaio de MTT
5 Verificar um possiacutevel efeito direto dos compostos agraves partiacuteculas virais de Dengue virus
6 Quantificar a produccedilatildeo de partiacuteculas virais infecciosas no sobrenadante de ceacutelulas
infectadas atraveacutes de titulaccedilatildeo viral pela contagem de unidades formadoras de placas
17
IV MATERIAL E MEacuteTODOS
18
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Linhagens celulares
411 Ceacutelulas C636
As ceacutelulas C636 satildeo ceacutelulas de linhagem contiacutenua de larvas de mosquito Aedes
albopictus Estas ceacutelulas foram utilizadas na produccedilatildeo de estoque viral de DENV sorotipos 1
e 2 para isso foram mantidas em meio de cultura Leibovitz-15 (L-15) (Cultilab)
suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (Cultilab) antibioacuteticos (Penicilina 100 UmL
Streptomicina 100 microgmL) e antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL) a 28degC
412 Ceacutelulas BHK-21
As ceacutelulas BHK-21 satildeo fibroblastos de linhagem contiacutenua derivados de rim de hamster
neonato Estas ceacutelulas foram utilizadas para os experimentos in vitro e para as titulaccedilotildees de
DENV 1 e 2 para isso foram mantidas em meio miacutenimo essencial modificado por Dulbecco
ndash DMEM (Cultilab) suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (SFB) com antibioacuteticos
(Penicilina 100 UmL Streptomicina 100 microgmL) e com antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL)
sendo mantidas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5
42 Viacuterus
421 DENV 1 e DENV 2
O Sorotipo 1 do Dengue virus (DENV-1) estirpe Mochizuki foi replicado em ceacutelulas
C636 para gerar estoques de trabalho durante 2 e 5 dias a 28degC O sobrenadante da cultura de
ceacutelulas infectadas foi recolhido e clarificado por centrifugaccedilatildeo a 4000 G durante 10 minutos agrave
4degC e entatildeo foi aliquotado e armazenado a -70 deg C como reserva de viacuterus ateacute agrave sua utilizaccedilatildeo
A replicaccedilatildeo geraccedilatildeo de estoque e titulaccedilatildeo do Sorotipo 2 do Dengue virus (DENV-2)
estirpe Nova Guineacute C ocorreu nos mesmos moldes do DENV-1
19
422 Titulaccedilatildeo viral
Os estoques virais foram diluiacutedos (10-1
a 10-7
) e inoculados em monocamadas de
ceacutelulas BHK-21 implantadas em placas de 6 poccedilos com confluecircncia de aproximadamente
60 (3x105 ceacutelulas por poccedilo) sendo um poccedilo natildeo infectado mantido para controle celular
Apoacutes uma hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus foram adicionados 3 mL de meio DMEM (Cultilab)
suplementado com 15 de SFB e contendo 15 de Carboximetilcelulose (CMC Synth) As
placas foram entatildeo incubadas a 37degC (CO2 a 5) por 96 horas As ceacutelulas foram entatildeo
fixadas com 2 mL de soluccedilatildeo de formol a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo
1 (pv) de cristal violeta em PBS para contagem das placas de lise O tiacutetulo viral foi
expresso atraveacutes do nuacutemero de unidades formadoras de placa por mL (UFPmL) segundo a
formula abaixo representada
Tiacutetulo viral (UFPmL) = N x FC x 10
N = nuacutemero de placas de lise contadas
FC = Fator de correccedilatildeo
= Inverso da diluiccedilatildeo na qual foram contadas as placas de lise
43 Compostos de naftoquinonas
Os compostos utilizados neste estudo foram fornecidos pelo Dr Geraldo Ceacutelio
Brandatildeo do laboratoacuterio de pesquisa da Escola de Farmaacutecia da Universidade Federal de Ouro
Preto
20
Tabela 1 Relaccedilatildeo de nome estrutura e coacutedigo dos compostos utilizados Na tabela estatildeo
presentes a relaccedilatildeo dos nomes dos compostos utilizados neste trabalho bem como sua
estrutura Os coacutedigos representantes de cada composto seratildeo utilizados no decorrer da escrita
Nome do composto Estrutura Coacutedigo
Lapachol
A1
β-lapachona
A2
2-Hidroxi-3-(ββ-dimetilvinil)-14-naftoquinona
A3
2-Cloro-14-naftoquinona
A4
Lapachol derivado 1
A5
Lapachol derivado 2 A6
Lapachol derivado 3 A7
Lapachol derivado 4 A8
44 Ensaio de citotoxicidade
Para avaliar a citotoxicidade dos compostos ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas foram incubadas com diferentes concentraccedilotildees dos compostos em triplicata num
volume de 200 microL de meio de cultura por poccedilo na presenccedila de 1 de SFB Os controles natildeo
tratados apresentaram adiccedilatildeo de 200 microL de meio de cultura As ceacutelulas foram entatildeo incubadas
durante 72 horas O meio foi removido e 28 microL de soluccedilatildeo de 5 mg mL MTT (brometo de 3-
21
[45-dimetil-tiazol-2-il]-25 difeniltertrazoacutelio) foi adicionado a cada poccedilo As placas foram re-
incubadas durante 1 hora e 30 minutos e entatildeo 122 microL de DMSO foi adicionado a cada poccedilo e
placas foram agitadas suavemente durante 15 minutos para dissolver os cristais de formazan
A absorbacircncia foi lida em um equipamento leitor de placas Victor X3 (PerkinElmer) a 490
nm A concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC 50) foi definida como a concentraccedilatildeo da amostra que
reduziu a viabilidade celular de 50 em comparaccedilatildeo com controles natildeo tratados Os dados
foram analisados utilizando o programa Prisma
45 Avaliaccedilatildeo da viabilidade e crescimento celular por exclusatildeo de azul de tripan
Ceacutelulas BHK-21 foram cultivadas em placas de 24 poccedilos (7x104 ceacutelulaspoccedilo) e apoacutes
24 horas foram tratadas com as concentraccedilotildees de uso de cada composto e incubadas por 72
horas na presenccedila de 1 de SFB A seguir as ceacutelulas foram tripsinizadas e incubadas com
azul de tripan e entatildeo foi utilizado um contador automatizado de ceacutelulas (Countess II FL
Automated Cell Counter ndash Thermo Fisher Scientific) para contagem das ceacutelulas e avaliaccedilatildeo da
porcentagem de viabilidade e diacircmetro celular do controle nos tempos de 0 24 e 96 horas e
avaliaccedilatildeo dos mesmos paracircmetros para os compostos no tempo de 96 horas (72 horas poacutes
tratamento)
Outra curva de multiplicaccedilatildeo celular foi feita para os compostos A1 A3 A4 e A5 onde as
ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos no momento da confecccedilatildeo da placa e
foram avaliados os mesmos paracircmetros nos tempos de 0 12 24 48 e 72 horas O
equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
46 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
Para determinar a menor Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) responsaacutevel pela letalidade
celular total 2x104 de ceacutelulas BHK-21 foram semeadas em placa de 96 poccedilos Apoacutes a
incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o
meio de cultura foi removido e as ceacutelulas foram expostas a diferentes diluiccedilotildees dos dois
sorotipos de DENV (100 microL de cada diluiccedilatildeo + 100 microL de meio DEMEM 1 SFB) As
diluiccedilotildees seriadas foram realizadas da suspensatildeo viral na razatildeo de 5 para o primeiro poccedilo e de
2 para os demais poccedilos Apoacutes 72 horas as ceacutelulas foram entatildeo fixadas com 200 microL de soluccedilatildeo
22
formalina a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo 1 (pv) de cristal violeta em
PBS para avaliaccedilatildeo da maior diluiccedilatildeo responsaacutevel pela letalidade de 100 das ceacutelulas
47 Ensaio Dose-resposta
Para cada composto foram realizados ensaios de dose-resposta para definiccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de cada composto capaz de promover a reduccedilatildeo na produccedilatildeo viral A atividade
antiviral foi avaliada tambeacutem pelo meacutetodo de MTT Ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas expostas a diferentes concentraccedilotildees dos extratos determinadas a partir das maiores
concentraccedilotildees em que natildeo foram observados efeitos citotoacutexicos As ceacutelulas foram tratadas
com as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de cada composto e em seguida infectadas com DENV
1 (MOI= 5) ou 2 (MOI= 2) Mantendo uma coluna para controle com DMSO uma coluna
para controle de viacuterus uma coluna para controle de citotoxicidade dos compostos e por fim
uma coluna para controle celular As ceacutelulas foram entatildeo incubadas durante 72 horas Apoacutes
este tempo procedeu-se a leitura pelo ensaio de MTT como descrito anteriormente Os dados
foram analisados levando-se em consideraccedilatildeo a leitura das absorbacircncias dos poccedilos dos
controles de viacuterus e do controle celular
Para realizacao destes experimentos os seguintes controles foram adotados
Controle de ceacutelulas poccedilos contendo somente ceacutelulas acrescidas do meio de cultura DMEM
1 SFB Utilizado para avaliar o comportamento das ceacutelulas sem que as mesmas tivessem
contato com qualquer interferente durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo Com isso os poccedilos
reservados para esse controle serviram de padratildeo para comparaccedilatildeo com aqueles em que fosse
observada atividade citotoacutexica ou citopaacutetica
Controle de viacuterus poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM 1 SFB
sem nenhum tratamento e de suspensatildeo de viacuterus Utilizando como referecircncia para anaacutelise da
atividade citopaacutetica provocada pelo viacuterus testado durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo das placas
23
Controle de viacuterus com DMSO Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura
DMEM 1 SFB e DMSO Foi utilizado para avaliar se havia influecircncia prejudicial do
solvente utilizado para diluiccedilatildeo das amostras no meio de cultivo das ceacutelulas e se o mesmo
poderia apresentar alguma potencial atividade antiviral aparente
Controle de citotoxicidade Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM
1 SFB e as quatro principais concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos Foi utilizado
para avaliar se haveria alguma possiacutevel atividade citotoacutexica das concentraccedilotildees dos compostos
em relaccedilatildeo agraves ceacutelulas
48 Ensaio Virucida
Para a realizaccedilatildeo deste ensaio aliacutequotas de 950 microL (diluiccedilatildeo de 20 vezes) do DENV 1 (tiacutetulo
6 x 107 UFPmL) foram incubadas com 50 microL de uma soluccedilatildeo de meio DMEM preparada
com 20x a concentraccedilatildeo natildeo citotoacutexica de cada composto A1 a A8 em banho-maria 37deg C
por 1 hora Apoacutes a incubaccedilatildeo as aliacutequotas foram imediatamente tituladas em ceacutelulas BHK-21
em placas de 6 poccedilos utilizando-se 3 diluiccedilotildees para cada incubaccedilatildeo (20x 20 x 10-1
e 20 x 10-
2) Foram titulados tambeacutem uma aliacutequota incubada apenas com meio DMEM sem nenhum
tratamento e outra aliacutequota incubada com DMSO (Dimetilsulfoacutexido) Estas foram tituladas
utilizando um controle e mais cinco diluiccedilotildees (20x 20 x 10-1
20 x 10-2
20 x 10-3
e 20 x 10-4
)
49 Ensaio antiviral
Neste ensaio ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em placas de 24 poccedilos no dia
seguinte foram tratadas durante 4 horas com as concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas de cada
composto em duplicata Apoacutes o preacute-tratamento as monocamadas foram infectadas com
DENV-1 a uma MOI=5 na presenccedila das concentraccedilotildees de uso respectivas de cada composto
Apoacutes 1 hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus as monocamadas foram lavadas duas vezes com PBS e
foi adicionado 500 microL por poccedilo de meio preparado com as mesmas concentraccedilotildees dos
diferentes compostos e mantidos durante 48 horas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5 Em
quatro poccedilos as ceacutelulas foram infectadas e natildeo tratadas e em outros quatro poccedilos as ceacutelulas
natildeo foram tratadas e nem infectadas (controle de ceacutelulas) destes uacuteltimos dois foram
tripsinizados e contados no momento da infecccedilatildeo e os outros dois apoacutes o teacutermino do ensaio
24
para avaliar o crescimento celular Decorridas as 48 horas o sobrenadante foi coletado e
centrifugado por 10 minutos a 4000 xG para separaccedilatildeo dos debris celulares e prontamente
titulado em placa de 6 poccedilos
410 Anaacutelise estatiacutestica
Os valores de CC50 foram obtidos a partir de anaacutelise de regressatildeo linear das curvas de
concentraccedilatildeocitotoxicidade A anaacutelise estatiacutestica dos dados foi realizada pelo programa
GraphPad Prism software Uma anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi utilizada para determinar
as diferenccedilas estatiacutesticas seguida do poacutes teste de Tukey A significacircncia estatiacutestica foi fixada
em p lt005
25
V RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
26
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Ensaio de citotoxicidade celular
Para avaliar a viabilidade da linhagem celular BHK-21 frente ao tratamento com oito
diferentes concentraccedilotildees dos compostos (A1 a A8) realizou-se um ensaio de MTT (brometo
de 3-[45-dimetil-tiazol-2-il]-25-difeniltetrazoacutelio) Este ensaio tem o objetivo de quantificar
espectrofotometricamente o crescimento celular a viabilidade e proliferaccedilatildeo podendo ser
utilizado como um indicador direto de citotoxicidade Trata-se de um ensaio colorimeacutetrico
para medir a atividade da redutase mitocondrial em ceacutelulas vivas Ele se baseia na reduccedilatildeo do
sal amarelo tetrazoacutelio (permeaacutevel agrave membrana celular) para cristais de formazan azuis
puacuterpura por ceacutelulas metabolicamente ativas a quantidade de formazan gerada medida por
espectrofotometria eacute proporcional ao nuacutemero de ceacutelulas viaacuteveis
A CC50 foi calculada plotando-se uma curva de porcentagem de viabilidade celular por
concentraccedilatildeo melhor representada na figura 7 pelo composto A7 e os resultados de CC50
para todos os compostos estatildeo representados na tabela 2 Foram feitos ensaios de
citotoxicidade com oito concentraccedilotildees diferentes sendo escolhida a maior concentraccedilatildeo que
natildeo apresentou citotoxicidade
Viabilidade Celular = [ ( A ndash B ) A ] x 100
Onde
A = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas natildeo tratadas
B = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas tratadas com
as respectivas concentraccedilotildees de cada composto
27
28
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (A curva dose resposta do composto A7 eacute a que
melhor representa a curva dose resposta esperada) Avaliou-se a viabilidade da linhagem
celular BHK-21 frente agrave diferentes concentraccedilotildees dos compostos realizando o ensaio de MTT
e determinando assim as concentraccedilotildees a serem utilizadas nos proacuteximos ensaios bem como
calculando a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) agrave partir da curva
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo
da concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50)
Composto Concentraccedilatildeo utilizada
[ ] microgmL
Concentraccedilatildeo citotoacutexica 50
(CC50) [ ] microgmL plusmn Desvio
Padratildeo
A1 ([ ]=1 mgmL) 00200 10010 plusmn 0014
A2 ([ ]=1 mgmL) 00025 09561 plusmn 0023
A3 ([ ]=1 mgmL) 00025 09988 plusmn 0017
A4 ([ ]=5 mgmL) 00125 10150 plusmn 0036
A5 ([ ]=10 mgmL) 00250 10590 plusmn 0047
A6 ([ ]=5 mgmL) 00250 08183 plusmn 0030
A7 ([ ]=5 mgmL) 00125 10280 plusmn 0052
A8 ([ ]=5 mgmL) 00125 09758 plusmn 0036
52 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan
Para corroborar o ensaio anterior de citotoxicidade utilizou -se o teste de viabilidade
celular pela teacutecnica da exclusatildeo do azul de tripan com a finalidade de determinar a
viabilidade das ceacutelulas Os procedimentos adotados no ensaio seguiram o manual do
equipamento contador automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL Automated Cell Counter) entatildeo
foi acrescentado agrave 10 microL da suspensatildeo celular 10 microL de azul de tripan (04) Apoacutes
homogeneizaccedilatildeo 10 microL da suspensatildeo foi colocada no local indicado da lacircmina proacutepria para
leitura e foi realizada a contagem sendo consideradas mortas (inviaacuteveis) as ceacutelulas que
incorporavam o corante e viaacuteveis as que excluiacuteam o azul de tripan
29
O equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
(A)
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan A avaliaccedilatildeo da
viabilidade celular foi realizada atraveacutes de um contador automaacutetico de ceacutelulas Este
equipamento possibilita explorar ferramentas de fotografia e avaliar alguns paracircmetros
importantes (A) fotografia das ceacutelulas (B) Zoom na fotografia das ceacutelulas com marcaccedilotildees
(em verde para ceacutelulas vivas e vermelho para mortas) e (D) contagem das ceacutelulas totais
ceacutelulas vivas e mortas graacutefico e meacutedia dos diacircmetros celulares das ceacutelulas vivas e mortas
(B)
(C)
30
O crescimento celular de ceacutelulas natildeo tratadas foi avaliado nos tempos de 0h (momento
da confecccedilatildeo da placa) 24h (momento de tratamento com os compostos) e 96 horas
(Momento em que todas as ceacutelulas foram tripsinizadas e contadas) para avaliar o perfil do
crescimento celular em ceacutelulas natildeo tratadas Foi observado um crescimento celular no periacuteodo
de 24 horas onde as ceacutelulas estavam incubadas com meio acrescido de 10 SFB Em 24
horas o meio foi trocado por 1 SFB e acrescido das substacircncias testes nas menores diluiccedilotildees
natildeo citotoacutexicas determinadas pelo ensaio do MTT Em 96 horas pode ser observado um
decaimento no nuacutemero de ceacutelulas vivas provavelmente devido ao crescimento celular (morte
por confluecircncia)
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas)
(A) (B)
31
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas (A)
Contagem de ceacutelulas vivas (B) Percentual de ceacutelulas viaacuteveis (Viabilidade celular ) e (C)
Meacutedia do diacircmetro apresentado pelas ceacutelulas vivas
Em 96 horas as ceacutelulas natildeo tratadas bem como as ceacutelulas tratadas por 72 horas com as
concentraccedilotildees de uso dos compostos foram tripsinizadas e avaliadas quanto ao nuacutemero de
ceacutelulas vivas viabilidade e diacircmetro celular apresentados na figura 10
Segundo se observa natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo aparente que possa demonstrar que
as concentraccedilotildees de uso dos compostos tenham causado alguma atividade citotoacutexica
corroborando assim os ensaios de citotoxicidade anteriores
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
A infectividade de um viacuterus depende de vaacuterios fatores entre eles da proporccedilatildeo de
partiacuteculas virais completas ou infecciosas da suscetibilidade da ceacutelula hospedeira e da
chance desta partiacutecula encontrar o receptor e penetrar na ceacutelula Quando ceacutelulas suscetiacuteveis
satildeo misturadas com uma suspensatildeo de viacuterus estas podem receber uma duas trecircs ou dez
partiacuteculas virais ou nenhuma Isto depende da proporccedilatildeo entre a quantidade de viacuterus
infecciosos presente no inoculo e a quantidade de ceacutelulas utilizada Esta relaccedilatildeo eacute denominada
de multiplicidade de infecccedilatildeo ou MOI Uma MOI=1 indica que a infecccedilatildeo foi feita em
principio com 1 viacuterus ou 1 dose infectante por ceacutelula
A determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo dos Dengue virus 1 e 2 a serem
utilizadas nos proacuteximos ensaios foi feita a partir da infecccedilatildeo de ceacutelulas BHK-21 por diferentes
(C)
32
concentraccedilotildees de viacuterus e revelaccedilatildeo com cristal violeta Escolheu-se a maior diluiccedilatildeo viral que
possibilitou a letalidade total das ceacutelulas (faixa onde todas as ceacutelulas estatildeo mortas utilizando
menor concentraccedilatildeo de viacuterus) As faixas escolhidas foram entatildeo calculadas levando-se em
consideraccedilatildeo o nuacutemero de ceacutelulas presentes no poccedilo e o nuacutemero de partiacuteculas virais que foram
adicionadas (Faixa3 para DENV2 e 2 para DENV1) Figura 11 Foi estipulado portanto a
Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 2 para DENV 2 e 5 para DENV 1
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI A partir da infecccedilatildeo da linhagem celular BHK-21 em
placa de 96 poccedilos com diferentes diluiccedilotildees de DENV foi determinado que a Multiplicidade
de infecccedilatildeo para o Dengue viacuterus sorotipos 1 e 2 seria de 5 e 2 respectivamente (colunas 2 -
DENV1 e 3 - DENV2)
54 Ensaio dose resposta
Apoacutes a determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas ideais realizou-se um
ensaio dose resposta tratando as ceacutelulas com oito concentraccedilotildees agrave partir das concentraccedilotildees natildeo
citotoacutexicas escolhidas para cada composto e em seguida infectando com DENV sorotipos 1 e
2 nas MOIs estipuladas anteriormente (5 e 2 respectivamente) A porcentagem do efeito
protetor conferida agraves ceacutelulas para cada concentraccedilatildeo de amostra testada foi calculada da
seguinte forma
33
EP = [ (A ndash B) (C ndash B) ] x 100
Onde
A Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas tratadas e infectadas
B Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e infectadas
C Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e natildeo infectadas
Este ensaio tem por objetivo identificar a resposta celular agrave infecccedilatildeo frente ao
tratamento com os compostos em diferentes concentraccedilotildees Assim como o ensaio de
toxicidade este ensaio feito utilizando a teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT permite o teste de vaacuterias
concentraccedilotildees diferentes em um menor tempo e com baixo gasto de material
34
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV1
(MOI=5)
35
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV2
(MOI=2)
36
Takegami et al (1998) demonstraram atividade de furanonaftoquinonas contra o viacuterus
da Encefalite Japonesa (Flavivirus) utilizando a concentraccedilatildeo de 3microgmL poreacutem para os
compostos apresentados avaliados pela teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT nenhuma das
concentraccedilotildees apresentadas produziu efeito antiviral significativo em relaccedilatildeo ao controle
celular como observado nas figuras 12 e 13
Apesar da teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT ser interessante como triagem de atividade
antiviral permitindo o teste de vaacuterias concentraccedilotildees dos compostos em menor tempo e
utilizando uma quantidade razoaacutevel de materiais optou-se por utilizar as maiores
concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas encontradas avaliando sua atividade antiviral por outras
teacutecnicas Como natildeo foi avaliada atividade antiviral preacutevia para nenhum dos compostos frente
agrave infecccedilatildeo por DENV1 e 2 foi selecionado o Dengue virus 1 para dar prosseguimento aos
ensaios
55 Ensaio Virucida
O ensaio virucida foi realizado para avaliar um potencial efeito dos compostos
diretamente sobre a partiacutecula viral Este ensaio eacute importante pois possibilita elucidar se o
composto pode produzir algum efeito sobre a partiacutecula viral impedindo que esta possa infectar
as ceacutelulas
Figura 14 Ensaio virucida Neste ensaio as aliacutequotas de DENV1 foram incubadas com as
concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos e titulados (NT) Controle natildeo tratado
37
Tabela 3 Ensaio virucida Caacutelculo do tiacutetulo viral (UFPmL) e porcentagem representante de
cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 254 x 105 100
DMSO 263 x 105 10335
A1 199 x 105 7835
A2 205 x 105 8071
A3 237 x 105 9311
A4 775 x 104 3049
A5 153 x 105 6024
A6 219 x 105 8602
A7 243 x 105 9547
A8 254 x 105 100
Lagrota et al (1988) demonstraram atividade de 2-HO-3-N-benzil-N(N-benzil-2-
etilamina) -14-naftoquinona sobre a partiacutecula viral de enterovirus De forma contraacuteria apesar
de se verificar a reduccedilatildeo de quase uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais
para o composto A4 natildeo considerou-se esta uma alteraccedilatildeo significativa pois devido agrave
magnitude do nuacutemero de UFPs se trata de uma alteraccedilatildeo muito pequena Portanto os
compostos avaliados neste trabalho natildeo produziram atividade virucida aparente frente ao
tratamento com as concentraccedilotildees de uso
56 Ensaio Antiviral
O sobrenadante de ceacutelulas tratadas previamente e infectadas por DENV1 coletado 48
horas poacutes infecccedilatildeo foi avaliado quanto agrave produccedilatildeo viral de partiacuteculas infecciosas pela
contagem de placas de lise e caacutelculo de Unidades Formadoras de Placa (Titulaccedilatildeo viral em
placa ndash UFPmL)
38
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral Sobrenadante de ceacutelulas tratadas e infectadas por DENV1
coletado apoacutes 48 horas e titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado
Tabela 4 Ensaio Antiviral Coleta do sobrenadante de ceacutelulas infectadas por DENV1 Tiacutetulo
viral (UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o
controle natildeo tratado como 100
Ao perceber um aumento no tiacutetulo viral frente ao tratamento com os compostos A1
A2 e A3 e uma reduccedilatildeo frente ao tratamento com A4 A5 e A6 foram escolhidos dois
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 119 x 105 10000
A1 235 x 105 19748
A2 228 x 105 19160
A3 318 x 105 26723
A4 128 x 104 1076
A5 186 x 103 156
A6 190 x 104 1597
A7 280 x 104 2353
A8 350 x 104 2941
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
40
Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
IV
V
LABORATOacuteRIO AUXIacuteLIO
Este trabalho foi realizado no Laboratoacuterio de Biologia e Tecnologia de Micro-organismos ndash
ICEBNUPEBUFOP com auxiacutelio da Coordenadoria de Aperfeiccediloamento de Pessoal de
Niacutevel Superior (CAPES) e Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP)
VI
EPIacuteGRAFE
ldquoA persistecircncia eacute o menor caminho do ecircxitordquo (Charles Chaplin)
ldquoO Senhor eacute meu Pastor e nada me faltaraacute () Ainda que eu andasse pelo
vale da sombra da morte natildeo temeria mal algum porque tu estaacutes comigo
a tua vara e o teu cajado me consolam () Certamente que a bondade e a
misericoacuterdia me seguiratildeo todos os dias da minha vida e habitarei na casa
do Senhor por longos diasrdquo (Salmos 23)
VII
AGRADECIMENTOS
Agradeccedilo primeiramente agrave Deus por ser o meu sustento e proteccedilatildeo
Aos meus pais Antocircnio e Sandra pelas oraccedilotildees esforccedilo carinho e dedicaccedilatildeo
E ao meu irmatildeo Joatildeo Paulo e minha Cunhada Naacutedia pelo apoio e torcida
Ao Prof Dr Breno de Mello Silva e Prof Dr Geraldo Ceacutelio Brandatildeo pela oportunidade e
orientaccedilatildeo durante o desenvolvimento do mestrado
Agrave toda equipe do LBTM em especial a Ana Claudia Cyntia e Erica pelo companheirismo
ajuda e incentivo
Aos meus amigos que fizeram parte de toda esta trajetoacuteria
Aos laboratoacuterios do NUPEB pela permissatildeo e ajuda no uso de diversos equipamentos
Agrave Universidade Federal de Ouro Preto por todas as oportunidades oferecidas
Agrave CAPES pelo apoio financeiro
Agrave todos aqueles que de alguma forma auxiliaram para o desenvolvimento e conclusatildeo deste
trabalho
VIII
RESUMO
O Dengue virus (DENV) possui quatro sorotipos diferentes (1-4) que satildeo principalmente
transmitidos pelo mosquito Aedes aegypti A infecccedilatildeo resulta na patogecircnese da dengue que eacute
uma epidemia de proporccedilotildees globais Apesar dos esforccedilos ainda natildeo existe uma vacina eficaz
contra os quatro sorotipos bem como drogas eficientes no tratamento de pacientes Portanto
vaacuterios estudos tem sido conduzidos na busca de faacutermacos com atividade antiviral contra o
DENV e outros Flavivirus Dentre os compostos estudados para este fim estatildeo as
naftoquinonas metaboacutelitos secundaacuterios produzidos por algas fungos plantas e animais Estes
compostos podem ser extraiacutedos principalmente a partir de plantas do gecircnero Tabebuia
(famiacutelia Bignoniaceae) satildeo caracterizados por apresentar atividade antiviral destacando-se a
szlig-lapachona potente inibidor da enzima transcriptase reversa dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria
(AMV) e leucemia murina de Rauscher (RLV) O objetivo deste trabalho foi testar oito
diferentes compostos derivados de naftoquinonas sinteacuteticas e naturais com potencial atividade
antiviral contra DENV Para isso uma triagem foi realizada por reduccedilatildeo de MTT (brometo de
3- (45-dimetiltiazol-2-il) -25-brometo difenil tetrazolina) para avaliar a atividade citotoacutexica
de oito compostos na linhagem celular BHK-21 resultando no caacutelculo da concentraccedilatildeo
citotoacutexica 50 (CC50) e as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas a serem utilizada em testes
subsequentes para os compostos A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 e A8 (lapachol β-lapachona 2-
Hidroxi-3-(ββ-dimetilvinil)-14-naftoquinona 2-Cloro-14-naftoquinona e 4 derivados de
lapachol) Em seguida ceacutelulas BHK-21 foram incubadas com os compostos em concentraccedilotildees
natildeo citotoacutexicas em diferentes diluiccedilotildees e infectadas com os sorotipos 1 e 2 DENV na
multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 5 e 2 para os sorotipos 1 e 2 respectivamente A
atividade antiviral foi testada atraveacutes da anaacutelise de reduccedilatildeo de MTT e pela titulaccedilatildeo de virus
liberados no sobrenadante Apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute
uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes
faacutermacos natildeo demonstraram atividade antiviral nas condiccedilotildees experimentais testadas
IX
ABSTRACT
The Dengue virus (DENV) has four different serotypes (1-4) that are primarily transmitted by
the mosquito Aedes aegypti Infection results in the pathogenesis of dengue which is an
epidemic of global proportions Despite these efforts there is still no effective vaccine against
the four serotypes as well as efficient drugs in the treatment of patients Therefore various
studies have been conducted in the search for drugs with antiviral activity against DENV and
other flaviviruses Among the studied compounds for this purpose are the naphthoquinones
secondary metabolites produced by algae fungi plants and animals These compounds can be
mainly extracted from plants of the genus Tabebuia (Bignoniaceae) are characterized by
having antiviral activity especially the szlig-lapachone potent inhibitor of the enzyme reverse
transcriptase of avian myeloblastosis virus (AMV) and murine leukemia Rauscher (RLV)
The aim of this study was to test eight different compounds derived from synthetic and
natural naphthoquinones with potential antiviral activity against DENV For this a screening
was performed by reduction of MTT (3- (45-dimethylthiazol-2-yl) -25-diphenyl bromide
tetrazolina) to assess the cytotoxic activity of the compounds eight BHK-21 cell line resulting
in the calculation of the cytotoxic concentration 50 (CC50) and non-cytotoxic
concentrations to be used in subsequent tests for compounds A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 and
A8 (lapachol β-lapachone 2-hydroxy -3- (β β-dimethylvinyl) -14-naphthoquinone 2-
chloro-14-naphthoquinone and derivatives lapachol 4) Then BHK-21 cells were incubated
with compounds at non-cytotoxic concentrations in different dilutions and infected with
serotypes 1 and 2 DENV at multiplicity of infection (MOI) of 5 and 2 for serotypes 1 and 2
respectively The antiviral activity was assayed by MTT reduction assay and the virus titer
released into the supernatant Although some compounds have shown reduced to one log unit
in the number of viral particles results indicate that these drugs did not show antiviral activity
in experimental conditions
X
SUMAacuteRIO
RESUMO VIII
ABSTRACT IX
LISTA DE FIGURAS XII
LISTA DE TABELAS XIII
1 INTRODUCcedilAtildeO 2
11 Flavivirus 2
12 Dengue virus 3
13 Epidemiologia 6
14 Naftoquinonas 8
3 OBJETIVOS 16
31 Objetivo Geral 16
32 Objetivos especiacuteficos 16
4 MATERIAL E MEacuteTODOS 18
41 Linhagens celulares 18
411 Ceacutelulas C636 18
412 Ceacutelulas BHK-21 18
42 Viacuterus 18
421 DENV 1 e DENV 2 18
422 Titulaccedilatildeo viral 19
43 Compostos de naftoquinonas 19
44 Ensaio de citotoxicidade 20
45 Avaliaccedilatildeo da viabilidade e crescimento celular por exclusatildeo de azul de tripan 21
46 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) 21
47 Ensaio Dose-resposta 22
48 Ensaio Virucida 23
49 Ensaio antiviral 23
410 Anaacutelise estatiacutestica 24
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO 26
51 Ensaio de citotoxicidade celular 26
52 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan 28
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) 31
54 Ensaio dose resposta 32
XI
55 Ensaio Virucida 36
56 Ensaio Antiviral 37
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao tratamento com
os compostos A1 A3 A4 e A5 40
6 CONCLUSAtildeO 44
7 PERSPECTIVAS 46
8 REFEREcircNCIAS 48
XII
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Estrutura da partiacutecula viral de Dengue viacuterus 4
Figura 2 Ciclo de multiplicaccedilatildeo de DENV 5
Figura 3 Distribuiccedilatildeo geograacutefica da Dengue 7
Figura 4 Estrutura quiacutemica da 12-naftoquinona (1) e 14-naftoquinona (2) 9
Figura 5 Estrutura quiacutemica do Lapachol (1) da α- Lapachona (2) e da β-Lapachona 10
Figura 6 Tabebuia avellanedae 11
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (Exemplo da curva dose resposta do composto A7) 28
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan 29
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas) 30
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas 31
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI 32
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 34
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 35
Figura 14 Ensaio virucida 36
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral 38
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados 39
Figura 17 Curva de crescimento celular 41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular 41
XIII
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Relaccedilatildeo de nome estrutura e coacutedigo dos compostos utilizados 20
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo da
concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) 28
Tabela 3 Ensaio virucida 37
Tabela 4 Ensaio Antiviral 38
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados 39
XIV
LISTA DE ABREVIATURAS
AMV ndash Mielobastose Aviaacuteria viacuterus (Avian Myeloblastosis virus )
CC50 ndash Concentraccedilatildeo Citotoacutexica 50
DENV ndash Dengue virus
DMEM ndash Meio baacutesico modificado por Dulbecco (Dulbeccos Modified Eagle Medium)
DMSO ndash Dimetilsulfoacutexido
ICTV ndash Comitecirc Inernacional de Taxonomia Viral
JEV ndash Viacuterus da Encefalite Japonesa (Japanese Encephalitis virus)
MOI ndash Multiplicidade de infecccedilatildeo viral
NS ndash Proteiacutenas natildeo estruturais
NT ndash Natildeo Tratado
OMS ndash Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede
RE ndash Retiacuteculo endoplasmaacutetico
RLV ndash Viacuterus da Leucemia Murina de Rauscher (Murine leukemia virus)
SFB ndash Soro Fetal Bovino
UFP ndash Unidades formadoras de placas
WNV ndash Viacuterus do Nilo Ocidental (West Nile virus)
YFV ndash Viacuterus da febre amarela (Yellow fever virus)
ZV ndash Zika virus
1
I INTRODUCcedilAtildeO
2
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Flavivirus
O Gecircnero Flavivirus pertencente agrave famiacutelia Flaviviridae inclui 53 espeacutecies
taxonomicamente reconhecidas (ICTV 2016) muitas das quais satildeo importantes patoacutegenos
humanos tais como o Dengue virus (DENV) Yellow fever virus (YFV - viacuterus da febre
amarela ndash protoacutetipo deste gecircnero) Japanese encephalitis virus (JEV - viacuterus da encefalite
japonesa) West Nile virus (WNV - virus do Nilo Ocidental) Zika virus (ZV) entre outros
(Villordo 2016) O nome flavivirus eacute derivado da palavra latina flavus que significa amarelo
significando a icteriacutecia causada pelo YFV Os sintomas da infecccedilatildeo por flavivirus pode variar
de leve febre e mal-estar a encefalite fatal e febre hemorraacutegica (Mukhopadhyay 2005)
Estes viacuterus regulam o metabolismo e a sobrevivecircncia das ceacutelulas infectadas
assegurando a sua proacutepria reproduccedilatildeo e propagaccedilatildeo O viacuterus da dengue tambeacutem provoca a
autofagia uma resposta homeostaacutetica geral que ajuda a ceacutelula infectada sobreviver e produzir
viacuterus (Datan 2016)
Os Flavivirus podem ser agrupados em complexos e sub-complexos antigecircnicos
baseados em criteacuterios soroloacutegicos ou em grupos clados e espeacutecies segundo a sua filogenia
molecular (Lindenbach 2007) A maioria dos membros deste gecircnero satildeo arbovirus (arthropod
borne virus) ou seja satildeo essencialmente transmitidos por Artroacutepodes (Mackenzie 2004)
onde 27 satildeo transmitidos por mosquitos 12 por carrapatos e 14 natildeo possuem vetor
conhecido Os viacuterus transmitidos pela fecircmea do gecircnero Aedes incluem DENV e YFV satildeo
viscerotroacutepicos e possuem primatas como reservatoacuterio natural (Gaunt 2001)
A patogenia da Dengue causada pelo DENV constitui uma das doenccedilas virais mais
importantes em seres humanos transmitidos por insetos e eacute responsaacutevel por cerca de 390
milhotildees de infecccedilotildees por ano O YFV por sua vez causador da febre amarela eacute endecircmico em
vaacuterios paiacuteses do continente Africano e da Ameacuterica do Sul resultando em 200000 casos e
30000 mortes na Aacutefrica mesmo com vacinas eficazes disponiacuteveis Outras doenccedilas causadas
por flaviviacuterus incluem a encefalite do Nilo Ocidental (West Nile virus) e febre Zika (Zika
virus) que satildeo consideradas doenccedilas emergentes com surtos importantes em todo o mundo
(Villordo 2016)
3
12 Dengue virus
Os DENV pertencem ao gecircnero flaviviacuterus e evoluiram em primatas natildeo-humanos a
partir de um ancestral comum Eacute composto por quatro sorotipos antigenicamente distintos
(DENV1-4) que co-circulam por todo o Sudeste da Aacutesia Aacutefrica e Ameacutericas (McArthur 2013)
e em outubro de 2013 foi anunciado um novo sorotipo circulante denominado entatildeo de DENV
5 (Normile 2013) A partiacutecula infecciosa eacute esfeacuterica com 40-50 nm de diacircmetro possuindo
um envelope de lipopolissacariacutedeo O genoma consiste em RNA de fita simples natildeo
segmentado e senso positivo de aproximadamente 11 kb de comprimento e possui uma uacutenica
janela aberta de leitura (start codon) (Guzman 2010) Apoacutes a traduccedilatildeo a uacutenica poliproteiacutena
formada eacute clivada por proteases virais e celulares em trecircs proteiacutenas estruturais que compotildeem
a partiacutecula viral C (capsideo) prM M (membrana e o seu precursor) e E (envelope) e sete
proteiacutenas natildeo estruturais essenciais para a replicaccedilatildeo viral (NS) (NS1 NS2a NS2b NS3
NS4a NS4b e NS5) (Robertson 2009)
A transmissatildeo do viacuterus ocorre atraveacutes da picada por fecircmeas infectadas de mosquitos
do gecircnero Aedes sendo responsaacutevel pelas maiores taxas de doenccedila e mortalidade entre os
membros do gecircnero Flavivirus (Mukhopadhyay 2005) No Brasil o Aedes aegypti eacute o
principal vetor de dengue enquanto o Aedes albopictus atua como um vector secundaacuterio
(Weaver 2010)
O diagnoacutestico soroloacutegico da Dengue se baseia na detecccedilatildeo de niacuteveis elevados de
anticorpos anti-Dengue-IgM ou anti-Dengue-IgG que reconhecem e se ligam ao antiacutegeno de
DENV A Glicoproteiacutena do envelope (E) uma proteiacutena estrutural de DENV eacute o alvo
antigecircnico mais importante destes anticorpos neutralizantes porque estaacute exposta na superfiacutecie
do viacuterus e medeia os receptores de ligaccedilatildeo e fusatildeo da ceacutelula hospedeira (Lee 2015)
Durante a infecccedilatildeo celular os virions de DENV se ligam agrave superfiacutecie da membrana
atraveacutes da glicoproteiacutena do envelope (E) a receptores especiacuteficos e satildeo internalizados por
endocitose Uma vez dentro do endossoma a acidificaccedilatildeo provocada pela ligaccedilatildeo de
lisossomos desencadeia uma trimerizaccedilatildeo irreversiacutevel da proteiacutena E que atua na fusatildeo das
membranas virais e endossomais celulares Apoacutes essa fusatildeo o nucleocapsideo eacute liberado no
citoplasma onde o mesmo eacute desnudado e a replicaccedilatildeo do genoma de RNA e montagem de
partiacuteculas eacute iniciada As partiacuteculas virais imaturas satildeo acumuladas no luacutemen do retiacuteculo
endoplasmaacutetico (RE) Essas partiacuteculas imaturas que contecircm proteiacutenas prM proteiacutena E
membrana lipiacutedica e nuacutecleo capsiacutedeo natildeo pode induzir a fusatildeo da ceacutelula hospedeira ou seja
4
neste estaacutegio elas natildeo satildeo infecciosas (Mukhopadhyay 2005) O processo de maturaccedilatildeo
desses viacuterus ocorre apoacutes a clivagem proteoliacutetica da proteiacutena precursora de membrana (prM)
transformando viacuterus inerte em partiacuteculas infecciosas (Li 2008) Partiacuteculas subvirais satildeo
tambeacutem produzidas no RE mas apenas contecircm as glicoproteiacutenas de membrana fazendo com
que estas partiacuteculas sejam natildeo infecciosas Os viacuterus maduros e as partiacuteculas sub-virais satildeo
liberados da ceacutelula hospedeira por exocitose (Mukhopadhyay 2005)
Na pele o DENV tende a infectar ceacutelulas dendriacuteticas imaturas Estas ceacutelulas infectadas
amadurecem e migram para os gacircnglios linfaacuteticos regionais ou locais onde apresentam
antiacutegenos virais agraves ceacutelulas T iniciando as respostas imunes Existe tambeacutem evidecircncia de
replicaccedilatildeo abundante de DENV em ceacutelulas do parecircnquima do fiacutegado e em macroacutefagos nos
gacircnglios linfaacuteticos fiacutegado e baccedilo bem como em monoacutecitos de sangue perifeacuterico (Guzman
2010)
Proteiacutena E
(diacutemero)
Proteiacutena
M
Proteiacutena C
ssRNA (+)
Figura 1 Estrutura da partiacutecula viral de Dengue viacuterus A partiacutecula viral eacute composta
por trecircs proteiacutenas estruturais proteiacutena de envelope (E) disposta em diacutemeros a proteiacutena
associada agrave membrana (M) e a proteiacutena do nucleocapsiacutedeo (C) O genoma de RNA fita-
simples de polaridade positiva se encontra dentro do nucleocapsiacutedeo (Adaptado de
httpviralzoneexpasyorgviralzoneall_by_species24html)
5
Figura 2 Ciclo de multiplicaccedilatildeo de DENV A Os viacuterus se ligam aos receptores na superfiacutecie da
ceacutelula e satildeo endocitados B Devido ao baixo pH dentro dos endossomas ocorre a fusatildeo de
membranas viral-celular mediada por proteiacutenas virais resultando na liberaccedilatildeo do RNA viral em um
processo chamado de desnudamento C O genoma viral eacute traduzido em uma uacutenica poliproteiacutena que
eacute processada por proteases do viacuterus e da ceacutelula hospedeira D O RNA eacute replicado por proteiacutenas
natildeo-estruturais do proacuteprio viacuterus E A montagem do viacuterus ocorre na membrana do Reticulo
endoplasmaacutetico no qual a proteiacutena do capsiacutedeo e o RNA viral satildeo envolvidos por glicoproteiacutenas e
pela membrana da organela para formar partiacuteculas virais imaturas F Partiacuteculas virais imaturas
utilizam a via secretora da ceacutelula hospedeira e sob o baixo pH do Complexo de Golgi a proteiacutena
precursora prM eacute clivada em proteiacutena M completando a maturaccedilatildeo do viacuterus GOs viacuterus maduros
satildeo entatildeo liberados das ceacutelulas por exocitose Os nuacutemeros indicados nas caixas coloridas referem-se
ao valor de pH dos respectivos compartimentos Imagem adaptada de PERERA 2009
Adsorccedilatildeo
Siacutentese e processamento
Fusatildeo e
Desnudamento
Replicaccedilatildeo do RNA
Montagem
Maturaccedilatildeo
Liberaccedilatildeo de
viacuterus
maduro
A
B
C
D
E
F
G
6
13 Epidemiologia
Ao longo das uacuteltimas deacutecadas a dengue se tornou a doenccedila viral transmitida por
mosquitos mais prevalente no mundo Estimativas de infecccedilatildeo pela OMS indicam que a
patologia eacute endecircmica em mais de 100 paiacuteses em todos os continentes exceto a Antaacutertida e
aflige principalmente paiacuteses pobres em recursos nas regiotildees tropicais e subtropicais (Perry
2011) Epidemias globais de DENV ocorreram ao longo das uacuteltimas deacutecadas em parte devido
agrave diminuiccedilatildeo dos esforccedilos no controle de mosquitos Satildeo estimados mais de 50 milhotildees de
casos de dengue anualmente (Mukhopadhyay 2005)
A Dengue eacute uma doenccedila viral sistecircmica aguda que se estabeleceu em todo o mundo
em ambos os ciclos de transmissatildeo endecircmicas e epidecircmicas A infecccedilatildeo pelo DENV em seres
humanos eacute frequentemente inaparente mas pode levar a uma grande variedade de
manifestaccedilotildees cliacutenicas de febre leve a siacutendrome do choque da dengue potencialmente fatal A
imunidade vitaliacutecia desenvolvida apoacutes a infecccedilatildeo com um dos quatro tipos de viacuterus eacute
especiacutefica para cada tipo e a progressatildeo para uma doenccedila mais grave eacute frequente mas natildeo
exclusivamente relacionada com infecccedilatildeo secundaacuteria por tipos heteroacutelogos No entanto
enquanto a expansatildeo histoacuterica desta doenccedila eacute bem documentada o elevado fardo de
problemas de sauacutede atribuiacuteveis agrave dengue em grande parte do mundo tropical e sub-tropical
permanecem pouco enumerados (Bhatt 2013)
O Brasil eacute um paiacutes de grande extensatildeo (8512000 km2) situado em uma zona
predominantemente tropical com extensas aacutereas de florestas na regiatildeo amazocircnica bem como
restos de uma floresta tropical na costa leste sudeste e sul entre outros ecossistemas A maior
parte do paiacutes tem um clima tropical e uma grande diversidade de plantas e animais portanto
um local adequado para a ocorrecircncia de patologias causadas por viacuterus transmitidos por
artroacutepodes (Figueiredo 2000) Segundo o boletim epidemioloacutegico do ministeacuterio da sauacutede em
2016 jaacute foram registrados 170103 casos provaacuteveis de dengue no paiacutes ateacute a semana
epidemioloacutegica 5 Nesse periacuteodo a regiatildeo Sudeste registrou o maior nuacutemero de casos
provaacuteveis (96664 casos 568) Em Minas Gerais jaacute foram registradas 19 mortes em
decorrecircncia da Dengue entre 1deg de janeiro e 14 de marccedilo deste ano Outros 91 oacutebitos estatildeo
sob investigaccedilatildeo (BRASIL 2016)
7
Figura 3 Distribuiccedilatildeo geograacutefica da Dengue Aacutereas de risco de transmissatildeo em amarelo
(Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede Adaptado de httpwwwwhointen)
As manifestaccedilotildees da doenccedila foram descritas pela primeira vez apoacutes a Segunda Guerra
Mundial coincidente com o aumento da urbanizaccedilatildeo particularmente na Aacutesia (Weaver 2010)
Atualmente o DENV eacute hiperendecircmico em muitas regiotildees tropicais onde 2 ou mais sorotipos
circulam endemicamente Embora DENV foi provavelmente introduzido periodicamente para
as Ameacutericas atraveacutes de navios desde o seacuteculo 17 o surgimento de DENV no Hemisfeacuterio
Ocidental comeccedilou mais tarde devido a uma campanha de sucesso parcial para erradicar o
vetor A aegypti para controlar a febre amarela Esta campanha teve sucesso na maior parte
das Ameacutericas da deacutecada de 1950 agrave deacutecada de 1970 mas foi interrompida O vetor entatildeo
rapidamente recolonizou quase toda a regiatildeo neotropical e subtropicais e a invasatildeo do DENV
seguiu logo depois Em 1985 A albopictus foi introduzido nos EUA e no Brasil
proporcionando um vetor para a transmissatildeo secundaacuteria de DENV nas Ameacutericas (Hawley
1987)
Os mosquitos vetores principalmente A aegypti tornam-se infectados quando eles se
alimentam do sangue de seres humanos durante o periacuteodo de cinco dias da viremia A
infecccedilatildeo produz um amplo espectro da doenccedila cliacutenica e varia de assintomaacutetica a doenccedila febril
auto-limitante A dengue tambeacutem conhecida como ldquofebre osso quebradordquo devido agraves fortes
dores nas articulaccedilotildees e inclui sintomas de febre alta dores musculares articulares e erupccedilatildeo
cutacircnea Uma pequena porcentagem de indiviacuteduos pode apresentar a siacutendrome do choque da
8
dengue (dengue hemorraacutegica) com risco de vida grave O tratamento eacute amplamente favoraacutevel
usando de reidrataccedilatildeo oral ou intravenosa acompanhamento e atenccedilatildeo meacutedica adequada No
entanto uma das principais consequecircncias da doenccedila eacute a sua capacidade de sobrecarregar
instalaccedilotildees meacutedicas durante um surto e em paiacuteses onde os recursos de sauacutede jaacute estatildeo no
limite isso pode ter efeitos catastroacuteficos Prevenccedilatildeo e tratamento portanto se fazem
altamente necessaacuterios (Perry 2011)
A prevalecircncia global de DENV cresceu drasticamente nas uacuteltimas deacutecadas e ateacute o
momento natildeo haacute nenhum medicamento especiacutefico para combater a infecccedilatildeo as medidas de
prevenccedilatildeo mais eficazes satildeo voltadas para o controle do vetor (Silva 2011) Diante disso a
Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) elegeu o desenvolvimento de vacinas contra o viacuterus da
dengue como prioridade mundial (Kinney 2001) Por conseguinte a busca de substacircncias
naturais ou sinteacuteticas com atividade antiviral especiacutefica sem toxicidade para as ceacutelulas
normais em seres humanos eacute uma estrateacutegia desejada para evitar que a dengue se agrave e
ajudar a controlar a difusatildeo da doenccedila As vaacuterias fases do ciclo viral representam alvos
terapecircuticos individuais que podem ser exploradas (Costa 2013) Nesse sentido vaacuterios
grupos de pesquisa e organizaccedilotildees estatildeo trabalhando com diversas abordagens para o
desenvolvimento de compostos antivirais com atividade protetora contra dengue Dentre elas
uma vasta gama de produtos naturais incluindo plantas numa tentativa de isolar e
caracterizar novos compostos que podem inibir a replicaccedilatildeo do viacuterus ou tratar a infecccedilatildeo
viral Por essa razatildeo extratos e componentes da planta satildeo cada vez mais importantes como
fontes potenciais para agentes antivirais (Silva 2011)
14 Naftoquinonas
As quinonas satildeo compostos aromaacuteticos amplamente distribuiacutedos na natureza e podem
ser encontrados em vaacuterias famiacutelias de plantas bem como isolado de fungos algas e
bacteacuterias Elas satildeo classificadas em benzoquinonas antraquinonas e naftoquinonas de acordo
com as suas estruturas quiacutemicas Naftoquinonas satildeo compostos orgacircnicos altamente reativos
utilizados como corantes naturais ou sinteacuteticos cujas cores variam de amarelo para vermelho
Apresentam cadeia carbocircnica similar ao naftaleno e satildeo caracterizadas por seus dois grupos
carbonila na posiccedilatildeo 1 e 4 por isso satildeo nomeadas de 14-naftoquinonas Os grupos carbonila
tambeacutem podem estar presente na posiccedilatildeo 12 com menor incidecircncia (Loacutepez 2014)
9
Figura 4 Estrutura quiacutemica da 12-naftoquinona (1) e 14-naftoquinona (2)
Entre as quinonas estatildeo compostos biologicamente importantes tais como o grupo da
vitamina K e a coenzima Q (ubiquinona) Estes compostos tecircm um papel importante no
metabolismo celular especialmente como carreadores de eleacutetrons Aleacutem de quinonas que
possuam uma funccedilatildeo bioloacutegica outros compostos desta classe tecircm sido encontrados
mostrando atividade antibioacutetica Alguns deles estatildeo presentes na natureza mas a maior parte
satildeo obtidos sinteticamente entre eles 2-hidroxi-3-alquil-14-naftoquinonas que possuem
evidecircncias de serem ativos in vitro contra os parasitas da malaacuteria e como coccidiostaacuteticos
(Ambrogi 1970)
A atividade bioloacutegica de quinonas estaacute muitas vezes relacionada com o seu
comportamento eletroquiacutemico A capacidade de aceitar um ou dois eleacutetrons para formar o
acircnion radical correspondente ou dianion pode ser o motivo da induccedilatildeo da formaccedilatildeo de
espeacutecies reativas de oxigecircnio responsaacuteveis pelo estresse oxidativo nas ceacutelulas A capacidade
de aceitar eleacutetrons de naftoquinonas pode ser alterada por mudanccedilas de posiccedilatildeo do grupo
carbonila (12- 14-naftoquinonas) ou diferentes substituintes ou funccedilotildees associadas agrave porccedilatildeo
de naftoquinona (Francisco 2010)
As naftoquinonas satildeo largamente encontradas em plantas micro-organismos e alguns
animais Estes compostos tecircm sido amplamente utilizados em diversas culturas como corantes
para cosmeacuteticos tecidos alimentos (Brandelli 2004) e para fins medicinais incluindo
antitumoral (Oliveira 1990 Ferreira 1996) anti-inflamatoacuterios antimalaacuterico antiviral
(Fonseca 2003 Hussain 2007) atibacterianos e antifuacutengicos (Nagata 1998) Estas atividades
bioloacutegicas tecircm justificado o grande nuacutemero de trabalhos (aproximadamente 42 ateacute abril 2016
ndash Pubmed) encontrados na literatura que visa a siacutentese e avaliaccedilatildeo de qualquer das quinonas
naturais ou seus anaacutelogos como agentes farmacoloacutegicos potenciais (Rahmoun 2013)
10
O Lapachol foi descoberto e estudado desde o seacuteculo XIX Foi isolado primeiramente
do lenho da aacutervore argentina ldquolapachordquo Tabebuia avellanedae (Bignoniaceae) conhecida
como Ipecirc roxo Os estudos quiacutemicos foram desenvolvidos inicialmente em 1892 (Fonseca
2003) O lapachol foi descrito pela primeira vez por Paterno em 1821 tendo sua estrutura
quiacutemica estabelecida em 1896 por Hooker que o identificou como uma naftoquinona Esta
naftoquinona possui accedilatildeo antiinflamatoacuteria analgeacutesica antibioacutetica e anti-neoplaacutesica
reconhecida (Arauacutejo 2002)
A β-lapachona (34-di-hidro-22-dimetil-2H-naptho [12-b] pirano-56-diona) eacute uma
quinona obtida de fontes naturais derivada da aacutervore Lapacho (Tabebuia avellanedae) nativa
da Ameacuterica do Sul e Central A siacutentese e quiacutemica da β-lapachona e compostos relacionados
foi inicialmente investigado no final do seacuteculo XIX e iniacutecio do seacuteculo XX pelo quiacutemico
Samuel Hooker Apesar de alguns estudos cliacutenicos sobre a bioatividade de naftoquinonas
terem sido relatados no iniacutecio de 1940 foi o relatoacuterio do potencial da β-lapachona como um
agente anti-tripanossoma em 1977 que revitalizou o estudo e caracterizaccedilatildeo deste composto
natural A β-lapachona tambeacutem apresenta vaacuterias accedilotildees farmacoloacutegicas incluindo accedilatildeo
formaccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (Hussain 2007)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do Lapachol (1) da α- Lapachona (2) e da β-
Lapachona (Fonseca et al 2003 Ferreira et al 2010)
11
Figura 6 Tabebuia avellanedae (Hussain 2007)
A β-lapachona eacute uma substacircncia natural facilmente obtida a partir do lapachol Esta
naftoquinona eacute o grande destaque desta classe de substacircncias porque se encontra em testes
cliacutenicos de fase II para o tratamento do cacircncer de pacircncreas (Ferreira 2010) O mecanismo de
accedilatildeo da β-lapachona diferencia-se de outros antineoplaacutesicos por atuar na topoisomerase I
promovendo a recuperaccedilatildeo da capacidade de apoptose celular Alguns estudos reportam sua
accedilatildeo sineacutergica de potenciaccedilatildeo com o Taxolreg
promovendo a inibiccedilatildeo em diferentes pontos de
replicaccedilatildeo celular aleacutem de sua combinaccedilatildeo com outros tratamentos como a aplicaccedilatildeo de
radiaccedilatildeo ionizante (Cunha 2005)
Vaacuterios estudos jaacute foram publicados demonstrando a atividade antiviral de
naftoquinonas naturais e sinteacuteticas A β-lapachona inibe seletivamente a replicaccedilatildeo do viacuterus
HIV-1 atuando na inibiccedilatildeo da enzima LTR117 Da mesma forma este composto eacute um
potente inibidor da enzima transcriptase reversa dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e
leucemia murina de Rauscher (RLV) inibindo tambeacutem a DNA polimerase A accedilatildeo inibitoacuteria
sobre estas enzimas revelou-se especiacutefica se comparada com a de outros inibidores
conhecidos (Silva 2003)
O Lapachol jaacute demonstrou atividade contra certas cepas virais incluindo Herpes virus
tipos I e II Outras naftoquinonas jaacute mostraram eficaacutecia contra cepas de Influenza virus
Poliomielite virus e estomatite vesicular Supotildee-se que o mecanismo de accedilatildeo destas quinonas
seja atraveacutes da inibiccedilatildeo da transcriptase reversa de retroviacuterus e da RNA polimerase Eacute relatado
12
que lapachol diminui a replicaccedilatildeo do viacuterus em seres humanos mas ainda natildeo existem
resultados de testes cliacutenicos disponiacuteveis (Hussain 2007)
Na avaliaccedilatildeo da atividade antiviral do Lapachol in vitro verificou-se que esta
substacircncia eacute ativa contra viacuterus RNA atuando tanto sobre viacuterus envelopados quanto sobre
partiacuteculas sem esta estrutura em concentraccedilotildees de 5 a 10 microgmL e ainda apresentou uma
pequena atividade sobre HSV (Herpes simplex I) e Ad5 (Adeno tipo 5) mas nenhuma
atividade sobre CoxB4 (Coxsackie B4) Em trabalho posterior demonstrou-se que nem o
Lapachol nem diversos dos seus derivados apresentaram atividade antiviral in vitro sobre
Poliovirus tipo 1 Ecovirus 19 e Coxsackie B tipo 4 Apenas os derivados 12-naftoquinonicos
e um intermediaacuterio da siacutentese Hoocker foram ativos contra o Echovirus 19 (Fonseca 2003)
Costa et al (2013) relataram que piranonaftoquinonas isocircmeras do lapachol possuem
atividade de inibiccedilatildeo da replicaccedilatildeo de DENV-2 atuando sobre a atividade da ATPase de NS3
(proteiacutena natildeo estrutural de DENV)
A utilizaccedilatildeo de testes in vitro por meio de ensaios de viabilidade celular constitui o
primeiro passo para a avaliaccedilatildeo da compatibilidade bioloacutegica de uma substacircncia e pode
fornecer elementos importantes para a anaacutelise da biocompatibilidade dos diferentes materiais
Para ser considerado natildeo citotoacutexico no teste de citotoxicidade in vitro um produto natildeo deve
ocasionar a morte das ceacutelulas nem afetar suas funccedilotildees celulares A prova do MTT eacute um dos
indicadores colorimeacutetricos de viabilidade celular mais utilizados sendo capaz de avaliar a
funccedilatildeo celular mitocondrial de acordo com a reduccedilatildeo enzimaacutetica do sal de tetrazoacutelio pelas
desidrogenases mitocondriais nas ceacutelulas viaacutevies (Arauacutejo et al 2008) Supotildee-se que o
mecanismo responsaacutevel pela citotoxicidade apresentada pelas quinonas esteja relacionado
com o estresse oxidativo causado por esses compostos poreacutem a capacidade de alquilaccedilatildeo de
nucleoacutefilos celulares tambeacutem representa correlaccedilatildeo com tais efeitos bioloacutegicos (Goulart
2004)
13
II JUSTIFICATIVA
14
2 JUSTIFICATIVA
Aleacutem do controle do mosquito transmissor e do desenvolvimento de vacinas que tem
sido exaustivamente estudado nos uacuteltimos anos uma alternativa para o combate agrave dengue
seria o desenvolvimento de faacutermacos para reduzir a viremia ou mesmo para controlar a
resposta imune do hospedeiro agrave infecccedilatildeo que tem sido apontada como principal fator de risco
nos casos mais graves Em funccedilatildeo disso o nuacutemero de pesquisas visando o desenvolvimento
de drogas com accedilatildeo antiviral ou com accedilatildeo imunomodulatoacuteria tem aumentado
significativamente As naftoquinonas vecircm ganhando bastante importacircncia na pesquisa de
novas drogas antivirais devido agrave algumas atividades apresentadas A szlig-lapachona-orto-
naftoquinona por exemplo se mostrou um potente inibidor da enzima transcriptase reversa
dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e leucemia murina de Rauscher (RLV)
Diante da inexistecircncia de drogas com accedilatildeo anti DENV e o elevado nuacutemero e casos da
patogenia nos uacuteltimos anos a organizaccedilatildeo mundial da sauacutede classificou a Dengue como uma
epidemia de proporccedilotildees globais e um problema de sauacutede puacuteblica Como as naftoquinonas jaacute
demonstraram na literatura possuir um potencial efeito terapecircutico contra alguns viacuterus eacute
possiacutevel que estes compostos possam apresentar atividade antiviral contra DENV Portanto
este trabalho visou atraveacutes de ensaios de MTT e titulaccedilotildees virais em placa avaliar a potencial
atividade antiviral de oito compostos derivados de naftoquinonas naturais e sinteacuteticas
15
III OBJETIVOS
16
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar oito compostos (2 naturais e 6 sinteacuteticos) derivados de naftoquinonas como potenciais
agentes antivirais em ceacutelulas BHK-21 frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1 e 2
32 Objetivos especiacuteficos
1 Calcular o iacutendice de citotoxicidade e a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) dos compostos
atraveacutes de ensaio de reduccedilatildeo de MTT
2 Avaliar os efeitos dos compostos sobre o crescimento a viabilidade e o volume celular
pela teacutecnica de exclusatildeo do azul de tripan
3 Determinar a multiplicidade de infecccedilatildeo de DENV 1 e 2 a ser utilizada nos ensaios
antivirais
4 Avaliar a atividade antiviral dos compostos frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1
e 2 atraveacutes do ensaio de MTT
5 Verificar um possiacutevel efeito direto dos compostos agraves partiacuteculas virais de Dengue virus
6 Quantificar a produccedilatildeo de partiacuteculas virais infecciosas no sobrenadante de ceacutelulas
infectadas atraveacutes de titulaccedilatildeo viral pela contagem de unidades formadoras de placas
17
IV MATERIAL E MEacuteTODOS
18
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Linhagens celulares
411 Ceacutelulas C636
As ceacutelulas C636 satildeo ceacutelulas de linhagem contiacutenua de larvas de mosquito Aedes
albopictus Estas ceacutelulas foram utilizadas na produccedilatildeo de estoque viral de DENV sorotipos 1
e 2 para isso foram mantidas em meio de cultura Leibovitz-15 (L-15) (Cultilab)
suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (Cultilab) antibioacuteticos (Penicilina 100 UmL
Streptomicina 100 microgmL) e antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL) a 28degC
412 Ceacutelulas BHK-21
As ceacutelulas BHK-21 satildeo fibroblastos de linhagem contiacutenua derivados de rim de hamster
neonato Estas ceacutelulas foram utilizadas para os experimentos in vitro e para as titulaccedilotildees de
DENV 1 e 2 para isso foram mantidas em meio miacutenimo essencial modificado por Dulbecco
ndash DMEM (Cultilab) suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (SFB) com antibioacuteticos
(Penicilina 100 UmL Streptomicina 100 microgmL) e com antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL)
sendo mantidas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5
42 Viacuterus
421 DENV 1 e DENV 2
O Sorotipo 1 do Dengue virus (DENV-1) estirpe Mochizuki foi replicado em ceacutelulas
C636 para gerar estoques de trabalho durante 2 e 5 dias a 28degC O sobrenadante da cultura de
ceacutelulas infectadas foi recolhido e clarificado por centrifugaccedilatildeo a 4000 G durante 10 minutos agrave
4degC e entatildeo foi aliquotado e armazenado a -70 deg C como reserva de viacuterus ateacute agrave sua utilizaccedilatildeo
A replicaccedilatildeo geraccedilatildeo de estoque e titulaccedilatildeo do Sorotipo 2 do Dengue virus (DENV-2)
estirpe Nova Guineacute C ocorreu nos mesmos moldes do DENV-1
19
422 Titulaccedilatildeo viral
Os estoques virais foram diluiacutedos (10-1
a 10-7
) e inoculados em monocamadas de
ceacutelulas BHK-21 implantadas em placas de 6 poccedilos com confluecircncia de aproximadamente
60 (3x105 ceacutelulas por poccedilo) sendo um poccedilo natildeo infectado mantido para controle celular
Apoacutes uma hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus foram adicionados 3 mL de meio DMEM (Cultilab)
suplementado com 15 de SFB e contendo 15 de Carboximetilcelulose (CMC Synth) As
placas foram entatildeo incubadas a 37degC (CO2 a 5) por 96 horas As ceacutelulas foram entatildeo
fixadas com 2 mL de soluccedilatildeo de formol a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo
1 (pv) de cristal violeta em PBS para contagem das placas de lise O tiacutetulo viral foi
expresso atraveacutes do nuacutemero de unidades formadoras de placa por mL (UFPmL) segundo a
formula abaixo representada
Tiacutetulo viral (UFPmL) = N x FC x 10
N = nuacutemero de placas de lise contadas
FC = Fator de correccedilatildeo
= Inverso da diluiccedilatildeo na qual foram contadas as placas de lise
43 Compostos de naftoquinonas
Os compostos utilizados neste estudo foram fornecidos pelo Dr Geraldo Ceacutelio
Brandatildeo do laboratoacuterio de pesquisa da Escola de Farmaacutecia da Universidade Federal de Ouro
Preto
20
Tabela 1 Relaccedilatildeo de nome estrutura e coacutedigo dos compostos utilizados Na tabela estatildeo
presentes a relaccedilatildeo dos nomes dos compostos utilizados neste trabalho bem como sua
estrutura Os coacutedigos representantes de cada composto seratildeo utilizados no decorrer da escrita
Nome do composto Estrutura Coacutedigo
Lapachol
A1
β-lapachona
A2
2-Hidroxi-3-(ββ-dimetilvinil)-14-naftoquinona
A3
2-Cloro-14-naftoquinona
A4
Lapachol derivado 1
A5
Lapachol derivado 2 A6
Lapachol derivado 3 A7
Lapachol derivado 4 A8
44 Ensaio de citotoxicidade
Para avaliar a citotoxicidade dos compostos ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas foram incubadas com diferentes concentraccedilotildees dos compostos em triplicata num
volume de 200 microL de meio de cultura por poccedilo na presenccedila de 1 de SFB Os controles natildeo
tratados apresentaram adiccedilatildeo de 200 microL de meio de cultura As ceacutelulas foram entatildeo incubadas
durante 72 horas O meio foi removido e 28 microL de soluccedilatildeo de 5 mg mL MTT (brometo de 3-
21
[45-dimetil-tiazol-2-il]-25 difeniltertrazoacutelio) foi adicionado a cada poccedilo As placas foram re-
incubadas durante 1 hora e 30 minutos e entatildeo 122 microL de DMSO foi adicionado a cada poccedilo e
placas foram agitadas suavemente durante 15 minutos para dissolver os cristais de formazan
A absorbacircncia foi lida em um equipamento leitor de placas Victor X3 (PerkinElmer) a 490
nm A concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC 50) foi definida como a concentraccedilatildeo da amostra que
reduziu a viabilidade celular de 50 em comparaccedilatildeo com controles natildeo tratados Os dados
foram analisados utilizando o programa Prisma
45 Avaliaccedilatildeo da viabilidade e crescimento celular por exclusatildeo de azul de tripan
Ceacutelulas BHK-21 foram cultivadas em placas de 24 poccedilos (7x104 ceacutelulaspoccedilo) e apoacutes
24 horas foram tratadas com as concentraccedilotildees de uso de cada composto e incubadas por 72
horas na presenccedila de 1 de SFB A seguir as ceacutelulas foram tripsinizadas e incubadas com
azul de tripan e entatildeo foi utilizado um contador automatizado de ceacutelulas (Countess II FL
Automated Cell Counter ndash Thermo Fisher Scientific) para contagem das ceacutelulas e avaliaccedilatildeo da
porcentagem de viabilidade e diacircmetro celular do controle nos tempos de 0 24 e 96 horas e
avaliaccedilatildeo dos mesmos paracircmetros para os compostos no tempo de 96 horas (72 horas poacutes
tratamento)
Outra curva de multiplicaccedilatildeo celular foi feita para os compostos A1 A3 A4 e A5 onde as
ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos no momento da confecccedilatildeo da placa e
foram avaliados os mesmos paracircmetros nos tempos de 0 12 24 48 e 72 horas O
equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
46 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
Para determinar a menor Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) responsaacutevel pela letalidade
celular total 2x104 de ceacutelulas BHK-21 foram semeadas em placa de 96 poccedilos Apoacutes a
incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o
meio de cultura foi removido e as ceacutelulas foram expostas a diferentes diluiccedilotildees dos dois
sorotipos de DENV (100 microL de cada diluiccedilatildeo + 100 microL de meio DEMEM 1 SFB) As
diluiccedilotildees seriadas foram realizadas da suspensatildeo viral na razatildeo de 5 para o primeiro poccedilo e de
2 para os demais poccedilos Apoacutes 72 horas as ceacutelulas foram entatildeo fixadas com 200 microL de soluccedilatildeo
22
formalina a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo 1 (pv) de cristal violeta em
PBS para avaliaccedilatildeo da maior diluiccedilatildeo responsaacutevel pela letalidade de 100 das ceacutelulas
47 Ensaio Dose-resposta
Para cada composto foram realizados ensaios de dose-resposta para definiccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de cada composto capaz de promover a reduccedilatildeo na produccedilatildeo viral A atividade
antiviral foi avaliada tambeacutem pelo meacutetodo de MTT Ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas expostas a diferentes concentraccedilotildees dos extratos determinadas a partir das maiores
concentraccedilotildees em que natildeo foram observados efeitos citotoacutexicos As ceacutelulas foram tratadas
com as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de cada composto e em seguida infectadas com DENV
1 (MOI= 5) ou 2 (MOI= 2) Mantendo uma coluna para controle com DMSO uma coluna
para controle de viacuterus uma coluna para controle de citotoxicidade dos compostos e por fim
uma coluna para controle celular As ceacutelulas foram entatildeo incubadas durante 72 horas Apoacutes
este tempo procedeu-se a leitura pelo ensaio de MTT como descrito anteriormente Os dados
foram analisados levando-se em consideraccedilatildeo a leitura das absorbacircncias dos poccedilos dos
controles de viacuterus e do controle celular
Para realizacao destes experimentos os seguintes controles foram adotados
Controle de ceacutelulas poccedilos contendo somente ceacutelulas acrescidas do meio de cultura DMEM
1 SFB Utilizado para avaliar o comportamento das ceacutelulas sem que as mesmas tivessem
contato com qualquer interferente durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo Com isso os poccedilos
reservados para esse controle serviram de padratildeo para comparaccedilatildeo com aqueles em que fosse
observada atividade citotoacutexica ou citopaacutetica
Controle de viacuterus poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM 1 SFB
sem nenhum tratamento e de suspensatildeo de viacuterus Utilizando como referecircncia para anaacutelise da
atividade citopaacutetica provocada pelo viacuterus testado durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo das placas
23
Controle de viacuterus com DMSO Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura
DMEM 1 SFB e DMSO Foi utilizado para avaliar se havia influecircncia prejudicial do
solvente utilizado para diluiccedilatildeo das amostras no meio de cultivo das ceacutelulas e se o mesmo
poderia apresentar alguma potencial atividade antiviral aparente
Controle de citotoxicidade Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM
1 SFB e as quatro principais concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos Foi utilizado
para avaliar se haveria alguma possiacutevel atividade citotoacutexica das concentraccedilotildees dos compostos
em relaccedilatildeo agraves ceacutelulas
48 Ensaio Virucida
Para a realizaccedilatildeo deste ensaio aliacutequotas de 950 microL (diluiccedilatildeo de 20 vezes) do DENV 1 (tiacutetulo
6 x 107 UFPmL) foram incubadas com 50 microL de uma soluccedilatildeo de meio DMEM preparada
com 20x a concentraccedilatildeo natildeo citotoacutexica de cada composto A1 a A8 em banho-maria 37deg C
por 1 hora Apoacutes a incubaccedilatildeo as aliacutequotas foram imediatamente tituladas em ceacutelulas BHK-21
em placas de 6 poccedilos utilizando-se 3 diluiccedilotildees para cada incubaccedilatildeo (20x 20 x 10-1
e 20 x 10-
2) Foram titulados tambeacutem uma aliacutequota incubada apenas com meio DMEM sem nenhum
tratamento e outra aliacutequota incubada com DMSO (Dimetilsulfoacutexido) Estas foram tituladas
utilizando um controle e mais cinco diluiccedilotildees (20x 20 x 10-1
20 x 10-2
20 x 10-3
e 20 x 10-4
)
49 Ensaio antiviral
Neste ensaio ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em placas de 24 poccedilos no dia
seguinte foram tratadas durante 4 horas com as concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas de cada
composto em duplicata Apoacutes o preacute-tratamento as monocamadas foram infectadas com
DENV-1 a uma MOI=5 na presenccedila das concentraccedilotildees de uso respectivas de cada composto
Apoacutes 1 hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus as monocamadas foram lavadas duas vezes com PBS e
foi adicionado 500 microL por poccedilo de meio preparado com as mesmas concentraccedilotildees dos
diferentes compostos e mantidos durante 48 horas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5 Em
quatro poccedilos as ceacutelulas foram infectadas e natildeo tratadas e em outros quatro poccedilos as ceacutelulas
natildeo foram tratadas e nem infectadas (controle de ceacutelulas) destes uacuteltimos dois foram
tripsinizados e contados no momento da infecccedilatildeo e os outros dois apoacutes o teacutermino do ensaio
24
para avaliar o crescimento celular Decorridas as 48 horas o sobrenadante foi coletado e
centrifugado por 10 minutos a 4000 xG para separaccedilatildeo dos debris celulares e prontamente
titulado em placa de 6 poccedilos
410 Anaacutelise estatiacutestica
Os valores de CC50 foram obtidos a partir de anaacutelise de regressatildeo linear das curvas de
concentraccedilatildeocitotoxicidade A anaacutelise estatiacutestica dos dados foi realizada pelo programa
GraphPad Prism software Uma anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi utilizada para determinar
as diferenccedilas estatiacutesticas seguida do poacutes teste de Tukey A significacircncia estatiacutestica foi fixada
em p lt005
25
V RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
26
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Ensaio de citotoxicidade celular
Para avaliar a viabilidade da linhagem celular BHK-21 frente ao tratamento com oito
diferentes concentraccedilotildees dos compostos (A1 a A8) realizou-se um ensaio de MTT (brometo
de 3-[45-dimetil-tiazol-2-il]-25-difeniltetrazoacutelio) Este ensaio tem o objetivo de quantificar
espectrofotometricamente o crescimento celular a viabilidade e proliferaccedilatildeo podendo ser
utilizado como um indicador direto de citotoxicidade Trata-se de um ensaio colorimeacutetrico
para medir a atividade da redutase mitocondrial em ceacutelulas vivas Ele se baseia na reduccedilatildeo do
sal amarelo tetrazoacutelio (permeaacutevel agrave membrana celular) para cristais de formazan azuis
puacuterpura por ceacutelulas metabolicamente ativas a quantidade de formazan gerada medida por
espectrofotometria eacute proporcional ao nuacutemero de ceacutelulas viaacuteveis
A CC50 foi calculada plotando-se uma curva de porcentagem de viabilidade celular por
concentraccedilatildeo melhor representada na figura 7 pelo composto A7 e os resultados de CC50
para todos os compostos estatildeo representados na tabela 2 Foram feitos ensaios de
citotoxicidade com oito concentraccedilotildees diferentes sendo escolhida a maior concentraccedilatildeo que
natildeo apresentou citotoxicidade
Viabilidade Celular = [ ( A ndash B ) A ] x 100
Onde
A = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas natildeo tratadas
B = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas tratadas com
as respectivas concentraccedilotildees de cada composto
27
28
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (A curva dose resposta do composto A7 eacute a que
melhor representa a curva dose resposta esperada) Avaliou-se a viabilidade da linhagem
celular BHK-21 frente agrave diferentes concentraccedilotildees dos compostos realizando o ensaio de MTT
e determinando assim as concentraccedilotildees a serem utilizadas nos proacuteximos ensaios bem como
calculando a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) agrave partir da curva
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo
da concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50)
Composto Concentraccedilatildeo utilizada
[ ] microgmL
Concentraccedilatildeo citotoacutexica 50
(CC50) [ ] microgmL plusmn Desvio
Padratildeo
A1 ([ ]=1 mgmL) 00200 10010 plusmn 0014
A2 ([ ]=1 mgmL) 00025 09561 plusmn 0023
A3 ([ ]=1 mgmL) 00025 09988 plusmn 0017
A4 ([ ]=5 mgmL) 00125 10150 plusmn 0036
A5 ([ ]=10 mgmL) 00250 10590 plusmn 0047
A6 ([ ]=5 mgmL) 00250 08183 plusmn 0030
A7 ([ ]=5 mgmL) 00125 10280 plusmn 0052
A8 ([ ]=5 mgmL) 00125 09758 plusmn 0036
52 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan
Para corroborar o ensaio anterior de citotoxicidade utilizou -se o teste de viabilidade
celular pela teacutecnica da exclusatildeo do azul de tripan com a finalidade de determinar a
viabilidade das ceacutelulas Os procedimentos adotados no ensaio seguiram o manual do
equipamento contador automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL Automated Cell Counter) entatildeo
foi acrescentado agrave 10 microL da suspensatildeo celular 10 microL de azul de tripan (04) Apoacutes
homogeneizaccedilatildeo 10 microL da suspensatildeo foi colocada no local indicado da lacircmina proacutepria para
leitura e foi realizada a contagem sendo consideradas mortas (inviaacuteveis) as ceacutelulas que
incorporavam o corante e viaacuteveis as que excluiacuteam o azul de tripan
29
O equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
(A)
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan A avaliaccedilatildeo da
viabilidade celular foi realizada atraveacutes de um contador automaacutetico de ceacutelulas Este
equipamento possibilita explorar ferramentas de fotografia e avaliar alguns paracircmetros
importantes (A) fotografia das ceacutelulas (B) Zoom na fotografia das ceacutelulas com marcaccedilotildees
(em verde para ceacutelulas vivas e vermelho para mortas) e (D) contagem das ceacutelulas totais
ceacutelulas vivas e mortas graacutefico e meacutedia dos diacircmetros celulares das ceacutelulas vivas e mortas
(B)
(C)
30
O crescimento celular de ceacutelulas natildeo tratadas foi avaliado nos tempos de 0h (momento
da confecccedilatildeo da placa) 24h (momento de tratamento com os compostos) e 96 horas
(Momento em que todas as ceacutelulas foram tripsinizadas e contadas) para avaliar o perfil do
crescimento celular em ceacutelulas natildeo tratadas Foi observado um crescimento celular no periacuteodo
de 24 horas onde as ceacutelulas estavam incubadas com meio acrescido de 10 SFB Em 24
horas o meio foi trocado por 1 SFB e acrescido das substacircncias testes nas menores diluiccedilotildees
natildeo citotoacutexicas determinadas pelo ensaio do MTT Em 96 horas pode ser observado um
decaimento no nuacutemero de ceacutelulas vivas provavelmente devido ao crescimento celular (morte
por confluecircncia)
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas)
(A) (B)
31
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas (A)
Contagem de ceacutelulas vivas (B) Percentual de ceacutelulas viaacuteveis (Viabilidade celular ) e (C)
Meacutedia do diacircmetro apresentado pelas ceacutelulas vivas
Em 96 horas as ceacutelulas natildeo tratadas bem como as ceacutelulas tratadas por 72 horas com as
concentraccedilotildees de uso dos compostos foram tripsinizadas e avaliadas quanto ao nuacutemero de
ceacutelulas vivas viabilidade e diacircmetro celular apresentados na figura 10
Segundo se observa natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo aparente que possa demonstrar que
as concentraccedilotildees de uso dos compostos tenham causado alguma atividade citotoacutexica
corroborando assim os ensaios de citotoxicidade anteriores
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
A infectividade de um viacuterus depende de vaacuterios fatores entre eles da proporccedilatildeo de
partiacuteculas virais completas ou infecciosas da suscetibilidade da ceacutelula hospedeira e da
chance desta partiacutecula encontrar o receptor e penetrar na ceacutelula Quando ceacutelulas suscetiacuteveis
satildeo misturadas com uma suspensatildeo de viacuterus estas podem receber uma duas trecircs ou dez
partiacuteculas virais ou nenhuma Isto depende da proporccedilatildeo entre a quantidade de viacuterus
infecciosos presente no inoculo e a quantidade de ceacutelulas utilizada Esta relaccedilatildeo eacute denominada
de multiplicidade de infecccedilatildeo ou MOI Uma MOI=1 indica que a infecccedilatildeo foi feita em
principio com 1 viacuterus ou 1 dose infectante por ceacutelula
A determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo dos Dengue virus 1 e 2 a serem
utilizadas nos proacuteximos ensaios foi feita a partir da infecccedilatildeo de ceacutelulas BHK-21 por diferentes
(C)
32
concentraccedilotildees de viacuterus e revelaccedilatildeo com cristal violeta Escolheu-se a maior diluiccedilatildeo viral que
possibilitou a letalidade total das ceacutelulas (faixa onde todas as ceacutelulas estatildeo mortas utilizando
menor concentraccedilatildeo de viacuterus) As faixas escolhidas foram entatildeo calculadas levando-se em
consideraccedilatildeo o nuacutemero de ceacutelulas presentes no poccedilo e o nuacutemero de partiacuteculas virais que foram
adicionadas (Faixa3 para DENV2 e 2 para DENV1) Figura 11 Foi estipulado portanto a
Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 2 para DENV 2 e 5 para DENV 1
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI A partir da infecccedilatildeo da linhagem celular BHK-21 em
placa de 96 poccedilos com diferentes diluiccedilotildees de DENV foi determinado que a Multiplicidade
de infecccedilatildeo para o Dengue viacuterus sorotipos 1 e 2 seria de 5 e 2 respectivamente (colunas 2 -
DENV1 e 3 - DENV2)
54 Ensaio dose resposta
Apoacutes a determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas ideais realizou-se um
ensaio dose resposta tratando as ceacutelulas com oito concentraccedilotildees agrave partir das concentraccedilotildees natildeo
citotoacutexicas escolhidas para cada composto e em seguida infectando com DENV sorotipos 1 e
2 nas MOIs estipuladas anteriormente (5 e 2 respectivamente) A porcentagem do efeito
protetor conferida agraves ceacutelulas para cada concentraccedilatildeo de amostra testada foi calculada da
seguinte forma
33
EP = [ (A ndash B) (C ndash B) ] x 100
Onde
A Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas tratadas e infectadas
B Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e infectadas
C Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e natildeo infectadas
Este ensaio tem por objetivo identificar a resposta celular agrave infecccedilatildeo frente ao
tratamento com os compostos em diferentes concentraccedilotildees Assim como o ensaio de
toxicidade este ensaio feito utilizando a teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT permite o teste de vaacuterias
concentraccedilotildees diferentes em um menor tempo e com baixo gasto de material
34
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV1
(MOI=5)
35
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV2
(MOI=2)
36
Takegami et al (1998) demonstraram atividade de furanonaftoquinonas contra o viacuterus
da Encefalite Japonesa (Flavivirus) utilizando a concentraccedilatildeo de 3microgmL poreacutem para os
compostos apresentados avaliados pela teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT nenhuma das
concentraccedilotildees apresentadas produziu efeito antiviral significativo em relaccedilatildeo ao controle
celular como observado nas figuras 12 e 13
Apesar da teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT ser interessante como triagem de atividade
antiviral permitindo o teste de vaacuterias concentraccedilotildees dos compostos em menor tempo e
utilizando uma quantidade razoaacutevel de materiais optou-se por utilizar as maiores
concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas encontradas avaliando sua atividade antiviral por outras
teacutecnicas Como natildeo foi avaliada atividade antiviral preacutevia para nenhum dos compostos frente
agrave infecccedilatildeo por DENV1 e 2 foi selecionado o Dengue virus 1 para dar prosseguimento aos
ensaios
55 Ensaio Virucida
O ensaio virucida foi realizado para avaliar um potencial efeito dos compostos
diretamente sobre a partiacutecula viral Este ensaio eacute importante pois possibilita elucidar se o
composto pode produzir algum efeito sobre a partiacutecula viral impedindo que esta possa infectar
as ceacutelulas
Figura 14 Ensaio virucida Neste ensaio as aliacutequotas de DENV1 foram incubadas com as
concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos e titulados (NT) Controle natildeo tratado
37
Tabela 3 Ensaio virucida Caacutelculo do tiacutetulo viral (UFPmL) e porcentagem representante de
cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 254 x 105 100
DMSO 263 x 105 10335
A1 199 x 105 7835
A2 205 x 105 8071
A3 237 x 105 9311
A4 775 x 104 3049
A5 153 x 105 6024
A6 219 x 105 8602
A7 243 x 105 9547
A8 254 x 105 100
Lagrota et al (1988) demonstraram atividade de 2-HO-3-N-benzil-N(N-benzil-2-
etilamina) -14-naftoquinona sobre a partiacutecula viral de enterovirus De forma contraacuteria apesar
de se verificar a reduccedilatildeo de quase uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais
para o composto A4 natildeo considerou-se esta uma alteraccedilatildeo significativa pois devido agrave
magnitude do nuacutemero de UFPs se trata de uma alteraccedilatildeo muito pequena Portanto os
compostos avaliados neste trabalho natildeo produziram atividade virucida aparente frente ao
tratamento com as concentraccedilotildees de uso
56 Ensaio Antiviral
O sobrenadante de ceacutelulas tratadas previamente e infectadas por DENV1 coletado 48
horas poacutes infecccedilatildeo foi avaliado quanto agrave produccedilatildeo viral de partiacuteculas infecciosas pela
contagem de placas de lise e caacutelculo de Unidades Formadoras de Placa (Titulaccedilatildeo viral em
placa ndash UFPmL)
38
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral Sobrenadante de ceacutelulas tratadas e infectadas por DENV1
coletado apoacutes 48 horas e titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado
Tabela 4 Ensaio Antiviral Coleta do sobrenadante de ceacutelulas infectadas por DENV1 Tiacutetulo
viral (UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o
controle natildeo tratado como 100
Ao perceber um aumento no tiacutetulo viral frente ao tratamento com os compostos A1
A2 e A3 e uma reduccedilatildeo frente ao tratamento com A4 A5 e A6 foram escolhidos dois
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 119 x 105 10000
A1 235 x 105 19748
A2 228 x 105 19160
A3 318 x 105 26723
A4 128 x 104 1076
A5 186 x 103 156
A6 190 x 104 1597
A7 280 x 104 2353
A8 350 x 104 2941
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
40
Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
V
LABORATOacuteRIO AUXIacuteLIO
Este trabalho foi realizado no Laboratoacuterio de Biologia e Tecnologia de Micro-organismos ndash
ICEBNUPEBUFOP com auxiacutelio da Coordenadoria de Aperfeiccediloamento de Pessoal de
Niacutevel Superior (CAPES) e Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP)
VI
EPIacuteGRAFE
ldquoA persistecircncia eacute o menor caminho do ecircxitordquo (Charles Chaplin)
ldquoO Senhor eacute meu Pastor e nada me faltaraacute () Ainda que eu andasse pelo
vale da sombra da morte natildeo temeria mal algum porque tu estaacutes comigo
a tua vara e o teu cajado me consolam () Certamente que a bondade e a
misericoacuterdia me seguiratildeo todos os dias da minha vida e habitarei na casa
do Senhor por longos diasrdquo (Salmos 23)
VII
AGRADECIMENTOS
Agradeccedilo primeiramente agrave Deus por ser o meu sustento e proteccedilatildeo
Aos meus pais Antocircnio e Sandra pelas oraccedilotildees esforccedilo carinho e dedicaccedilatildeo
E ao meu irmatildeo Joatildeo Paulo e minha Cunhada Naacutedia pelo apoio e torcida
Ao Prof Dr Breno de Mello Silva e Prof Dr Geraldo Ceacutelio Brandatildeo pela oportunidade e
orientaccedilatildeo durante o desenvolvimento do mestrado
Agrave toda equipe do LBTM em especial a Ana Claudia Cyntia e Erica pelo companheirismo
ajuda e incentivo
Aos meus amigos que fizeram parte de toda esta trajetoacuteria
Aos laboratoacuterios do NUPEB pela permissatildeo e ajuda no uso de diversos equipamentos
Agrave Universidade Federal de Ouro Preto por todas as oportunidades oferecidas
Agrave CAPES pelo apoio financeiro
Agrave todos aqueles que de alguma forma auxiliaram para o desenvolvimento e conclusatildeo deste
trabalho
VIII
RESUMO
O Dengue virus (DENV) possui quatro sorotipos diferentes (1-4) que satildeo principalmente
transmitidos pelo mosquito Aedes aegypti A infecccedilatildeo resulta na patogecircnese da dengue que eacute
uma epidemia de proporccedilotildees globais Apesar dos esforccedilos ainda natildeo existe uma vacina eficaz
contra os quatro sorotipos bem como drogas eficientes no tratamento de pacientes Portanto
vaacuterios estudos tem sido conduzidos na busca de faacutermacos com atividade antiviral contra o
DENV e outros Flavivirus Dentre os compostos estudados para este fim estatildeo as
naftoquinonas metaboacutelitos secundaacuterios produzidos por algas fungos plantas e animais Estes
compostos podem ser extraiacutedos principalmente a partir de plantas do gecircnero Tabebuia
(famiacutelia Bignoniaceae) satildeo caracterizados por apresentar atividade antiviral destacando-se a
szlig-lapachona potente inibidor da enzima transcriptase reversa dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria
(AMV) e leucemia murina de Rauscher (RLV) O objetivo deste trabalho foi testar oito
diferentes compostos derivados de naftoquinonas sinteacuteticas e naturais com potencial atividade
antiviral contra DENV Para isso uma triagem foi realizada por reduccedilatildeo de MTT (brometo de
3- (45-dimetiltiazol-2-il) -25-brometo difenil tetrazolina) para avaliar a atividade citotoacutexica
de oito compostos na linhagem celular BHK-21 resultando no caacutelculo da concentraccedilatildeo
citotoacutexica 50 (CC50) e as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas a serem utilizada em testes
subsequentes para os compostos A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 e A8 (lapachol β-lapachona 2-
Hidroxi-3-(ββ-dimetilvinil)-14-naftoquinona 2-Cloro-14-naftoquinona e 4 derivados de
lapachol) Em seguida ceacutelulas BHK-21 foram incubadas com os compostos em concentraccedilotildees
natildeo citotoacutexicas em diferentes diluiccedilotildees e infectadas com os sorotipos 1 e 2 DENV na
multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 5 e 2 para os sorotipos 1 e 2 respectivamente A
atividade antiviral foi testada atraveacutes da anaacutelise de reduccedilatildeo de MTT e pela titulaccedilatildeo de virus
liberados no sobrenadante Apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute
uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes
faacutermacos natildeo demonstraram atividade antiviral nas condiccedilotildees experimentais testadas
IX
ABSTRACT
The Dengue virus (DENV) has four different serotypes (1-4) that are primarily transmitted by
the mosquito Aedes aegypti Infection results in the pathogenesis of dengue which is an
epidemic of global proportions Despite these efforts there is still no effective vaccine against
the four serotypes as well as efficient drugs in the treatment of patients Therefore various
studies have been conducted in the search for drugs with antiviral activity against DENV and
other flaviviruses Among the studied compounds for this purpose are the naphthoquinones
secondary metabolites produced by algae fungi plants and animals These compounds can be
mainly extracted from plants of the genus Tabebuia (Bignoniaceae) are characterized by
having antiviral activity especially the szlig-lapachone potent inhibitor of the enzyme reverse
transcriptase of avian myeloblastosis virus (AMV) and murine leukemia Rauscher (RLV)
The aim of this study was to test eight different compounds derived from synthetic and
natural naphthoquinones with potential antiviral activity against DENV For this a screening
was performed by reduction of MTT (3- (45-dimethylthiazol-2-yl) -25-diphenyl bromide
tetrazolina) to assess the cytotoxic activity of the compounds eight BHK-21 cell line resulting
in the calculation of the cytotoxic concentration 50 (CC50) and non-cytotoxic
concentrations to be used in subsequent tests for compounds A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 and
A8 (lapachol β-lapachone 2-hydroxy -3- (β β-dimethylvinyl) -14-naphthoquinone 2-
chloro-14-naphthoquinone and derivatives lapachol 4) Then BHK-21 cells were incubated
with compounds at non-cytotoxic concentrations in different dilutions and infected with
serotypes 1 and 2 DENV at multiplicity of infection (MOI) of 5 and 2 for serotypes 1 and 2
respectively The antiviral activity was assayed by MTT reduction assay and the virus titer
released into the supernatant Although some compounds have shown reduced to one log unit
in the number of viral particles results indicate that these drugs did not show antiviral activity
in experimental conditions
X
SUMAacuteRIO
RESUMO VIII
ABSTRACT IX
LISTA DE FIGURAS XII
LISTA DE TABELAS XIII
1 INTRODUCcedilAtildeO 2
11 Flavivirus 2
12 Dengue virus 3
13 Epidemiologia 6
14 Naftoquinonas 8
3 OBJETIVOS 16
31 Objetivo Geral 16
32 Objetivos especiacuteficos 16
4 MATERIAL E MEacuteTODOS 18
41 Linhagens celulares 18
411 Ceacutelulas C636 18
412 Ceacutelulas BHK-21 18
42 Viacuterus 18
421 DENV 1 e DENV 2 18
422 Titulaccedilatildeo viral 19
43 Compostos de naftoquinonas 19
44 Ensaio de citotoxicidade 20
45 Avaliaccedilatildeo da viabilidade e crescimento celular por exclusatildeo de azul de tripan 21
46 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) 21
47 Ensaio Dose-resposta 22
48 Ensaio Virucida 23
49 Ensaio antiviral 23
410 Anaacutelise estatiacutestica 24
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO 26
51 Ensaio de citotoxicidade celular 26
52 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan 28
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) 31
54 Ensaio dose resposta 32
XI
55 Ensaio Virucida 36
56 Ensaio Antiviral 37
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao tratamento com
os compostos A1 A3 A4 e A5 40
6 CONCLUSAtildeO 44
7 PERSPECTIVAS 46
8 REFEREcircNCIAS 48
XII
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Estrutura da partiacutecula viral de Dengue viacuterus 4
Figura 2 Ciclo de multiplicaccedilatildeo de DENV 5
Figura 3 Distribuiccedilatildeo geograacutefica da Dengue 7
Figura 4 Estrutura quiacutemica da 12-naftoquinona (1) e 14-naftoquinona (2) 9
Figura 5 Estrutura quiacutemica do Lapachol (1) da α- Lapachona (2) e da β-Lapachona 10
Figura 6 Tabebuia avellanedae 11
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (Exemplo da curva dose resposta do composto A7) 28
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan 29
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas) 30
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas 31
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI 32
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 34
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 35
Figura 14 Ensaio virucida 36
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral 38
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados 39
Figura 17 Curva de crescimento celular 41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular 41
XIII
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Relaccedilatildeo de nome estrutura e coacutedigo dos compostos utilizados 20
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo da
concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) 28
Tabela 3 Ensaio virucida 37
Tabela 4 Ensaio Antiviral 38
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados 39
XIV
LISTA DE ABREVIATURAS
AMV ndash Mielobastose Aviaacuteria viacuterus (Avian Myeloblastosis virus )
CC50 ndash Concentraccedilatildeo Citotoacutexica 50
DENV ndash Dengue virus
DMEM ndash Meio baacutesico modificado por Dulbecco (Dulbeccos Modified Eagle Medium)
DMSO ndash Dimetilsulfoacutexido
ICTV ndash Comitecirc Inernacional de Taxonomia Viral
JEV ndash Viacuterus da Encefalite Japonesa (Japanese Encephalitis virus)
MOI ndash Multiplicidade de infecccedilatildeo viral
NS ndash Proteiacutenas natildeo estruturais
NT ndash Natildeo Tratado
OMS ndash Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede
RE ndash Retiacuteculo endoplasmaacutetico
RLV ndash Viacuterus da Leucemia Murina de Rauscher (Murine leukemia virus)
SFB ndash Soro Fetal Bovino
UFP ndash Unidades formadoras de placas
WNV ndash Viacuterus do Nilo Ocidental (West Nile virus)
YFV ndash Viacuterus da febre amarela (Yellow fever virus)
ZV ndash Zika virus
1
I INTRODUCcedilAtildeO
2
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Flavivirus
O Gecircnero Flavivirus pertencente agrave famiacutelia Flaviviridae inclui 53 espeacutecies
taxonomicamente reconhecidas (ICTV 2016) muitas das quais satildeo importantes patoacutegenos
humanos tais como o Dengue virus (DENV) Yellow fever virus (YFV - viacuterus da febre
amarela ndash protoacutetipo deste gecircnero) Japanese encephalitis virus (JEV - viacuterus da encefalite
japonesa) West Nile virus (WNV - virus do Nilo Ocidental) Zika virus (ZV) entre outros
(Villordo 2016) O nome flavivirus eacute derivado da palavra latina flavus que significa amarelo
significando a icteriacutecia causada pelo YFV Os sintomas da infecccedilatildeo por flavivirus pode variar
de leve febre e mal-estar a encefalite fatal e febre hemorraacutegica (Mukhopadhyay 2005)
Estes viacuterus regulam o metabolismo e a sobrevivecircncia das ceacutelulas infectadas
assegurando a sua proacutepria reproduccedilatildeo e propagaccedilatildeo O viacuterus da dengue tambeacutem provoca a
autofagia uma resposta homeostaacutetica geral que ajuda a ceacutelula infectada sobreviver e produzir
viacuterus (Datan 2016)
Os Flavivirus podem ser agrupados em complexos e sub-complexos antigecircnicos
baseados em criteacuterios soroloacutegicos ou em grupos clados e espeacutecies segundo a sua filogenia
molecular (Lindenbach 2007) A maioria dos membros deste gecircnero satildeo arbovirus (arthropod
borne virus) ou seja satildeo essencialmente transmitidos por Artroacutepodes (Mackenzie 2004)
onde 27 satildeo transmitidos por mosquitos 12 por carrapatos e 14 natildeo possuem vetor
conhecido Os viacuterus transmitidos pela fecircmea do gecircnero Aedes incluem DENV e YFV satildeo
viscerotroacutepicos e possuem primatas como reservatoacuterio natural (Gaunt 2001)
A patogenia da Dengue causada pelo DENV constitui uma das doenccedilas virais mais
importantes em seres humanos transmitidos por insetos e eacute responsaacutevel por cerca de 390
milhotildees de infecccedilotildees por ano O YFV por sua vez causador da febre amarela eacute endecircmico em
vaacuterios paiacuteses do continente Africano e da Ameacuterica do Sul resultando em 200000 casos e
30000 mortes na Aacutefrica mesmo com vacinas eficazes disponiacuteveis Outras doenccedilas causadas
por flaviviacuterus incluem a encefalite do Nilo Ocidental (West Nile virus) e febre Zika (Zika
virus) que satildeo consideradas doenccedilas emergentes com surtos importantes em todo o mundo
(Villordo 2016)
3
12 Dengue virus
Os DENV pertencem ao gecircnero flaviviacuterus e evoluiram em primatas natildeo-humanos a
partir de um ancestral comum Eacute composto por quatro sorotipos antigenicamente distintos
(DENV1-4) que co-circulam por todo o Sudeste da Aacutesia Aacutefrica e Ameacutericas (McArthur 2013)
e em outubro de 2013 foi anunciado um novo sorotipo circulante denominado entatildeo de DENV
5 (Normile 2013) A partiacutecula infecciosa eacute esfeacuterica com 40-50 nm de diacircmetro possuindo
um envelope de lipopolissacariacutedeo O genoma consiste em RNA de fita simples natildeo
segmentado e senso positivo de aproximadamente 11 kb de comprimento e possui uma uacutenica
janela aberta de leitura (start codon) (Guzman 2010) Apoacutes a traduccedilatildeo a uacutenica poliproteiacutena
formada eacute clivada por proteases virais e celulares em trecircs proteiacutenas estruturais que compotildeem
a partiacutecula viral C (capsideo) prM M (membrana e o seu precursor) e E (envelope) e sete
proteiacutenas natildeo estruturais essenciais para a replicaccedilatildeo viral (NS) (NS1 NS2a NS2b NS3
NS4a NS4b e NS5) (Robertson 2009)
A transmissatildeo do viacuterus ocorre atraveacutes da picada por fecircmeas infectadas de mosquitos
do gecircnero Aedes sendo responsaacutevel pelas maiores taxas de doenccedila e mortalidade entre os
membros do gecircnero Flavivirus (Mukhopadhyay 2005) No Brasil o Aedes aegypti eacute o
principal vetor de dengue enquanto o Aedes albopictus atua como um vector secundaacuterio
(Weaver 2010)
O diagnoacutestico soroloacutegico da Dengue se baseia na detecccedilatildeo de niacuteveis elevados de
anticorpos anti-Dengue-IgM ou anti-Dengue-IgG que reconhecem e se ligam ao antiacutegeno de
DENV A Glicoproteiacutena do envelope (E) uma proteiacutena estrutural de DENV eacute o alvo
antigecircnico mais importante destes anticorpos neutralizantes porque estaacute exposta na superfiacutecie
do viacuterus e medeia os receptores de ligaccedilatildeo e fusatildeo da ceacutelula hospedeira (Lee 2015)
Durante a infecccedilatildeo celular os virions de DENV se ligam agrave superfiacutecie da membrana
atraveacutes da glicoproteiacutena do envelope (E) a receptores especiacuteficos e satildeo internalizados por
endocitose Uma vez dentro do endossoma a acidificaccedilatildeo provocada pela ligaccedilatildeo de
lisossomos desencadeia uma trimerizaccedilatildeo irreversiacutevel da proteiacutena E que atua na fusatildeo das
membranas virais e endossomais celulares Apoacutes essa fusatildeo o nucleocapsideo eacute liberado no
citoplasma onde o mesmo eacute desnudado e a replicaccedilatildeo do genoma de RNA e montagem de
partiacuteculas eacute iniciada As partiacuteculas virais imaturas satildeo acumuladas no luacutemen do retiacuteculo
endoplasmaacutetico (RE) Essas partiacuteculas imaturas que contecircm proteiacutenas prM proteiacutena E
membrana lipiacutedica e nuacutecleo capsiacutedeo natildeo pode induzir a fusatildeo da ceacutelula hospedeira ou seja
4
neste estaacutegio elas natildeo satildeo infecciosas (Mukhopadhyay 2005) O processo de maturaccedilatildeo
desses viacuterus ocorre apoacutes a clivagem proteoliacutetica da proteiacutena precursora de membrana (prM)
transformando viacuterus inerte em partiacuteculas infecciosas (Li 2008) Partiacuteculas subvirais satildeo
tambeacutem produzidas no RE mas apenas contecircm as glicoproteiacutenas de membrana fazendo com
que estas partiacuteculas sejam natildeo infecciosas Os viacuterus maduros e as partiacuteculas sub-virais satildeo
liberados da ceacutelula hospedeira por exocitose (Mukhopadhyay 2005)
Na pele o DENV tende a infectar ceacutelulas dendriacuteticas imaturas Estas ceacutelulas infectadas
amadurecem e migram para os gacircnglios linfaacuteticos regionais ou locais onde apresentam
antiacutegenos virais agraves ceacutelulas T iniciando as respostas imunes Existe tambeacutem evidecircncia de
replicaccedilatildeo abundante de DENV em ceacutelulas do parecircnquima do fiacutegado e em macroacutefagos nos
gacircnglios linfaacuteticos fiacutegado e baccedilo bem como em monoacutecitos de sangue perifeacuterico (Guzman
2010)
Proteiacutena E
(diacutemero)
Proteiacutena
M
Proteiacutena C
ssRNA (+)
Figura 1 Estrutura da partiacutecula viral de Dengue viacuterus A partiacutecula viral eacute composta
por trecircs proteiacutenas estruturais proteiacutena de envelope (E) disposta em diacutemeros a proteiacutena
associada agrave membrana (M) e a proteiacutena do nucleocapsiacutedeo (C) O genoma de RNA fita-
simples de polaridade positiva se encontra dentro do nucleocapsiacutedeo (Adaptado de
httpviralzoneexpasyorgviralzoneall_by_species24html)
5
Figura 2 Ciclo de multiplicaccedilatildeo de DENV A Os viacuterus se ligam aos receptores na superfiacutecie da
ceacutelula e satildeo endocitados B Devido ao baixo pH dentro dos endossomas ocorre a fusatildeo de
membranas viral-celular mediada por proteiacutenas virais resultando na liberaccedilatildeo do RNA viral em um
processo chamado de desnudamento C O genoma viral eacute traduzido em uma uacutenica poliproteiacutena que
eacute processada por proteases do viacuterus e da ceacutelula hospedeira D O RNA eacute replicado por proteiacutenas
natildeo-estruturais do proacuteprio viacuterus E A montagem do viacuterus ocorre na membrana do Reticulo
endoplasmaacutetico no qual a proteiacutena do capsiacutedeo e o RNA viral satildeo envolvidos por glicoproteiacutenas e
pela membrana da organela para formar partiacuteculas virais imaturas F Partiacuteculas virais imaturas
utilizam a via secretora da ceacutelula hospedeira e sob o baixo pH do Complexo de Golgi a proteiacutena
precursora prM eacute clivada em proteiacutena M completando a maturaccedilatildeo do viacuterus GOs viacuterus maduros
satildeo entatildeo liberados das ceacutelulas por exocitose Os nuacutemeros indicados nas caixas coloridas referem-se
ao valor de pH dos respectivos compartimentos Imagem adaptada de PERERA 2009
Adsorccedilatildeo
Siacutentese e processamento
Fusatildeo e
Desnudamento
Replicaccedilatildeo do RNA
Montagem
Maturaccedilatildeo
Liberaccedilatildeo de
viacuterus
maduro
A
B
C
D
E
F
G
6
13 Epidemiologia
Ao longo das uacuteltimas deacutecadas a dengue se tornou a doenccedila viral transmitida por
mosquitos mais prevalente no mundo Estimativas de infecccedilatildeo pela OMS indicam que a
patologia eacute endecircmica em mais de 100 paiacuteses em todos os continentes exceto a Antaacutertida e
aflige principalmente paiacuteses pobres em recursos nas regiotildees tropicais e subtropicais (Perry
2011) Epidemias globais de DENV ocorreram ao longo das uacuteltimas deacutecadas em parte devido
agrave diminuiccedilatildeo dos esforccedilos no controle de mosquitos Satildeo estimados mais de 50 milhotildees de
casos de dengue anualmente (Mukhopadhyay 2005)
A Dengue eacute uma doenccedila viral sistecircmica aguda que se estabeleceu em todo o mundo
em ambos os ciclos de transmissatildeo endecircmicas e epidecircmicas A infecccedilatildeo pelo DENV em seres
humanos eacute frequentemente inaparente mas pode levar a uma grande variedade de
manifestaccedilotildees cliacutenicas de febre leve a siacutendrome do choque da dengue potencialmente fatal A
imunidade vitaliacutecia desenvolvida apoacutes a infecccedilatildeo com um dos quatro tipos de viacuterus eacute
especiacutefica para cada tipo e a progressatildeo para uma doenccedila mais grave eacute frequente mas natildeo
exclusivamente relacionada com infecccedilatildeo secundaacuteria por tipos heteroacutelogos No entanto
enquanto a expansatildeo histoacuterica desta doenccedila eacute bem documentada o elevado fardo de
problemas de sauacutede atribuiacuteveis agrave dengue em grande parte do mundo tropical e sub-tropical
permanecem pouco enumerados (Bhatt 2013)
O Brasil eacute um paiacutes de grande extensatildeo (8512000 km2) situado em uma zona
predominantemente tropical com extensas aacutereas de florestas na regiatildeo amazocircnica bem como
restos de uma floresta tropical na costa leste sudeste e sul entre outros ecossistemas A maior
parte do paiacutes tem um clima tropical e uma grande diversidade de plantas e animais portanto
um local adequado para a ocorrecircncia de patologias causadas por viacuterus transmitidos por
artroacutepodes (Figueiredo 2000) Segundo o boletim epidemioloacutegico do ministeacuterio da sauacutede em
2016 jaacute foram registrados 170103 casos provaacuteveis de dengue no paiacutes ateacute a semana
epidemioloacutegica 5 Nesse periacuteodo a regiatildeo Sudeste registrou o maior nuacutemero de casos
provaacuteveis (96664 casos 568) Em Minas Gerais jaacute foram registradas 19 mortes em
decorrecircncia da Dengue entre 1deg de janeiro e 14 de marccedilo deste ano Outros 91 oacutebitos estatildeo
sob investigaccedilatildeo (BRASIL 2016)
7
Figura 3 Distribuiccedilatildeo geograacutefica da Dengue Aacutereas de risco de transmissatildeo em amarelo
(Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede Adaptado de httpwwwwhointen)
As manifestaccedilotildees da doenccedila foram descritas pela primeira vez apoacutes a Segunda Guerra
Mundial coincidente com o aumento da urbanizaccedilatildeo particularmente na Aacutesia (Weaver 2010)
Atualmente o DENV eacute hiperendecircmico em muitas regiotildees tropicais onde 2 ou mais sorotipos
circulam endemicamente Embora DENV foi provavelmente introduzido periodicamente para
as Ameacutericas atraveacutes de navios desde o seacuteculo 17 o surgimento de DENV no Hemisfeacuterio
Ocidental comeccedilou mais tarde devido a uma campanha de sucesso parcial para erradicar o
vetor A aegypti para controlar a febre amarela Esta campanha teve sucesso na maior parte
das Ameacutericas da deacutecada de 1950 agrave deacutecada de 1970 mas foi interrompida O vetor entatildeo
rapidamente recolonizou quase toda a regiatildeo neotropical e subtropicais e a invasatildeo do DENV
seguiu logo depois Em 1985 A albopictus foi introduzido nos EUA e no Brasil
proporcionando um vetor para a transmissatildeo secundaacuteria de DENV nas Ameacutericas (Hawley
1987)
Os mosquitos vetores principalmente A aegypti tornam-se infectados quando eles se
alimentam do sangue de seres humanos durante o periacuteodo de cinco dias da viremia A
infecccedilatildeo produz um amplo espectro da doenccedila cliacutenica e varia de assintomaacutetica a doenccedila febril
auto-limitante A dengue tambeacutem conhecida como ldquofebre osso quebradordquo devido agraves fortes
dores nas articulaccedilotildees e inclui sintomas de febre alta dores musculares articulares e erupccedilatildeo
cutacircnea Uma pequena porcentagem de indiviacuteduos pode apresentar a siacutendrome do choque da
8
dengue (dengue hemorraacutegica) com risco de vida grave O tratamento eacute amplamente favoraacutevel
usando de reidrataccedilatildeo oral ou intravenosa acompanhamento e atenccedilatildeo meacutedica adequada No
entanto uma das principais consequecircncias da doenccedila eacute a sua capacidade de sobrecarregar
instalaccedilotildees meacutedicas durante um surto e em paiacuteses onde os recursos de sauacutede jaacute estatildeo no
limite isso pode ter efeitos catastroacuteficos Prevenccedilatildeo e tratamento portanto se fazem
altamente necessaacuterios (Perry 2011)
A prevalecircncia global de DENV cresceu drasticamente nas uacuteltimas deacutecadas e ateacute o
momento natildeo haacute nenhum medicamento especiacutefico para combater a infecccedilatildeo as medidas de
prevenccedilatildeo mais eficazes satildeo voltadas para o controle do vetor (Silva 2011) Diante disso a
Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) elegeu o desenvolvimento de vacinas contra o viacuterus da
dengue como prioridade mundial (Kinney 2001) Por conseguinte a busca de substacircncias
naturais ou sinteacuteticas com atividade antiviral especiacutefica sem toxicidade para as ceacutelulas
normais em seres humanos eacute uma estrateacutegia desejada para evitar que a dengue se agrave e
ajudar a controlar a difusatildeo da doenccedila As vaacuterias fases do ciclo viral representam alvos
terapecircuticos individuais que podem ser exploradas (Costa 2013) Nesse sentido vaacuterios
grupos de pesquisa e organizaccedilotildees estatildeo trabalhando com diversas abordagens para o
desenvolvimento de compostos antivirais com atividade protetora contra dengue Dentre elas
uma vasta gama de produtos naturais incluindo plantas numa tentativa de isolar e
caracterizar novos compostos que podem inibir a replicaccedilatildeo do viacuterus ou tratar a infecccedilatildeo
viral Por essa razatildeo extratos e componentes da planta satildeo cada vez mais importantes como
fontes potenciais para agentes antivirais (Silva 2011)
14 Naftoquinonas
As quinonas satildeo compostos aromaacuteticos amplamente distribuiacutedos na natureza e podem
ser encontrados em vaacuterias famiacutelias de plantas bem como isolado de fungos algas e
bacteacuterias Elas satildeo classificadas em benzoquinonas antraquinonas e naftoquinonas de acordo
com as suas estruturas quiacutemicas Naftoquinonas satildeo compostos orgacircnicos altamente reativos
utilizados como corantes naturais ou sinteacuteticos cujas cores variam de amarelo para vermelho
Apresentam cadeia carbocircnica similar ao naftaleno e satildeo caracterizadas por seus dois grupos
carbonila na posiccedilatildeo 1 e 4 por isso satildeo nomeadas de 14-naftoquinonas Os grupos carbonila
tambeacutem podem estar presente na posiccedilatildeo 12 com menor incidecircncia (Loacutepez 2014)
9
Figura 4 Estrutura quiacutemica da 12-naftoquinona (1) e 14-naftoquinona (2)
Entre as quinonas estatildeo compostos biologicamente importantes tais como o grupo da
vitamina K e a coenzima Q (ubiquinona) Estes compostos tecircm um papel importante no
metabolismo celular especialmente como carreadores de eleacutetrons Aleacutem de quinonas que
possuam uma funccedilatildeo bioloacutegica outros compostos desta classe tecircm sido encontrados
mostrando atividade antibioacutetica Alguns deles estatildeo presentes na natureza mas a maior parte
satildeo obtidos sinteticamente entre eles 2-hidroxi-3-alquil-14-naftoquinonas que possuem
evidecircncias de serem ativos in vitro contra os parasitas da malaacuteria e como coccidiostaacuteticos
(Ambrogi 1970)
A atividade bioloacutegica de quinonas estaacute muitas vezes relacionada com o seu
comportamento eletroquiacutemico A capacidade de aceitar um ou dois eleacutetrons para formar o
acircnion radical correspondente ou dianion pode ser o motivo da induccedilatildeo da formaccedilatildeo de
espeacutecies reativas de oxigecircnio responsaacuteveis pelo estresse oxidativo nas ceacutelulas A capacidade
de aceitar eleacutetrons de naftoquinonas pode ser alterada por mudanccedilas de posiccedilatildeo do grupo
carbonila (12- 14-naftoquinonas) ou diferentes substituintes ou funccedilotildees associadas agrave porccedilatildeo
de naftoquinona (Francisco 2010)
As naftoquinonas satildeo largamente encontradas em plantas micro-organismos e alguns
animais Estes compostos tecircm sido amplamente utilizados em diversas culturas como corantes
para cosmeacuteticos tecidos alimentos (Brandelli 2004) e para fins medicinais incluindo
antitumoral (Oliveira 1990 Ferreira 1996) anti-inflamatoacuterios antimalaacuterico antiviral
(Fonseca 2003 Hussain 2007) atibacterianos e antifuacutengicos (Nagata 1998) Estas atividades
bioloacutegicas tecircm justificado o grande nuacutemero de trabalhos (aproximadamente 42 ateacute abril 2016
ndash Pubmed) encontrados na literatura que visa a siacutentese e avaliaccedilatildeo de qualquer das quinonas
naturais ou seus anaacutelogos como agentes farmacoloacutegicos potenciais (Rahmoun 2013)
10
O Lapachol foi descoberto e estudado desde o seacuteculo XIX Foi isolado primeiramente
do lenho da aacutervore argentina ldquolapachordquo Tabebuia avellanedae (Bignoniaceae) conhecida
como Ipecirc roxo Os estudos quiacutemicos foram desenvolvidos inicialmente em 1892 (Fonseca
2003) O lapachol foi descrito pela primeira vez por Paterno em 1821 tendo sua estrutura
quiacutemica estabelecida em 1896 por Hooker que o identificou como uma naftoquinona Esta
naftoquinona possui accedilatildeo antiinflamatoacuteria analgeacutesica antibioacutetica e anti-neoplaacutesica
reconhecida (Arauacutejo 2002)
A β-lapachona (34-di-hidro-22-dimetil-2H-naptho [12-b] pirano-56-diona) eacute uma
quinona obtida de fontes naturais derivada da aacutervore Lapacho (Tabebuia avellanedae) nativa
da Ameacuterica do Sul e Central A siacutentese e quiacutemica da β-lapachona e compostos relacionados
foi inicialmente investigado no final do seacuteculo XIX e iniacutecio do seacuteculo XX pelo quiacutemico
Samuel Hooker Apesar de alguns estudos cliacutenicos sobre a bioatividade de naftoquinonas
terem sido relatados no iniacutecio de 1940 foi o relatoacuterio do potencial da β-lapachona como um
agente anti-tripanossoma em 1977 que revitalizou o estudo e caracterizaccedilatildeo deste composto
natural A β-lapachona tambeacutem apresenta vaacuterias accedilotildees farmacoloacutegicas incluindo accedilatildeo
formaccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (Hussain 2007)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do Lapachol (1) da α- Lapachona (2) e da β-
Lapachona (Fonseca et al 2003 Ferreira et al 2010)
11
Figura 6 Tabebuia avellanedae (Hussain 2007)
A β-lapachona eacute uma substacircncia natural facilmente obtida a partir do lapachol Esta
naftoquinona eacute o grande destaque desta classe de substacircncias porque se encontra em testes
cliacutenicos de fase II para o tratamento do cacircncer de pacircncreas (Ferreira 2010) O mecanismo de
accedilatildeo da β-lapachona diferencia-se de outros antineoplaacutesicos por atuar na topoisomerase I
promovendo a recuperaccedilatildeo da capacidade de apoptose celular Alguns estudos reportam sua
accedilatildeo sineacutergica de potenciaccedilatildeo com o Taxolreg
promovendo a inibiccedilatildeo em diferentes pontos de
replicaccedilatildeo celular aleacutem de sua combinaccedilatildeo com outros tratamentos como a aplicaccedilatildeo de
radiaccedilatildeo ionizante (Cunha 2005)
Vaacuterios estudos jaacute foram publicados demonstrando a atividade antiviral de
naftoquinonas naturais e sinteacuteticas A β-lapachona inibe seletivamente a replicaccedilatildeo do viacuterus
HIV-1 atuando na inibiccedilatildeo da enzima LTR117 Da mesma forma este composto eacute um
potente inibidor da enzima transcriptase reversa dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e
leucemia murina de Rauscher (RLV) inibindo tambeacutem a DNA polimerase A accedilatildeo inibitoacuteria
sobre estas enzimas revelou-se especiacutefica se comparada com a de outros inibidores
conhecidos (Silva 2003)
O Lapachol jaacute demonstrou atividade contra certas cepas virais incluindo Herpes virus
tipos I e II Outras naftoquinonas jaacute mostraram eficaacutecia contra cepas de Influenza virus
Poliomielite virus e estomatite vesicular Supotildee-se que o mecanismo de accedilatildeo destas quinonas
seja atraveacutes da inibiccedilatildeo da transcriptase reversa de retroviacuterus e da RNA polimerase Eacute relatado
12
que lapachol diminui a replicaccedilatildeo do viacuterus em seres humanos mas ainda natildeo existem
resultados de testes cliacutenicos disponiacuteveis (Hussain 2007)
Na avaliaccedilatildeo da atividade antiviral do Lapachol in vitro verificou-se que esta
substacircncia eacute ativa contra viacuterus RNA atuando tanto sobre viacuterus envelopados quanto sobre
partiacuteculas sem esta estrutura em concentraccedilotildees de 5 a 10 microgmL e ainda apresentou uma
pequena atividade sobre HSV (Herpes simplex I) e Ad5 (Adeno tipo 5) mas nenhuma
atividade sobre CoxB4 (Coxsackie B4) Em trabalho posterior demonstrou-se que nem o
Lapachol nem diversos dos seus derivados apresentaram atividade antiviral in vitro sobre
Poliovirus tipo 1 Ecovirus 19 e Coxsackie B tipo 4 Apenas os derivados 12-naftoquinonicos
e um intermediaacuterio da siacutentese Hoocker foram ativos contra o Echovirus 19 (Fonseca 2003)
Costa et al (2013) relataram que piranonaftoquinonas isocircmeras do lapachol possuem
atividade de inibiccedilatildeo da replicaccedilatildeo de DENV-2 atuando sobre a atividade da ATPase de NS3
(proteiacutena natildeo estrutural de DENV)
A utilizaccedilatildeo de testes in vitro por meio de ensaios de viabilidade celular constitui o
primeiro passo para a avaliaccedilatildeo da compatibilidade bioloacutegica de uma substacircncia e pode
fornecer elementos importantes para a anaacutelise da biocompatibilidade dos diferentes materiais
Para ser considerado natildeo citotoacutexico no teste de citotoxicidade in vitro um produto natildeo deve
ocasionar a morte das ceacutelulas nem afetar suas funccedilotildees celulares A prova do MTT eacute um dos
indicadores colorimeacutetricos de viabilidade celular mais utilizados sendo capaz de avaliar a
funccedilatildeo celular mitocondrial de acordo com a reduccedilatildeo enzimaacutetica do sal de tetrazoacutelio pelas
desidrogenases mitocondriais nas ceacutelulas viaacutevies (Arauacutejo et al 2008) Supotildee-se que o
mecanismo responsaacutevel pela citotoxicidade apresentada pelas quinonas esteja relacionado
com o estresse oxidativo causado por esses compostos poreacutem a capacidade de alquilaccedilatildeo de
nucleoacutefilos celulares tambeacutem representa correlaccedilatildeo com tais efeitos bioloacutegicos (Goulart
2004)
13
II JUSTIFICATIVA
14
2 JUSTIFICATIVA
Aleacutem do controle do mosquito transmissor e do desenvolvimento de vacinas que tem
sido exaustivamente estudado nos uacuteltimos anos uma alternativa para o combate agrave dengue
seria o desenvolvimento de faacutermacos para reduzir a viremia ou mesmo para controlar a
resposta imune do hospedeiro agrave infecccedilatildeo que tem sido apontada como principal fator de risco
nos casos mais graves Em funccedilatildeo disso o nuacutemero de pesquisas visando o desenvolvimento
de drogas com accedilatildeo antiviral ou com accedilatildeo imunomodulatoacuteria tem aumentado
significativamente As naftoquinonas vecircm ganhando bastante importacircncia na pesquisa de
novas drogas antivirais devido agrave algumas atividades apresentadas A szlig-lapachona-orto-
naftoquinona por exemplo se mostrou um potente inibidor da enzima transcriptase reversa
dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e leucemia murina de Rauscher (RLV)
Diante da inexistecircncia de drogas com accedilatildeo anti DENV e o elevado nuacutemero e casos da
patogenia nos uacuteltimos anos a organizaccedilatildeo mundial da sauacutede classificou a Dengue como uma
epidemia de proporccedilotildees globais e um problema de sauacutede puacuteblica Como as naftoquinonas jaacute
demonstraram na literatura possuir um potencial efeito terapecircutico contra alguns viacuterus eacute
possiacutevel que estes compostos possam apresentar atividade antiviral contra DENV Portanto
este trabalho visou atraveacutes de ensaios de MTT e titulaccedilotildees virais em placa avaliar a potencial
atividade antiviral de oito compostos derivados de naftoquinonas naturais e sinteacuteticas
15
III OBJETIVOS
16
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar oito compostos (2 naturais e 6 sinteacuteticos) derivados de naftoquinonas como potenciais
agentes antivirais em ceacutelulas BHK-21 frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1 e 2
32 Objetivos especiacuteficos
1 Calcular o iacutendice de citotoxicidade e a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) dos compostos
atraveacutes de ensaio de reduccedilatildeo de MTT
2 Avaliar os efeitos dos compostos sobre o crescimento a viabilidade e o volume celular
pela teacutecnica de exclusatildeo do azul de tripan
3 Determinar a multiplicidade de infecccedilatildeo de DENV 1 e 2 a ser utilizada nos ensaios
antivirais
4 Avaliar a atividade antiviral dos compostos frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1
e 2 atraveacutes do ensaio de MTT
5 Verificar um possiacutevel efeito direto dos compostos agraves partiacuteculas virais de Dengue virus
6 Quantificar a produccedilatildeo de partiacuteculas virais infecciosas no sobrenadante de ceacutelulas
infectadas atraveacutes de titulaccedilatildeo viral pela contagem de unidades formadoras de placas
17
IV MATERIAL E MEacuteTODOS
18
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Linhagens celulares
411 Ceacutelulas C636
As ceacutelulas C636 satildeo ceacutelulas de linhagem contiacutenua de larvas de mosquito Aedes
albopictus Estas ceacutelulas foram utilizadas na produccedilatildeo de estoque viral de DENV sorotipos 1
e 2 para isso foram mantidas em meio de cultura Leibovitz-15 (L-15) (Cultilab)
suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (Cultilab) antibioacuteticos (Penicilina 100 UmL
Streptomicina 100 microgmL) e antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL) a 28degC
412 Ceacutelulas BHK-21
As ceacutelulas BHK-21 satildeo fibroblastos de linhagem contiacutenua derivados de rim de hamster
neonato Estas ceacutelulas foram utilizadas para os experimentos in vitro e para as titulaccedilotildees de
DENV 1 e 2 para isso foram mantidas em meio miacutenimo essencial modificado por Dulbecco
ndash DMEM (Cultilab) suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (SFB) com antibioacuteticos
(Penicilina 100 UmL Streptomicina 100 microgmL) e com antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL)
sendo mantidas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5
42 Viacuterus
421 DENV 1 e DENV 2
O Sorotipo 1 do Dengue virus (DENV-1) estirpe Mochizuki foi replicado em ceacutelulas
C636 para gerar estoques de trabalho durante 2 e 5 dias a 28degC O sobrenadante da cultura de
ceacutelulas infectadas foi recolhido e clarificado por centrifugaccedilatildeo a 4000 G durante 10 minutos agrave
4degC e entatildeo foi aliquotado e armazenado a -70 deg C como reserva de viacuterus ateacute agrave sua utilizaccedilatildeo
A replicaccedilatildeo geraccedilatildeo de estoque e titulaccedilatildeo do Sorotipo 2 do Dengue virus (DENV-2)
estirpe Nova Guineacute C ocorreu nos mesmos moldes do DENV-1
19
422 Titulaccedilatildeo viral
Os estoques virais foram diluiacutedos (10-1
a 10-7
) e inoculados em monocamadas de
ceacutelulas BHK-21 implantadas em placas de 6 poccedilos com confluecircncia de aproximadamente
60 (3x105 ceacutelulas por poccedilo) sendo um poccedilo natildeo infectado mantido para controle celular
Apoacutes uma hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus foram adicionados 3 mL de meio DMEM (Cultilab)
suplementado com 15 de SFB e contendo 15 de Carboximetilcelulose (CMC Synth) As
placas foram entatildeo incubadas a 37degC (CO2 a 5) por 96 horas As ceacutelulas foram entatildeo
fixadas com 2 mL de soluccedilatildeo de formol a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo
1 (pv) de cristal violeta em PBS para contagem das placas de lise O tiacutetulo viral foi
expresso atraveacutes do nuacutemero de unidades formadoras de placa por mL (UFPmL) segundo a
formula abaixo representada
Tiacutetulo viral (UFPmL) = N x FC x 10
N = nuacutemero de placas de lise contadas
FC = Fator de correccedilatildeo
= Inverso da diluiccedilatildeo na qual foram contadas as placas de lise
43 Compostos de naftoquinonas
Os compostos utilizados neste estudo foram fornecidos pelo Dr Geraldo Ceacutelio
Brandatildeo do laboratoacuterio de pesquisa da Escola de Farmaacutecia da Universidade Federal de Ouro
Preto
20
Tabela 1 Relaccedilatildeo de nome estrutura e coacutedigo dos compostos utilizados Na tabela estatildeo
presentes a relaccedilatildeo dos nomes dos compostos utilizados neste trabalho bem como sua
estrutura Os coacutedigos representantes de cada composto seratildeo utilizados no decorrer da escrita
Nome do composto Estrutura Coacutedigo
Lapachol
A1
β-lapachona
A2
2-Hidroxi-3-(ββ-dimetilvinil)-14-naftoquinona
A3
2-Cloro-14-naftoquinona
A4
Lapachol derivado 1
A5
Lapachol derivado 2 A6
Lapachol derivado 3 A7
Lapachol derivado 4 A8
44 Ensaio de citotoxicidade
Para avaliar a citotoxicidade dos compostos ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas foram incubadas com diferentes concentraccedilotildees dos compostos em triplicata num
volume de 200 microL de meio de cultura por poccedilo na presenccedila de 1 de SFB Os controles natildeo
tratados apresentaram adiccedilatildeo de 200 microL de meio de cultura As ceacutelulas foram entatildeo incubadas
durante 72 horas O meio foi removido e 28 microL de soluccedilatildeo de 5 mg mL MTT (brometo de 3-
21
[45-dimetil-tiazol-2-il]-25 difeniltertrazoacutelio) foi adicionado a cada poccedilo As placas foram re-
incubadas durante 1 hora e 30 minutos e entatildeo 122 microL de DMSO foi adicionado a cada poccedilo e
placas foram agitadas suavemente durante 15 minutos para dissolver os cristais de formazan
A absorbacircncia foi lida em um equipamento leitor de placas Victor X3 (PerkinElmer) a 490
nm A concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC 50) foi definida como a concentraccedilatildeo da amostra que
reduziu a viabilidade celular de 50 em comparaccedilatildeo com controles natildeo tratados Os dados
foram analisados utilizando o programa Prisma
45 Avaliaccedilatildeo da viabilidade e crescimento celular por exclusatildeo de azul de tripan
Ceacutelulas BHK-21 foram cultivadas em placas de 24 poccedilos (7x104 ceacutelulaspoccedilo) e apoacutes
24 horas foram tratadas com as concentraccedilotildees de uso de cada composto e incubadas por 72
horas na presenccedila de 1 de SFB A seguir as ceacutelulas foram tripsinizadas e incubadas com
azul de tripan e entatildeo foi utilizado um contador automatizado de ceacutelulas (Countess II FL
Automated Cell Counter ndash Thermo Fisher Scientific) para contagem das ceacutelulas e avaliaccedilatildeo da
porcentagem de viabilidade e diacircmetro celular do controle nos tempos de 0 24 e 96 horas e
avaliaccedilatildeo dos mesmos paracircmetros para os compostos no tempo de 96 horas (72 horas poacutes
tratamento)
Outra curva de multiplicaccedilatildeo celular foi feita para os compostos A1 A3 A4 e A5 onde as
ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos no momento da confecccedilatildeo da placa e
foram avaliados os mesmos paracircmetros nos tempos de 0 12 24 48 e 72 horas O
equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
46 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
Para determinar a menor Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) responsaacutevel pela letalidade
celular total 2x104 de ceacutelulas BHK-21 foram semeadas em placa de 96 poccedilos Apoacutes a
incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o
meio de cultura foi removido e as ceacutelulas foram expostas a diferentes diluiccedilotildees dos dois
sorotipos de DENV (100 microL de cada diluiccedilatildeo + 100 microL de meio DEMEM 1 SFB) As
diluiccedilotildees seriadas foram realizadas da suspensatildeo viral na razatildeo de 5 para o primeiro poccedilo e de
2 para os demais poccedilos Apoacutes 72 horas as ceacutelulas foram entatildeo fixadas com 200 microL de soluccedilatildeo
22
formalina a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo 1 (pv) de cristal violeta em
PBS para avaliaccedilatildeo da maior diluiccedilatildeo responsaacutevel pela letalidade de 100 das ceacutelulas
47 Ensaio Dose-resposta
Para cada composto foram realizados ensaios de dose-resposta para definiccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de cada composto capaz de promover a reduccedilatildeo na produccedilatildeo viral A atividade
antiviral foi avaliada tambeacutem pelo meacutetodo de MTT Ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas expostas a diferentes concentraccedilotildees dos extratos determinadas a partir das maiores
concentraccedilotildees em que natildeo foram observados efeitos citotoacutexicos As ceacutelulas foram tratadas
com as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de cada composto e em seguida infectadas com DENV
1 (MOI= 5) ou 2 (MOI= 2) Mantendo uma coluna para controle com DMSO uma coluna
para controle de viacuterus uma coluna para controle de citotoxicidade dos compostos e por fim
uma coluna para controle celular As ceacutelulas foram entatildeo incubadas durante 72 horas Apoacutes
este tempo procedeu-se a leitura pelo ensaio de MTT como descrito anteriormente Os dados
foram analisados levando-se em consideraccedilatildeo a leitura das absorbacircncias dos poccedilos dos
controles de viacuterus e do controle celular
Para realizacao destes experimentos os seguintes controles foram adotados
Controle de ceacutelulas poccedilos contendo somente ceacutelulas acrescidas do meio de cultura DMEM
1 SFB Utilizado para avaliar o comportamento das ceacutelulas sem que as mesmas tivessem
contato com qualquer interferente durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo Com isso os poccedilos
reservados para esse controle serviram de padratildeo para comparaccedilatildeo com aqueles em que fosse
observada atividade citotoacutexica ou citopaacutetica
Controle de viacuterus poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM 1 SFB
sem nenhum tratamento e de suspensatildeo de viacuterus Utilizando como referecircncia para anaacutelise da
atividade citopaacutetica provocada pelo viacuterus testado durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo das placas
23
Controle de viacuterus com DMSO Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura
DMEM 1 SFB e DMSO Foi utilizado para avaliar se havia influecircncia prejudicial do
solvente utilizado para diluiccedilatildeo das amostras no meio de cultivo das ceacutelulas e se o mesmo
poderia apresentar alguma potencial atividade antiviral aparente
Controle de citotoxicidade Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM
1 SFB e as quatro principais concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos Foi utilizado
para avaliar se haveria alguma possiacutevel atividade citotoacutexica das concentraccedilotildees dos compostos
em relaccedilatildeo agraves ceacutelulas
48 Ensaio Virucida
Para a realizaccedilatildeo deste ensaio aliacutequotas de 950 microL (diluiccedilatildeo de 20 vezes) do DENV 1 (tiacutetulo
6 x 107 UFPmL) foram incubadas com 50 microL de uma soluccedilatildeo de meio DMEM preparada
com 20x a concentraccedilatildeo natildeo citotoacutexica de cada composto A1 a A8 em banho-maria 37deg C
por 1 hora Apoacutes a incubaccedilatildeo as aliacutequotas foram imediatamente tituladas em ceacutelulas BHK-21
em placas de 6 poccedilos utilizando-se 3 diluiccedilotildees para cada incubaccedilatildeo (20x 20 x 10-1
e 20 x 10-
2) Foram titulados tambeacutem uma aliacutequota incubada apenas com meio DMEM sem nenhum
tratamento e outra aliacutequota incubada com DMSO (Dimetilsulfoacutexido) Estas foram tituladas
utilizando um controle e mais cinco diluiccedilotildees (20x 20 x 10-1
20 x 10-2
20 x 10-3
e 20 x 10-4
)
49 Ensaio antiviral
Neste ensaio ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em placas de 24 poccedilos no dia
seguinte foram tratadas durante 4 horas com as concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas de cada
composto em duplicata Apoacutes o preacute-tratamento as monocamadas foram infectadas com
DENV-1 a uma MOI=5 na presenccedila das concentraccedilotildees de uso respectivas de cada composto
Apoacutes 1 hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus as monocamadas foram lavadas duas vezes com PBS e
foi adicionado 500 microL por poccedilo de meio preparado com as mesmas concentraccedilotildees dos
diferentes compostos e mantidos durante 48 horas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5 Em
quatro poccedilos as ceacutelulas foram infectadas e natildeo tratadas e em outros quatro poccedilos as ceacutelulas
natildeo foram tratadas e nem infectadas (controle de ceacutelulas) destes uacuteltimos dois foram
tripsinizados e contados no momento da infecccedilatildeo e os outros dois apoacutes o teacutermino do ensaio
24
para avaliar o crescimento celular Decorridas as 48 horas o sobrenadante foi coletado e
centrifugado por 10 minutos a 4000 xG para separaccedilatildeo dos debris celulares e prontamente
titulado em placa de 6 poccedilos
410 Anaacutelise estatiacutestica
Os valores de CC50 foram obtidos a partir de anaacutelise de regressatildeo linear das curvas de
concentraccedilatildeocitotoxicidade A anaacutelise estatiacutestica dos dados foi realizada pelo programa
GraphPad Prism software Uma anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi utilizada para determinar
as diferenccedilas estatiacutesticas seguida do poacutes teste de Tukey A significacircncia estatiacutestica foi fixada
em p lt005
25
V RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
26
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Ensaio de citotoxicidade celular
Para avaliar a viabilidade da linhagem celular BHK-21 frente ao tratamento com oito
diferentes concentraccedilotildees dos compostos (A1 a A8) realizou-se um ensaio de MTT (brometo
de 3-[45-dimetil-tiazol-2-il]-25-difeniltetrazoacutelio) Este ensaio tem o objetivo de quantificar
espectrofotometricamente o crescimento celular a viabilidade e proliferaccedilatildeo podendo ser
utilizado como um indicador direto de citotoxicidade Trata-se de um ensaio colorimeacutetrico
para medir a atividade da redutase mitocondrial em ceacutelulas vivas Ele se baseia na reduccedilatildeo do
sal amarelo tetrazoacutelio (permeaacutevel agrave membrana celular) para cristais de formazan azuis
puacuterpura por ceacutelulas metabolicamente ativas a quantidade de formazan gerada medida por
espectrofotometria eacute proporcional ao nuacutemero de ceacutelulas viaacuteveis
A CC50 foi calculada plotando-se uma curva de porcentagem de viabilidade celular por
concentraccedilatildeo melhor representada na figura 7 pelo composto A7 e os resultados de CC50
para todos os compostos estatildeo representados na tabela 2 Foram feitos ensaios de
citotoxicidade com oito concentraccedilotildees diferentes sendo escolhida a maior concentraccedilatildeo que
natildeo apresentou citotoxicidade
Viabilidade Celular = [ ( A ndash B ) A ] x 100
Onde
A = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas natildeo tratadas
B = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas tratadas com
as respectivas concentraccedilotildees de cada composto
27
28
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (A curva dose resposta do composto A7 eacute a que
melhor representa a curva dose resposta esperada) Avaliou-se a viabilidade da linhagem
celular BHK-21 frente agrave diferentes concentraccedilotildees dos compostos realizando o ensaio de MTT
e determinando assim as concentraccedilotildees a serem utilizadas nos proacuteximos ensaios bem como
calculando a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) agrave partir da curva
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo
da concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50)
Composto Concentraccedilatildeo utilizada
[ ] microgmL
Concentraccedilatildeo citotoacutexica 50
(CC50) [ ] microgmL plusmn Desvio
Padratildeo
A1 ([ ]=1 mgmL) 00200 10010 plusmn 0014
A2 ([ ]=1 mgmL) 00025 09561 plusmn 0023
A3 ([ ]=1 mgmL) 00025 09988 plusmn 0017
A4 ([ ]=5 mgmL) 00125 10150 plusmn 0036
A5 ([ ]=10 mgmL) 00250 10590 plusmn 0047
A6 ([ ]=5 mgmL) 00250 08183 plusmn 0030
A7 ([ ]=5 mgmL) 00125 10280 plusmn 0052
A8 ([ ]=5 mgmL) 00125 09758 plusmn 0036
52 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan
Para corroborar o ensaio anterior de citotoxicidade utilizou -se o teste de viabilidade
celular pela teacutecnica da exclusatildeo do azul de tripan com a finalidade de determinar a
viabilidade das ceacutelulas Os procedimentos adotados no ensaio seguiram o manual do
equipamento contador automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL Automated Cell Counter) entatildeo
foi acrescentado agrave 10 microL da suspensatildeo celular 10 microL de azul de tripan (04) Apoacutes
homogeneizaccedilatildeo 10 microL da suspensatildeo foi colocada no local indicado da lacircmina proacutepria para
leitura e foi realizada a contagem sendo consideradas mortas (inviaacuteveis) as ceacutelulas que
incorporavam o corante e viaacuteveis as que excluiacuteam o azul de tripan
29
O equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
(A)
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan A avaliaccedilatildeo da
viabilidade celular foi realizada atraveacutes de um contador automaacutetico de ceacutelulas Este
equipamento possibilita explorar ferramentas de fotografia e avaliar alguns paracircmetros
importantes (A) fotografia das ceacutelulas (B) Zoom na fotografia das ceacutelulas com marcaccedilotildees
(em verde para ceacutelulas vivas e vermelho para mortas) e (D) contagem das ceacutelulas totais
ceacutelulas vivas e mortas graacutefico e meacutedia dos diacircmetros celulares das ceacutelulas vivas e mortas
(B)
(C)
30
O crescimento celular de ceacutelulas natildeo tratadas foi avaliado nos tempos de 0h (momento
da confecccedilatildeo da placa) 24h (momento de tratamento com os compostos) e 96 horas
(Momento em que todas as ceacutelulas foram tripsinizadas e contadas) para avaliar o perfil do
crescimento celular em ceacutelulas natildeo tratadas Foi observado um crescimento celular no periacuteodo
de 24 horas onde as ceacutelulas estavam incubadas com meio acrescido de 10 SFB Em 24
horas o meio foi trocado por 1 SFB e acrescido das substacircncias testes nas menores diluiccedilotildees
natildeo citotoacutexicas determinadas pelo ensaio do MTT Em 96 horas pode ser observado um
decaimento no nuacutemero de ceacutelulas vivas provavelmente devido ao crescimento celular (morte
por confluecircncia)
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas)
(A) (B)
31
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas (A)
Contagem de ceacutelulas vivas (B) Percentual de ceacutelulas viaacuteveis (Viabilidade celular ) e (C)
Meacutedia do diacircmetro apresentado pelas ceacutelulas vivas
Em 96 horas as ceacutelulas natildeo tratadas bem como as ceacutelulas tratadas por 72 horas com as
concentraccedilotildees de uso dos compostos foram tripsinizadas e avaliadas quanto ao nuacutemero de
ceacutelulas vivas viabilidade e diacircmetro celular apresentados na figura 10
Segundo se observa natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo aparente que possa demonstrar que
as concentraccedilotildees de uso dos compostos tenham causado alguma atividade citotoacutexica
corroborando assim os ensaios de citotoxicidade anteriores
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
A infectividade de um viacuterus depende de vaacuterios fatores entre eles da proporccedilatildeo de
partiacuteculas virais completas ou infecciosas da suscetibilidade da ceacutelula hospedeira e da
chance desta partiacutecula encontrar o receptor e penetrar na ceacutelula Quando ceacutelulas suscetiacuteveis
satildeo misturadas com uma suspensatildeo de viacuterus estas podem receber uma duas trecircs ou dez
partiacuteculas virais ou nenhuma Isto depende da proporccedilatildeo entre a quantidade de viacuterus
infecciosos presente no inoculo e a quantidade de ceacutelulas utilizada Esta relaccedilatildeo eacute denominada
de multiplicidade de infecccedilatildeo ou MOI Uma MOI=1 indica que a infecccedilatildeo foi feita em
principio com 1 viacuterus ou 1 dose infectante por ceacutelula
A determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo dos Dengue virus 1 e 2 a serem
utilizadas nos proacuteximos ensaios foi feita a partir da infecccedilatildeo de ceacutelulas BHK-21 por diferentes
(C)
32
concentraccedilotildees de viacuterus e revelaccedilatildeo com cristal violeta Escolheu-se a maior diluiccedilatildeo viral que
possibilitou a letalidade total das ceacutelulas (faixa onde todas as ceacutelulas estatildeo mortas utilizando
menor concentraccedilatildeo de viacuterus) As faixas escolhidas foram entatildeo calculadas levando-se em
consideraccedilatildeo o nuacutemero de ceacutelulas presentes no poccedilo e o nuacutemero de partiacuteculas virais que foram
adicionadas (Faixa3 para DENV2 e 2 para DENV1) Figura 11 Foi estipulado portanto a
Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 2 para DENV 2 e 5 para DENV 1
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI A partir da infecccedilatildeo da linhagem celular BHK-21 em
placa de 96 poccedilos com diferentes diluiccedilotildees de DENV foi determinado que a Multiplicidade
de infecccedilatildeo para o Dengue viacuterus sorotipos 1 e 2 seria de 5 e 2 respectivamente (colunas 2 -
DENV1 e 3 - DENV2)
54 Ensaio dose resposta
Apoacutes a determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas ideais realizou-se um
ensaio dose resposta tratando as ceacutelulas com oito concentraccedilotildees agrave partir das concentraccedilotildees natildeo
citotoacutexicas escolhidas para cada composto e em seguida infectando com DENV sorotipos 1 e
2 nas MOIs estipuladas anteriormente (5 e 2 respectivamente) A porcentagem do efeito
protetor conferida agraves ceacutelulas para cada concentraccedilatildeo de amostra testada foi calculada da
seguinte forma
33
EP = [ (A ndash B) (C ndash B) ] x 100
Onde
A Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas tratadas e infectadas
B Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e infectadas
C Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e natildeo infectadas
Este ensaio tem por objetivo identificar a resposta celular agrave infecccedilatildeo frente ao
tratamento com os compostos em diferentes concentraccedilotildees Assim como o ensaio de
toxicidade este ensaio feito utilizando a teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT permite o teste de vaacuterias
concentraccedilotildees diferentes em um menor tempo e com baixo gasto de material
34
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV1
(MOI=5)
35
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV2
(MOI=2)
36
Takegami et al (1998) demonstraram atividade de furanonaftoquinonas contra o viacuterus
da Encefalite Japonesa (Flavivirus) utilizando a concentraccedilatildeo de 3microgmL poreacutem para os
compostos apresentados avaliados pela teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT nenhuma das
concentraccedilotildees apresentadas produziu efeito antiviral significativo em relaccedilatildeo ao controle
celular como observado nas figuras 12 e 13
Apesar da teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT ser interessante como triagem de atividade
antiviral permitindo o teste de vaacuterias concentraccedilotildees dos compostos em menor tempo e
utilizando uma quantidade razoaacutevel de materiais optou-se por utilizar as maiores
concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas encontradas avaliando sua atividade antiviral por outras
teacutecnicas Como natildeo foi avaliada atividade antiviral preacutevia para nenhum dos compostos frente
agrave infecccedilatildeo por DENV1 e 2 foi selecionado o Dengue virus 1 para dar prosseguimento aos
ensaios
55 Ensaio Virucida
O ensaio virucida foi realizado para avaliar um potencial efeito dos compostos
diretamente sobre a partiacutecula viral Este ensaio eacute importante pois possibilita elucidar se o
composto pode produzir algum efeito sobre a partiacutecula viral impedindo que esta possa infectar
as ceacutelulas
Figura 14 Ensaio virucida Neste ensaio as aliacutequotas de DENV1 foram incubadas com as
concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos e titulados (NT) Controle natildeo tratado
37
Tabela 3 Ensaio virucida Caacutelculo do tiacutetulo viral (UFPmL) e porcentagem representante de
cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 254 x 105 100
DMSO 263 x 105 10335
A1 199 x 105 7835
A2 205 x 105 8071
A3 237 x 105 9311
A4 775 x 104 3049
A5 153 x 105 6024
A6 219 x 105 8602
A7 243 x 105 9547
A8 254 x 105 100
Lagrota et al (1988) demonstraram atividade de 2-HO-3-N-benzil-N(N-benzil-2-
etilamina) -14-naftoquinona sobre a partiacutecula viral de enterovirus De forma contraacuteria apesar
de se verificar a reduccedilatildeo de quase uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais
para o composto A4 natildeo considerou-se esta uma alteraccedilatildeo significativa pois devido agrave
magnitude do nuacutemero de UFPs se trata de uma alteraccedilatildeo muito pequena Portanto os
compostos avaliados neste trabalho natildeo produziram atividade virucida aparente frente ao
tratamento com as concentraccedilotildees de uso
56 Ensaio Antiviral
O sobrenadante de ceacutelulas tratadas previamente e infectadas por DENV1 coletado 48
horas poacutes infecccedilatildeo foi avaliado quanto agrave produccedilatildeo viral de partiacuteculas infecciosas pela
contagem de placas de lise e caacutelculo de Unidades Formadoras de Placa (Titulaccedilatildeo viral em
placa ndash UFPmL)
38
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral Sobrenadante de ceacutelulas tratadas e infectadas por DENV1
coletado apoacutes 48 horas e titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado
Tabela 4 Ensaio Antiviral Coleta do sobrenadante de ceacutelulas infectadas por DENV1 Tiacutetulo
viral (UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o
controle natildeo tratado como 100
Ao perceber um aumento no tiacutetulo viral frente ao tratamento com os compostos A1
A2 e A3 e uma reduccedilatildeo frente ao tratamento com A4 A5 e A6 foram escolhidos dois
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 119 x 105 10000
A1 235 x 105 19748
A2 228 x 105 19160
A3 318 x 105 26723
A4 128 x 104 1076
A5 186 x 103 156
A6 190 x 104 1597
A7 280 x 104 2353
A8 350 x 104 2941
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
40
Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
VI
EPIacuteGRAFE
ldquoA persistecircncia eacute o menor caminho do ecircxitordquo (Charles Chaplin)
ldquoO Senhor eacute meu Pastor e nada me faltaraacute () Ainda que eu andasse pelo
vale da sombra da morte natildeo temeria mal algum porque tu estaacutes comigo
a tua vara e o teu cajado me consolam () Certamente que a bondade e a
misericoacuterdia me seguiratildeo todos os dias da minha vida e habitarei na casa
do Senhor por longos diasrdquo (Salmos 23)
VII
AGRADECIMENTOS
Agradeccedilo primeiramente agrave Deus por ser o meu sustento e proteccedilatildeo
Aos meus pais Antocircnio e Sandra pelas oraccedilotildees esforccedilo carinho e dedicaccedilatildeo
E ao meu irmatildeo Joatildeo Paulo e minha Cunhada Naacutedia pelo apoio e torcida
Ao Prof Dr Breno de Mello Silva e Prof Dr Geraldo Ceacutelio Brandatildeo pela oportunidade e
orientaccedilatildeo durante o desenvolvimento do mestrado
Agrave toda equipe do LBTM em especial a Ana Claudia Cyntia e Erica pelo companheirismo
ajuda e incentivo
Aos meus amigos que fizeram parte de toda esta trajetoacuteria
Aos laboratoacuterios do NUPEB pela permissatildeo e ajuda no uso de diversos equipamentos
Agrave Universidade Federal de Ouro Preto por todas as oportunidades oferecidas
Agrave CAPES pelo apoio financeiro
Agrave todos aqueles que de alguma forma auxiliaram para o desenvolvimento e conclusatildeo deste
trabalho
VIII
RESUMO
O Dengue virus (DENV) possui quatro sorotipos diferentes (1-4) que satildeo principalmente
transmitidos pelo mosquito Aedes aegypti A infecccedilatildeo resulta na patogecircnese da dengue que eacute
uma epidemia de proporccedilotildees globais Apesar dos esforccedilos ainda natildeo existe uma vacina eficaz
contra os quatro sorotipos bem como drogas eficientes no tratamento de pacientes Portanto
vaacuterios estudos tem sido conduzidos na busca de faacutermacos com atividade antiviral contra o
DENV e outros Flavivirus Dentre os compostos estudados para este fim estatildeo as
naftoquinonas metaboacutelitos secundaacuterios produzidos por algas fungos plantas e animais Estes
compostos podem ser extraiacutedos principalmente a partir de plantas do gecircnero Tabebuia
(famiacutelia Bignoniaceae) satildeo caracterizados por apresentar atividade antiviral destacando-se a
szlig-lapachona potente inibidor da enzima transcriptase reversa dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria
(AMV) e leucemia murina de Rauscher (RLV) O objetivo deste trabalho foi testar oito
diferentes compostos derivados de naftoquinonas sinteacuteticas e naturais com potencial atividade
antiviral contra DENV Para isso uma triagem foi realizada por reduccedilatildeo de MTT (brometo de
3- (45-dimetiltiazol-2-il) -25-brometo difenil tetrazolina) para avaliar a atividade citotoacutexica
de oito compostos na linhagem celular BHK-21 resultando no caacutelculo da concentraccedilatildeo
citotoacutexica 50 (CC50) e as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas a serem utilizada em testes
subsequentes para os compostos A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 e A8 (lapachol β-lapachona 2-
Hidroxi-3-(ββ-dimetilvinil)-14-naftoquinona 2-Cloro-14-naftoquinona e 4 derivados de
lapachol) Em seguida ceacutelulas BHK-21 foram incubadas com os compostos em concentraccedilotildees
natildeo citotoacutexicas em diferentes diluiccedilotildees e infectadas com os sorotipos 1 e 2 DENV na
multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 5 e 2 para os sorotipos 1 e 2 respectivamente A
atividade antiviral foi testada atraveacutes da anaacutelise de reduccedilatildeo de MTT e pela titulaccedilatildeo de virus
liberados no sobrenadante Apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute
uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes
faacutermacos natildeo demonstraram atividade antiviral nas condiccedilotildees experimentais testadas
IX
ABSTRACT
The Dengue virus (DENV) has four different serotypes (1-4) that are primarily transmitted by
the mosquito Aedes aegypti Infection results in the pathogenesis of dengue which is an
epidemic of global proportions Despite these efforts there is still no effective vaccine against
the four serotypes as well as efficient drugs in the treatment of patients Therefore various
studies have been conducted in the search for drugs with antiviral activity against DENV and
other flaviviruses Among the studied compounds for this purpose are the naphthoquinones
secondary metabolites produced by algae fungi plants and animals These compounds can be
mainly extracted from plants of the genus Tabebuia (Bignoniaceae) are characterized by
having antiviral activity especially the szlig-lapachone potent inhibitor of the enzyme reverse
transcriptase of avian myeloblastosis virus (AMV) and murine leukemia Rauscher (RLV)
The aim of this study was to test eight different compounds derived from synthetic and
natural naphthoquinones with potential antiviral activity against DENV For this a screening
was performed by reduction of MTT (3- (45-dimethylthiazol-2-yl) -25-diphenyl bromide
tetrazolina) to assess the cytotoxic activity of the compounds eight BHK-21 cell line resulting
in the calculation of the cytotoxic concentration 50 (CC50) and non-cytotoxic
concentrations to be used in subsequent tests for compounds A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 and
A8 (lapachol β-lapachone 2-hydroxy -3- (β β-dimethylvinyl) -14-naphthoquinone 2-
chloro-14-naphthoquinone and derivatives lapachol 4) Then BHK-21 cells were incubated
with compounds at non-cytotoxic concentrations in different dilutions and infected with
serotypes 1 and 2 DENV at multiplicity of infection (MOI) of 5 and 2 for serotypes 1 and 2
respectively The antiviral activity was assayed by MTT reduction assay and the virus titer
released into the supernatant Although some compounds have shown reduced to one log unit
in the number of viral particles results indicate that these drugs did not show antiviral activity
in experimental conditions
X
SUMAacuteRIO
RESUMO VIII
ABSTRACT IX
LISTA DE FIGURAS XII
LISTA DE TABELAS XIII
1 INTRODUCcedilAtildeO 2
11 Flavivirus 2
12 Dengue virus 3
13 Epidemiologia 6
14 Naftoquinonas 8
3 OBJETIVOS 16
31 Objetivo Geral 16
32 Objetivos especiacuteficos 16
4 MATERIAL E MEacuteTODOS 18
41 Linhagens celulares 18
411 Ceacutelulas C636 18
412 Ceacutelulas BHK-21 18
42 Viacuterus 18
421 DENV 1 e DENV 2 18
422 Titulaccedilatildeo viral 19
43 Compostos de naftoquinonas 19
44 Ensaio de citotoxicidade 20
45 Avaliaccedilatildeo da viabilidade e crescimento celular por exclusatildeo de azul de tripan 21
46 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) 21
47 Ensaio Dose-resposta 22
48 Ensaio Virucida 23
49 Ensaio antiviral 23
410 Anaacutelise estatiacutestica 24
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO 26
51 Ensaio de citotoxicidade celular 26
52 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan 28
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) 31
54 Ensaio dose resposta 32
XI
55 Ensaio Virucida 36
56 Ensaio Antiviral 37
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao tratamento com
os compostos A1 A3 A4 e A5 40
6 CONCLUSAtildeO 44
7 PERSPECTIVAS 46
8 REFEREcircNCIAS 48
XII
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Estrutura da partiacutecula viral de Dengue viacuterus 4
Figura 2 Ciclo de multiplicaccedilatildeo de DENV 5
Figura 3 Distribuiccedilatildeo geograacutefica da Dengue 7
Figura 4 Estrutura quiacutemica da 12-naftoquinona (1) e 14-naftoquinona (2) 9
Figura 5 Estrutura quiacutemica do Lapachol (1) da α- Lapachona (2) e da β-Lapachona 10
Figura 6 Tabebuia avellanedae 11
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (Exemplo da curva dose resposta do composto A7) 28
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan 29
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas) 30
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas 31
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI 32
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 34
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 35
Figura 14 Ensaio virucida 36
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral 38
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados 39
Figura 17 Curva de crescimento celular 41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular 41
XIII
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Relaccedilatildeo de nome estrutura e coacutedigo dos compostos utilizados 20
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo da
concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) 28
Tabela 3 Ensaio virucida 37
Tabela 4 Ensaio Antiviral 38
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados 39
XIV
LISTA DE ABREVIATURAS
AMV ndash Mielobastose Aviaacuteria viacuterus (Avian Myeloblastosis virus )
CC50 ndash Concentraccedilatildeo Citotoacutexica 50
DENV ndash Dengue virus
DMEM ndash Meio baacutesico modificado por Dulbecco (Dulbeccos Modified Eagle Medium)
DMSO ndash Dimetilsulfoacutexido
ICTV ndash Comitecirc Inernacional de Taxonomia Viral
JEV ndash Viacuterus da Encefalite Japonesa (Japanese Encephalitis virus)
MOI ndash Multiplicidade de infecccedilatildeo viral
NS ndash Proteiacutenas natildeo estruturais
NT ndash Natildeo Tratado
OMS ndash Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede
RE ndash Retiacuteculo endoplasmaacutetico
RLV ndash Viacuterus da Leucemia Murina de Rauscher (Murine leukemia virus)
SFB ndash Soro Fetal Bovino
UFP ndash Unidades formadoras de placas
WNV ndash Viacuterus do Nilo Ocidental (West Nile virus)
YFV ndash Viacuterus da febre amarela (Yellow fever virus)
ZV ndash Zika virus
1
I INTRODUCcedilAtildeO
2
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Flavivirus
O Gecircnero Flavivirus pertencente agrave famiacutelia Flaviviridae inclui 53 espeacutecies
taxonomicamente reconhecidas (ICTV 2016) muitas das quais satildeo importantes patoacutegenos
humanos tais como o Dengue virus (DENV) Yellow fever virus (YFV - viacuterus da febre
amarela ndash protoacutetipo deste gecircnero) Japanese encephalitis virus (JEV - viacuterus da encefalite
japonesa) West Nile virus (WNV - virus do Nilo Ocidental) Zika virus (ZV) entre outros
(Villordo 2016) O nome flavivirus eacute derivado da palavra latina flavus que significa amarelo
significando a icteriacutecia causada pelo YFV Os sintomas da infecccedilatildeo por flavivirus pode variar
de leve febre e mal-estar a encefalite fatal e febre hemorraacutegica (Mukhopadhyay 2005)
Estes viacuterus regulam o metabolismo e a sobrevivecircncia das ceacutelulas infectadas
assegurando a sua proacutepria reproduccedilatildeo e propagaccedilatildeo O viacuterus da dengue tambeacutem provoca a
autofagia uma resposta homeostaacutetica geral que ajuda a ceacutelula infectada sobreviver e produzir
viacuterus (Datan 2016)
Os Flavivirus podem ser agrupados em complexos e sub-complexos antigecircnicos
baseados em criteacuterios soroloacutegicos ou em grupos clados e espeacutecies segundo a sua filogenia
molecular (Lindenbach 2007) A maioria dos membros deste gecircnero satildeo arbovirus (arthropod
borne virus) ou seja satildeo essencialmente transmitidos por Artroacutepodes (Mackenzie 2004)
onde 27 satildeo transmitidos por mosquitos 12 por carrapatos e 14 natildeo possuem vetor
conhecido Os viacuterus transmitidos pela fecircmea do gecircnero Aedes incluem DENV e YFV satildeo
viscerotroacutepicos e possuem primatas como reservatoacuterio natural (Gaunt 2001)
A patogenia da Dengue causada pelo DENV constitui uma das doenccedilas virais mais
importantes em seres humanos transmitidos por insetos e eacute responsaacutevel por cerca de 390
milhotildees de infecccedilotildees por ano O YFV por sua vez causador da febre amarela eacute endecircmico em
vaacuterios paiacuteses do continente Africano e da Ameacuterica do Sul resultando em 200000 casos e
30000 mortes na Aacutefrica mesmo com vacinas eficazes disponiacuteveis Outras doenccedilas causadas
por flaviviacuterus incluem a encefalite do Nilo Ocidental (West Nile virus) e febre Zika (Zika
virus) que satildeo consideradas doenccedilas emergentes com surtos importantes em todo o mundo
(Villordo 2016)
3
12 Dengue virus
Os DENV pertencem ao gecircnero flaviviacuterus e evoluiram em primatas natildeo-humanos a
partir de um ancestral comum Eacute composto por quatro sorotipos antigenicamente distintos
(DENV1-4) que co-circulam por todo o Sudeste da Aacutesia Aacutefrica e Ameacutericas (McArthur 2013)
e em outubro de 2013 foi anunciado um novo sorotipo circulante denominado entatildeo de DENV
5 (Normile 2013) A partiacutecula infecciosa eacute esfeacuterica com 40-50 nm de diacircmetro possuindo
um envelope de lipopolissacariacutedeo O genoma consiste em RNA de fita simples natildeo
segmentado e senso positivo de aproximadamente 11 kb de comprimento e possui uma uacutenica
janela aberta de leitura (start codon) (Guzman 2010) Apoacutes a traduccedilatildeo a uacutenica poliproteiacutena
formada eacute clivada por proteases virais e celulares em trecircs proteiacutenas estruturais que compotildeem
a partiacutecula viral C (capsideo) prM M (membrana e o seu precursor) e E (envelope) e sete
proteiacutenas natildeo estruturais essenciais para a replicaccedilatildeo viral (NS) (NS1 NS2a NS2b NS3
NS4a NS4b e NS5) (Robertson 2009)
A transmissatildeo do viacuterus ocorre atraveacutes da picada por fecircmeas infectadas de mosquitos
do gecircnero Aedes sendo responsaacutevel pelas maiores taxas de doenccedila e mortalidade entre os
membros do gecircnero Flavivirus (Mukhopadhyay 2005) No Brasil o Aedes aegypti eacute o
principal vetor de dengue enquanto o Aedes albopictus atua como um vector secundaacuterio
(Weaver 2010)
O diagnoacutestico soroloacutegico da Dengue se baseia na detecccedilatildeo de niacuteveis elevados de
anticorpos anti-Dengue-IgM ou anti-Dengue-IgG que reconhecem e se ligam ao antiacutegeno de
DENV A Glicoproteiacutena do envelope (E) uma proteiacutena estrutural de DENV eacute o alvo
antigecircnico mais importante destes anticorpos neutralizantes porque estaacute exposta na superfiacutecie
do viacuterus e medeia os receptores de ligaccedilatildeo e fusatildeo da ceacutelula hospedeira (Lee 2015)
Durante a infecccedilatildeo celular os virions de DENV se ligam agrave superfiacutecie da membrana
atraveacutes da glicoproteiacutena do envelope (E) a receptores especiacuteficos e satildeo internalizados por
endocitose Uma vez dentro do endossoma a acidificaccedilatildeo provocada pela ligaccedilatildeo de
lisossomos desencadeia uma trimerizaccedilatildeo irreversiacutevel da proteiacutena E que atua na fusatildeo das
membranas virais e endossomais celulares Apoacutes essa fusatildeo o nucleocapsideo eacute liberado no
citoplasma onde o mesmo eacute desnudado e a replicaccedilatildeo do genoma de RNA e montagem de
partiacuteculas eacute iniciada As partiacuteculas virais imaturas satildeo acumuladas no luacutemen do retiacuteculo
endoplasmaacutetico (RE) Essas partiacuteculas imaturas que contecircm proteiacutenas prM proteiacutena E
membrana lipiacutedica e nuacutecleo capsiacutedeo natildeo pode induzir a fusatildeo da ceacutelula hospedeira ou seja
4
neste estaacutegio elas natildeo satildeo infecciosas (Mukhopadhyay 2005) O processo de maturaccedilatildeo
desses viacuterus ocorre apoacutes a clivagem proteoliacutetica da proteiacutena precursora de membrana (prM)
transformando viacuterus inerte em partiacuteculas infecciosas (Li 2008) Partiacuteculas subvirais satildeo
tambeacutem produzidas no RE mas apenas contecircm as glicoproteiacutenas de membrana fazendo com
que estas partiacuteculas sejam natildeo infecciosas Os viacuterus maduros e as partiacuteculas sub-virais satildeo
liberados da ceacutelula hospedeira por exocitose (Mukhopadhyay 2005)
Na pele o DENV tende a infectar ceacutelulas dendriacuteticas imaturas Estas ceacutelulas infectadas
amadurecem e migram para os gacircnglios linfaacuteticos regionais ou locais onde apresentam
antiacutegenos virais agraves ceacutelulas T iniciando as respostas imunes Existe tambeacutem evidecircncia de
replicaccedilatildeo abundante de DENV em ceacutelulas do parecircnquima do fiacutegado e em macroacutefagos nos
gacircnglios linfaacuteticos fiacutegado e baccedilo bem como em monoacutecitos de sangue perifeacuterico (Guzman
2010)
Proteiacutena E
(diacutemero)
Proteiacutena
M
Proteiacutena C
ssRNA (+)
Figura 1 Estrutura da partiacutecula viral de Dengue viacuterus A partiacutecula viral eacute composta
por trecircs proteiacutenas estruturais proteiacutena de envelope (E) disposta em diacutemeros a proteiacutena
associada agrave membrana (M) e a proteiacutena do nucleocapsiacutedeo (C) O genoma de RNA fita-
simples de polaridade positiva se encontra dentro do nucleocapsiacutedeo (Adaptado de
httpviralzoneexpasyorgviralzoneall_by_species24html)
5
Figura 2 Ciclo de multiplicaccedilatildeo de DENV A Os viacuterus se ligam aos receptores na superfiacutecie da
ceacutelula e satildeo endocitados B Devido ao baixo pH dentro dos endossomas ocorre a fusatildeo de
membranas viral-celular mediada por proteiacutenas virais resultando na liberaccedilatildeo do RNA viral em um
processo chamado de desnudamento C O genoma viral eacute traduzido em uma uacutenica poliproteiacutena que
eacute processada por proteases do viacuterus e da ceacutelula hospedeira D O RNA eacute replicado por proteiacutenas
natildeo-estruturais do proacuteprio viacuterus E A montagem do viacuterus ocorre na membrana do Reticulo
endoplasmaacutetico no qual a proteiacutena do capsiacutedeo e o RNA viral satildeo envolvidos por glicoproteiacutenas e
pela membrana da organela para formar partiacuteculas virais imaturas F Partiacuteculas virais imaturas
utilizam a via secretora da ceacutelula hospedeira e sob o baixo pH do Complexo de Golgi a proteiacutena
precursora prM eacute clivada em proteiacutena M completando a maturaccedilatildeo do viacuterus GOs viacuterus maduros
satildeo entatildeo liberados das ceacutelulas por exocitose Os nuacutemeros indicados nas caixas coloridas referem-se
ao valor de pH dos respectivos compartimentos Imagem adaptada de PERERA 2009
Adsorccedilatildeo
Siacutentese e processamento
Fusatildeo e
Desnudamento
Replicaccedilatildeo do RNA
Montagem
Maturaccedilatildeo
Liberaccedilatildeo de
viacuterus
maduro
A
B
C
D
E
F
G
6
13 Epidemiologia
Ao longo das uacuteltimas deacutecadas a dengue se tornou a doenccedila viral transmitida por
mosquitos mais prevalente no mundo Estimativas de infecccedilatildeo pela OMS indicam que a
patologia eacute endecircmica em mais de 100 paiacuteses em todos os continentes exceto a Antaacutertida e
aflige principalmente paiacuteses pobres em recursos nas regiotildees tropicais e subtropicais (Perry
2011) Epidemias globais de DENV ocorreram ao longo das uacuteltimas deacutecadas em parte devido
agrave diminuiccedilatildeo dos esforccedilos no controle de mosquitos Satildeo estimados mais de 50 milhotildees de
casos de dengue anualmente (Mukhopadhyay 2005)
A Dengue eacute uma doenccedila viral sistecircmica aguda que se estabeleceu em todo o mundo
em ambos os ciclos de transmissatildeo endecircmicas e epidecircmicas A infecccedilatildeo pelo DENV em seres
humanos eacute frequentemente inaparente mas pode levar a uma grande variedade de
manifestaccedilotildees cliacutenicas de febre leve a siacutendrome do choque da dengue potencialmente fatal A
imunidade vitaliacutecia desenvolvida apoacutes a infecccedilatildeo com um dos quatro tipos de viacuterus eacute
especiacutefica para cada tipo e a progressatildeo para uma doenccedila mais grave eacute frequente mas natildeo
exclusivamente relacionada com infecccedilatildeo secundaacuteria por tipos heteroacutelogos No entanto
enquanto a expansatildeo histoacuterica desta doenccedila eacute bem documentada o elevado fardo de
problemas de sauacutede atribuiacuteveis agrave dengue em grande parte do mundo tropical e sub-tropical
permanecem pouco enumerados (Bhatt 2013)
O Brasil eacute um paiacutes de grande extensatildeo (8512000 km2) situado em uma zona
predominantemente tropical com extensas aacutereas de florestas na regiatildeo amazocircnica bem como
restos de uma floresta tropical na costa leste sudeste e sul entre outros ecossistemas A maior
parte do paiacutes tem um clima tropical e uma grande diversidade de plantas e animais portanto
um local adequado para a ocorrecircncia de patologias causadas por viacuterus transmitidos por
artroacutepodes (Figueiredo 2000) Segundo o boletim epidemioloacutegico do ministeacuterio da sauacutede em
2016 jaacute foram registrados 170103 casos provaacuteveis de dengue no paiacutes ateacute a semana
epidemioloacutegica 5 Nesse periacuteodo a regiatildeo Sudeste registrou o maior nuacutemero de casos
provaacuteveis (96664 casos 568) Em Minas Gerais jaacute foram registradas 19 mortes em
decorrecircncia da Dengue entre 1deg de janeiro e 14 de marccedilo deste ano Outros 91 oacutebitos estatildeo
sob investigaccedilatildeo (BRASIL 2016)
7
Figura 3 Distribuiccedilatildeo geograacutefica da Dengue Aacutereas de risco de transmissatildeo em amarelo
(Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede Adaptado de httpwwwwhointen)
As manifestaccedilotildees da doenccedila foram descritas pela primeira vez apoacutes a Segunda Guerra
Mundial coincidente com o aumento da urbanizaccedilatildeo particularmente na Aacutesia (Weaver 2010)
Atualmente o DENV eacute hiperendecircmico em muitas regiotildees tropicais onde 2 ou mais sorotipos
circulam endemicamente Embora DENV foi provavelmente introduzido periodicamente para
as Ameacutericas atraveacutes de navios desde o seacuteculo 17 o surgimento de DENV no Hemisfeacuterio
Ocidental comeccedilou mais tarde devido a uma campanha de sucesso parcial para erradicar o
vetor A aegypti para controlar a febre amarela Esta campanha teve sucesso na maior parte
das Ameacutericas da deacutecada de 1950 agrave deacutecada de 1970 mas foi interrompida O vetor entatildeo
rapidamente recolonizou quase toda a regiatildeo neotropical e subtropicais e a invasatildeo do DENV
seguiu logo depois Em 1985 A albopictus foi introduzido nos EUA e no Brasil
proporcionando um vetor para a transmissatildeo secundaacuteria de DENV nas Ameacutericas (Hawley
1987)
Os mosquitos vetores principalmente A aegypti tornam-se infectados quando eles se
alimentam do sangue de seres humanos durante o periacuteodo de cinco dias da viremia A
infecccedilatildeo produz um amplo espectro da doenccedila cliacutenica e varia de assintomaacutetica a doenccedila febril
auto-limitante A dengue tambeacutem conhecida como ldquofebre osso quebradordquo devido agraves fortes
dores nas articulaccedilotildees e inclui sintomas de febre alta dores musculares articulares e erupccedilatildeo
cutacircnea Uma pequena porcentagem de indiviacuteduos pode apresentar a siacutendrome do choque da
8
dengue (dengue hemorraacutegica) com risco de vida grave O tratamento eacute amplamente favoraacutevel
usando de reidrataccedilatildeo oral ou intravenosa acompanhamento e atenccedilatildeo meacutedica adequada No
entanto uma das principais consequecircncias da doenccedila eacute a sua capacidade de sobrecarregar
instalaccedilotildees meacutedicas durante um surto e em paiacuteses onde os recursos de sauacutede jaacute estatildeo no
limite isso pode ter efeitos catastroacuteficos Prevenccedilatildeo e tratamento portanto se fazem
altamente necessaacuterios (Perry 2011)
A prevalecircncia global de DENV cresceu drasticamente nas uacuteltimas deacutecadas e ateacute o
momento natildeo haacute nenhum medicamento especiacutefico para combater a infecccedilatildeo as medidas de
prevenccedilatildeo mais eficazes satildeo voltadas para o controle do vetor (Silva 2011) Diante disso a
Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) elegeu o desenvolvimento de vacinas contra o viacuterus da
dengue como prioridade mundial (Kinney 2001) Por conseguinte a busca de substacircncias
naturais ou sinteacuteticas com atividade antiviral especiacutefica sem toxicidade para as ceacutelulas
normais em seres humanos eacute uma estrateacutegia desejada para evitar que a dengue se agrave e
ajudar a controlar a difusatildeo da doenccedila As vaacuterias fases do ciclo viral representam alvos
terapecircuticos individuais que podem ser exploradas (Costa 2013) Nesse sentido vaacuterios
grupos de pesquisa e organizaccedilotildees estatildeo trabalhando com diversas abordagens para o
desenvolvimento de compostos antivirais com atividade protetora contra dengue Dentre elas
uma vasta gama de produtos naturais incluindo plantas numa tentativa de isolar e
caracterizar novos compostos que podem inibir a replicaccedilatildeo do viacuterus ou tratar a infecccedilatildeo
viral Por essa razatildeo extratos e componentes da planta satildeo cada vez mais importantes como
fontes potenciais para agentes antivirais (Silva 2011)
14 Naftoquinonas
As quinonas satildeo compostos aromaacuteticos amplamente distribuiacutedos na natureza e podem
ser encontrados em vaacuterias famiacutelias de plantas bem como isolado de fungos algas e
bacteacuterias Elas satildeo classificadas em benzoquinonas antraquinonas e naftoquinonas de acordo
com as suas estruturas quiacutemicas Naftoquinonas satildeo compostos orgacircnicos altamente reativos
utilizados como corantes naturais ou sinteacuteticos cujas cores variam de amarelo para vermelho
Apresentam cadeia carbocircnica similar ao naftaleno e satildeo caracterizadas por seus dois grupos
carbonila na posiccedilatildeo 1 e 4 por isso satildeo nomeadas de 14-naftoquinonas Os grupos carbonila
tambeacutem podem estar presente na posiccedilatildeo 12 com menor incidecircncia (Loacutepez 2014)
9
Figura 4 Estrutura quiacutemica da 12-naftoquinona (1) e 14-naftoquinona (2)
Entre as quinonas estatildeo compostos biologicamente importantes tais como o grupo da
vitamina K e a coenzima Q (ubiquinona) Estes compostos tecircm um papel importante no
metabolismo celular especialmente como carreadores de eleacutetrons Aleacutem de quinonas que
possuam uma funccedilatildeo bioloacutegica outros compostos desta classe tecircm sido encontrados
mostrando atividade antibioacutetica Alguns deles estatildeo presentes na natureza mas a maior parte
satildeo obtidos sinteticamente entre eles 2-hidroxi-3-alquil-14-naftoquinonas que possuem
evidecircncias de serem ativos in vitro contra os parasitas da malaacuteria e como coccidiostaacuteticos
(Ambrogi 1970)
A atividade bioloacutegica de quinonas estaacute muitas vezes relacionada com o seu
comportamento eletroquiacutemico A capacidade de aceitar um ou dois eleacutetrons para formar o
acircnion radical correspondente ou dianion pode ser o motivo da induccedilatildeo da formaccedilatildeo de
espeacutecies reativas de oxigecircnio responsaacuteveis pelo estresse oxidativo nas ceacutelulas A capacidade
de aceitar eleacutetrons de naftoquinonas pode ser alterada por mudanccedilas de posiccedilatildeo do grupo
carbonila (12- 14-naftoquinonas) ou diferentes substituintes ou funccedilotildees associadas agrave porccedilatildeo
de naftoquinona (Francisco 2010)
As naftoquinonas satildeo largamente encontradas em plantas micro-organismos e alguns
animais Estes compostos tecircm sido amplamente utilizados em diversas culturas como corantes
para cosmeacuteticos tecidos alimentos (Brandelli 2004) e para fins medicinais incluindo
antitumoral (Oliveira 1990 Ferreira 1996) anti-inflamatoacuterios antimalaacuterico antiviral
(Fonseca 2003 Hussain 2007) atibacterianos e antifuacutengicos (Nagata 1998) Estas atividades
bioloacutegicas tecircm justificado o grande nuacutemero de trabalhos (aproximadamente 42 ateacute abril 2016
ndash Pubmed) encontrados na literatura que visa a siacutentese e avaliaccedilatildeo de qualquer das quinonas
naturais ou seus anaacutelogos como agentes farmacoloacutegicos potenciais (Rahmoun 2013)
10
O Lapachol foi descoberto e estudado desde o seacuteculo XIX Foi isolado primeiramente
do lenho da aacutervore argentina ldquolapachordquo Tabebuia avellanedae (Bignoniaceae) conhecida
como Ipecirc roxo Os estudos quiacutemicos foram desenvolvidos inicialmente em 1892 (Fonseca
2003) O lapachol foi descrito pela primeira vez por Paterno em 1821 tendo sua estrutura
quiacutemica estabelecida em 1896 por Hooker que o identificou como uma naftoquinona Esta
naftoquinona possui accedilatildeo antiinflamatoacuteria analgeacutesica antibioacutetica e anti-neoplaacutesica
reconhecida (Arauacutejo 2002)
A β-lapachona (34-di-hidro-22-dimetil-2H-naptho [12-b] pirano-56-diona) eacute uma
quinona obtida de fontes naturais derivada da aacutervore Lapacho (Tabebuia avellanedae) nativa
da Ameacuterica do Sul e Central A siacutentese e quiacutemica da β-lapachona e compostos relacionados
foi inicialmente investigado no final do seacuteculo XIX e iniacutecio do seacuteculo XX pelo quiacutemico
Samuel Hooker Apesar de alguns estudos cliacutenicos sobre a bioatividade de naftoquinonas
terem sido relatados no iniacutecio de 1940 foi o relatoacuterio do potencial da β-lapachona como um
agente anti-tripanossoma em 1977 que revitalizou o estudo e caracterizaccedilatildeo deste composto
natural A β-lapachona tambeacutem apresenta vaacuterias accedilotildees farmacoloacutegicas incluindo accedilatildeo
formaccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (Hussain 2007)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do Lapachol (1) da α- Lapachona (2) e da β-
Lapachona (Fonseca et al 2003 Ferreira et al 2010)
11
Figura 6 Tabebuia avellanedae (Hussain 2007)
A β-lapachona eacute uma substacircncia natural facilmente obtida a partir do lapachol Esta
naftoquinona eacute o grande destaque desta classe de substacircncias porque se encontra em testes
cliacutenicos de fase II para o tratamento do cacircncer de pacircncreas (Ferreira 2010) O mecanismo de
accedilatildeo da β-lapachona diferencia-se de outros antineoplaacutesicos por atuar na topoisomerase I
promovendo a recuperaccedilatildeo da capacidade de apoptose celular Alguns estudos reportam sua
accedilatildeo sineacutergica de potenciaccedilatildeo com o Taxolreg
promovendo a inibiccedilatildeo em diferentes pontos de
replicaccedilatildeo celular aleacutem de sua combinaccedilatildeo com outros tratamentos como a aplicaccedilatildeo de
radiaccedilatildeo ionizante (Cunha 2005)
Vaacuterios estudos jaacute foram publicados demonstrando a atividade antiviral de
naftoquinonas naturais e sinteacuteticas A β-lapachona inibe seletivamente a replicaccedilatildeo do viacuterus
HIV-1 atuando na inibiccedilatildeo da enzima LTR117 Da mesma forma este composto eacute um
potente inibidor da enzima transcriptase reversa dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e
leucemia murina de Rauscher (RLV) inibindo tambeacutem a DNA polimerase A accedilatildeo inibitoacuteria
sobre estas enzimas revelou-se especiacutefica se comparada com a de outros inibidores
conhecidos (Silva 2003)
O Lapachol jaacute demonstrou atividade contra certas cepas virais incluindo Herpes virus
tipos I e II Outras naftoquinonas jaacute mostraram eficaacutecia contra cepas de Influenza virus
Poliomielite virus e estomatite vesicular Supotildee-se que o mecanismo de accedilatildeo destas quinonas
seja atraveacutes da inibiccedilatildeo da transcriptase reversa de retroviacuterus e da RNA polimerase Eacute relatado
12
que lapachol diminui a replicaccedilatildeo do viacuterus em seres humanos mas ainda natildeo existem
resultados de testes cliacutenicos disponiacuteveis (Hussain 2007)
Na avaliaccedilatildeo da atividade antiviral do Lapachol in vitro verificou-se que esta
substacircncia eacute ativa contra viacuterus RNA atuando tanto sobre viacuterus envelopados quanto sobre
partiacuteculas sem esta estrutura em concentraccedilotildees de 5 a 10 microgmL e ainda apresentou uma
pequena atividade sobre HSV (Herpes simplex I) e Ad5 (Adeno tipo 5) mas nenhuma
atividade sobre CoxB4 (Coxsackie B4) Em trabalho posterior demonstrou-se que nem o
Lapachol nem diversos dos seus derivados apresentaram atividade antiviral in vitro sobre
Poliovirus tipo 1 Ecovirus 19 e Coxsackie B tipo 4 Apenas os derivados 12-naftoquinonicos
e um intermediaacuterio da siacutentese Hoocker foram ativos contra o Echovirus 19 (Fonseca 2003)
Costa et al (2013) relataram que piranonaftoquinonas isocircmeras do lapachol possuem
atividade de inibiccedilatildeo da replicaccedilatildeo de DENV-2 atuando sobre a atividade da ATPase de NS3
(proteiacutena natildeo estrutural de DENV)
A utilizaccedilatildeo de testes in vitro por meio de ensaios de viabilidade celular constitui o
primeiro passo para a avaliaccedilatildeo da compatibilidade bioloacutegica de uma substacircncia e pode
fornecer elementos importantes para a anaacutelise da biocompatibilidade dos diferentes materiais
Para ser considerado natildeo citotoacutexico no teste de citotoxicidade in vitro um produto natildeo deve
ocasionar a morte das ceacutelulas nem afetar suas funccedilotildees celulares A prova do MTT eacute um dos
indicadores colorimeacutetricos de viabilidade celular mais utilizados sendo capaz de avaliar a
funccedilatildeo celular mitocondrial de acordo com a reduccedilatildeo enzimaacutetica do sal de tetrazoacutelio pelas
desidrogenases mitocondriais nas ceacutelulas viaacutevies (Arauacutejo et al 2008) Supotildee-se que o
mecanismo responsaacutevel pela citotoxicidade apresentada pelas quinonas esteja relacionado
com o estresse oxidativo causado por esses compostos poreacutem a capacidade de alquilaccedilatildeo de
nucleoacutefilos celulares tambeacutem representa correlaccedilatildeo com tais efeitos bioloacutegicos (Goulart
2004)
13
II JUSTIFICATIVA
14
2 JUSTIFICATIVA
Aleacutem do controle do mosquito transmissor e do desenvolvimento de vacinas que tem
sido exaustivamente estudado nos uacuteltimos anos uma alternativa para o combate agrave dengue
seria o desenvolvimento de faacutermacos para reduzir a viremia ou mesmo para controlar a
resposta imune do hospedeiro agrave infecccedilatildeo que tem sido apontada como principal fator de risco
nos casos mais graves Em funccedilatildeo disso o nuacutemero de pesquisas visando o desenvolvimento
de drogas com accedilatildeo antiviral ou com accedilatildeo imunomodulatoacuteria tem aumentado
significativamente As naftoquinonas vecircm ganhando bastante importacircncia na pesquisa de
novas drogas antivirais devido agrave algumas atividades apresentadas A szlig-lapachona-orto-
naftoquinona por exemplo se mostrou um potente inibidor da enzima transcriptase reversa
dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e leucemia murina de Rauscher (RLV)
Diante da inexistecircncia de drogas com accedilatildeo anti DENV e o elevado nuacutemero e casos da
patogenia nos uacuteltimos anos a organizaccedilatildeo mundial da sauacutede classificou a Dengue como uma
epidemia de proporccedilotildees globais e um problema de sauacutede puacuteblica Como as naftoquinonas jaacute
demonstraram na literatura possuir um potencial efeito terapecircutico contra alguns viacuterus eacute
possiacutevel que estes compostos possam apresentar atividade antiviral contra DENV Portanto
este trabalho visou atraveacutes de ensaios de MTT e titulaccedilotildees virais em placa avaliar a potencial
atividade antiviral de oito compostos derivados de naftoquinonas naturais e sinteacuteticas
15
III OBJETIVOS
16
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar oito compostos (2 naturais e 6 sinteacuteticos) derivados de naftoquinonas como potenciais
agentes antivirais em ceacutelulas BHK-21 frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1 e 2
32 Objetivos especiacuteficos
1 Calcular o iacutendice de citotoxicidade e a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) dos compostos
atraveacutes de ensaio de reduccedilatildeo de MTT
2 Avaliar os efeitos dos compostos sobre o crescimento a viabilidade e o volume celular
pela teacutecnica de exclusatildeo do azul de tripan
3 Determinar a multiplicidade de infecccedilatildeo de DENV 1 e 2 a ser utilizada nos ensaios
antivirais
4 Avaliar a atividade antiviral dos compostos frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1
e 2 atraveacutes do ensaio de MTT
5 Verificar um possiacutevel efeito direto dos compostos agraves partiacuteculas virais de Dengue virus
6 Quantificar a produccedilatildeo de partiacuteculas virais infecciosas no sobrenadante de ceacutelulas
infectadas atraveacutes de titulaccedilatildeo viral pela contagem de unidades formadoras de placas
17
IV MATERIAL E MEacuteTODOS
18
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Linhagens celulares
411 Ceacutelulas C636
As ceacutelulas C636 satildeo ceacutelulas de linhagem contiacutenua de larvas de mosquito Aedes
albopictus Estas ceacutelulas foram utilizadas na produccedilatildeo de estoque viral de DENV sorotipos 1
e 2 para isso foram mantidas em meio de cultura Leibovitz-15 (L-15) (Cultilab)
suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (Cultilab) antibioacuteticos (Penicilina 100 UmL
Streptomicina 100 microgmL) e antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL) a 28degC
412 Ceacutelulas BHK-21
As ceacutelulas BHK-21 satildeo fibroblastos de linhagem contiacutenua derivados de rim de hamster
neonato Estas ceacutelulas foram utilizadas para os experimentos in vitro e para as titulaccedilotildees de
DENV 1 e 2 para isso foram mantidas em meio miacutenimo essencial modificado por Dulbecco
ndash DMEM (Cultilab) suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (SFB) com antibioacuteticos
(Penicilina 100 UmL Streptomicina 100 microgmL) e com antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL)
sendo mantidas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5
42 Viacuterus
421 DENV 1 e DENV 2
O Sorotipo 1 do Dengue virus (DENV-1) estirpe Mochizuki foi replicado em ceacutelulas
C636 para gerar estoques de trabalho durante 2 e 5 dias a 28degC O sobrenadante da cultura de
ceacutelulas infectadas foi recolhido e clarificado por centrifugaccedilatildeo a 4000 G durante 10 minutos agrave
4degC e entatildeo foi aliquotado e armazenado a -70 deg C como reserva de viacuterus ateacute agrave sua utilizaccedilatildeo
A replicaccedilatildeo geraccedilatildeo de estoque e titulaccedilatildeo do Sorotipo 2 do Dengue virus (DENV-2)
estirpe Nova Guineacute C ocorreu nos mesmos moldes do DENV-1
19
422 Titulaccedilatildeo viral
Os estoques virais foram diluiacutedos (10-1
a 10-7
) e inoculados em monocamadas de
ceacutelulas BHK-21 implantadas em placas de 6 poccedilos com confluecircncia de aproximadamente
60 (3x105 ceacutelulas por poccedilo) sendo um poccedilo natildeo infectado mantido para controle celular
Apoacutes uma hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus foram adicionados 3 mL de meio DMEM (Cultilab)
suplementado com 15 de SFB e contendo 15 de Carboximetilcelulose (CMC Synth) As
placas foram entatildeo incubadas a 37degC (CO2 a 5) por 96 horas As ceacutelulas foram entatildeo
fixadas com 2 mL de soluccedilatildeo de formol a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo
1 (pv) de cristal violeta em PBS para contagem das placas de lise O tiacutetulo viral foi
expresso atraveacutes do nuacutemero de unidades formadoras de placa por mL (UFPmL) segundo a
formula abaixo representada
Tiacutetulo viral (UFPmL) = N x FC x 10
N = nuacutemero de placas de lise contadas
FC = Fator de correccedilatildeo
= Inverso da diluiccedilatildeo na qual foram contadas as placas de lise
43 Compostos de naftoquinonas
Os compostos utilizados neste estudo foram fornecidos pelo Dr Geraldo Ceacutelio
Brandatildeo do laboratoacuterio de pesquisa da Escola de Farmaacutecia da Universidade Federal de Ouro
Preto
20
Tabela 1 Relaccedilatildeo de nome estrutura e coacutedigo dos compostos utilizados Na tabela estatildeo
presentes a relaccedilatildeo dos nomes dos compostos utilizados neste trabalho bem como sua
estrutura Os coacutedigos representantes de cada composto seratildeo utilizados no decorrer da escrita
Nome do composto Estrutura Coacutedigo
Lapachol
A1
β-lapachona
A2
2-Hidroxi-3-(ββ-dimetilvinil)-14-naftoquinona
A3
2-Cloro-14-naftoquinona
A4
Lapachol derivado 1
A5
Lapachol derivado 2 A6
Lapachol derivado 3 A7
Lapachol derivado 4 A8
44 Ensaio de citotoxicidade
Para avaliar a citotoxicidade dos compostos ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas foram incubadas com diferentes concentraccedilotildees dos compostos em triplicata num
volume de 200 microL de meio de cultura por poccedilo na presenccedila de 1 de SFB Os controles natildeo
tratados apresentaram adiccedilatildeo de 200 microL de meio de cultura As ceacutelulas foram entatildeo incubadas
durante 72 horas O meio foi removido e 28 microL de soluccedilatildeo de 5 mg mL MTT (brometo de 3-
21
[45-dimetil-tiazol-2-il]-25 difeniltertrazoacutelio) foi adicionado a cada poccedilo As placas foram re-
incubadas durante 1 hora e 30 minutos e entatildeo 122 microL de DMSO foi adicionado a cada poccedilo e
placas foram agitadas suavemente durante 15 minutos para dissolver os cristais de formazan
A absorbacircncia foi lida em um equipamento leitor de placas Victor X3 (PerkinElmer) a 490
nm A concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC 50) foi definida como a concentraccedilatildeo da amostra que
reduziu a viabilidade celular de 50 em comparaccedilatildeo com controles natildeo tratados Os dados
foram analisados utilizando o programa Prisma
45 Avaliaccedilatildeo da viabilidade e crescimento celular por exclusatildeo de azul de tripan
Ceacutelulas BHK-21 foram cultivadas em placas de 24 poccedilos (7x104 ceacutelulaspoccedilo) e apoacutes
24 horas foram tratadas com as concentraccedilotildees de uso de cada composto e incubadas por 72
horas na presenccedila de 1 de SFB A seguir as ceacutelulas foram tripsinizadas e incubadas com
azul de tripan e entatildeo foi utilizado um contador automatizado de ceacutelulas (Countess II FL
Automated Cell Counter ndash Thermo Fisher Scientific) para contagem das ceacutelulas e avaliaccedilatildeo da
porcentagem de viabilidade e diacircmetro celular do controle nos tempos de 0 24 e 96 horas e
avaliaccedilatildeo dos mesmos paracircmetros para os compostos no tempo de 96 horas (72 horas poacutes
tratamento)
Outra curva de multiplicaccedilatildeo celular foi feita para os compostos A1 A3 A4 e A5 onde as
ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos no momento da confecccedilatildeo da placa e
foram avaliados os mesmos paracircmetros nos tempos de 0 12 24 48 e 72 horas O
equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
46 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
Para determinar a menor Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) responsaacutevel pela letalidade
celular total 2x104 de ceacutelulas BHK-21 foram semeadas em placa de 96 poccedilos Apoacutes a
incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o
meio de cultura foi removido e as ceacutelulas foram expostas a diferentes diluiccedilotildees dos dois
sorotipos de DENV (100 microL de cada diluiccedilatildeo + 100 microL de meio DEMEM 1 SFB) As
diluiccedilotildees seriadas foram realizadas da suspensatildeo viral na razatildeo de 5 para o primeiro poccedilo e de
2 para os demais poccedilos Apoacutes 72 horas as ceacutelulas foram entatildeo fixadas com 200 microL de soluccedilatildeo
22
formalina a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo 1 (pv) de cristal violeta em
PBS para avaliaccedilatildeo da maior diluiccedilatildeo responsaacutevel pela letalidade de 100 das ceacutelulas
47 Ensaio Dose-resposta
Para cada composto foram realizados ensaios de dose-resposta para definiccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de cada composto capaz de promover a reduccedilatildeo na produccedilatildeo viral A atividade
antiviral foi avaliada tambeacutem pelo meacutetodo de MTT Ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas expostas a diferentes concentraccedilotildees dos extratos determinadas a partir das maiores
concentraccedilotildees em que natildeo foram observados efeitos citotoacutexicos As ceacutelulas foram tratadas
com as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de cada composto e em seguida infectadas com DENV
1 (MOI= 5) ou 2 (MOI= 2) Mantendo uma coluna para controle com DMSO uma coluna
para controle de viacuterus uma coluna para controle de citotoxicidade dos compostos e por fim
uma coluna para controle celular As ceacutelulas foram entatildeo incubadas durante 72 horas Apoacutes
este tempo procedeu-se a leitura pelo ensaio de MTT como descrito anteriormente Os dados
foram analisados levando-se em consideraccedilatildeo a leitura das absorbacircncias dos poccedilos dos
controles de viacuterus e do controle celular
Para realizacao destes experimentos os seguintes controles foram adotados
Controle de ceacutelulas poccedilos contendo somente ceacutelulas acrescidas do meio de cultura DMEM
1 SFB Utilizado para avaliar o comportamento das ceacutelulas sem que as mesmas tivessem
contato com qualquer interferente durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo Com isso os poccedilos
reservados para esse controle serviram de padratildeo para comparaccedilatildeo com aqueles em que fosse
observada atividade citotoacutexica ou citopaacutetica
Controle de viacuterus poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM 1 SFB
sem nenhum tratamento e de suspensatildeo de viacuterus Utilizando como referecircncia para anaacutelise da
atividade citopaacutetica provocada pelo viacuterus testado durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo das placas
23
Controle de viacuterus com DMSO Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura
DMEM 1 SFB e DMSO Foi utilizado para avaliar se havia influecircncia prejudicial do
solvente utilizado para diluiccedilatildeo das amostras no meio de cultivo das ceacutelulas e se o mesmo
poderia apresentar alguma potencial atividade antiviral aparente
Controle de citotoxicidade Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM
1 SFB e as quatro principais concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos Foi utilizado
para avaliar se haveria alguma possiacutevel atividade citotoacutexica das concentraccedilotildees dos compostos
em relaccedilatildeo agraves ceacutelulas
48 Ensaio Virucida
Para a realizaccedilatildeo deste ensaio aliacutequotas de 950 microL (diluiccedilatildeo de 20 vezes) do DENV 1 (tiacutetulo
6 x 107 UFPmL) foram incubadas com 50 microL de uma soluccedilatildeo de meio DMEM preparada
com 20x a concentraccedilatildeo natildeo citotoacutexica de cada composto A1 a A8 em banho-maria 37deg C
por 1 hora Apoacutes a incubaccedilatildeo as aliacutequotas foram imediatamente tituladas em ceacutelulas BHK-21
em placas de 6 poccedilos utilizando-se 3 diluiccedilotildees para cada incubaccedilatildeo (20x 20 x 10-1
e 20 x 10-
2) Foram titulados tambeacutem uma aliacutequota incubada apenas com meio DMEM sem nenhum
tratamento e outra aliacutequota incubada com DMSO (Dimetilsulfoacutexido) Estas foram tituladas
utilizando um controle e mais cinco diluiccedilotildees (20x 20 x 10-1
20 x 10-2
20 x 10-3
e 20 x 10-4
)
49 Ensaio antiviral
Neste ensaio ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em placas de 24 poccedilos no dia
seguinte foram tratadas durante 4 horas com as concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas de cada
composto em duplicata Apoacutes o preacute-tratamento as monocamadas foram infectadas com
DENV-1 a uma MOI=5 na presenccedila das concentraccedilotildees de uso respectivas de cada composto
Apoacutes 1 hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus as monocamadas foram lavadas duas vezes com PBS e
foi adicionado 500 microL por poccedilo de meio preparado com as mesmas concentraccedilotildees dos
diferentes compostos e mantidos durante 48 horas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5 Em
quatro poccedilos as ceacutelulas foram infectadas e natildeo tratadas e em outros quatro poccedilos as ceacutelulas
natildeo foram tratadas e nem infectadas (controle de ceacutelulas) destes uacuteltimos dois foram
tripsinizados e contados no momento da infecccedilatildeo e os outros dois apoacutes o teacutermino do ensaio
24
para avaliar o crescimento celular Decorridas as 48 horas o sobrenadante foi coletado e
centrifugado por 10 minutos a 4000 xG para separaccedilatildeo dos debris celulares e prontamente
titulado em placa de 6 poccedilos
410 Anaacutelise estatiacutestica
Os valores de CC50 foram obtidos a partir de anaacutelise de regressatildeo linear das curvas de
concentraccedilatildeocitotoxicidade A anaacutelise estatiacutestica dos dados foi realizada pelo programa
GraphPad Prism software Uma anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi utilizada para determinar
as diferenccedilas estatiacutesticas seguida do poacutes teste de Tukey A significacircncia estatiacutestica foi fixada
em p lt005
25
V RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
26
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Ensaio de citotoxicidade celular
Para avaliar a viabilidade da linhagem celular BHK-21 frente ao tratamento com oito
diferentes concentraccedilotildees dos compostos (A1 a A8) realizou-se um ensaio de MTT (brometo
de 3-[45-dimetil-tiazol-2-il]-25-difeniltetrazoacutelio) Este ensaio tem o objetivo de quantificar
espectrofotometricamente o crescimento celular a viabilidade e proliferaccedilatildeo podendo ser
utilizado como um indicador direto de citotoxicidade Trata-se de um ensaio colorimeacutetrico
para medir a atividade da redutase mitocondrial em ceacutelulas vivas Ele se baseia na reduccedilatildeo do
sal amarelo tetrazoacutelio (permeaacutevel agrave membrana celular) para cristais de formazan azuis
puacuterpura por ceacutelulas metabolicamente ativas a quantidade de formazan gerada medida por
espectrofotometria eacute proporcional ao nuacutemero de ceacutelulas viaacuteveis
A CC50 foi calculada plotando-se uma curva de porcentagem de viabilidade celular por
concentraccedilatildeo melhor representada na figura 7 pelo composto A7 e os resultados de CC50
para todos os compostos estatildeo representados na tabela 2 Foram feitos ensaios de
citotoxicidade com oito concentraccedilotildees diferentes sendo escolhida a maior concentraccedilatildeo que
natildeo apresentou citotoxicidade
Viabilidade Celular = [ ( A ndash B ) A ] x 100
Onde
A = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas natildeo tratadas
B = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas tratadas com
as respectivas concentraccedilotildees de cada composto
27
28
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (A curva dose resposta do composto A7 eacute a que
melhor representa a curva dose resposta esperada) Avaliou-se a viabilidade da linhagem
celular BHK-21 frente agrave diferentes concentraccedilotildees dos compostos realizando o ensaio de MTT
e determinando assim as concentraccedilotildees a serem utilizadas nos proacuteximos ensaios bem como
calculando a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) agrave partir da curva
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo
da concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50)
Composto Concentraccedilatildeo utilizada
[ ] microgmL
Concentraccedilatildeo citotoacutexica 50
(CC50) [ ] microgmL plusmn Desvio
Padratildeo
A1 ([ ]=1 mgmL) 00200 10010 plusmn 0014
A2 ([ ]=1 mgmL) 00025 09561 plusmn 0023
A3 ([ ]=1 mgmL) 00025 09988 plusmn 0017
A4 ([ ]=5 mgmL) 00125 10150 plusmn 0036
A5 ([ ]=10 mgmL) 00250 10590 plusmn 0047
A6 ([ ]=5 mgmL) 00250 08183 plusmn 0030
A7 ([ ]=5 mgmL) 00125 10280 plusmn 0052
A8 ([ ]=5 mgmL) 00125 09758 plusmn 0036
52 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan
Para corroborar o ensaio anterior de citotoxicidade utilizou -se o teste de viabilidade
celular pela teacutecnica da exclusatildeo do azul de tripan com a finalidade de determinar a
viabilidade das ceacutelulas Os procedimentos adotados no ensaio seguiram o manual do
equipamento contador automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL Automated Cell Counter) entatildeo
foi acrescentado agrave 10 microL da suspensatildeo celular 10 microL de azul de tripan (04) Apoacutes
homogeneizaccedilatildeo 10 microL da suspensatildeo foi colocada no local indicado da lacircmina proacutepria para
leitura e foi realizada a contagem sendo consideradas mortas (inviaacuteveis) as ceacutelulas que
incorporavam o corante e viaacuteveis as que excluiacuteam o azul de tripan
29
O equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
(A)
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan A avaliaccedilatildeo da
viabilidade celular foi realizada atraveacutes de um contador automaacutetico de ceacutelulas Este
equipamento possibilita explorar ferramentas de fotografia e avaliar alguns paracircmetros
importantes (A) fotografia das ceacutelulas (B) Zoom na fotografia das ceacutelulas com marcaccedilotildees
(em verde para ceacutelulas vivas e vermelho para mortas) e (D) contagem das ceacutelulas totais
ceacutelulas vivas e mortas graacutefico e meacutedia dos diacircmetros celulares das ceacutelulas vivas e mortas
(B)
(C)
30
O crescimento celular de ceacutelulas natildeo tratadas foi avaliado nos tempos de 0h (momento
da confecccedilatildeo da placa) 24h (momento de tratamento com os compostos) e 96 horas
(Momento em que todas as ceacutelulas foram tripsinizadas e contadas) para avaliar o perfil do
crescimento celular em ceacutelulas natildeo tratadas Foi observado um crescimento celular no periacuteodo
de 24 horas onde as ceacutelulas estavam incubadas com meio acrescido de 10 SFB Em 24
horas o meio foi trocado por 1 SFB e acrescido das substacircncias testes nas menores diluiccedilotildees
natildeo citotoacutexicas determinadas pelo ensaio do MTT Em 96 horas pode ser observado um
decaimento no nuacutemero de ceacutelulas vivas provavelmente devido ao crescimento celular (morte
por confluecircncia)
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas)
(A) (B)
31
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas (A)
Contagem de ceacutelulas vivas (B) Percentual de ceacutelulas viaacuteveis (Viabilidade celular ) e (C)
Meacutedia do diacircmetro apresentado pelas ceacutelulas vivas
Em 96 horas as ceacutelulas natildeo tratadas bem como as ceacutelulas tratadas por 72 horas com as
concentraccedilotildees de uso dos compostos foram tripsinizadas e avaliadas quanto ao nuacutemero de
ceacutelulas vivas viabilidade e diacircmetro celular apresentados na figura 10
Segundo se observa natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo aparente que possa demonstrar que
as concentraccedilotildees de uso dos compostos tenham causado alguma atividade citotoacutexica
corroborando assim os ensaios de citotoxicidade anteriores
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
A infectividade de um viacuterus depende de vaacuterios fatores entre eles da proporccedilatildeo de
partiacuteculas virais completas ou infecciosas da suscetibilidade da ceacutelula hospedeira e da
chance desta partiacutecula encontrar o receptor e penetrar na ceacutelula Quando ceacutelulas suscetiacuteveis
satildeo misturadas com uma suspensatildeo de viacuterus estas podem receber uma duas trecircs ou dez
partiacuteculas virais ou nenhuma Isto depende da proporccedilatildeo entre a quantidade de viacuterus
infecciosos presente no inoculo e a quantidade de ceacutelulas utilizada Esta relaccedilatildeo eacute denominada
de multiplicidade de infecccedilatildeo ou MOI Uma MOI=1 indica que a infecccedilatildeo foi feita em
principio com 1 viacuterus ou 1 dose infectante por ceacutelula
A determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo dos Dengue virus 1 e 2 a serem
utilizadas nos proacuteximos ensaios foi feita a partir da infecccedilatildeo de ceacutelulas BHK-21 por diferentes
(C)
32
concentraccedilotildees de viacuterus e revelaccedilatildeo com cristal violeta Escolheu-se a maior diluiccedilatildeo viral que
possibilitou a letalidade total das ceacutelulas (faixa onde todas as ceacutelulas estatildeo mortas utilizando
menor concentraccedilatildeo de viacuterus) As faixas escolhidas foram entatildeo calculadas levando-se em
consideraccedilatildeo o nuacutemero de ceacutelulas presentes no poccedilo e o nuacutemero de partiacuteculas virais que foram
adicionadas (Faixa3 para DENV2 e 2 para DENV1) Figura 11 Foi estipulado portanto a
Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 2 para DENV 2 e 5 para DENV 1
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI A partir da infecccedilatildeo da linhagem celular BHK-21 em
placa de 96 poccedilos com diferentes diluiccedilotildees de DENV foi determinado que a Multiplicidade
de infecccedilatildeo para o Dengue viacuterus sorotipos 1 e 2 seria de 5 e 2 respectivamente (colunas 2 -
DENV1 e 3 - DENV2)
54 Ensaio dose resposta
Apoacutes a determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas ideais realizou-se um
ensaio dose resposta tratando as ceacutelulas com oito concentraccedilotildees agrave partir das concentraccedilotildees natildeo
citotoacutexicas escolhidas para cada composto e em seguida infectando com DENV sorotipos 1 e
2 nas MOIs estipuladas anteriormente (5 e 2 respectivamente) A porcentagem do efeito
protetor conferida agraves ceacutelulas para cada concentraccedilatildeo de amostra testada foi calculada da
seguinte forma
33
EP = [ (A ndash B) (C ndash B) ] x 100
Onde
A Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas tratadas e infectadas
B Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e infectadas
C Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e natildeo infectadas
Este ensaio tem por objetivo identificar a resposta celular agrave infecccedilatildeo frente ao
tratamento com os compostos em diferentes concentraccedilotildees Assim como o ensaio de
toxicidade este ensaio feito utilizando a teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT permite o teste de vaacuterias
concentraccedilotildees diferentes em um menor tempo e com baixo gasto de material
34
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV1
(MOI=5)
35
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV2
(MOI=2)
36
Takegami et al (1998) demonstraram atividade de furanonaftoquinonas contra o viacuterus
da Encefalite Japonesa (Flavivirus) utilizando a concentraccedilatildeo de 3microgmL poreacutem para os
compostos apresentados avaliados pela teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT nenhuma das
concentraccedilotildees apresentadas produziu efeito antiviral significativo em relaccedilatildeo ao controle
celular como observado nas figuras 12 e 13
Apesar da teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT ser interessante como triagem de atividade
antiviral permitindo o teste de vaacuterias concentraccedilotildees dos compostos em menor tempo e
utilizando uma quantidade razoaacutevel de materiais optou-se por utilizar as maiores
concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas encontradas avaliando sua atividade antiviral por outras
teacutecnicas Como natildeo foi avaliada atividade antiviral preacutevia para nenhum dos compostos frente
agrave infecccedilatildeo por DENV1 e 2 foi selecionado o Dengue virus 1 para dar prosseguimento aos
ensaios
55 Ensaio Virucida
O ensaio virucida foi realizado para avaliar um potencial efeito dos compostos
diretamente sobre a partiacutecula viral Este ensaio eacute importante pois possibilita elucidar se o
composto pode produzir algum efeito sobre a partiacutecula viral impedindo que esta possa infectar
as ceacutelulas
Figura 14 Ensaio virucida Neste ensaio as aliacutequotas de DENV1 foram incubadas com as
concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos e titulados (NT) Controle natildeo tratado
37
Tabela 3 Ensaio virucida Caacutelculo do tiacutetulo viral (UFPmL) e porcentagem representante de
cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 254 x 105 100
DMSO 263 x 105 10335
A1 199 x 105 7835
A2 205 x 105 8071
A3 237 x 105 9311
A4 775 x 104 3049
A5 153 x 105 6024
A6 219 x 105 8602
A7 243 x 105 9547
A8 254 x 105 100
Lagrota et al (1988) demonstraram atividade de 2-HO-3-N-benzil-N(N-benzil-2-
etilamina) -14-naftoquinona sobre a partiacutecula viral de enterovirus De forma contraacuteria apesar
de se verificar a reduccedilatildeo de quase uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais
para o composto A4 natildeo considerou-se esta uma alteraccedilatildeo significativa pois devido agrave
magnitude do nuacutemero de UFPs se trata de uma alteraccedilatildeo muito pequena Portanto os
compostos avaliados neste trabalho natildeo produziram atividade virucida aparente frente ao
tratamento com as concentraccedilotildees de uso
56 Ensaio Antiviral
O sobrenadante de ceacutelulas tratadas previamente e infectadas por DENV1 coletado 48
horas poacutes infecccedilatildeo foi avaliado quanto agrave produccedilatildeo viral de partiacuteculas infecciosas pela
contagem de placas de lise e caacutelculo de Unidades Formadoras de Placa (Titulaccedilatildeo viral em
placa ndash UFPmL)
38
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral Sobrenadante de ceacutelulas tratadas e infectadas por DENV1
coletado apoacutes 48 horas e titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado
Tabela 4 Ensaio Antiviral Coleta do sobrenadante de ceacutelulas infectadas por DENV1 Tiacutetulo
viral (UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o
controle natildeo tratado como 100
Ao perceber um aumento no tiacutetulo viral frente ao tratamento com os compostos A1
A2 e A3 e uma reduccedilatildeo frente ao tratamento com A4 A5 e A6 foram escolhidos dois
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 119 x 105 10000
A1 235 x 105 19748
A2 228 x 105 19160
A3 318 x 105 26723
A4 128 x 104 1076
A5 186 x 103 156
A6 190 x 104 1597
A7 280 x 104 2353
A8 350 x 104 2941
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
40
Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
VII
AGRADECIMENTOS
Agradeccedilo primeiramente agrave Deus por ser o meu sustento e proteccedilatildeo
Aos meus pais Antocircnio e Sandra pelas oraccedilotildees esforccedilo carinho e dedicaccedilatildeo
E ao meu irmatildeo Joatildeo Paulo e minha Cunhada Naacutedia pelo apoio e torcida
Ao Prof Dr Breno de Mello Silva e Prof Dr Geraldo Ceacutelio Brandatildeo pela oportunidade e
orientaccedilatildeo durante o desenvolvimento do mestrado
Agrave toda equipe do LBTM em especial a Ana Claudia Cyntia e Erica pelo companheirismo
ajuda e incentivo
Aos meus amigos que fizeram parte de toda esta trajetoacuteria
Aos laboratoacuterios do NUPEB pela permissatildeo e ajuda no uso de diversos equipamentos
Agrave Universidade Federal de Ouro Preto por todas as oportunidades oferecidas
Agrave CAPES pelo apoio financeiro
Agrave todos aqueles que de alguma forma auxiliaram para o desenvolvimento e conclusatildeo deste
trabalho
VIII
RESUMO
O Dengue virus (DENV) possui quatro sorotipos diferentes (1-4) que satildeo principalmente
transmitidos pelo mosquito Aedes aegypti A infecccedilatildeo resulta na patogecircnese da dengue que eacute
uma epidemia de proporccedilotildees globais Apesar dos esforccedilos ainda natildeo existe uma vacina eficaz
contra os quatro sorotipos bem como drogas eficientes no tratamento de pacientes Portanto
vaacuterios estudos tem sido conduzidos na busca de faacutermacos com atividade antiviral contra o
DENV e outros Flavivirus Dentre os compostos estudados para este fim estatildeo as
naftoquinonas metaboacutelitos secundaacuterios produzidos por algas fungos plantas e animais Estes
compostos podem ser extraiacutedos principalmente a partir de plantas do gecircnero Tabebuia
(famiacutelia Bignoniaceae) satildeo caracterizados por apresentar atividade antiviral destacando-se a
szlig-lapachona potente inibidor da enzima transcriptase reversa dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria
(AMV) e leucemia murina de Rauscher (RLV) O objetivo deste trabalho foi testar oito
diferentes compostos derivados de naftoquinonas sinteacuteticas e naturais com potencial atividade
antiviral contra DENV Para isso uma triagem foi realizada por reduccedilatildeo de MTT (brometo de
3- (45-dimetiltiazol-2-il) -25-brometo difenil tetrazolina) para avaliar a atividade citotoacutexica
de oito compostos na linhagem celular BHK-21 resultando no caacutelculo da concentraccedilatildeo
citotoacutexica 50 (CC50) e as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas a serem utilizada em testes
subsequentes para os compostos A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 e A8 (lapachol β-lapachona 2-
Hidroxi-3-(ββ-dimetilvinil)-14-naftoquinona 2-Cloro-14-naftoquinona e 4 derivados de
lapachol) Em seguida ceacutelulas BHK-21 foram incubadas com os compostos em concentraccedilotildees
natildeo citotoacutexicas em diferentes diluiccedilotildees e infectadas com os sorotipos 1 e 2 DENV na
multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 5 e 2 para os sorotipos 1 e 2 respectivamente A
atividade antiviral foi testada atraveacutes da anaacutelise de reduccedilatildeo de MTT e pela titulaccedilatildeo de virus
liberados no sobrenadante Apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute
uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes
faacutermacos natildeo demonstraram atividade antiviral nas condiccedilotildees experimentais testadas
IX
ABSTRACT
The Dengue virus (DENV) has four different serotypes (1-4) that are primarily transmitted by
the mosquito Aedes aegypti Infection results in the pathogenesis of dengue which is an
epidemic of global proportions Despite these efforts there is still no effective vaccine against
the four serotypes as well as efficient drugs in the treatment of patients Therefore various
studies have been conducted in the search for drugs with antiviral activity against DENV and
other flaviviruses Among the studied compounds for this purpose are the naphthoquinones
secondary metabolites produced by algae fungi plants and animals These compounds can be
mainly extracted from plants of the genus Tabebuia (Bignoniaceae) are characterized by
having antiviral activity especially the szlig-lapachone potent inhibitor of the enzyme reverse
transcriptase of avian myeloblastosis virus (AMV) and murine leukemia Rauscher (RLV)
The aim of this study was to test eight different compounds derived from synthetic and
natural naphthoquinones with potential antiviral activity against DENV For this a screening
was performed by reduction of MTT (3- (45-dimethylthiazol-2-yl) -25-diphenyl bromide
tetrazolina) to assess the cytotoxic activity of the compounds eight BHK-21 cell line resulting
in the calculation of the cytotoxic concentration 50 (CC50) and non-cytotoxic
concentrations to be used in subsequent tests for compounds A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 and
A8 (lapachol β-lapachone 2-hydroxy -3- (β β-dimethylvinyl) -14-naphthoquinone 2-
chloro-14-naphthoquinone and derivatives lapachol 4) Then BHK-21 cells were incubated
with compounds at non-cytotoxic concentrations in different dilutions and infected with
serotypes 1 and 2 DENV at multiplicity of infection (MOI) of 5 and 2 for serotypes 1 and 2
respectively The antiviral activity was assayed by MTT reduction assay and the virus titer
released into the supernatant Although some compounds have shown reduced to one log unit
in the number of viral particles results indicate that these drugs did not show antiviral activity
in experimental conditions
X
SUMAacuteRIO
RESUMO VIII
ABSTRACT IX
LISTA DE FIGURAS XII
LISTA DE TABELAS XIII
1 INTRODUCcedilAtildeO 2
11 Flavivirus 2
12 Dengue virus 3
13 Epidemiologia 6
14 Naftoquinonas 8
3 OBJETIVOS 16
31 Objetivo Geral 16
32 Objetivos especiacuteficos 16
4 MATERIAL E MEacuteTODOS 18
41 Linhagens celulares 18
411 Ceacutelulas C636 18
412 Ceacutelulas BHK-21 18
42 Viacuterus 18
421 DENV 1 e DENV 2 18
422 Titulaccedilatildeo viral 19
43 Compostos de naftoquinonas 19
44 Ensaio de citotoxicidade 20
45 Avaliaccedilatildeo da viabilidade e crescimento celular por exclusatildeo de azul de tripan 21
46 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) 21
47 Ensaio Dose-resposta 22
48 Ensaio Virucida 23
49 Ensaio antiviral 23
410 Anaacutelise estatiacutestica 24
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO 26
51 Ensaio de citotoxicidade celular 26
52 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan 28
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) 31
54 Ensaio dose resposta 32
XI
55 Ensaio Virucida 36
56 Ensaio Antiviral 37
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao tratamento com
os compostos A1 A3 A4 e A5 40
6 CONCLUSAtildeO 44
7 PERSPECTIVAS 46
8 REFEREcircNCIAS 48
XII
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Estrutura da partiacutecula viral de Dengue viacuterus 4
Figura 2 Ciclo de multiplicaccedilatildeo de DENV 5
Figura 3 Distribuiccedilatildeo geograacutefica da Dengue 7
Figura 4 Estrutura quiacutemica da 12-naftoquinona (1) e 14-naftoquinona (2) 9
Figura 5 Estrutura quiacutemica do Lapachol (1) da α- Lapachona (2) e da β-Lapachona 10
Figura 6 Tabebuia avellanedae 11
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (Exemplo da curva dose resposta do composto A7) 28
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan 29
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas) 30
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas 31
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI 32
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 34
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 35
Figura 14 Ensaio virucida 36
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral 38
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados 39
Figura 17 Curva de crescimento celular 41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular 41
XIII
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Relaccedilatildeo de nome estrutura e coacutedigo dos compostos utilizados 20
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo da
concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) 28
Tabela 3 Ensaio virucida 37
Tabela 4 Ensaio Antiviral 38
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados 39
XIV
LISTA DE ABREVIATURAS
AMV ndash Mielobastose Aviaacuteria viacuterus (Avian Myeloblastosis virus )
CC50 ndash Concentraccedilatildeo Citotoacutexica 50
DENV ndash Dengue virus
DMEM ndash Meio baacutesico modificado por Dulbecco (Dulbeccos Modified Eagle Medium)
DMSO ndash Dimetilsulfoacutexido
ICTV ndash Comitecirc Inernacional de Taxonomia Viral
JEV ndash Viacuterus da Encefalite Japonesa (Japanese Encephalitis virus)
MOI ndash Multiplicidade de infecccedilatildeo viral
NS ndash Proteiacutenas natildeo estruturais
NT ndash Natildeo Tratado
OMS ndash Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede
RE ndash Retiacuteculo endoplasmaacutetico
RLV ndash Viacuterus da Leucemia Murina de Rauscher (Murine leukemia virus)
SFB ndash Soro Fetal Bovino
UFP ndash Unidades formadoras de placas
WNV ndash Viacuterus do Nilo Ocidental (West Nile virus)
YFV ndash Viacuterus da febre amarela (Yellow fever virus)
ZV ndash Zika virus
1
I INTRODUCcedilAtildeO
2
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Flavivirus
O Gecircnero Flavivirus pertencente agrave famiacutelia Flaviviridae inclui 53 espeacutecies
taxonomicamente reconhecidas (ICTV 2016) muitas das quais satildeo importantes patoacutegenos
humanos tais como o Dengue virus (DENV) Yellow fever virus (YFV - viacuterus da febre
amarela ndash protoacutetipo deste gecircnero) Japanese encephalitis virus (JEV - viacuterus da encefalite
japonesa) West Nile virus (WNV - virus do Nilo Ocidental) Zika virus (ZV) entre outros
(Villordo 2016) O nome flavivirus eacute derivado da palavra latina flavus que significa amarelo
significando a icteriacutecia causada pelo YFV Os sintomas da infecccedilatildeo por flavivirus pode variar
de leve febre e mal-estar a encefalite fatal e febre hemorraacutegica (Mukhopadhyay 2005)
Estes viacuterus regulam o metabolismo e a sobrevivecircncia das ceacutelulas infectadas
assegurando a sua proacutepria reproduccedilatildeo e propagaccedilatildeo O viacuterus da dengue tambeacutem provoca a
autofagia uma resposta homeostaacutetica geral que ajuda a ceacutelula infectada sobreviver e produzir
viacuterus (Datan 2016)
Os Flavivirus podem ser agrupados em complexos e sub-complexos antigecircnicos
baseados em criteacuterios soroloacutegicos ou em grupos clados e espeacutecies segundo a sua filogenia
molecular (Lindenbach 2007) A maioria dos membros deste gecircnero satildeo arbovirus (arthropod
borne virus) ou seja satildeo essencialmente transmitidos por Artroacutepodes (Mackenzie 2004)
onde 27 satildeo transmitidos por mosquitos 12 por carrapatos e 14 natildeo possuem vetor
conhecido Os viacuterus transmitidos pela fecircmea do gecircnero Aedes incluem DENV e YFV satildeo
viscerotroacutepicos e possuem primatas como reservatoacuterio natural (Gaunt 2001)
A patogenia da Dengue causada pelo DENV constitui uma das doenccedilas virais mais
importantes em seres humanos transmitidos por insetos e eacute responsaacutevel por cerca de 390
milhotildees de infecccedilotildees por ano O YFV por sua vez causador da febre amarela eacute endecircmico em
vaacuterios paiacuteses do continente Africano e da Ameacuterica do Sul resultando em 200000 casos e
30000 mortes na Aacutefrica mesmo com vacinas eficazes disponiacuteveis Outras doenccedilas causadas
por flaviviacuterus incluem a encefalite do Nilo Ocidental (West Nile virus) e febre Zika (Zika
virus) que satildeo consideradas doenccedilas emergentes com surtos importantes em todo o mundo
(Villordo 2016)
3
12 Dengue virus
Os DENV pertencem ao gecircnero flaviviacuterus e evoluiram em primatas natildeo-humanos a
partir de um ancestral comum Eacute composto por quatro sorotipos antigenicamente distintos
(DENV1-4) que co-circulam por todo o Sudeste da Aacutesia Aacutefrica e Ameacutericas (McArthur 2013)
e em outubro de 2013 foi anunciado um novo sorotipo circulante denominado entatildeo de DENV
5 (Normile 2013) A partiacutecula infecciosa eacute esfeacuterica com 40-50 nm de diacircmetro possuindo
um envelope de lipopolissacariacutedeo O genoma consiste em RNA de fita simples natildeo
segmentado e senso positivo de aproximadamente 11 kb de comprimento e possui uma uacutenica
janela aberta de leitura (start codon) (Guzman 2010) Apoacutes a traduccedilatildeo a uacutenica poliproteiacutena
formada eacute clivada por proteases virais e celulares em trecircs proteiacutenas estruturais que compotildeem
a partiacutecula viral C (capsideo) prM M (membrana e o seu precursor) e E (envelope) e sete
proteiacutenas natildeo estruturais essenciais para a replicaccedilatildeo viral (NS) (NS1 NS2a NS2b NS3
NS4a NS4b e NS5) (Robertson 2009)
A transmissatildeo do viacuterus ocorre atraveacutes da picada por fecircmeas infectadas de mosquitos
do gecircnero Aedes sendo responsaacutevel pelas maiores taxas de doenccedila e mortalidade entre os
membros do gecircnero Flavivirus (Mukhopadhyay 2005) No Brasil o Aedes aegypti eacute o
principal vetor de dengue enquanto o Aedes albopictus atua como um vector secundaacuterio
(Weaver 2010)
O diagnoacutestico soroloacutegico da Dengue se baseia na detecccedilatildeo de niacuteveis elevados de
anticorpos anti-Dengue-IgM ou anti-Dengue-IgG que reconhecem e se ligam ao antiacutegeno de
DENV A Glicoproteiacutena do envelope (E) uma proteiacutena estrutural de DENV eacute o alvo
antigecircnico mais importante destes anticorpos neutralizantes porque estaacute exposta na superfiacutecie
do viacuterus e medeia os receptores de ligaccedilatildeo e fusatildeo da ceacutelula hospedeira (Lee 2015)
Durante a infecccedilatildeo celular os virions de DENV se ligam agrave superfiacutecie da membrana
atraveacutes da glicoproteiacutena do envelope (E) a receptores especiacuteficos e satildeo internalizados por
endocitose Uma vez dentro do endossoma a acidificaccedilatildeo provocada pela ligaccedilatildeo de
lisossomos desencadeia uma trimerizaccedilatildeo irreversiacutevel da proteiacutena E que atua na fusatildeo das
membranas virais e endossomais celulares Apoacutes essa fusatildeo o nucleocapsideo eacute liberado no
citoplasma onde o mesmo eacute desnudado e a replicaccedilatildeo do genoma de RNA e montagem de
partiacuteculas eacute iniciada As partiacuteculas virais imaturas satildeo acumuladas no luacutemen do retiacuteculo
endoplasmaacutetico (RE) Essas partiacuteculas imaturas que contecircm proteiacutenas prM proteiacutena E
membrana lipiacutedica e nuacutecleo capsiacutedeo natildeo pode induzir a fusatildeo da ceacutelula hospedeira ou seja
4
neste estaacutegio elas natildeo satildeo infecciosas (Mukhopadhyay 2005) O processo de maturaccedilatildeo
desses viacuterus ocorre apoacutes a clivagem proteoliacutetica da proteiacutena precursora de membrana (prM)
transformando viacuterus inerte em partiacuteculas infecciosas (Li 2008) Partiacuteculas subvirais satildeo
tambeacutem produzidas no RE mas apenas contecircm as glicoproteiacutenas de membrana fazendo com
que estas partiacuteculas sejam natildeo infecciosas Os viacuterus maduros e as partiacuteculas sub-virais satildeo
liberados da ceacutelula hospedeira por exocitose (Mukhopadhyay 2005)
Na pele o DENV tende a infectar ceacutelulas dendriacuteticas imaturas Estas ceacutelulas infectadas
amadurecem e migram para os gacircnglios linfaacuteticos regionais ou locais onde apresentam
antiacutegenos virais agraves ceacutelulas T iniciando as respostas imunes Existe tambeacutem evidecircncia de
replicaccedilatildeo abundante de DENV em ceacutelulas do parecircnquima do fiacutegado e em macroacutefagos nos
gacircnglios linfaacuteticos fiacutegado e baccedilo bem como em monoacutecitos de sangue perifeacuterico (Guzman
2010)
Proteiacutena E
(diacutemero)
Proteiacutena
M
Proteiacutena C
ssRNA (+)
Figura 1 Estrutura da partiacutecula viral de Dengue viacuterus A partiacutecula viral eacute composta
por trecircs proteiacutenas estruturais proteiacutena de envelope (E) disposta em diacutemeros a proteiacutena
associada agrave membrana (M) e a proteiacutena do nucleocapsiacutedeo (C) O genoma de RNA fita-
simples de polaridade positiva se encontra dentro do nucleocapsiacutedeo (Adaptado de
httpviralzoneexpasyorgviralzoneall_by_species24html)
5
Figura 2 Ciclo de multiplicaccedilatildeo de DENV A Os viacuterus se ligam aos receptores na superfiacutecie da
ceacutelula e satildeo endocitados B Devido ao baixo pH dentro dos endossomas ocorre a fusatildeo de
membranas viral-celular mediada por proteiacutenas virais resultando na liberaccedilatildeo do RNA viral em um
processo chamado de desnudamento C O genoma viral eacute traduzido em uma uacutenica poliproteiacutena que
eacute processada por proteases do viacuterus e da ceacutelula hospedeira D O RNA eacute replicado por proteiacutenas
natildeo-estruturais do proacuteprio viacuterus E A montagem do viacuterus ocorre na membrana do Reticulo
endoplasmaacutetico no qual a proteiacutena do capsiacutedeo e o RNA viral satildeo envolvidos por glicoproteiacutenas e
pela membrana da organela para formar partiacuteculas virais imaturas F Partiacuteculas virais imaturas
utilizam a via secretora da ceacutelula hospedeira e sob o baixo pH do Complexo de Golgi a proteiacutena
precursora prM eacute clivada em proteiacutena M completando a maturaccedilatildeo do viacuterus GOs viacuterus maduros
satildeo entatildeo liberados das ceacutelulas por exocitose Os nuacutemeros indicados nas caixas coloridas referem-se
ao valor de pH dos respectivos compartimentos Imagem adaptada de PERERA 2009
Adsorccedilatildeo
Siacutentese e processamento
Fusatildeo e
Desnudamento
Replicaccedilatildeo do RNA
Montagem
Maturaccedilatildeo
Liberaccedilatildeo de
viacuterus
maduro
A
B
C
D
E
F
G
6
13 Epidemiologia
Ao longo das uacuteltimas deacutecadas a dengue se tornou a doenccedila viral transmitida por
mosquitos mais prevalente no mundo Estimativas de infecccedilatildeo pela OMS indicam que a
patologia eacute endecircmica em mais de 100 paiacuteses em todos os continentes exceto a Antaacutertida e
aflige principalmente paiacuteses pobres em recursos nas regiotildees tropicais e subtropicais (Perry
2011) Epidemias globais de DENV ocorreram ao longo das uacuteltimas deacutecadas em parte devido
agrave diminuiccedilatildeo dos esforccedilos no controle de mosquitos Satildeo estimados mais de 50 milhotildees de
casos de dengue anualmente (Mukhopadhyay 2005)
A Dengue eacute uma doenccedila viral sistecircmica aguda que se estabeleceu em todo o mundo
em ambos os ciclos de transmissatildeo endecircmicas e epidecircmicas A infecccedilatildeo pelo DENV em seres
humanos eacute frequentemente inaparente mas pode levar a uma grande variedade de
manifestaccedilotildees cliacutenicas de febre leve a siacutendrome do choque da dengue potencialmente fatal A
imunidade vitaliacutecia desenvolvida apoacutes a infecccedilatildeo com um dos quatro tipos de viacuterus eacute
especiacutefica para cada tipo e a progressatildeo para uma doenccedila mais grave eacute frequente mas natildeo
exclusivamente relacionada com infecccedilatildeo secundaacuteria por tipos heteroacutelogos No entanto
enquanto a expansatildeo histoacuterica desta doenccedila eacute bem documentada o elevado fardo de
problemas de sauacutede atribuiacuteveis agrave dengue em grande parte do mundo tropical e sub-tropical
permanecem pouco enumerados (Bhatt 2013)
O Brasil eacute um paiacutes de grande extensatildeo (8512000 km2) situado em uma zona
predominantemente tropical com extensas aacutereas de florestas na regiatildeo amazocircnica bem como
restos de uma floresta tropical na costa leste sudeste e sul entre outros ecossistemas A maior
parte do paiacutes tem um clima tropical e uma grande diversidade de plantas e animais portanto
um local adequado para a ocorrecircncia de patologias causadas por viacuterus transmitidos por
artroacutepodes (Figueiredo 2000) Segundo o boletim epidemioloacutegico do ministeacuterio da sauacutede em
2016 jaacute foram registrados 170103 casos provaacuteveis de dengue no paiacutes ateacute a semana
epidemioloacutegica 5 Nesse periacuteodo a regiatildeo Sudeste registrou o maior nuacutemero de casos
provaacuteveis (96664 casos 568) Em Minas Gerais jaacute foram registradas 19 mortes em
decorrecircncia da Dengue entre 1deg de janeiro e 14 de marccedilo deste ano Outros 91 oacutebitos estatildeo
sob investigaccedilatildeo (BRASIL 2016)
7
Figura 3 Distribuiccedilatildeo geograacutefica da Dengue Aacutereas de risco de transmissatildeo em amarelo
(Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede Adaptado de httpwwwwhointen)
As manifestaccedilotildees da doenccedila foram descritas pela primeira vez apoacutes a Segunda Guerra
Mundial coincidente com o aumento da urbanizaccedilatildeo particularmente na Aacutesia (Weaver 2010)
Atualmente o DENV eacute hiperendecircmico em muitas regiotildees tropicais onde 2 ou mais sorotipos
circulam endemicamente Embora DENV foi provavelmente introduzido periodicamente para
as Ameacutericas atraveacutes de navios desde o seacuteculo 17 o surgimento de DENV no Hemisfeacuterio
Ocidental comeccedilou mais tarde devido a uma campanha de sucesso parcial para erradicar o
vetor A aegypti para controlar a febre amarela Esta campanha teve sucesso na maior parte
das Ameacutericas da deacutecada de 1950 agrave deacutecada de 1970 mas foi interrompida O vetor entatildeo
rapidamente recolonizou quase toda a regiatildeo neotropical e subtropicais e a invasatildeo do DENV
seguiu logo depois Em 1985 A albopictus foi introduzido nos EUA e no Brasil
proporcionando um vetor para a transmissatildeo secundaacuteria de DENV nas Ameacutericas (Hawley
1987)
Os mosquitos vetores principalmente A aegypti tornam-se infectados quando eles se
alimentam do sangue de seres humanos durante o periacuteodo de cinco dias da viremia A
infecccedilatildeo produz um amplo espectro da doenccedila cliacutenica e varia de assintomaacutetica a doenccedila febril
auto-limitante A dengue tambeacutem conhecida como ldquofebre osso quebradordquo devido agraves fortes
dores nas articulaccedilotildees e inclui sintomas de febre alta dores musculares articulares e erupccedilatildeo
cutacircnea Uma pequena porcentagem de indiviacuteduos pode apresentar a siacutendrome do choque da
8
dengue (dengue hemorraacutegica) com risco de vida grave O tratamento eacute amplamente favoraacutevel
usando de reidrataccedilatildeo oral ou intravenosa acompanhamento e atenccedilatildeo meacutedica adequada No
entanto uma das principais consequecircncias da doenccedila eacute a sua capacidade de sobrecarregar
instalaccedilotildees meacutedicas durante um surto e em paiacuteses onde os recursos de sauacutede jaacute estatildeo no
limite isso pode ter efeitos catastroacuteficos Prevenccedilatildeo e tratamento portanto se fazem
altamente necessaacuterios (Perry 2011)
A prevalecircncia global de DENV cresceu drasticamente nas uacuteltimas deacutecadas e ateacute o
momento natildeo haacute nenhum medicamento especiacutefico para combater a infecccedilatildeo as medidas de
prevenccedilatildeo mais eficazes satildeo voltadas para o controle do vetor (Silva 2011) Diante disso a
Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) elegeu o desenvolvimento de vacinas contra o viacuterus da
dengue como prioridade mundial (Kinney 2001) Por conseguinte a busca de substacircncias
naturais ou sinteacuteticas com atividade antiviral especiacutefica sem toxicidade para as ceacutelulas
normais em seres humanos eacute uma estrateacutegia desejada para evitar que a dengue se agrave e
ajudar a controlar a difusatildeo da doenccedila As vaacuterias fases do ciclo viral representam alvos
terapecircuticos individuais que podem ser exploradas (Costa 2013) Nesse sentido vaacuterios
grupos de pesquisa e organizaccedilotildees estatildeo trabalhando com diversas abordagens para o
desenvolvimento de compostos antivirais com atividade protetora contra dengue Dentre elas
uma vasta gama de produtos naturais incluindo plantas numa tentativa de isolar e
caracterizar novos compostos que podem inibir a replicaccedilatildeo do viacuterus ou tratar a infecccedilatildeo
viral Por essa razatildeo extratos e componentes da planta satildeo cada vez mais importantes como
fontes potenciais para agentes antivirais (Silva 2011)
14 Naftoquinonas
As quinonas satildeo compostos aromaacuteticos amplamente distribuiacutedos na natureza e podem
ser encontrados em vaacuterias famiacutelias de plantas bem como isolado de fungos algas e
bacteacuterias Elas satildeo classificadas em benzoquinonas antraquinonas e naftoquinonas de acordo
com as suas estruturas quiacutemicas Naftoquinonas satildeo compostos orgacircnicos altamente reativos
utilizados como corantes naturais ou sinteacuteticos cujas cores variam de amarelo para vermelho
Apresentam cadeia carbocircnica similar ao naftaleno e satildeo caracterizadas por seus dois grupos
carbonila na posiccedilatildeo 1 e 4 por isso satildeo nomeadas de 14-naftoquinonas Os grupos carbonila
tambeacutem podem estar presente na posiccedilatildeo 12 com menor incidecircncia (Loacutepez 2014)
9
Figura 4 Estrutura quiacutemica da 12-naftoquinona (1) e 14-naftoquinona (2)
Entre as quinonas estatildeo compostos biologicamente importantes tais como o grupo da
vitamina K e a coenzima Q (ubiquinona) Estes compostos tecircm um papel importante no
metabolismo celular especialmente como carreadores de eleacutetrons Aleacutem de quinonas que
possuam uma funccedilatildeo bioloacutegica outros compostos desta classe tecircm sido encontrados
mostrando atividade antibioacutetica Alguns deles estatildeo presentes na natureza mas a maior parte
satildeo obtidos sinteticamente entre eles 2-hidroxi-3-alquil-14-naftoquinonas que possuem
evidecircncias de serem ativos in vitro contra os parasitas da malaacuteria e como coccidiostaacuteticos
(Ambrogi 1970)
A atividade bioloacutegica de quinonas estaacute muitas vezes relacionada com o seu
comportamento eletroquiacutemico A capacidade de aceitar um ou dois eleacutetrons para formar o
acircnion radical correspondente ou dianion pode ser o motivo da induccedilatildeo da formaccedilatildeo de
espeacutecies reativas de oxigecircnio responsaacuteveis pelo estresse oxidativo nas ceacutelulas A capacidade
de aceitar eleacutetrons de naftoquinonas pode ser alterada por mudanccedilas de posiccedilatildeo do grupo
carbonila (12- 14-naftoquinonas) ou diferentes substituintes ou funccedilotildees associadas agrave porccedilatildeo
de naftoquinona (Francisco 2010)
As naftoquinonas satildeo largamente encontradas em plantas micro-organismos e alguns
animais Estes compostos tecircm sido amplamente utilizados em diversas culturas como corantes
para cosmeacuteticos tecidos alimentos (Brandelli 2004) e para fins medicinais incluindo
antitumoral (Oliveira 1990 Ferreira 1996) anti-inflamatoacuterios antimalaacuterico antiviral
(Fonseca 2003 Hussain 2007) atibacterianos e antifuacutengicos (Nagata 1998) Estas atividades
bioloacutegicas tecircm justificado o grande nuacutemero de trabalhos (aproximadamente 42 ateacute abril 2016
ndash Pubmed) encontrados na literatura que visa a siacutentese e avaliaccedilatildeo de qualquer das quinonas
naturais ou seus anaacutelogos como agentes farmacoloacutegicos potenciais (Rahmoun 2013)
10
O Lapachol foi descoberto e estudado desde o seacuteculo XIX Foi isolado primeiramente
do lenho da aacutervore argentina ldquolapachordquo Tabebuia avellanedae (Bignoniaceae) conhecida
como Ipecirc roxo Os estudos quiacutemicos foram desenvolvidos inicialmente em 1892 (Fonseca
2003) O lapachol foi descrito pela primeira vez por Paterno em 1821 tendo sua estrutura
quiacutemica estabelecida em 1896 por Hooker que o identificou como uma naftoquinona Esta
naftoquinona possui accedilatildeo antiinflamatoacuteria analgeacutesica antibioacutetica e anti-neoplaacutesica
reconhecida (Arauacutejo 2002)
A β-lapachona (34-di-hidro-22-dimetil-2H-naptho [12-b] pirano-56-diona) eacute uma
quinona obtida de fontes naturais derivada da aacutervore Lapacho (Tabebuia avellanedae) nativa
da Ameacuterica do Sul e Central A siacutentese e quiacutemica da β-lapachona e compostos relacionados
foi inicialmente investigado no final do seacuteculo XIX e iniacutecio do seacuteculo XX pelo quiacutemico
Samuel Hooker Apesar de alguns estudos cliacutenicos sobre a bioatividade de naftoquinonas
terem sido relatados no iniacutecio de 1940 foi o relatoacuterio do potencial da β-lapachona como um
agente anti-tripanossoma em 1977 que revitalizou o estudo e caracterizaccedilatildeo deste composto
natural A β-lapachona tambeacutem apresenta vaacuterias accedilotildees farmacoloacutegicas incluindo accedilatildeo
formaccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (Hussain 2007)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do Lapachol (1) da α- Lapachona (2) e da β-
Lapachona (Fonseca et al 2003 Ferreira et al 2010)
11
Figura 6 Tabebuia avellanedae (Hussain 2007)
A β-lapachona eacute uma substacircncia natural facilmente obtida a partir do lapachol Esta
naftoquinona eacute o grande destaque desta classe de substacircncias porque se encontra em testes
cliacutenicos de fase II para o tratamento do cacircncer de pacircncreas (Ferreira 2010) O mecanismo de
accedilatildeo da β-lapachona diferencia-se de outros antineoplaacutesicos por atuar na topoisomerase I
promovendo a recuperaccedilatildeo da capacidade de apoptose celular Alguns estudos reportam sua
accedilatildeo sineacutergica de potenciaccedilatildeo com o Taxolreg
promovendo a inibiccedilatildeo em diferentes pontos de
replicaccedilatildeo celular aleacutem de sua combinaccedilatildeo com outros tratamentos como a aplicaccedilatildeo de
radiaccedilatildeo ionizante (Cunha 2005)
Vaacuterios estudos jaacute foram publicados demonstrando a atividade antiviral de
naftoquinonas naturais e sinteacuteticas A β-lapachona inibe seletivamente a replicaccedilatildeo do viacuterus
HIV-1 atuando na inibiccedilatildeo da enzima LTR117 Da mesma forma este composto eacute um
potente inibidor da enzima transcriptase reversa dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e
leucemia murina de Rauscher (RLV) inibindo tambeacutem a DNA polimerase A accedilatildeo inibitoacuteria
sobre estas enzimas revelou-se especiacutefica se comparada com a de outros inibidores
conhecidos (Silva 2003)
O Lapachol jaacute demonstrou atividade contra certas cepas virais incluindo Herpes virus
tipos I e II Outras naftoquinonas jaacute mostraram eficaacutecia contra cepas de Influenza virus
Poliomielite virus e estomatite vesicular Supotildee-se que o mecanismo de accedilatildeo destas quinonas
seja atraveacutes da inibiccedilatildeo da transcriptase reversa de retroviacuterus e da RNA polimerase Eacute relatado
12
que lapachol diminui a replicaccedilatildeo do viacuterus em seres humanos mas ainda natildeo existem
resultados de testes cliacutenicos disponiacuteveis (Hussain 2007)
Na avaliaccedilatildeo da atividade antiviral do Lapachol in vitro verificou-se que esta
substacircncia eacute ativa contra viacuterus RNA atuando tanto sobre viacuterus envelopados quanto sobre
partiacuteculas sem esta estrutura em concentraccedilotildees de 5 a 10 microgmL e ainda apresentou uma
pequena atividade sobre HSV (Herpes simplex I) e Ad5 (Adeno tipo 5) mas nenhuma
atividade sobre CoxB4 (Coxsackie B4) Em trabalho posterior demonstrou-se que nem o
Lapachol nem diversos dos seus derivados apresentaram atividade antiviral in vitro sobre
Poliovirus tipo 1 Ecovirus 19 e Coxsackie B tipo 4 Apenas os derivados 12-naftoquinonicos
e um intermediaacuterio da siacutentese Hoocker foram ativos contra o Echovirus 19 (Fonseca 2003)
Costa et al (2013) relataram que piranonaftoquinonas isocircmeras do lapachol possuem
atividade de inibiccedilatildeo da replicaccedilatildeo de DENV-2 atuando sobre a atividade da ATPase de NS3
(proteiacutena natildeo estrutural de DENV)
A utilizaccedilatildeo de testes in vitro por meio de ensaios de viabilidade celular constitui o
primeiro passo para a avaliaccedilatildeo da compatibilidade bioloacutegica de uma substacircncia e pode
fornecer elementos importantes para a anaacutelise da biocompatibilidade dos diferentes materiais
Para ser considerado natildeo citotoacutexico no teste de citotoxicidade in vitro um produto natildeo deve
ocasionar a morte das ceacutelulas nem afetar suas funccedilotildees celulares A prova do MTT eacute um dos
indicadores colorimeacutetricos de viabilidade celular mais utilizados sendo capaz de avaliar a
funccedilatildeo celular mitocondrial de acordo com a reduccedilatildeo enzimaacutetica do sal de tetrazoacutelio pelas
desidrogenases mitocondriais nas ceacutelulas viaacutevies (Arauacutejo et al 2008) Supotildee-se que o
mecanismo responsaacutevel pela citotoxicidade apresentada pelas quinonas esteja relacionado
com o estresse oxidativo causado por esses compostos poreacutem a capacidade de alquilaccedilatildeo de
nucleoacutefilos celulares tambeacutem representa correlaccedilatildeo com tais efeitos bioloacutegicos (Goulart
2004)
13
II JUSTIFICATIVA
14
2 JUSTIFICATIVA
Aleacutem do controle do mosquito transmissor e do desenvolvimento de vacinas que tem
sido exaustivamente estudado nos uacuteltimos anos uma alternativa para o combate agrave dengue
seria o desenvolvimento de faacutermacos para reduzir a viremia ou mesmo para controlar a
resposta imune do hospedeiro agrave infecccedilatildeo que tem sido apontada como principal fator de risco
nos casos mais graves Em funccedilatildeo disso o nuacutemero de pesquisas visando o desenvolvimento
de drogas com accedilatildeo antiviral ou com accedilatildeo imunomodulatoacuteria tem aumentado
significativamente As naftoquinonas vecircm ganhando bastante importacircncia na pesquisa de
novas drogas antivirais devido agrave algumas atividades apresentadas A szlig-lapachona-orto-
naftoquinona por exemplo se mostrou um potente inibidor da enzima transcriptase reversa
dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e leucemia murina de Rauscher (RLV)
Diante da inexistecircncia de drogas com accedilatildeo anti DENV e o elevado nuacutemero e casos da
patogenia nos uacuteltimos anos a organizaccedilatildeo mundial da sauacutede classificou a Dengue como uma
epidemia de proporccedilotildees globais e um problema de sauacutede puacuteblica Como as naftoquinonas jaacute
demonstraram na literatura possuir um potencial efeito terapecircutico contra alguns viacuterus eacute
possiacutevel que estes compostos possam apresentar atividade antiviral contra DENV Portanto
este trabalho visou atraveacutes de ensaios de MTT e titulaccedilotildees virais em placa avaliar a potencial
atividade antiviral de oito compostos derivados de naftoquinonas naturais e sinteacuteticas
15
III OBJETIVOS
16
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar oito compostos (2 naturais e 6 sinteacuteticos) derivados de naftoquinonas como potenciais
agentes antivirais em ceacutelulas BHK-21 frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1 e 2
32 Objetivos especiacuteficos
1 Calcular o iacutendice de citotoxicidade e a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) dos compostos
atraveacutes de ensaio de reduccedilatildeo de MTT
2 Avaliar os efeitos dos compostos sobre o crescimento a viabilidade e o volume celular
pela teacutecnica de exclusatildeo do azul de tripan
3 Determinar a multiplicidade de infecccedilatildeo de DENV 1 e 2 a ser utilizada nos ensaios
antivirais
4 Avaliar a atividade antiviral dos compostos frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1
e 2 atraveacutes do ensaio de MTT
5 Verificar um possiacutevel efeito direto dos compostos agraves partiacuteculas virais de Dengue virus
6 Quantificar a produccedilatildeo de partiacuteculas virais infecciosas no sobrenadante de ceacutelulas
infectadas atraveacutes de titulaccedilatildeo viral pela contagem de unidades formadoras de placas
17
IV MATERIAL E MEacuteTODOS
18
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Linhagens celulares
411 Ceacutelulas C636
As ceacutelulas C636 satildeo ceacutelulas de linhagem contiacutenua de larvas de mosquito Aedes
albopictus Estas ceacutelulas foram utilizadas na produccedilatildeo de estoque viral de DENV sorotipos 1
e 2 para isso foram mantidas em meio de cultura Leibovitz-15 (L-15) (Cultilab)
suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (Cultilab) antibioacuteticos (Penicilina 100 UmL
Streptomicina 100 microgmL) e antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL) a 28degC
412 Ceacutelulas BHK-21
As ceacutelulas BHK-21 satildeo fibroblastos de linhagem contiacutenua derivados de rim de hamster
neonato Estas ceacutelulas foram utilizadas para os experimentos in vitro e para as titulaccedilotildees de
DENV 1 e 2 para isso foram mantidas em meio miacutenimo essencial modificado por Dulbecco
ndash DMEM (Cultilab) suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (SFB) com antibioacuteticos
(Penicilina 100 UmL Streptomicina 100 microgmL) e com antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL)
sendo mantidas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5
42 Viacuterus
421 DENV 1 e DENV 2
O Sorotipo 1 do Dengue virus (DENV-1) estirpe Mochizuki foi replicado em ceacutelulas
C636 para gerar estoques de trabalho durante 2 e 5 dias a 28degC O sobrenadante da cultura de
ceacutelulas infectadas foi recolhido e clarificado por centrifugaccedilatildeo a 4000 G durante 10 minutos agrave
4degC e entatildeo foi aliquotado e armazenado a -70 deg C como reserva de viacuterus ateacute agrave sua utilizaccedilatildeo
A replicaccedilatildeo geraccedilatildeo de estoque e titulaccedilatildeo do Sorotipo 2 do Dengue virus (DENV-2)
estirpe Nova Guineacute C ocorreu nos mesmos moldes do DENV-1
19
422 Titulaccedilatildeo viral
Os estoques virais foram diluiacutedos (10-1
a 10-7
) e inoculados em monocamadas de
ceacutelulas BHK-21 implantadas em placas de 6 poccedilos com confluecircncia de aproximadamente
60 (3x105 ceacutelulas por poccedilo) sendo um poccedilo natildeo infectado mantido para controle celular
Apoacutes uma hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus foram adicionados 3 mL de meio DMEM (Cultilab)
suplementado com 15 de SFB e contendo 15 de Carboximetilcelulose (CMC Synth) As
placas foram entatildeo incubadas a 37degC (CO2 a 5) por 96 horas As ceacutelulas foram entatildeo
fixadas com 2 mL de soluccedilatildeo de formol a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo
1 (pv) de cristal violeta em PBS para contagem das placas de lise O tiacutetulo viral foi
expresso atraveacutes do nuacutemero de unidades formadoras de placa por mL (UFPmL) segundo a
formula abaixo representada
Tiacutetulo viral (UFPmL) = N x FC x 10
N = nuacutemero de placas de lise contadas
FC = Fator de correccedilatildeo
= Inverso da diluiccedilatildeo na qual foram contadas as placas de lise
43 Compostos de naftoquinonas
Os compostos utilizados neste estudo foram fornecidos pelo Dr Geraldo Ceacutelio
Brandatildeo do laboratoacuterio de pesquisa da Escola de Farmaacutecia da Universidade Federal de Ouro
Preto
20
Tabela 1 Relaccedilatildeo de nome estrutura e coacutedigo dos compostos utilizados Na tabela estatildeo
presentes a relaccedilatildeo dos nomes dos compostos utilizados neste trabalho bem como sua
estrutura Os coacutedigos representantes de cada composto seratildeo utilizados no decorrer da escrita
Nome do composto Estrutura Coacutedigo
Lapachol
A1
β-lapachona
A2
2-Hidroxi-3-(ββ-dimetilvinil)-14-naftoquinona
A3
2-Cloro-14-naftoquinona
A4
Lapachol derivado 1
A5
Lapachol derivado 2 A6
Lapachol derivado 3 A7
Lapachol derivado 4 A8
44 Ensaio de citotoxicidade
Para avaliar a citotoxicidade dos compostos ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas foram incubadas com diferentes concentraccedilotildees dos compostos em triplicata num
volume de 200 microL de meio de cultura por poccedilo na presenccedila de 1 de SFB Os controles natildeo
tratados apresentaram adiccedilatildeo de 200 microL de meio de cultura As ceacutelulas foram entatildeo incubadas
durante 72 horas O meio foi removido e 28 microL de soluccedilatildeo de 5 mg mL MTT (brometo de 3-
21
[45-dimetil-tiazol-2-il]-25 difeniltertrazoacutelio) foi adicionado a cada poccedilo As placas foram re-
incubadas durante 1 hora e 30 minutos e entatildeo 122 microL de DMSO foi adicionado a cada poccedilo e
placas foram agitadas suavemente durante 15 minutos para dissolver os cristais de formazan
A absorbacircncia foi lida em um equipamento leitor de placas Victor X3 (PerkinElmer) a 490
nm A concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC 50) foi definida como a concentraccedilatildeo da amostra que
reduziu a viabilidade celular de 50 em comparaccedilatildeo com controles natildeo tratados Os dados
foram analisados utilizando o programa Prisma
45 Avaliaccedilatildeo da viabilidade e crescimento celular por exclusatildeo de azul de tripan
Ceacutelulas BHK-21 foram cultivadas em placas de 24 poccedilos (7x104 ceacutelulaspoccedilo) e apoacutes
24 horas foram tratadas com as concentraccedilotildees de uso de cada composto e incubadas por 72
horas na presenccedila de 1 de SFB A seguir as ceacutelulas foram tripsinizadas e incubadas com
azul de tripan e entatildeo foi utilizado um contador automatizado de ceacutelulas (Countess II FL
Automated Cell Counter ndash Thermo Fisher Scientific) para contagem das ceacutelulas e avaliaccedilatildeo da
porcentagem de viabilidade e diacircmetro celular do controle nos tempos de 0 24 e 96 horas e
avaliaccedilatildeo dos mesmos paracircmetros para os compostos no tempo de 96 horas (72 horas poacutes
tratamento)
Outra curva de multiplicaccedilatildeo celular foi feita para os compostos A1 A3 A4 e A5 onde as
ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos no momento da confecccedilatildeo da placa e
foram avaliados os mesmos paracircmetros nos tempos de 0 12 24 48 e 72 horas O
equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
46 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
Para determinar a menor Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) responsaacutevel pela letalidade
celular total 2x104 de ceacutelulas BHK-21 foram semeadas em placa de 96 poccedilos Apoacutes a
incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o
meio de cultura foi removido e as ceacutelulas foram expostas a diferentes diluiccedilotildees dos dois
sorotipos de DENV (100 microL de cada diluiccedilatildeo + 100 microL de meio DEMEM 1 SFB) As
diluiccedilotildees seriadas foram realizadas da suspensatildeo viral na razatildeo de 5 para o primeiro poccedilo e de
2 para os demais poccedilos Apoacutes 72 horas as ceacutelulas foram entatildeo fixadas com 200 microL de soluccedilatildeo
22
formalina a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo 1 (pv) de cristal violeta em
PBS para avaliaccedilatildeo da maior diluiccedilatildeo responsaacutevel pela letalidade de 100 das ceacutelulas
47 Ensaio Dose-resposta
Para cada composto foram realizados ensaios de dose-resposta para definiccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de cada composto capaz de promover a reduccedilatildeo na produccedilatildeo viral A atividade
antiviral foi avaliada tambeacutem pelo meacutetodo de MTT Ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas expostas a diferentes concentraccedilotildees dos extratos determinadas a partir das maiores
concentraccedilotildees em que natildeo foram observados efeitos citotoacutexicos As ceacutelulas foram tratadas
com as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de cada composto e em seguida infectadas com DENV
1 (MOI= 5) ou 2 (MOI= 2) Mantendo uma coluna para controle com DMSO uma coluna
para controle de viacuterus uma coluna para controle de citotoxicidade dos compostos e por fim
uma coluna para controle celular As ceacutelulas foram entatildeo incubadas durante 72 horas Apoacutes
este tempo procedeu-se a leitura pelo ensaio de MTT como descrito anteriormente Os dados
foram analisados levando-se em consideraccedilatildeo a leitura das absorbacircncias dos poccedilos dos
controles de viacuterus e do controle celular
Para realizacao destes experimentos os seguintes controles foram adotados
Controle de ceacutelulas poccedilos contendo somente ceacutelulas acrescidas do meio de cultura DMEM
1 SFB Utilizado para avaliar o comportamento das ceacutelulas sem que as mesmas tivessem
contato com qualquer interferente durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo Com isso os poccedilos
reservados para esse controle serviram de padratildeo para comparaccedilatildeo com aqueles em que fosse
observada atividade citotoacutexica ou citopaacutetica
Controle de viacuterus poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM 1 SFB
sem nenhum tratamento e de suspensatildeo de viacuterus Utilizando como referecircncia para anaacutelise da
atividade citopaacutetica provocada pelo viacuterus testado durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo das placas
23
Controle de viacuterus com DMSO Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura
DMEM 1 SFB e DMSO Foi utilizado para avaliar se havia influecircncia prejudicial do
solvente utilizado para diluiccedilatildeo das amostras no meio de cultivo das ceacutelulas e se o mesmo
poderia apresentar alguma potencial atividade antiviral aparente
Controle de citotoxicidade Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM
1 SFB e as quatro principais concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos Foi utilizado
para avaliar se haveria alguma possiacutevel atividade citotoacutexica das concentraccedilotildees dos compostos
em relaccedilatildeo agraves ceacutelulas
48 Ensaio Virucida
Para a realizaccedilatildeo deste ensaio aliacutequotas de 950 microL (diluiccedilatildeo de 20 vezes) do DENV 1 (tiacutetulo
6 x 107 UFPmL) foram incubadas com 50 microL de uma soluccedilatildeo de meio DMEM preparada
com 20x a concentraccedilatildeo natildeo citotoacutexica de cada composto A1 a A8 em banho-maria 37deg C
por 1 hora Apoacutes a incubaccedilatildeo as aliacutequotas foram imediatamente tituladas em ceacutelulas BHK-21
em placas de 6 poccedilos utilizando-se 3 diluiccedilotildees para cada incubaccedilatildeo (20x 20 x 10-1
e 20 x 10-
2) Foram titulados tambeacutem uma aliacutequota incubada apenas com meio DMEM sem nenhum
tratamento e outra aliacutequota incubada com DMSO (Dimetilsulfoacutexido) Estas foram tituladas
utilizando um controle e mais cinco diluiccedilotildees (20x 20 x 10-1
20 x 10-2
20 x 10-3
e 20 x 10-4
)
49 Ensaio antiviral
Neste ensaio ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em placas de 24 poccedilos no dia
seguinte foram tratadas durante 4 horas com as concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas de cada
composto em duplicata Apoacutes o preacute-tratamento as monocamadas foram infectadas com
DENV-1 a uma MOI=5 na presenccedila das concentraccedilotildees de uso respectivas de cada composto
Apoacutes 1 hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus as monocamadas foram lavadas duas vezes com PBS e
foi adicionado 500 microL por poccedilo de meio preparado com as mesmas concentraccedilotildees dos
diferentes compostos e mantidos durante 48 horas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5 Em
quatro poccedilos as ceacutelulas foram infectadas e natildeo tratadas e em outros quatro poccedilos as ceacutelulas
natildeo foram tratadas e nem infectadas (controle de ceacutelulas) destes uacuteltimos dois foram
tripsinizados e contados no momento da infecccedilatildeo e os outros dois apoacutes o teacutermino do ensaio
24
para avaliar o crescimento celular Decorridas as 48 horas o sobrenadante foi coletado e
centrifugado por 10 minutos a 4000 xG para separaccedilatildeo dos debris celulares e prontamente
titulado em placa de 6 poccedilos
410 Anaacutelise estatiacutestica
Os valores de CC50 foram obtidos a partir de anaacutelise de regressatildeo linear das curvas de
concentraccedilatildeocitotoxicidade A anaacutelise estatiacutestica dos dados foi realizada pelo programa
GraphPad Prism software Uma anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi utilizada para determinar
as diferenccedilas estatiacutesticas seguida do poacutes teste de Tukey A significacircncia estatiacutestica foi fixada
em p lt005
25
V RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
26
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Ensaio de citotoxicidade celular
Para avaliar a viabilidade da linhagem celular BHK-21 frente ao tratamento com oito
diferentes concentraccedilotildees dos compostos (A1 a A8) realizou-se um ensaio de MTT (brometo
de 3-[45-dimetil-tiazol-2-il]-25-difeniltetrazoacutelio) Este ensaio tem o objetivo de quantificar
espectrofotometricamente o crescimento celular a viabilidade e proliferaccedilatildeo podendo ser
utilizado como um indicador direto de citotoxicidade Trata-se de um ensaio colorimeacutetrico
para medir a atividade da redutase mitocondrial em ceacutelulas vivas Ele se baseia na reduccedilatildeo do
sal amarelo tetrazoacutelio (permeaacutevel agrave membrana celular) para cristais de formazan azuis
puacuterpura por ceacutelulas metabolicamente ativas a quantidade de formazan gerada medida por
espectrofotometria eacute proporcional ao nuacutemero de ceacutelulas viaacuteveis
A CC50 foi calculada plotando-se uma curva de porcentagem de viabilidade celular por
concentraccedilatildeo melhor representada na figura 7 pelo composto A7 e os resultados de CC50
para todos os compostos estatildeo representados na tabela 2 Foram feitos ensaios de
citotoxicidade com oito concentraccedilotildees diferentes sendo escolhida a maior concentraccedilatildeo que
natildeo apresentou citotoxicidade
Viabilidade Celular = [ ( A ndash B ) A ] x 100
Onde
A = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas natildeo tratadas
B = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas tratadas com
as respectivas concentraccedilotildees de cada composto
27
28
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (A curva dose resposta do composto A7 eacute a que
melhor representa a curva dose resposta esperada) Avaliou-se a viabilidade da linhagem
celular BHK-21 frente agrave diferentes concentraccedilotildees dos compostos realizando o ensaio de MTT
e determinando assim as concentraccedilotildees a serem utilizadas nos proacuteximos ensaios bem como
calculando a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) agrave partir da curva
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo
da concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50)
Composto Concentraccedilatildeo utilizada
[ ] microgmL
Concentraccedilatildeo citotoacutexica 50
(CC50) [ ] microgmL plusmn Desvio
Padratildeo
A1 ([ ]=1 mgmL) 00200 10010 plusmn 0014
A2 ([ ]=1 mgmL) 00025 09561 plusmn 0023
A3 ([ ]=1 mgmL) 00025 09988 plusmn 0017
A4 ([ ]=5 mgmL) 00125 10150 plusmn 0036
A5 ([ ]=10 mgmL) 00250 10590 plusmn 0047
A6 ([ ]=5 mgmL) 00250 08183 plusmn 0030
A7 ([ ]=5 mgmL) 00125 10280 plusmn 0052
A8 ([ ]=5 mgmL) 00125 09758 plusmn 0036
52 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan
Para corroborar o ensaio anterior de citotoxicidade utilizou -se o teste de viabilidade
celular pela teacutecnica da exclusatildeo do azul de tripan com a finalidade de determinar a
viabilidade das ceacutelulas Os procedimentos adotados no ensaio seguiram o manual do
equipamento contador automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL Automated Cell Counter) entatildeo
foi acrescentado agrave 10 microL da suspensatildeo celular 10 microL de azul de tripan (04) Apoacutes
homogeneizaccedilatildeo 10 microL da suspensatildeo foi colocada no local indicado da lacircmina proacutepria para
leitura e foi realizada a contagem sendo consideradas mortas (inviaacuteveis) as ceacutelulas que
incorporavam o corante e viaacuteveis as que excluiacuteam o azul de tripan
29
O equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
(A)
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan A avaliaccedilatildeo da
viabilidade celular foi realizada atraveacutes de um contador automaacutetico de ceacutelulas Este
equipamento possibilita explorar ferramentas de fotografia e avaliar alguns paracircmetros
importantes (A) fotografia das ceacutelulas (B) Zoom na fotografia das ceacutelulas com marcaccedilotildees
(em verde para ceacutelulas vivas e vermelho para mortas) e (D) contagem das ceacutelulas totais
ceacutelulas vivas e mortas graacutefico e meacutedia dos diacircmetros celulares das ceacutelulas vivas e mortas
(B)
(C)
30
O crescimento celular de ceacutelulas natildeo tratadas foi avaliado nos tempos de 0h (momento
da confecccedilatildeo da placa) 24h (momento de tratamento com os compostos) e 96 horas
(Momento em que todas as ceacutelulas foram tripsinizadas e contadas) para avaliar o perfil do
crescimento celular em ceacutelulas natildeo tratadas Foi observado um crescimento celular no periacuteodo
de 24 horas onde as ceacutelulas estavam incubadas com meio acrescido de 10 SFB Em 24
horas o meio foi trocado por 1 SFB e acrescido das substacircncias testes nas menores diluiccedilotildees
natildeo citotoacutexicas determinadas pelo ensaio do MTT Em 96 horas pode ser observado um
decaimento no nuacutemero de ceacutelulas vivas provavelmente devido ao crescimento celular (morte
por confluecircncia)
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas)
(A) (B)
31
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas (A)
Contagem de ceacutelulas vivas (B) Percentual de ceacutelulas viaacuteveis (Viabilidade celular ) e (C)
Meacutedia do diacircmetro apresentado pelas ceacutelulas vivas
Em 96 horas as ceacutelulas natildeo tratadas bem como as ceacutelulas tratadas por 72 horas com as
concentraccedilotildees de uso dos compostos foram tripsinizadas e avaliadas quanto ao nuacutemero de
ceacutelulas vivas viabilidade e diacircmetro celular apresentados na figura 10
Segundo se observa natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo aparente que possa demonstrar que
as concentraccedilotildees de uso dos compostos tenham causado alguma atividade citotoacutexica
corroborando assim os ensaios de citotoxicidade anteriores
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
A infectividade de um viacuterus depende de vaacuterios fatores entre eles da proporccedilatildeo de
partiacuteculas virais completas ou infecciosas da suscetibilidade da ceacutelula hospedeira e da
chance desta partiacutecula encontrar o receptor e penetrar na ceacutelula Quando ceacutelulas suscetiacuteveis
satildeo misturadas com uma suspensatildeo de viacuterus estas podem receber uma duas trecircs ou dez
partiacuteculas virais ou nenhuma Isto depende da proporccedilatildeo entre a quantidade de viacuterus
infecciosos presente no inoculo e a quantidade de ceacutelulas utilizada Esta relaccedilatildeo eacute denominada
de multiplicidade de infecccedilatildeo ou MOI Uma MOI=1 indica que a infecccedilatildeo foi feita em
principio com 1 viacuterus ou 1 dose infectante por ceacutelula
A determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo dos Dengue virus 1 e 2 a serem
utilizadas nos proacuteximos ensaios foi feita a partir da infecccedilatildeo de ceacutelulas BHK-21 por diferentes
(C)
32
concentraccedilotildees de viacuterus e revelaccedilatildeo com cristal violeta Escolheu-se a maior diluiccedilatildeo viral que
possibilitou a letalidade total das ceacutelulas (faixa onde todas as ceacutelulas estatildeo mortas utilizando
menor concentraccedilatildeo de viacuterus) As faixas escolhidas foram entatildeo calculadas levando-se em
consideraccedilatildeo o nuacutemero de ceacutelulas presentes no poccedilo e o nuacutemero de partiacuteculas virais que foram
adicionadas (Faixa3 para DENV2 e 2 para DENV1) Figura 11 Foi estipulado portanto a
Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 2 para DENV 2 e 5 para DENV 1
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI A partir da infecccedilatildeo da linhagem celular BHK-21 em
placa de 96 poccedilos com diferentes diluiccedilotildees de DENV foi determinado que a Multiplicidade
de infecccedilatildeo para o Dengue viacuterus sorotipos 1 e 2 seria de 5 e 2 respectivamente (colunas 2 -
DENV1 e 3 - DENV2)
54 Ensaio dose resposta
Apoacutes a determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas ideais realizou-se um
ensaio dose resposta tratando as ceacutelulas com oito concentraccedilotildees agrave partir das concentraccedilotildees natildeo
citotoacutexicas escolhidas para cada composto e em seguida infectando com DENV sorotipos 1 e
2 nas MOIs estipuladas anteriormente (5 e 2 respectivamente) A porcentagem do efeito
protetor conferida agraves ceacutelulas para cada concentraccedilatildeo de amostra testada foi calculada da
seguinte forma
33
EP = [ (A ndash B) (C ndash B) ] x 100
Onde
A Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas tratadas e infectadas
B Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e infectadas
C Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e natildeo infectadas
Este ensaio tem por objetivo identificar a resposta celular agrave infecccedilatildeo frente ao
tratamento com os compostos em diferentes concentraccedilotildees Assim como o ensaio de
toxicidade este ensaio feito utilizando a teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT permite o teste de vaacuterias
concentraccedilotildees diferentes em um menor tempo e com baixo gasto de material
34
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV1
(MOI=5)
35
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV2
(MOI=2)
36
Takegami et al (1998) demonstraram atividade de furanonaftoquinonas contra o viacuterus
da Encefalite Japonesa (Flavivirus) utilizando a concentraccedilatildeo de 3microgmL poreacutem para os
compostos apresentados avaliados pela teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT nenhuma das
concentraccedilotildees apresentadas produziu efeito antiviral significativo em relaccedilatildeo ao controle
celular como observado nas figuras 12 e 13
Apesar da teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT ser interessante como triagem de atividade
antiviral permitindo o teste de vaacuterias concentraccedilotildees dos compostos em menor tempo e
utilizando uma quantidade razoaacutevel de materiais optou-se por utilizar as maiores
concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas encontradas avaliando sua atividade antiviral por outras
teacutecnicas Como natildeo foi avaliada atividade antiviral preacutevia para nenhum dos compostos frente
agrave infecccedilatildeo por DENV1 e 2 foi selecionado o Dengue virus 1 para dar prosseguimento aos
ensaios
55 Ensaio Virucida
O ensaio virucida foi realizado para avaliar um potencial efeito dos compostos
diretamente sobre a partiacutecula viral Este ensaio eacute importante pois possibilita elucidar se o
composto pode produzir algum efeito sobre a partiacutecula viral impedindo que esta possa infectar
as ceacutelulas
Figura 14 Ensaio virucida Neste ensaio as aliacutequotas de DENV1 foram incubadas com as
concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos e titulados (NT) Controle natildeo tratado
37
Tabela 3 Ensaio virucida Caacutelculo do tiacutetulo viral (UFPmL) e porcentagem representante de
cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 254 x 105 100
DMSO 263 x 105 10335
A1 199 x 105 7835
A2 205 x 105 8071
A3 237 x 105 9311
A4 775 x 104 3049
A5 153 x 105 6024
A6 219 x 105 8602
A7 243 x 105 9547
A8 254 x 105 100
Lagrota et al (1988) demonstraram atividade de 2-HO-3-N-benzil-N(N-benzil-2-
etilamina) -14-naftoquinona sobre a partiacutecula viral de enterovirus De forma contraacuteria apesar
de se verificar a reduccedilatildeo de quase uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais
para o composto A4 natildeo considerou-se esta uma alteraccedilatildeo significativa pois devido agrave
magnitude do nuacutemero de UFPs se trata de uma alteraccedilatildeo muito pequena Portanto os
compostos avaliados neste trabalho natildeo produziram atividade virucida aparente frente ao
tratamento com as concentraccedilotildees de uso
56 Ensaio Antiviral
O sobrenadante de ceacutelulas tratadas previamente e infectadas por DENV1 coletado 48
horas poacutes infecccedilatildeo foi avaliado quanto agrave produccedilatildeo viral de partiacuteculas infecciosas pela
contagem de placas de lise e caacutelculo de Unidades Formadoras de Placa (Titulaccedilatildeo viral em
placa ndash UFPmL)
38
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral Sobrenadante de ceacutelulas tratadas e infectadas por DENV1
coletado apoacutes 48 horas e titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado
Tabela 4 Ensaio Antiviral Coleta do sobrenadante de ceacutelulas infectadas por DENV1 Tiacutetulo
viral (UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o
controle natildeo tratado como 100
Ao perceber um aumento no tiacutetulo viral frente ao tratamento com os compostos A1
A2 e A3 e uma reduccedilatildeo frente ao tratamento com A4 A5 e A6 foram escolhidos dois
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 119 x 105 10000
A1 235 x 105 19748
A2 228 x 105 19160
A3 318 x 105 26723
A4 128 x 104 1076
A5 186 x 103 156
A6 190 x 104 1597
A7 280 x 104 2353
A8 350 x 104 2941
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
40
Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
VIII
RESUMO
O Dengue virus (DENV) possui quatro sorotipos diferentes (1-4) que satildeo principalmente
transmitidos pelo mosquito Aedes aegypti A infecccedilatildeo resulta na patogecircnese da dengue que eacute
uma epidemia de proporccedilotildees globais Apesar dos esforccedilos ainda natildeo existe uma vacina eficaz
contra os quatro sorotipos bem como drogas eficientes no tratamento de pacientes Portanto
vaacuterios estudos tem sido conduzidos na busca de faacutermacos com atividade antiviral contra o
DENV e outros Flavivirus Dentre os compostos estudados para este fim estatildeo as
naftoquinonas metaboacutelitos secundaacuterios produzidos por algas fungos plantas e animais Estes
compostos podem ser extraiacutedos principalmente a partir de plantas do gecircnero Tabebuia
(famiacutelia Bignoniaceae) satildeo caracterizados por apresentar atividade antiviral destacando-se a
szlig-lapachona potente inibidor da enzima transcriptase reversa dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria
(AMV) e leucemia murina de Rauscher (RLV) O objetivo deste trabalho foi testar oito
diferentes compostos derivados de naftoquinonas sinteacuteticas e naturais com potencial atividade
antiviral contra DENV Para isso uma triagem foi realizada por reduccedilatildeo de MTT (brometo de
3- (45-dimetiltiazol-2-il) -25-brometo difenil tetrazolina) para avaliar a atividade citotoacutexica
de oito compostos na linhagem celular BHK-21 resultando no caacutelculo da concentraccedilatildeo
citotoacutexica 50 (CC50) e as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas a serem utilizada em testes
subsequentes para os compostos A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 e A8 (lapachol β-lapachona 2-
Hidroxi-3-(ββ-dimetilvinil)-14-naftoquinona 2-Cloro-14-naftoquinona e 4 derivados de
lapachol) Em seguida ceacutelulas BHK-21 foram incubadas com os compostos em concentraccedilotildees
natildeo citotoacutexicas em diferentes diluiccedilotildees e infectadas com os sorotipos 1 e 2 DENV na
multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 5 e 2 para os sorotipos 1 e 2 respectivamente A
atividade antiviral foi testada atraveacutes da anaacutelise de reduccedilatildeo de MTT e pela titulaccedilatildeo de virus
liberados no sobrenadante Apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute
uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes
faacutermacos natildeo demonstraram atividade antiviral nas condiccedilotildees experimentais testadas
IX
ABSTRACT
The Dengue virus (DENV) has four different serotypes (1-4) that are primarily transmitted by
the mosquito Aedes aegypti Infection results in the pathogenesis of dengue which is an
epidemic of global proportions Despite these efforts there is still no effective vaccine against
the four serotypes as well as efficient drugs in the treatment of patients Therefore various
studies have been conducted in the search for drugs with antiviral activity against DENV and
other flaviviruses Among the studied compounds for this purpose are the naphthoquinones
secondary metabolites produced by algae fungi plants and animals These compounds can be
mainly extracted from plants of the genus Tabebuia (Bignoniaceae) are characterized by
having antiviral activity especially the szlig-lapachone potent inhibitor of the enzyme reverse
transcriptase of avian myeloblastosis virus (AMV) and murine leukemia Rauscher (RLV)
The aim of this study was to test eight different compounds derived from synthetic and
natural naphthoquinones with potential antiviral activity against DENV For this a screening
was performed by reduction of MTT (3- (45-dimethylthiazol-2-yl) -25-diphenyl bromide
tetrazolina) to assess the cytotoxic activity of the compounds eight BHK-21 cell line resulting
in the calculation of the cytotoxic concentration 50 (CC50) and non-cytotoxic
concentrations to be used in subsequent tests for compounds A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 and
A8 (lapachol β-lapachone 2-hydroxy -3- (β β-dimethylvinyl) -14-naphthoquinone 2-
chloro-14-naphthoquinone and derivatives lapachol 4) Then BHK-21 cells were incubated
with compounds at non-cytotoxic concentrations in different dilutions and infected with
serotypes 1 and 2 DENV at multiplicity of infection (MOI) of 5 and 2 for serotypes 1 and 2
respectively The antiviral activity was assayed by MTT reduction assay and the virus titer
released into the supernatant Although some compounds have shown reduced to one log unit
in the number of viral particles results indicate that these drugs did not show antiviral activity
in experimental conditions
X
SUMAacuteRIO
RESUMO VIII
ABSTRACT IX
LISTA DE FIGURAS XII
LISTA DE TABELAS XIII
1 INTRODUCcedilAtildeO 2
11 Flavivirus 2
12 Dengue virus 3
13 Epidemiologia 6
14 Naftoquinonas 8
3 OBJETIVOS 16
31 Objetivo Geral 16
32 Objetivos especiacuteficos 16
4 MATERIAL E MEacuteTODOS 18
41 Linhagens celulares 18
411 Ceacutelulas C636 18
412 Ceacutelulas BHK-21 18
42 Viacuterus 18
421 DENV 1 e DENV 2 18
422 Titulaccedilatildeo viral 19
43 Compostos de naftoquinonas 19
44 Ensaio de citotoxicidade 20
45 Avaliaccedilatildeo da viabilidade e crescimento celular por exclusatildeo de azul de tripan 21
46 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) 21
47 Ensaio Dose-resposta 22
48 Ensaio Virucida 23
49 Ensaio antiviral 23
410 Anaacutelise estatiacutestica 24
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO 26
51 Ensaio de citotoxicidade celular 26
52 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan 28
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) 31
54 Ensaio dose resposta 32
XI
55 Ensaio Virucida 36
56 Ensaio Antiviral 37
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao tratamento com
os compostos A1 A3 A4 e A5 40
6 CONCLUSAtildeO 44
7 PERSPECTIVAS 46
8 REFEREcircNCIAS 48
XII
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Estrutura da partiacutecula viral de Dengue viacuterus 4
Figura 2 Ciclo de multiplicaccedilatildeo de DENV 5
Figura 3 Distribuiccedilatildeo geograacutefica da Dengue 7
Figura 4 Estrutura quiacutemica da 12-naftoquinona (1) e 14-naftoquinona (2) 9
Figura 5 Estrutura quiacutemica do Lapachol (1) da α- Lapachona (2) e da β-Lapachona 10
Figura 6 Tabebuia avellanedae 11
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (Exemplo da curva dose resposta do composto A7) 28
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan 29
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas) 30
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas 31
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI 32
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 34
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 35
Figura 14 Ensaio virucida 36
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral 38
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados 39
Figura 17 Curva de crescimento celular 41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular 41
XIII
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Relaccedilatildeo de nome estrutura e coacutedigo dos compostos utilizados 20
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo da
concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) 28
Tabela 3 Ensaio virucida 37
Tabela 4 Ensaio Antiviral 38
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados 39
XIV
LISTA DE ABREVIATURAS
AMV ndash Mielobastose Aviaacuteria viacuterus (Avian Myeloblastosis virus )
CC50 ndash Concentraccedilatildeo Citotoacutexica 50
DENV ndash Dengue virus
DMEM ndash Meio baacutesico modificado por Dulbecco (Dulbeccos Modified Eagle Medium)
DMSO ndash Dimetilsulfoacutexido
ICTV ndash Comitecirc Inernacional de Taxonomia Viral
JEV ndash Viacuterus da Encefalite Japonesa (Japanese Encephalitis virus)
MOI ndash Multiplicidade de infecccedilatildeo viral
NS ndash Proteiacutenas natildeo estruturais
NT ndash Natildeo Tratado
OMS ndash Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede
RE ndash Retiacuteculo endoplasmaacutetico
RLV ndash Viacuterus da Leucemia Murina de Rauscher (Murine leukemia virus)
SFB ndash Soro Fetal Bovino
UFP ndash Unidades formadoras de placas
WNV ndash Viacuterus do Nilo Ocidental (West Nile virus)
YFV ndash Viacuterus da febre amarela (Yellow fever virus)
ZV ndash Zika virus
1
I INTRODUCcedilAtildeO
2
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Flavivirus
O Gecircnero Flavivirus pertencente agrave famiacutelia Flaviviridae inclui 53 espeacutecies
taxonomicamente reconhecidas (ICTV 2016) muitas das quais satildeo importantes patoacutegenos
humanos tais como o Dengue virus (DENV) Yellow fever virus (YFV - viacuterus da febre
amarela ndash protoacutetipo deste gecircnero) Japanese encephalitis virus (JEV - viacuterus da encefalite
japonesa) West Nile virus (WNV - virus do Nilo Ocidental) Zika virus (ZV) entre outros
(Villordo 2016) O nome flavivirus eacute derivado da palavra latina flavus que significa amarelo
significando a icteriacutecia causada pelo YFV Os sintomas da infecccedilatildeo por flavivirus pode variar
de leve febre e mal-estar a encefalite fatal e febre hemorraacutegica (Mukhopadhyay 2005)
Estes viacuterus regulam o metabolismo e a sobrevivecircncia das ceacutelulas infectadas
assegurando a sua proacutepria reproduccedilatildeo e propagaccedilatildeo O viacuterus da dengue tambeacutem provoca a
autofagia uma resposta homeostaacutetica geral que ajuda a ceacutelula infectada sobreviver e produzir
viacuterus (Datan 2016)
Os Flavivirus podem ser agrupados em complexos e sub-complexos antigecircnicos
baseados em criteacuterios soroloacutegicos ou em grupos clados e espeacutecies segundo a sua filogenia
molecular (Lindenbach 2007) A maioria dos membros deste gecircnero satildeo arbovirus (arthropod
borne virus) ou seja satildeo essencialmente transmitidos por Artroacutepodes (Mackenzie 2004)
onde 27 satildeo transmitidos por mosquitos 12 por carrapatos e 14 natildeo possuem vetor
conhecido Os viacuterus transmitidos pela fecircmea do gecircnero Aedes incluem DENV e YFV satildeo
viscerotroacutepicos e possuem primatas como reservatoacuterio natural (Gaunt 2001)
A patogenia da Dengue causada pelo DENV constitui uma das doenccedilas virais mais
importantes em seres humanos transmitidos por insetos e eacute responsaacutevel por cerca de 390
milhotildees de infecccedilotildees por ano O YFV por sua vez causador da febre amarela eacute endecircmico em
vaacuterios paiacuteses do continente Africano e da Ameacuterica do Sul resultando em 200000 casos e
30000 mortes na Aacutefrica mesmo com vacinas eficazes disponiacuteveis Outras doenccedilas causadas
por flaviviacuterus incluem a encefalite do Nilo Ocidental (West Nile virus) e febre Zika (Zika
virus) que satildeo consideradas doenccedilas emergentes com surtos importantes em todo o mundo
(Villordo 2016)
3
12 Dengue virus
Os DENV pertencem ao gecircnero flaviviacuterus e evoluiram em primatas natildeo-humanos a
partir de um ancestral comum Eacute composto por quatro sorotipos antigenicamente distintos
(DENV1-4) que co-circulam por todo o Sudeste da Aacutesia Aacutefrica e Ameacutericas (McArthur 2013)
e em outubro de 2013 foi anunciado um novo sorotipo circulante denominado entatildeo de DENV
5 (Normile 2013) A partiacutecula infecciosa eacute esfeacuterica com 40-50 nm de diacircmetro possuindo
um envelope de lipopolissacariacutedeo O genoma consiste em RNA de fita simples natildeo
segmentado e senso positivo de aproximadamente 11 kb de comprimento e possui uma uacutenica
janela aberta de leitura (start codon) (Guzman 2010) Apoacutes a traduccedilatildeo a uacutenica poliproteiacutena
formada eacute clivada por proteases virais e celulares em trecircs proteiacutenas estruturais que compotildeem
a partiacutecula viral C (capsideo) prM M (membrana e o seu precursor) e E (envelope) e sete
proteiacutenas natildeo estruturais essenciais para a replicaccedilatildeo viral (NS) (NS1 NS2a NS2b NS3
NS4a NS4b e NS5) (Robertson 2009)
A transmissatildeo do viacuterus ocorre atraveacutes da picada por fecircmeas infectadas de mosquitos
do gecircnero Aedes sendo responsaacutevel pelas maiores taxas de doenccedila e mortalidade entre os
membros do gecircnero Flavivirus (Mukhopadhyay 2005) No Brasil o Aedes aegypti eacute o
principal vetor de dengue enquanto o Aedes albopictus atua como um vector secundaacuterio
(Weaver 2010)
O diagnoacutestico soroloacutegico da Dengue se baseia na detecccedilatildeo de niacuteveis elevados de
anticorpos anti-Dengue-IgM ou anti-Dengue-IgG que reconhecem e se ligam ao antiacutegeno de
DENV A Glicoproteiacutena do envelope (E) uma proteiacutena estrutural de DENV eacute o alvo
antigecircnico mais importante destes anticorpos neutralizantes porque estaacute exposta na superfiacutecie
do viacuterus e medeia os receptores de ligaccedilatildeo e fusatildeo da ceacutelula hospedeira (Lee 2015)
Durante a infecccedilatildeo celular os virions de DENV se ligam agrave superfiacutecie da membrana
atraveacutes da glicoproteiacutena do envelope (E) a receptores especiacuteficos e satildeo internalizados por
endocitose Uma vez dentro do endossoma a acidificaccedilatildeo provocada pela ligaccedilatildeo de
lisossomos desencadeia uma trimerizaccedilatildeo irreversiacutevel da proteiacutena E que atua na fusatildeo das
membranas virais e endossomais celulares Apoacutes essa fusatildeo o nucleocapsideo eacute liberado no
citoplasma onde o mesmo eacute desnudado e a replicaccedilatildeo do genoma de RNA e montagem de
partiacuteculas eacute iniciada As partiacuteculas virais imaturas satildeo acumuladas no luacutemen do retiacuteculo
endoplasmaacutetico (RE) Essas partiacuteculas imaturas que contecircm proteiacutenas prM proteiacutena E
membrana lipiacutedica e nuacutecleo capsiacutedeo natildeo pode induzir a fusatildeo da ceacutelula hospedeira ou seja
4
neste estaacutegio elas natildeo satildeo infecciosas (Mukhopadhyay 2005) O processo de maturaccedilatildeo
desses viacuterus ocorre apoacutes a clivagem proteoliacutetica da proteiacutena precursora de membrana (prM)
transformando viacuterus inerte em partiacuteculas infecciosas (Li 2008) Partiacuteculas subvirais satildeo
tambeacutem produzidas no RE mas apenas contecircm as glicoproteiacutenas de membrana fazendo com
que estas partiacuteculas sejam natildeo infecciosas Os viacuterus maduros e as partiacuteculas sub-virais satildeo
liberados da ceacutelula hospedeira por exocitose (Mukhopadhyay 2005)
Na pele o DENV tende a infectar ceacutelulas dendriacuteticas imaturas Estas ceacutelulas infectadas
amadurecem e migram para os gacircnglios linfaacuteticos regionais ou locais onde apresentam
antiacutegenos virais agraves ceacutelulas T iniciando as respostas imunes Existe tambeacutem evidecircncia de
replicaccedilatildeo abundante de DENV em ceacutelulas do parecircnquima do fiacutegado e em macroacutefagos nos
gacircnglios linfaacuteticos fiacutegado e baccedilo bem como em monoacutecitos de sangue perifeacuterico (Guzman
2010)
Proteiacutena E
(diacutemero)
Proteiacutena
M
Proteiacutena C
ssRNA (+)
Figura 1 Estrutura da partiacutecula viral de Dengue viacuterus A partiacutecula viral eacute composta
por trecircs proteiacutenas estruturais proteiacutena de envelope (E) disposta em diacutemeros a proteiacutena
associada agrave membrana (M) e a proteiacutena do nucleocapsiacutedeo (C) O genoma de RNA fita-
simples de polaridade positiva se encontra dentro do nucleocapsiacutedeo (Adaptado de
httpviralzoneexpasyorgviralzoneall_by_species24html)
5
Figura 2 Ciclo de multiplicaccedilatildeo de DENV A Os viacuterus se ligam aos receptores na superfiacutecie da
ceacutelula e satildeo endocitados B Devido ao baixo pH dentro dos endossomas ocorre a fusatildeo de
membranas viral-celular mediada por proteiacutenas virais resultando na liberaccedilatildeo do RNA viral em um
processo chamado de desnudamento C O genoma viral eacute traduzido em uma uacutenica poliproteiacutena que
eacute processada por proteases do viacuterus e da ceacutelula hospedeira D O RNA eacute replicado por proteiacutenas
natildeo-estruturais do proacuteprio viacuterus E A montagem do viacuterus ocorre na membrana do Reticulo
endoplasmaacutetico no qual a proteiacutena do capsiacutedeo e o RNA viral satildeo envolvidos por glicoproteiacutenas e
pela membrana da organela para formar partiacuteculas virais imaturas F Partiacuteculas virais imaturas
utilizam a via secretora da ceacutelula hospedeira e sob o baixo pH do Complexo de Golgi a proteiacutena
precursora prM eacute clivada em proteiacutena M completando a maturaccedilatildeo do viacuterus GOs viacuterus maduros
satildeo entatildeo liberados das ceacutelulas por exocitose Os nuacutemeros indicados nas caixas coloridas referem-se
ao valor de pH dos respectivos compartimentos Imagem adaptada de PERERA 2009
Adsorccedilatildeo
Siacutentese e processamento
Fusatildeo e
Desnudamento
Replicaccedilatildeo do RNA
Montagem
Maturaccedilatildeo
Liberaccedilatildeo de
viacuterus
maduro
A
B
C
D
E
F
G
6
13 Epidemiologia
Ao longo das uacuteltimas deacutecadas a dengue se tornou a doenccedila viral transmitida por
mosquitos mais prevalente no mundo Estimativas de infecccedilatildeo pela OMS indicam que a
patologia eacute endecircmica em mais de 100 paiacuteses em todos os continentes exceto a Antaacutertida e
aflige principalmente paiacuteses pobres em recursos nas regiotildees tropicais e subtropicais (Perry
2011) Epidemias globais de DENV ocorreram ao longo das uacuteltimas deacutecadas em parte devido
agrave diminuiccedilatildeo dos esforccedilos no controle de mosquitos Satildeo estimados mais de 50 milhotildees de
casos de dengue anualmente (Mukhopadhyay 2005)
A Dengue eacute uma doenccedila viral sistecircmica aguda que se estabeleceu em todo o mundo
em ambos os ciclos de transmissatildeo endecircmicas e epidecircmicas A infecccedilatildeo pelo DENV em seres
humanos eacute frequentemente inaparente mas pode levar a uma grande variedade de
manifestaccedilotildees cliacutenicas de febre leve a siacutendrome do choque da dengue potencialmente fatal A
imunidade vitaliacutecia desenvolvida apoacutes a infecccedilatildeo com um dos quatro tipos de viacuterus eacute
especiacutefica para cada tipo e a progressatildeo para uma doenccedila mais grave eacute frequente mas natildeo
exclusivamente relacionada com infecccedilatildeo secundaacuteria por tipos heteroacutelogos No entanto
enquanto a expansatildeo histoacuterica desta doenccedila eacute bem documentada o elevado fardo de
problemas de sauacutede atribuiacuteveis agrave dengue em grande parte do mundo tropical e sub-tropical
permanecem pouco enumerados (Bhatt 2013)
O Brasil eacute um paiacutes de grande extensatildeo (8512000 km2) situado em uma zona
predominantemente tropical com extensas aacutereas de florestas na regiatildeo amazocircnica bem como
restos de uma floresta tropical na costa leste sudeste e sul entre outros ecossistemas A maior
parte do paiacutes tem um clima tropical e uma grande diversidade de plantas e animais portanto
um local adequado para a ocorrecircncia de patologias causadas por viacuterus transmitidos por
artroacutepodes (Figueiredo 2000) Segundo o boletim epidemioloacutegico do ministeacuterio da sauacutede em
2016 jaacute foram registrados 170103 casos provaacuteveis de dengue no paiacutes ateacute a semana
epidemioloacutegica 5 Nesse periacuteodo a regiatildeo Sudeste registrou o maior nuacutemero de casos
provaacuteveis (96664 casos 568) Em Minas Gerais jaacute foram registradas 19 mortes em
decorrecircncia da Dengue entre 1deg de janeiro e 14 de marccedilo deste ano Outros 91 oacutebitos estatildeo
sob investigaccedilatildeo (BRASIL 2016)
7
Figura 3 Distribuiccedilatildeo geograacutefica da Dengue Aacutereas de risco de transmissatildeo em amarelo
(Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede Adaptado de httpwwwwhointen)
As manifestaccedilotildees da doenccedila foram descritas pela primeira vez apoacutes a Segunda Guerra
Mundial coincidente com o aumento da urbanizaccedilatildeo particularmente na Aacutesia (Weaver 2010)
Atualmente o DENV eacute hiperendecircmico em muitas regiotildees tropicais onde 2 ou mais sorotipos
circulam endemicamente Embora DENV foi provavelmente introduzido periodicamente para
as Ameacutericas atraveacutes de navios desde o seacuteculo 17 o surgimento de DENV no Hemisfeacuterio
Ocidental comeccedilou mais tarde devido a uma campanha de sucesso parcial para erradicar o
vetor A aegypti para controlar a febre amarela Esta campanha teve sucesso na maior parte
das Ameacutericas da deacutecada de 1950 agrave deacutecada de 1970 mas foi interrompida O vetor entatildeo
rapidamente recolonizou quase toda a regiatildeo neotropical e subtropicais e a invasatildeo do DENV
seguiu logo depois Em 1985 A albopictus foi introduzido nos EUA e no Brasil
proporcionando um vetor para a transmissatildeo secundaacuteria de DENV nas Ameacutericas (Hawley
1987)
Os mosquitos vetores principalmente A aegypti tornam-se infectados quando eles se
alimentam do sangue de seres humanos durante o periacuteodo de cinco dias da viremia A
infecccedilatildeo produz um amplo espectro da doenccedila cliacutenica e varia de assintomaacutetica a doenccedila febril
auto-limitante A dengue tambeacutem conhecida como ldquofebre osso quebradordquo devido agraves fortes
dores nas articulaccedilotildees e inclui sintomas de febre alta dores musculares articulares e erupccedilatildeo
cutacircnea Uma pequena porcentagem de indiviacuteduos pode apresentar a siacutendrome do choque da
8
dengue (dengue hemorraacutegica) com risco de vida grave O tratamento eacute amplamente favoraacutevel
usando de reidrataccedilatildeo oral ou intravenosa acompanhamento e atenccedilatildeo meacutedica adequada No
entanto uma das principais consequecircncias da doenccedila eacute a sua capacidade de sobrecarregar
instalaccedilotildees meacutedicas durante um surto e em paiacuteses onde os recursos de sauacutede jaacute estatildeo no
limite isso pode ter efeitos catastroacuteficos Prevenccedilatildeo e tratamento portanto se fazem
altamente necessaacuterios (Perry 2011)
A prevalecircncia global de DENV cresceu drasticamente nas uacuteltimas deacutecadas e ateacute o
momento natildeo haacute nenhum medicamento especiacutefico para combater a infecccedilatildeo as medidas de
prevenccedilatildeo mais eficazes satildeo voltadas para o controle do vetor (Silva 2011) Diante disso a
Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) elegeu o desenvolvimento de vacinas contra o viacuterus da
dengue como prioridade mundial (Kinney 2001) Por conseguinte a busca de substacircncias
naturais ou sinteacuteticas com atividade antiviral especiacutefica sem toxicidade para as ceacutelulas
normais em seres humanos eacute uma estrateacutegia desejada para evitar que a dengue se agrave e
ajudar a controlar a difusatildeo da doenccedila As vaacuterias fases do ciclo viral representam alvos
terapecircuticos individuais que podem ser exploradas (Costa 2013) Nesse sentido vaacuterios
grupos de pesquisa e organizaccedilotildees estatildeo trabalhando com diversas abordagens para o
desenvolvimento de compostos antivirais com atividade protetora contra dengue Dentre elas
uma vasta gama de produtos naturais incluindo plantas numa tentativa de isolar e
caracterizar novos compostos que podem inibir a replicaccedilatildeo do viacuterus ou tratar a infecccedilatildeo
viral Por essa razatildeo extratos e componentes da planta satildeo cada vez mais importantes como
fontes potenciais para agentes antivirais (Silva 2011)
14 Naftoquinonas
As quinonas satildeo compostos aromaacuteticos amplamente distribuiacutedos na natureza e podem
ser encontrados em vaacuterias famiacutelias de plantas bem como isolado de fungos algas e
bacteacuterias Elas satildeo classificadas em benzoquinonas antraquinonas e naftoquinonas de acordo
com as suas estruturas quiacutemicas Naftoquinonas satildeo compostos orgacircnicos altamente reativos
utilizados como corantes naturais ou sinteacuteticos cujas cores variam de amarelo para vermelho
Apresentam cadeia carbocircnica similar ao naftaleno e satildeo caracterizadas por seus dois grupos
carbonila na posiccedilatildeo 1 e 4 por isso satildeo nomeadas de 14-naftoquinonas Os grupos carbonila
tambeacutem podem estar presente na posiccedilatildeo 12 com menor incidecircncia (Loacutepez 2014)
9
Figura 4 Estrutura quiacutemica da 12-naftoquinona (1) e 14-naftoquinona (2)
Entre as quinonas estatildeo compostos biologicamente importantes tais como o grupo da
vitamina K e a coenzima Q (ubiquinona) Estes compostos tecircm um papel importante no
metabolismo celular especialmente como carreadores de eleacutetrons Aleacutem de quinonas que
possuam uma funccedilatildeo bioloacutegica outros compostos desta classe tecircm sido encontrados
mostrando atividade antibioacutetica Alguns deles estatildeo presentes na natureza mas a maior parte
satildeo obtidos sinteticamente entre eles 2-hidroxi-3-alquil-14-naftoquinonas que possuem
evidecircncias de serem ativos in vitro contra os parasitas da malaacuteria e como coccidiostaacuteticos
(Ambrogi 1970)
A atividade bioloacutegica de quinonas estaacute muitas vezes relacionada com o seu
comportamento eletroquiacutemico A capacidade de aceitar um ou dois eleacutetrons para formar o
acircnion radical correspondente ou dianion pode ser o motivo da induccedilatildeo da formaccedilatildeo de
espeacutecies reativas de oxigecircnio responsaacuteveis pelo estresse oxidativo nas ceacutelulas A capacidade
de aceitar eleacutetrons de naftoquinonas pode ser alterada por mudanccedilas de posiccedilatildeo do grupo
carbonila (12- 14-naftoquinonas) ou diferentes substituintes ou funccedilotildees associadas agrave porccedilatildeo
de naftoquinona (Francisco 2010)
As naftoquinonas satildeo largamente encontradas em plantas micro-organismos e alguns
animais Estes compostos tecircm sido amplamente utilizados em diversas culturas como corantes
para cosmeacuteticos tecidos alimentos (Brandelli 2004) e para fins medicinais incluindo
antitumoral (Oliveira 1990 Ferreira 1996) anti-inflamatoacuterios antimalaacuterico antiviral
(Fonseca 2003 Hussain 2007) atibacterianos e antifuacutengicos (Nagata 1998) Estas atividades
bioloacutegicas tecircm justificado o grande nuacutemero de trabalhos (aproximadamente 42 ateacute abril 2016
ndash Pubmed) encontrados na literatura que visa a siacutentese e avaliaccedilatildeo de qualquer das quinonas
naturais ou seus anaacutelogos como agentes farmacoloacutegicos potenciais (Rahmoun 2013)
10
O Lapachol foi descoberto e estudado desde o seacuteculo XIX Foi isolado primeiramente
do lenho da aacutervore argentina ldquolapachordquo Tabebuia avellanedae (Bignoniaceae) conhecida
como Ipecirc roxo Os estudos quiacutemicos foram desenvolvidos inicialmente em 1892 (Fonseca
2003) O lapachol foi descrito pela primeira vez por Paterno em 1821 tendo sua estrutura
quiacutemica estabelecida em 1896 por Hooker que o identificou como uma naftoquinona Esta
naftoquinona possui accedilatildeo antiinflamatoacuteria analgeacutesica antibioacutetica e anti-neoplaacutesica
reconhecida (Arauacutejo 2002)
A β-lapachona (34-di-hidro-22-dimetil-2H-naptho [12-b] pirano-56-diona) eacute uma
quinona obtida de fontes naturais derivada da aacutervore Lapacho (Tabebuia avellanedae) nativa
da Ameacuterica do Sul e Central A siacutentese e quiacutemica da β-lapachona e compostos relacionados
foi inicialmente investigado no final do seacuteculo XIX e iniacutecio do seacuteculo XX pelo quiacutemico
Samuel Hooker Apesar de alguns estudos cliacutenicos sobre a bioatividade de naftoquinonas
terem sido relatados no iniacutecio de 1940 foi o relatoacuterio do potencial da β-lapachona como um
agente anti-tripanossoma em 1977 que revitalizou o estudo e caracterizaccedilatildeo deste composto
natural A β-lapachona tambeacutem apresenta vaacuterias accedilotildees farmacoloacutegicas incluindo accedilatildeo
formaccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (Hussain 2007)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do Lapachol (1) da α- Lapachona (2) e da β-
Lapachona (Fonseca et al 2003 Ferreira et al 2010)
11
Figura 6 Tabebuia avellanedae (Hussain 2007)
A β-lapachona eacute uma substacircncia natural facilmente obtida a partir do lapachol Esta
naftoquinona eacute o grande destaque desta classe de substacircncias porque se encontra em testes
cliacutenicos de fase II para o tratamento do cacircncer de pacircncreas (Ferreira 2010) O mecanismo de
accedilatildeo da β-lapachona diferencia-se de outros antineoplaacutesicos por atuar na topoisomerase I
promovendo a recuperaccedilatildeo da capacidade de apoptose celular Alguns estudos reportam sua
accedilatildeo sineacutergica de potenciaccedilatildeo com o Taxolreg
promovendo a inibiccedilatildeo em diferentes pontos de
replicaccedilatildeo celular aleacutem de sua combinaccedilatildeo com outros tratamentos como a aplicaccedilatildeo de
radiaccedilatildeo ionizante (Cunha 2005)
Vaacuterios estudos jaacute foram publicados demonstrando a atividade antiviral de
naftoquinonas naturais e sinteacuteticas A β-lapachona inibe seletivamente a replicaccedilatildeo do viacuterus
HIV-1 atuando na inibiccedilatildeo da enzima LTR117 Da mesma forma este composto eacute um
potente inibidor da enzima transcriptase reversa dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e
leucemia murina de Rauscher (RLV) inibindo tambeacutem a DNA polimerase A accedilatildeo inibitoacuteria
sobre estas enzimas revelou-se especiacutefica se comparada com a de outros inibidores
conhecidos (Silva 2003)
O Lapachol jaacute demonstrou atividade contra certas cepas virais incluindo Herpes virus
tipos I e II Outras naftoquinonas jaacute mostraram eficaacutecia contra cepas de Influenza virus
Poliomielite virus e estomatite vesicular Supotildee-se que o mecanismo de accedilatildeo destas quinonas
seja atraveacutes da inibiccedilatildeo da transcriptase reversa de retroviacuterus e da RNA polimerase Eacute relatado
12
que lapachol diminui a replicaccedilatildeo do viacuterus em seres humanos mas ainda natildeo existem
resultados de testes cliacutenicos disponiacuteveis (Hussain 2007)
Na avaliaccedilatildeo da atividade antiviral do Lapachol in vitro verificou-se que esta
substacircncia eacute ativa contra viacuterus RNA atuando tanto sobre viacuterus envelopados quanto sobre
partiacuteculas sem esta estrutura em concentraccedilotildees de 5 a 10 microgmL e ainda apresentou uma
pequena atividade sobre HSV (Herpes simplex I) e Ad5 (Adeno tipo 5) mas nenhuma
atividade sobre CoxB4 (Coxsackie B4) Em trabalho posterior demonstrou-se que nem o
Lapachol nem diversos dos seus derivados apresentaram atividade antiviral in vitro sobre
Poliovirus tipo 1 Ecovirus 19 e Coxsackie B tipo 4 Apenas os derivados 12-naftoquinonicos
e um intermediaacuterio da siacutentese Hoocker foram ativos contra o Echovirus 19 (Fonseca 2003)
Costa et al (2013) relataram que piranonaftoquinonas isocircmeras do lapachol possuem
atividade de inibiccedilatildeo da replicaccedilatildeo de DENV-2 atuando sobre a atividade da ATPase de NS3
(proteiacutena natildeo estrutural de DENV)
A utilizaccedilatildeo de testes in vitro por meio de ensaios de viabilidade celular constitui o
primeiro passo para a avaliaccedilatildeo da compatibilidade bioloacutegica de uma substacircncia e pode
fornecer elementos importantes para a anaacutelise da biocompatibilidade dos diferentes materiais
Para ser considerado natildeo citotoacutexico no teste de citotoxicidade in vitro um produto natildeo deve
ocasionar a morte das ceacutelulas nem afetar suas funccedilotildees celulares A prova do MTT eacute um dos
indicadores colorimeacutetricos de viabilidade celular mais utilizados sendo capaz de avaliar a
funccedilatildeo celular mitocondrial de acordo com a reduccedilatildeo enzimaacutetica do sal de tetrazoacutelio pelas
desidrogenases mitocondriais nas ceacutelulas viaacutevies (Arauacutejo et al 2008) Supotildee-se que o
mecanismo responsaacutevel pela citotoxicidade apresentada pelas quinonas esteja relacionado
com o estresse oxidativo causado por esses compostos poreacutem a capacidade de alquilaccedilatildeo de
nucleoacutefilos celulares tambeacutem representa correlaccedilatildeo com tais efeitos bioloacutegicos (Goulart
2004)
13
II JUSTIFICATIVA
14
2 JUSTIFICATIVA
Aleacutem do controle do mosquito transmissor e do desenvolvimento de vacinas que tem
sido exaustivamente estudado nos uacuteltimos anos uma alternativa para o combate agrave dengue
seria o desenvolvimento de faacutermacos para reduzir a viremia ou mesmo para controlar a
resposta imune do hospedeiro agrave infecccedilatildeo que tem sido apontada como principal fator de risco
nos casos mais graves Em funccedilatildeo disso o nuacutemero de pesquisas visando o desenvolvimento
de drogas com accedilatildeo antiviral ou com accedilatildeo imunomodulatoacuteria tem aumentado
significativamente As naftoquinonas vecircm ganhando bastante importacircncia na pesquisa de
novas drogas antivirais devido agrave algumas atividades apresentadas A szlig-lapachona-orto-
naftoquinona por exemplo se mostrou um potente inibidor da enzima transcriptase reversa
dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e leucemia murina de Rauscher (RLV)
Diante da inexistecircncia de drogas com accedilatildeo anti DENV e o elevado nuacutemero e casos da
patogenia nos uacuteltimos anos a organizaccedilatildeo mundial da sauacutede classificou a Dengue como uma
epidemia de proporccedilotildees globais e um problema de sauacutede puacuteblica Como as naftoquinonas jaacute
demonstraram na literatura possuir um potencial efeito terapecircutico contra alguns viacuterus eacute
possiacutevel que estes compostos possam apresentar atividade antiviral contra DENV Portanto
este trabalho visou atraveacutes de ensaios de MTT e titulaccedilotildees virais em placa avaliar a potencial
atividade antiviral de oito compostos derivados de naftoquinonas naturais e sinteacuteticas
15
III OBJETIVOS
16
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar oito compostos (2 naturais e 6 sinteacuteticos) derivados de naftoquinonas como potenciais
agentes antivirais em ceacutelulas BHK-21 frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1 e 2
32 Objetivos especiacuteficos
1 Calcular o iacutendice de citotoxicidade e a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) dos compostos
atraveacutes de ensaio de reduccedilatildeo de MTT
2 Avaliar os efeitos dos compostos sobre o crescimento a viabilidade e o volume celular
pela teacutecnica de exclusatildeo do azul de tripan
3 Determinar a multiplicidade de infecccedilatildeo de DENV 1 e 2 a ser utilizada nos ensaios
antivirais
4 Avaliar a atividade antiviral dos compostos frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1
e 2 atraveacutes do ensaio de MTT
5 Verificar um possiacutevel efeito direto dos compostos agraves partiacuteculas virais de Dengue virus
6 Quantificar a produccedilatildeo de partiacuteculas virais infecciosas no sobrenadante de ceacutelulas
infectadas atraveacutes de titulaccedilatildeo viral pela contagem de unidades formadoras de placas
17
IV MATERIAL E MEacuteTODOS
18
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Linhagens celulares
411 Ceacutelulas C636
As ceacutelulas C636 satildeo ceacutelulas de linhagem contiacutenua de larvas de mosquito Aedes
albopictus Estas ceacutelulas foram utilizadas na produccedilatildeo de estoque viral de DENV sorotipos 1
e 2 para isso foram mantidas em meio de cultura Leibovitz-15 (L-15) (Cultilab)
suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (Cultilab) antibioacuteticos (Penicilina 100 UmL
Streptomicina 100 microgmL) e antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL) a 28degC
412 Ceacutelulas BHK-21
As ceacutelulas BHK-21 satildeo fibroblastos de linhagem contiacutenua derivados de rim de hamster
neonato Estas ceacutelulas foram utilizadas para os experimentos in vitro e para as titulaccedilotildees de
DENV 1 e 2 para isso foram mantidas em meio miacutenimo essencial modificado por Dulbecco
ndash DMEM (Cultilab) suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (SFB) com antibioacuteticos
(Penicilina 100 UmL Streptomicina 100 microgmL) e com antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL)
sendo mantidas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5
42 Viacuterus
421 DENV 1 e DENV 2
O Sorotipo 1 do Dengue virus (DENV-1) estirpe Mochizuki foi replicado em ceacutelulas
C636 para gerar estoques de trabalho durante 2 e 5 dias a 28degC O sobrenadante da cultura de
ceacutelulas infectadas foi recolhido e clarificado por centrifugaccedilatildeo a 4000 G durante 10 minutos agrave
4degC e entatildeo foi aliquotado e armazenado a -70 deg C como reserva de viacuterus ateacute agrave sua utilizaccedilatildeo
A replicaccedilatildeo geraccedilatildeo de estoque e titulaccedilatildeo do Sorotipo 2 do Dengue virus (DENV-2)
estirpe Nova Guineacute C ocorreu nos mesmos moldes do DENV-1
19
422 Titulaccedilatildeo viral
Os estoques virais foram diluiacutedos (10-1
a 10-7
) e inoculados em monocamadas de
ceacutelulas BHK-21 implantadas em placas de 6 poccedilos com confluecircncia de aproximadamente
60 (3x105 ceacutelulas por poccedilo) sendo um poccedilo natildeo infectado mantido para controle celular
Apoacutes uma hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus foram adicionados 3 mL de meio DMEM (Cultilab)
suplementado com 15 de SFB e contendo 15 de Carboximetilcelulose (CMC Synth) As
placas foram entatildeo incubadas a 37degC (CO2 a 5) por 96 horas As ceacutelulas foram entatildeo
fixadas com 2 mL de soluccedilatildeo de formol a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo
1 (pv) de cristal violeta em PBS para contagem das placas de lise O tiacutetulo viral foi
expresso atraveacutes do nuacutemero de unidades formadoras de placa por mL (UFPmL) segundo a
formula abaixo representada
Tiacutetulo viral (UFPmL) = N x FC x 10
N = nuacutemero de placas de lise contadas
FC = Fator de correccedilatildeo
= Inverso da diluiccedilatildeo na qual foram contadas as placas de lise
43 Compostos de naftoquinonas
Os compostos utilizados neste estudo foram fornecidos pelo Dr Geraldo Ceacutelio
Brandatildeo do laboratoacuterio de pesquisa da Escola de Farmaacutecia da Universidade Federal de Ouro
Preto
20
Tabela 1 Relaccedilatildeo de nome estrutura e coacutedigo dos compostos utilizados Na tabela estatildeo
presentes a relaccedilatildeo dos nomes dos compostos utilizados neste trabalho bem como sua
estrutura Os coacutedigos representantes de cada composto seratildeo utilizados no decorrer da escrita
Nome do composto Estrutura Coacutedigo
Lapachol
A1
β-lapachona
A2
2-Hidroxi-3-(ββ-dimetilvinil)-14-naftoquinona
A3
2-Cloro-14-naftoquinona
A4
Lapachol derivado 1
A5
Lapachol derivado 2 A6
Lapachol derivado 3 A7
Lapachol derivado 4 A8
44 Ensaio de citotoxicidade
Para avaliar a citotoxicidade dos compostos ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas foram incubadas com diferentes concentraccedilotildees dos compostos em triplicata num
volume de 200 microL de meio de cultura por poccedilo na presenccedila de 1 de SFB Os controles natildeo
tratados apresentaram adiccedilatildeo de 200 microL de meio de cultura As ceacutelulas foram entatildeo incubadas
durante 72 horas O meio foi removido e 28 microL de soluccedilatildeo de 5 mg mL MTT (brometo de 3-
21
[45-dimetil-tiazol-2-il]-25 difeniltertrazoacutelio) foi adicionado a cada poccedilo As placas foram re-
incubadas durante 1 hora e 30 minutos e entatildeo 122 microL de DMSO foi adicionado a cada poccedilo e
placas foram agitadas suavemente durante 15 minutos para dissolver os cristais de formazan
A absorbacircncia foi lida em um equipamento leitor de placas Victor X3 (PerkinElmer) a 490
nm A concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC 50) foi definida como a concentraccedilatildeo da amostra que
reduziu a viabilidade celular de 50 em comparaccedilatildeo com controles natildeo tratados Os dados
foram analisados utilizando o programa Prisma
45 Avaliaccedilatildeo da viabilidade e crescimento celular por exclusatildeo de azul de tripan
Ceacutelulas BHK-21 foram cultivadas em placas de 24 poccedilos (7x104 ceacutelulaspoccedilo) e apoacutes
24 horas foram tratadas com as concentraccedilotildees de uso de cada composto e incubadas por 72
horas na presenccedila de 1 de SFB A seguir as ceacutelulas foram tripsinizadas e incubadas com
azul de tripan e entatildeo foi utilizado um contador automatizado de ceacutelulas (Countess II FL
Automated Cell Counter ndash Thermo Fisher Scientific) para contagem das ceacutelulas e avaliaccedilatildeo da
porcentagem de viabilidade e diacircmetro celular do controle nos tempos de 0 24 e 96 horas e
avaliaccedilatildeo dos mesmos paracircmetros para os compostos no tempo de 96 horas (72 horas poacutes
tratamento)
Outra curva de multiplicaccedilatildeo celular foi feita para os compostos A1 A3 A4 e A5 onde as
ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos no momento da confecccedilatildeo da placa e
foram avaliados os mesmos paracircmetros nos tempos de 0 12 24 48 e 72 horas O
equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
46 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
Para determinar a menor Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) responsaacutevel pela letalidade
celular total 2x104 de ceacutelulas BHK-21 foram semeadas em placa de 96 poccedilos Apoacutes a
incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o
meio de cultura foi removido e as ceacutelulas foram expostas a diferentes diluiccedilotildees dos dois
sorotipos de DENV (100 microL de cada diluiccedilatildeo + 100 microL de meio DEMEM 1 SFB) As
diluiccedilotildees seriadas foram realizadas da suspensatildeo viral na razatildeo de 5 para o primeiro poccedilo e de
2 para os demais poccedilos Apoacutes 72 horas as ceacutelulas foram entatildeo fixadas com 200 microL de soluccedilatildeo
22
formalina a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo 1 (pv) de cristal violeta em
PBS para avaliaccedilatildeo da maior diluiccedilatildeo responsaacutevel pela letalidade de 100 das ceacutelulas
47 Ensaio Dose-resposta
Para cada composto foram realizados ensaios de dose-resposta para definiccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de cada composto capaz de promover a reduccedilatildeo na produccedilatildeo viral A atividade
antiviral foi avaliada tambeacutem pelo meacutetodo de MTT Ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas expostas a diferentes concentraccedilotildees dos extratos determinadas a partir das maiores
concentraccedilotildees em que natildeo foram observados efeitos citotoacutexicos As ceacutelulas foram tratadas
com as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de cada composto e em seguida infectadas com DENV
1 (MOI= 5) ou 2 (MOI= 2) Mantendo uma coluna para controle com DMSO uma coluna
para controle de viacuterus uma coluna para controle de citotoxicidade dos compostos e por fim
uma coluna para controle celular As ceacutelulas foram entatildeo incubadas durante 72 horas Apoacutes
este tempo procedeu-se a leitura pelo ensaio de MTT como descrito anteriormente Os dados
foram analisados levando-se em consideraccedilatildeo a leitura das absorbacircncias dos poccedilos dos
controles de viacuterus e do controle celular
Para realizacao destes experimentos os seguintes controles foram adotados
Controle de ceacutelulas poccedilos contendo somente ceacutelulas acrescidas do meio de cultura DMEM
1 SFB Utilizado para avaliar o comportamento das ceacutelulas sem que as mesmas tivessem
contato com qualquer interferente durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo Com isso os poccedilos
reservados para esse controle serviram de padratildeo para comparaccedilatildeo com aqueles em que fosse
observada atividade citotoacutexica ou citopaacutetica
Controle de viacuterus poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM 1 SFB
sem nenhum tratamento e de suspensatildeo de viacuterus Utilizando como referecircncia para anaacutelise da
atividade citopaacutetica provocada pelo viacuterus testado durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo das placas
23
Controle de viacuterus com DMSO Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura
DMEM 1 SFB e DMSO Foi utilizado para avaliar se havia influecircncia prejudicial do
solvente utilizado para diluiccedilatildeo das amostras no meio de cultivo das ceacutelulas e se o mesmo
poderia apresentar alguma potencial atividade antiviral aparente
Controle de citotoxicidade Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM
1 SFB e as quatro principais concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos Foi utilizado
para avaliar se haveria alguma possiacutevel atividade citotoacutexica das concentraccedilotildees dos compostos
em relaccedilatildeo agraves ceacutelulas
48 Ensaio Virucida
Para a realizaccedilatildeo deste ensaio aliacutequotas de 950 microL (diluiccedilatildeo de 20 vezes) do DENV 1 (tiacutetulo
6 x 107 UFPmL) foram incubadas com 50 microL de uma soluccedilatildeo de meio DMEM preparada
com 20x a concentraccedilatildeo natildeo citotoacutexica de cada composto A1 a A8 em banho-maria 37deg C
por 1 hora Apoacutes a incubaccedilatildeo as aliacutequotas foram imediatamente tituladas em ceacutelulas BHK-21
em placas de 6 poccedilos utilizando-se 3 diluiccedilotildees para cada incubaccedilatildeo (20x 20 x 10-1
e 20 x 10-
2) Foram titulados tambeacutem uma aliacutequota incubada apenas com meio DMEM sem nenhum
tratamento e outra aliacutequota incubada com DMSO (Dimetilsulfoacutexido) Estas foram tituladas
utilizando um controle e mais cinco diluiccedilotildees (20x 20 x 10-1
20 x 10-2
20 x 10-3
e 20 x 10-4
)
49 Ensaio antiviral
Neste ensaio ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em placas de 24 poccedilos no dia
seguinte foram tratadas durante 4 horas com as concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas de cada
composto em duplicata Apoacutes o preacute-tratamento as monocamadas foram infectadas com
DENV-1 a uma MOI=5 na presenccedila das concentraccedilotildees de uso respectivas de cada composto
Apoacutes 1 hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus as monocamadas foram lavadas duas vezes com PBS e
foi adicionado 500 microL por poccedilo de meio preparado com as mesmas concentraccedilotildees dos
diferentes compostos e mantidos durante 48 horas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5 Em
quatro poccedilos as ceacutelulas foram infectadas e natildeo tratadas e em outros quatro poccedilos as ceacutelulas
natildeo foram tratadas e nem infectadas (controle de ceacutelulas) destes uacuteltimos dois foram
tripsinizados e contados no momento da infecccedilatildeo e os outros dois apoacutes o teacutermino do ensaio
24
para avaliar o crescimento celular Decorridas as 48 horas o sobrenadante foi coletado e
centrifugado por 10 minutos a 4000 xG para separaccedilatildeo dos debris celulares e prontamente
titulado em placa de 6 poccedilos
410 Anaacutelise estatiacutestica
Os valores de CC50 foram obtidos a partir de anaacutelise de regressatildeo linear das curvas de
concentraccedilatildeocitotoxicidade A anaacutelise estatiacutestica dos dados foi realizada pelo programa
GraphPad Prism software Uma anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi utilizada para determinar
as diferenccedilas estatiacutesticas seguida do poacutes teste de Tukey A significacircncia estatiacutestica foi fixada
em p lt005
25
V RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
26
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Ensaio de citotoxicidade celular
Para avaliar a viabilidade da linhagem celular BHK-21 frente ao tratamento com oito
diferentes concentraccedilotildees dos compostos (A1 a A8) realizou-se um ensaio de MTT (brometo
de 3-[45-dimetil-tiazol-2-il]-25-difeniltetrazoacutelio) Este ensaio tem o objetivo de quantificar
espectrofotometricamente o crescimento celular a viabilidade e proliferaccedilatildeo podendo ser
utilizado como um indicador direto de citotoxicidade Trata-se de um ensaio colorimeacutetrico
para medir a atividade da redutase mitocondrial em ceacutelulas vivas Ele se baseia na reduccedilatildeo do
sal amarelo tetrazoacutelio (permeaacutevel agrave membrana celular) para cristais de formazan azuis
puacuterpura por ceacutelulas metabolicamente ativas a quantidade de formazan gerada medida por
espectrofotometria eacute proporcional ao nuacutemero de ceacutelulas viaacuteveis
A CC50 foi calculada plotando-se uma curva de porcentagem de viabilidade celular por
concentraccedilatildeo melhor representada na figura 7 pelo composto A7 e os resultados de CC50
para todos os compostos estatildeo representados na tabela 2 Foram feitos ensaios de
citotoxicidade com oito concentraccedilotildees diferentes sendo escolhida a maior concentraccedilatildeo que
natildeo apresentou citotoxicidade
Viabilidade Celular = [ ( A ndash B ) A ] x 100
Onde
A = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas natildeo tratadas
B = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas tratadas com
as respectivas concentraccedilotildees de cada composto
27
28
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (A curva dose resposta do composto A7 eacute a que
melhor representa a curva dose resposta esperada) Avaliou-se a viabilidade da linhagem
celular BHK-21 frente agrave diferentes concentraccedilotildees dos compostos realizando o ensaio de MTT
e determinando assim as concentraccedilotildees a serem utilizadas nos proacuteximos ensaios bem como
calculando a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) agrave partir da curva
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo
da concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50)
Composto Concentraccedilatildeo utilizada
[ ] microgmL
Concentraccedilatildeo citotoacutexica 50
(CC50) [ ] microgmL plusmn Desvio
Padratildeo
A1 ([ ]=1 mgmL) 00200 10010 plusmn 0014
A2 ([ ]=1 mgmL) 00025 09561 plusmn 0023
A3 ([ ]=1 mgmL) 00025 09988 plusmn 0017
A4 ([ ]=5 mgmL) 00125 10150 plusmn 0036
A5 ([ ]=10 mgmL) 00250 10590 plusmn 0047
A6 ([ ]=5 mgmL) 00250 08183 plusmn 0030
A7 ([ ]=5 mgmL) 00125 10280 plusmn 0052
A8 ([ ]=5 mgmL) 00125 09758 plusmn 0036
52 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan
Para corroborar o ensaio anterior de citotoxicidade utilizou -se o teste de viabilidade
celular pela teacutecnica da exclusatildeo do azul de tripan com a finalidade de determinar a
viabilidade das ceacutelulas Os procedimentos adotados no ensaio seguiram o manual do
equipamento contador automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL Automated Cell Counter) entatildeo
foi acrescentado agrave 10 microL da suspensatildeo celular 10 microL de azul de tripan (04) Apoacutes
homogeneizaccedilatildeo 10 microL da suspensatildeo foi colocada no local indicado da lacircmina proacutepria para
leitura e foi realizada a contagem sendo consideradas mortas (inviaacuteveis) as ceacutelulas que
incorporavam o corante e viaacuteveis as que excluiacuteam o azul de tripan
29
O equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
(A)
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan A avaliaccedilatildeo da
viabilidade celular foi realizada atraveacutes de um contador automaacutetico de ceacutelulas Este
equipamento possibilita explorar ferramentas de fotografia e avaliar alguns paracircmetros
importantes (A) fotografia das ceacutelulas (B) Zoom na fotografia das ceacutelulas com marcaccedilotildees
(em verde para ceacutelulas vivas e vermelho para mortas) e (D) contagem das ceacutelulas totais
ceacutelulas vivas e mortas graacutefico e meacutedia dos diacircmetros celulares das ceacutelulas vivas e mortas
(B)
(C)
30
O crescimento celular de ceacutelulas natildeo tratadas foi avaliado nos tempos de 0h (momento
da confecccedilatildeo da placa) 24h (momento de tratamento com os compostos) e 96 horas
(Momento em que todas as ceacutelulas foram tripsinizadas e contadas) para avaliar o perfil do
crescimento celular em ceacutelulas natildeo tratadas Foi observado um crescimento celular no periacuteodo
de 24 horas onde as ceacutelulas estavam incubadas com meio acrescido de 10 SFB Em 24
horas o meio foi trocado por 1 SFB e acrescido das substacircncias testes nas menores diluiccedilotildees
natildeo citotoacutexicas determinadas pelo ensaio do MTT Em 96 horas pode ser observado um
decaimento no nuacutemero de ceacutelulas vivas provavelmente devido ao crescimento celular (morte
por confluecircncia)
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas)
(A) (B)
31
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas (A)
Contagem de ceacutelulas vivas (B) Percentual de ceacutelulas viaacuteveis (Viabilidade celular ) e (C)
Meacutedia do diacircmetro apresentado pelas ceacutelulas vivas
Em 96 horas as ceacutelulas natildeo tratadas bem como as ceacutelulas tratadas por 72 horas com as
concentraccedilotildees de uso dos compostos foram tripsinizadas e avaliadas quanto ao nuacutemero de
ceacutelulas vivas viabilidade e diacircmetro celular apresentados na figura 10
Segundo se observa natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo aparente que possa demonstrar que
as concentraccedilotildees de uso dos compostos tenham causado alguma atividade citotoacutexica
corroborando assim os ensaios de citotoxicidade anteriores
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
A infectividade de um viacuterus depende de vaacuterios fatores entre eles da proporccedilatildeo de
partiacuteculas virais completas ou infecciosas da suscetibilidade da ceacutelula hospedeira e da
chance desta partiacutecula encontrar o receptor e penetrar na ceacutelula Quando ceacutelulas suscetiacuteveis
satildeo misturadas com uma suspensatildeo de viacuterus estas podem receber uma duas trecircs ou dez
partiacuteculas virais ou nenhuma Isto depende da proporccedilatildeo entre a quantidade de viacuterus
infecciosos presente no inoculo e a quantidade de ceacutelulas utilizada Esta relaccedilatildeo eacute denominada
de multiplicidade de infecccedilatildeo ou MOI Uma MOI=1 indica que a infecccedilatildeo foi feita em
principio com 1 viacuterus ou 1 dose infectante por ceacutelula
A determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo dos Dengue virus 1 e 2 a serem
utilizadas nos proacuteximos ensaios foi feita a partir da infecccedilatildeo de ceacutelulas BHK-21 por diferentes
(C)
32
concentraccedilotildees de viacuterus e revelaccedilatildeo com cristal violeta Escolheu-se a maior diluiccedilatildeo viral que
possibilitou a letalidade total das ceacutelulas (faixa onde todas as ceacutelulas estatildeo mortas utilizando
menor concentraccedilatildeo de viacuterus) As faixas escolhidas foram entatildeo calculadas levando-se em
consideraccedilatildeo o nuacutemero de ceacutelulas presentes no poccedilo e o nuacutemero de partiacuteculas virais que foram
adicionadas (Faixa3 para DENV2 e 2 para DENV1) Figura 11 Foi estipulado portanto a
Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 2 para DENV 2 e 5 para DENV 1
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI A partir da infecccedilatildeo da linhagem celular BHK-21 em
placa de 96 poccedilos com diferentes diluiccedilotildees de DENV foi determinado que a Multiplicidade
de infecccedilatildeo para o Dengue viacuterus sorotipos 1 e 2 seria de 5 e 2 respectivamente (colunas 2 -
DENV1 e 3 - DENV2)
54 Ensaio dose resposta
Apoacutes a determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas ideais realizou-se um
ensaio dose resposta tratando as ceacutelulas com oito concentraccedilotildees agrave partir das concentraccedilotildees natildeo
citotoacutexicas escolhidas para cada composto e em seguida infectando com DENV sorotipos 1 e
2 nas MOIs estipuladas anteriormente (5 e 2 respectivamente) A porcentagem do efeito
protetor conferida agraves ceacutelulas para cada concentraccedilatildeo de amostra testada foi calculada da
seguinte forma
33
EP = [ (A ndash B) (C ndash B) ] x 100
Onde
A Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas tratadas e infectadas
B Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e infectadas
C Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e natildeo infectadas
Este ensaio tem por objetivo identificar a resposta celular agrave infecccedilatildeo frente ao
tratamento com os compostos em diferentes concentraccedilotildees Assim como o ensaio de
toxicidade este ensaio feito utilizando a teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT permite o teste de vaacuterias
concentraccedilotildees diferentes em um menor tempo e com baixo gasto de material
34
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV1
(MOI=5)
35
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV2
(MOI=2)
36
Takegami et al (1998) demonstraram atividade de furanonaftoquinonas contra o viacuterus
da Encefalite Japonesa (Flavivirus) utilizando a concentraccedilatildeo de 3microgmL poreacutem para os
compostos apresentados avaliados pela teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT nenhuma das
concentraccedilotildees apresentadas produziu efeito antiviral significativo em relaccedilatildeo ao controle
celular como observado nas figuras 12 e 13
Apesar da teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT ser interessante como triagem de atividade
antiviral permitindo o teste de vaacuterias concentraccedilotildees dos compostos em menor tempo e
utilizando uma quantidade razoaacutevel de materiais optou-se por utilizar as maiores
concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas encontradas avaliando sua atividade antiviral por outras
teacutecnicas Como natildeo foi avaliada atividade antiviral preacutevia para nenhum dos compostos frente
agrave infecccedilatildeo por DENV1 e 2 foi selecionado o Dengue virus 1 para dar prosseguimento aos
ensaios
55 Ensaio Virucida
O ensaio virucida foi realizado para avaliar um potencial efeito dos compostos
diretamente sobre a partiacutecula viral Este ensaio eacute importante pois possibilita elucidar se o
composto pode produzir algum efeito sobre a partiacutecula viral impedindo que esta possa infectar
as ceacutelulas
Figura 14 Ensaio virucida Neste ensaio as aliacutequotas de DENV1 foram incubadas com as
concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos e titulados (NT) Controle natildeo tratado
37
Tabela 3 Ensaio virucida Caacutelculo do tiacutetulo viral (UFPmL) e porcentagem representante de
cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 254 x 105 100
DMSO 263 x 105 10335
A1 199 x 105 7835
A2 205 x 105 8071
A3 237 x 105 9311
A4 775 x 104 3049
A5 153 x 105 6024
A6 219 x 105 8602
A7 243 x 105 9547
A8 254 x 105 100
Lagrota et al (1988) demonstraram atividade de 2-HO-3-N-benzil-N(N-benzil-2-
etilamina) -14-naftoquinona sobre a partiacutecula viral de enterovirus De forma contraacuteria apesar
de se verificar a reduccedilatildeo de quase uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais
para o composto A4 natildeo considerou-se esta uma alteraccedilatildeo significativa pois devido agrave
magnitude do nuacutemero de UFPs se trata de uma alteraccedilatildeo muito pequena Portanto os
compostos avaliados neste trabalho natildeo produziram atividade virucida aparente frente ao
tratamento com as concentraccedilotildees de uso
56 Ensaio Antiviral
O sobrenadante de ceacutelulas tratadas previamente e infectadas por DENV1 coletado 48
horas poacutes infecccedilatildeo foi avaliado quanto agrave produccedilatildeo viral de partiacuteculas infecciosas pela
contagem de placas de lise e caacutelculo de Unidades Formadoras de Placa (Titulaccedilatildeo viral em
placa ndash UFPmL)
38
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral Sobrenadante de ceacutelulas tratadas e infectadas por DENV1
coletado apoacutes 48 horas e titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado
Tabela 4 Ensaio Antiviral Coleta do sobrenadante de ceacutelulas infectadas por DENV1 Tiacutetulo
viral (UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o
controle natildeo tratado como 100
Ao perceber um aumento no tiacutetulo viral frente ao tratamento com os compostos A1
A2 e A3 e uma reduccedilatildeo frente ao tratamento com A4 A5 e A6 foram escolhidos dois
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 119 x 105 10000
A1 235 x 105 19748
A2 228 x 105 19160
A3 318 x 105 26723
A4 128 x 104 1076
A5 186 x 103 156
A6 190 x 104 1597
A7 280 x 104 2353
A8 350 x 104 2941
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
40
Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
IX
ABSTRACT
The Dengue virus (DENV) has four different serotypes (1-4) that are primarily transmitted by
the mosquito Aedes aegypti Infection results in the pathogenesis of dengue which is an
epidemic of global proportions Despite these efforts there is still no effective vaccine against
the four serotypes as well as efficient drugs in the treatment of patients Therefore various
studies have been conducted in the search for drugs with antiviral activity against DENV and
other flaviviruses Among the studied compounds for this purpose are the naphthoquinones
secondary metabolites produced by algae fungi plants and animals These compounds can be
mainly extracted from plants of the genus Tabebuia (Bignoniaceae) are characterized by
having antiviral activity especially the szlig-lapachone potent inhibitor of the enzyme reverse
transcriptase of avian myeloblastosis virus (AMV) and murine leukemia Rauscher (RLV)
The aim of this study was to test eight different compounds derived from synthetic and
natural naphthoquinones with potential antiviral activity against DENV For this a screening
was performed by reduction of MTT (3- (45-dimethylthiazol-2-yl) -25-diphenyl bromide
tetrazolina) to assess the cytotoxic activity of the compounds eight BHK-21 cell line resulting
in the calculation of the cytotoxic concentration 50 (CC50) and non-cytotoxic
concentrations to be used in subsequent tests for compounds A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 and
A8 (lapachol β-lapachone 2-hydroxy -3- (β β-dimethylvinyl) -14-naphthoquinone 2-
chloro-14-naphthoquinone and derivatives lapachol 4) Then BHK-21 cells were incubated
with compounds at non-cytotoxic concentrations in different dilutions and infected with
serotypes 1 and 2 DENV at multiplicity of infection (MOI) of 5 and 2 for serotypes 1 and 2
respectively The antiviral activity was assayed by MTT reduction assay and the virus titer
released into the supernatant Although some compounds have shown reduced to one log unit
in the number of viral particles results indicate that these drugs did not show antiviral activity
in experimental conditions
X
SUMAacuteRIO
RESUMO VIII
ABSTRACT IX
LISTA DE FIGURAS XII
LISTA DE TABELAS XIII
1 INTRODUCcedilAtildeO 2
11 Flavivirus 2
12 Dengue virus 3
13 Epidemiologia 6
14 Naftoquinonas 8
3 OBJETIVOS 16
31 Objetivo Geral 16
32 Objetivos especiacuteficos 16
4 MATERIAL E MEacuteTODOS 18
41 Linhagens celulares 18
411 Ceacutelulas C636 18
412 Ceacutelulas BHK-21 18
42 Viacuterus 18
421 DENV 1 e DENV 2 18
422 Titulaccedilatildeo viral 19
43 Compostos de naftoquinonas 19
44 Ensaio de citotoxicidade 20
45 Avaliaccedilatildeo da viabilidade e crescimento celular por exclusatildeo de azul de tripan 21
46 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) 21
47 Ensaio Dose-resposta 22
48 Ensaio Virucida 23
49 Ensaio antiviral 23
410 Anaacutelise estatiacutestica 24
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO 26
51 Ensaio de citotoxicidade celular 26
52 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan 28
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) 31
54 Ensaio dose resposta 32
XI
55 Ensaio Virucida 36
56 Ensaio Antiviral 37
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao tratamento com
os compostos A1 A3 A4 e A5 40
6 CONCLUSAtildeO 44
7 PERSPECTIVAS 46
8 REFEREcircNCIAS 48
XII
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Estrutura da partiacutecula viral de Dengue viacuterus 4
Figura 2 Ciclo de multiplicaccedilatildeo de DENV 5
Figura 3 Distribuiccedilatildeo geograacutefica da Dengue 7
Figura 4 Estrutura quiacutemica da 12-naftoquinona (1) e 14-naftoquinona (2) 9
Figura 5 Estrutura quiacutemica do Lapachol (1) da α- Lapachona (2) e da β-Lapachona 10
Figura 6 Tabebuia avellanedae 11
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (Exemplo da curva dose resposta do composto A7) 28
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan 29
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas) 30
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas 31
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI 32
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 34
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 35
Figura 14 Ensaio virucida 36
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral 38
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados 39
Figura 17 Curva de crescimento celular 41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular 41
XIII
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Relaccedilatildeo de nome estrutura e coacutedigo dos compostos utilizados 20
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo da
concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) 28
Tabela 3 Ensaio virucida 37
Tabela 4 Ensaio Antiviral 38
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados 39
XIV
LISTA DE ABREVIATURAS
AMV ndash Mielobastose Aviaacuteria viacuterus (Avian Myeloblastosis virus )
CC50 ndash Concentraccedilatildeo Citotoacutexica 50
DENV ndash Dengue virus
DMEM ndash Meio baacutesico modificado por Dulbecco (Dulbeccos Modified Eagle Medium)
DMSO ndash Dimetilsulfoacutexido
ICTV ndash Comitecirc Inernacional de Taxonomia Viral
JEV ndash Viacuterus da Encefalite Japonesa (Japanese Encephalitis virus)
MOI ndash Multiplicidade de infecccedilatildeo viral
NS ndash Proteiacutenas natildeo estruturais
NT ndash Natildeo Tratado
OMS ndash Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede
RE ndash Retiacuteculo endoplasmaacutetico
RLV ndash Viacuterus da Leucemia Murina de Rauscher (Murine leukemia virus)
SFB ndash Soro Fetal Bovino
UFP ndash Unidades formadoras de placas
WNV ndash Viacuterus do Nilo Ocidental (West Nile virus)
YFV ndash Viacuterus da febre amarela (Yellow fever virus)
ZV ndash Zika virus
1
I INTRODUCcedilAtildeO
2
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Flavivirus
O Gecircnero Flavivirus pertencente agrave famiacutelia Flaviviridae inclui 53 espeacutecies
taxonomicamente reconhecidas (ICTV 2016) muitas das quais satildeo importantes patoacutegenos
humanos tais como o Dengue virus (DENV) Yellow fever virus (YFV - viacuterus da febre
amarela ndash protoacutetipo deste gecircnero) Japanese encephalitis virus (JEV - viacuterus da encefalite
japonesa) West Nile virus (WNV - virus do Nilo Ocidental) Zika virus (ZV) entre outros
(Villordo 2016) O nome flavivirus eacute derivado da palavra latina flavus que significa amarelo
significando a icteriacutecia causada pelo YFV Os sintomas da infecccedilatildeo por flavivirus pode variar
de leve febre e mal-estar a encefalite fatal e febre hemorraacutegica (Mukhopadhyay 2005)
Estes viacuterus regulam o metabolismo e a sobrevivecircncia das ceacutelulas infectadas
assegurando a sua proacutepria reproduccedilatildeo e propagaccedilatildeo O viacuterus da dengue tambeacutem provoca a
autofagia uma resposta homeostaacutetica geral que ajuda a ceacutelula infectada sobreviver e produzir
viacuterus (Datan 2016)
Os Flavivirus podem ser agrupados em complexos e sub-complexos antigecircnicos
baseados em criteacuterios soroloacutegicos ou em grupos clados e espeacutecies segundo a sua filogenia
molecular (Lindenbach 2007) A maioria dos membros deste gecircnero satildeo arbovirus (arthropod
borne virus) ou seja satildeo essencialmente transmitidos por Artroacutepodes (Mackenzie 2004)
onde 27 satildeo transmitidos por mosquitos 12 por carrapatos e 14 natildeo possuem vetor
conhecido Os viacuterus transmitidos pela fecircmea do gecircnero Aedes incluem DENV e YFV satildeo
viscerotroacutepicos e possuem primatas como reservatoacuterio natural (Gaunt 2001)
A patogenia da Dengue causada pelo DENV constitui uma das doenccedilas virais mais
importantes em seres humanos transmitidos por insetos e eacute responsaacutevel por cerca de 390
milhotildees de infecccedilotildees por ano O YFV por sua vez causador da febre amarela eacute endecircmico em
vaacuterios paiacuteses do continente Africano e da Ameacuterica do Sul resultando em 200000 casos e
30000 mortes na Aacutefrica mesmo com vacinas eficazes disponiacuteveis Outras doenccedilas causadas
por flaviviacuterus incluem a encefalite do Nilo Ocidental (West Nile virus) e febre Zika (Zika
virus) que satildeo consideradas doenccedilas emergentes com surtos importantes em todo o mundo
(Villordo 2016)
3
12 Dengue virus
Os DENV pertencem ao gecircnero flaviviacuterus e evoluiram em primatas natildeo-humanos a
partir de um ancestral comum Eacute composto por quatro sorotipos antigenicamente distintos
(DENV1-4) que co-circulam por todo o Sudeste da Aacutesia Aacutefrica e Ameacutericas (McArthur 2013)
e em outubro de 2013 foi anunciado um novo sorotipo circulante denominado entatildeo de DENV
5 (Normile 2013) A partiacutecula infecciosa eacute esfeacuterica com 40-50 nm de diacircmetro possuindo
um envelope de lipopolissacariacutedeo O genoma consiste em RNA de fita simples natildeo
segmentado e senso positivo de aproximadamente 11 kb de comprimento e possui uma uacutenica
janela aberta de leitura (start codon) (Guzman 2010) Apoacutes a traduccedilatildeo a uacutenica poliproteiacutena
formada eacute clivada por proteases virais e celulares em trecircs proteiacutenas estruturais que compotildeem
a partiacutecula viral C (capsideo) prM M (membrana e o seu precursor) e E (envelope) e sete
proteiacutenas natildeo estruturais essenciais para a replicaccedilatildeo viral (NS) (NS1 NS2a NS2b NS3
NS4a NS4b e NS5) (Robertson 2009)
A transmissatildeo do viacuterus ocorre atraveacutes da picada por fecircmeas infectadas de mosquitos
do gecircnero Aedes sendo responsaacutevel pelas maiores taxas de doenccedila e mortalidade entre os
membros do gecircnero Flavivirus (Mukhopadhyay 2005) No Brasil o Aedes aegypti eacute o
principal vetor de dengue enquanto o Aedes albopictus atua como um vector secundaacuterio
(Weaver 2010)
O diagnoacutestico soroloacutegico da Dengue se baseia na detecccedilatildeo de niacuteveis elevados de
anticorpos anti-Dengue-IgM ou anti-Dengue-IgG que reconhecem e se ligam ao antiacutegeno de
DENV A Glicoproteiacutena do envelope (E) uma proteiacutena estrutural de DENV eacute o alvo
antigecircnico mais importante destes anticorpos neutralizantes porque estaacute exposta na superfiacutecie
do viacuterus e medeia os receptores de ligaccedilatildeo e fusatildeo da ceacutelula hospedeira (Lee 2015)
Durante a infecccedilatildeo celular os virions de DENV se ligam agrave superfiacutecie da membrana
atraveacutes da glicoproteiacutena do envelope (E) a receptores especiacuteficos e satildeo internalizados por
endocitose Uma vez dentro do endossoma a acidificaccedilatildeo provocada pela ligaccedilatildeo de
lisossomos desencadeia uma trimerizaccedilatildeo irreversiacutevel da proteiacutena E que atua na fusatildeo das
membranas virais e endossomais celulares Apoacutes essa fusatildeo o nucleocapsideo eacute liberado no
citoplasma onde o mesmo eacute desnudado e a replicaccedilatildeo do genoma de RNA e montagem de
partiacuteculas eacute iniciada As partiacuteculas virais imaturas satildeo acumuladas no luacutemen do retiacuteculo
endoplasmaacutetico (RE) Essas partiacuteculas imaturas que contecircm proteiacutenas prM proteiacutena E
membrana lipiacutedica e nuacutecleo capsiacutedeo natildeo pode induzir a fusatildeo da ceacutelula hospedeira ou seja
4
neste estaacutegio elas natildeo satildeo infecciosas (Mukhopadhyay 2005) O processo de maturaccedilatildeo
desses viacuterus ocorre apoacutes a clivagem proteoliacutetica da proteiacutena precursora de membrana (prM)
transformando viacuterus inerte em partiacuteculas infecciosas (Li 2008) Partiacuteculas subvirais satildeo
tambeacutem produzidas no RE mas apenas contecircm as glicoproteiacutenas de membrana fazendo com
que estas partiacuteculas sejam natildeo infecciosas Os viacuterus maduros e as partiacuteculas sub-virais satildeo
liberados da ceacutelula hospedeira por exocitose (Mukhopadhyay 2005)
Na pele o DENV tende a infectar ceacutelulas dendriacuteticas imaturas Estas ceacutelulas infectadas
amadurecem e migram para os gacircnglios linfaacuteticos regionais ou locais onde apresentam
antiacutegenos virais agraves ceacutelulas T iniciando as respostas imunes Existe tambeacutem evidecircncia de
replicaccedilatildeo abundante de DENV em ceacutelulas do parecircnquima do fiacutegado e em macroacutefagos nos
gacircnglios linfaacuteticos fiacutegado e baccedilo bem como em monoacutecitos de sangue perifeacuterico (Guzman
2010)
Proteiacutena E
(diacutemero)
Proteiacutena
M
Proteiacutena C
ssRNA (+)
Figura 1 Estrutura da partiacutecula viral de Dengue viacuterus A partiacutecula viral eacute composta
por trecircs proteiacutenas estruturais proteiacutena de envelope (E) disposta em diacutemeros a proteiacutena
associada agrave membrana (M) e a proteiacutena do nucleocapsiacutedeo (C) O genoma de RNA fita-
simples de polaridade positiva se encontra dentro do nucleocapsiacutedeo (Adaptado de
httpviralzoneexpasyorgviralzoneall_by_species24html)
5
Figura 2 Ciclo de multiplicaccedilatildeo de DENV A Os viacuterus se ligam aos receptores na superfiacutecie da
ceacutelula e satildeo endocitados B Devido ao baixo pH dentro dos endossomas ocorre a fusatildeo de
membranas viral-celular mediada por proteiacutenas virais resultando na liberaccedilatildeo do RNA viral em um
processo chamado de desnudamento C O genoma viral eacute traduzido em uma uacutenica poliproteiacutena que
eacute processada por proteases do viacuterus e da ceacutelula hospedeira D O RNA eacute replicado por proteiacutenas
natildeo-estruturais do proacuteprio viacuterus E A montagem do viacuterus ocorre na membrana do Reticulo
endoplasmaacutetico no qual a proteiacutena do capsiacutedeo e o RNA viral satildeo envolvidos por glicoproteiacutenas e
pela membrana da organela para formar partiacuteculas virais imaturas F Partiacuteculas virais imaturas
utilizam a via secretora da ceacutelula hospedeira e sob o baixo pH do Complexo de Golgi a proteiacutena
precursora prM eacute clivada em proteiacutena M completando a maturaccedilatildeo do viacuterus GOs viacuterus maduros
satildeo entatildeo liberados das ceacutelulas por exocitose Os nuacutemeros indicados nas caixas coloridas referem-se
ao valor de pH dos respectivos compartimentos Imagem adaptada de PERERA 2009
Adsorccedilatildeo
Siacutentese e processamento
Fusatildeo e
Desnudamento
Replicaccedilatildeo do RNA
Montagem
Maturaccedilatildeo
Liberaccedilatildeo de
viacuterus
maduro
A
B
C
D
E
F
G
6
13 Epidemiologia
Ao longo das uacuteltimas deacutecadas a dengue se tornou a doenccedila viral transmitida por
mosquitos mais prevalente no mundo Estimativas de infecccedilatildeo pela OMS indicam que a
patologia eacute endecircmica em mais de 100 paiacuteses em todos os continentes exceto a Antaacutertida e
aflige principalmente paiacuteses pobres em recursos nas regiotildees tropicais e subtropicais (Perry
2011) Epidemias globais de DENV ocorreram ao longo das uacuteltimas deacutecadas em parte devido
agrave diminuiccedilatildeo dos esforccedilos no controle de mosquitos Satildeo estimados mais de 50 milhotildees de
casos de dengue anualmente (Mukhopadhyay 2005)
A Dengue eacute uma doenccedila viral sistecircmica aguda que se estabeleceu em todo o mundo
em ambos os ciclos de transmissatildeo endecircmicas e epidecircmicas A infecccedilatildeo pelo DENV em seres
humanos eacute frequentemente inaparente mas pode levar a uma grande variedade de
manifestaccedilotildees cliacutenicas de febre leve a siacutendrome do choque da dengue potencialmente fatal A
imunidade vitaliacutecia desenvolvida apoacutes a infecccedilatildeo com um dos quatro tipos de viacuterus eacute
especiacutefica para cada tipo e a progressatildeo para uma doenccedila mais grave eacute frequente mas natildeo
exclusivamente relacionada com infecccedilatildeo secundaacuteria por tipos heteroacutelogos No entanto
enquanto a expansatildeo histoacuterica desta doenccedila eacute bem documentada o elevado fardo de
problemas de sauacutede atribuiacuteveis agrave dengue em grande parte do mundo tropical e sub-tropical
permanecem pouco enumerados (Bhatt 2013)
O Brasil eacute um paiacutes de grande extensatildeo (8512000 km2) situado em uma zona
predominantemente tropical com extensas aacutereas de florestas na regiatildeo amazocircnica bem como
restos de uma floresta tropical na costa leste sudeste e sul entre outros ecossistemas A maior
parte do paiacutes tem um clima tropical e uma grande diversidade de plantas e animais portanto
um local adequado para a ocorrecircncia de patologias causadas por viacuterus transmitidos por
artroacutepodes (Figueiredo 2000) Segundo o boletim epidemioloacutegico do ministeacuterio da sauacutede em
2016 jaacute foram registrados 170103 casos provaacuteveis de dengue no paiacutes ateacute a semana
epidemioloacutegica 5 Nesse periacuteodo a regiatildeo Sudeste registrou o maior nuacutemero de casos
provaacuteveis (96664 casos 568) Em Minas Gerais jaacute foram registradas 19 mortes em
decorrecircncia da Dengue entre 1deg de janeiro e 14 de marccedilo deste ano Outros 91 oacutebitos estatildeo
sob investigaccedilatildeo (BRASIL 2016)
7
Figura 3 Distribuiccedilatildeo geograacutefica da Dengue Aacutereas de risco de transmissatildeo em amarelo
(Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede Adaptado de httpwwwwhointen)
As manifestaccedilotildees da doenccedila foram descritas pela primeira vez apoacutes a Segunda Guerra
Mundial coincidente com o aumento da urbanizaccedilatildeo particularmente na Aacutesia (Weaver 2010)
Atualmente o DENV eacute hiperendecircmico em muitas regiotildees tropicais onde 2 ou mais sorotipos
circulam endemicamente Embora DENV foi provavelmente introduzido periodicamente para
as Ameacutericas atraveacutes de navios desde o seacuteculo 17 o surgimento de DENV no Hemisfeacuterio
Ocidental comeccedilou mais tarde devido a uma campanha de sucesso parcial para erradicar o
vetor A aegypti para controlar a febre amarela Esta campanha teve sucesso na maior parte
das Ameacutericas da deacutecada de 1950 agrave deacutecada de 1970 mas foi interrompida O vetor entatildeo
rapidamente recolonizou quase toda a regiatildeo neotropical e subtropicais e a invasatildeo do DENV
seguiu logo depois Em 1985 A albopictus foi introduzido nos EUA e no Brasil
proporcionando um vetor para a transmissatildeo secundaacuteria de DENV nas Ameacutericas (Hawley
1987)
Os mosquitos vetores principalmente A aegypti tornam-se infectados quando eles se
alimentam do sangue de seres humanos durante o periacuteodo de cinco dias da viremia A
infecccedilatildeo produz um amplo espectro da doenccedila cliacutenica e varia de assintomaacutetica a doenccedila febril
auto-limitante A dengue tambeacutem conhecida como ldquofebre osso quebradordquo devido agraves fortes
dores nas articulaccedilotildees e inclui sintomas de febre alta dores musculares articulares e erupccedilatildeo
cutacircnea Uma pequena porcentagem de indiviacuteduos pode apresentar a siacutendrome do choque da
8
dengue (dengue hemorraacutegica) com risco de vida grave O tratamento eacute amplamente favoraacutevel
usando de reidrataccedilatildeo oral ou intravenosa acompanhamento e atenccedilatildeo meacutedica adequada No
entanto uma das principais consequecircncias da doenccedila eacute a sua capacidade de sobrecarregar
instalaccedilotildees meacutedicas durante um surto e em paiacuteses onde os recursos de sauacutede jaacute estatildeo no
limite isso pode ter efeitos catastroacuteficos Prevenccedilatildeo e tratamento portanto se fazem
altamente necessaacuterios (Perry 2011)
A prevalecircncia global de DENV cresceu drasticamente nas uacuteltimas deacutecadas e ateacute o
momento natildeo haacute nenhum medicamento especiacutefico para combater a infecccedilatildeo as medidas de
prevenccedilatildeo mais eficazes satildeo voltadas para o controle do vetor (Silva 2011) Diante disso a
Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) elegeu o desenvolvimento de vacinas contra o viacuterus da
dengue como prioridade mundial (Kinney 2001) Por conseguinte a busca de substacircncias
naturais ou sinteacuteticas com atividade antiviral especiacutefica sem toxicidade para as ceacutelulas
normais em seres humanos eacute uma estrateacutegia desejada para evitar que a dengue se agrave e
ajudar a controlar a difusatildeo da doenccedila As vaacuterias fases do ciclo viral representam alvos
terapecircuticos individuais que podem ser exploradas (Costa 2013) Nesse sentido vaacuterios
grupos de pesquisa e organizaccedilotildees estatildeo trabalhando com diversas abordagens para o
desenvolvimento de compostos antivirais com atividade protetora contra dengue Dentre elas
uma vasta gama de produtos naturais incluindo plantas numa tentativa de isolar e
caracterizar novos compostos que podem inibir a replicaccedilatildeo do viacuterus ou tratar a infecccedilatildeo
viral Por essa razatildeo extratos e componentes da planta satildeo cada vez mais importantes como
fontes potenciais para agentes antivirais (Silva 2011)
14 Naftoquinonas
As quinonas satildeo compostos aromaacuteticos amplamente distribuiacutedos na natureza e podem
ser encontrados em vaacuterias famiacutelias de plantas bem como isolado de fungos algas e
bacteacuterias Elas satildeo classificadas em benzoquinonas antraquinonas e naftoquinonas de acordo
com as suas estruturas quiacutemicas Naftoquinonas satildeo compostos orgacircnicos altamente reativos
utilizados como corantes naturais ou sinteacuteticos cujas cores variam de amarelo para vermelho
Apresentam cadeia carbocircnica similar ao naftaleno e satildeo caracterizadas por seus dois grupos
carbonila na posiccedilatildeo 1 e 4 por isso satildeo nomeadas de 14-naftoquinonas Os grupos carbonila
tambeacutem podem estar presente na posiccedilatildeo 12 com menor incidecircncia (Loacutepez 2014)
9
Figura 4 Estrutura quiacutemica da 12-naftoquinona (1) e 14-naftoquinona (2)
Entre as quinonas estatildeo compostos biologicamente importantes tais como o grupo da
vitamina K e a coenzima Q (ubiquinona) Estes compostos tecircm um papel importante no
metabolismo celular especialmente como carreadores de eleacutetrons Aleacutem de quinonas que
possuam uma funccedilatildeo bioloacutegica outros compostos desta classe tecircm sido encontrados
mostrando atividade antibioacutetica Alguns deles estatildeo presentes na natureza mas a maior parte
satildeo obtidos sinteticamente entre eles 2-hidroxi-3-alquil-14-naftoquinonas que possuem
evidecircncias de serem ativos in vitro contra os parasitas da malaacuteria e como coccidiostaacuteticos
(Ambrogi 1970)
A atividade bioloacutegica de quinonas estaacute muitas vezes relacionada com o seu
comportamento eletroquiacutemico A capacidade de aceitar um ou dois eleacutetrons para formar o
acircnion radical correspondente ou dianion pode ser o motivo da induccedilatildeo da formaccedilatildeo de
espeacutecies reativas de oxigecircnio responsaacuteveis pelo estresse oxidativo nas ceacutelulas A capacidade
de aceitar eleacutetrons de naftoquinonas pode ser alterada por mudanccedilas de posiccedilatildeo do grupo
carbonila (12- 14-naftoquinonas) ou diferentes substituintes ou funccedilotildees associadas agrave porccedilatildeo
de naftoquinona (Francisco 2010)
As naftoquinonas satildeo largamente encontradas em plantas micro-organismos e alguns
animais Estes compostos tecircm sido amplamente utilizados em diversas culturas como corantes
para cosmeacuteticos tecidos alimentos (Brandelli 2004) e para fins medicinais incluindo
antitumoral (Oliveira 1990 Ferreira 1996) anti-inflamatoacuterios antimalaacuterico antiviral
(Fonseca 2003 Hussain 2007) atibacterianos e antifuacutengicos (Nagata 1998) Estas atividades
bioloacutegicas tecircm justificado o grande nuacutemero de trabalhos (aproximadamente 42 ateacute abril 2016
ndash Pubmed) encontrados na literatura que visa a siacutentese e avaliaccedilatildeo de qualquer das quinonas
naturais ou seus anaacutelogos como agentes farmacoloacutegicos potenciais (Rahmoun 2013)
10
O Lapachol foi descoberto e estudado desde o seacuteculo XIX Foi isolado primeiramente
do lenho da aacutervore argentina ldquolapachordquo Tabebuia avellanedae (Bignoniaceae) conhecida
como Ipecirc roxo Os estudos quiacutemicos foram desenvolvidos inicialmente em 1892 (Fonseca
2003) O lapachol foi descrito pela primeira vez por Paterno em 1821 tendo sua estrutura
quiacutemica estabelecida em 1896 por Hooker que o identificou como uma naftoquinona Esta
naftoquinona possui accedilatildeo antiinflamatoacuteria analgeacutesica antibioacutetica e anti-neoplaacutesica
reconhecida (Arauacutejo 2002)
A β-lapachona (34-di-hidro-22-dimetil-2H-naptho [12-b] pirano-56-diona) eacute uma
quinona obtida de fontes naturais derivada da aacutervore Lapacho (Tabebuia avellanedae) nativa
da Ameacuterica do Sul e Central A siacutentese e quiacutemica da β-lapachona e compostos relacionados
foi inicialmente investigado no final do seacuteculo XIX e iniacutecio do seacuteculo XX pelo quiacutemico
Samuel Hooker Apesar de alguns estudos cliacutenicos sobre a bioatividade de naftoquinonas
terem sido relatados no iniacutecio de 1940 foi o relatoacuterio do potencial da β-lapachona como um
agente anti-tripanossoma em 1977 que revitalizou o estudo e caracterizaccedilatildeo deste composto
natural A β-lapachona tambeacutem apresenta vaacuterias accedilotildees farmacoloacutegicas incluindo accedilatildeo
formaccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (Hussain 2007)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do Lapachol (1) da α- Lapachona (2) e da β-
Lapachona (Fonseca et al 2003 Ferreira et al 2010)
11
Figura 6 Tabebuia avellanedae (Hussain 2007)
A β-lapachona eacute uma substacircncia natural facilmente obtida a partir do lapachol Esta
naftoquinona eacute o grande destaque desta classe de substacircncias porque se encontra em testes
cliacutenicos de fase II para o tratamento do cacircncer de pacircncreas (Ferreira 2010) O mecanismo de
accedilatildeo da β-lapachona diferencia-se de outros antineoplaacutesicos por atuar na topoisomerase I
promovendo a recuperaccedilatildeo da capacidade de apoptose celular Alguns estudos reportam sua
accedilatildeo sineacutergica de potenciaccedilatildeo com o Taxolreg
promovendo a inibiccedilatildeo em diferentes pontos de
replicaccedilatildeo celular aleacutem de sua combinaccedilatildeo com outros tratamentos como a aplicaccedilatildeo de
radiaccedilatildeo ionizante (Cunha 2005)
Vaacuterios estudos jaacute foram publicados demonstrando a atividade antiviral de
naftoquinonas naturais e sinteacuteticas A β-lapachona inibe seletivamente a replicaccedilatildeo do viacuterus
HIV-1 atuando na inibiccedilatildeo da enzima LTR117 Da mesma forma este composto eacute um
potente inibidor da enzima transcriptase reversa dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e
leucemia murina de Rauscher (RLV) inibindo tambeacutem a DNA polimerase A accedilatildeo inibitoacuteria
sobre estas enzimas revelou-se especiacutefica se comparada com a de outros inibidores
conhecidos (Silva 2003)
O Lapachol jaacute demonstrou atividade contra certas cepas virais incluindo Herpes virus
tipos I e II Outras naftoquinonas jaacute mostraram eficaacutecia contra cepas de Influenza virus
Poliomielite virus e estomatite vesicular Supotildee-se que o mecanismo de accedilatildeo destas quinonas
seja atraveacutes da inibiccedilatildeo da transcriptase reversa de retroviacuterus e da RNA polimerase Eacute relatado
12
que lapachol diminui a replicaccedilatildeo do viacuterus em seres humanos mas ainda natildeo existem
resultados de testes cliacutenicos disponiacuteveis (Hussain 2007)
Na avaliaccedilatildeo da atividade antiviral do Lapachol in vitro verificou-se que esta
substacircncia eacute ativa contra viacuterus RNA atuando tanto sobre viacuterus envelopados quanto sobre
partiacuteculas sem esta estrutura em concentraccedilotildees de 5 a 10 microgmL e ainda apresentou uma
pequena atividade sobre HSV (Herpes simplex I) e Ad5 (Adeno tipo 5) mas nenhuma
atividade sobre CoxB4 (Coxsackie B4) Em trabalho posterior demonstrou-se que nem o
Lapachol nem diversos dos seus derivados apresentaram atividade antiviral in vitro sobre
Poliovirus tipo 1 Ecovirus 19 e Coxsackie B tipo 4 Apenas os derivados 12-naftoquinonicos
e um intermediaacuterio da siacutentese Hoocker foram ativos contra o Echovirus 19 (Fonseca 2003)
Costa et al (2013) relataram que piranonaftoquinonas isocircmeras do lapachol possuem
atividade de inibiccedilatildeo da replicaccedilatildeo de DENV-2 atuando sobre a atividade da ATPase de NS3
(proteiacutena natildeo estrutural de DENV)
A utilizaccedilatildeo de testes in vitro por meio de ensaios de viabilidade celular constitui o
primeiro passo para a avaliaccedilatildeo da compatibilidade bioloacutegica de uma substacircncia e pode
fornecer elementos importantes para a anaacutelise da biocompatibilidade dos diferentes materiais
Para ser considerado natildeo citotoacutexico no teste de citotoxicidade in vitro um produto natildeo deve
ocasionar a morte das ceacutelulas nem afetar suas funccedilotildees celulares A prova do MTT eacute um dos
indicadores colorimeacutetricos de viabilidade celular mais utilizados sendo capaz de avaliar a
funccedilatildeo celular mitocondrial de acordo com a reduccedilatildeo enzimaacutetica do sal de tetrazoacutelio pelas
desidrogenases mitocondriais nas ceacutelulas viaacutevies (Arauacutejo et al 2008) Supotildee-se que o
mecanismo responsaacutevel pela citotoxicidade apresentada pelas quinonas esteja relacionado
com o estresse oxidativo causado por esses compostos poreacutem a capacidade de alquilaccedilatildeo de
nucleoacutefilos celulares tambeacutem representa correlaccedilatildeo com tais efeitos bioloacutegicos (Goulart
2004)
13
II JUSTIFICATIVA
14
2 JUSTIFICATIVA
Aleacutem do controle do mosquito transmissor e do desenvolvimento de vacinas que tem
sido exaustivamente estudado nos uacuteltimos anos uma alternativa para o combate agrave dengue
seria o desenvolvimento de faacutermacos para reduzir a viremia ou mesmo para controlar a
resposta imune do hospedeiro agrave infecccedilatildeo que tem sido apontada como principal fator de risco
nos casos mais graves Em funccedilatildeo disso o nuacutemero de pesquisas visando o desenvolvimento
de drogas com accedilatildeo antiviral ou com accedilatildeo imunomodulatoacuteria tem aumentado
significativamente As naftoquinonas vecircm ganhando bastante importacircncia na pesquisa de
novas drogas antivirais devido agrave algumas atividades apresentadas A szlig-lapachona-orto-
naftoquinona por exemplo se mostrou um potente inibidor da enzima transcriptase reversa
dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e leucemia murina de Rauscher (RLV)
Diante da inexistecircncia de drogas com accedilatildeo anti DENV e o elevado nuacutemero e casos da
patogenia nos uacuteltimos anos a organizaccedilatildeo mundial da sauacutede classificou a Dengue como uma
epidemia de proporccedilotildees globais e um problema de sauacutede puacuteblica Como as naftoquinonas jaacute
demonstraram na literatura possuir um potencial efeito terapecircutico contra alguns viacuterus eacute
possiacutevel que estes compostos possam apresentar atividade antiviral contra DENV Portanto
este trabalho visou atraveacutes de ensaios de MTT e titulaccedilotildees virais em placa avaliar a potencial
atividade antiviral de oito compostos derivados de naftoquinonas naturais e sinteacuteticas
15
III OBJETIVOS
16
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar oito compostos (2 naturais e 6 sinteacuteticos) derivados de naftoquinonas como potenciais
agentes antivirais em ceacutelulas BHK-21 frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1 e 2
32 Objetivos especiacuteficos
1 Calcular o iacutendice de citotoxicidade e a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) dos compostos
atraveacutes de ensaio de reduccedilatildeo de MTT
2 Avaliar os efeitos dos compostos sobre o crescimento a viabilidade e o volume celular
pela teacutecnica de exclusatildeo do azul de tripan
3 Determinar a multiplicidade de infecccedilatildeo de DENV 1 e 2 a ser utilizada nos ensaios
antivirais
4 Avaliar a atividade antiviral dos compostos frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1
e 2 atraveacutes do ensaio de MTT
5 Verificar um possiacutevel efeito direto dos compostos agraves partiacuteculas virais de Dengue virus
6 Quantificar a produccedilatildeo de partiacuteculas virais infecciosas no sobrenadante de ceacutelulas
infectadas atraveacutes de titulaccedilatildeo viral pela contagem de unidades formadoras de placas
17
IV MATERIAL E MEacuteTODOS
18
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Linhagens celulares
411 Ceacutelulas C636
As ceacutelulas C636 satildeo ceacutelulas de linhagem contiacutenua de larvas de mosquito Aedes
albopictus Estas ceacutelulas foram utilizadas na produccedilatildeo de estoque viral de DENV sorotipos 1
e 2 para isso foram mantidas em meio de cultura Leibovitz-15 (L-15) (Cultilab)
suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (Cultilab) antibioacuteticos (Penicilina 100 UmL
Streptomicina 100 microgmL) e antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL) a 28degC
412 Ceacutelulas BHK-21
As ceacutelulas BHK-21 satildeo fibroblastos de linhagem contiacutenua derivados de rim de hamster
neonato Estas ceacutelulas foram utilizadas para os experimentos in vitro e para as titulaccedilotildees de
DENV 1 e 2 para isso foram mantidas em meio miacutenimo essencial modificado por Dulbecco
ndash DMEM (Cultilab) suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (SFB) com antibioacuteticos
(Penicilina 100 UmL Streptomicina 100 microgmL) e com antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL)
sendo mantidas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5
42 Viacuterus
421 DENV 1 e DENV 2
O Sorotipo 1 do Dengue virus (DENV-1) estirpe Mochizuki foi replicado em ceacutelulas
C636 para gerar estoques de trabalho durante 2 e 5 dias a 28degC O sobrenadante da cultura de
ceacutelulas infectadas foi recolhido e clarificado por centrifugaccedilatildeo a 4000 G durante 10 minutos agrave
4degC e entatildeo foi aliquotado e armazenado a -70 deg C como reserva de viacuterus ateacute agrave sua utilizaccedilatildeo
A replicaccedilatildeo geraccedilatildeo de estoque e titulaccedilatildeo do Sorotipo 2 do Dengue virus (DENV-2)
estirpe Nova Guineacute C ocorreu nos mesmos moldes do DENV-1
19
422 Titulaccedilatildeo viral
Os estoques virais foram diluiacutedos (10-1
a 10-7
) e inoculados em monocamadas de
ceacutelulas BHK-21 implantadas em placas de 6 poccedilos com confluecircncia de aproximadamente
60 (3x105 ceacutelulas por poccedilo) sendo um poccedilo natildeo infectado mantido para controle celular
Apoacutes uma hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus foram adicionados 3 mL de meio DMEM (Cultilab)
suplementado com 15 de SFB e contendo 15 de Carboximetilcelulose (CMC Synth) As
placas foram entatildeo incubadas a 37degC (CO2 a 5) por 96 horas As ceacutelulas foram entatildeo
fixadas com 2 mL de soluccedilatildeo de formol a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo
1 (pv) de cristal violeta em PBS para contagem das placas de lise O tiacutetulo viral foi
expresso atraveacutes do nuacutemero de unidades formadoras de placa por mL (UFPmL) segundo a
formula abaixo representada
Tiacutetulo viral (UFPmL) = N x FC x 10
N = nuacutemero de placas de lise contadas
FC = Fator de correccedilatildeo
= Inverso da diluiccedilatildeo na qual foram contadas as placas de lise
43 Compostos de naftoquinonas
Os compostos utilizados neste estudo foram fornecidos pelo Dr Geraldo Ceacutelio
Brandatildeo do laboratoacuterio de pesquisa da Escola de Farmaacutecia da Universidade Federal de Ouro
Preto
20
Tabela 1 Relaccedilatildeo de nome estrutura e coacutedigo dos compostos utilizados Na tabela estatildeo
presentes a relaccedilatildeo dos nomes dos compostos utilizados neste trabalho bem como sua
estrutura Os coacutedigos representantes de cada composto seratildeo utilizados no decorrer da escrita
Nome do composto Estrutura Coacutedigo
Lapachol
A1
β-lapachona
A2
2-Hidroxi-3-(ββ-dimetilvinil)-14-naftoquinona
A3
2-Cloro-14-naftoquinona
A4
Lapachol derivado 1
A5
Lapachol derivado 2 A6
Lapachol derivado 3 A7
Lapachol derivado 4 A8
44 Ensaio de citotoxicidade
Para avaliar a citotoxicidade dos compostos ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas foram incubadas com diferentes concentraccedilotildees dos compostos em triplicata num
volume de 200 microL de meio de cultura por poccedilo na presenccedila de 1 de SFB Os controles natildeo
tratados apresentaram adiccedilatildeo de 200 microL de meio de cultura As ceacutelulas foram entatildeo incubadas
durante 72 horas O meio foi removido e 28 microL de soluccedilatildeo de 5 mg mL MTT (brometo de 3-
21
[45-dimetil-tiazol-2-il]-25 difeniltertrazoacutelio) foi adicionado a cada poccedilo As placas foram re-
incubadas durante 1 hora e 30 minutos e entatildeo 122 microL de DMSO foi adicionado a cada poccedilo e
placas foram agitadas suavemente durante 15 minutos para dissolver os cristais de formazan
A absorbacircncia foi lida em um equipamento leitor de placas Victor X3 (PerkinElmer) a 490
nm A concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC 50) foi definida como a concentraccedilatildeo da amostra que
reduziu a viabilidade celular de 50 em comparaccedilatildeo com controles natildeo tratados Os dados
foram analisados utilizando o programa Prisma
45 Avaliaccedilatildeo da viabilidade e crescimento celular por exclusatildeo de azul de tripan
Ceacutelulas BHK-21 foram cultivadas em placas de 24 poccedilos (7x104 ceacutelulaspoccedilo) e apoacutes
24 horas foram tratadas com as concentraccedilotildees de uso de cada composto e incubadas por 72
horas na presenccedila de 1 de SFB A seguir as ceacutelulas foram tripsinizadas e incubadas com
azul de tripan e entatildeo foi utilizado um contador automatizado de ceacutelulas (Countess II FL
Automated Cell Counter ndash Thermo Fisher Scientific) para contagem das ceacutelulas e avaliaccedilatildeo da
porcentagem de viabilidade e diacircmetro celular do controle nos tempos de 0 24 e 96 horas e
avaliaccedilatildeo dos mesmos paracircmetros para os compostos no tempo de 96 horas (72 horas poacutes
tratamento)
Outra curva de multiplicaccedilatildeo celular foi feita para os compostos A1 A3 A4 e A5 onde as
ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos no momento da confecccedilatildeo da placa e
foram avaliados os mesmos paracircmetros nos tempos de 0 12 24 48 e 72 horas O
equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
46 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
Para determinar a menor Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) responsaacutevel pela letalidade
celular total 2x104 de ceacutelulas BHK-21 foram semeadas em placa de 96 poccedilos Apoacutes a
incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o
meio de cultura foi removido e as ceacutelulas foram expostas a diferentes diluiccedilotildees dos dois
sorotipos de DENV (100 microL de cada diluiccedilatildeo + 100 microL de meio DEMEM 1 SFB) As
diluiccedilotildees seriadas foram realizadas da suspensatildeo viral na razatildeo de 5 para o primeiro poccedilo e de
2 para os demais poccedilos Apoacutes 72 horas as ceacutelulas foram entatildeo fixadas com 200 microL de soluccedilatildeo
22
formalina a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo 1 (pv) de cristal violeta em
PBS para avaliaccedilatildeo da maior diluiccedilatildeo responsaacutevel pela letalidade de 100 das ceacutelulas
47 Ensaio Dose-resposta
Para cada composto foram realizados ensaios de dose-resposta para definiccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de cada composto capaz de promover a reduccedilatildeo na produccedilatildeo viral A atividade
antiviral foi avaliada tambeacutem pelo meacutetodo de MTT Ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas expostas a diferentes concentraccedilotildees dos extratos determinadas a partir das maiores
concentraccedilotildees em que natildeo foram observados efeitos citotoacutexicos As ceacutelulas foram tratadas
com as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de cada composto e em seguida infectadas com DENV
1 (MOI= 5) ou 2 (MOI= 2) Mantendo uma coluna para controle com DMSO uma coluna
para controle de viacuterus uma coluna para controle de citotoxicidade dos compostos e por fim
uma coluna para controle celular As ceacutelulas foram entatildeo incubadas durante 72 horas Apoacutes
este tempo procedeu-se a leitura pelo ensaio de MTT como descrito anteriormente Os dados
foram analisados levando-se em consideraccedilatildeo a leitura das absorbacircncias dos poccedilos dos
controles de viacuterus e do controle celular
Para realizacao destes experimentos os seguintes controles foram adotados
Controle de ceacutelulas poccedilos contendo somente ceacutelulas acrescidas do meio de cultura DMEM
1 SFB Utilizado para avaliar o comportamento das ceacutelulas sem que as mesmas tivessem
contato com qualquer interferente durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo Com isso os poccedilos
reservados para esse controle serviram de padratildeo para comparaccedilatildeo com aqueles em que fosse
observada atividade citotoacutexica ou citopaacutetica
Controle de viacuterus poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM 1 SFB
sem nenhum tratamento e de suspensatildeo de viacuterus Utilizando como referecircncia para anaacutelise da
atividade citopaacutetica provocada pelo viacuterus testado durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo das placas
23
Controle de viacuterus com DMSO Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura
DMEM 1 SFB e DMSO Foi utilizado para avaliar se havia influecircncia prejudicial do
solvente utilizado para diluiccedilatildeo das amostras no meio de cultivo das ceacutelulas e se o mesmo
poderia apresentar alguma potencial atividade antiviral aparente
Controle de citotoxicidade Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM
1 SFB e as quatro principais concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos Foi utilizado
para avaliar se haveria alguma possiacutevel atividade citotoacutexica das concentraccedilotildees dos compostos
em relaccedilatildeo agraves ceacutelulas
48 Ensaio Virucida
Para a realizaccedilatildeo deste ensaio aliacutequotas de 950 microL (diluiccedilatildeo de 20 vezes) do DENV 1 (tiacutetulo
6 x 107 UFPmL) foram incubadas com 50 microL de uma soluccedilatildeo de meio DMEM preparada
com 20x a concentraccedilatildeo natildeo citotoacutexica de cada composto A1 a A8 em banho-maria 37deg C
por 1 hora Apoacutes a incubaccedilatildeo as aliacutequotas foram imediatamente tituladas em ceacutelulas BHK-21
em placas de 6 poccedilos utilizando-se 3 diluiccedilotildees para cada incubaccedilatildeo (20x 20 x 10-1
e 20 x 10-
2) Foram titulados tambeacutem uma aliacutequota incubada apenas com meio DMEM sem nenhum
tratamento e outra aliacutequota incubada com DMSO (Dimetilsulfoacutexido) Estas foram tituladas
utilizando um controle e mais cinco diluiccedilotildees (20x 20 x 10-1
20 x 10-2
20 x 10-3
e 20 x 10-4
)
49 Ensaio antiviral
Neste ensaio ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em placas de 24 poccedilos no dia
seguinte foram tratadas durante 4 horas com as concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas de cada
composto em duplicata Apoacutes o preacute-tratamento as monocamadas foram infectadas com
DENV-1 a uma MOI=5 na presenccedila das concentraccedilotildees de uso respectivas de cada composto
Apoacutes 1 hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus as monocamadas foram lavadas duas vezes com PBS e
foi adicionado 500 microL por poccedilo de meio preparado com as mesmas concentraccedilotildees dos
diferentes compostos e mantidos durante 48 horas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5 Em
quatro poccedilos as ceacutelulas foram infectadas e natildeo tratadas e em outros quatro poccedilos as ceacutelulas
natildeo foram tratadas e nem infectadas (controle de ceacutelulas) destes uacuteltimos dois foram
tripsinizados e contados no momento da infecccedilatildeo e os outros dois apoacutes o teacutermino do ensaio
24
para avaliar o crescimento celular Decorridas as 48 horas o sobrenadante foi coletado e
centrifugado por 10 minutos a 4000 xG para separaccedilatildeo dos debris celulares e prontamente
titulado em placa de 6 poccedilos
410 Anaacutelise estatiacutestica
Os valores de CC50 foram obtidos a partir de anaacutelise de regressatildeo linear das curvas de
concentraccedilatildeocitotoxicidade A anaacutelise estatiacutestica dos dados foi realizada pelo programa
GraphPad Prism software Uma anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi utilizada para determinar
as diferenccedilas estatiacutesticas seguida do poacutes teste de Tukey A significacircncia estatiacutestica foi fixada
em p lt005
25
V RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
26
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Ensaio de citotoxicidade celular
Para avaliar a viabilidade da linhagem celular BHK-21 frente ao tratamento com oito
diferentes concentraccedilotildees dos compostos (A1 a A8) realizou-se um ensaio de MTT (brometo
de 3-[45-dimetil-tiazol-2-il]-25-difeniltetrazoacutelio) Este ensaio tem o objetivo de quantificar
espectrofotometricamente o crescimento celular a viabilidade e proliferaccedilatildeo podendo ser
utilizado como um indicador direto de citotoxicidade Trata-se de um ensaio colorimeacutetrico
para medir a atividade da redutase mitocondrial em ceacutelulas vivas Ele se baseia na reduccedilatildeo do
sal amarelo tetrazoacutelio (permeaacutevel agrave membrana celular) para cristais de formazan azuis
puacuterpura por ceacutelulas metabolicamente ativas a quantidade de formazan gerada medida por
espectrofotometria eacute proporcional ao nuacutemero de ceacutelulas viaacuteveis
A CC50 foi calculada plotando-se uma curva de porcentagem de viabilidade celular por
concentraccedilatildeo melhor representada na figura 7 pelo composto A7 e os resultados de CC50
para todos os compostos estatildeo representados na tabela 2 Foram feitos ensaios de
citotoxicidade com oito concentraccedilotildees diferentes sendo escolhida a maior concentraccedilatildeo que
natildeo apresentou citotoxicidade
Viabilidade Celular = [ ( A ndash B ) A ] x 100
Onde
A = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas natildeo tratadas
B = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas tratadas com
as respectivas concentraccedilotildees de cada composto
27
28
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (A curva dose resposta do composto A7 eacute a que
melhor representa a curva dose resposta esperada) Avaliou-se a viabilidade da linhagem
celular BHK-21 frente agrave diferentes concentraccedilotildees dos compostos realizando o ensaio de MTT
e determinando assim as concentraccedilotildees a serem utilizadas nos proacuteximos ensaios bem como
calculando a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) agrave partir da curva
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo
da concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50)
Composto Concentraccedilatildeo utilizada
[ ] microgmL
Concentraccedilatildeo citotoacutexica 50
(CC50) [ ] microgmL plusmn Desvio
Padratildeo
A1 ([ ]=1 mgmL) 00200 10010 plusmn 0014
A2 ([ ]=1 mgmL) 00025 09561 plusmn 0023
A3 ([ ]=1 mgmL) 00025 09988 plusmn 0017
A4 ([ ]=5 mgmL) 00125 10150 plusmn 0036
A5 ([ ]=10 mgmL) 00250 10590 plusmn 0047
A6 ([ ]=5 mgmL) 00250 08183 plusmn 0030
A7 ([ ]=5 mgmL) 00125 10280 plusmn 0052
A8 ([ ]=5 mgmL) 00125 09758 plusmn 0036
52 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan
Para corroborar o ensaio anterior de citotoxicidade utilizou -se o teste de viabilidade
celular pela teacutecnica da exclusatildeo do azul de tripan com a finalidade de determinar a
viabilidade das ceacutelulas Os procedimentos adotados no ensaio seguiram o manual do
equipamento contador automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL Automated Cell Counter) entatildeo
foi acrescentado agrave 10 microL da suspensatildeo celular 10 microL de azul de tripan (04) Apoacutes
homogeneizaccedilatildeo 10 microL da suspensatildeo foi colocada no local indicado da lacircmina proacutepria para
leitura e foi realizada a contagem sendo consideradas mortas (inviaacuteveis) as ceacutelulas que
incorporavam o corante e viaacuteveis as que excluiacuteam o azul de tripan
29
O equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
(A)
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan A avaliaccedilatildeo da
viabilidade celular foi realizada atraveacutes de um contador automaacutetico de ceacutelulas Este
equipamento possibilita explorar ferramentas de fotografia e avaliar alguns paracircmetros
importantes (A) fotografia das ceacutelulas (B) Zoom na fotografia das ceacutelulas com marcaccedilotildees
(em verde para ceacutelulas vivas e vermelho para mortas) e (D) contagem das ceacutelulas totais
ceacutelulas vivas e mortas graacutefico e meacutedia dos diacircmetros celulares das ceacutelulas vivas e mortas
(B)
(C)
30
O crescimento celular de ceacutelulas natildeo tratadas foi avaliado nos tempos de 0h (momento
da confecccedilatildeo da placa) 24h (momento de tratamento com os compostos) e 96 horas
(Momento em que todas as ceacutelulas foram tripsinizadas e contadas) para avaliar o perfil do
crescimento celular em ceacutelulas natildeo tratadas Foi observado um crescimento celular no periacuteodo
de 24 horas onde as ceacutelulas estavam incubadas com meio acrescido de 10 SFB Em 24
horas o meio foi trocado por 1 SFB e acrescido das substacircncias testes nas menores diluiccedilotildees
natildeo citotoacutexicas determinadas pelo ensaio do MTT Em 96 horas pode ser observado um
decaimento no nuacutemero de ceacutelulas vivas provavelmente devido ao crescimento celular (morte
por confluecircncia)
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas)
(A) (B)
31
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas (A)
Contagem de ceacutelulas vivas (B) Percentual de ceacutelulas viaacuteveis (Viabilidade celular ) e (C)
Meacutedia do diacircmetro apresentado pelas ceacutelulas vivas
Em 96 horas as ceacutelulas natildeo tratadas bem como as ceacutelulas tratadas por 72 horas com as
concentraccedilotildees de uso dos compostos foram tripsinizadas e avaliadas quanto ao nuacutemero de
ceacutelulas vivas viabilidade e diacircmetro celular apresentados na figura 10
Segundo se observa natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo aparente que possa demonstrar que
as concentraccedilotildees de uso dos compostos tenham causado alguma atividade citotoacutexica
corroborando assim os ensaios de citotoxicidade anteriores
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
A infectividade de um viacuterus depende de vaacuterios fatores entre eles da proporccedilatildeo de
partiacuteculas virais completas ou infecciosas da suscetibilidade da ceacutelula hospedeira e da
chance desta partiacutecula encontrar o receptor e penetrar na ceacutelula Quando ceacutelulas suscetiacuteveis
satildeo misturadas com uma suspensatildeo de viacuterus estas podem receber uma duas trecircs ou dez
partiacuteculas virais ou nenhuma Isto depende da proporccedilatildeo entre a quantidade de viacuterus
infecciosos presente no inoculo e a quantidade de ceacutelulas utilizada Esta relaccedilatildeo eacute denominada
de multiplicidade de infecccedilatildeo ou MOI Uma MOI=1 indica que a infecccedilatildeo foi feita em
principio com 1 viacuterus ou 1 dose infectante por ceacutelula
A determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo dos Dengue virus 1 e 2 a serem
utilizadas nos proacuteximos ensaios foi feita a partir da infecccedilatildeo de ceacutelulas BHK-21 por diferentes
(C)
32
concentraccedilotildees de viacuterus e revelaccedilatildeo com cristal violeta Escolheu-se a maior diluiccedilatildeo viral que
possibilitou a letalidade total das ceacutelulas (faixa onde todas as ceacutelulas estatildeo mortas utilizando
menor concentraccedilatildeo de viacuterus) As faixas escolhidas foram entatildeo calculadas levando-se em
consideraccedilatildeo o nuacutemero de ceacutelulas presentes no poccedilo e o nuacutemero de partiacuteculas virais que foram
adicionadas (Faixa3 para DENV2 e 2 para DENV1) Figura 11 Foi estipulado portanto a
Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 2 para DENV 2 e 5 para DENV 1
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI A partir da infecccedilatildeo da linhagem celular BHK-21 em
placa de 96 poccedilos com diferentes diluiccedilotildees de DENV foi determinado que a Multiplicidade
de infecccedilatildeo para o Dengue viacuterus sorotipos 1 e 2 seria de 5 e 2 respectivamente (colunas 2 -
DENV1 e 3 - DENV2)
54 Ensaio dose resposta
Apoacutes a determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas ideais realizou-se um
ensaio dose resposta tratando as ceacutelulas com oito concentraccedilotildees agrave partir das concentraccedilotildees natildeo
citotoacutexicas escolhidas para cada composto e em seguida infectando com DENV sorotipos 1 e
2 nas MOIs estipuladas anteriormente (5 e 2 respectivamente) A porcentagem do efeito
protetor conferida agraves ceacutelulas para cada concentraccedilatildeo de amostra testada foi calculada da
seguinte forma
33
EP = [ (A ndash B) (C ndash B) ] x 100
Onde
A Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas tratadas e infectadas
B Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e infectadas
C Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e natildeo infectadas
Este ensaio tem por objetivo identificar a resposta celular agrave infecccedilatildeo frente ao
tratamento com os compostos em diferentes concentraccedilotildees Assim como o ensaio de
toxicidade este ensaio feito utilizando a teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT permite o teste de vaacuterias
concentraccedilotildees diferentes em um menor tempo e com baixo gasto de material
34
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV1
(MOI=5)
35
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV2
(MOI=2)
36
Takegami et al (1998) demonstraram atividade de furanonaftoquinonas contra o viacuterus
da Encefalite Japonesa (Flavivirus) utilizando a concentraccedilatildeo de 3microgmL poreacutem para os
compostos apresentados avaliados pela teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT nenhuma das
concentraccedilotildees apresentadas produziu efeito antiviral significativo em relaccedilatildeo ao controle
celular como observado nas figuras 12 e 13
Apesar da teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT ser interessante como triagem de atividade
antiviral permitindo o teste de vaacuterias concentraccedilotildees dos compostos em menor tempo e
utilizando uma quantidade razoaacutevel de materiais optou-se por utilizar as maiores
concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas encontradas avaliando sua atividade antiviral por outras
teacutecnicas Como natildeo foi avaliada atividade antiviral preacutevia para nenhum dos compostos frente
agrave infecccedilatildeo por DENV1 e 2 foi selecionado o Dengue virus 1 para dar prosseguimento aos
ensaios
55 Ensaio Virucida
O ensaio virucida foi realizado para avaliar um potencial efeito dos compostos
diretamente sobre a partiacutecula viral Este ensaio eacute importante pois possibilita elucidar se o
composto pode produzir algum efeito sobre a partiacutecula viral impedindo que esta possa infectar
as ceacutelulas
Figura 14 Ensaio virucida Neste ensaio as aliacutequotas de DENV1 foram incubadas com as
concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos e titulados (NT) Controle natildeo tratado
37
Tabela 3 Ensaio virucida Caacutelculo do tiacutetulo viral (UFPmL) e porcentagem representante de
cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 254 x 105 100
DMSO 263 x 105 10335
A1 199 x 105 7835
A2 205 x 105 8071
A3 237 x 105 9311
A4 775 x 104 3049
A5 153 x 105 6024
A6 219 x 105 8602
A7 243 x 105 9547
A8 254 x 105 100
Lagrota et al (1988) demonstraram atividade de 2-HO-3-N-benzil-N(N-benzil-2-
etilamina) -14-naftoquinona sobre a partiacutecula viral de enterovirus De forma contraacuteria apesar
de se verificar a reduccedilatildeo de quase uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais
para o composto A4 natildeo considerou-se esta uma alteraccedilatildeo significativa pois devido agrave
magnitude do nuacutemero de UFPs se trata de uma alteraccedilatildeo muito pequena Portanto os
compostos avaliados neste trabalho natildeo produziram atividade virucida aparente frente ao
tratamento com as concentraccedilotildees de uso
56 Ensaio Antiviral
O sobrenadante de ceacutelulas tratadas previamente e infectadas por DENV1 coletado 48
horas poacutes infecccedilatildeo foi avaliado quanto agrave produccedilatildeo viral de partiacuteculas infecciosas pela
contagem de placas de lise e caacutelculo de Unidades Formadoras de Placa (Titulaccedilatildeo viral em
placa ndash UFPmL)
38
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral Sobrenadante de ceacutelulas tratadas e infectadas por DENV1
coletado apoacutes 48 horas e titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado
Tabela 4 Ensaio Antiviral Coleta do sobrenadante de ceacutelulas infectadas por DENV1 Tiacutetulo
viral (UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o
controle natildeo tratado como 100
Ao perceber um aumento no tiacutetulo viral frente ao tratamento com os compostos A1
A2 e A3 e uma reduccedilatildeo frente ao tratamento com A4 A5 e A6 foram escolhidos dois
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 119 x 105 10000
A1 235 x 105 19748
A2 228 x 105 19160
A3 318 x 105 26723
A4 128 x 104 1076
A5 186 x 103 156
A6 190 x 104 1597
A7 280 x 104 2353
A8 350 x 104 2941
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
40
Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
X
SUMAacuteRIO
RESUMO VIII
ABSTRACT IX
LISTA DE FIGURAS XII
LISTA DE TABELAS XIII
1 INTRODUCcedilAtildeO 2
11 Flavivirus 2
12 Dengue virus 3
13 Epidemiologia 6
14 Naftoquinonas 8
3 OBJETIVOS 16
31 Objetivo Geral 16
32 Objetivos especiacuteficos 16
4 MATERIAL E MEacuteTODOS 18
41 Linhagens celulares 18
411 Ceacutelulas C636 18
412 Ceacutelulas BHK-21 18
42 Viacuterus 18
421 DENV 1 e DENV 2 18
422 Titulaccedilatildeo viral 19
43 Compostos de naftoquinonas 19
44 Ensaio de citotoxicidade 20
45 Avaliaccedilatildeo da viabilidade e crescimento celular por exclusatildeo de azul de tripan 21
46 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) 21
47 Ensaio Dose-resposta 22
48 Ensaio Virucida 23
49 Ensaio antiviral 23
410 Anaacutelise estatiacutestica 24
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO 26
51 Ensaio de citotoxicidade celular 26
52 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan 28
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) 31
54 Ensaio dose resposta 32
XI
55 Ensaio Virucida 36
56 Ensaio Antiviral 37
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao tratamento com
os compostos A1 A3 A4 e A5 40
6 CONCLUSAtildeO 44
7 PERSPECTIVAS 46
8 REFEREcircNCIAS 48
XII
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Estrutura da partiacutecula viral de Dengue viacuterus 4
Figura 2 Ciclo de multiplicaccedilatildeo de DENV 5
Figura 3 Distribuiccedilatildeo geograacutefica da Dengue 7
Figura 4 Estrutura quiacutemica da 12-naftoquinona (1) e 14-naftoquinona (2) 9
Figura 5 Estrutura quiacutemica do Lapachol (1) da α- Lapachona (2) e da β-Lapachona 10
Figura 6 Tabebuia avellanedae 11
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (Exemplo da curva dose resposta do composto A7) 28
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan 29
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas) 30
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas 31
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI 32
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 34
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 35
Figura 14 Ensaio virucida 36
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral 38
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados 39
Figura 17 Curva de crescimento celular 41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular 41
XIII
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Relaccedilatildeo de nome estrutura e coacutedigo dos compostos utilizados 20
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo da
concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) 28
Tabela 3 Ensaio virucida 37
Tabela 4 Ensaio Antiviral 38
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados 39
XIV
LISTA DE ABREVIATURAS
AMV ndash Mielobastose Aviaacuteria viacuterus (Avian Myeloblastosis virus )
CC50 ndash Concentraccedilatildeo Citotoacutexica 50
DENV ndash Dengue virus
DMEM ndash Meio baacutesico modificado por Dulbecco (Dulbeccos Modified Eagle Medium)
DMSO ndash Dimetilsulfoacutexido
ICTV ndash Comitecirc Inernacional de Taxonomia Viral
JEV ndash Viacuterus da Encefalite Japonesa (Japanese Encephalitis virus)
MOI ndash Multiplicidade de infecccedilatildeo viral
NS ndash Proteiacutenas natildeo estruturais
NT ndash Natildeo Tratado
OMS ndash Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede
RE ndash Retiacuteculo endoplasmaacutetico
RLV ndash Viacuterus da Leucemia Murina de Rauscher (Murine leukemia virus)
SFB ndash Soro Fetal Bovino
UFP ndash Unidades formadoras de placas
WNV ndash Viacuterus do Nilo Ocidental (West Nile virus)
YFV ndash Viacuterus da febre amarela (Yellow fever virus)
ZV ndash Zika virus
1
I INTRODUCcedilAtildeO
2
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Flavivirus
O Gecircnero Flavivirus pertencente agrave famiacutelia Flaviviridae inclui 53 espeacutecies
taxonomicamente reconhecidas (ICTV 2016) muitas das quais satildeo importantes patoacutegenos
humanos tais como o Dengue virus (DENV) Yellow fever virus (YFV - viacuterus da febre
amarela ndash protoacutetipo deste gecircnero) Japanese encephalitis virus (JEV - viacuterus da encefalite
japonesa) West Nile virus (WNV - virus do Nilo Ocidental) Zika virus (ZV) entre outros
(Villordo 2016) O nome flavivirus eacute derivado da palavra latina flavus que significa amarelo
significando a icteriacutecia causada pelo YFV Os sintomas da infecccedilatildeo por flavivirus pode variar
de leve febre e mal-estar a encefalite fatal e febre hemorraacutegica (Mukhopadhyay 2005)
Estes viacuterus regulam o metabolismo e a sobrevivecircncia das ceacutelulas infectadas
assegurando a sua proacutepria reproduccedilatildeo e propagaccedilatildeo O viacuterus da dengue tambeacutem provoca a
autofagia uma resposta homeostaacutetica geral que ajuda a ceacutelula infectada sobreviver e produzir
viacuterus (Datan 2016)
Os Flavivirus podem ser agrupados em complexos e sub-complexos antigecircnicos
baseados em criteacuterios soroloacutegicos ou em grupos clados e espeacutecies segundo a sua filogenia
molecular (Lindenbach 2007) A maioria dos membros deste gecircnero satildeo arbovirus (arthropod
borne virus) ou seja satildeo essencialmente transmitidos por Artroacutepodes (Mackenzie 2004)
onde 27 satildeo transmitidos por mosquitos 12 por carrapatos e 14 natildeo possuem vetor
conhecido Os viacuterus transmitidos pela fecircmea do gecircnero Aedes incluem DENV e YFV satildeo
viscerotroacutepicos e possuem primatas como reservatoacuterio natural (Gaunt 2001)
A patogenia da Dengue causada pelo DENV constitui uma das doenccedilas virais mais
importantes em seres humanos transmitidos por insetos e eacute responsaacutevel por cerca de 390
milhotildees de infecccedilotildees por ano O YFV por sua vez causador da febre amarela eacute endecircmico em
vaacuterios paiacuteses do continente Africano e da Ameacuterica do Sul resultando em 200000 casos e
30000 mortes na Aacutefrica mesmo com vacinas eficazes disponiacuteveis Outras doenccedilas causadas
por flaviviacuterus incluem a encefalite do Nilo Ocidental (West Nile virus) e febre Zika (Zika
virus) que satildeo consideradas doenccedilas emergentes com surtos importantes em todo o mundo
(Villordo 2016)
3
12 Dengue virus
Os DENV pertencem ao gecircnero flaviviacuterus e evoluiram em primatas natildeo-humanos a
partir de um ancestral comum Eacute composto por quatro sorotipos antigenicamente distintos
(DENV1-4) que co-circulam por todo o Sudeste da Aacutesia Aacutefrica e Ameacutericas (McArthur 2013)
e em outubro de 2013 foi anunciado um novo sorotipo circulante denominado entatildeo de DENV
5 (Normile 2013) A partiacutecula infecciosa eacute esfeacuterica com 40-50 nm de diacircmetro possuindo
um envelope de lipopolissacariacutedeo O genoma consiste em RNA de fita simples natildeo
segmentado e senso positivo de aproximadamente 11 kb de comprimento e possui uma uacutenica
janela aberta de leitura (start codon) (Guzman 2010) Apoacutes a traduccedilatildeo a uacutenica poliproteiacutena
formada eacute clivada por proteases virais e celulares em trecircs proteiacutenas estruturais que compotildeem
a partiacutecula viral C (capsideo) prM M (membrana e o seu precursor) e E (envelope) e sete
proteiacutenas natildeo estruturais essenciais para a replicaccedilatildeo viral (NS) (NS1 NS2a NS2b NS3
NS4a NS4b e NS5) (Robertson 2009)
A transmissatildeo do viacuterus ocorre atraveacutes da picada por fecircmeas infectadas de mosquitos
do gecircnero Aedes sendo responsaacutevel pelas maiores taxas de doenccedila e mortalidade entre os
membros do gecircnero Flavivirus (Mukhopadhyay 2005) No Brasil o Aedes aegypti eacute o
principal vetor de dengue enquanto o Aedes albopictus atua como um vector secundaacuterio
(Weaver 2010)
O diagnoacutestico soroloacutegico da Dengue se baseia na detecccedilatildeo de niacuteveis elevados de
anticorpos anti-Dengue-IgM ou anti-Dengue-IgG que reconhecem e se ligam ao antiacutegeno de
DENV A Glicoproteiacutena do envelope (E) uma proteiacutena estrutural de DENV eacute o alvo
antigecircnico mais importante destes anticorpos neutralizantes porque estaacute exposta na superfiacutecie
do viacuterus e medeia os receptores de ligaccedilatildeo e fusatildeo da ceacutelula hospedeira (Lee 2015)
Durante a infecccedilatildeo celular os virions de DENV se ligam agrave superfiacutecie da membrana
atraveacutes da glicoproteiacutena do envelope (E) a receptores especiacuteficos e satildeo internalizados por
endocitose Uma vez dentro do endossoma a acidificaccedilatildeo provocada pela ligaccedilatildeo de
lisossomos desencadeia uma trimerizaccedilatildeo irreversiacutevel da proteiacutena E que atua na fusatildeo das
membranas virais e endossomais celulares Apoacutes essa fusatildeo o nucleocapsideo eacute liberado no
citoplasma onde o mesmo eacute desnudado e a replicaccedilatildeo do genoma de RNA e montagem de
partiacuteculas eacute iniciada As partiacuteculas virais imaturas satildeo acumuladas no luacutemen do retiacuteculo
endoplasmaacutetico (RE) Essas partiacuteculas imaturas que contecircm proteiacutenas prM proteiacutena E
membrana lipiacutedica e nuacutecleo capsiacutedeo natildeo pode induzir a fusatildeo da ceacutelula hospedeira ou seja
4
neste estaacutegio elas natildeo satildeo infecciosas (Mukhopadhyay 2005) O processo de maturaccedilatildeo
desses viacuterus ocorre apoacutes a clivagem proteoliacutetica da proteiacutena precursora de membrana (prM)
transformando viacuterus inerte em partiacuteculas infecciosas (Li 2008) Partiacuteculas subvirais satildeo
tambeacutem produzidas no RE mas apenas contecircm as glicoproteiacutenas de membrana fazendo com
que estas partiacuteculas sejam natildeo infecciosas Os viacuterus maduros e as partiacuteculas sub-virais satildeo
liberados da ceacutelula hospedeira por exocitose (Mukhopadhyay 2005)
Na pele o DENV tende a infectar ceacutelulas dendriacuteticas imaturas Estas ceacutelulas infectadas
amadurecem e migram para os gacircnglios linfaacuteticos regionais ou locais onde apresentam
antiacutegenos virais agraves ceacutelulas T iniciando as respostas imunes Existe tambeacutem evidecircncia de
replicaccedilatildeo abundante de DENV em ceacutelulas do parecircnquima do fiacutegado e em macroacutefagos nos
gacircnglios linfaacuteticos fiacutegado e baccedilo bem como em monoacutecitos de sangue perifeacuterico (Guzman
2010)
Proteiacutena E
(diacutemero)
Proteiacutena
M
Proteiacutena C
ssRNA (+)
Figura 1 Estrutura da partiacutecula viral de Dengue viacuterus A partiacutecula viral eacute composta
por trecircs proteiacutenas estruturais proteiacutena de envelope (E) disposta em diacutemeros a proteiacutena
associada agrave membrana (M) e a proteiacutena do nucleocapsiacutedeo (C) O genoma de RNA fita-
simples de polaridade positiva se encontra dentro do nucleocapsiacutedeo (Adaptado de
httpviralzoneexpasyorgviralzoneall_by_species24html)
5
Figura 2 Ciclo de multiplicaccedilatildeo de DENV A Os viacuterus se ligam aos receptores na superfiacutecie da
ceacutelula e satildeo endocitados B Devido ao baixo pH dentro dos endossomas ocorre a fusatildeo de
membranas viral-celular mediada por proteiacutenas virais resultando na liberaccedilatildeo do RNA viral em um
processo chamado de desnudamento C O genoma viral eacute traduzido em uma uacutenica poliproteiacutena que
eacute processada por proteases do viacuterus e da ceacutelula hospedeira D O RNA eacute replicado por proteiacutenas
natildeo-estruturais do proacuteprio viacuterus E A montagem do viacuterus ocorre na membrana do Reticulo
endoplasmaacutetico no qual a proteiacutena do capsiacutedeo e o RNA viral satildeo envolvidos por glicoproteiacutenas e
pela membrana da organela para formar partiacuteculas virais imaturas F Partiacuteculas virais imaturas
utilizam a via secretora da ceacutelula hospedeira e sob o baixo pH do Complexo de Golgi a proteiacutena
precursora prM eacute clivada em proteiacutena M completando a maturaccedilatildeo do viacuterus GOs viacuterus maduros
satildeo entatildeo liberados das ceacutelulas por exocitose Os nuacutemeros indicados nas caixas coloridas referem-se
ao valor de pH dos respectivos compartimentos Imagem adaptada de PERERA 2009
Adsorccedilatildeo
Siacutentese e processamento
Fusatildeo e
Desnudamento
Replicaccedilatildeo do RNA
Montagem
Maturaccedilatildeo
Liberaccedilatildeo de
viacuterus
maduro
A
B
C
D
E
F
G
6
13 Epidemiologia
Ao longo das uacuteltimas deacutecadas a dengue se tornou a doenccedila viral transmitida por
mosquitos mais prevalente no mundo Estimativas de infecccedilatildeo pela OMS indicam que a
patologia eacute endecircmica em mais de 100 paiacuteses em todos os continentes exceto a Antaacutertida e
aflige principalmente paiacuteses pobres em recursos nas regiotildees tropicais e subtropicais (Perry
2011) Epidemias globais de DENV ocorreram ao longo das uacuteltimas deacutecadas em parte devido
agrave diminuiccedilatildeo dos esforccedilos no controle de mosquitos Satildeo estimados mais de 50 milhotildees de
casos de dengue anualmente (Mukhopadhyay 2005)
A Dengue eacute uma doenccedila viral sistecircmica aguda que se estabeleceu em todo o mundo
em ambos os ciclos de transmissatildeo endecircmicas e epidecircmicas A infecccedilatildeo pelo DENV em seres
humanos eacute frequentemente inaparente mas pode levar a uma grande variedade de
manifestaccedilotildees cliacutenicas de febre leve a siacutendrome do choque da dengue potencialmente fatal A
imunidade vitaliacutecia desenvolvida apoacutes a infecccedilatildeo com um dos quatro tipos de viacuterus eacute
especiacutefica para cada tipo e a progressatildeo para uma doenccedila mais grave eacute frequente mas natildeo
exclusivamente relacionada com infecccedilatildeo secundaacuteria por tipos heteroacutelogos No entanto
enquanto a expansatildeo histoacuterica desta doenccedila eacute bem documentada o elevado fardo de
problemas de sauacutede atribuiacuteveis agrave dengue em grande parte do mundo tropical e sub-tropical
permanecem pouco enumerados (Bhatt 2013)
O Brasil eacute um paiacutes de grande extensatildeo (8512000 km2) situado em uma zona
predominantemente tropical com extensas aacutereas de florestas na regiatildeo amazocircnica bem como
restos de uma floresta tropical na costa leste sudeste e sul entre outros ecossistemas A maior
parte do paiacutes tem um clima tropical e uma grande diversidade de plantas e animais portanto
um local adequado para a ocorrecircncia de patologias causadas por viacuterus transmitidos por
artroacutepodes (Figueiredo 2000) Segundo o boletim epidemioloacutegico do ministeacuterio da sauacutede em
2016 jaacute foram registrados 170103 casos provaacuteveis de dengue no paiacutes ateacute a semana
epidemioloacutegica 5 Nesse periacuteodo a regiatildeo Sudeste registrou o maior nuacutemero de casos
provaacuteveis (96664 casos 568) Em Minas Gerais jaacute foram registradas 19 mortes em
decorrecircncia da Dengue entre 1deg de janeiro e 14 de marccedilo deste ano Outros 91 oacutebitos estatildeo
sob investigaccedilatildeo (BRASIL 2016)
7
Figura 3 Distribuiccedilatildeo geograacutefica da Dengue Aacutereas de risco de transmissatildeo em amarelo
(Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede Adaptado de httpwwwwhointen)
As manifestaccedilotildees da doenccedila foram descritas pela primeira vez apoacutes a Segunda Guerra
Mundial coincidente com o aumento da urbanizaccedilatildeo particularmente na Aacutesia (Weaver 2010)
Atualmente o DENV eacute hiperendecircmico em muitas regiotildees tropicais onde 2 ou mais sorotipos
circulam endemicamente Embora DENV foi provavelmente introduzido periodicamente para
as Ameacutericas atraveacutes de navios desde o seacuteculo 17 o surgimento de DENV no Hemisfeacuterio
Ocidental comeccedilou mais tarde devido a uma campanha de sucesso parcial para erradicar o
vetor A aegypti para controlar a febre amarela Esta campanha teve sucesso na maior parte
das Ameacutericas da deacutecada de 1950 agrave deacutecada de 1970 mas foi interrompida O vetor entatildeo
rapidamente recolonizou quase toda a regiatildeo neotropical e subtropicais e a invasatildeo do DENV
seguiu logo depois Em 1985 A albopictus foi introduzido nos EUA e no Brasil
proporcionando um vetor para a transmissatildeo secundaacuteria de DENV nas Ameacutericas (Hawley
1987)
Os mosquitos vetores principalmente A aegypti tornam-se infectados quando eles se
alimentam do sangue de seres humanos durante o periacuteodo de cinco dias da viremia A
infecccedilatildeo produz um amplo espectro da doenccedila cliacutenica e varia de assintomaacutetica a doenccedila febril
auto-limitante A dengue tambeacutem conhecida como ldquofebre osso quebradordquo devido agraves fortes
dores nas articulaccedilotildees e inclui sintomas de febre alta dores musculares articulares e erupccedilatildeo
cutacircnea Uma pequena porcentagem de indiviacuteduos pode apresentar a siacutendrome do choque da
8
dengue (dengue hemorraacutegica) com risco de vida grave O tratamento eacute amplamente favoraacutevel
usando de reidrataccedilatildeo oral ou intravenosa acompanhamento e atenccedilatildeo meacutedica adequada No
entanto uma das principais consequecircncias da doenccedila eacute a sua capacidade de sobrecarregar
instalaccedilotildees meacutedicas durante um surto e em paiacuteses onde os recursos de sauacutede jaacute estatildeo no
limite isso pode ter efeitos catastroacuteficos Prevenccedilatildeo e tratamento portanto se fazem
altamente necessaacuterios (Perry 2011)
A prevalecircncia global de DENV cresceu drasticamente nas uacuteltimas deacutecadas e ateacute o
momento natildeo haacute nenhum medicamento especiacutefico para combater a infecccedilatildeo as medidas de
prevenccedilatildeo mais eficazes satildeo voltadas para o controle do vetor (Silva 2011) Diante disso a
Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) elegeu o desenvolvimento de vacinas contra o viacuterus da
dengue como prioridade mundial (Kinney 2001) Por conseguinte a busca de substacircncias
naturais ou sinteacuteticas com atividade antiviral especiacutefica sem toxicidade para as ceacutelulas
normais em seres humanos eacute uma estrateacutegia desejada para evitar que a dengue se agrave e
ajudar a controlar a difusatildeo da doenccedila As vaacuterias fases do ciclo viral representam alvos
terapecircuticos individuais que podem ser exploradas (Costa 2013) Nesse sentido vaacuterios
grupos de pesquisa e organizaccedilotildees estatildeo trabalhando com diversas abordagens para o
desenvolvimento de compostos antivirais com atividade protetora contra dengue Dentre elas
uma vasta gama de produtos naturais incluindo plantas numa tentativa de isolar e
caracterizar novos compostos que podem inibir a replicaccedilatildeo do viacuterus ou tratar a infecccedilatildeo
viral Por essa razatildeo extratos e componentes da planta satildeo cada vez mais importantes como
fontes potenciais para agentes antivirais (Silva 2011)
14 Naftoquinonas
As quinonas satildeo compostos aromaacuteticos amplamente distribuiacutedos na natureza e podem
ser encontrados em vaacuterias famiacutelias de plantas bem como isolado de fungos algas e
bacteacuterias Elas satildeo classificadas em benzoquinonas antraquinonas e naftoquinonas de acordo
com as suas estruturas quiacutemicas Naftoquinonas satildeo compostos orgacircnicos altamente reativos
utilizados como corantes naturais ou sinteacuteticos cujas cores variam de amarelo para vermelho
Apresentam cadeia carbocircnica similar ao naftaleno e satildeo caracterizadas por seus dois grupos
carbonila na posiccedilatildeo 1 e 4 por isso satildeo nomeadas de 14-naftoquinonas Os grupos carbonila
tambeacutem podem estar presente na posiccedilatildeo 12 com menor incidecircncia (Loacutepez 2014)
9
Figura 4 Estrutura quiacutemica da 12-naftoquinona (1) e 14-naftoquinona (2)
Entre as quinonas estatildeo compostos biologicamente importantes tais como o grupo da
vitamina K e a coenzima Q (ubiquinona) Estes compostos tecircm um papel importante no
metabolismo celular especialmente como carreadores de eleacutetrons Aleacutem de quinonas que
possuam uma funccedilatildeo bioloacutegica outros compostos desta classe tecircm sido encontrados
mostrando atividade antibioacutetica Alguns deles estatildeo presentes na natureza mas a maior parte
satildeo obtidos sinteticamente entre eles 2-hidroxi-3-alquil-14-naftoquinonas que possuem
evidecircncias de serem ativos in vitro contra os parasitas da malaacuteria e como coccidiostaacuteticos
(Ambrogi 1970)
A atividade bioloacutegica de quinonas estaacute muitas vezes relacionada com o seu
comportamento eletroquiacutemico A capacidade de aceitar um ou dois eleacutetrons para formar o
acircnion radical correspondente ou dianion pode ser o motivo da induccedilatildeo da formaccedilatildeo de
espeacutecies reativas de oxigecircnio responsaacuteveis pelo estresse oxidativo nas ceacutelulas A capacidade
de aceitar eleacutetrons de naftoquinonas pode ser alterada por mudanccedilas de posiccedilatildeo do grupo
carbonila (12- 14-naftoquinonas) ou diferentes substituintes ou funccedilotildees associadas agrave porccedilatildeo
de naftoquinona (Francisco 2010)
As naftoquinonas satildeo largamente encontradas em plantas micro-organismos e alguns
animais Estes compostos tecircm sido amplamente utilizados em diversas culturas como corantes
para cosmeacuteticos tecidos alimentos (Brandelli 2004) e para fins medicinais incluindo
antitumoral (Oliveira 1990 Ferreira 1996) anti-inflamatoacuterios antimalaacuterico antiviral
(Fonseca 2003 Hussain 2007) atibacterianos e antifuacutengicos (Nagata 1998) Estas atividades
bioloacutegicas tecircm justificado o grande nuacutemero de trabalhos (aproximadamente 42 ateacute abril 2016
ndash Pubmed) encontrados na literatura que visa a siacutentese e avaliaccedilatildeo de qualquer das quinonas
naturais ou seus anaacutelogos como agentes farmacoloacutegicos potenciais (Rahmoun 2013)
10
O Lapachol foi descoberto e estudado desde o seacuteculo XIX Foi isolado primeiramente
do lenho da aacutervore argentina ldquolapachordquo Tabebuia avellanedae (Bignoniaceae) conhecida
como Ipecirc roxo Os estudos quiacutemicos foram desenvolvidos inicialmente em 1892 (Fonseca
2003) O lapachol foi descrito pela primeira vez por Paterno em 1821 tendo sua estrutura
quiacutemica estabelecida em 1896 por Hooker que o identificou como uma naftoquinona Esta
naftoquinona possui accedilatildeo antiinflamatoacuteria analgeacutesica antibioacutetica e anti-neoplaacutesica
reconhecida (Arauacutejo 2002)
A β-lapachona (34-di-hidro-22-dimetil-2H-naptho [12-b] pirano-56-diona) eacute uma
quinona obtida de fontes naturais derivada da aacutervore Lapacho (Tabebuia avellanedae) nativa
da Ameacuterica do Sul e Central A siacutentese e quiacutemica da β-lapachona e compostos relacionados
foi inicialmente investigado no final do seacuteculo XIX e iniacutecio do seacuteculo XX pelo quiacutemico
Samuel Hooker Apesar de alguns estudos cliacutenicos sobre a bioatividade de naftoquinonas
terem sido relatados no iniacutecio de 1940 foi o relatoacuterio do potencial da β-lapachona como um
agente anti-tripanossoma em 1977 que revitalizou o estudo e caracterizaccedilatildeo deste composto
natural A β-lapachona tambeacutem apresenta vaacuterias accedilotildees farmacoloacutegicas incluindo accedilatildeo
formaccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (Hussain 2007)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do Lapachol (1) da α- Lapachona (2) e da β-
Lapachona (Fonseca et al 2003 Ferreira et al 2010)
11
Figura 6 Tabebuia avellanedae (Hussain 2007)
A β-lapachona eacute uma substacircncia natural facilmente obtida a partir do lapachol Esta
naftoquinona eacute o grande destaque desta classe de substacircncias porque se encontra em testes
cliacutenicos de fase II para o tratamento do cacircncer de pacircncreas (Ferreira 2010) O mecanismo de
accedilatildeo da β-lapachona diferencia-se de outros antineoplaacutesicos por atuar na topoisomerase I
promovendo a recuperaccedilatildeo da capacidade de apoptose celular Alguns estudos reportam sua
accedilatildeo sineacutergica de potenciaccedilatildeo com o Taxolreg
promovendo a inibiccedilatildeo em diferentes pontos de
replicaccedilatildeo celular aleacutem de sua combinaccedilatildeo com outros tratamentos como a aplicaccedilatildeo de
radiaccedilatildeo ionizante (Cunha 2005)
Vaacuterios estudos jaacute foram publicados demonstrando a atividade antiviral de
naftoquinonas naturais e sinteacuteticas A β-lapachona inibe seletivamente a replicaccedilatildeo do viacuterus
HIV-1 atuando na inibiccedilatildeo da enzima LTR117 Da mesma forma este composto eacute um
potente inibidor da enzima transcriptase reversa dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e
leucemia murina de Rauscher (RLV) inibindo tambeacutem a DNA polimerase A accedilatildeo inibitoacuteria
sobre estas enzimas revelou-se especiacutefica se comparada com a de outros inibidores
conhecidos (Silva 2003)
O Lapachol jaacute demonstrou atividade contra certas cepas virais incluindo Herpes virus
tipos I e II Outras naftoquinonas jaacute mostraram eficaacutecia contra cepas de Influenza virus
Poliomielite virus e estomatite vesicular Supotildee-se que o mecanismo de accedilatildeo destas quinonas
seja atraveacutes da inibiccedilatildeo da transcriptase reversa de retroviacuterus e da RNA polimerase Eacute relatado
12
que lapachol diminui a replicaccedilatildeo do viacuterus em seres humanos mas ainda natildeo existem
resultados de testes cliacutenicos disponiacuteveis (Hussain 2007)
Na avaliaccedilatildeo da atividade antiviral do Lapachol in vitro verificou-se que esta
substacircncia eacute ativa contra viacuterus RNA atuando tanto sobre viacuterus envelopados quanto sobre
partiacuteculas sem esta estrutura em concentraccedilotildees de 5 a 10 microgmL e ainda apresentou uma
pequena atividade sobre HSV (Herpes simplex I) e Ad5 (Adeno tipo 5) mas nenhuma
atividade sobre CoxB4 (Coxsackie B4) Em trabalho posterior demonstrou-se que nem o
Lapachol nem diversos dos seus derivados apresentaram atividade antiviral in vitro sobre
Poliovirus tipo 1 Ecovirus 19 e Coxsackie B tipo 4 Apenas os derivados 12-naftoquinonicos
e um intermediaacuterio da siacutentese Hoocker foram ativos contra o Echovirus 19 (Fonseca 2003)
Costa et al (2013) relataram que piranonaftoquinonas isocircmeras do lapachol possuem
atividade de inibiccedilatildeo da replicaccedilatildeo de DENV-2 atuando sobre a atividade da ATPase de NS3
(proteiacutena natildeo estrutural de DENV)
A utilizaccedilatildeo de testes in vitro por meio de ensaios de viabilidade celular constitui o
primeiro passo para a avaliaccedilatildeo da compatibilidade bioloacutegica de uma substacircncia e pode
fornecer elementos importantes para a anaacutelise da biocompatibilidade dos diferentes materiais
Para ser considerado natildeo citotoacutexico no teste de citotoxicidade in vitro um produto natildeo deve
ocasionar a morte das ceacutelulas nem afetar suas funccedilotildees celulares A prova do MTT eacute um dos
indicadores colorimeacutetricos de viabilidade celular mais utilizados sendo capaz de avaliar a
funccedilatildeo celular mitocondrial de acordo com a reduccedilatildeo enzimaacutetica do sal de tetrazoacutelio pelas
desidrogenases mitocondriais nas ceacutelulas viaacutevies (Arauacutejo et al 2008) Supotildee-se que o
mecanismo responsaacutevel pela citotoxicidade apresentada pelas quinonas esteja relacionado
com o estresse oxidativo causado por esses compostos poreacutem a capacidade de alquilaccedilatildeo de
nucleoacutefilos celulares tambeacutem representa correlaccedilatildeo com tais efeitos bioloacutegicos (Goulart
2004)
13
II JUSTIFICATIVA
14
2 JUSTIFICATIVA
Aleacutem do controle do mosquito transmissor e do desenvolvimento de vacinas que tem
sido exaustivamente estudado nos uacuteltimos anos uma alternativa para o combate agrave dengue
seria o desenvolvimento de faacutermacos para reduzir a viremia ou mesmo para controlar a
resposta imune do hospedeiro agrave infecccedilatildeo que tem sido apontada como principal fator de risco
nos casos mais graves Em funccedilatildeo disso o nuacutemero de pesquisas visando o desenvolvimento
de drogas com accedilatildeo antiviral ou com accedilatildeo imunomodulatoacuteria tem aumentado
significativamente As naftoquinonas vecircm ganhando bastante importacircncia na pesquisa de
novas drogas antivirais devido agrave algumas atividades apresentadas A szlig-lapachona-orto-
naftoquinona por exemplo se mostrou um potente inibidor da enzima transcriptase reversa
dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e leucemia murina de Rauscher (RLV)
Diante da inexistecircncia de drogas com accedilatildeo anti DENV e o elevado nuacutemero e casos da
patogenia nos uacuteltimos anos a organizaccedilatildeo mundial da sauacutede classificou a Dengue como uma
epidemia de proporccedilotildees globais e um problema de sauacutede puacuteblica Como as naftoquinonas jaacute
demonstraram na literatura possuir um potencial efeito terapecircutico contra alguns viacuterus eacute
possiacutevel que estes compostos possam apresentar atividade antiviral contra DENV Portanto
este trabalho visou atraveacutes de ensaios de MTT e titulaccedilotildees virais em placa avaliar a potencial
atividade antiviral de oito compostos derivados de naftoquinonas naturais e sinteacuteticas
15
III OBJETIVOS
16
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar oito compostos (2 naturais e 6 sinteacuteticos) derivados de naftoquinonas como potenciais
agentes antivirais em ceacutelulas BHK-21 frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1 e 2
32 Objetivos especiacuteficos
1 Calcular o iacutendice de citotoxicidade e a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) dos compostos
atraveacutes de ensaio de reduccedilatildeo de MTT
2 Avaliar os efeitos dos compostos sobre o crescimento a viabilidade e o volume celular
pela teacutecnica de exclusatildeo do azul de tripan
3 Determinar a multiplicidade de infecccedilatildeo de DENV 1 e 2 a ser utilizada nos ensaios
antivirais
4 Avaliar a atividade antiviral dos compostos frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1
e 2 atraveacutes do ensaio de MTT
5 Verificar um possiacutevel efeito direto dos compostos agraves partiacuteculas virais de Dengue virus
6 Quantificar a produccedilatildeo de partiacuteculas virais infecciosas no sobrenadante de ceacutelulas
infectadas atraveacutes de titulaccedilatildeo viral pela contagem de unidades formadoras de placas
17
IV MATERIAL E MEacuteTODOS
18
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Linhagens celulares
411 Ceacutelulas C636
As ceacutelulas C636 satildeo ceacutelulas de linhagem contiacutenua de larvas de mosquito Aedes
albopictus Estas ceacutelulas foram utilizadas na produccedilatildeo de estoque viral de DENV sorotipos 1
e 2 para isso foram mantidas em meio de cultura Leibovitz-15 (L-15) (Cultilab)
suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (Cultilab) antibioacuteticos (Penicilina 100 UmL
Streptomicina 100 microgmL) e antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL) a 28degC
412 Ceacutelulas BHK-21
As ceacutelulas BHK-21 satildeo fibroblastos de linhagem contiacutenua derivados de rim de hamster
neonato Estas ceacutelulas foram utilizadas para os experimentos in vitro e para as titulaccedilotildees de
DENV 1 e 2 para isso foram mantidas em meio miacutenimo essencial modificado por Dulbecco
ndash DMEM (Cultilab) suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (SFB) com antibioacuteticos
(Penicilina 100 UmL Streptomicina 100 microgmL) e com antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL)
sendo mantidas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5
42 Viacuterus
421 DENV 1 e DENV 2
O Sorotipo 1 do Dengue virus (DENV-1) estirpe Mochizuki foi replicado em ceacutelulas
C636 para gerar estoques de trabalho durante 2 e 5 dias a 28degC O sobrenadante da cultura de
ceacutelulas infectadas foi recolhido e clarificado por centrifugaccedilatildeo a 4000 G durante 10 minutos agrave
4degC e entatildeo foi aliquotado e armazenado a -70 deg C como reserva de viacuterus ateacute agrave sua utilizaccedilatildeo
A replicaccedilatildeo geraccedilatildeo de estoque e titulaccedilatildeo do Sorotipo 2 do Dengue virus (DENV-2)
estirpe Nova Guineacute C ocorreu nos mesmos moldes do DENV-1
19
422 Titulaccedilatildeo viral
Os estoques virais foram diluiacutedos (10-1
a 10-7
) e inoculados em monocamadas de
ceacutelulas BHK-21 implantadas em placas de 6 poccedilos com confluecircncia de aproximadamente
60 (3x105 ceacutelulas por poccedilo) sendo um poccedilo natildeo infectado mantido para controle celular
Apoacutes uma hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus foram adicionados 3 mL de meio DMEM (Cultilab)
suplementado com 15 de SFB e contendo 15 de Carboximetilcelulose (CMC Synth) As
placas foram entatildeo incubadas a 37degC (CO2 a 5) por 96 horas As ceacutelulas foram entatildeo
fixadas com 2 mL de soluccedilatildeo de formol a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo
1 (pv) de cristal violeta em PBS para contagem das placas de lise O tiacutetulo viral foi
expresso atraveacutes do nuacutemero de unidades formadoras de placa por mL (UFPmL) segundo a
formula abaixo representada
Tiacutetulo viral (UFPmL) = N x FC x 10
N = nuacutemero de placas de lise contadas
FC = Fator de correccedilatildeo
= Inverso da diluiccedilatildeo na qual foram contadas as placas de lise
43 Compostos de naftoquinonas
Os compostos utilizados neste estudo foram fornecidos pelo Dr Geraldo Ceacutelio
Brandatildeo do laboratoacuterio de pesquisa da Escola de Farmaacutecia da Universidade Federal de Ouro
Preto
20
Tabela 1 Relaccedilatildeo de nome estrutura e coacutedigo dos compostos utilizados Na tabela estatildeo
presentes a relaccedilatildeo dos nomes dos compostos utilizados neste trabalho bem como sua
estrutura Os coacutedigos representantes de cada composto seratildeo utilizados no decorrer da escrita
Nome do composto Estrutura Coacutedigo
Lapachol
A1
β-lapachona
A2
2-Hidroxi-3-(ββ-dimetilvinil)-14-naftoquinona
A3
2-Cloro-14-naftoquinona
A4
Lapachol derivado 1
A5
Lapachol derivado 2 A6
Lapachol derivado 3 A7
Lapachol derivado 4 A8
44 Ensaio de citotoxicidade
Para avaliar a citotoxicidade dos compostos ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas foram incubadas com diferentes concentraccedilotildees dos compostos em triplicata num
volume de 200 microL de meio de cultura por poccedilo na presenccedila de 1 de SFB Os controles natildeo
tratados apresentaram adiccedilatildeo de 200 microL de meio de cultura As ceacutelulas foram entatildeo incubadas
durante 72 horas O meio foi removido e 28 microL de soluccedilatildeo de 5 mg mL MTT (brometo de 3-
21
[45-dimetil-tiazol-2-il]-25 difeniltertrazoacutelio) foi adicionado a cada poccedilo As placas foram re-
incubadas durante 1 hora e 30 minutos e entatildeo 122 microL de DMSO foi adicionado a cada poccedilo e
placas foram agitadas suavemente durante 15 minutos para dissolver os cristais de formazan
A absorbacircncia foi lida em um equipamento leitor de placas Victor X3 (PerkinElmer) a 490
nm A concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC 50) foi definida como a concentraccedilatildeo da amostra que
reduziu a viabilidade celular de 50 em comparaccedilatildeo com controles natildeo tratados Os dados
foram analisados utilizando o programa Prisma
45 Avaliaccedilatildeo da viabilidade e crescimento celular por exclusatildeo de azul de tripan
Ceacutelulas BHK-21 foram cultivadas em placas de 24 poccedilos (7x104 ceacutelulaspoccedilo) e apoacutes
24 horas foram tratadas com as concentraccedilotildees de uso de cada composto e incubadas por 72
horas na presenccedila de 1 de SFB A seguir as ceacutelulas foram tripsinizadas e incubadas com
azul de tripan e entatildeo foi utilizado um contador automatizado de ceacutelulas (Countess II FL
Automated Cell Counter ndash Thermo Fisher Scientific) para contagem das ceacutelulas e avaliaccedilatildeo da
porcentagem de viabilidade e diacircmetro celular do controle nos tempos de 0 24 e 96 horas e
avaliaccedilatildeo dos mesmos paracircmetros para os compostos no tempo de 96 horas (72 horas poacutes
tratamento)
Outra curva de multiplicaccedilatildeo celular foi feita para os compostos A1 A3 A4 e A5 onde as
ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos no momento da confecccedilatildeo da placa e
foram avaliados os mesmos paracircmetros nos tempos de 0 12 24 48 e 72 horas O
equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
46 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
Para determinar a menor Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) responsaacutevel pela letalidade
celular total 2x104 de ceacutelulas BHK-21 foram semeadas em placa de 96 poccedilos Apoacutes a
incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o
meio de cultura foi removido e as ceacutelulas foram expostas a diferentes diluiccedilotildees dos dois
sorotipos de DENV (100 microL de cada diluiccedilatildeo + 100 microL de meio DEMEM 1 SFB) As
diluiccedilotildees seriadas foram realizadas da suspensatildeo viral na razatildeo de 5 para o primeiro poccedilo e de
2 para os demais poccedilos Apoacutes 72 horas as ceacutelulas foram entatildeo fixadas com 200 microL de soluccedilatildeo
22
formalina a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo 1 (pv) de cristal violeta em
PBS para avaliaccedilatildeo da maior diluiccedilatildeo responsaacutevel pela letalidade de 100 das ceacutelulas
47 Ensaio Dose-resposta
Para cada composto foram realizados ensaios de dose-resposta para definiccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de cada composto capaz de promover a reduccedilatildeo na produccedilatildeo viral A atividade
antiviral foi avaliada tambeacutem pelo meacutetodo de MTT Ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas expostas a diferentes concentraccedilotildees dos extratos determinadas a partir das maiores
concentraccedilotildees em que natildeo foram observados efeitos citotoacutexicos As ceacutelulas foram tratadas
com as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de cada composto e em seguida infectadas com DENV
1 (MOI= 5) ou 2 (MOI= 2) Mantendo uma coluna para controle com DMSO uma coluna
para controle de viacuterus uma coluna para controle de citotoxicidade dos compostos e por fim
uma coluna para controle celular As ceacutelulas foram entatildeo incubadas durante 72 horas Apoacutes
este tempo procedeu-se a leitura pelo ensaio de MTT como descrito anteriormente Os dados
foram analisados levando-se em consideraccedilatildeo a leitura das absorbacircncias dos poccedilos dos
controles de viacuterus e do controle celular
Para realizacao destes experimentos os seguintes controles foram adotados
Controle de ceacutelulas poccedilos contendo somente ceacutelulas acrescidas do meio de cultura DMEM
1 SFB Utilizado para avaliar o comportamento das ceacutelulas sem que as mesmas tivessem
contato com qualquer interferente durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo Com isso os poccedilos
reservados para esse controle serviram de padratildeo para comparaccedilatildeo com aqueles em que fosse
observada atividade citotoacutexica ou citopaacutetica
Controle de viacuterus poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM 1 SFB
sem nenhum tratamento e de suspensatildeo de viacuterus Utilizando como referecircncia para anaacutelise da
atividade citopaacutetica provocada pelo viacuterus testado durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo das placas
23
Controle de viacuterus com DMSO Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura
DMEM 1 SFB e DMSO Foi utilizado para avaliar se havia influecircncia prejudicial do
solvente utilizado para diluiccedilatildeo das amostras no meio de cultivo das ceacutelulas e se o mesmo
poderia apresentar alguma potencial atividade antiviral aparente
Controle de citotoxicidade Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM
1 SFB e as quatro principais concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos Foi utilizado
para avaliar se haveria alguma possiacutevel atividade citotoacutexica das concentraccedilotildees dos compostos
em relaccedilatildeo agraves ceacutelulas
48 Ensaio Virucida
Para a realizaccedilatildeo deste ensaio aliacutequotas de 950 microL (diluiccedilatildeo de 20 vezes) do DENV 1 (tiacutetulo
6 x 107 UFPmL) foram incubadas com 50 microL de uma soluccedilatildeo de meio DMEM preparada
com 20x a concentraccedilatildeo natildeo citotoacutexica de cada composto A1 a A8 em banho-maria 37deg C
por 1 hora Apoacutes a incubaccedilatildeo as aliacutequotas foram imediatamente tituladas em ceacutelulas BHK-21
em placas de 6 poccedilos utilizando-se 3 diluiccedilotildees para cada incubaccedilatildeo (20x 20 x 10-1
e 20 x 10-
2) Foram titulados tambeacutem uma aliacutequota incubada apenas com meio DMEM sem nenhum
tratamento e outra aliacutequota incubada com DMSO (Dimetilsulfoacutexido) Estas foram tituladas
utilizando um controle e mais cinco diluiccedilotildees (20x 20 x 10-1
20 x 10-2
20 x 10-3
e 20 x 10-4
)
49 Ensaio antiviral
Neste ensaio ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em placas de 24 poccedilos no dia
seguinte foram tratadas durante 4 horas com as concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas de cada
composto em duplicata Apoacutes o preacute-tratamento as monocamadas foram infectadas com
DENV-1 a uma MOI=5 na presenccedila das concentraccedilotildees de uso respectivas de cada composto
Apoacutes 1 hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus as monocamadas foram lavadas duas vezes com PBS e
foi adicionado 500 microL por poccedilo de meio preparado com as mesmas concentraccedilotildees dos
diferentes compostos e mantidos durante 48 horas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5 Em
quatro poccedilos as ceacutelulas foram infectadas e natildeo tratadas e em outros quatro poccedilos as ceacutelulas
natildeo foram tratadas e nem infectadas (controle de ceacutelulas) destes uacuteltimos dois foram
tripsinizados e contados no momento da infecccedilatildeo e os outros dois apoacutes o teacutermino do ensaio
24
para avaliar o crescimento celular Decorridas as 48 horas o sobrenadante foi coletado e
centrifugado por 10 minutos a 4000 xG para separaccedilatildeo dos debris celulares e prontamente
titulado em placa de 6 poccedilos
410 Anaacutelise estatiacutestica
Os valores de CC50 foram obtidos a partir de anaacutelise de regressatildeo linear das curvas de
concentraccedilatildeocitotoxicidade A anaacutelise estatiacutestica dos dados foi realizada pelo programa
GraphPad Prism software Uma anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi utilizada para determinar
as diferenccedilas estatiacutesticas seguida do poacutes teste de Tukey A significacircncia estatiacutestica foi fixada
em p lt005
25
V RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
26
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Ensaio de citotoxicidade celular
Para avaliar a viabilidade da linhagem celular BHK-21 frente ao tratamento com oito
diferentes concentraccedilotildees dos compostos (A1 a A8) realizou-se um ensaio de MTT (brometo
de 3-[45-dimetil-tiazol-2-il]-25-difeniltetrazoacutelio) Este ensaio tem o objetivo de quantificar
espectrofotometricamente o crescimento celular a viabilidade e proliferaccedilatildeo podendo ser
utilizado como um indicador direto de citotoxicidade Trata-se de um ensaio colorimeacutetrico
para medir a atividade da redutase mitocondrial em ceacutelulas vivas Ele se baseia na reduccedilatildeo do
sal amarelo tetrazoacutelio (permeaacutevel agrave membrana celular) para cristais de formazan azuis
puacuterpura por ceacutelulas metabolicamente ativas a quantidade de formazan gerada medida por
espectrofotometria eacute proporcional ao nuacutemero de ceacutelulas viaacuteveis
A CC50 foi calculada plotando-se uma curva de porcentagem de viabilidade celular por
concentraccedilatildeo melhor representada na figura 7 pelo composto A7 e os resultados de CC50
para todos os compostos estatildeo representados na tabela 2 Foram feitos ensaios de
citotoxicidade com oito concentraccedilotildees diferentes sendo escolhida a maior concentraccedilatildeo que
natildeo apresentou citotoxicidade
Viabilidade Celular = [ ( A ndash B ) A ] x 100
Onde
A = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas natildeo tratadas
B = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas tratadas com
as respectivas concentraccedilotildees de cada composto
27
28
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (A curva dose resposta do composto A7 eacute a que
melhor representa a curva dose resposta esperada) Avaliou-se a viabilidade da linhagem
celular BHK-21 frente agrave diferentes concentraccedilotildees dos compostos realizando o ensaio de MTT
e determinando assim as concentraccedilotildees a serem utilizadas nos proacuteximos ensaios bem como
calculando a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) agrave partir da curva
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo
da concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50)
Composto Concentraccedilatildeo utilizada
[ ] microgmL
Concentraccedilatildeo citotoacutexica 50
(CC50) [ ] microgmL plusmn Desvio
Padratildeo
A1 ([ ]=1 mgmL) 00200 10010 plusmn 0014
A2 ([ ]=1 mgmL) 00025 09561 plusmn 0023
A3 ([ ]=1 mgmL) 00025 09988 plusmn 0017
A4 ([ ]=5 mgmL) 00125 10150 plusmn 0036
A5 ([ ]=10 mgmL) 00250 10590 plusmn 0047
A6 ([ ]=5 mgmL) 00250 08183 plusmn 0030
A7 ([ ]=5 mgmL) 00125 10280 plusmn 0052
A8 ([ ]=5 mgmL) 00125 09758 plusmn 0036
52 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan
Para corroborar o ensaio anterior de citotoxicidade utilizou -se o teste de viabilidade
celular pela teacutecnica da exclusatildeo do azul de tripan com a finalidade de determinar a
viabilidade das ceacutelulas Os procedimentos adotados no ensaio seguiram o manual do
equipamento contador automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL Automated Cell Counter) entatildeo
foi acrescentado agrave 10 microL da suspensatildeo celular 10 microL de azul de tripan (04) Apoacutes
homogeneizaccedilatildeo 10 microL da suspensatildeo foi colocada no local indicado da lacircmina proacutepria para
leitura e foi realizada a contagem sendo consideradas mortas (inviaacuteveis) as ceacutelulas que
incorporavam o corante e viaacuteveis as que excluiacuteam o azul de tripan
29
O equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
(A)
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan A avaliaccedilatildeo da
viabilidade celular foi realizada atraveacutes de um contador automaacutetico de ceacutelulas Este
equipamento possibilita explorar ferramentas de fotografia e avaliar alguns paracircmetros
importantes (A) fotografia das ceacutelulas (B) Zoom na fotografia das ceacutelulas com marcaccedilotildees
(em verde para ceacutelulas vivas e vermelho para mortas) e (D) contagem das ceacutelulas totais
ceacutelulas vivas e mortas graacutefico e meacutedia dos diacircmetros celulares das ceacutelulas vivas e mortas
(B)
(C)
30
O crescimento celular de ceacutelulas natildeo tratadas foi avaliado nos tempos de 0h (momento
da confecccedilatildeo da placa) 24h (momento de tratamento com os compostos) e 96 horas
(Momento em que todas as ceacutelulas foram tripsinizadas e contadas) para avaliar o perfil do
crescimento celular em ceacutelulas natildeo tratadas Foi observado um crescimento celular no periacuteodo
de 24 horas onde as ceacutelulas estavam incubadas com meio acrescido de 10 SFB Em 24
horas o meio foi trocado por 1 SFB e acrescido das substacircncias testes nas menores diluiccedilotildees
natildeo citotoacutexicas determinadas pelo ensaio do MTT Em 96 horas pode ser observado um
decaimento no nuacutemero de ceacutelulas vivas provavelmente devido ao crescimento celular (morte
por confluecircncia)
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas)
(A) (B)
31
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas (A)
Contagem de ceacutelulas vivas (B) Percentual de ceacutelulas viaacuteveis (Viabilidade celular ) e (C)
Meacutedia do diacircmetro apresentado pelas ceacutelulas vivas
Em 96 horas as ceacutelulas natildeo tratadas bem como as ceacutelulas tratadas por 72 horas com as
concentraccedilotildees de uso dos compostos foram tripsinizadas e avaliadas quanto ao nuacutemero de
ceacutelulas vivas viabilidade e diacircmetro celular apresentados na figura 10
Segundo se observa natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo aparente que possa demonstrar que
as concentraccedilotildees de uso dos compostos tenham causado alguma atividade citotoacutexica
corroborando assim os ensaios de citotoxicidade anteriores
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
A infectividade de um viacuterus depende de vaacuterios fatores entre eles da proporccedilatildeo de
partiacuteculas virais completas ou infecciosas da suscetibilidade da ceacutelula hospedeira e da
chance desta partiacutecula encontrar o receptor e penetrar na ceacutelula Quando ceacutelulas suscetiacuteveis
satildeo misturadas com uma suspensatildeo de viacuterus estas podem receber uma duas trecircs ou dez
partiacuteculas virais ou nenhuma Isto depende da proporccedilatildeo entre a quantidade de viacuterus
infecciosos presente no inoculo e a quantidade de ceacutelulas utilizada Esta relaccedilatildeo eacute denominada
de multiplicidade de infecccedilatildeo ou MOI Uma MOI=1 indica que a infecccedilatildeo foi feita em
principio com 1 viacuterus ou 1 dose infectante por ceacutelula
A determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo dos Dengue virus 1 e 2 a serem
utilizadas nos proacuteximos ensaios foi feita a partir da infecccedilatildeo de ceacutelulas BHK-21 por diferentes
(C)
32
concentraccedilotildees de viacuterus e revelaccedilatildeo com cristal violeta Escolheu-se a maior diluiccedilatildeo viral que
possibilitou a letalidade total das ceacutelulas (faixa onde todas as ceacutelulas estatildeo mortas utilizando
menor concentraccedilatildeo de viacuterus) As faixas escolhidas foram entatildeo calculadas levando-se em
consideraccedilatildeo o nuacutemero de ceacutelulas presentes no poccedilo e o nuacutemero de partiacuteculas virais que foram
adicionadas (Faixa3 para DENV2 e 2 para DENV1) Figura 11 Foi estipulado portanto a
Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 2 para DENV 2 e 5 para DENV 1
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI A partir da infecccedilatildeo da linhagem celular BHK-21 em
placa de 96 poccedilos com diferentes diluiccedilotildees de DENV foi determinado que a Multiplicidade
de infecccedilatildeo para o Dengue viacuterus sorotipos 1 e 2 seria de 5 e 2 respectivamente (colunas 2 -
DENV1 e 3 - DENV2)
54 Ensaio dose resposta
Apoacutes a determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas ideais realizou-se um
ensaio dose resposta tratando as ceacutelulas com oito concentraccedilotildees agrave partir das concentraccedilotildees natildeo
citotoacutexicas escolhidas para cada composto e em seguida infectando com DENV sorotipos 1 e
2 nas MOIs estipuladas anteriormente (5 e 2 respectivamente) A porcentagem do efeito
protetor conferida agraves ceacutelulas para cada concentraccedilatildeo de amostra testada foi calculada da
seguinte forma
33
EP = [ (A ndash B) (C ndash B) ] x 100
Onde
A Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas tratadas e infectadas
B Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e infectadas
C Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e natildeo infectadas
Este ensaio tem por objetivo identificar a resposta celular agrave infecccedilatildeo frente ao
tratamento com os compostos em diferentes concentraccedilotildees Assim como o ensaio de
toxicidade este ensaio feito utilizando a teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT permite o teste de vaacuterias
concentraccedilotildees diferentes em um menor tempo e com baixo gasto de material
34
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV1
(MOI=5)
35
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV2
(MOI=2)
36
Takegami et al (1998) demonstraram atividade de furanonaftoquinonas contra o viacuterus
da Encefalite Japonesa (Flavivirus) utilizando a concentraccedilatildeo de 3microgmL poreacutem para os
compostos apresentados avaliados pela teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT nenhuma das
concentraccedilotildees apresentadas produziu efeito antiviral significativo em relaccedilatildeo ao controle
celular como observado nas figuras 12 e 13
Apesar da teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT ser interessante como triagem de atividade
antiviral permitindo o teste de vaacuterias concentraccedilotildees dos compostos em menor tempo e
utilizando uma quantidade razoaacutevel de materiais optou-se por utilizar as maiores
concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas encontradas avaliando sua atividade antiviral por outras
teacutecnicas Como natildeo foi avaliada atividade antiviral preacutevia para nenhum dos compostos frente
agrave infecccedilatildeo por DENV1 e 2 foi selecionado o Dengue virus 1 para dar prosseguimento aos
ensaios
55 Ensaio Virucida
O ensaio virucida foi realizado para avaliar um potencial efeito dos compostos
diretamente sobre a partiacutecula viral Este ensaio eacute importante pois possibilita elucidar se o
composto pode produzir algum efeito sobre a partiacutecula viral impedindo que esta possa infectar
as ceacutelulas
Figura 14 Ensaio virucida Neste ensaio as aliacutequotas de DENV1 foram incubadas com as
concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos e titulados (NT) Controle natildeo tratado
37
Tabela 3 Ensaio virucida Caacutelculo do tiacutetulo viral (UFPmL) e porcentagem representante de
cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 254 x 105 100
DMSO 263 x 105 10335
A1 199 x 105 7835
A2 205 x 105 8071
A3 237 x 105 9311
A4 775 x 104 3049
A5 153 x 105 6024
A6 219 x 105 8602
A7 243 x 105 9547
A8 254 x 105 100
Lagrota et al (1988) demonstraram atividade de 2-HO-3-N-benzil-N(N-benzil-2-
etilamina) -14-naftoquinona sobre a partiacutecula viral de enterovirus De forma contraacuteria apesar
de se verificar a reduccedilatildeo de quase uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais
para o composto A4 natildeo considerou-se esta uma alteraccedilatildeo significativa pois devido agrave
magnitude do nuacutemero de UFPs se trata de uma alteraccedilatildeo muito pequena Portanto os
compostos avaliados neste trabalho natildeo produziram atividade virucida aparente frente ao
tratamento com as concentraccedilotildees de uso
56 Ensaio Antiviral
O sobrenadante de ceacutelulas tratadas previamente e infectadas por DENV1 coletado 48
horas poacutes infecccedilatildeo foi avaliado quanto agrave produccedilatildeo viral de partiacuteculas infecciosas pela
contagem de placas de lise e caacutelculo de Unidades Formadoras de Placa (Titulaccedilatildeo viral em
placa ndash UFPmL)
38
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral Sobrenadante de ceacutelulas tratadas e infectadas por DENV1
coletado apoacutes 48 horas e titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado
Tabela 4 Ensaio Antiviral Coleta do sobrenadante de ceacutelulas infectadas por DENV1 Tiacutetulo
viral (UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o
controle natildeo tratado como 100
Ao perceber um aumento no tiacutetulo viral frente ao tratamento com os compostos A1
A2 e A3 e uma reduccedilatildeo frente ao tratamento com A4 A5 e A6 foram escolhidos dois
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 119 x 105 10000
A1 235 x 105 19748
A2 228 x 105 19160
A3 318 x 105 26723
A4 128 x 104 1076
A5 186 x 103 156
A6 190 x 104 1597
A7 280 x 104 2353
A8 350 x 104 2941
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
40
Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
XI
55 Ensaio Virucida 36
56 Ensaio Antiviral 37
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao tratamento com
os compostos A1 A3 A4 e A5 40
6 CONCLUSAtildeO 44
7 PERSPECTIVAS 46
8 REFEREcircNCIAS 48
XII
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Estrutura da partiacutecula viral de Dengue viacuterus 4
Figura 2 Ciclo de multiplicaccedilatildeo de DENV 5
Figura 3 Distribuiccedilatildeo geograacutefica da Dengue 7
Figura 4 Estrutura quiacutemica da 12-naftoquinona (1) e 14-naftoquinona (2) 9
Figura 5 Estrutura quiacutemica do Lapachol (1) da α- Lapachona (2) e da β-Lapachona 10
Figura 6 Tabebuia avellanedae 11
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (Exemplo da curva dose resposta do composto A7) 28
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan 29
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas) 30
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas 31
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI 32
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 34
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 35
Figura 14 Ensaio virucida 36
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral 38
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados 39
Figura 17 Curva de crescimento celular 41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular 41
XIII
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Relaccedilatildeo de nome estrutura e coacutedigo dos compostos utilizados 20
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo da
concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) 28
Tabela 3 Ensaio virucida 37
Tabela 4 Ensaio Antiviral 38
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados 39
XIV
LISTA DE ABREVIATURAS
AMV ndash Mielobastose Aviaacuteria viacuterus (Avian Myeloblastosis virus )
CC50 ndash Concentraccedilatildeo Citotoacutexica 50
DENV ndash Dengue virus
DMEM ndash Meio baacutesico modificado por Dulbecco (Dulbeccos Modified Eagle Medium)
DMSO ndash Dimetilsulfoacutexido
ICTV ndash Comitecirc Inernacional de Taxonomia Viral
JEV ndash Viacuterus da Encefalite Japonesa (Japanese Encephalitis virus)
MOI ndash Multiplicidade de infecccedilatildeo viral
NS ndash Proteiacutenas natildeo estruturais
NT ndash Natildeo Tratado
OMS ndash Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede
RE ndash Retiacuteculo endoplasmaacutetico
RLV ndash Viacuterus da Leucemia Murina de Rauscher (Murine leukemia virus)
SFB ndash Soro Fetal Bovino
UFP ndash Unidades formadoras de placas
WNV ndash Viacuterus do Nilo Ocidental (West Nile virus)
YFV ndash Viacuterus da febre amarela (Yellow fever virus)
ZV ndash Zika virus
1
I INTRODUCcedilAtildeO
2
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Flavivirus
O Gecircnero Flavivirus pertencente agrave famiacutelia Flaviviridae inclui 53 espeacutecies
taxonomicamente reconhecidas (ICTV 2016) muitas das quais satildeo importantes patoacutegenos
humanos tais como o Dengue virus (DENV) Yellow fever virus (YFV - viacuterus da febre
amarela ndash protoacutetipo deste gecircnero) Japanese encephalitis virus (JEV - viacuterus da encefalite
japonesa) West Nile virus (WNV - virus do Nilo Ocidental) Zika virus (ZV) entre outros
(Villordo 2016) O nome flavivirus eacute derivado da palavra latina flavus que significa amarelo
significando a icteriacutecia causada pelo YFV Os sintomas da infecccedilatildeo por flavivirus pode variar
de leve febre e mal-estar a encefalite fatal e febre hemorraacutegica (Mukhopadhyay 2005)
Estes viacuterus regulam o metabolismo e a sobrevivecircncia das ceacutelulas infectadas
assegurando a sua proacutepria reproduccedilatildeo e propagaccedilatildeo O viacuterus da dengue tambeacutem provoca a
autofagia uma resposta homeostaacutetica geral que ajuda a ceacutelula infectada sobreviver e produzir
viacuterus (Datan 2016)
Os Flavivirus podem ser agrupados em complexos e sub-complexos antigecircnicos
baseados em criteacuterios soroloacutegicos ou em grupos clados e espeacutecies segundo a sua filogenia
molecular (Lindenbach 2007) A maioria dos membros deste gecircnero satildeo arbovirus (arthropod
borne virus) ou seja satildeo essencialmente transmitidos por Artroacutepodes (Mackenzie 2004)
onde 27 satildeo transmitidos por mosquitos 12 por carrapatos e 14 natildeo possuem vetor
conhecido Os viacuterus transmitidos pela fecircmea do gecircnero Aedes incluem DENV e YFV satildeo
viscerotroacutepicos e possuem primatas como reservatoacuterio natural (Gaunt 2001)
A patogenia da Dengue causada pelo DENV constitui uma das doenccedilas virais mais
importantes em seres humanos transmitidos por insetos e eacute responsaacutevel por cerca de 390
milhotildees de infecccedilotildees por ano O YFV por sua vez causador da febre amarela eacute endecircmico em
vaacuterios paiacuteses do continente Africano e da Ameacuterica do Sul resultando em 200000 casos e
30000 mortes na Aacutefrica mesmo com vacinas eficazes disponiacuteveis Outras doenccedilas causadas
por flaviviacuterus incluem a encefalite do Nilo Ocidental (West Nile virus) e febre Zika (Zika
virus) que satildeo consideradas doenccedilas emergentes com surtos importantes em todo o mundo
(Villordo 2016)
3
12 Dengue virus
Os DENV pertencem ao gecircnero flaviviacuterus e evoluiram em primatas natildeo-humanos a
partir de um ancestral comum Eacute composto por quatro sorotipos antigenicamente distintos
(DENV1-4) que co-circulam por todo o Sudeste da Aacutesia Aacutefrica e Ameacutericas (McArthur 2013)
e em outubro de 2013 foi anunciado um novo sorotipo circulante denominado entatildeo de DENV
5 (Normile 2013) A partiacutecula infecciosa eacute esfeacuterica com 40-50 nm de diacircmetro possuindo
um envelope de lipopolissacariacutedeo O genoma consiste em RNA de fita simples natildeo
segmentado e senso positivo de aproximadamente 11 kb de comprimento e possui uma uacutenica
janela aberta de leitura (start codon) (Guzman 2010) Apoacutes a traduccedilatildeo a uacutenica poliproteiacutena
formada eacute clivada por proteases virais e celulares em trecircs proteiacutenas estruturais que compotildeem
a partiacutecula viral C (capsideo) prM M (membrana e o seu precursor) e E (envelope) e sete
proteiacutenas natildeo estruturais essenciais para a replicaccedilatildeo viral (NS) (NS1 NS2a NS2b NS3
NS4a NS4b e NS5) (Robertson 2009)
A transmissatildeo do viacuterus ocorre atraveacutes da picada por fecircmeas infectadas de mosquitos
do gecircnero Aedes sendo responsaacutevel pelas maiores taxas de doenccedila e mortalidade entre os
membros do gecircnero Flavivirus (Mukhopadhyay 2005) No Brasil o Aedes aegypti eacute o
principal vetor de dengue enquanto o Aedes albopictus atua como um vector secundaacuterio
(Weaver 2010)
O diagnoacutestico soroloacutegico da Dengue se baseia na detecccedilatildeo de niacuteveis elevados de
anticorpos anti-Dengue-IgM ou anti-Dengue-IgG que reconhecem e se ligam ao antiacutegeno de
DENV A Glicoproteiacutena do envelope (E) uma proteiacutena estrutural de DENV eacute o alvo
antigecircnico mais importante destes anticorpos neutralizantes porque estaacute exposta na superfiacutecie
do viacuterus e medeia os receptores de ligaccedilatildeo e fusatildeo da ceacutelula hospedeira (Lee 2015)
Durante a infecccedilatildeo celular os virions de DENV se ligam agrave superfiacutecie da membrana
atraveacutes da glicoproteiacutena do envelope (E) a receptores especiacuteficos e satildeo internalizados por
endocitose Uma vez dentro do endossoma a acidificaccedilatildeo provocada pela ligaccedilatildeo de
lisossomos desencadeia uma trimerizaccedilatildeo irreversiacutevel da proteiacutena E que atua na fusatildeo das
membranas virais e endossomais celulares Apoacutes essa fusatildeo o nucleocapsideo eacute liberado no
citoplasma onde o mesmo eacute desnudado e a replicaccedilatildeo do genoma de RNA e montagem de
partiacuteculas eacute iniciada As partiacuteculas virais imaturas satildeo acumuladas no luacutemen do retiacuteculo
endoplasmaacutetico (RE) Essas partiacuteculas imaturas que contecircm proteiacutenas prM proteiacutena E
membrana lipiacutedica e nuacutecleo capsiacutedeo natildeo pode induzir a fusatildeo da ceacutelula hospedeira ou seja
4
neste estaacutegio elas natildeo satildeo infecciosas (Mukhopadhyay 2005) O processo de maturaccedilatildeo
desses viacuterus ocorre apoacutes a clivagem proteoliacutetica da proteiacutena precursora de membrana (prM)
transformando viacuterus inerte em partiacuteculas infecciosas (Li 2008) Partiacuteculas subvirais satildeo
tambeacutem produzidas no RE mas apenas contecircm as glicoproteiacutenas de membrana fazendo com
que estas partiacuteculas sejam natildeo infecciosas Os viacuterus maduros e as partiacuteculas sub-virais satildeo
liberados da ceacutelula hospedeira por exocitose (Mukhopadhyay 2005)
Na pele o DENV tende a infectar ceacutelulas dendriacuteticas imaturas Estas ceacutelulas infectadas
amadurecem e migram para os gacircnglios linfaacuteticos regionais ou locais onde apresentam
antiacutegenos virais agraves ceacutelulas T iniciando as respostas imunes Existe tambeacutem evidecircncia de
replicaccedilatildeo abundante de DENV em ceacutelulas do parecircnquima do fiacutegado e em macroacutefagos nos
gacircnglios linfaacuteticos fiacutegado e baccedilo bem como em monoacutecitos de sangue perifeacuterico (Guzman
2010)
Proteiacutena E
(diacutemero)
Proteiacutena
M
Proteiacutena C
ssRNA (+)
Figura 1 Estrutura da partiacutecula viral de Dengue viacuterus A partiacutecula viral eacute composta
por trecircs proteiacutenas estruturais proteiacutena de envelope (E) disposta em diacutemeros a proteiacutena
associada agrave membrana (M) e a proteiacutena do nucleocapsiacutedeo (C) O genoma de RNA fita-
simples de polaridade positiva se encontra dentro do nucleocapsiacutedeo (Adaptado de
httpviralzoneexpasyorgviralzoneall_by_species24html)
5
Figura 2 Ciclo de multiplicaccedilatildeo de DENV A Os viacuterus se ligam aos receptores na superfiacutecie da
ceacutelula e satildeo endocitados B Devido ao baixo pH dentro dos endossomas ocorre a fusatildeo de
membranas viral-celular mediada por proteiacutenas virais resultando na liberaccedilatildeo do RNA viral em um
processo chamado de desnudamento C O genoma viral eacute traduzido em uma uacutenica poliproteiacutena que
eacute processada por proteases do viacuterus e da ceacutelula hospedeira D O RNA eacute replicado por proteiacutenas
natildeo-estruturais do proacuteprio viacuterus E A montagem do viacuterus ocorre na membrana do Reticulo
endoplasmaacutetico no qual a proteiacutena do capsiacutedeo e o RNA viral satildeo envolvidos por glicoproteiacutenas e
pela membrana da organela para formar partiacuteculas virais imaturas F Partiacuteculas virais imaturas
utilizam a via secretora da ceacutelula hospedeira e sob o baixo pH do Complexo de Golgi a proteiacutena
precursora prM eacute clivada em proteiacutena M completando a maturaccedilatildeo do viacuterus GOs viacuterus maduros
satildeo entatildeo liberados das ceacutelulas por exocitose Os nuacutemeros indicados nas caixas coloridas referem-se
ao valor de pH dos respectivos compartimentos Imagem adaptada de PERERA 2009
Adsorccedilatildeo
Siacutentese e processamento
Fusatildeo e
Desnudamento
Replicaccedilatildeo do RNA
Montagem
Maturaccedilatildeo
Liberaccedilatildeo de
viacuterus
maduro
A
B
C
D
E
F
G
6
13 Epidemiologia
Ao longo das uacuteltimas deacutecadas a dengue se tornou a doenccedila viral transmitida por
mosquitos mais prevalente no mundo Estimativas de infecccedilatildeo pela OMS indicam que a
patologia eacute endecircmica em mais de 100 paiacuteses em todos os continentes exceto a Antaacutertida e
aflige principalmente paiacuteses pobres em recursos nas regiotildees tropicais e subtropicais (Perry
2011) Epidemias globais de DENV ocorreram ao longo das uacuteltimas deacutecadas em parte devido
agrave diminuiccedilatildeo dos esforccedilos no controle de mosquitos Satildeo estimados mais de 50 milhotildees de
casos de dengue anualmente (Mukhopadhyay 2005)
A Dengue eacute uma doenccedila viral sistecircmica aguda que se estabeleceu em todo o mundo
em ambos os ciclos de transmissatildeo endecircmicas e epidecircmicas A infecccedilatildeo pelo DENV em seres
humanos eacute frequentemente inaparente mas pode levar a uma grande variedade de
manifestaccedilotildees cliacutenicas de febre leve a siacutendrome do choque da dengue potencialmente fatal A
imunidade vitaliacutecia desenvolvida apoacutes a infecccedilatildeo com um dos quatro tipos de viacuterus eacute
especiacutefica para cada tipo e a progressatildeo para uma doenccedila mais grave eacute frequente mas natildeo
exclusivamente relacionada com infecccedilatildeo secundaacuteria por tipos heteroacutelogos No entanto
enquanto a expansatildeo histoacuterica desta doenccedila eacute bem documentada o elevado fardo de
problemas de sauacutede atribuiacuteveis agrave dengue em grande parte do mundo tropical e sub-tropical
permanecem pouco enumerados (Bhatt 2013)
O Brasil eacute um paiacutes de grande extensatildeo (8512000 km2) situado em uma zona
predominantemente tropical com extensas aacutereas de florestas na regiatildeo amazocircnica bem como
restos de uma floresta tropical na costa leste sudeste e sul entre outros ecossistemas A maior
parte do paiacutes tem um clima tropical e uma grande diversidade de plantas e animais portanto
um local adequado para a ocorrecircncia de patologias causadas por viacuterus transmitidos por
artroacutepodes (Figueiredo 2000) Segundo o boletim epidemioloacutegico do ministeacuterio da sauacutede em
2016 jaacute foram registrados 170103 casos provaacuteveis de dengue no paiacutes ateacute a semana
epidemioloacutegica 5 Nesse periacuteodo a regiatildeo Sudeste registrou o maior nuacutemero de casos
provaacuteveis (96664 casos 568) Em Minas Gerais jaacute foram registradas 19 mortes em
decorrecircncia da Dengue entre 1deg de janeiro e 14 de marccedilo deste ano Outros 91 oacutebitos estatildeo
sob investigaccedilatildeo (BRASIL 2016)
7
Figura 3 Distribuiccedilatildeo geograacutefica da Dengue Aacutereas de risco de transmissatildeo em amarelo
(Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede Adaptado de httpwwwwhointen)
As manifestaccedilotildees da doenccedila foram descritas pela primeira vez apoacutes a Segunda Guerra
Mundial coincidente com o aumento da urbanizaccedilatildeo particularmente na Aacutesia (Weaver 2010)
Atualmente o DENV eacute hiperendecircmico em muitas regiotildees tropicais onde 2 ou mais sorotipos
circulam endemicamente Embora DENV foi provavelmente introduzido periodicamente para
as Ameacutericas atraveacutes de navios desde o seacuteculo 17 o surgimento de DENV no Hemisfeacuterio
Ocidental comeccedilou mais tarde devido a uma campanha de sucesso parcial para erradicar o
vetor A aegypti para controlar a febre amarela Esta campanha teve sucesso na maior parte
das Ameacutericas da deacutecada de 1950 agrave deacutecada de 1970 mas foi interrompida O vetor entatildeo
rapidamente recolonizou quase toda a regiatildeo neotropical e subtropicais e a invasatildeo do DENV
seguiu logo depois Em 1985 A albopictus foi introduzido nos EUA e no Brasil
proporcionando um vetor para a transmissatildeo secundaacuteria de DENV nas Ameacutericas (Hawley
1987)
Os mosquitos vetores principalmente A aegypti tornam-se infectados quando eles se
alimentam do sangue de seres humanos durante o periacuteodo de cinco dias da viremia A
infecccedilatildeo produz um amplo espectro da doenccedila cliacutenica e varia de assintomaacutetica a doenccedila febril
auto-limitante A dengue tambeacutem conhecida como ldquofebre osso quebradordquo devido agraves fortes
dores nas articulaccedilotildees e inclui sintomas de febre alta dores musculares articulares e erupccedilatildeo
cutacircnea Uma pequena porcentagem de indiviacuteduos pode apresentar a siacutendrome do choque da
8
dengue (dengue hemorraacutegica) com risco de vida grave O tratamento eacute amplamente favoraacutevel
usando de reidrataccedilatildeo oral ou intravenosa acompanhamento e atenccedilatildeo meacutedica adequada No
entanto uma das principais consequecircncias da doenccedila eacute a sua capacidade de sobrecarregar
instalaccedilotildees meacutedicas durante um surto e em paiacuteses onde os recursos de sauacutede jaacute estatildeo no
limite isso pode ter efeitos catastroacuteficos Prevenccedilatildeo e tratamento portanto se fazem
altamente necessaacuterios (Perry 2011)
A prevalecircncia global de DENV cresceu drasticamente nas uacuteltimas deacutecadas e ateacute o
momento natildeo haacute nenhum medicamento especiacutefico para combater a infecccedilatildeo as medidas de
prevenccedilatildeo mais eficazes satildeo voltadas para o controle do vetor (Silva 2011) Diante disso a
Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) elegeu o desenvolvimento de vacinas contra o viacuterus da
dengue como prioridade mundial (Kinney 2001) Por conseguinte a busca de substacircncias
naturais ou sinteacuteticas com atividade antiviral especiacutefica sem toxicidade para as ceacutelulas
normais em seres humanos eacute uma estrateacutegia desejada para evitar que a dengue se agrave e
ajudar a controlar a difusatildeo da doenccedila As vaacuterias fases do ciclo viral representam alvos
terapecircuticos individuais que podem ser exploradas (Costa 2013) Nesse sentido vaacuterios
grupos de pesquisa e organizaccedilotildees estatildeo trabalhando com diversas abordagens para o
desenvolvimento de compostos antivirais com atividade protetora contra dengue Dentre elas
uma vasta gama de produtos naturais incluindo plantas numa tentativa de isolar e
caracterizar novos compostos que podem inibir a replicaccedilatildeo do viacuterus ou tratar a infecccedilatildeo
viral Por essa razatildeo extratos e componentes da planta satildeo cada vez mais importantes como
fontes potenciais para agentes antivirais (Silva 2011)
14 Naftoquinonas
As quinonas satildeo compostos aromaacuteticos amplamente distribuiacutedos na natureza e podem
ser encontrados em vaacuterias famiacutelias de plantas bem como isolado de fungos algas e
bacteacuterias Elas satildeo classificadas em benzoquinonas antraquinonas e naftoquinonas de acordo
com as suas estruturas quiacutemicas Naftoquinonas satildeo compostos orgacircnicos altamente reativos
utilizados como corantes naturais ou sinteacuteticos cujas cores variam de amarelo para vermelho
Apresentam cadeia carbocircnica similar ao naftaleno e satildeo caracterizadas por seus dois grupos
carbonila na posiccedilatildeo 1 e 4 por isso satildeo nomeadas de 14-naftoquinonas Os grupos carbonila
tambeacutem podem estar presente na posiccedilatildeo 12 com menor incidecircncia (Loacutepez 2014)
9
Figura 4 Estrutura quiacutemica da 12-naftoquinona (1) e 14-naftoquinona (2)
Entre as quinonas estatildeo compostos biologicamente importantes tais como o grupo da
vitamina K e a coenzima Q (ubiquinona) Estes compostos tecircm um papel importante no
metabolismo celular especialmente como carreadores de eleacutetrons Aleacutem de quinonas que
possuam uma funccedilatildeo bioloacutegica outros compostos desta classe tecircm sido encontrados
mostrando atividade antibioacutetica Alguns deles estatildeo presentes na natureza mas a maior parte
satildeo obtidos sinteticamente entre eles 2-hidroxi-3-alquil-14-naftoquinonas que possuem
evidecircncias de serem ativos in vitro contra os parasitas da malaacuteria e como coccidiostaacuteticos
(Ambrogi 1970)
A atividade bioloacutegica de quinonas estaacute muitas vezes relacionada com o seu
comportamento eletroquiacutemico A capacidade de aceitar um ou dois eleacutetrons para formar o
acircnion radical correspondente ou dianion pode ser o motivo da induccedilatildeo da formaccedilatildeo de
espeacutecies reativas de oxigecircnio responsaacuteveis pelo estresse oxidativo nas ceacutelulas A capacidade
de aceitar eleacutetrons de naftoquinonas pode ser alterada por mudanccedilas de posiccedilatildeo do grupo
carbonila (12- 14-naftoquinonas) ou diferentes substituintes ou funccedilotildees associadas agrave porccedilatildeo
de naftoquinona (Francisco 2010)
As naftoquinonas satildeo largamente encontradas em plantas micro-organismos e alguns
animais Estes compostos tecircm sido amplamente utilizados em diversas culturas como corantes
para cosmeacuteticos tecidos alimentos (Brandelli 2004) e para fins medicinais incluindo
antitumoral (Oliveira 1990 Ferreira 1996) anti-inflamatoacuterios antimalaacuterico antiviral
(Fonseca 2003 Hussain 2007) atibacterianos e antifuacutengicos (Nagata 1998) Estas atividades
bioloacutegicas tecircm justificado o grande nuacutemero de trabalhos (aproximadamente 42 ateacute abril 2016
ndash Pubmed) encontrados na literatura que visa a siacutentese e avaliaccedilatildeo de qualquer das quinonas
naturais ou seus anaacutelogos como agentes farmacoloacutegicos potenciais (Rahmoun 2013)
10
O Lapachol foi descoberto e estudado desde o seacuteculo XIX Foi isolado primeiramente
do lenho da aacutervore argentina ldquolapachordquo Tabebuia avellanedae (Bignoniaceae) conhecida
como Ipecirc roxo Os estudos quiacutemicos foram desenvolvidos inicialmente em 1892 (Fonseca
2003) O lapachol foi descrito pela primeira vez por Paterno em 1821 tendo sua estrutura
quiacutemica estabelecida em 1896 por Hooker que o identificou como uma naftoquinona Esta
naftoquinona possui accedilatildeo antiinflamatoacuteria analgeacutesica antibioacutetica e anti-neoplaacutesica
reconhecida (Arauacutejo 2002)
A β-lapachona (34-di-hidro-22-dimetil-2H-naptho [12-b] pirano-56-diona) eacute uma
quinona obtida de fontes naturais derivada da aacutervore Lapacho (Tabebuia avellanedae) nativa
da Ameacuterica do Sul e Central A siacutentese e quiacutemica da β-lapachona e compostos relacionados
foi inicialmente investigado no final do seacuteculo XIX e iniacutecio do seacuteculo XX pelo quiacutemico
Samuel Hooker Apesar de alguns estudos cliacutenicos sobre a bioatividade de naftoquinonas
terem sido relatados no iniacutecio de 1940 foi o relatoacuterio do potencial da β-lapachona como um
agente anti-tripanossoma em 1977 que revitalizou o estudo e caracterizaccedilatildeo deste composto
natural A β-lapachona tambeacutem apresenta vaacuterias accedilotildees farmacoloacutegicas incluindo accedilatildeo
formaccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (Hussain 2007)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do Lapachol (1) da α- Lapachona (2) e da β-
Lapachona (Fonseca et al 2003 Ferreira et al 2010)
11
Figura 6 Tabebuia avellanedae (Hussain 2007)
A β-lapachona eacute uma substacircncia natural facilmente obtida a partir do lapachol Esta
naftoquinona eacute o grande destaque desta classe de substacircncias porque se encontra em testes
cliacutenicos de fase II para o tratamento do cacircncer de pacircncreas (Ferreira 2010) O mecanismo de
accedilatildeo da β-lapachona diferencia-se de outros antineoplaacutesicos por atuar na topoisomerase I
promovendo a recuperaccedilatildeo da capacidade de apoptose celular Alguns estudos reportam sua
accedilatildeo sineacutergica de potenciaccedilatildeo com o Taxolreg
promovendo a inibiccedilatildeo em diferentes pontos de
replicaccedilatildeo celular aleacutem de sua combinaccedilatildeo com outros tratamentos como a aplicaccedilatildeo de
radiaccedilatildeo ionizante (Cunha 2005)
Vaacuterios estudos jaacute foram publicados demonstrando a atividade antiviral de
naftoquinonas naturais e sinteacuteticas A β-lapachona inibe seletivamente a replicaccedilatildeo do viacuterus
HIV-1 atuando na inibiccedilatildeo da enzima LTR117 Da mesma forma este composto eacute um
potente inibidor da enzima transcriptase reversa dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e
leucemia murina de Rauscher (RLV) inibindo tambeacutem a DNA polimerase A accedilatildeo inibitoacuteria
sobre estas enzimas revelou-se especiacutefica se comparada com a de outros inibidores
conhecidos (Silva 2003)
O Lapachol jaacute demonstrou atividade contra certas cepas virais incluindo Herpes virus
tipos I e II Outras naftoquinonas jaacute mostraram eficaacutecia contra cepas de Influenza virus
Poliomielite virus e estomatite vesicular Supotildee-se que o mecanismo de accedilatildeo destas quinonas
seja atraveacutes da inibiccedilatildeo da transcriptase reversa de retroviacuterus e da RNA polimerase Eacute relatado
12
que lapachol diminui a replicaccedilatildeo do viacuterus em seres humanos mas ainda natildeo existem
resultados de testes cliacutenicos disponiacuteveis (Hussain 2007)
Na avaliaccedilatildeo da atividade antiviral do Lapachol in vitro verificou-se que esta
substacircncia eacute ativa contra viacuterus RNA atuando tanto sobre viacuterus envelopados quanto sobre
partiacuteculas sem esta estrutura em concentraccedilotildees de 5 a 10 microgmL e ainda apresentou uma
pequena atividade sobre HSV (Herpes simplex I) e Ad5 (Adeno tipo 5) mas nenhuma
atividade sobre CoxB4 (Coxsackie B4) Em trabalho posterior demonstrou-se que nem o
Lapachol nem diversos dos seus derivados apresentaram atividade antiviral in vitro sobre
Poliovirus tipo 1 Ecovirus 19 e Coxsackie B tipo 4 Apenas os derivados 12-naftoquinonicos
e um intermediaacuterio da siacutentese Hoocker foram ativos contra o Echovirus 19 (Fonseca 2003)
Costa et al (2013) relataram que piranonaftoquinonas isocircmeras do lapachol possuem
atividade de inibiccedilatildeo da replicaccedilatildeo de DENV-2 atuando sobre a atividade da ATPase de NS3
(proteiacutena natildeo estrutural de DENV)
A utilizaccedilatildeo de testes in vitro por meio de ensaios de viabilidade celular constitui o
primeiro passo para a avaliaccedilatildeo da compatibilidade bioloacutegica de uma substacircncia e pode
fornecer elementos importantes para a anaacutelise da biocompatibilidade dos diferentes materiais
Para ser considerado natildeo citotoacutexico no teste de citotoxicidade in vitro um produto natildeo deve
ocasionar a morte das ceacutelulas nem afetar suas funccedilotildees celulares A prova do MTT eacute um dos
indicadores colorimeacutetricos de viabilidade celular mais utilizados sendo capaz de avaliar a
funccedilatildeo celular mitocondrial de acordo com a reduccedilatildeo enzimaacutetica do sal de tetrazoacutelio pelas
desidrogenases mitocondriais nas ceacutelulas viaacutevies (Arauacutejo et al 2008) Supotildee-se que o
mecanismo responsaacutevel pela citotoxicidade apresentada pelas quinonas esteja relacionado
com o estresse oxidativo causado por esses compostos poreacutem a capacidade de alquilaccedilatildeo de
nucleoacutefilos celulares tambeacutem representa correlaccedilatildeo com tais efeitos bioloacutegicos (Goulart
2004)
13
II JUSTIFICATIVA
14
2 JUSTIFICATIVA
Aleacutem do controle do mosquito transmissor e do desenvolvimento de vacinas que tem
sido exaustivamente estudado nos uacuteltimos anos uma alternativa para o combate agrave dengue
seria o desenvolvimento de faacutermacos para reduzir a viremia ou mesmo para controlar a
resposta imune do hospedeiro agrave infecccedilatildeo que tem sido apontada como principal fator de risco
nos casos mais graves Em funccedilatildeo disso o nuacutemero de pesquisas visando o desenvolvimento
de drogas com accedilatildeo antiviral ou com accedilatildeo imunomodulatoacuteria tem aumentado
significativamente As naftoquinonas vecircm ganhando bastante importacircncia na pesquisa de
novas drogas antivirais devido agrave algumas atividades apresentadas A szlig-lapachona-orto-
naftoquinona por exemplo se mostrou um potente inibidor da enzima transcriptase reversa
dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e leucemia murina de Rauscher (RLV)
Diante da inexistecircncia de drogas com accedilatildeo anti DENV e o elevado nuacutemero e casos da
patogenia nos uacuteltimos anos a organizaccedilatildeo mundial da sauacutede classificou a Dengue como uma
epidemia de proporccedilotildees globais e um problema de sauacutede puacuteblica Como as naftoquinonas jaacute
demonstraram na literatura possuir um potencial efeito terapecircutico contra alguns viacuterus eacute
possiacutevel que estes compostos possam apresentar atividade antiviral contra DENV Portanto
este trabalho visou atraveacutes de ensaios de MTT e titulaccedilotildees virais em placa avaliar a potencial
atividade antiviral de oito compostos derivados de naftoquinonas naturais e sinteacuteticas
15
III OBJETIVOS
16
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar oito compostos (2 naturais e 6 sinteacuteticos) derivados de naftoquinonas como potenciais
agentes antivirais em ceacutelulas BHK-21 frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1 e 2
32 Objetivos especiacuteficos
1 Calcular o iacutendice de citotoxicidade e a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) dos compostos
atraveacutes de ensaio de reduccedilatildeo de MTT
2 Avaliar os efeitos dos compostos sobre o crescimento a viabilidade e o volume celular
pela teacutecnica de exclusatildeo do azul de tripan
3 Determinar a multiplicidade de infecccedilatildeo de DENV 1 e 2 a ser utilizada nos ensaios
antivirais
4 Avaliar a atividade antiviral dos compostos frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1
e 2 atraveacutes do ensaio de MTT
5 Verificar um possiacutevel efeito direto dos compostos agraves partiacuteculas virais de Dengue virus
6 Quantificar a produccedilatildeo de partiacuteculas virais infecciosas no sobrenadante de ceacutelulas
infectadas atraveacutes de titulaccedilatildeo viral pela contagem de unidades formadoras de placas
17
IV MATERIAL E MEacuteTODOS
18
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Linhagens celulares
411 Ceacutelulas C636
As ceacutelulas C636 satildeo ceacutelulas de linhagem contiacutenua de larvas de mosquito Aedes
albopictus Estas ceacutelulas foram utilizadas na produccedilatildeo de estoque viral de DENV sorotipos 1
e 2 para isso foram mantidas em meio de cultura Leibovitz-15 (L-15) (Cultilab)
suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (Cultilab) antibioacuteticos (Penicilina 100 UmL
Streptomicina 100 microgmL) e antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL) a 28degC
412 Ceacutelulas BHK-21
As ceacutelulas BHK-21 satildeo fibroblastos de linhagem contiacutenua derivados de rim de hamster
neonato Estas ceacutelulas foram utilizadas para os experimentos in vitro e para as titulaccedilotildees de
DENV 1 e 2 para isso foram mantidas em meio miacutenimo essencial modificado por Dulbecco
ndash DMEM (Cultilab) suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (SFB) com antibioacuteticos
(Penicilina 100 UmL Streptomicina 100 microgmL) e com antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL)
sendo mantidas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5
42 Viacuterus
421 DENV 1 e DENV 2
O Sorotipo 1 do Dengue virus (DENV-1) estirpe Mochizuki foi replicado em ceacutelulas
C636 para gerar estoques de trabalho durante 2 e 5 dias a 28degC O sobrenadante da cultura de
ceacutelulas infectadas foi recolhido e clarificado por centrifugaccedilatildeo a 4000 G durante 10 minutos agrave
4degC e entatildeo foi aliquotado e armazenado a -70 deg C como reserva de viacuterus ateacute agrave sua utilizaccedilatildeo
A replicaccedilatildeo geraccedilatildeo de estoque e titulaccedilatildeo do Sorotipo 2 do Dengue virus (DENV-2)
estirpe Nova Guineacute C ocorreu nos mesmos moldes do DENV-1
19
422 Titulaccedilatildeo viral
Os estoques virais foram diluiacutedos (10-1
a 10-7
) e inoculados em monocamadas de
ceacutelulas BHK-21 implantadas em placas de 6 poccedilos com confluecircncia de aproximadamente
60 (3x105 ceacutelulas por poccedilo) sendo um poccedilo natildeo infectado mantido para controle celular
Apoacutes uma hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus foram adicionados 3 mL de meio DMEM (Cultilab)
suplementado com 15 de SFB e contendo 15 de Carboximetilcelulose (CMC Synth) As
placas foram entatildeo incubadas a 37degC (CO2 a 5) por 96 horas As ceacutelulas foram entatildeo
fixadas com 2 mL de soluccedilatildeo de formol a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo
1 (pv) de cristal violeta em PBS para contagem das placas de lise O tiacutetulo viral foi
expresso atraveacutes do nuacutemero de unidades formadoras de placa por mL (UFPmL) segundo a
formula abaixo representada
Tiacutetulo viral (UFPmL) = N x FC x 10
N = nuacutemero de placas de lise contadas
FC = Fator de correccedilatildeo
= Inverso da diluiccedilatildeo na qual foram contadas as placas de lise
43 Compostos de naftoquinonas
Os compostos utilizados neste estudo foram fornecidos pelo Dr Geraldo Ceacutelio
Brandatildeo do laboratoacuterio de pesquisa da Escola de Farmaacutecia da Universidade Federal de Ouro
Preto
20
Tabela 1 Relaccedilatildeo de nome estrutura e coacutedigo dos compostos utilizados Na tabela estatildeo
presentes a relaccedilatildeo dos nomes dos compostos utilizados neste trabalho bem como sua
estrutura Os coacutedigos representantes de cada composto seratildeo utilizados no decorrer da escrita
Nome do composto Estrutura Coacutedigo
Lapachol
A1
β-lapachona
A2
2-Hidroxi-3-(ββ-dimetilvinil)-14-naftoquinona
A3
2-Cloro-14-naftoquinona
A4
Lapachol derivado 1
A5
Lapachol derivado 2 A6
Lapachol derivado 3 A7
Lapachol derivado 4 A8
44 Ensaio de citotoxicidade
Para avaliar a citotoxicidade dos compostos ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas foram incubadas com diferentes concentraccedilotildees dos compostos em triplicata num
volume de 200 microL de meio de cultura por poccedilo na presenccedila de 1 de SFB Os controles natildeo
tratados apresentaram adiccedilatildeo de 200 microL de meio de cultura As ceacutelulas foram entatildeo incubadas
durante 72 horas O meio foi removido e 28 microL de soluccedilatildeo de 5 mg mL MTT (brometo de 3-
21
[45-dimetil-tiazol-2-il]-25 difeniltertrazoacutelio) foi adicionado a cada poccedilo As placas foram re-
incubadas durante 1 hora e 30 minutos e entatildeo 122 microL de DMSO foi adicionado a cada poccedilo e
placas foram agitadas suavemente durante 15 minutos para dissolver os cristais de formazan
A absorbacircncia foi lida em um equipamento leitor de placas Victor X3 (PerkinElmer) a 490
nm A concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC 50) foi definida como a concentraccedilatildeo da amostra que
reduziu a viabilidade celular de 50 em comparaccedilatildeo com controles natildeo tratados Os dados
foram analisados utilizando o programa Prisma
45 Avaliaccedilatildeo da viabilidade e crescimento celular por exclusatildeo de azul de tripan
Ceacutelulas BHK-21 foram cultivadas em placas de 24 poccedilos (7x104 ceacutelulaspoccedilo) e apoacutes
24 horas foram tratadas com as concentraccedilotildees de uso de cada composto e incubadas por 72
horas na presenccedila de 1 de SFB A seguir as ceacutelulas foram tripsinizadas e incubadas com
azul de tripan e entatildeo foi utilizado um contador automatizado de ceacutelulas (Countess II FL
Automated Cell Counter ndash Thermo Fisher Scientific) para contagem das ceacutelulas e avaliaccedilatildeo da
porcentagem de viabilidade e diacircmetro celular do controle nos tempos de 0 24 e 96 horas e
avaliaccedilatildeo dos mesmos paracircmetros para os compostos no tempo de 96 horas (72 horas poacutes
tratamento)
Outra curva de multiplicaccedilatildeo celular foi feita para os compostos A1 A3 A4 e A5 onde as
ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos no momento da confecccedilatildeo da placa e
foram avaliados os mesmos paracircmetros nos tempos de 0 12 24 48 e 72 horas O
equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
46 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
Para determinar a menor Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) responsaacutevel pela letalidade
celular total 2x104 de ceacutelulas BHK-21 foram semeadas em placa de 96 poccedilos Apoacutes a
incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o
meio de cultura foi removido e as ceacutelulas foram expostas a diferentes diluiccedilotildees dos dois
sorotipos de DENV (100 microL de cada diluiccedilatildeo + 100 microL de meio DEMEM 1 SFB) As
diluiccedilotildees seriadas foram realizadas da suspensatildeo viral na razatildeo de 5 para o primeiro poccedilo e de
2 para os demais poccedilos Apoacutes 72 horas as ceacutelulas foram entatildeo fixadas com 200 microL de soluccedilatildeo
22
formalina a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo 1 (pv) de cristal violeta em
PBS para avaliaccedilatildeo da maior diluiccedilatildeo responsaacutevel pela letalidade de 100 das ceacutelulas
47 Ensaio Dose-resposta
Para cada composto foram realizados ensaios de dose-resposta para definiccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de cada composto capaz de promover a reduccedilatildeo na produccedilatildeo viral A atividade
antiviral foi avaliada tambeacutem pelo meacutetodo de MTT Ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas expostas a diferentes concentraccedilotildees dos extratos determinadas a partir das maiores
concentraccedilotildees em que natildeo foram observados efeitos citotoacutexicos As ceacutelulas foram tratadas
com as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de cada composto e em seguida infectadas com DENV
1 (MOI= 5) ou 2 (MOI= 2) Mantendo uma coluna para controle com DMSO uma coluna
para controle de viacuterus uma coluna para controle de citotoxicidade dos compostos e por fim
uma coluna para controle celular As ceacutelulas foram entatildeo incubadas durante 72 horas Apoacutes
este tempo procedeu-se a leitura pelo ensaio de MTT como descrito anteriormente Os dados
foram analisados levando-se em consideraccedilatildeo a leitura das absorbacircncias dos poccedilos dos
controles de viacuterus e do controle celular
Para realizacao destes experimentos os seguintes controles foram adotados
Controle de ceacutelulas poccedilos contendo somente ceacutelulas acrescidas do meio de cultura DMEM
1 SFB Utilizado para avaliar o comportamento das ceacutelulas sem que as mesmas tivessem
contato com qualquer interferente durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo Com isso os poccedilos
reservados para esse controle serviram de padratildeo para comparaccedilatildeo com aqueles em que fosse
observada atividade citotoacutexica ou citopaacutetica
Controle de viacuterus poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM 1 SFB
sem nenhum tratamento e de suspensatildeo de viacuterus Utilizando como referecircncia para anaacutelise da
atividade citopaacutetica provocada pelo viacuterus testado durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo das placas
23
Controle de viacuterus com DMSO Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura
DMEM 1 SFB e DMSO Foi utilizado para avaliar se havia influecircncia prejudicial do
solvente utilizado para diluiccedilatildeo das amostras no meio de cultivo das ceacutelulas e se o mesmo
poderia apresentar alguma potencial atividade antiviral aparente
Controle de citotoxicidade Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM
1 SFB e as quatro principais concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos Foi utilizado
para avaliar se haveria alguma possiacutevel atividade citotoacutexica das concentraccedilotildees dos compostos
em relaccedilatildeo agraves ceacutelulas
48 Ensaio Virucida
Para a realizaccedilatildeo deste ensaio aliacutequotas de 950 microL (diluiccedilatildeo de 20 vezes) do DENV 1 (tiacutetulo
6 x 107 UFPmL) foram incubadas com 50 microL de uma soluccedilatildeo de meio DMEM preparada
com 20x a concentraccedilatildeo natildeo citotoacutexica de cada composto A1 a A8 em banho-maria 37deg C
por 1 hora Apoacutes a incubaccedilatildeo as aliacutequotas foram imediatamente tituladas em ceacutelulas BHK-21
em placas de 6 poccedilos utilizando-se 3 diluiccedilotildees para cada incubaccedilatildeo (20x 20 x 10-1
e 20 x 10-
2) Foram titulados tambeacutem uma aliacutequota incubada apenas com meio DMEM sem nenhum
tratamento e outra aliacutequota incubada com DMSO (Dimetilsulfoacutexido) Estas foram tituladas
utilizando um controle e mais cinco diluiccedilotildees (20x 20 x 10-1
20 x 10-2
20 x 10-3
e 20 x 10-4
)
49 Ensaio antiviral
Neste ensaio ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em placas de 24 poccedilos no dia
seguinte foram tratadas durante 4 horas com as concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas de cada
composto em duplicata Apoacutes o preacute-tratamento as monocamadas foram infectadas com
DENV-1 a uma MOI=5 na presenccedila das concentraccedilotildees de uso respectivas de cada composto
Apoacutes 1 hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus as monocamadas foram lavadas duas vezes com PBS e
foi adicionado 500 microL por poccedilo de meio preparado com as mesmas concentraccedilotildees dos
diferentes compostos e mantidos durante 48 horas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5 Em
quatro poccedilos as ceacutelulas foram infectadas e natildeo tratadas e em outros quatro poccedilos as ceacutelulas
natildeo foram tratadas e nem infectadas (controle de ceacutelulas) destes uacuteltimos dois foram
tripsinizados e contados no momento da infecccedilatildeo e os outros dois apoacutes o teacutermino do ensaio
24
para avaliar o crescimento celular Decorridas as 48 horas o sobrenadante foi coletado e
centrifugado por 10 minutos a 4000 xG para separaccedilatildeo dos debris celulares e prontamente
titulado em placa de 6 poccedilos
410 Anaacutelise estatiacutestica
Os valores de CC50 foram obtidos a partir de anaacutelise de regressatildeo linear das curvas de
concentraccedilatildeocitotoxicidade A anaacutelise estatiacutestica dos dados foi realizada pelo programa
GraphPad Prism software Uma anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi utilizada para determinar
as diferenccedilas estatiacutesticas seguida do poacutes teste de Tukey A significacircncia estatiacutestica foi fixada
em p lt005
25
V RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
26
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Ensaio de citotoxicidade celular
Para avaliar a viabilidade da linhagem celular BHK-21 frente ao tratamento com oito
diferentes concentraccedilotildees dos compostos (A1 a A8) realizou-se um ensaio de MTT (brometo
de 3-[45-dimetil-tiazol-2-il]-25-difeniltetrazoacutelio) Este ensaio tem o objetivo de quantificar
espectrofotometricamente o crescimento celular a viabilidade e proliferaccedilatildeo podendo ser
utilizado como um indicador direto de citotoxicidade Trata-se de um ensaio colorimeacutetrico
para medir a atividade da redutase mitocondrial em ceacutelulas vivas Ele se baseia na reduccedilatildeo do
sal amarelo tetrazoacutelio (permeaacutevel agrave membrana celular) para cristais de formazan azuis
puacuterpura por ceacutelulas metabolicamente ativas a quantidade de formazan gerada medida por
espectrofotometria eacute proporcional ao nuacutemero de ceacutelulas viaacuteveis
A CC50 foi calculada plotando-se uma curva de porcentagem de viabilidade celular por
concentraccedilatildeo melhor representada na figura 7 pelo composto A7 e os resultados de CC50
para todos os compostos estatildeo representados na tabela 2 Foram feitos ensaios de
citotoxicidade com oito concentraccedilotildees diferentes sendo escolhida a maior concentraccedilatildeo que
natildeo apresentou citotoxicidade
Viabilidade Celular = [ ( A ndash B ) A ] x 100
Onde
A = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas natildeo tratadas
B = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas tratadas com
as respectivas concentraccedilotildees de cada composto
27
28
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (A curva dose resposta do composto A7 eacute a que
melhor representa a curva dose resposta esperada) Avaliou-se a viabilidade da linhagem
celular BHK-21 frente agrave diferentes concentraccedilotildees dos compostos realizando o ensaio de MTT
e determinando assim as concentraccedilotildees a serem utilizadas nos proacuteximos ensaios bem como
calculando a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) agrave partir da curva
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo
da concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50)
Composto Concentraccedilatildeo utilizada
[ ] microgmL
Concentraccedilatildeo citotoacutexica 50
(CC50) [ ] microgmL plusmn Desvio
Padratildeo
A1 ([ ]=1 mgmL) 00200 10010 plusmn 0014
A2 ([ ]=1 mgmL) 00025 09561 plusmn 0023
A3 ([ ]=1 mgmL) 00025 09988 plusmn 0017
A4 ([ ]=5 mgmL) 00125 10150 plusmn 0036
A5 ([ ]=10 mgmL) 00250 10590 plusmn 0047
A6 ([ ]=5 mgmL) 00250 08183 plusmn 0030
A7 ([ ]=5 mgmL) 00125 10280 plusmn 0052
A8 ([ ]=5 mgmL) 00125 09758 plusmn 0036
52 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan
Para corroborar o ensaio anterior de citotoxicidade utilizou -se o teste de viabilidade
celular pela teacutecnica da exclusatildeo do azul de tripan com a finalidade de determinar a
viabilidade das ceacutelulas Os procedimentos adotados no ensaio seguiram o manual do
equipamento contador automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL Automated Cell Counter) entatildeo
foi acrescentado agrave 10 microL da suspensatildeo celular 10 microL de azul de tripan (04) Apoacutes
homogeneizaccedilatildeo 10 microL da suspensatildeo foi colocada no local indicado da lacircmina proacutepria para
leitura e foi realizada a contagem sendo consideradas mortas (inviaacuteveis) as ceacutelulas que
incorporavam o corante e viaacuteveis as que excluiacuteam o azul de tripan
29
O equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
(A)
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan A avaliaccedilatildeo da
viabilidade celular foi realizada atraveacutes de um contador automaacutetico de ceacutelulas Este
equipamento possibilita explorar ferramentas de fotografia e avaliar alguns paracircmetros
importantes (A) fotografia das ceacutelulas (B) Zoom na fotografia das ceacutelulas com marcaccedilotildees
(em verde para ceacutelulas vivas e vermelho para mortas) e (D) contagem das ceacutelulas totais
ceacutelulas vivas e mortas graacutefico e meacutedia dos diacircmetros celulares das ceacutelulas vivas e mortas
(B)
(C)
30
O crescimento celular de ceacutelulas natildeo tratadas foi avaliado nos tempos de 0h (momento
da confecccedilatildeo da placa) 24h (momento de tratamento com os compostos) e 96 horas
(Momento em que todas as ceacutelulas foram tripsinizadas e contadas) para avaliar o perfil do
crescimento celular em ceacutelulas natildeo tratadas Foi observado um crescimento celular no periacuteodo
de 24 horas onde as ceacutelulas estavam incubadas com meio acrescido de 10 SFB Em 24
horas o meio foi trocado por 1 SFB e acrescido das substacircncias testes nas menores diluiccedilotildees
natildeo citotoacutexicas determinadas pelo ensaio do MTT Em 96 horas pode ser observado um
decaimento no nuacutemero de ceacutelulas vivas provavelmente devido ao crescimento celular (morte
por confluecircncia)
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas)
(A) (B)
31
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas (A)
Contagem de ceacutelulas vivas (B) Percentual de ceacutelulas viaacuteveis (Viabilidade celular ) e (C)
Meacutedia do diacircmetro apresentado pelas ceacutelulas vivas
Em 96 horas as ceacutelulas natildeo tratadas bem como as ceacutelulas tratadas por 72 horas com as
concentraccedilotildees de uso dos compostos foram tripsinizadas e avaliadas quanto ao nuacutemero de
ceacutelulas vivas viabilidade e diacircmetro celular apresentados na figura 10
Segundo se observa natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo aparente que possa demonstrar que
as concentraccedilotildees de uso dos compostos tenham causado alguma atividade citotoacutexica
corroborando assim os ensaios de citotoxicidade anteriores
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
A infectividade de um viacuterus depende de vaacuterios fatores entre eles da proporccedilatildeo de
partiacuteculas virais completas ou infecciosas da suscetibilidade da ceacutelula hospedeira e da
chance desta partiacutecula encontrar o receptor e penetrar na ceacutelula Quando ceacutelulas suscetiacuteveis
satildeo misturadas com uma suspensatildeo de viacuterus estas podem receber uma duas trecircs ou dez
partiacuteculas virais ou nenhuma Isto depende da proporccedilatildeo entre a quantidade de viacuterus
infecciosos presente no inoculo e a quantidade de ceacutelulas utilizada Esta relaccedilatildeo eacute denominada
de multiplicidade de infecccedilatildeo ou MOI Uma MOI=1 indica que a infecccedilatildeo foi feita em
principio com 1 viacuterus ou 1 dose infectante por ceacutelula
A determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo dos Dengue virus 1 e 2 a serem
utilizadas nos proacuteximos ensaios foi feita a partir da infecccedilatildeo de ceacutelulas BHK-21 por diferentes
(C)
32
concentraccedilotildees de viacuterus e revelaccedilatildeo com cristal violeta Escolheu-se a maior diluiccedilatildeo viral que
possibilitou a letalidade total das ceacutelulas (faixa onde todas as ceacutelulas estatildeo mortas utilizando
menor concentraccedilatildeo de viacuterus) As faixas escolhidas foram entatildeo calculadas levando-se em
consideraccedilatildeo o nuacutemero de ceacutelulas presentes no poccedilo e o nuacutemero de partiacuteculas virais que foram
adicionadas (Faixa3 para DENV2 e 2 para DENV1) Figura 11 Foi estipulado portanto a
Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 2 para DENV 2 e 5 para DENV 1
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI A partir da infecccedilatildeo da linhagem celular BHK-21 em
placa de 96 poccedilos com diferentes diluiccedilotildees de DENV foi determinado que a Multiplicidade
de infecccedilatildeo para o Dengue viacuterus sorotipos 1 e 2 seria de 5 e 2 respectivamente (colunas 2 -
DENV1 e 3 - DENV2)
54 Ensaio dose resposta
Apoacutes a determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas ideais realizou-se um
ensaio dose resposta tratando as ceacutelulas com oito concentraccedilotildees agrave partir das concentraccedilotildees natildeo
citotoacutexicas escolhidas para cada composto e em seguida infectando com DENV sorotipos 1 e
2 nas MOIs estipuladas anteriormente (5 e 2 respectivamente) A porcentagem do efeito
protetor conferida agraves ceacutelulas para cada concentraccedilatildeo de amostra testada foi calculada da
seguinte forma
33
EP = [ (A ndash B) (C ndash B) ] x 100
Onde
A Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas tratadas e infectadas
B Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e infectadas
C Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e natildeo infectadas
Este ensaio tem por objetivo identificar a resposta celular agrave infecccedilatildeo frente ao
tratamento com os compostos em diferentes concentraccedilotildees Assim como o ensaio de
toxicidade este ensaio feito utilizando a teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT permite o teste de vaacuterias
concentraccedilotildees diferentes em um menor tempo e com baixo gasto de material
34
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV1
(MOI=5)
35
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV2
(MOI=2)
36
Takegami et al (1998) demonstraram atividade de furanonaftoquinonas contra o viacuterus
da Encefalite Japonesa (Flavivirus) utilizando a concentraccedilatildeo de 3microgmL poreacutem para os
compostos apresentados avaliados pela teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT nenhuma das
concentraccedilotildees apresentadas produziu efeito antiviral significativo em relaccedilatildeo ao controle
celular como observado nas figuras 12 e 13
Apesar da teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT ser interessante como triagem de atividade
antiviral permitindo o teste de vaacuterias concentraccedilotildees dos compostos em menor tempo e
utilizando uma quantidade razoaacutevel de materiais optou-se por utilizar as maiores
concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas encontradas avaliando sua atividade antiviral por outras
teacutecnicas Como natildeo foi avaliada atividade antiviral preacutevia para nenhum dos compostos frente
agrave infecccedilatildeo por DENV1 e 2 foi selecionado o Dengue virus 1 para dar prosseguimento aos
ensaios
55 Ensaio Virucida
O ensaio virucida foi realizado para avaliar um potencial efeito dos compostos
diretamente sobre a partiacutecula viral Este ensaio eacute importante pois possibilita elucidar se o
composto pode produzir algum efeito sobre a partiacutecula viral impedindo que esta possa infectar
as ceacutelulas
Figura 14 Ensaio virucida Neste ensaio as aliacutequotas de DENV1 foram incubadas com as
concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos e titulados (NT) Controle natildeo tratado
37
Tabela 3 Ensaio virucida Caacutelculo do tiacutetulo viral (UFPmL) e porcentagem representante de
cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 254 x 105 100
DMSO 263 x 105 10335
A1 199 x 105 7835
A2 205 x 105 8071
A3 237 x 105 9311
A4 775 x 104 3049
A5 153 x 105 6024
A6 219 x 105 8602
A7 243 x 105 9547
A8 254 x 105 100
Lagrota et al (1988) demonstraram atividade de 2-HO-3-N-benzil-N(N-benzil-2-
etilamina) -14-naftoquinona sobre a partiacutecula viral de enterovirus De forma contraacuteria apesar
de se verificar a reduccedilatildeo de quase uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais
para o composto A4 natildeo considerou-se esta uma alteraccedilatildeo significativa pois devido agrave
magnitude do nuacutemero de UFPs se trata de uma alteraccedilatildeo muito pequena Portanto os
compostos avaliados neste trabalho natildeo produziram atividade virucida aparente frente ao
tratamento com as concentraccedilotildees de uso
56 Ensaio Antiviral
O sobrenadante de ceacutelulas tratadas previamente e infectadas por DENV1 coletado 48
horas poacutes infecccedilatildeo foi avaliado quanto agrave produccedilatildeo viral de partiacuteculas infecciosas pela
contagem de placas de lise e caacutelculo de Unidades Formadoras de Placa (Titulaccedilatildeo viral em
placa ndash UFPmL)
38
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral Sobrenadante de ceacutelulas tratadas e infectadas por DENV1
coletado apoacutes 48 horas e titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado
Tabela 4 Ensaio Antiviral Coleta do sobrenadante de ceacutelulas infectadas por DENV1 Tiacutetulo
viral (UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o
controle natildeo tratado como 100
Ao perceber um aumento no tiacutetulo viral frente ao tratamento com os compostos A1
A2 e A3 e uma reduccedilatildeo frente ao tratamento com A4 A5 e A6 foram escolhidos dois
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 119 x 105 10000
A1 235 x 105 19748
A2 228 x 105 19160
A3 318 x 105 26723
A4 128 x 104 1076
A5 186 x 103 156
A6 190 x 104 1597
A7 280 x 104 2353
A8 350 x 104 2941
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
40
Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
XII
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Estrutura da partiacutecula viral de Dengue viacuterus 4
Figura 2 Ciclo de multiplicaccedilatildeo de DENV 5
Figura 3 Distribuiccedilatildeo geograacutefica da Dengue 7
Figura 4 Estrutura quiacutemica da 12-naftoquinona (1) e 14-naftoquinona (2) 9
Figura 5 Estrutura quiacutemica do Lapachol (1) da α- Lapachona (2) e da β-Lapachona 10
Figura 6 Tabebuia avellanedae 11
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (Exemplo da curva dose resposta do composto A7) 28
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan 29
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas) 30
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas 31
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI 32
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 34
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 35
Figura 14 Ensaio virucida 36
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral 38
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados 39
Figura 17 Curva de crescimento celular 41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular 41
XIII
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Relaccedilatildeo de nome estrutura e coacutedigo dos compostos utilizados 20
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo da
concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) 28
Tabela 3 Ensaio virucida 37
Tabela 4 Ensaio Antiviral 38
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados 39
XIV
LISTA DE ABREVIATURAS
AMV ndash Mielobastose Aviaacuteria viacuterus (Avian Myeloblastosis virus )
CC50 ndash Concentraccedilatildeo Citotoacutexica 50
DENV ndash Dengue virus
DMEM ndash Meio baacutesico modificado por Dulbecco (Dulbeccos Modified Eagle Medium)
DMSO ndash Dimetilsulfoacutexido
ICTV ndash Comitecirc Inernacional de Taxonomia Viral
JEV ndash Viacuterus da Encefalite Japonesa (Japanese Encephalitis virus)
MOI ndash Multiplicidade de infecccedilatildeo viral
NS ndash Proteiacutenas natildeo estruturais
NT ndash Natildeo Tratado
OMS ndash Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede
RE ndash Retiacuteculo endoplasmaacutetico
RLV ndash Viacuterus da Leucemia Murina de Rauscher (Murine leukemia virus)
SFB ndash Soro Fetal Bovino
UFP ndash Unidades formadoras de placas
WNV ndash Viacuterus do Nilo Ocidental (West Nile virus)
YFV ndash Viacuterus da febre amarela (Yellow fever virus)
ZV ndash Zika virus
1
I INTRODUCcedilAtildeO
2
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Flavivirus
O Gecircnero Flavivirus pertencente agrave famiacutelia Flaviviridae inclui 53 espeacutecies
taxonomicamente reconhecidas (ICTV 2016) muitas das quais satildeo importantes patoacutegenos
humanos tais como o Dengue virus (DENV) Yellow fever virus (YFV - viacuterus da febre
amarela ndash protoacutetipo deste gecircnero) Japanese encephalitis virus (JEV - viacuterus da encefalite
japonesa) West Nile virus (WNV - virus do Nilo Ocidental) Zika virus (ZV) entre outros
(Villordo 2016) O nome flavivirus eacute derivado da palavra latina flavus que significa amarelo
significando a icteriacutecia causada pelo YFV Os sintomas da infecccedilatildeo por flavivirus pode variar
de leve febre e mal-estar a encefalite fatal e febre hemorraacutegica (Mukhopadhyay 2005)
Estes viacuterus regulam o metabolismo e a sobrevivecircncia das ceacutelulas infectadas
assegurando a sua proacutepria reproduccedilatildeo e propagaccedilatildeo O viacuterus da dengue tambeacutem provoca a
autofagia uma resposta homeostaacutetica geral que ajuda a ceacutelula infectada sobreviver e produzir
viacuterus (Datan 2016)
Os Flavivirus podem ser agrupados em complexos e sub-complexos antigecircnicos
baseados em criteacuterios soroloacutegicos ou em grupos clados e espeacutecies segundo a sua filogenia
molecular (Lindenbach 2007) A maioria dos membros deste gecircnero satildeo arbovirus (arthropod
borne virus) ou seja satildeo essencialmente transmitidos por Artroacutepodes (Mackenzie 2004)
onde 27 satildeo transmitidos por mosquitos 12 por carrapatos e 14 natildeo possuem vetor
conhecido Os viacuterus transmitidos pela fecircmea do gecircnero Aedes incluem DENV e YFV satildeo
viscerotroacutepicos e possuem primatas como reservatoacuterio natural (Gaunt 2001)
A patogenia da Dengue causada pelo DENV constitui uma das doenccedilas virais mais
importantes em seres humanos transmitidos por insetos e eacute responsaacutevel por cerca de 390
milhotildees de infecccedilotildees por ano O YFV por sua vez causador da febre amarela eacute endecircmico em
vaacuterios paiacuteses do continente Africano e da Ameacuterica do Sul resultando em 200000 casos e
30000 mortes na Aacutefrica mesmo com vacinas eficazes disponiacuteveis Outras doenccedilas causadas
por flaviviacuterus incluem a encefalite do Nilo Ocidental (West Nile virus) e febre Zika (Zika
virus) que satildeo consideradas doenccedilas emergentes com surtos importantes em todo o mundo
(Villordo 2016)
3
12 Dengue virus
Os DENV pertencem ao gecircnero flaviviacuterus e evoluiram em primatas natildeo-humanos a
partir de um ancestral comum Eacute composto por quatro sorotipos antigenicamente distintos
(DENV1-4) que co-circulam por todo o Sudeste da Aacutesia Aacutefrica e Ameacutericas (McArthur 2013)
e em outubro de 2013 foi anunciado um novo sorotipo circulante denominado entatildeo de DENV
5 (Normile 2013) A partiacutecula infecciosa eacute esfeacuterica com 40-50 nm de diacircmetro possuindo
um envelope de lipopolissacariacutedeo O genoma consiste em RNA de fita simples natildeo
segmentado e senso positivo de aproximadamente 11 kb de comprimento e possui uma uacutenica
janela aberta de leitura (start codon) (Guzman 2010) Apoacutes a traduccedilatildeo a uacutenica poliproteiacutena
formada eacute clivada por proteases virais e celulares em trecircs proteiacutenas estruturais que compotildeem
a partiacutecula viral C (capsideo) prM M (membrana e o seu precursor) e E (envelope) e sete
proteiacutenas natildeo estruturais essenciais para a replicaccedilatildeo viral (NS) (NS1 NS2a NS2b NS3
NS4a NS4b e NS5) (Robertson 2009)
A transmissatildeo do viacuterus ocorre atraveacutes da picada por fecircmeas infectadas de mosquitos
do gecircnero Aedes sendo responsaacutevel pelas maiores taxas de doenccedila e mortalidade entre os
membros do gecircnero Flavivirus (Mukhopadhyay 2005) No Brasil o Aedes aegypti eacute o
principal vetor de dengue enquanto o Aedes albopictus atua como um vector secundaacuterio
(Weaver 2010)
O diagnoacutestico soroloacutegico da Dengue se baseia na detecccedilatildeo de niacuteveis elevados de
anticorpos anti-Dengue-IgM ou anti-Dengue-IgG que reconhecem e se ligam ao antiacutegeno de
DENV A Glicoproteiacutena do envelope (E) uma proteiacutena estrutural de DENV eacute o alvo
antigecircnico mais importante destes anticorpos neutralizantes porque estaacute exposta na superfiacutecie
do viacuterus e medeia os receptores de ligaccedilatildeo e fusatildeo da ceacutelula hospedeira (Lee 2015)
Durante a infecccedilatildeo celular os virions de DENV se ligam agrave superfiacutecie da membrana
atraveacutes da glicoproteiacutena do envelope (E) a receptores especiacuteficos e satildeo internalizados por
endocitose Uma vez dentro do endossoma a acidificaccedilatildeo provocada pela ligaccedilatildeo de
lisossomos desencadeia uma trimerizaccedilatildeo irreversiacutevel da proteiacutena E que atua na fusatildeo das
membranas virais e endossomais celulares Apoacutes essa fusatildeo o nucleocapsideo eacute liberado no
citoplasma onde o mesmo eacute desnudado e a replicaccedilatildeo do genoma de RNA e montagem de
partiacuteculas eacute iniciada As partiacuteculas virais imaturas satildeo acumuladas no luacutemen do retiacuteculo
endoplasmaacutetico (RE) Essas partiacuteculas imaturas que contecircm proteiacutenas prM proteiacutena E
membrana lipiacutedica e nuacutecleo capsiacutedeo natildeo pode induzir a fusatildeo da ceacutelula hospedeira ou seja
4
neste estaacutegio elas natildeo satildeo infecciosas (Mukhopadhyay 2005) O processo de maturaccedilatildeo
desses viacuterus ocorre apoacutes a clivagem proteoliacutetica da proteiacutena precursora de membrana (prM)
transformando viacuterus inerte em partiacuteculas infecciosas (Li 2008) Partiacuteculas subvirais satildeo
tambeacutem produzidas no RE mas apenas contecircm as glicoproteiacutenas de membrana fazendo com
que estas partiacuteculas sejam natildeo infecciosas Os viacuterus maduros e as partiacuteculas sub-virais satildeo
liberados da ceacutelula hospedeira por exocitose (Mukhopadhyay 2005)
Na pele o DENV tende a infectar ceacutelulas dendriacuteticas imaturas Estas ceacutelulas infectadas
amadurecem e migram para os gacircnglios linfaacuteticos regionais ou locais onde apresentam
antiacutegenos virais agraves ceacutelulas T iniciando as respostas imunes Existe tambeacutem evidecircncia de
replicaccedilatildeo abundante de DENV em ceacutelulas do parecircnquima do fiacutegado e em macroacutefagos nos
gacircnglios linfaacuteticos fiacutegado e baccedilo bem como em monoacutecitos de sangue perifeacuterico (Guzman
2010)
Proteiacutena E
(diacutemero)
Proteiacutena
M
Proteiacutena C
ssRNA (+)
Figura 1 Estrutura da partiacutecula viral de Dengue viacuterus A partiacutecula viral eacute composta
por trecircs proteiacutenas estruturais proteiacutena de envelope (E) disposta em diacutemeros a proteiacutena
associada agrave membrana (M) e a proteiacutena do nucleocapsiacutedeo (C) O genoma de RNA fita-
simples de polaridade positiva se encontra dentro do nucleocapsiacutedeo (Adaptado de
httpviralzoneexpasyorgviralzoneall_by_species24html)
5
Figura 2 Ciclo de multiplicaccedilatildeo de DENV A Os viacuterus se ligam aos receptores na superfiacutecie da
ceacutelula e satildeo endocitados B Devido ao baixo pH dentro dos endossomas ocorre a fusatildeo de
membranas viral-celular mediada por proteiacutenas virais resultando na liberaccedilatildeo do RNA viral em um
processo chamado de desnudamento C O genoma viral eacute traduzido em uma uacutenica poliproteiacutena que
eacute processada por proteases do viacuterus e da ceacutelula hospedeira D O RNA eacute replicado por proteiacutenas
natildeo-estruturais do proacuteprio viacuterus E A montagem do viacuterus ocorre na membrana do Reticulo
endoplasmaacutetico no qual a proteiacutena do capsiacutedeo e o RNA viral satildeo envolvidos por glicoproteiacutenas e
pela membrana da organela para formar partiacuteculas virais imaturas F Partiacuteculas virais imaturas
utilizam a via secretora da ceacutelula hospedeira e sob o baixo pH do Complexo de Golgi a proteiacutena
precursora prM eacute clivada em proteiacutena M completando a maturaccedilatildeo do viacuterus GOs viacuterus maduros
satildeo entatildeo liberados das ceacutelulas por exocitose Os nuacutemeros indicados nas caixas coloridas referem-se
ao valor de pH dos respectivos compartimentos Imagem adaptada de PERERA 2009
Adsorccedilatildeo
Siacutentese e processamento
Fusatildeo e
Desnudamento
Replicaccedilatildeo do RNA
Montagem
Maturaccedilatildeo
Liberaccedilatildeo de
viacuterus
maduro
A
B
C
D
E
F
G
6
13 Epidemiologia
Ao longo das uacuteltimas deacutecadas a dengue se tornou a doenccedila viral transmitida por
mosquitos mais prevalente no mundo Estimativas de infecccedilatildeo pela OMS indicam que a
patologia eacute endecircmica em mais de 100 paiacuteses em todos os continentes exceto a Antaacutertida e
aflige principalmente paiacuteses pobres em recursos nas regiotildees tropicais e subtropicais (Perry
2011) Epidemias globais de DENV ocorreram ao longo das uacuteltimas deacutecadas em parte devido
agrave diminuiccedilatildeo dos esforccedilos no controle de mosquitos Satildeo estimados mais de 50 milhotildees de
casos de dengue anualmente (Mukhopadhyay 2005)
A Dengue eacute uma doenccedila viral sistecircmica aguda que se estabeleceu em todo o mundo
em ambos os ciclos de transmissatildeo endecircmicas e epidecircmicas A infecccedilatildeo pelo DENV em seres
humanos eacute frequentemente inaparente mas pode levar a uma grande variedade de
manifestaccedilotildees cliacutenicas de febre leve a siacutendrome do choque da dengue potencialmente fatal A
imunidade vitaliacutecia desenvolvida apoacutes a infecccedilatildeo com um dos quatro tipos de viacuterus eacute
especiacutefica para cada tipo e a progressatildeo para uma doenccedila mais grave eacute frequente mas natildeo
exclusivamente relacionada com infecccedilatildeo secundaacuteria por tipos heteroacutelogos No entanto
enquanto a expansatildeo histoacuterica desta doenccedila eacute bem documentada o elevado fardo de
problemas de sauacutede atribuiacuteveis agrave dengue em grande parte do mundo tropical e sub-tropical
permanecem pouco enumerados (Bhatt 2013)
O Brasil eacute um paiacutes de grande extensatildeo (8512000 km2) situado em uma zona
predominantemente tropical com extensas aacutereas de florestas na regiatildeo amazocircnica bem como
restos de uma floresta tropical na costa leste sudeste e sul entre outros ecossistemas A maior
parte do paiacutes tem um clima tropical e uma grande diversidade de plantas e animais portanto
um local adequado para a ocorrecircncia de patologias causadas por viacuterus transmitidos por
artroacutepodes (Figueiredo 2000) Segundo o boletim epidemioloacutegico do ministeacuterio da sauacutede em
2016 jaacute foram registrados 170103 casos provaacuteveis de dengue no paiacutes ateacute a semana
epidemioloacutegica 5 Nesse periacuteodo a regiatildeo Sudeste registrou o maior nuacutemero de casos
provaacuteveis (96664 casos 568) Em Minas Gerais jaacute foram registradas 19 mortes em
decorrecircncia da Dengue entre 1deg de janeiro e 14 de marccedilo deste ano Outros 91 oacutebitos estatildeo
sob investigaccedilatildeo (BRASIL 2016)
7
Figura 3 Distribuiccedilatildeo geograacutefica da Dengue Aacutereas de risco de transmissatildeo em amarelo
(Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede Adaptado de httpwwwwhointen)
As manifestaccedilotildees da doenccedila foram descritas pela primeira vez apoacutes a Segunda Guerra
Mundial coincidente com o aumento da urbanizaccedilatildeo particularmente na Aacutesia (Weaver 2010)
Atualmente o DENV eacute hiperendecircmico em muitas regiotildees tropicais onde 2 ou mais sorotipos
circulam endemicamente Embora DENV foi provavelmente introduzido periodicamente para
as Ameacutericas atraveacutes de navios desde o seacuteculo 17 o surgimento de DENV no Hemisfeacuterio
Ocidental comeccedilou mais tarde devido a uma campanha de sucesso parcial para erradicar o
vetor A aegypti para controlar a febre amarela Esta campanha teve sucesso na maior parte
das Ameacutericas da deacutecada de 1950 agrave deacutecada de 1970 mas foi interrompida O vetor entatildeo
rapidamente recolonizou quase toda a regiatildeo neotropical e subtropicais e a invasatildeo do DENV
seguiu logo depois Em 1985 A albopictus foi introduzido nos EUA e no Brasil
proporcionando um vetor para a transmissatildeo secundaacuteria de DENV nas Ameacutericas (Hawley
1987)
Os mosquitos vetores principalmente A aegypti tornam-se infectados quando eles se
alimentam do sangue de seres humanos durante o periacuteodo de cinco dias da viremia A
infecccedilatildeo produz um amplo espectro da doenccedila cliacutenica e varia de assintomaacutetica a doenccedila febril
auto-limitante A dengue tambeacutem conhecida como ldquofebre osso quebradordquo devido agraves fortes
dores nas articulaccedilotildees e inclui sintomas de febre alta dores musculares articulares e erupccedilatildeo
cutacircnea Uma pequena porcentagem de indiviacuteduos pode apresentar a siacutendrome do choque da
8
dengue (dengue hemorraacutegica) com risco de vida grave O tratamento eacute amplamente favoraacutevel
usando de reidrataccedilatildeo oral ou intravenosa acompanhamento e atenccedilatildeo meacutedica adequada No
entanto uma das principais consequecircncias da doenccedila eacute a sua capacidade de sobrecarregar
instalaccedilotildees meacutedicas durante um surto e em paiacuteses onde os recursos de sauacutede jaacute estatildeo no
limite isso pode ter efeitos catastroacuteficos Prevenccedilatildeo e tratamento portanto se fazem
altamente necessaacuterios (Perry 2011)
A prevalecircncia global de DENV cresceu drasticamente nas uacuteltimas deacutecadas e ateacute o
momento natildeo haacute nenhum medicamento especiacutefico para combater a infecccedilatildeo as medidas de
prevenccedilatildeo mais eficazes satildeo voltadas para o controle do vetor (Silva 2011) Diante disso a
Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) elegeu o desenvolvimento de vacinas contra o viacuterus da
dengue como prioridade mundial (Kinney 2001) Por conseguinte a busca de substacircncias
naturais ou sinteacuteticas com atividade antiviral especiacutefica sem toxicidade para as ceacutelulas
normais em seres humanos eacute uma estrateacutegia desejada para evitar que a dengue se agrave e
ajudar a controlar a difusatildeo da doenccedila As vaacuterias fases do ciclo viral representam alvos
terapecircuticos individuais que podem ser exploradas (Costa 2013) Nesse sentido vaacuterios
grupos de pesquisa e organizaccedilotildees estatildeo trabalhando com diversas abordagens para o
desenvolvimento de compostos antivirais com atividade protetora contra dengue Dentre elas
uma vasta gama de produtos naturais incluindo plantas numa tentativa de isolar e
caracterizar novos compostos que podem inibir a replicaccedilatildeo do viacuterus ou tratar a infecccedilatildeo
viral Por essa razatildeo extratos e componentes da planta satildeo cada vez mais importantes como
fontes potenciais para agentes antivirais (Silva 2011)
14 Naftoquinonas
As quinonas satildeo compostos aromaacuteticos amplamente distribuiacutedos na natureza e podem
ser encontrados em vaacuterias famiacutelias de plantas bem como isolado de fungos algas e
bacteacuterias Elas satildeo classificadas em benzoquinonas antraquinonas e naftoquinonas de acordo
com as suas estruturas quiacutemicas Naftoquinonas satildeo compostos orgacircnicos altamente reativos
utilizados como corantes naturais ou sinteacuteticos cujas cores variam de amarelo para vermelho
Apresentam cadeia carbocircnica similar ao naftaleno e satildeo caracterizadas por seus dois grupos
carbonila na posiccedilatildeo 1 e 4 por isso satildeo nomeadas de 14-naftoquinonas Os grupos carbonila
tambeacutem podem estar presente na posiccedilatildeo 12 com menor incidecircncia (Loacutepez 2014)
9
Figura 4 Estrutura quiacutemica da 12-naftoquinona (1) e 14-naftoquinona (2)
Entre as quinonas estatildeo compostos biologicamente importantes tais como o grupo da
vitamina K e a coenzima Q (ubiquinona) Estes compostos tecircm um papel importante no
metabolismo celular especialmente como carreadores de eleacutetrons Aleacutem de quinonas que
possuam uma funccedilatildeo bioloacutegica outros compostos desta classe tecircm sido encontrados
mostrando atividade antibioacutetica Alguns deles estatildeo presentes na natureza mas a maior parte
satildeo obtidos sinteticamente entre eles 2-hidroxi-3-alquil-14-naftoquinonas que possuem
evidecircncias de serem ativos in vitro contra os parasitas da malaacuteria e como coccidiostaacuteticos
(Ambrogi 1970)
A atividade bioloacutegica de quinonas estaacute muitas vezes relacionada com o seu
comportamento eletroquiacutemico A capacidade de aceitar um ou dois eleacutetrons para formar o
acircnion radical correspondente ou dianion pode ser o motivo da induccedilatildeo da formaccedilatildeo de
espeacutecies reativas de oxigecircnio responsaacuteveis pelo estresse oxidativo nas ceacutelulas A capacidade
de aceitar eleacutetrons de naftoquinonas pode ser alterada por mudanccedilas de posiccedilatildeo do grupo
carbonila (12- 14-naftoquinonas) ou diferentes substituintes ou funccedilotildees associadas agrave porccedilatildeo
de naftoquinona (Francisco 2010)
As naftoquinonas satildeo largamente encontradas em plantas micro-organismos e alguns
animais Estes compostos tecircm sido amplamente utilizados em diversas culturas como corantes
para cosmeacuteticos tecidos alimentos (Brandelli 2004) e para fins medicinais incluindo
antitumoral (Oliveira 1990 Ferreira 1996) anti-inflamatoacuterios antimalaacuterico antiviral
(Fonseca 2003 Hussain 2007) atibacterianos e antifuacutengicos (Nagata 1998) Estas atividades
bioloacutegicas tecircm justificado o grande nuacutemero de trabalhos (aproximadamente 42 ateacute abril 2016
ndash Pubmed) encontrados na literatura que visa a siacutentese e avaliaccedilatildeo de qualquer das quinonas
naturais ou seus anaacutelogos como agentes farmacoloacutegicos potenciais (Rahmoun 2013)
10
O Lapachol foi descoberto e estudado desde o seacuteculo XIX Foi isolado primeiramente
do lenho da aacutervore argentina ldquolapachordquo Tabebuia avellanedae (Bignoniaceae) conhecida
como Ipecirc roxo Os estudos quiacutemicos foram desenvolvidos inicialmente em 1892 (Fonseca
2003) O lapachol foi descrito pela primeira vez por Paterno em 1821 tendo sua estrutura
quiacutemica estabelecida em 1896 por Hooker que o identificou como uma naftoquinona Esta
naftoquinona possui accedilatildeo antiinflamatoacuteria analgeacutesica antibioacutetica e anti-neoplaacutesica
reconhecida (Arauacutejo 2002)
A β-lapachona (34-di-hidro-22-dimetil-2H-naptho [12-b] pirano-56-diona) eacute uma
quinona obtida de fontes naturais derivada da aacutervore Lapacho (Tabebuia avellanedae) nativa
da Ameacuterica do Sul e Central A siacutentese e quiacutemica da β-lapachona e compostos relacionados
foi inicialmente investigado no final do seacuteculo XIX e iniacutecio do seacuteculo XX pelo quiacutemico
Samuel Hooker Apesar de alguns estudos cliacutenicos sobre a bioatividade de naftoquinonas
terem sido relatados no iniacutecio de 1940 foi o relatoacuterio do potencial da β-lapachona como um
agente anti-tripanossoma em 1977 que revitalizou o estudo e caracterizaccedilatildeo deste composto
natural A β-lapachona tambeacutem apresenta vaacuterias accedilotildees farmacoloacutegicas incluindo accedilatildeo
formaccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (Hussain 2007)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do Lapachol (1) da α- Lapachona (2) e da β-
Lapachona (Fonseca et al 2003 Ferreira et al 2010)
11
Figura 6 Tabebuia avellanedae (Hussain 2007)
A β-lapachona eacute uma substacircncia natural facilmente obtida a partir do lapachol Esta
naftoquinona eacute o grande destaque desta classe de substacircncias porque se encontra em testes
cliacutenicos de fase II para o tratamento do cacircncer de pacircncreas (Ferreira 2010) O mecanismo de
accedilatildeo da β-lapachona diferencia-se de outros antineoplaacutesicos por atuar na topoisomerase I
promovendo a recuperaccedilatildeo da capacidade de apoptose celular Alguns estudos reportam sua
accedilatildeo sineacutergica de potenciaccedilatildeo com o Taxolreg
promovendo a inibiccedilatildeo em diferentes pontos de
replicaccedilatildeo celular aleacutem de sua combinaccedilatildeo com outros tratamentos como a aplicaccedilatildeo de
radiaccedilatildeo ionizante (Cunha 2005)
Vaacuterios estudos jaacute foram publicados demonstrando a atividade antiviral de
naftoquinonas naturais e sinteacuteticas A β-lapachona inibe seletivamente a replicaccedilatildeo do viacuterus
HIV-1 atuando na inibiccedilatildeo da enzima LTR117 Da mesma forma este composto eacute um
potente inibidor da enzima transcriptase reversa dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e
leucemia murina de Rauscher (RLV) inibindo tambeacutem a DNA polimerase A accedilatildeo inibitoacuteria
sobre estas enzimas revelou-se especiacutefica se comparada com a de outros inibidores
conhecidos (Silva 2003)
O Lapachol jaacute demonstrou atividade contra certas cepas virais incluindo Herpes virus
tipos I e II Outras naftoquinonas jaacute mostraram eficaacutecia contra cepas de Influenza virus
Poliomielite virus e estomatite vesicular Supotildee-se que o mecanismo de accedilatildeo destas quinonas
seja atraveacutes da inibiccedilatildeo da transcriptase reversa de retroviacuterus e da RNA polimerase Eacute relatado
12
que lapachol diminui a replicaccedilatildeo do viacuterus em seres humanos mas ainda natildeo existem
resultados de testes cliacutenicos disponiacuteveis (Hussain 2007)
Na avaliaccedilatildeo da atividade antiviral do Lapachol in vitro verificou-se que esta
substacircncia eacute ativa contra viacuterus RNA atuando tanto sobre viacuterus envelopados quanto sobre
partiacuteculas sem esta estrutura em concentraccedilotildees de 5 a 10 microgmL e ainda apresentou uma
pequena atividade sobre HSV (Herpes simplex I) e Ad5 (Adeno tipo 5) mas nenhuma
atividade sobre CoxB4 (Coxsackie B4) Em trabalho posterior demonstrou-se que nem o
Lapachol nem diversos dos seus derivados apresentaram atividade antiviral in vitro sobre
Poliovirus tipo 1 Ecovirus 19 e Coxsackie B tipo 4 Apenas os derivados 12-naftoquinonicos
e um intermediaacuterio da siacutentese Hoocker foram ativos contra o Echovirus 19 (Fonseca 2003)
Costa et al (2013) relataram que piranonaftoquinonas isocircmeras do lapachol possuem
atividade de inibiccedilatildeo da replicaccedilatildeo de DENV-2 atuando sobre a atividade da ATPase de NS3
(proteiacutena natildeo estrutural de DENV)
A utilizaccedilatildeo de testes in vitro por meio de ensaios de viabilidade celular constitui o
primeiro passo para a avaliaccedilatildeo da compatibilidade bioloacutegica de uma substacircncia e pode
fornecer elementos importantes para a anaacutelise da biocompatibilidade dos diferentes materiais
Para ser considerado natildeo citotoacutexico no teste de citotoxicidade in vitro um produto natildeo deve
ocasionar a morte das ceacutelulas nem afetar suas funccedilotildees celulares A prova do MTT eacute um dos
indicadores colorimeacutetricos de viabilidade celular mais utilizados sendo capaz de avaliar a
funccedilatildeo celular mitocondrial de acordo com a reduccedilatildeo enzimaacutetica do sal de tetrazoacutelio pelas
desidrogenases mitocondriais nas ceacutelulas viaacutevies (Arauacutejo et al 2008) Supotildee-se que o
mecanismo responsaacutevel pela citotoxicidade apresentada pelas quinonas esteja relacionado
com o estresse oxidativo causado por esses compostos poreacutem a capacidade de alquilaccedilatildeo de
nucleoacutefilos celulares tambeacutem representa correlaccedilatildeo com tais efeitos bioloacutegicos (Goulart
2004)
13
II JUSTIFICATIVA
14
2 JUSTIFICATIVA
Aleacutem do controle do mosquito transmissor e do desenvolvimento de vacinas que tem
sido exaustivamente estudado nos uacuteltimos anos uma alternativa para o combate agrave dengue
seria o desenvolvimento de faacutermacos para reduzir a viremia ou mesmo para controlar a
resposta imune do hospedeiro agrave infecccedilatildeo que tem sido apontada como principal fator de risco
nos casos mais graves Em funccedilatildeo disso o nuacutemero de pesquisas visando o desenvolvimento
de drogas com accedilatildeo antiviral ou com accedilatildeo imunomodulatoacuteria tem aumentado
significativamente As naftoquinonas vecircm ganhando bastante importacircncia na pesquisa de
novas drogas antivirais devido agrave algumas atividades apresentadas A szlig-lapachona-orto-
naftoquinona por exemplo se mostrou um potente inibidor da enzima transcriptase reversa
dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e leucemia murina de Rauscher (RLV)
Diante da inexistecircncia de drogas com accedilatildeo anti DENV e o elevado nuacutemero e casos da
patogenia nos uacuteltimos anos a organizaccedilatildeo mundial da sauacutede classificou a Dengue como uma
epidemia de proporccedilotildees globais e um problema de sauacutede puacuteblica Como as naftoquinonas jaacute
demonstraram na literatura possuir um potencial efeito terapecircutico contra alguns viacuterus eacute
possiacutevel que estes compostos possam apresentar atividade antiviral contra DENV Portanto
este trabalho visou atraveacutes de ensaios de MTT e titulaccedilotildees virais em placa avaliar a potencial
atividade antiviral de oito compostos derivados de naftoquinonas naturais e sinteacuteticas
15
III OBJETIVOS
16
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar oito compostos (2 naturais e 6 sinteacuteticos) derivados de naftoquinonas como potenciais
agentes antivirais em ceacutelulas BHK-21 frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1 e 2
32 Objetivos especiacuteficos
1 Calcular o iacutendice de citotoxicidade e a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) dos compostos
atraveacutes de ensaio de reduccedilatildeo de MTT
2 Avaliar os efeitos dos compostos sobre o crescimento a viabilidade e o volume celular
pela teacutecnica de exclusatildeo do azul de tripan
3 Determinar a multiplicidade de infecccedilatildeo de DENV 1 e 2 a ser utilizada nos ensaios
antivirais
4 Avaliar a atividade antiviral dos compostos frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1
e 2 atraveacutes do ensaio de MTT
5 Verificar um possiacutevel efeito direto dos compostos agraves partiacuteculas virais de Dengue virus
6 Quantificar a produccedilatildeo de partiacuteculas virais infecciosas no sobrenadante de ceacutelulas
infectadas atraveacutes de titulaccedilatildeo viral pela contagem de unidades formadoras de placas
17
IV MATERIAL E MEacuteTODOS
18
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Linhagens celulares
411 Ceacutelulas C636
As ceacutelulas C636 satildeo ceacutelulas de linhagem contiacutenua de larvas de mosquito Aedes
albopictus Estas ceacutelulas foram utilizadas na produccedilatildeo de estoque viral de DENV sorotipos 1
e 2 para isso foram mantidas em meio de cultura Leibovitz-15 (L-15) (Cultilab)
suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (Cultilab) antibioacuteticos (Penicilina 100 UmL
Streptomicina 100 microgmL) e antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL) a 28degC
412 Ceacutelulas BHK-21
As ceacutelulas BHK-21 satildeo fibroblastos de linhagem contiacutenua derivados de rim de hamster
neonato Estas ceacutelulas foram utilizadas para os experimentos in vitro e para as titulaccedilotildees de
DENV 1 e 2 para isso foram mantidas em meio miacutenimo essencial modificado por Dulbecco
ndash DMEM (Cultilab) suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (SFB) com antibioacuteticos
(Penicilina 100 UmL Streptomicina 100 microgmL) e com antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL)
sendo mantidas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5
42 Viacuterus
421 DENV 1 e DENV 2
O Sorotipo 1 do Dengue virus (DENV-1) estirpe Mochizuki foi replicado em ceacutelulas
C636 para gerar estoques de trabalho durante 2 e 5 dias a 28degC O sobrenadante da cultura de
ceacutelulas infectadas foi recolhido e clarificado por centrifugaccedilatildeo a 4000 G durante 10 minutos agrave
4degC e entatildeo foi aliquotado e armazenado a -70 deg C como reserva de viacuterus ateacute agrave sua utilizaccedilatildeo
A replicaccedilatildeo geraccedilatildeo de estoque e titulaccedilatildeo do Sorotipo 2 do Dengue virus (DENV-2)
estirpe Nova Guineacute C ocorreu nos mesmos moldes do DENV-1
19
422 Titulaccedilatildeo viral
Os estoques virais foram diluiacutedos (10-1
a 10-7
) e inoculados em monocamadas de
ceacutelulas BHK-21 implantadas em placas de 6 poccedilos com confluecircncia de aproximadamente
60 (3x105 ceacutelulas por poccedilo) sendo um poccedilo natildeo infectado mantido para controle celular
Apoacutes uma hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus foram adicionados 3 mL de meio DMEM (Cultilab)
suplementado com 15 de SFB e contendo 15 de Carboximetilcelulose (CMC Synth) As
placas foram entatildeo incubadas a 37degC (CO2 a 5) por 96 horas As ceacutelulas foram entatildeo
fixadas com 2 mL de soluccedilatildeo de formol a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo
1 (pv) de cristal violeta em PBS para contagem das placas de lise O tiacutetulo viral foi
expresso atraveacutes do nuacutemero de unidades formadoras de placa por mL (UFPmL) segundo a
formula abaixo representada
Tiacutetulo viral (UFPmL) = N x FC x 10
N = nuacutemero de placas de lise contadas
FC = Fator de correccedilatildeo
= Inverso da diluiccedilatildeo na qual foram contadas as placas de lise
43 Compostos de naftoquinonas
Os compostos utilizados neste estudo foram fornecidos pelo Dr Geraldo Ceacutelio
Brandatildeo do laboratoacuterio de pesquisa da Escola de Farmaacutecia da Universidade Federal de Ouro
Preto
20
Tabela 1 Relaccedilatildeo de nome estrutura e coacutedigo dos compostos utilizados Na tabela estatildeo
presentes a relaccedilatildeo dos nomes dos compostos utilizados neste trabalho bem como sua
estrutura Os coacutedigos representantes de cada composto seratildeo utilizados no decorrer da escrita
Nome do composto Estrutura Coacutedigo
Lapachol
A1
β-lapachona
A2
2-Hidroxi-3-(ββ-dimetilvinil)-14-naftoquinona
A3
2-Cloro-14-naftoquinona
A4
Lapachol derivado 1
A5
Lapachol derivado 2 A6
Lapachol derivado 3 A7
Lapachol derivado 4 A8
44 Ensaio de citotoxicidade
Para avaliar a citotoxicidade dos compostos ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas foram incubadas com diferentes concentraccedilotildees dos compostos em triplicata num
volume de 200 microL de meio de cultura por poccedilo na presenccedila de 1 de SFB Os controles natildeo
tratados apresentaram adiccedilatildeo de 200 microL de meio de cultura As ceacutelulas foram entatildeo incubadas
durante 72 horas O meio foi removido e 28 microL de soluccedilatildeo de 5 mg mL MTT (brometo de 3-
21
[45-dimetil-tiazol-2-il]-25 difeniltertrazoacutelio) foi adicionado a cada poccedilo As placas foram re-
incubadas durante 1 hora e 30 minutos e entatildeo 122 microL de DMSO foi adicionado a cada poccedilo e
placas foram agitadas suavemente durante 15 minutos para dissolver os cristais de formazan
A absorbacircncia foi lida em um equipamento leitor de placas Victor X3 (PerkinElmer) a 490
nm A concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC 50) foi definida como a concentraccedilatildeo da amostra que
reduziu a viabilidade celular de 50 em comparaccedilatildeo com controles natildeo tratados Os dados
foram analisados utilizando o programa Prisma
45 Avaliaccedilatildeo da viabilidade e crescimento celular por exclusatildeo de azul de tripan
Ceacutelulas BHK-21 foram cultivadas em placas de 24 poccedilos (7x104 ceacutelulaspoccedilo) e apoacutes
24 horas foram tratadas com as concentraccedilotildees de uso de cada composto e incubadas por 72
horas na presenccedila de 1 de SFB A seguir as ceacutelulas foram tripsinizadas e incubadas com
azul de tripan e entatildeo foi utilizado um contador automatizado de ceacutelulas (Countess II FL
Automated Cell Counter ndash Thermo Fisher Scientific) para contagem das ceacutelulas e avaliaccedilatildeo da
porcentagem de viabilidade e diacircmetro celular do controle nos tempos de 0 24 e 96 horas e
avaliaccedilatildeo dos mesmos paracircmetros para os compostos no tempo de 96 horas (72 horas poacutes
tratamento)
Outra curva de multiplicaccedilatildeo celular foi feita para os compostos A1 A3 A4 e A5 onde as
ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos no momento da confecccedilatildeo da placa e
foram avaliados os mesmos paracircmetros nos tempos de 0 12 24 48 e 72 horas O
equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
46 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
Para determinar a menor Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) responsaacutevel pela letalidade
celular total 2x104 de ceacutelulas BHK-21 foram semeadas em placa de 96 poccedilos Apoacutes a
incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o
meio de cultura foi removido e as ceacutelulas foram expostas a diferentes diluiccedilotildees dos dois
sorotipos de DENV (100 microL de cada diluiccedilatildeo + 100 microL de meio DEMEM 1 SFB) As
diluiccedilotildees seriadas foram realizadas da suspensatildeo viral na razatildeo de 5 para o primeiro poccedilo e de
2 para os demais poccedilos Apoacutes 72 horas as ceacutelulas foram entatildeo fixadas com 200 microL de soluccedilatildeo
22
formalina a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo 1 (pv) de cristal violeta em
PBS para avaliaccedilatildeo da maior diluiccedilatildeo responsaacutevel pela letalidade de 100 das ceacutelulas
47 Ensaio Dose-resposta
Para cada composto foram realizados ensaios de dose-resposta para definiccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de cada composto capaz de promover a reduccedilatildeo na produccedilatildeo viral A atividade
antiviral foi avaliada tambeacutem pelo meacutetodo de MTT Ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas expostas a diferentes concentraccedilotildees dos extratos determinadas a partir das maiores
concentraccedilotildees em que natildeo foram observados efeitos citotoacutexicos As ceacutelulas foram tratadas
com as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de cada composto e em seguida infectadas com DENV
1 (MOI= 5) ou 2 (MOI= 2) Mantendo uma coluna para controle com DMSO uma coluna
para controle de viacuterus uma coluna para controle de citotoxicidade dos compostos e por fim
uma coluna para controle celular As ceacutelulas foram entatildeo incubadas durante 72 horas Apoacutes
este tempo procedeu-se a leitura pelo ensaio de MTT como descrito anteriormente Os dados
foram analisados levando-se em consideraccedilatildeo a leitura das absorbacircncias dos poccedilos dos
controles de viacuterus e do controle celular
Para realizacao destes experimentos os seguintes controles foram adotados
Controle de ceacutelulas poccedilos contendo somente ceacutelulas acrescidas do meio de cultura DMEM
1 SFB Utilizado para avaliar o comportamento das ceacutelulas sem que as mesmas tivessem
contato com qualquer interferente durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo Com isso os poccedilos
reservados para esse controle serviram de padratildeo para comparaccedilatildeo com aqueles em que fosse
observada atividade citotoacutexica ou citopaacutetica
Controle de viacuterus poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM 1 SFB
sem nenhum tratamento e de suspensatildeo de viacuterus Utilizando como referecircncia para anaacutelise da
atividade citopaacutetica provocada pelo viacuterus testado durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo das placas
23
Controle de viacuterus com DMSO Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura
DMEM 1 SFB e DMSO Foi utilizado para avaliar se havia influecircncia prejudicial do
solvente utilizado para diluiccedilatildeo das amostras no meio de cultivo das ceacutelulas e se o mesmo
poderia apresentar alguma potencial atividade antiviral aparente
Controle de citotoxicidade Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM
1 SFB e as quatro principais concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos Foi utilizado
para avaliar se haveria alguma possiacutevel atividade citotoacutexica das concentraccedilotildees dos compostos
em relaccedilatildeo agraves ceacutelulas
48 Ensaio Virucida
Para a realizaccedilatildeo deste ensaio aliacutequotas de 950 microL (diluiccedilatildeo de 20 vezes) do DENV 1 (tiacutetulo
6 x 107 UFPmL) foram incubadas com 50 microL de uma soluccedilatildeo de meio DMEM preparada
com 20x a concentraccedilatildeo natildeo citotoacutexica de cada composto A1 a A8 em banho-maria 37deg C
por 1 hora Apoacutes a incubaccedilatildeo as aliacutequotas foram imediatamente tituladas em ceacutelulas BHK-21
em placas de 6 poccedilos utilizando-se 3 diluiccedilotildees para cada incubaccedilatildeo (20x 20 x 10-1
e 20 x 10-
2) Foram titulados tambeacutem uma aliacutequota incubada apenas com meio DMEM sem nenhum
tratamento e outra aliacutequota incubada com DMSO (Dimetilsulfoacutexido) Estas foram tituladas
utilizando um controle e mais cinco diluiccedilotildees (20x 20 x 10-1
20 x 10-2
20 x 10-3
e 20 x 10-4
)
49 Ensaio antiviral
Neste ensaio ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em placas de 24 poccedilos no dia
seguinte foram tratadas durante 4 horas com as concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas de cada
composto em duplicata Apoacutes o preacute-tratamento as monocamadas foram infectadas com
DENV-1 a uma MOI=5 na presenccedila das concentraccedilotildees de uso respectivas de cada composto
Apoacutes 1 hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus as monocamadas foram lavadas duas vezes com PBS e
foi adicionado 500 microL por poccedilo de meio preparado com as mesmas concentraccedilotildees dos
diferentes compostos e mantidos durante 48 horas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5 Em
quatro poccedilos as ceacutelulas foram infectadas e natildeo tratadas e em outros quatro poccedilos as ceacutelulas
natildeo foram tratadas e nem infectadas (controle de ceacutelulas) destes uacuteltimos dois foram
tripsinizados e contados no momento da infecccedilatildeo e os outros dois apoacutes o teacutermino do ensaio
24
para avaliar o crescimento celular Decorridas as 48 horas o sobrenadante foi coletado e
centrifugado por 10 minutos a 4000 xG para separaccedilatildeo dos debris celulares e prontamente
titulado em placa de 6 poccedilos
410 Anaacutelise estatiacutestica
Os valores de CC50 foram obtidos a partir de anaacutelise de regressatildeo linear das curvas de
concentraccedilatildeocitotoxicidade A anaacutelise estatiacutestica dos dados foi realizada pelo programa
GraphPad Prism software Uma anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi utilizada para determinar
as diferenccedilas estatiacutesticas seguida do poacutes teste de Tukey A significacircncia estatiacutestica foi fixada
em p lt005
25
V RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
26
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Ensaio de citotoxicidade celular
Para avaliar a viabilidade da linhagem celular BHK-21 frente ao tratamento com oito
diferentes concentraccedilotildees dos compostos (A1 a A8) realizou-se um ensaio de MTT (brometo
de 3-[45-dimetil-tiazol-2-il]-25-difeniltetrazoacutelio) Este ensaio tem o objetivo de quantificar
espectrofotometricamente o crescimento celular a viabilidade e proliferaccedilatildeo podendo ser
utilizado como um indicador direto de citotoxicidade Trata-se de um ensaio colorimeacutetrico
para medir a atividade da redutase mitocondrial em ceacutelulas vivas Ele se baseia na reduccedilatildeo do
sal amarelo tetrazoacutelio (permeaacutevel agrave membrana celular) para cristais de formazan azuis
puacuterpura por ceacutelulas metabolicamente ativas a quantidade de formazan gerada medida por
espectrofotometria eacute proporcional ao nuacutemero de ceacutelulas viaacuteveis
A CC50 foi calculada plotando-se uma curva de porcentagem de viabilidade celular por
concentraccedilatildeo melhor representada na figura 7 pelo composto A7 e os resultados de CC50
para todos os compostos estatildeo representados na tabela 2 Foram feitos ensaios de
citotoxicidade com oito concentraccedilotildees diferentes sendo escolhida a maior concentraccedilatildeo que
natildeo apresentou citotoxicidade
Viabilidade Celular = [ ( A ndash B ) A ] x 100
Onde
A = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas natildeo tratadas
B = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas tratadas com
as respectivas concentraccedilotildees de cada composto
27
28
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (A curva dose resposta do composto A7 eacute a que
melhor representa a curva dose resposta esperada) Avaliou-se a viabilidade da linhagem
celular BHK-21 frente agrave diferentes concentraccedilotildees dos compostos realizando o ensaio de MTT
e determinando assim as concentraccedilotildees a serem utilizadas nos proacuteximos ensaios bem como
calculando a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) agrave partir da curva
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo
da concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50)
Composto Concentraccedilatildeo utilizada
[ ] microgmL
Concentraccedilatildeo citotoacutexica 50
(CC50) [ ] microgmL plusmn Desvio
Padratildeo
A1 ([ ]=1 mgmL) 00200 10010 plusmn 0014
A2 ([ ]=1 mgmL) 00025 09561 plusmn 0023
A3 ([ ]=1 mgmL) 00025 09988 plusmn 0017
A4 ([ ]=5 mgmL) 00125 10150 plusmn 0036
A5 ([ ]=10 mgmL) 00250 10590 plusmn 0047
A6 ([ ]=5 mgmL) 00250 08183 plusmn 0030
A7 ([ ]=5 mgmL) 00125 10280 plusmn 0052
A8 ([ ]=5 mgmL) 00125 09758 plusmn 0036
52 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan
Para corroborar o ensaio anterior de citotoxicidade utilizou -se o teste de viabilidade
celular pela teacutecnica da exclusatildeo do azul de tripan com a finalidade de determinar a
viabilidade das ceacutelulas Os procedimentos adotados no ensaio seguiram o manual do
equipamento contador automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL Automated Cell Counter) entatildeo
foi acrescentado agrave 10 microL da suspensatildeo celular 10 microL de azul de tripan (04) Apoacutes
homogeneizaccedilatildeo 10 microL da suspensatildeo foi colocada no local indicado da lacircmina proacutepria para
leitura e foi realizada a contagem sendo consideradas mortas (inviaacuteveis) as ceacutelulas que
incorporavam o corante e viaacuteveis as que excluiacuteam o azul de tripan
29
O equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
(A)
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan A avaliaccedilatildeo da
viabilidade celular foi realizada atraveacutes de um contador automaacutetico de ceacutelulas Este
equipamento possibilita explorar ferramentas de fotografia e avaliar alguns paracircmetros
importantes (A) fotografia das ceacutelulas (B) Zoom na fotografia das ceacutelulas com marcaccedilotildees
(em verde para ceacutelulas vivas e vermelho para mortas) e (D) contagem das ceacutelulas totais
ceacutelulas vivas e mortas graacutefico e meacutedia dos diacircmetros celulares das ceacutelulas vivas e mortas
(B)
(C)
30
O crescimento celular de ceacutelulas natildeo tratadas foi avaliado nos tempos de 0h (momento
da confecccedilatildeo da placa) 24h (momento de tratamento com os compostos) e 96 horas
(Momento em que todas as ceacutelulas foram tripsinizadas e contadas) para avaliar o perfil do
crescimento celular em ceacutelulas natildeo tratadas Foi observado um crescimento celular no periacuteodo
de 24 horas onde as ceacutelulas estavam incubadas com meio acrescido de 10 SFB Em 24
horas o meio foi trocado por 1 SFB e acrescido das substacircncias testes nas menores diluiccedilotildees
natildeo citotoacutexicas determinadas pelo ensaio do MTT Em 96 horas pode ser observado um
decaimento no nuacutemero de ceacutelulas vivas provavelmente devido ao crescimento celular (morte
por confluecircncia)
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas)
(A) (B)
31
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas (A)
Contagem de ceacutelulas vivas (B) Percentual de ceacutelulas viaacuteveis (Viabilidade celular ) e (C)
Meacutedia do diacircmetro apresentado pelas ceacutelulas vivas
Em 96 horas as ceacutelulas natildeo tratadas bem como as ceacutelulas tratadas por 72 horas com as
concentraccedilotildees de uso dos compostos foram tripsinizadas e avaliadas quanto ao nuacutemero de
ceacutelulas vivas viabilidade e diacircmetro celular apresentados na figura 10
Segundo se observa natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo aparente que possa demonstrar que
as concentraccedilotildees de uso dos compostos tenham causado alguma atividade citotoacutexica
corroborando assim os ensaios de citotoxicidade anteriores
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
A infectividade de um viacuterus depende de vaacuterios fatores entre eles da proporccedilatildeo de
partiacuteculas virais completas ou infecciosas da suscetibilidade da ceacutelula hospedeira e da
chance desta partiacutecula encontrar o receptor e penetrar na ceacutelula Quando ceacutelulas suscetiacuteveis
satildeo misturadas com uma suspensatildeo de viacuterus estas podem receber uma duas trecircs ou dez
partiacuteculas virais ou nenhuma Isto depende da proporccedilatildeo entre a quantidade de viacuterus
infecciosos presente no inoculo e a quantidade de ceacutelulas utilizada Esta relaccedilatildeo eacute denominada
de multiplicidade de infecccedilatildeo ou MOI Uma MOI=1 indica que a infecccedilatildeo foi feita em
principio com 1 viacuterus ou 1 dose infectante por ceacutelula
A determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo dos Dengue virus 1 e 2 a serem
utilizadas nos proacuteximos ensaios foi feita a partir da infecccedilatildeo de ceacutelulas BHK-21 por diferentes
(C)
32
concentraccedilotildees de viacuterus e revelaccedilatildeo com cristal violeta Escolheu-se a maior diluiccedilatildeo viral que
possibilitou a letalidade total das ceacutelulas (faixa onde todas as ceacutelulas estatildeo mortas utilizando
menor concentraccedilatildeo de viacuterus) As faixas escolhidas foram entatildeo calculadas levando-se em
consideraccedilatildeo o nuacutemero de ceacutelulas presentes no poccedilo e o nuacutemero de partiacuteculas virais que foram
adicionadas (Faixa3 para DENV2 e 2 para DENV1) Figura 11 Foi estipulado portanto a
Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 2 para DENV 2 e 5 para DENV 1
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI A partir da infecccedilatildeo da linhagem celular BHK-21 em
placa de 96 poccedilos com diferentes diluiccedilotildees de DENV foi determinado que a Multiplicidade
de infecccedilatildeo para o Dengue viacuterus sorotipos 1 e 2 seria de 5 e 2 respectivamente (colunas 2 -
DENV1 e 3 - DENV2)
54 Ensaio dose resposta
Apoacutes a determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas ideais realizou-se um
ensaio dose resposta tratando as ceacutelulas com oito concentraccedilotildees agrave partir das concentraccedilotildees natildeo
citotoacutexicas escolhidas para cada composto e em seguida infectando com DENV sorotipos 1 e
2 nas MOIs estipuladas anteriormente (5 e 2 respectivamente) A porcentagem do efeito
protetor conferida agraves ceacutelulas para cada concentraccedilatildeo de amostra testada foi calculada da
seguinte forma
33
EP = [ (A ndash B) (C ndash B) ] x 100
Onde
A Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas tratadas e infectadas
B Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e infectadas
C Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e natildeo infectadas
Este ensaio tem por objetivo identificar a resposta celular agrave infecccedilatildeo frente ao
tratamento com os compostos em diferentes concentraccedilotildees Assim como o ensaio de
toxicidade este ensaio feito utilizando a teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT permite o teste de vaacuterias
concentraccedilotildees diferentes em um menor tempo e com baixo gasto de material
34
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV1
(MOI=5)
35
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV2
(MOI=2)
36
Takegami et al (1998) demonstraram atividade de furanonaftoquinonas contra o viacuterus
da Encefalite Japonesa (Flavivirus) utilizando a concentraccedilatildeo de 3microgmL poreacutem para os
compostos apresentados avaliados pela teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT nenhuma das
concentraccedilotildees apresentadas produziu efeito antiviral significativo em relaccedilatildeo ao controle
celular como observado nas figuras 12 e 13
Apesar da teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT ser interessante como triagem de atividade
antiviral permitindo o teste de vaacuterias concentraccedilotildees dos compostos em menor tempo e
utilizando uma quantidade razoaacutevel de materiais optou-se por utilizar as maiores
concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas encontradas avaliando sua atividade antiviral por outras
teacutecnicas Como natildeo foi avaliada atividade antiviral preacutevia para nenhum dos compostos frente
agrave infecccedilatildeo por DENV1 e 2 foi selecionado o Dengue virus 1 para dar prosseguimento aos
ensaios
55 Ensaio Virucida
O ensaio virucida foi realizado para avaliar um potencial efeito dos compostos
diretamente sobre a partiacutecula viral Este ensaio eacute importante pois possibilita elucidar se o
composto pode produzir algum efeito sobre a partiacutecula viral impedindo que esta possa infectar
as ceacutelulas
Figura 14 Ensaio virucida Neste ensaio as aliacutequotas de DENV1 foram incubadas com as
concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos e titulados (NT) Controle natildeo tratado
37
Tabela 3 Ensaio virucida Caacutelculo do tiacutetulo viral (UFPmL) e porcentagem representante de
cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 254 x 105 100
DMSO 263 x 105 10335
A1 199 x 105 7835
A2 205 x 105 8071
A3 237 x 105 9311
A4 775 x 104 3049
A5 153 x 105 6024
A6 219 x 105 8602
A7 243 x 105 9547
A8 254 x 105 100
Lagrota et al (1988) demonstraram atividade de 2-HO-3-N-benzil-N(N-benzil-2-
etilamina) -14-naftoquinona sobre a partiacutecula viral de enterovirus De forma contraacuteria apesar
de se verificar a reduccedilatildeo de quase uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais
para o composto A4 natildeo considerou-se esta uma alteraccedilatildeo significativa pois devido agrave
magnitude do nuacutemero de UFPs se trata de uma alteraccedilatildeo muito pequena Portanto os
compostos avaliados neste trabalho natildeo produziram atividade virucida aparente frente ao
tratamento com as concentraccedilotildees de uso
56 Ensaio Antiviral
O sobrenadante de ceacutelulas tratadas previamente e infectadas por DENV1 coletado 48
horas poacutes infecccedilatildeo foi avaliado quanto agrave produccedilatildeo viral de partiacuteculas infecciosas pela
contagem de placas de lise e caacutelculo de Unidades Formadoras de Placa (Titulaccedilatildeo viral em
placa ndash UFPmL)
38
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral Sobrenadante de ceacutelulas tratadas e infectadas por DENV1
coletado apoacutes 48 horas e titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado
Tabela 4 Ensaio Antiviral Coleta do sobrenadante de ceacutelulas infectadas por DENV1 Tiacutetulo
viral (UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o
controle natildeo tratado como 100
Ao perceber um aumento no tiacutetulo viral frente ao tratamento com os compostos A1
A2 e A3 e uma reduccedilatildeo frente ao tratamento com A4 A5 e A6 foram escolhidos dois
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 119 x 105 10000
A1 235 x 105 19748
A2 228 x 105 19160
A3 318 x 105 26723
A4 128 x 104 1076
A5 186 x 103 156
A6 190 x 104 1597
A7 280 x 104 2353
A8 350 x 104 2941
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
40
Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
XIII
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Relaccedilatildeo de nome estrutura e coacutedigo dos compostos utilizados 20
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo da
concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) 28
Tabela 3 Ensaio virucida 37
Tabela 4 Ensaio Antiviral 38
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados 39
XIV
LISTA DE ABREVIATURAS
AMV ndash Mielobastose Aviaacuteria viacuterus (Avian Myeloblastosis virus )
CC50 ndash Concentraccedilatildeo Citotoacutexica 50
DENV ndash Dengue virus
DMEM ndash Meio baacutesico modificado por Dulbecco (Dulbeccos Modified Eagle Medium)
DMSO ndash Dimetilsulfoacutexido
ICTV ndash Comitecirc Inernacional de Taxonomia Viral
JEV ndash Viacuterus da Encefalite Japonesa (Japanese Encephalitis virus)
MOI ndash Multiplicidade de infecccedilatildeo viral
NS ndash Proteiacutenas natildeo estruturais
NT ndash Natildeo Tratado
OMS ndash Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede
RE ndash Retiacuteculo endoplasmaacutetico
RLV ndash Viacuterus da Leucemia Murina de Rauscher (Murine leukemia virus)
SFB ndash Soro Fetal Bovino
UFP ndash Unidades formadoras de placas
WNV ndash Viacuterus do Nilo Ocidental (West Nile virus)
YFV ndash Viacuterus da febre amarela (Yellow fever virus)
ZV ndash Zika virus
1
I INTRODUCcedilAtildeO
2
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Flavivirus
O Gecircnero Flavivirus pertencente agrave famiacutelia Flaviviridae inclui 53 espeacutecies
taxonomicamente reconhecidas (ICTV 2016) muitas das quais satildeo importantes patoacutegenos
humanos tais como o Dengue virus (DENV) Yellow fever virus (YFV - viacuterus da febre
amarela ndash protoacutetipo deste gecircnero) Japanese encephalitis virus (JEV - viacuterus da encefalite
japonesa) West Nile virus (WNV - virus do Nilo Ocidental) Zika virus (ZV) entre outros
(Villordo 2016) O nome flavivirus eacute derivado da palavra latina flavus que significa amarelo
significando a icteriacutecia causada pelo YFV Os sintomas da infecccedilatildeo por flavivirus pode variar
de leve febre e mal-estar a encefalite fatal e febre hemorraacutegica (Mukhopadhyay 2005)
Estes viacuterus regulam o metabolismo e a sobrevivecircncia das ceacutelulas infectadas
assegurando a sua proacutepria reproduccedilatildeo e propagaccedilatildeo O viacuterus da dengue tambeacutem provoca a
autofagia uma resposta homeostaacutetica geral que ajuda a ceacutelula infectada sobreviver e produzir
viacuterus (Datan 2016)
Os Flavivirus podem ser agrupados em complexos e sub-complexos antigecircnicos
baseados em criteacuterios soroloacutegicos ou em grupos clados e espeacutecies segundo a sua filogenia
molecular (Lindenbach 2007) A maioria dos membros deste gecircnero satildeo arbovirus (arthropod
borne virus) ou seja satildeo essencialmente transmitidos por Artroacutepodes (Mackenzie 2004)
onde 27 satildeo transmitidos por mosquitos 12 por carrapatos e 14 natildeo possuem vetor
conhecido Os viacuterus transmitidos pela fecircmea do gecircnero Aedes incluem DENV e YFV satildeo
viscerotroacutepicos e possuem primatas como reservatoacuterio natural (Gaunt 2001)
A patogenia da Dengue causada pelo DENV constitui uma das doenccedilas virais mais
importantes em seres humanos transmitidos por insetos e eacute responsaacutevel por cerca de 390
milhotildees de infecccedilotildees por ano O YFV por sua vez causador da febre amarela eacute endecircmico em
vaacuterios paiacuteses do continente Africano e da Ameacuterica do Sul resultando em 200000 casos e
30000 mortes na Aacutefrica mesmo com vacinas eficazes disponiacuteveis Outras doenccedilas causadas
por flaviviacuterus incluem a encefalite do Nilo Ocidental (West Nile virus) e febre Zika (Zika
virus) que satildeo consideradas doenccedilas emergentes com surtos importantes em todo o mundo
(Villordo 2016)
3
12 Dengue virus
Os DENV pertencem ao gecircnero flaviviacuterus e evoluiram em primatas natildeo-humanos a
partir de um ancestral comum Eacute composto por quatro sorotipos antigenicamente distintos
(DENV1-4) que co-circulam por todo o Sudeste da Aacutesia Aacutefrica e Ameacutericas (McArthur 2013)
e em outubro de 2013 foi anunciado um novo sorotipo circulante denominado entatildeo de DENV
5 (Normile 2013) A partiacutecula infecciosa eacute esfeacuterica com 40-50 nm de diacircmetro possuindo
um envelope de lipopolissacariacutedeo O genoma consiste em RNA de fita simples natildeo
segmentado e senso positivo de aproximadamente 11 kb de comprimento e possui uma uacutenica
janela aberta de leitura (start codon) (Guzman 2010) Apoacutes a traduccedilatildeo a uacutenica poliproteiacutena
formada eacute clivada por proteases virais e celulares em trecircs proteiacutenas estruturais que compotildeem
a partiacutecula viral C (capsideo) prM M (membrana e o seu precursor) e E (envelope) e sete
proteiacutenas natildeo estruturais essenciais para a replicaccedilatildeo viral (NS) (NS1 NS2a NS2b NS3
NS4a NS4b e NS5) (Robertson 2009)
A transmissatildeo do viacuterus ocorre atraveacutes da picada por fecircmeas infectadas de mosquitos
do gecircnero Aedes sendo responsaacutevel pelas maiores taxas de doenccedila e mortalidade entre os
membros do gecircnero Flavivirus (Mukhopadhyay 2005) No Brasil o Aedes aegypti eacute o
principal vetor de dengue enquanto o Aedes albopictus atua como um vector secundaacuterio
(Weaver 2010)
O diagnoacutestico soroloacutegico da Dengue se baseia na detecccedilatildeo de niacuteveis elevados de
anticorpos anti-Dengue-IgM ou anti-Dengue-IgG que reconhecem e se ligam ao antiacutegeno de
DENV A Glicoproteiacutena do envelope (E) uma proteiacutena estrutural de DENV eacute o alvo
antigecircnico mais importante destes anticorpos neutralizantes porque estaacute exposta na superfiacutecie
do viacuterus e medeia os receptores de ligaccedilatildeo e fusatildeo da ceacutelula hospedeira (Lee 2015)
Durante a infecccedilatildeo celular os virions de DENV se ligam agrave superfiacutecie da membrana
atraveacutes da glicoproteiacutena do envelope (E) a receptores especiacuteficos e satildeo internalizados por
endocitose Uma vez dentro do endossoma a acidificaccedilatildeo provocada pela ligaccedilatildeo de
lisossomos desencadeia uma trimerizaccedilatildeo irreversiacutevel da proteiacutena E que atua na fusatildeo das
membranas virais e endossomais celulares Apoacutes essa fusatildeo o nucleocapsideo eacute liberado no
citoplasma onde o mesmo eacute desnudado e a replicaccedilatildeo do genoma de RNA e montagem de
partiacuteculas eacute iniciada As partiacuteculas virais imaturas satildeo acumuladas no luacutemen do retiacuteculo
endoplasmaacutetico (RE) Essas partiacuteculas imaturas que contecircm proteiacutenas prM proteiacutena E
membrana lipiacutedica e nuacutecleo capsiacutedeo natildeo pode induzir a fusatildeo da ceacutelula hospedeira ou seja
4
neste estaacutegio elas natildeo satildeo infecciosas (Mukhopadhyay 2005) O processo de maturaccedilatildeo
desses viacuterus ocorre apoacutes a clivagem proteoliacutetica da proteiacutena precursora de membrana (prM)
transformando viacuterus inerte em partiacuteculas infecciosas (Li 2008) Partiacuteculas subvirais satildeo
tambeacutem produzidas no RE mas apenas contecircm as glicoproteiacutenas de membrana fazendo com
que estas partiacuteculas sejam natildeo infecciosas Os viacuterus maduros e as partiacuteculas sub-virais satildeo
liberados da ceacutelula hospedeira por exocitose (Mukhopadhyay 2005)
Na pele o DENV tende a infectar ceacutelulas dendriacuteticas imaturas Estas ceacutelulas infectadas
amadurecem e migram para os gacircnglios linfaacuteticos regionais ou locais onde apresentam
antiacutegenos virais agraves ceacutelulas T iniciando as respostas imunes Existe tambeacutem evidecircncia de
replicaccedilatildeo abundante de DENV em ceacutelulas do parecircnquima do fiacutegado e em macroacutefagos nos
gacircnglios linfaacuteticos fiacutegado e baccedilo bem como em monoacutecitos de sangue perifeacuterico (Guzman
2010)
Proteiacutena E
(diacutemero)
Proteiacutena
M
Proteiacutena C
ssRNA (+)
Figura 1 Estrutura da partiacutecula viral de Dengue viacuterus A partiacutecula viral eacute composta
por trecircs proteiacutenas estruturais proteiacutena de envelope (E) disposta em diacutemeros a proteiacutena
associada agrave membrana (M) e a proteiacutena do nucleocapsiacutedeo (C) O genoma de RNA fita-
simples de polaridade positiva se encontra dentro do nucleocapsiacutedeo (Adaptado de
httpviralzoneexpasyorgviralzoneall_by_species24html)
5
Figura 2 Ciclo de multiplicaccedilatildeo de DENV A Os viacuterus se ligam aos receptores na superfiacutecie da
ceacutelula e satildeo endocitados B Devido ao baixo pH dentro dos endossomas ocorre a fusatildeo de
membranas viral-celular mediada por proteiacutenas virais resultando na liberaccedilatildeo do RNA viral em um
processo chamado de desnudamento C O genoma viral eacute traduzido em uma uacutenica poliproteiacutena que
eacute processada por proteases do viacuterus e da ceacutelula hospedeira D O RNA eacute replicado por proteiacutenas
natildeo-estruturais do proacuteprio viacuterus E A montagem do viacuterus ocorre na membrana do Reticulo
endoplasmaacutetico no qual a proteiacutena do capsiacutedeo e o RNA viral satildeo envolvidos por glicoproteiacutenas e
pela membrana da organela para formar partiacuteculas virais imaturas F Partiacuteculas virais imaturas
utilizam a via secretora da ceacutelula hospedeira e sob o baixo pH do Complexo de Golgi a proteiacutena
precursora prM eacute clivada em proteiacutena M completando a maturaccedilatildeo do viacuterus GOs viacuterus maduros
satildeo entatildeo liberados das ceacutelulas por exocitose Os nuacutemeros indicados nas caixas coloridas referem-se
ao valor de pH dos respectivos compartimentos Imagem adaptada de PERERA 2009
Adsorccedilatildeo
Siacutentese e processamento
Fusatildeo e
Desnudamento
Replicaccedilatildeo do RNA
Montagem
Maturaccedilatildeo
Liberaccedilatildeo de
viacuterus
maduro
A
B
C
D
E
F
G
6
13 Epidemiologia
Ao longo das uacuteltimas deacutecadas a dengue se tornou a doenccedila viral transmitida por
mosquitos mais prevalente no mundo Estimativas de infecccedilatildeo pela OMS indicam que a
patologia eacute endecircmica em mais de 100 paiacuteses em todos os continentes exceto a Antaacutertida e
aflige principalmente paiacuteses pobres em recursos nas regiotildees tropicais e subtropicais (Perry
2011) Epidemias globais de DENV ocorreram ao longo das uacuteltimas deacutecadas em parte devido
agrave diminuiccedilatildeo dos esforccedilos no controle de mosquitos Satildeo estimados mais de 50 milhotildees de
casos de dengue anualmente (Mukhopadhyay 2005)
A Dengue eacute uma doenccedila viral sistecircmica aguda que se estabeleceu em todo o mundo
em ambos os ciclos de transmissatildeo endecircmicas e epidecircmicas A infecccedilatildeo pelo DENV em seres
humanos eacute frequentemente inaparente mas pode levar a uma grande variedade de
manifestaccedilotildees cliacutenicas de febre leve a siacutendrome do choque da dengue potencialmente fatal A
imunidade vitaliacutecia desenvolvida apoacutes a infecccedilatildeo com um dos quatro tipos de viacuterus eacute
especiacutefica para cada tipo e a progressatildeo para uma doenccedila mais grave eacute frequente mas natildeo
exclusivamente relacionada com infecccedilatildeo secundaacuteria por tipos heteroacutelogos No entanto
enquanto a expansatildeo histoacuterica desta doenccedila eacute bem documentada o elevado fardo de
problemas de sauacutede atribuiacuteveis agrave dengue em grande parte do mundo tropical e sub-tropical
permanecem pouco enumerados (Bhatt 2013)
O Brasil eacute um paiacutes de grande extensatildeo (8512000 km2) situado em uma zona
predominantemente tropical com extensas aacutereas de florestas na regiatildeo amazocircnica bem como
restos de uma floresta tropical na costa leste sudeste e sul entre outros ecossistemas A maior
parte do paiacutes tem um clima tropical e uma grande diversidade de plantas e animais portanto
um local adequado para a ocorrecircncia de patologias causadas por viacuterus transmitidos por
artroacutepodes (Figueiredo 2000) Segundo o boletim epidemioloacutegico do ministeacuterio da sauacutede em
2016 jaacute foram registrados 170103 casos provaacuteveis de dengue no paiacutes ateacute a semana
epidemioloacutegica 5 Nesse periacuteodo a regiatildeo Sudeste registrou o maior nuacutemero de casos
provaacuteveis (96664 casos 568) Em Minas Gerais jaacute foram registradas 19 mortes em
decorrecircncia da Dengue entre 1deg de janeiro e 14 de marccedilo deste ano Outros 91 oacutebitos estatildeo
sob investigaccedilatildeo (BRASIL 2016)
7
Figura 3 Distribuiccedilatildeo geograacutefica da Dengue Aacutereas de risco de transmissatildeo em amarelo
(Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede Adaptado de httpwwwwhointen)
As manifestaccedilotildees da doenccedila foram descritas pela primeira vez apoacutes a Segunda Guerra
Mundial coincidente com o aumento da urbanizaccedilatildeo particularmente na Aacutesia (Weaver 2010)
Atualmente o DENV eacute hiperendecircmico em muitas regiotildees tropicais onde 2 ou mais sorotipos
circulam endemicamente Embora DENV foi provavelmente introduzido periodicamente para
as Ameacutericas atraveacutes de navios desde o seacuteculo 17 o surgimento de DENV no Hemisfeacuterio
Ocidental comeccedilou mais tarde devido a uma campanha de sucesso parcial para erradicar o
vetor A aegypti para controlar a febre amarela Esta campanha teve sucesso na maior parte
das Ameacutericas da deacutecada de 1950 agrave deacutecada de 1970 mas foi interrompida O vetor entatildeo
rapidamente recolonizou quase toda a regiatildeo neotropical e subtropicais e a invasatildeo do DENV
seguiu logo depois Em 1985 A albopictus foi introduzido nos EUA e no Brasil
proporcionando um vetor para a transmissatildeo secundaacuteria de DENV nas Ameacutericas (Hawley
1987)
Os mosquitos vetores principalmente A aegypti tornam-se infectados quando eles se
alimentam do sangue de seres humanos durante o periacuteodo de cinco dias da viremia A
infecccedilatildeo produz um amplo espectro da doenccedila cliacutenica e varia de assintomaacutetica a doenccedila febril
auto-limitante A dengue tambeacutem conhecida como ldquofebre osso quebradordquo devido agraves fortes
dores nas articulaccedilotildees e inclui sintomas de febre alta dores musculares articulares e erupccedilatildeo
cutacircnea Uma pequena porcentagem de indiviacuteduos pode apresentar a siacutendrome do choque da
8
dengue (dengue hemorraacutegica) com risco de vida grave O tratamento eacute amplamente favoraacutevel
usando de reidrataccedilatildeo oral ou intravenosa acompanhamento e atenccedilatildeo meacutedica adequada No
entanto uma das principais consequecircncias da doenccedila eacute a sua capacidade de sobrecarregar
instalaccedilotildees meacutedicas durante um surto e em paiacuteses onde os recursos de sauacutede jaacute estatildeo no
limite isso pode ter efeitos catastroacuteficos Prevenccedilatildeo e tratamento portanto se fazem
altamente necessaacuterios (Perry 2011)
A prevalecircncia global de DENV cresceu drasticamente nas uacuteltimas deacutecadas e ateacute o
momento natildeo haacute nenhum medicamento especiacutefico para combater a infecccedilatildeo as medidas de
prevenccedilatildeo mais eficazes satildeo voltadas para o controle do vetor (Silva 2011) Diante disso a
Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) elegeu o desenvolvimento de vacinas contra o viacuterus da
dengue como prioridade mundial (Kinney 2001) Por conseguinte a busca de substacircncias
naturais ou sinteacuteticas com atividade antiviral especiacutefica sem toxicidade para as ceacutelulas
normais em seres humanos eacute uma estrateacutegia desejada para evitar que a dengue se agrave e
ajudar a controlar a difusatildeo da doenccedila As vaacuterias fases do ciclo viral representam alvos
terapecircuticos individuais que podem ser exploradas (Costa 2013) Nesse sentido vaacuterios
grupos de pesquisa e organizaccedilotildees estatildeo trabalhando com diversas abordagens para o
desenvolvimento de compostos antivirais com atividade protetora contra dengue Dentre elas
uma vasta gama de produtos naturais incluindo plantas numa tentativa de isolar e
caracterizar novos compostos que podem inibir a replicaccedilatildeo do viacuterus ou tratar a infecccedilatildeo
viral Por essa razatildeo extratos e componentes da planta satildeo cada vez mais importantes como
fontes potenciais para agentes antivirais (Silva 2011)
14 Naftoquinonas
As quinonas satildeo compostos aromaacuteticos amplamente distribuiacutedos na natureza e podem
ser encontrados em vaacuterias famiacutelias de plantas bem como isolado de fungos algas e
bacteacuterias Elas satildeo classificadas em benzoquinonas antraquinonas e naftoquinonas de acordo
com as suas estruturas quiacutemicas Naftoquinonas satildeo compostos orgacircnicos altamente reativos
utilizados como corantes naturais ou sinteacuteticos cujas cores variam de amarelo para vermelho
Apresentam cadeia carbocircnica similar ao naftaleno e satildeo caracterizadas por seus dois grupos
carbonila na posiccedilatildeo 1 e 4 por isso satildeo nomeadas de 14-naftoquinonas Os grupos carbonila
tambeacutem podem estar presente na posiccedilatildeo 12 com menor incidecircncia (Loacutepez 2014)
9
Figura 4 Estrutura quiacutemica da 12-naftoquinona (1) e 14-naftoquinona (2)
Entre as quinonas estatildeo compostos biologicamente importantes tais como o grupo da
vitamina K e a coenzima Q (ubiquinona) Estes compostos tecircm um papel importante no
metabolismo celular especialmente como carreadores de eleacutetrons Aleacutem de quinonas que
possuam uma funccedilatildeo bioloacutegica outros compostos desta classe tecircm sido encontrados
mostrando atividade antibioacutetica Alguns deles estatildeo presentes na natureza mas a maior parte
satildeo obtidos sinteticamente entre eles 2-hidroxi-3-alquil-14-naftoquinonas que possuem
evidecircncias de serem ativos in vitro contra os parasitas da malaacuteria e como coccidiostaacuteticos
(Ambrogi 1970)
A atividade bioloacutegica de quinonas estaacute muitas vezes relacionada com o seu
comportamento eletroquiacutemico A capacidade de aceitar um ou dois eleacutetrons para formar o
acircnion radical correspondente ou dianion pode ser o motivo da induccedilatildeo da formaccedilatildeo de
espeacutecies reativas de oxigecircnio responsaacuteveis pelo estresse oxidativo nas ceacutelulas A capacidade
de aceitar eleacutetrons de naftoquinonas pode ser alterada por mudanccedilas de posiccedilatildeo do grupo
carbonila (12- 14-naftoquinonas) ou diferentes substituintes ou funccedilotildees associadas agrave porccedilatildeo
de naftoquinona (Francisco 2010)
As naftoquinonas satildeo largamente encontradas em plantas micro-organismos e alguns
animais Estes compostos tecircm sido amplamente utilizados em diversas culturas como corantes
para cosmeacuteticos tecidos alimentos (Brandelli 2004) e para fins medicinais incluindo
antitumoral (Oliveira 1990 Ferreira 1996) anti-inflamatoacuterios antimalaacuterico antiviral
(Fonseca 2003 Hussain 2007) atibacterianos e antifuacutengicos (Nagata 1998) Estas atividades
bioloacutegicas tecircm justificado o grande nuacutemero de trabalhos (aproximadamente 42 ateacute abril 2016
ndash Pubmed) encontrados na literatura que visa a siacutentese e avaliaccedilatildeo de qualquer das quinonas
naturais ou seus anaacutelogos como agentes farmacoloacutegicos potenciais (Rahmoun 2013)
10
O Lapachol foi descoberto e estudado desde o seacuteculo XIX Foi isolado primeiramente
do lenho da aacutervore argentina ldquolapachordquo Tabebuia avellanedae (Bignoniaceae) conhecida
como Ipecirc roxo Os estudos quiacutemicos foram desenvolvidos inicialmente em 1892 (Fonseca
2003) O lapachol foi descrito pela primeira vez por Paterno em 1821 tendo sua estrutura
quiacutemica estabelecida em 1896 por Hooker que o identificou como uma naftoquinona Esta
naftoquinona possui accedilatildeo antiinflamatoacuteria analgeacutesica antibioacutetica e anti-neoplaacutesica
reconhecida (Arauacutejo 2002)
A β-lapachona (34-di-hidro-22-dimetil-2H-naptho [12-b] pirano-56-diona) eacute uma
quinona obtida de fontes naturais derivada da aacutervore Lapacho (Tabebuia avellanedae) nativa
da Ameacuterica do Sul e Central A siacutentese e quiacutemica da β-lapachona e compostos relacionados
foi inicialmente investigado no final do seacuteculo XIX e iniacutecio do seacuteculo XX pelo quiacutemico
Samuel Hooker Apesar de alguns estudos cliacutenicos sobre a bioatividade de naftoquinonas
terem sido relatados no iniacutecio de 1940 foi o relatoacuterio do potencial da β-lapachona como um
agente anti-tripanossoma em 1977 que revitalizou o estudo e caracterizaccedilatildeo deste composto
natural A β-lapachona tambeacutem apresenta vaacuterias accedilotildees farmacoloacutegicas incluindo accedilatildeo
formaccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (Hussain 2007)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do Lapachol (1) da α- Lapachona (2) e da β-
Lapachona (Fonseca et al 2003 Ferreira et al 2010)
11
Figura 6 Tabebuia avellanedae (Hussain 2007)
A β-lapachona eacute uma substacircncia natural facilmente obtida a partir do lapachol Esta
naftoquinona eacute o grande destaque desta classe de substacircncias porque se encontra em testes
cliacutenicos de fase II para o tratamento do cacircncer de pacircncreas (Ferreira 2010) O mecanismo de
accedilatildeo da β-lapachona diferencia-se de outros antineoplaacutesicos por atuar na topoisomerase I
promovendo a recuperaccedilatildeo da capacidade de apoptose celular Alguns estudos reportam sua
accedilatildeo sineacutergica de potenciaccedilatildeo com o Taxolreg
promovendo a inibiccedilatildeo em diferentes pontos de
replicaccedilatildeo celular aleacutem de sua combinaccedilatildeo com outros tratamentos como a aplicaccedilatildeo de
radiaccedilatildeo ionizante (Cunha 2005)
Vaacuterios estudos jaacute foram publicados demonstrando a atividade antiviral de
naftoquinonas naturais e sinteacuteticas A β-lapachona inibe seletivamente a replicaccedilatildeo do viacuterus
HIV-1 atuando na inibiccedilatildeo da enzima LTR117 Da mesma forma este composto eacute um
potente inibidor da enzima transcriptase reversa dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e
leucemia murina de Rauscher (RLV) inibindo tambeacutem a DNA polimerase A accedilatildeo inibitoacuteria
sobre estas enzimas revelou-se especiacutefica se comparada com a de outros inibidores
conhecidos (Silva 2003)
O Lapachol jaacute demonstrou atividade contra certas cepas virais incluindo Herpes virus
tipos I e II Outras naftoquinonas jaacute mostraram eficaacutecia contra cepas de Influenza virus
Poliomielite virus e estomatite vesicular Supotildee-se que o mecanismo de accedilatildeo destas quinonas
seja atraveacutes da inibiccedilatildeo da transcriptase reversa de retroviacuterus e da RNA polimerase Eacute relatado
12
que lapachol diminui a replicaccedilatildeo do viacuterus em seres humanos mas ainda natildeo existem
resultados de testes cliacutenicos disponiacuteveis (Hussain 2007)
Na avaliaccedilatildeo da atividade antiviral do Lapachol in vitro verificou-se que esta
substacircncia eacute ativa contra viacuterus RNA atuando tanto sobre viacuterus envelopados quanto sobre
partiacuteculas sem esta estrutura em concentraccedilotildees de 5 a 10 microgmL e ainda apresentou uma
pequena atividade sobre HSV (Herpes simplex I) e Ad5 (Adeno tipo 5) mas nenhuma
atividade sobre CoxB4 (Coxsackie B4) Em trabalho posterior demonstrou-se que nem o
Lapachol nem diversos dos seus derivados apresentaram atividade antiviral in vitro sobre
Poliovirus tipo 1 Ecovirus 19 e Coxsackie B tipo 4 Apenas os derivados 12-naftoquinonicos
e um intermediaacuterio da siacutentese Hoocker foram ativos contra o Echovirus 19 (Fonseca 2003)
Costa et al (2013) relataram que piranonaftoquinonas isocircmeras do lapachol possuem
atividade de inibiccedilatildeo da replicaccedilatildeo de DENV-2 atuando sobre a atividade da ATPase de NS3
(proteiacutena natildeo estrutural de DENV)
A utilizaccedilatildeo de testes in vitro por meio de ensaios de viabilidade celular constitui o
primeiro passo para a avaliaccedilatildeo da compatibilidade bioloacutegica de uma substacircncia e pode
fornecer elementos importantes para a anaacutelise da biocompatibilidade dos diferentes materiais
Para ser considerado natildeo citotoacutexico no teste de citotoxicidade in vitro um produto natildeo deve
ocasionar a morte das ceacutelulas nem afetar suas funccedilotildees celulares A prova do MTT eacute um dos
indicadores colorimeacutetricos de viabilidade celular mais utilizados sendo capaz de avaliar a
funccedilatildeo celular mitocondrial de acordo com a reduccedilatildeo enzimaacutetica do sal de tetrazoacutelio pelas
desidrogenases mitocondriais nas ceacutelulas viaacutevies (Arauacutejo et al 2008) Supotildee-se que o
mecanismo responsaacutevel pela citotoxicidade apresentada pelas quinonas esteja relacionado
com o estresse oxidativo causado por esses compostos poreacutem a capacidade de alquilaccedilatildeo de
nucleoacutefilos celulares tambeacutem representa correlaccedilatildeo com tais efeitos bioloacutegicos (Goulart
2004)
13
II JUSTIFICATIVA
14
2 JUSTIFICATIVA
Aleacutem do controle do mosquito transmissor e do desenvolvimento de vacinas que tem
sido exaustivamente estudado nos uacuteltimos anos uma alternativa para o combate agrave dengue
seria o desenvolvimento de faacutermacos para reduzir a viremia ou mesmo para controlar a
resposta imune do hospedeiro agrave infecccedilatildeo que tem sido apontada como principal fator de risco
nos casos mais graves Em funccedilatildeo disso o nuacutemero de pesquisas visando o desenvolvimento
de drogas com accedilatildeo antiviral ou com accedilatildeo imunomodulatoacuteria tem aumentado
significativamente As naftoquinonas vecircm ganhando bastante importacircncia na pesquisa de
novas drogas antivirais devido agrave algumas atividades apresentadas A szlig-lapachona-orto-
naftoquinona por exemplo se mostrou um potente inibidor da enzima transcriptase reversa
dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e leucemia murina de Rauscher (RLV)
Diante da inexistecircncia de drogas com accedilatildeo anti DENV e o elevado nuacutemero e casos da
patogenia nos uacuteltimos anos a organizaccedilatildeo mundial da sauacutede classificou a Dengue como uma
epidemia de proporccedilotildees globais e um problema de sauacutede puacuteblica Como as naftoquinonas jaacute
demonstraram na literatura possuir um potencial efeito terapecircutico contra alguns viacuterus eacute
possiacutevel que estes compostos possam apresentar atividade antiviral contra DENV Portanto
este trabalho visou atraveacutes de ensaios de MTT e titulaccedilotildees virais em placa avaliar a potencial
atividade antiviral de oito compostos derivados de naftoquinonas naturais e sinteacuteticas
15
III OBJETIVOS
16
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar oito compostos (2 naturais e 6 sinteacuteticos) derivados de naftoquinonas como potenciais
agentes antivirais em ceacutelulas BHK-21 frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1 e 2
32 Objetivos especiacuteficos
1 Calcular o iacutendice de citotoxicidade e a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) dos compostos
atraveacutes de ensaio de reduccedilatildeo de MTT
2 Avaliar os efeitos dos compostos sobre o crescimento a viabilidade e o volume celular
pela teacutecnica de exclusatildeo do azul de tripan
3 Determinar a multiplicidade de infecccedilatildeo de DENV 1 e 2 a ser utilizada nos ensaios
antivirais
4 Avaliar a atividade antiviral dos compostos frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1
e 2 atraveacutes do ensaio de MTT
5 Verificar um possiacutevel efeito direto dos compostos agraves partiacuteculas virais de Dengue virus
6 Quantificar a produccedilatildeo de partiacuteculas virais infecciosas no sobrenadante de ceacutelulas
infectadas atraveacutes de titulaccedilatildeo viral pela contagem de unidades formadoras de placas
17
IV MATERIAL E MEacuteTODOS
18
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Linhagens celulares
411 Ceacutelulas C636
As ceacutelulas C636 satildeo ceacutelulas de linhagem contiacutenua de larvas de mosquito Aedes
albopictus Estas ceacutelulas foram utilizadas na produccedilatildeo de estoque viral de DENV sorotipos 1
e 2 para isso foram mantidas em meio de cultura Leibovitz-15 (L-15) (Cultilab)
suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (Cultilab) antibioacuteticos (Penicilina 100 UmL
Streptomicina 100 microgmL) e antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL) a 28degC
412 Ceacutelulas BHK-21
As ceacutelulas BHK-21 satildeo fibroblastos de linhagem contiacutenua derivados de rim de hamster
neonato Estas ceacutelulas foram utilizadas para os experimentos in vitro e para as titulaccedilotildees de
DENV 1 e 2 para isso foram mantidas em meio miacutenimo essencial modificado por Dulbecco
ndash DMEM (Cultilab) suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (SFB) com antibioacuteticos
(Penicilina 100 UmL Streptomicina 100 microgmL) e com antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL)
sendo mantidas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5
42 Viacuterus
421 DENV 1 e DENV 2
O Sorotipo 1 do Dengue virus (DENV-1) estirpe Mochizuki foi replicado em ceacutelulas
C636 para gerar estoques de trabalho durante 2 e 5 dias a 28degC O sobrenadante da cultura de
ceacutelulas infectadas foi recolhido e clarificado por centrifugaccedilatildeo a 4000 G durante 10 minutos agrave
4degC e entatildeo foi aliquotado e armazenado a -70 deg C como reserva de viacuterus ateacute agrave sua utilizaccedilatildeo
A replicaccedilatildeo geraccedilatildeo de estoque e titulaccedilatildeo do Sorotipo 2 do Dengue virus (DENV-2)
estirpe Nova Guineacute C ocorreu nos mesmos moldes do DENV-1
19
422 Titulaccedilatildeo viral
Os estoques virais foram diluiacutedos (10-1
a 10-7
) e inoculados em monocamadas de
ceacutelulas BHK-21 implantadas em placas de 6 poccedilos com confluecircncia de aproximadamente
60 (3x105 ceacutelulas por poccedilo) sendo um poccedilo natildeo infectado mantido para controle celular
Apoacutes uma hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus foram adicionados 3 mL de meio DMEM (Cultilab)
suplementado com 15 de SFB e contendo 15 de Carboximetilcelulose (CMC Synth) As
placas foram entatildeo incubadas a 37degC (CO2 a 5) por 96 horas As ceacutelulas foram entatildeo
fixadas com 2 mL de soluccedilatildeo de formol a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo
1 (pv) de cristal violeta em PBS para contagem das placas de lise O tiacutetulo viral foi
expresso atraveacutes do nuacutemero de unidades formadoras de placa por mL (UFPmL) segundo a
formula abaixo representada
Tiacutetulo viral (UFPmL) = N x FC x 10
N = nuacutemero de placas de lise contadas
FC = Fator de correccedilatildeo
= Inverso da diluiccedilatildeo na qual foram contadas as placas de lise
43 Compostos de naftoquinonas
Os compostos utilizados neste estudo foram fornecidos pelo Dr Geraldo Ceacutelio
Brandatildeo do laboratoacuterio de pesquisa da Escola de Farmaacutecia da Universidade Federal de Ouro
Preto
20
Tabela 1 Relaccedilatildeo de nome estrutura e coacutedigo dos compostos utilizados Na tabela estatildeo
presentes a relaccedilatildeo dos nomes dos compostos utilizados neste trabalho bem como sua
estrutura Os coacutedigos representantes de cada composto seratildeo utilizados no decorrer da escrita
Nome do composto Estrutura Coacutedigo
Lapachol
A1
β-lapachona
A2
2-Hidroxi-3-(ββ-dimetilvinil)-14-naftoquinona
A3
2-Cloro-14-naftoquinona
A4
Lapachol derivado 1
A5
Lapachol derivado 2 A6
Lapachol derivado 3 A7
Lapachol derivado 4 A8
44 Ensaio de citotoxicidade
Para avaliar a citotoxicidade dos compostos ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas foram incubadas com diferentes concentraccedilotildees dos compostos em triplicata num
volume de 200 microL de meio de cultura por poccedilo na presenccedila de 1 de SFB Os controles natildeo
tratados apresentaram adiccedilatildeo de 200 microL de meio de cultura As ceacutelulas foram entatildeo incubadas
durante 72 horas O meio foi removido e 28 microL de soluccedilatildeo de 5 mg mL MTT (brometo de 3-
21
[45-dimetil-tiazol-2-il]-25 difeniltertrazoacutelio) foi adicionado a cada poccedilo As placas foram re-
incubadas durante 1 hora e 30 minutos e entatildeo 122 microL de DMSO foi adicionado a cada poccedilo e
placas foram agitadas suavemente durante 15 minutos para dissolver os cristais de formazan
A absorbacircncia foi lida em um equipamento leitor de placas Victor X3 (PerkinElmer) a 490
nm A concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC 50) foi definida como a concentraccedilatildeo da amostra que
reduziu a viabilidade celular de 50 em comparaccedilatildeo com controles natildeo tratados Os dados
foram analisados utilizando o programa Prisma
45 Avaliaccedilatildeo da viabilidade e crescimento celular por exclusatildeo de azul de tripan
Ceacutelulas BHK-21 foram cultivadas em placas de 24 poccedilos (7x104 ceacutelulaspoccedilo) e apoacutes
24 horas foram tratadas com as concentraccedilotildees de uso de cada composto e incubadas por 72
horas na presenccedila de 1 de SFB A seguir as ceacutelulas foram tripsinizadas e incubadas com
azul de tripan e entatildeo foi utilizado um contador automatizado de ceacutelulas (Countess II FL
Automated Cell Counter ndash Thermo Fisher Scientific) para contagem das ceacutelulas e avaliaccedilatildeo da
porcentagem de viabilidade e diacircmetro celular do controle nos tempos de 0 24 e 96 horas e
avaliaccedilatildeo dos mesmos paracircmetros para os compostos no tempo de 96 horas (72 horas poacutes
tratamento)
Outra curva de multiplicaccedilatildeo celular foi feita para os compostos A1 A3 A4 e A5 onde as
ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos no momento da confecccedilatildeo da placa e
foram avaliados os mesmos paracircmetros nos tempos de 0 12 24 48 e 72 horas O
equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
46 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
Para determinar a menor Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) responsaacutevel pela letalidade
celular total 2x104 de ceacutelulas BHK-21 foram semeadas em placa de 96 poccedilos Apoacutes a
incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o
meio de cultura foi removido e as ceacutelulas foram expostas a diferentes diluiccedilotildees dos dois
sorotipos de DENV (100 microL de cada diluiccedilatildeo + 100 microL de meio DEMEM 1 SFB) As
diluiccedilotildees seriadas foram realizadas da suspensatildeo viral na razatildeo de 5 para o primeiro poccedilo e de
2 para os demais poccedilos Apoacutes 72 horas as ceacutelulas foram entatildeo fixadas com 200 microL de soluccedilatildeo
22
formalina a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo 1 (pv) de cristal violeta em
PBS para avaliaccedilatildeo da maior diluiccedilatildeo responsaacutevel pela letalidade de 100 das ceacutelulas
47 Ensaio Dose-resposta
Para cada composto foram realizados ensaios de dose-resposta para definiccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de cada composto capaz de promover a reduccedilatildeo na produccedilatildeo viral A atividade
antiviral foi avaliada tambeacutem pelo meacutetodo de MTT Ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas expostas a diferentes concentraccedilotildees dos extratos determinadas a partir das maiores
concentraccedilotildees em que natildeo foram observados efeitos citotoacutexicos As ceacutelulas foram tratadas
com as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de cada composto e em seguida infectadas com DENV
1 (MOI= 5) ou 2 (MOI= 2) Mantendo uma coluna para controle com DMSO uma coluna
para controle de viacuterus uma coluna para controle de citotoxicidade dos compostos e por fim
uma coluna para controle celular As ceacutelulas foram entatildeo incubadas durante 72 horas Apoacutes
este tempo procedeu-se a leitura pelo ensaio de MTT como descrito anteriormente Os dados
foram analisados levando-se em consideraccedilatildeo a leitura das absorbacircncias dos poccedilos dos
controles de viacuterus e do controle celular
Para realizacao destes experimentos os seguintes controles foram adotados
Controle de ceacutelulas poccedilos contendo somente ceacutelulas acrescidas do meio de cultura DMEM
1 SFB Utilizado para avaliar o comportamento das ceacutelulas sem que as mesmas tivessem
contato com qualquer interferente durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo Com isso os poccedilos
reservados para esse controle serviram de padratildeo para comparaccedilatildeo com aqueles em que fosse
observada atividade citotoacutexica ou citopaacutetica
Controle de viacuterus poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM 1 SFB
sem nenhum tratamento e de suspensatildeo de viacuterus Utilizando como referecircncia para anaacutelise da
atividade citopaacutetica provocada pelo viacuterus testado durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo das placas
23
Controle de viacuterus com DMSO Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura
DMEM 1 SFB e DMSO Foi utilizado para avaliar se havia influecircncia prejudicial do
solvente utilizado para diluiccedilatildeo das amostras no meio de cultivo das ceacutelulas e se o mesmo
poderia apresentar alguma potencial atividade antiviral aparente
Controle de citotoxicidade Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM
1 SFB e as quatro principais concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos Foi utilizado
para avaliar se haveria alguma possiacutevel atividade citotoacutexica das concentraccedilotildees dos compostos
em relaccedilatildeo agraves ceacutelulas
48 Ensaio Virucida
Para a realizaccedilatildeo deste ensaio aliacutequotas de 950 microL (diluiccedilatildeo de 20 vezes) do DENV 1 (tiacutetulo
6 x 107 UFPmL) foram incubadas com 50 microL de uma soluccedilatildeo de meio DMEM preparada
com 20x a concentraccedilatildeo natildeo citotoacutexica de cada composto A1 a A8 em banho-maria 37deg C
por 1 hora Apoacutes a incubaccedilatildeo as aliacutequotas foram imediatamente tituladas em ceacutelulas BHK-21
em placas de 6 poccedilos utilizando-se 3 diluiccedilotildees para cada incubaccedilatildeo (20x 20 x 10-1
e 20 x 10-
2) Foram titulados tambeacutem uma aliacutequota incubada apenas com meio DMEM sem nenhum
tratamento e outra aliacutequota incubada com DMSO (Dimetilsulfoacutexido) Estas foram tituladas
utilizando um controle e mais cinco diluiccedilotildees (20x 20 x 10-1
20 x 10-2
20 x 10-3
e 20 x 10-4
)
49 Ensaio antiviral
Neste ensaio ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em placas de 24 poccedilos no dia
seguinte foram tratadas durante 4 horas com as concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas de cada
composto em duplicata Apoacutes o preacute-tratamento as monocamadas foram infectadas com
DENV-1 a uma MOI=5 na presenccedila das concentraccedilotildees de uso respectivas de cada composto
Apoacutes 1 hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus as monocamadas foram lavadas duas vezes com PBS e
foi adicionado 500 microL por poccedilo de meio preparado com as mesmas concentraccedilotildees dos
diferentes compostos e mantidos durante 48 horas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5 Em
quatro poccedilos as ceacutelulas foram infectadas e natildeo tratadas e em outros quatro poccedilos as ceacutelulas
natildeo foram tratadas e nem infectadas (controle de ceacutelulas) destes uacuteltimos dois foram
tripsinizados e contados no momento da infecccedilatildeo e os outros dois apoacutes o teacutermino do ensaio
24
para avaliar o crescimento celular Decorridas as 48 horas o sobrenadante foi coletado e
centrifugado por 10 minutos a 4000 xG para separaccedilatildeo dos debris celulares e prontamente
titulado em placa de 6 poccedilos
410 Anaacutelise estatiacutestica
Os valores de CC50 foram obtidos a partir de anaacutelise de regressatildeo linear das curvas de
concentraccedilatildeocitotoxicidade A anaacutelise estatiacutestica dos dados foi realizada pelo programa
GraphPad Prism software Uma anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi utilizada para determinar
as diferenccedilas estatiacutesticas seguida do poacutes teste de Tukey A significacircncia estatiacutestica foi fixada
em p lt005
25
V RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
26
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Ensaio de citotoxicidade celular
Para avaliar a viabilidade da linhagem celular BHK-21 frente ao tratamento com oito
diferentes concentraccedilotildees dos compostos (A1 a A8) realizou-se um ensaio de MTT (brometo
de 3-[45-dimetil-tiazol-2-il]-25-difeniltetrazoacutelio) Este ensaio tem o objetivo de quantificar
espectrofotometricamente o crescimento celular a viabilidade e proliferaccedilatildeo podendo ser
utilizado como um indicador direto de citotoxicidade Trata-se de um ensaio colorimeacutetrico
para medir a atividade da redutase mitocondrial em ceacutelulas vivas Ele se baseia na reduccedilatildeo do
sal amarelo tetrazoacutelio (permeaacutevel agrave membrana celular) para cristais de formazan azuis
puacuterpura por ceacutelulas metabolicamente ativas a quantidade de formazan gerada medida por
espectrofotometria eacute proporcional ao nuacutemero de ceacutelulas viaacuteveis
A CC50 foi calculada plotando-se uma curva de porcentagem de viabilidade celular por
concentraccedilatildeo melhor representada na figura 7 pelo composto A7 e os resultados de CC50
para todos os compostos estatildeo representados na tabela 2 Foram feitos ensaios de
citotoxicidade com oito concentraccedilotildees diferentes sendo escolhida a maior concentraccedilatildeo que
natildeo apresentou citotoxicidade
Viabilidade Celular = [ ( A ndash B ) A ] x 100
Onde
A = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas natildeo tratadas
B = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas tratadas com
as respectivas concentraccedilotildees de cada composto
27
28
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (A curva dose resposta do composto A7 eacute a que
melhor representa a curva dose resposta esperada) Avaliou-se a viabilidade da linhagem
celular BHK-21 frente agrave diferentes concentraccedilotildees dos compostos realizando o ensaio de MTT
e determinando assim as concentraccedilotildees a serem utilizadas nos proacuteximos ensaios bem como
calculando a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) agrave partir da curva
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo
da concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50)
Composto Concentraccedilatildeo utilizada
[ ] microgmL
Concentraccedilatildeo citotoacutexica 50
(CC50) [ ] microgmL plusmn Desvio
Padratildeo
A1 ([ ]=1 mgmL) 00200 10010 plusmn 0014
A2 ([ ]=1 mgmL) 00025 09561 plusmn 0023
A3 ([ ]=1 mgmL) 00025 09988 plusmn 0017
A4 ([ ]=5 mgmL) 00125 10150 plusmn 0036
A5 ([ ]=10 mgmL) 00250 10590 plusmn 0047
A6 ([ ]=5 mgmL) 00250 08183 plusmn 0030
A7 ([ ]=5 mgmL) 00125 10280 plusmn 0052
A8 ([ ]=5 mgmL) 00125 09758 plusmn 0036
52 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan
Para corroborar o ensaio anterior de citotoxicidade utilizou -se o teste de viabilidade
celular pela teacutecnica da exclusatildeo do azul de tripan com a finalidade de determinar a
viabilidade das ceacutelulas Os procedimentos adotados no ensaio seguiram o manual do
equipamento contador automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL Automated Cell Counter) entatildeo
foi acrescentado agrave 10 microL da suspensatildeo celular 10 microL de azul de tripan (04) Apoacutes
homogeneizaccedilatildeo 10 microL da suspensatildeo foi colocada no local indicado da lacircmina proacutepria para
leitura e foi realizada a contagem sendo consideradas mortas (inviaacuteveis) as ceacutelulas que
incorporavam o corante e viaacuteveis as que excluiacuteam o azul de tripan
29
O equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
(A)
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan A avaliaccedilatildeo da
viabilidade celular foi realizada atraveacutes de um contador automaacutetico de ceacutelulas Este
equipamento possibilita explorar ferramentas de fotografia e avaliar alguns paracircmetros
importantes (A) fotografia das ceacutelulas (B) Zoom na fotografia das ceacutelulas com marcaccedilotildees
(em verde para ceacutelulas vivas e vermelho para mortas) e (D) contagem das ceacutelulas totais
ceacutelulas vivas e mortas graacutefico e meacutedia dos diacircmetros celulares das ceacutelulas vivas e mortas
(B)
(C)
30
O crescimento celular de ceacutelulas natildeo tratadas foi avaliado nos tempos de 0h (momento
da confecccedilatildeo da placa) 24h (momento de tratamento com os compostos) e 96 horas
(Momento em que todas as ceacutelulas foram tripsinizadas e contadas) para avaliar o perfil do
crescimento celular em ceacutelulas natildeo tratadas Foi observado um crescimento celular no periacuteodo
de 24 horas onde as ceacutelulas estavam incubadas com meio acrescido de 10 SFB Em 24
horas o meio foi trocado por 1 SFB e acrescido das substacircncias testes nas menores diluiccedilotildees
natildeo citotoacutexicas determinadas pelo ensaio do MTT Em 96 horas pode ser observado um
decaimento no nuacutemero de ceacutelulas vivas provavelmente devido ao crescimento celular (morte
por confluecircncia)
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas)
(A) (B)
31
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas (A)
Contagem de ceacutelulas vivas (B) Percentual de ceacutelulas viaacuteveis (Viabilidade celular ) e (C)
Meacutedia do diacircmetro apresentado pelas ceacutelulas vivas
Em 96 horas as ceacutelulas natildeo tratadas bem como as ceacutelulas tratadas por 72 horas com as
concentraccedilotildees de uso dos compostos foram tripsinizadas e avaliadas quanto ao nuacutemero de
ceacutelulas vivas viabilidade e diacircmetro celular apresentados na figura 10
Segundo se observa natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo aparente que possa demonstrar que
as concentraccedilotildees de uso dos compostos tenham causado alguma atividade citotoacutexica
corroborando assim os ensaios de citotoxicidade anteriores
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
A infectividade de um viacuterus depende de vaacuterios fatores entre eles da proporccedilatildeo de
partiacuteculas virais completas ou infecciosas da suscetibilidade da ceacutelula hospedeira e da
chance desta partiacutecula encontrar o receptor e penetrar na ceacutelula Quando ceacutelulas suscetiacuteveis
satildeo misturadas com uma suspensatildeo de viacuterus estas podem receber uma duas trecircs ou dez
partiacuteculas virais ou nenhuma Isto depende da proporccedilatildeo entre a quantidade de viacuterus
infecciosos presente no inoculo e a quantidade de ceacutelulas utilizada Esta relaccedilatildeo eacute denominada
de multiplicidade de infecccedilatildeo ou MOI Uma MOI=1 indica que a infecccedilatildeo foi feita em
principio com 1 viacuterus ou 1 dose infectante por ceacutelula
A determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo dos Dengue virus 1 e 2 a serem
utilizadas nos proacuteximos ensaios foi feita a partir da infecccedilatildeo de ceacutelulas BHK-21 por diferentes
(C)
32
concentraccedilotildees de viacuterus e revelaccedilatildeo com cristal violeta Escolheu-se a maior diluiccedilatildeo viral que
possibilitou a letalidade total das ceacutelulas (faixa onde todas as ceacutelulas estatildeo mortas utilizando
menor concentraccedilatildeo de viacuterus) As faixas escolhidas foram entatildeo calculadas levando-se em
consideraccedilatildeo o nuacutemero de ceacutelulas presentes no poccedilo e o nuacutemero de partiacuteculas virais que foram
adicionadas (Faixa3 para DENV2 e 2 para DENV1) Figura 11 Foi estipulado portanto a
Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 2 para DENV 2 e 5 para DENV 1
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI A partir da infecccedilatildeo da linhagem celular BHK-21 em
placa de 96 poccedilos com diferentes diluiccedilotildees de DENV foi determinado que a Multiplicidade
de infecccedilatildeo para o Dengue viacuterus sorotipos 1 e 2 seria de 5 e 2 respectivamente (colunas 2 -
DENV1 e 3 - DENV2)
54 Ensaio dose resposta
Apoacutes a determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas ideais realizou-se um
ensaio dose resposta tratando as ceacutelulas com oito concentraccedilotildees agrave partir das concentraccedilotildees natildeo
citotoacutexicas escolhidas para cada composto e em seguida infectando com DENV sorotipos 1 e
2 nas MOIs estipuladas anteriormente (5 e 2 respectivamente) A porcentagem do efeito
protetor conferida agraves ceacutelulas para cada concentraccedilatildeo de amostra testada foi calculada da
seguinte forma
33
EP = [ (A ndash B) (C ndash B) ] x 100
Onde
A Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas tratadas e infectadas
B Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e infectadas
C Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e natildeo infectadas
Este ensaio tem por objetivo identificar a resposta celular agrave infecccedilatildeo frente ao
tratamento com os compostos em diferentes concentraccedilotildees Assim como o ensaio de
toxicidade este ensaio feito utilizando a teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT permite o teste de vaacuterias
concentraccedilotildees diferentes em um menor tempo e com baixo gasto de material
34
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV1
(MOI=5)
35
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV2
(MOI=2)
36
Takegami et al (1998) demonstraram atividade de furanonaftoquinonas contra o viacuterus
da Encefalite Japonesa (Flavivirus) utilizando a concentraccedilatildeo de 3microgmL poreacutem para os
compostos apresentados avaliados pela teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT nenhuma das
concentraccedilotildees apresentadas produziu efeito antiviral significativo em relaccedilatildeo ao controle
celular como observado nas figuras 12 e 13
Apesar da teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT ser interessante como triagem de atividade
antiviral permitindo o teste de vaacuterias concentraccedilotildees dos compostos em menor tempo e
utilizando uma quantidade razoaacutevel de materiais optou-se por utilizar as maiores
concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas encontradas avaliando sua atividade antiviral por outras
teacutecnicas Como natildeo foi avaliada atividade antiviral preacutevia para nenhum dos compostos frente
agrave infecccedilatildeo por DENV1 e 2 foi selecionado o Dengue virus 1 para dar prosseguimento aos
ensaios
55 Ensaio Virucida
O ensaio virucida foi realizado para avaliar um potencial efeito dos compostos
diretamente sobre a partiacutecula viral Este ensaio eacute importante pois possibilita elucidar se o
composto pode produzir algum efeito sobre a partiacutecula viral impedindo que esta possa infectar
as ceacutelulas
Figura 14 Ensaio virucida Neste ensaio as aliacutequotas de DENV1 foram incubadas com as
concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos e titulados (NT) Controle natildeo tratado
37
Tabela 3 Ensaio virucida Caacutelculo do tiacutetulo viral (UFPmL) e porcentagem representante de
cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 254 x 105 100
DMSO 263 x 105 10335
A1 199 x 105 7835
A2 205 x 105 8071
A3 237 x 105 9311
A4 775 x 104 3049
A5 153 x 105 6024
A6 219 x 105 8602
A7 243 x 105 9547
A8 254 x 105 100
Lagrota et al (1988) demonstraram atividade de 2-HO-3-N-benzil-N(N-benzil-2-
etilamina) -14-naftoquinona sobre a partiacutecula viral de enterovirus De forma contraacuteria apesar
de se verificar a reduccedilatildeo de quase uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais
para o composto A4 natildeo considerou-se esta uma alteraccedilatildeo significativa pois devido agrave
magnitude do nuacutemero de UFPs se trata de uma alteraccedilatildeo muito pequena Portanto os
compostos avaliados neste trabalho natildeo produziram atividade virucida aparente frente ao
tratamento com as concentraccedilotildees de uso
56 Ensaio Antiviral
O sobrenadante de ceacutelulas tratadas previamente e infectadas por DENV1 coletado 48
horas poacutes infecccedilatildeo foi avaliado quanto agrave produccedilatildeo viral de partiacuteculas infecciosas pela
contagem de placas de lise e caacutelculo de Unidades Formadoras de Placa (Titulaccedilatildeo viral em
placa ndash UFPmL)
38
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral Sobrenadante de ceacutelulas tratadas e infectadas por DENV1
coletado apoacutes 48 horas e titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado
Tabela 4 Ensaio Antiviral Coleta do sobrenadante de ceacutelulas infectadas por DENV1 Tiacutetulo
viral (UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o
controle natildeo tratado como 100
Ao perceber um aumento no tiacutetulo viral frente ao tratamento com os compostos A1
A2 e A3 e uma reduccedilatildeo frente ao tratamento com A4 A5 e A6 foram escolhidos dois
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 119 x 105 10000
A1 235 x 105 19748
A2 228 x 105 19160
A3 318 x 105 26723
A4 128 x 104 1076
A5 186 x 103 156
A6 190 x 104 1597
A7 280 x 104 2353
A8 350 x 104 2941
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
40
Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
XIV
LISTA DE ABREVIATURAS
AMV ndash Mielobastose Aviaacuteria viacuterus (Avian Myeloblastosis virus )
CC50 ndash Concentraccedilatildeo Citotoacutexica 50
DENV ndash Dengue virus
DMEM ndash Meio baacutesico modificado por Dulbecco (Dulbeccos Modified Eagle Medium)
DMSO ndash Dimetilsulfoacutexido
ICTV ndash Comitecirc Inernacional de Taxonomia Viral
JEV ndash Viacuterus da Encefalite Japonesa (Japanese Encephalitis virus)
MOI ndash Multiplicidade de infecccedilatildeo viral
NS ndash Proteiacutenas natildeo estruturais
NT ndash Natildeo Tratado
OMS ndash Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede
RE ndash Retiacuteculo endoplasmaacutetico
RLV ndash Viacuterus da Leucemia Murina de Rauscher (Murine leukemia virus)
SFB ndash Soro Fetal Bovino
UFP ndash Unidades formadoras de placas
WNV ndash Viacuterus do Nilo Ocidental (West Nile virus)
YFV ndash Viacuterus da febre amarela (Yellow fever virus)
ZV ndash Zika virus
1
I INTRODUCcedilAtildeO
2
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Flavivirus
O Gecircnero Flavivirus pertencente agrave famiacutelia Flaviviridae inclui 53 espeacutecies
taxonomicamente reconhecidas (ICTV 2016) muitas das quais satildeo importantes patoacutegenos
humanos tais como o Dengue virus (DENV) Yellow fever virus (YFV - viacuterus da febre
amarela ndash protoacutetipo deste gecircnero) Japanese encephalitis virus (JEV - viacuterus da encefalite
japonesa) West Nile virus (WNV - virus do Nilo Ocidental) Zika virus (ZV) entre outros
(Villordo 2016) O nome flavivirus eacute derivado da palavra latina flavus que significa amarelo
significando a icteriacutecia causada pelo YFV Os sintomas da infecccedilatildeo por flavivirus pode variar
de leve febre e mal-estar a encefalite fatal e febre hemorraacutegica (Mukhopadhyay 2005)
Estes viacuterus regulam o metabolismo e a sobrevivecircncia das ceacutelulas infectadas
assegurando a sua proacutepria reproduccedilatildeo e propagaccedilatildeo O viacuterus da dengue tambeacutem provoca a
autofagia uma resposta homeostaacutetica geral que ajuda a ceacutelula infectada sobreviver e produzir
viacuterus (Datan 2016)
Os Flavivirus podem ser agrupados em complexos e sub-complexos antigecircnicos
baseados em criteacuterios soroloacutegicos ou em grupos clados e espeacutecies segundo a sua filogenia
molecular (Lindenbach 2007) A maioria dos membros deste gecircnero satildeo arbovirus (arthropod
borne virus) ou seja satildeo essencialmente transmitidos por Artroacutepodes (Mackenzie 2004)
onde 27 satildeo transmitidos por mosquitos 12 por carrapatos e 14 natildeo possuem vetor
conhecido Os viacuterus transmitidos pela fecircmea do gecircnero Aedes incluem DENV e YFV satildeo
viscerotroacutepicos e possuem primatas como reservatoacuterio natural (Gaunt 2001)
A patogenia da Dengue causada pelo DENV constitui uma das doenccedilas virais mais
importantes em seres humanos transmitidos por insetos e eacute responsaacutevel por cerca de 390
milhotildees de infecccedilotildees por ano O YFV por sua vez causador da febre amarela eacute endecircmico em
vaacuterios paiacuteses do continente Africano e da Ameacuterica do Sul resultando em 200000 casos e
30000 mortes na Aacutefrica mesmo com vacinas eficazes disponiacuteveis Outras doenccedilas causadas
por flaviviacuterus incluem a encefalite do Nilo Ocidental (West Nile virus) e febre Zika (Zika
virus) que satildeo consideradas doenccedilas emergentes com surtos importantes em todo o mundo
(Villordo 2016)
3
12 Dengue virus
Os DENV pertencem ao gecircnero flaviviacuterus e evoluiram em primatas natildeo-humanos a
partir de um ancestral comum Eacute composto por quatro sorotipos antigenicamente distintos
(DENV1-4) que co-circulam por todo o Sudeste da Aacutesia Aacutefrica e Ameacutericas (McArthur 2013)
e em outubro de 2013 foi anunciado um novo sorotipo circulante denominado entatildeo de DENV
5 (Normile 2013) A partiacutecula infecciosa eacute esfeacuterica com 40-50 nm de diacircmetro possuindo
um envelope de lipopolissacariacutedeo O genoma consiste em RNA de fita simples natildeo
segmentado e senso positivo de aproximadamente 11 kb de comprimento e possui uma uacutenica
janela aberta de leitura (start codon) (Guzman 2010) Apoacutes a traduccedilatildeo a uacutenica poliproteiacutena
formada eacute clivada por proteases virais e celulares em trecircs proteiacutenas estruturais que compotildeem
a partiacutecula viral C (capsideo) prM M (membrana e o seu precursor) e E (envelope) e sete
proteiacutenas natildeo estruturais essenciais para a replicaccedilatildeo viral (NS) (NS1 NS2a NS2b NS3
NS4a NS4b e NS5) (Robertson 2009)
A transmissatildeo do viacuterus ocorre atraveacutes da picada por fecircmeas infectadas de mosquitos
do gecircnero Aedes sendo responsaacutevel pelas maiores taxas de doenccedila e mortalidade entre os
membros do gecircnero Flavivirus (Mukhopadhyay 2005) No Brasil o Aedes aegypti eacute o
principal vetor de dengue enquanto o Aedes albopictus atua como um vector secundaacuterio
(Weaver 2010)
O diagnoacutestico soroloacutegico da Dengue se baseia na detecccedilatildeo de niacuteveis elevados de
anticorpos anti-Dengue-IgM ou anti-Dengue-IgG que reconhecem e se ligam ao antiacutegeno de
DENV A Glicoproteiacutena do envelope (E) uma proteiacutena estrutural de DENV eacute o alvo
antigecircnico mais importante destes anticorpos neutralizantes porque estaacute exposta na superfiacutecie
do viacuterus e medeia os receptores de ligaccedilatildeo e fusatildeo da ceacutelula hospedeira (Lee 2015)
Durante a infecccedilatildeo celular os virions de DENV se ligam agrave superfiacutecie da membrana
atraveacutes da glicoproteiacutena do envelope (E) a receptores especiacuteficos e satildeo internalizados por
endocitose Uma vez dentro do endossoma a acidificaccedilatildeo provocada pela ligaccedilatildeo de
lisossomos desencadeia uma trimerizaccedilatildeo irreversiacutevel da proteiacutena E que atua na fusatildeo das
membranas virais e endossomais celulares Apoacutes essa fusatildeo o nucleocapsideo eacute liberado no
citoplasma onde o mesmo eacute desnudado e a replicaccedilatildeo do genoma de RNA e montagem de
partiacuteculas eacute iniciada As partiacuteculas virais imaturas satildeo acumuladas no luacutemen do retiacuteculo
endoplasmaacutetico (RE) Essas partiacuteculas imaturas que contecircm proteiacutenas prM proteiacutena E
membrana lipiacutedica e nuacutecleo capsiacutedeo natildeo pode induzir a fusatildeo da ceacutelula hospedeira ou seja
4
neste estaacutegio elas natildeo satildeo infecciosas (Mukhopadhyay 2005) O processo de maturaccedilatildeo
desses viacuterus ocorre apoacutes a clivagem proteoliacutetica da proteiacutena precursora de membrana (prM)
transformando viacuterus inerte em partiacuteculas infecciosas (Li 2008) Partiacuteculas subvirais satildeo
tambeacutem produzidas no RE mas apenas contecircm as glicoproteiacutenas de membrana fazendo com
que estas partiacuteculas sejam natildeo infecciosas Os viacuterus maduros e as partiacuteculas sub-virais satildeo
liberados da ceacutelula hospedeira por exocitose (Mukhopadhyay 2005)
Na pele o DENV tende a infectar ceacutelulas dendriacuteticas imaturas Estas ceacutelulas infectadas
amadurecem e migram para os gacircnglios linfaacuteticos regionais ou locais onde apresentam
antiacutegenos virais agraves ceacutelulas T iniciando as respostas imunes Existe tambeacutem evidecircncia de
replicaccedilatildeo abundante de DENV em ceacutelulas do parecircnquima do fiacutegado e em macroacutefagos nos
gacircnglios linfaacuteticos fiacutegado e baccedilo bem como em monoacutecitos de sangue perifeacuterico (Guzman
2010)
Proteiacutena E
(diacutemero)
Proteiacutena
M
Proteiacutena C
ssRNA (+)
Figura 1 Estrutura da partiacutecula viral de Dengue viacuterus A partiacutecula viral eacute composta
por trecircs proteiacutenas estruturais proteiacutena de envelope (E) disposta em diacutemeros a proteiacutena
associada agrave membrana (M) e a proteiacutena do nucleocapsiacutedeo (C) O genoma de RNA fita-
simples de polaridade positiva se encontra dentro do nucleocapsiacutedeo (Adaptado de
httpviralzoneexpasyorgviralzoneall_by_species24html)
5
Figura 2 Ciclo de multiplicaccedilatildeo de DENV A Os viacuterus se ligam aos receptores na superfiacutecie da
ceacutelula e satildeo endocitados B Devido ao baixo pH dentro dos endossomas ocorre a fusatildeo de
membranas viral-celular mediada por proteiacutenas virais resultando na liberaccedilatildeo do RNA viral em um
processo chamado de desnudamento C O genoma viral eacute traduzido em uma uacutenica poliproteiacutena que
eacute processada por proteases do viacuterus e da ceacutelula hospedeira D O RNA eacute replicado por proteiacutenas
natildeo-estruturais do proacuteprio viacuterus E A montagem do viacuterus ocorre na membrana do Reticulo
endoplasmaacutetico no qual a proteiacutena do capsiacutedeo e o RNA viral satildeo envolvidos por glicoproteiacutenas e
pela membrana da organela para formar partiacuteculas virais imaturas F Partiacuteculas virais imaturas
utilizam a via secretora da ceacutelula hospedeira e sob o baixo pH do Complexo de Golgi a proteiacutena
precursora prM eacute clivada em proteiacutena M completando a maturaccedilatildeo do viacuterus GOs viacuterus maduros
satildeo entatildeo liberados das ceacutelulas por exocitose Os nuacutemeros indicados nas caixas coloridas referem-se
ao valor de pH dos respectivos compartimentos Imagem adaptada de PERERA 2009
Adsorccedilatildeo
Siacutentese e processamento
Fusatildeo e
Desnudamento
Replicaccedilatildeo do RNA
Montagem
Maturaccedilatildeo
Liberaccedilatildeo de
viacuterus
maduro
A
B
C
D
E
F
G
6
13 Epidemiologia
Ao longo das uacuteltimas deacutecadas a dengue se tornou a doenccedila viral transmitida por
mosquitos mais prevalente no mundo Estimativas de infecccedilatildeo pela OMS indicam que a
patologia eacute endecircmica em mais de 100 paiacuteses em todos os continentes exceto a Antaacutertida e
aflige principalmente paiacuteses pobres em recursos nas regiotildees tropicais e subtropicais (Perry
2011) Epidemias globais de DENV ocorreram ao longo das uacuteltimas deacutecadas em parte devido
agrave diminuiccedilatildeo dos esforccedilos no controle de mosquitos Satildeo estimados mais de 50 milhotildees de
casos de dengue anualmente (Mukhopadhyay 2005)
A Dengue eacute uma doenccedila viral sistecircmica aguda que se estabeleceu em todo o mundo
em ambos os ciclos de transmissatildeo endecircmicas e epidecircmicas A infecccedilatildeo pelo DENV em seres
humanos eacute frequentemente inaparente mas pode levar a uma grande variedade de
manifestaccedilotildees cliacutenicas de febre leve a siacutendrome do choque da dengue potencialmente fatal A
imunidade vitaliacutecia desenvolvida apoacutes a infecccedilatildeo com um dos quatro tipos de viacuterus eacute
especiacutefica para cada tipo e a progressatildeo para uma doenccedila mais grave eacute frequente mas natildeo
exclusivamente relacionada com infecccedilatildeo secundaacuteria por tipos heteroacutelogos No entanto
enquanto a expansatildeo histoacuterica desta doenccedila eacute bem documentada o elevado fardo de
problemas de sauacutede atribuiacuteveis agrave dengue em grande parte do mundo tropical e sub-tropical
permanecem pouco enumerados (Bhatt 2013)
O Brasil eacute um paiacutes de grande extensatildeo (8512000 km2) situado em uma zona
predominantemente tropical com extensas aacutereas de florestas na regiatildeo amazocircnica bem como
restos de uma floresta tropical na costa leste sudeste e sul entre outros ecossistemas A maior
parte do paiacutes tem um clima tropical e uma grande diversidade de plantas e animais portanto
um local adequado para a ocorrecircncia de patologias causadas por viacuterus transmitidos por
artroacutepodes (Figueiredo 2000) Segundo o boletim epidemioloacutegico do ministeacuterio da sauacutede em
2016 jaacute foram registrados 170103 casos provaacuteveis de dengue no paiacutes ateacute a semana
epidemioloacutegica 5 Nesse periacuteodo a regiatildeo Sudeste registrou o maior nuacutemero de casos
provaacuteveis (96664 casos 568) Em Minas Gerais jaacute foram registradas 19 mortes em
decorrecircncia da Dengue entre 1deg de janeiro e 14 de marccedilo deste ano Outros 91 oacutebitos estatildeo
sob investigaccedilatildeo (BRASIL 2016)
7
Figura 3 Distribuiccedilatildeo geograacutefica da Dengue Aacutereas de risco de transmissatildeo em amarelo
(Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede Adaptado de httpwwwwhointen)
As manifestaccedilotildees da doenccedila foram descritas pela primeira vez apoacutes a Segunda Guerra
Mundial coincidente com o aumento da urbanizaccedilatildeo particularmente na Aacutesia (Weaver 2010)
Atualmente o DENV eacute hiperendecircmico em muitas regiotildees tropicais onde 2 ou mais sorotipos
circulam endemicamente Embora DENV foi provavelmente introduzido periodicamente para
as Ameacutericas atraveacutes de navios desde o seacuteculo 17 o surgimento de DENV no Hemisfeacuterio
Ocidental comeccedilou mais tarde devido a uma campanha de sucesso parcial para erradicar o
vetor A aegypti para controlar a febre amarela Esta campanha teve sucesso na maior parte
das Ameacutericas da deacutecada de 1950 agrave deacutecada de 1970 mas foi interrompida O vetor entatildeo
rapidamente recolonizou quase toda a regiatildeo neotropical e subtropicais e a invasatildeo do DENV
seguiu logo depois Em 1985 A albopictus foi introduzido nos EUA e no Brasil
proporcionando um vetor para a transmissatildeo secundaacuteria de DENV nas Ameacutericas (Hawley
1987)
Os mosquitos vetores principalmente A aegypti tornam-se infectados quando eles se
alimentam do sangue de seres humanos durante o periacuteodo de cinco dias da viremia A
infecccedilatildeo produz um amplo espectro da doenccedila cliacutenica e varia de assintomaacutetica a doenccedila febril
auto-limitante A dengue tambeacutem conhecida como ldquofebre osso quebradordquo devido agraves fortes
dores nas articulaccedilotildees e inclui sintomas de febre alta dores musculares articulares e erupccedilatildeo
cutacircnea Uma pequena porcentagem de indiviacuteduos pode apresentar a siacutendrome do choque da
8
dengue (dengue hemorraacutegica) com risco de vida grave O tratamento eacute amplamente favoraacutevel
usando de reidrataccedilatildeo oral ou intravenosa acompanhamento e atenccedilatildeo meacutedica adequada No
entanto uma das principais consequecircncias da doenccedila eacute a sua capacidade de sobrecarregar
instalaccedilotildees meacutedicas durante um surto e em paiacuteses onde os recursos de sauacutede jaacute estatildeo no
limite isso pode ter efeitos catastroacuteficos Prevenccedilatildeo e tratamento portanto se fazem
altamente necessaacuterios (Perry 2011)
A prevalecircncia global de DENV cresceu drasticamente nas uacuteltimas deacutecadas e ateacute o
momento natildeo haacute nenhum medicamento especiacutefico para combater a infecccedilatildeo as medidas de
prevenccedilatildeo mais eficazes satildeo voltadas para o controle do vetor (Silva 2011) Diante disso a
Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) elegeu o desenvolvimento de vacinas contra o viacuterus da
dengue como prioridade mundial (Kinney 2001) Por conseguinte a busca de substacircncias
naturais ou sinteacuteticas com atividade antiviral especiacutefica sem toxicidade para as ceacutelulas
normais em seres humanos eacute uma estrateacutegia desejada para evitar que a dengue se agrave e
ajudar a controlar a difusatildeo da doenccedila As vaacuterias fases do ciclo viral representam alvos
terapecircuticos individuais que podem ser exploradas (Costa 2013) Nesse sentido vaacuterios
grupos de pesquisa e organizaccedilotildees estatildeo trabalhando com diversas abordagens para o
desenvolvimento de compostos antivirais com atividade protetora contra dengue Dentre elas
uma vasta gama de produtos naturais incluindo plantas numa tentativa de isolar e
caracterizar novos compostos que podem inibir a replicaccedilatildeo do viacuterus ou tratar a infecccedilatildeo
viral Por essa razatildeo extratos e componentes da planta satildeo cada vez mais importantes como
fontes potenciais para agentes antivirais (Silva 2011)
14 Naftoquinonas
As quinonas satildeo compostos aromaacuteticos amplamente distribuiacutedos na natureza e podem
ser encontrados em vaacuterias famiacutelias de plantas bem como isolado de fungos algas e
bacteacuterias Elas satildeo classificadas em benzoquinonas antraquinonas e naftoquinonas de acordo
com as suas estruturas quiacutemicas Naftoquinonas satildeo compostos orgacircnicos altamente reativos
utilizados como corantes naturais ou sinteacuteticos cujas cores variam de amarelo para vermelho
Apresentam cadeia carbocircnica similar ao naftaleno e satildeo caracterizadas por seus dois grupos
carbonila na posiccedilatildeo 1 e 4 por isso satildeo nomeadas de 14-naftoquinonas Os grupos carbonila
tambeacutem podem estar presente na posiccedilatildeo 12 com menor incidecircncia (Loacutepez 2014)
9
Figura 4 Estrutura quiacutemica da 12-naftoquinona (1) e 14-naftoquinona (2)
Entre as quinonas estatildeo compostos biologicamente importantes tais como o grupo da
vitamina K e a coenzima Q (ubiquinona) Estes compostos tecircm um papel importante no
metabolismo celular especialmente como carreadores de eleacutetrons Aleacutem de quinonas que
possuam uma funccedilatildeo bioloacutegica outros compostos desta classe tecircm sido encontrados
mostrando atividade antibioacutetica Alguns deles estatildeo presentes na natureza mas a maior parte
satildeo obtidos sinteticamente entre eles 2-hidroxi-3-alquil-14-naftoquinonas que possuem
evidecircncias de serem ativos in vitro contra os parasitas da malaacuteria e como coccidiostaacuteticos
(Ambrogi 1970)
A atividade bioloacutegica de quinonas estaacute muitas vezes relacionada com o seu
comportamento eletroquiacutemico A capacidade de aceitar um ou dois eleacutetrons para formar o
acircnion radical correspondente ou dianion pode ser o motivo da induccedilatildeo da formaccedilatildeo de
espeacutecies reativas de oxigecircnio responsaacuteveis pelo estresse oxidativo nas ceacutelulas A capacidade
de aceitar eleacutetrons de naftoquinonas pode ser alterada por mudanccedilas de posiccedilatildeo do grupo
carbonila (12- 14-naftoquinonas) ou diferentes substituintes ou funccedilotildees associadas agrave porccedilatildeo
de naftoquinona (Francisco 2010)
As naftoquinonas satildeo largamente encontradas em plantas micro-organismos e alguns
animais Estes compostos tecircm sido amplamente utilizados em diversas culturas como corantes
para cosmeacuteticos tecidos alimentos (Brandelli 2004) e para fins medicinais incluindo
antitumoral (Oliveira 1990 Ferreira 1996) anti-inflamatoacuterios antimalaacuterico antiviral
(Fonseca 2003 Hussain 2007) atibacterianos e antifuacutengicos (Nagata 1998) Estas atividades
bioloacutegicas tecircm justificado o grande nuacutemero de trabalhos (aproximadamente 42 ateacute abril 2016
ndash Pubmed) encontrados na literatura que visa a siacutentese e avaliaccedilatildeo de qualquer das quinonas
naturais ou seus anaacutelogos como agentes farmacoloacutegicos potenciais (Rahmoun 2013)
10
O Lapachol foi descoberto e estudado desde o seacuteculo XIX Foi isolado primeiramente
do lenho da aacutervore argentina ldquolapachordquo Tabebuia avellanedae (Bignoniaceae) conhecida
como Ipecirc roxo Os estudos quiacutemicos foram desenvolvidos inicialmente em 1892 (Fonseca
2003) O lapachol foi descrito pela primeira vez por Paterno em 1821 tendo sua estrutura
quiacutemica estabelecida em 1896 por Hooker que o identificou como uma naftoquinona Esta
naftoquinona possui accedilatildeo antiinflamatoacuteria analgeacutesica antibioacutetica e anti-neoplaacutesica
reconhecida (Arauacutejo 2002)
A β-lapachona (34-di-hidro-22-dimetil-2H-naptho [12-b] pirano-56-diona) eacute uma
quinona obtida de fontes naturais derivada da aacutervore Lapacho (Tabebuia avellanedae) nativa
da Ameacuterica do Sul e Central A siacutentese e quiacutemica da β-lapachona e compostos relacionados
foi inicialmente investigado no final do seacuteculo XIX e iniacutecio do seacuteculo XX pelo quiacutemico
Samuel Hooker Apesar de alguns estudos cliacutenicos sobre a bioatividade de naftoquinonas
terem sido relatados no iniacutecio de 1940 foi o relatoacuterio do potencial da β-lapachona como um
agente anti-tripanossoma em 1977 que revitalizou o estudo e caracterizaccedilatildeo deste composto
natural A β-lapachona tambeacutem apresenta vaacuterias accedilotildees farmacoloacutegicas incluindo accedilatildeo
formaccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (Hussain 2007)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do Lapachol (1) da α- Lapachona (2) e da β-
Lapachona (Fonseca et al 2003 Ferreira et al 2010)
11
Figura 6 Tabebuia avellanedae (Hussain 2007)
A β-lapachona eacute uma substacircncia natural facilmente obtida a partir do lapachol Esta
naftoquinona eacute o grande destaque desta classe de substacircncias porque se encontra em testes
cliacutenicos de fase II para o tratamento do cacircncer de pacircncreas (Ferreira 2010) O mecanismo de
accedilatildeo da β-lapachona diferencia-se de outros antineoplaacutesicos por atuar na topoisomerase I
promovendo a recuperaccedilatildeo da capacidade de apoptose celular Alguns estudos reportam sua
accedilatildeo sineacutergica de potenciaccedilatildeo com o Taxolreg
promovendo a inibiccedilatildeo em diferentes pontos de
replicaccedilatildeo celular aleacutem de sua combinaccedilatildeo com outros tratamentos como a aplicaccedilatildeo de
radiaccedilatildeo ionizante (Cunha 2005)
Vaacuterios estudos jaacute foram publicados demonstrando a atividade antiviral de
naftoquinonas naturais e sinteacuteticas A β-lapachona inibe seletivamente a replicaccedilatildeo do viacuterus
HIV-1 atuando na inibiccedilatildeo da enzima LTR117 Da mesma forma este composto eacute um
potente inibidor da enzima transcriptase reversa dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e
leucemia murina de Rauscher (RLV) inibindo tambeacutem a DNA polimerase A accedilatildeo inibitoacuteria
sobre estas enzimas revelou-se especiacutefica se comparada com a de outros inibidores
conhecidos (Silva 2003)
O Lapachol jaacute demonstrou atividade contra certas cepas virais incluindo Herpes virus
tipos I e II Outras naftoquinonas jaacute mostraram eficaacutecia contra cepas de Influenza virus
Poliomielite virus e estomatite vesicular Supotildee-se que o mecanismo de accedilatildeo destas quinonas
seja atraveacutes da inibiccedilatildeo da transcriptase reversa de retroviacuterus e da RNA polimerase Eacute relatado
12
que lapachol diminui a replicaccedilatildeo do viacuterus em seres humanos mas ainda natildeo existem
resultados de testes cliacutenicos disponiacuteveis (Hussain 2007)
Na avaliaccedilatildeo da atividade antiviral do Lapachol in vitro verificou-se que esta
substacircncia eacute ativa contra viacuterus RNA atuando tanto sobre viacuterus envelopados quanto sobre
partiacuteculas sem esta estrutura em concentraccedilotildees de 5 a 10 microgmL e ainda apresentou uma
pequena atividade sobre HSV (Herpes simplex I) e Ad5 (Adeno tipo 5) mas nenhuma
atividade sobre CoxB4 (Coxsackie B4) Em trabalho posterior demonstrou-se que nem o
Lapachol nem diversos dos seus derivados apresentaram atividade antiviral in vitro sobre
Poliovirus tipo 1 Ecovirus 19 e Coxsackie B tipo 4 Apenas os derivados 12-naftoquinonicos
e um intermediaacuterio da siacutentese Hoocker foram ativos contra o Echovirus 19 (Fonseca 2003)
Costa et al (2013) relataram que piranonaftoquinonas isocircmeras do lapachol possuem
atividade de inibiccedilatildeo da replicaccedilatildeo de DENV-2 atuando sobre a atividade da ATPase de NS3
(proteiacutena natildeo estrutural de DENV)
A utilizaccedilatildeo de testes in vitro por meio de ensaios de viabilidade celular constitui o
primeiro passo para a avaliaccedilatildeo da compatibilidade bioloacutegica de uma substacircncia e pode
fornecer elementos importantes para a anaacutelise da biocompatibilidade dos diferentes materiais
Para ser considerado natildeo citotoacutexico no teste de citotoxicidade in vitro um produto natildeo deve
ocasionar a morte das ceacutelulas nem afetar suas funccedilotildees celulares A prova do MTT eacute um dos
indicadores colorimeacutetricos de viabilidade celular mais utilizados sendo capaz de avaliar a
funccedilatildeo celular mitocondrial de acordo com a reduccedilatildeo enzimaacutetica do sal de tetrazoacutelio pelas
desidrogenases mitocondriais nas ceacutelulas viaacutevies (Arauacutejo et al 2008) Supotildee-se que o
mecanismo responsaacutevel pela citotoxicidade apresentada pelas quinonas esteja relacionado
com o estresse oxidativo causado por esses compostos poreacutem a capacidade de alquilaccedilatildeo de
nucleoacutefilos celulares tambeacutem representa correlaccedilatildeo com tais efeitos bioloacutegicos (Goulart
2004)
13
II JUSTIFICATIVA
14
2 JUSTIFICATIVA
Aleacutem do controle do mosquito transmissor e do desenvolvimento de vacinas que tem
sido exaustivamente estudado nos uacuteltimos anos uma alternativa para o combate agrave dengue
seria o desenvolvimento de faacutermacos para reduzir a viremia ou mesmo para controlar a
resposta imune do hospedeiro agrave infecccedilatildeo que tem sido apontada como principal fator de risco
nos casos mais graves Em funccedilatildeo disso o nuacutemero de pesquisas visando o desenvolvimento
de drogas com accedilatildeo antiviral ou com accedilatildeo imunomodulatoacuteria tem aumentado
significativamente As naftoquinonas vecircm ganhando bastante importacircncia na pesquisa de
novas drogas antivirais devido agrave algumas atividades apresentadas A szlig-lapachona-orto-
naftoquinona por exemplo se mostrou um potente inibidor da enzima transcriptase reversa
dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e leucemia murina de Rauscher (RLV)
Diante da inexistecircncia de drogas com accedilatildeo anti DENV e o elevado nuacutemero e casos da
patogenia nos uacuteltimos anos a organizaccedilatildeo mundial da sauacutede classificou a Dengue como uma
epidemia de proporccedilotildees globais e um problema de sauacutede puacuteblica Como as naftoquinonas jaacute
demonstraram na literatura possuir um potencial efeito terapecircutico contra alguns viacuterus eacute
possiacutevel que estes compostos possam apresentar atividade antiviral contra DENV Portanto
este trabalho visou atraveacutes de ensaios de MTT e titulaccedilotildees virais em placa avaliar a potencial
atividade antiviral de oito compostos derivados de naftoquinonas naturais e sinteacuteticas
15
III OBJETIVOS
16
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar oito compostos (2 naturais e 6 sinteacuteticos) derivados de naftoquinonas como potenciais
agentes antivirais em ceacutelulas BHK-21 frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1 e 2
32 Objetivos especiacuteficos
1 Calcular o iacutendice de citotoxicidade e a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) dos compostos
atraveacutes de ensaio de reduccedilatildeo de MTT
2 Avaliar os efeitos dos compostos sobre o crescimento a viabilidade e o volume celular
pela teacutecnica de exclusatildeo do azul de tripan
3 Determinar a multiplicidade de infecccedilatildeo de DENV 1 e 2 a ser utilizada nos ensaios
antivirais
4 Avaliar a atividade antiviral dos compostos frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1
e 2 atraveacutes do ensaio de MTT
5 Verificar um possiacutevel efeito direto dos compostos agraves partiacuteculas virais de Dengue virus
6 Quantificar a produccedilatildeo de partiacuteculas virais infecciosas no sobrenadante de ceacutelulas
infectadas atraveacutes de titulaccedilatildeo viral pela contagem de unidades formadoras de placas
17
IV MATERIAL E MEacuteTODOS
18
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Linhagens celulares
411 Ceacutelulas C636
As ceacutelulas C636 satildeo ceacutelulas de linhagem contiacutenua de larvas de mosquito Aedes
albopictus Estas ceacutelulas foram utilizadas na produccedilatildeo de estoque viral de DENV sorotipos 1
e 2 para isso foram mantidas em meio de cultura Leibovitz-15 (L-15) (Cultilab)
suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (Cultilab) antibioacuteticos (Penicilina 100 UmL
Streptomicina 100 microgmL) e antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL) a 28degC
412 Ceacutelulas BHK-21
As ceacutelulas BHK-21 satildeo fibroblastos de linhagem contiacutenua derivados de rim de hamster
neonato Estas ceacutelulas foram utilizadas para os experimentos in vitro e para as titulaccedilotildees de
DENV 1 e 2 para isso foram mantidas em meio miacutenimo essencial modificado por Dulbecco
ndash DMEM (Cultilab) suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (SFB) com antibioacuteticos
(Penicilina 100 UmL Streptomicina 100 microgmL) e com antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL)
sendo mantidas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5
42 Viacuterus
421 DENV 1 e DENV 2
O Sorotipo 1 do Dengue virus (DENV-1) estirpe Mochizuki foi replicado em ceacutelulas
C636 para gerar estoques de trabalho durante 2 e 5 dias a 28degC O sobrenadante da cultura de
ceacutelulas infectadas foi recolhido e clarificado por centrifugaccedilatildeo a 4000 G durante 10 minutos agrave
4degC e entatildeo foi aliquotado e armazenado a -70 deg C como reserva de viacuterus ateacute agrave sua utilizaccedilatildeo
A replicaccedilatildeo geraccedilatildeo de estoque e titulaccedilatildeo do Sorotipo 2 do Dengue virus (DENV-2)
estirpe Nova Guineacute C ocorreu nos mesmos moldes do DENV-1
19
422 Titulaccedilatildeo viral
Os estoques virais foram diluiacutedos (10-1
a 10-7
) e inoculados em monocamadas de
ceacutelulas BHK-21 implantadas em placas de 6 poccedilos com confluecircncia de aproximadamente
60 (3x105 ceacutelulas por poccedilo) sendo um poccedilo natildeo infectado mantido para controle celular
Apoacutes uma hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus foram adicionados 3 mL de meio DMEM (Cultilab)
suplementado com 15 de SFB e contendo 15 de Carboximetilcelulose (CMC Synth) As
placas foram entatildeo incubadas a 37degC (CO2 a 5) por 96 horas As ceacutelulas foram entatildeo
fixadas com 2 mL de soluccedilatildeo de formol a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo
1 (pv) de cristal violeta em PBS para contagem das placas de lise O tiacutetulo viral foi
expresso atraveacutes do nuacutemero de unidades formadoras de placa por mL (UFPmL) segundo a
formula abaixo representada
Tiacutetulo viral (UFPmL) = N x FC x 10
N = nuacutemero de placas de lise contadas
FC = Fator de correccedilatildeo
= Inverso da diluiccedilatildeo na qual foram contadas as placas de lise
43 Compostos de naftoquinonas
Os compostos utilizados neste estudo foram fornecidos pelo Dr Geraldo Ceacutelio
Brandatildeo do laboratoacuterio de pesquisa da Escola de Farmaacutecia da Universidade Federal de Ouro
Preto
20
Tabela 1 Relaccedilatildeo de nome estrutura e coacutedigo dos compostos utilizados Na tabela estatildeo
presentes a relaccedilatildeo dos nomes dos compostos utilizados neste trabalho bem como sua
estrutura Os coacutedigos representantes de cada composto seratildeo utilizados no decorrer da escrita
Nome do composto Estrutura Coacutedigo
Lapachol
A1
β-lapachona
A2
2-Hidroxi-3-(ββ-dimetilvinil)-14-naftoquinona
A3
2-Cloro-14-naftoquinona
A4
Lapachol derivado 1
A5
Lapachol derivado 2 A6
Lapachol derivado 3 A7
Lapachol derivado 4 A8
44 Ensaio de citotoxicidade
Para avaliar a citotoxicidade dos compostos ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas foram incubadas com diferentes concentraccedilotildees dos compostos em triplicata num
volume de 200 microL de meio de cultura por poccedilo na presenccedila de 1 de SFB Os controles natildeo
tratados apresentaram adiccedilatildeo de 200 microL de meio de cultura As ceacutelulas foram entatildeo incubadas
durante 72 horas O meio foi removido e 28 microL de soluccedilatildeo de 5 mg mL MTT (brometo de 3-
21
[45-dimetil-tiazol-2-il]-25 difeniltertrazoacutelio) foi adicionado a cada poccedilo As placas foram re-
incubadas durante 1 hora e 30 minutos e entatildeo 122 microL de DMSO foi adicionado a cada poccedilo e
placas foram agitadas suavemente durante 15 minutos para dissolver os cristais de formazan
A absorbacircncia foi lida em um equipamento leitor de placas Victor X3 (PerkinElmer) a 490
nm A concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC 50) foi definida como a concentraccedilatildeo da amostra que
reduziu a viabilidade celular de 50 em comparaccedilatildeo com controles natildeo tratados Os dados
foram analisados utilizando o programa Prisma
45 Avaliaccedilatildeo da viabilidade e crescimento celular por exclusatildeo de azul de tripan
Ceacutelulas BHK-21 foram cultivadas em placas de 24 poccedilos (7x104 ceacutelulaspoccedilo) e apoacutes
24 horas foram tratadas com as concentraccedilotildees de uso de cada composto e incubadas por 72
horas na presenccedila de 1 de SFB A seguir as ceacutelulas foram tripsinizadas e incubadas com
azul de tripan e entatildeo foi utilizado um contador automatizado de ceacutelulas (Countess II FL
Automated Cell Counter ndash Thermo Fisher Scientific) para contagem das ceacutelulas e avaliaccedilatildeo da
porcentagem de viabilidade e diacircmetro celular do controle nos tempos de 0 24 e 96 horas e
avaliaccedilatildeo dos mesmos paracircmetros para os compostos no tempo de 96 horas (72 horas poacutes
tratamento)
Outra curva de multiplicaccedilatildeo celular foi feita para os compostos A1 A3 A4 e A5 onde as
ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos no momento da confecccedilatildeo da placa e
foram avaliados os mesmos paracircmetros nos tempos de 0 12 24 48 e 72 horas O
equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
46 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
Para determinar a menor Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) responsaacutevel pela letalidade
celular total 2x104 de ceacutelulas BHK-21 foram semeadas em placa de 96 poccedilos Apoacutes a
incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o
meio de cultura foi removido e as ceacutelulas foram expostas a diferentes diluiccedilotildees dos dois
sorotipos de DENV (100 microL de cada diluiccedilatildeo + 100 microL de meio DEMEM 1 SFB) As
diluiccedilotildees seriadas foram realizadas da suspensatildeo viral na razatildeo de 5 para o primeiro poccedilo e de
2 para os demais poccedilos Apoacutes 72 horas as ceacutelulas foram entatildeo fixadas com 200 microL de soluccedilatildeo
22
formalina a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo 1 (pv) de cristal violeta em
PBS para avaliaccedilatildeo da maior diluiccedilatildeo responsaacutevel pela letalidade de 100 das ceacutelulas
47 Ensaio Dose-resposta
Para cada composto foram realizados ensaios de dose-resposta para definiccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de cada composto capaz de promover a reduccedilatildeo na produccedilatildeo viral A atividade
antiviral foi avaliada tambeacutem pelo meacutetodo de MTT Ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas expostas a diferentes concentraccedilotildees dos extratos determinadas a partir das maiores
concentraccedilotildees em que natildeo foram observados efeitos citotoacutexicos As ceacutelulas foram tratadas
com as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de cada composto e em seguida infectadas com DENV
1 (MOI= 5) ou 2 (MOI= 2) Mantendo uma coluna para controle com DMSO uma coluna
para controle de viacuterus uma coluna para controle de citotoxicidade dos compostos e por fim
uma coluna para controle celular As ceacutelulas foram entatildeo incubadas durante 72 horas Apoacutes
este tempo procedeu-se a leitura pelo ensaio de MTT como descrito anteriormente Os dados
foram analisados levando-se em consideraccedilatildeo a leitura das absorbacircncias dos poccedilos dos
controles de viacuterus e do controle celular
Para realizacao destes experimentos os seguintes controles foram adotados
Controle de ceacutelulas poccedilos contendo somente ceacutelulas acrescidas do meio de cultura DMEM
1 SFB Utilizado para avaliar o comportamento das ceacutelulas sem que as mesmas tivessem
contato com qualquer interferente durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo Com isso os poccedilos
reservados para esse controle serviram de padratildeo para comparaccedilatildeo com aqueles em que fosse
observada atividade citotoacutexica ou citopaacutetica
Controle de viacuterus poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM 1 SFB
sem nenhum tratamento e de suspensatildeo de viacuterus Utilizando como referecircncia para anaacutelise da
atividade citopaacutetica provocada pelo viacuterus testado durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo das placas
23
Controle de viacuterus com DMSO Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura
DMEM 1 SFB e DMSO Foi utilizado para avaliar se havia influecircncia prejudicial do
solvente utilizado para diluiccedilatildeo das amostras no meio de cultivo das ceacutelulas e se o mesmo
poderia apresentar alguma potencial atividade antiviral aparente
Controle de citotoxicidade Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM
1 SFB e as quatro principais concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos Foi utilizado
para avaliar se haveria alguma possiacutevel atividade citotoacutexica das concentraccedilotildees dos compostos
em relaccedilatildeo agraves ceacutelulas
48 Ensaio Virucida
Para a realizaccedilatildeo deste ensaio aliacutequotas de 950 microL (diluiccedilatildeo de 20 vezes) do DENV 1 (tiacutetulo
6 x 107 UFPmL) foram incubadas com 50 microL de uma soluccedilatildeo de meio DMEM preparada
com 20x a concentraccedilatildeo natildeo citotoacutexica de cada composto A1 a A8 em banho-maria 37deg C
por 1 hora Apoacutes a incubaccedilatildeo as aliacutequotas foram imediatamente tituladas em ceacutelulas BHK-21
em placas de 6 poccedilos utilizando-se 3 diluiccedilotildees para cada incubaccedilatildeo (20x 20 x 10-1
e 20 x 10-
2) Foram titulados tambeacutem uma aliacutequota incubada apenas com meio DMEM sem nenhum
tratamento e outra aliacutequota incubada com DMSO (Dimetilsulfoacutexido) Estas foram tituladas
utilizando um controle e mais cinco diluiccedilotildees (20x 20 x 10-1
20 x 10-2
20 x 10-3
e 20 x 10-4
)
49 Ensaio antiviral
Neste ensaio ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em placas de 24 poccedilos no dia
seguinte foram tratadas durante 4 horas com as concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas de cada
composto em duplicata Apoacutes o preacute-tratamento as monocamadas foram infectadas com
DENV-1 a uma MOI=5 na presenccedila das concentraccedilotildees de uso respectivas de cada composto
Apoacutes 1 hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus as monocamadas foram lavadas duas vezes com PBS e
foi adicionado 500 microL por poccedilo de meio preparado com as mesmas concentraccedilotildees dos
diferentes compostos e mantidos durante 48 horas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5 Em
quatro poccedilos as ceacutelulas foram infectadas e natildeo tratadas e em outros quatro poccedilos as ceacutelulas
natildeo foram tratadas e nem infectadas (controle de ceacutelulas) destes uacuteltimos dois foram
tripsinizados e contados no momento da infecccedilatildeo e os outros dois apoacutes o teacutermino do ensaio
24
para avaliar o crescimento celular Decorridas as 48 horas o sobrenadante foi coletado e
centrifugado por 10 minutos a 4000 xG para separaccedilatildeo dos debris celulares e prontamente
titulado em placa de 6 poccedilos
410 Anaacutelise estatiacutestica
Os valores de CC50 foram obtidos a partir de anaacutelise de regressatildeo linear das curvas de
concentraccedilatildeocitotoxicidade A anaacutelise estatiacutestica dos dados foi realizada pelo programa
GraphPad Prism software Uma anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi utilizada para determinar
as diferenccedilas estatiacutesticas seguida do poacutes teste de Tukey A significacircncia estatiacutestica foi fixada
em p lt005
25
V RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
26
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Ensaio de citotoxicidade celular
Para avaliar a viabilidade da linhagem celular BHK-21 frente ao tratamento com oito
diferentes concentraccedilotildees dos compostos (A1 a A8) realizou-se um ensaio de MTT (brometo
de 3-[45-dimetil-tiazol-2-il]-25-difeniltetrazoacutelio) Este ensaio tem o objetivo de quantificar
espectrofotometricamente o crescimento celular a viabilidade e proliferaccedilatildeo podendo ser
utilizado como um indicador direto de citotoxicidade Trata-se de um ensaio colorimeacutetrico
para medir a atividade da redutase mitocondrial em ceacutelulas vivas Ele se baseia na reduccedilatildeo do
sal amarelo tetrazoacutelio (permeaacutevel agrave membrana celular) para cristais de formazan azuis
puacuterpura por ceacutelulas metabolicamente ativas a quantidade de formazan gerada medida por
espectrofotometria eacute proporcional ao nuacutemero de ceacutelulas viaacuteveis
A CC50 foi calculada plotando-se uma curva de porcentagem de viabilidade celular por
concentraccedilatildeo melhor representada na figura 7 pelo composto A7 e os resultados de CC50
para todos os compostos estatildeo representados na tabela 2 Foram feitos ensaios de
citotoxicidade com oito concentraccedilotildees diferentes sendo escolhida a maior concentraccedilatildeo que
natildeo apresentou citotoxicidade
Viabilidade Celular = [ ( A ndash B ) A ] x 100
Onde
A = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas natildeo tratadas
B = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas tratadas com
as respectivas concentraccedilotildees de cada composto
27
28
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (A curva dose resposta do composto A7 eacute a que
melhor representa a curva dose resposta esperada) Avaliou-se a viabilidade da linhagem
celular BHK-21 frente agrave diferentes concentraccedilotildees dos compostos realizando o ensaio de MTT
e determinando assim as concentraccedilotildees a serem utilizadas nos proacuteximos ensaios bem como
calculando a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) agrave partir da curva
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo
da concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50)
Composto Concentraccedilatildeo utilizada
[ ] microgmL
Concentraccedilatildeo citotoacutexica 50
(CC50) [ ] microgmL plusmn Desvio
Padratildeo
A1 ([ ]=1 mgmL) 00200 10010 plusmn 0014
A2 ([ ]=1 mgmL) 00025 09561 plusmn 0023
A3 ([ ]=1 mgmL) 00025 09988 plusmn 0017
A4 ([ ]=5 mgmL) 00125 10150 plusmn 0036
A5 ([ ]=10 mgmL) 00250 10590 plusmn 0047
A6 ([ ]=5 mgmL) 00250 08183 plusmn 0030
A7 ([ ]=5 mgmL) 00125 10280 plusmn 0052
A8 ([ ]=5 mgmL) 00125 09758 plusmn 0036
52 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan
Para corroborar o ensaio anterior de citotoxicidade utilizou -se o teste de viabilidade
celular pela teacutecnica da exclusatildeo do azul de tripan com a finalidade de determinar a
viabilidade das ceacutelulas Os procedimentos adotados no ensaio seguiram o manual do
equipamento contador automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL Automated Cell Counter) entatildeo
foi acrescentado agrave 10 microL da suspensatildeo celular 10 microL de azul de tripan (04) Apoacutes
homogeneizaccedilatildeo 10 microL da suspensatildeo foi colocada no local indicado da lacircmina proacutepria para
leitura e foi realizada a contagem sendo consideradas mortas (inviaacuteveis) as ceacutelulas que
incorporavam o corante e viaacuteveis as que excluiacuteam o azul de tripan
29
O equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
(A)
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan A avaliaccedilatildeo da
viabilidade celular foi realizada atraveacutes de um contador automaacutetico de ceacutelulas Este
equipamento possibilita explorar ferramentas de fotografia e avaliar alguns paracircmetros
importantes (A) fotografia das ceacutelulas (B) Zoom na fotografia das ceacutelulas com marcaccedilotildees
(em verde para ceacutelulas vivas e vermelho para mortas) e (D) contagem das ceacutelulas totais
ceacutelulas vivas e mortas graacutefico e meacutedia dos diacircmetros celulares das ceacutelulas vivas e mortas
(B)
(C)
30
O crescimento celular de ceacutelulas natildeo tratadas foi avaliado nos tempos de 0h (momento
da confecccedilatildeo da placa) 24h (momento de tratamento com os compostos) e 96 horas
(Momento em que todas as ceacutelulas foram tripsinizadas e contadas) para avaliar o perfil do
crescimento celular em ceacutelulas natildeo tratadas Foi observado um crescimento celular no periacuteodo
de 24 horas onde as ceacutelulas estavam incubadas com meio acrescido de 10 SFB Em 24
horas o meio foi trocado por 1 SFB e acrescido das substacircncias testes nas menores diluiccedilotildees
natildeo citotoacutexicas determinadas pelo ensaio do MTT Em 96 horas pode ser observado um
decaimento no nuacutemero de ceacutelulas vivas provavelmente devido ao crescimento celular (morte
por confluecircncia)
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas)
(A) (B)
31
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas (A)
Contagem de ceacutelulas vivas (B) Percentual de ceacutelulas viaacuteveis (Viabilidade celular ) e (C)
Meacutedia do diacircmetro apresentado pelas ceacutelulas vivas
Em 96 horas as ceacutelulas natildeo tratadas bem como as ceacutelulas tratadas por 72 horas com as
concentraccedilotildees de uso dos compostos foram tripsinizadas e avaliadas quanto ao nuacutemero de
ceacutelulas vivas viabilidade e diacircmetro celular apresentados na figura 10
Segundo se observa natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo aparente que possa demonstrar que
as concentraccedilotildees de uso dos compostos tenham causado alguma atividade citotoacutexica
corroborando assim os ensaios de citotoxicidade anteriores
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
A infectividade de um viacuterus depende de vaacuterios fatores entre eles da proporccedilatildeo de
partiacuteculas virais completas ou infecciosas da suscetibilidade da ceacutelula hospedeira e da
chance desta partiacutecula encontrar o receptor e penetrar na ceacutelula Quando ceacutelulas suscetiacuteveis
satildeo misturadas com uma suspensatildeo de viacuterus estas podem receber uma duas trecircs ou dez
partiacuteculas virais ou nenhuma Isto depende da proporccedilatildeo entre a quantidade de viacuterus
infecciosos presente no inoculo e a quantidade de ceacutelulas utilizada Esta relaccedilatildeo eacute denominada
de multiplicidade de infecccedilatildeo ou MOI Uma MOI=1 indica que a infecccedilatildeo foi feita em
principio com 1 viacuterus ou 1 dose infectante por ceacutelula
A determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo dos Dengue virus 1 e 2 a serem
utilizadas nos proacuteximos ensaios foi feita a partir da infecccedilatildeo de ceacutelulas BHK-21 por diferentes
(C)
32
concentraccedilotildees de viacuterus e revelaccedilatildeo com cristal violeta Escolheu-se a maior diluiccedilatildeo viral que
possibilitou a letalidade total das ceacutelulas (faixa onde todas as ceacutelulas estatildeo mortas utilizando
menor concentraccedilatildeo de viacuterus) As faixas escolhidas foram entatildeo calculadas levando-se em
consideraccedilatildeo o nuacutemero de ceacutelulas presentes no poccedilo e o nuacutemero de partiacuteculas virais que foram
adicionadas (Faixa3 para DENV2 e 2 para DENV1) Figura 11 Foi estipulado portanto a
Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 2 para DENV 2 e 5 para DENV 1
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI A partir da infecccedilatildeo da linhagem celular BHK-21 em
placa de 96 poccedilos com diferentes diluiccedilotildees de DENV foi determinado que a Multiplicidade
de infecccedilatildeo para o Dengue viacuterus sorotipos 1 e 2 seria de 5 e 2 respectivamente (colunas 2 -
DENV1 e 3 - DENV2)
54 Ensaio dose resposta
Apoacutes a determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas ideais realizou-se um
ensaio dose resposta tratando as ceacutelulas com oito concentraccedilotildees agrave partir das concentraccedilotildees natildeo
citotoacutexicas escolhidas para cada composto e em seguida infectando com DENV sorotipos 1 e
2 nas MOIs estipuladas anteriormente (5 e 2 respectivamente) A porcentagem do efeito
protetor conferida agraves ceacutelulas para cada concentraccedilatildeo de amostra testada foi calculada da
seguinte forma
33
EP = [ (A ndash B) (C ndash B) ] x 100
Onde
A Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas tratadas e infectadas
B Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e infectadas
C Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e natildeo infectadas
Este ensaio tem por objetivo identificar a resposta celular agrave infecccedilatildeo frente ao
tratamento com os compostos em diferentes concentraccedilotildees Assim como o ensaio de
toxicidade este ensaio feito utilizando a teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT permite o teste de vaacuterias
concentraccedilotildees diferentes em um menor tempo e com baixo gasto de material
34
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV1
(MOI=5)
35
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV2
(MOI=2)
36
Takegami et al (1998) demonstraram atividade de furanonaftoquinonas contra o viacuterus
da Encefalite Japonesa (Flavivirus) utilizando a concentraccedilatildeo de 3microgmL poreacutem para os
compostos apresentados avaliados pela teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT nenhuma das
concentraccedilotildees apresentadas produziu efeito antiviral significativo em relaccedilatildeo ao controle
celular como observado nas figuras 12 e 13
Apesar da teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT ser interessante como triagem de atividade
antiviral permitindo o teste de vaacuterias concentraccedilotildees dos compostos em menor tempo e
utilizando uma quantidade razoaacutevel de materiais optou-se por utilizar as maiores
concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas encontradas avaliando sua atividade antiviral por outras
teacutecnicas Como natildeo foi avaliada atividade antiviral preacutevia para nenhum dos compostos frente
agrave infecccedilatildeo por DENV1 e 2 foi selecionado o Dengue virus 1 para dar prosseguimento aos
ensaios
55 Ensaio Virucida
O ensaio virucida foi realizado para avaliar um potencial efeito dos compostos
diretamente sobre a partiacutecula viral Este ensaio eacute importante pois possibilita elucidar se o
composto pode produzir algum efeito sobre a partiacutecula viral impedindo que esta possa infectar
as ceacutelulas
Figura 14 Ensaio virucida Neste ensaio as aliacutequotas de DENV1 foram incubadas com as
concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos e titulados (NT) Controle natildeo tratado
37
Tabela 3 Ensaio virucida Caacutelculo do tiacutetulo viral (UFPmL) e porcentagem representante de
cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 254 x 105 100
DMSO 263 x 105 10335
A1 199 x 105 7835
A2 205 x 105 8071
A3 237 x 105 9311
A4 775 x 104 3049
A5 153 x 105 6024
A6 219 x 105 8602
A7 243 x 105 9547
A8 254 x 105 100
Lagrota et al (1988) demonstraram atividade de 2-HO-3-N-benzil-N(N-benzil-2-
etilamina) -14-naftoquinona sobre a partiacutecula viral de enterovirus De forma contraacuteria apesar
de se verificar a reduccedilatildeo de quase uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais
para o composto A4 natildeo considerou-se esta uma alteraccedilatildeo significativa pois devido agrave
magnitude do nuacutemero de UFPs se trata de uma alteraccedilatildeo muito pequena Portanto os
compostos avaliados neste trabalho natildeo produziram atividade virucida aparente frente ao
tratamento com as concentraccedilotildees de uso
56 Ensaio Antiviral
O sobrenadante de ceacutelulas tratadas previamente e infectadas por DENV1 coletado 48
horas poacutes infecccedilatildeo foi avaliado quanto agrave produccedilatildeo viral de partiacuteculas infecciosas pela
contagem de placas de lise e caacutelculo de Unidades Formadoras de Placa (Titulaccedilatildeo viral em
placa ndash UFPmL)
38
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral Sobrenadante de ceacutelulas tratadas e infectadas por DENV1
coletado apoacutes 48 horas e titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado
Tabela 4 Ensaio Antiviral Coleta do sobrenadante de ceacutelulas infectadas por DENV1 Tiacutetulo
viral (UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o
controle natildeo tratado como 100
Ao perceber um aumento no tiacutetulo viral frente ao tratamento com os compostos A1
A2 e A3 e uma reduccedilatildeo frente ao tratamento com A4 A5 e A6 foram escolhidos dois
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 119 x 105 10000
A1 235 x 105 19748
A2 228 x 105 19160
A3 318 x 105 26723
A4 128 x 104 1076
A5 186 x 103 156
A6 190 x 104 1597
A7 280 x 104 2353
A8 350 x 104 2941
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
40
Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
1
I INTRODUCcedilAtildeO
2
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Flavivirus
O Gecircnero Flavivirus pertencente agrave famiacutelia Flaviviridae inclui 53 espeacutecies
taxonomicamente reconhecidas (ICTV 2016) muitas das quais satildeo importantes patoacutegenos
humanos tais como o Dengue virus (DENV) Yellow fever virus (YFV - viacuterus da febre
amarela ndash protoacutetipo deste gecircnero) Japanese encephalitis virus (JEV - viacuterus da encefalite
japonesa) West Nile virus (WNV - virus do Nilo Ocidental) Zika virus (ZV) entre outros
(Villordo 2016) O nome flavivirus eacute derivado da palavra latina flavus que significa amarelo
significando a icteriacutecia causada pelo YFV Os sintomas da infecccedilatildeo por flavivirus pode variar
de leve febre e mal-estar a encefalite fatal e febre hemorraacutegica (Mukhopadhyay 2005)
Estes viacuterus regulam o metabolismo e a sobrevivecircncia das ceacutelulas infectadas
assegurando a sua proacutepria reproduccedilatildeo e propagaccedilatildeo O viacuterus da dengue tambeacutem provoca a
autofagia uma resposta homeostaacutetica geral que ajuda a ceacutelula infectada sobreviver e produzir
viacuterus (Datan 2016)
Os Flavivirus podem ser agrupados em complexos e sub-complexos antigecircnicos
baseados em criteacuterios soroloacutegicos ou em grupos clados e espeacutecies segundo a sua filogenia
molecular (Lindenbach 2007) A maioria dos membros deste gecircnero satildeo arbovirus (arthropod
borne virus) ou seja satildeo essencialmente transmitidos por Artroacutepodes (Mackenzie 2004)
onde 27 satildeo transmitidos por mosquitos 12 por carrapatos e 14 natildeo possuem vetor
conhecido Os viacuterus transmitidos pela fecircmea do gecircnero Aedes incluem DENV e YFV satildeo
viscerotroacutepicos e possuem primatas como reservatoacuterio natural (Gaunt 2001)
A patogenia da Dengue causada pelo DENV constitui uma das doenccedilas virais mais
importantes em seres humanos transmitidos por insetos e eacute responsaacutevel por cerca de 390
milhotildees de infecccedilotildees por ano O YFV por sua vez causador da febre amarela eacute endecircmico em
vaacuterios paiacuteses do continente Africano e da Ameacuterica do Sul resultando em 200000 casos e
30000 mortes na Aacutefrica mesmo com vacinas eficazes disponiacuteveis Outras doenccedilas causadas
por flaviviacuterus incluem a encefalite do Nilo Ocidental (West Nile virus) e febre Zika (Zika
virus) que satildeo consideradas doenccedilas emergentes com surtos importantes em todo o mundo
(Villordo 2016)
3
12 Dengue virus
Os DENV pertencem ao gecircnero flaviviacuterus e evoluiram em primatas natildeo-humanos a
partir de um ancestral comum Eacute composto por quatro sorotipos antigenicamente distintos
(DENV1-4) que co-circulam por todo o Sudeste da Aacutesia Aacutefrica e Ameacutericas (McArthur 2013)
e em outubro de 2013 foi anunciado um novo sorotipo circulante denominado entatildeo de DENV
5 (Normile 2013) A partiacutecula infecciosa eacute esfeacuterica com 40-50 nm de diacircmetro possuindo
um envelope de lipopolissacariacutedeo O genoma consiste em RNA de fita simples natildeo
segmentado e senso positivo de aproximadamente 11 kb de comprimento e possui uma uacutenica
janela aberta de leitura (start codon) (Guzman 2010) Apoacutes a traduccedilatildeo a uacutenica poliproteiacutena
formada eacute clivada por proteases virais e celulares em trecircs proteiacutenas estruturais que compotildeem
a partiacutecula viral C (capsideo) prM M (membrana e o seu precursor) e E (envelope) e sete
proteiacutenas natildeo estruturais essenciais para a replicaccedilatildeo viral (NS) (NS1 NS2a NS2b NS3
NS4a NS4b e NS5) (Robertson 2009)
A transmissatildeo do viacuterus ocorre atraveacutes da picada por fecircmeas infectadas de mosquitos
do gecircnero Aedes sendo responsaacutevel pelas maiores taxas de doenccedila e mortalidade entre os
membros do gecircnero Flavivirus (Mukhopadhyay 2005) No Brasil o Aedes aegypti eacute o
principal vetor de dengue enquanto o Aedes albopictus atua como um vector secundaacuterio
(Weaver 2010)
O diagnoacutestico soroloacutegico da Dengue se baseia na detecccedilatildeo de niacuteveis elevados de
anticorpos anti-Dengue-IgM ou anti-Dengue-IgG que reconhecem e se ligam ao antiacutegeno de
DENV A Glicoproteiacutena do envelope (E) uma proteiacutena estrutural de DENV eacute o alvo
antigecircnico mais importante destes anticorpos neutralizantes porque estaacute exposta na superfiacutecie
do viacuterus e medeia os receptores de ligaccedilatildeo e fusatildeo da ceacutelula hospedeira (Lee 2015)
Durante a infecccedilatildeo celular os virions de DENV se ligam agrave superfiacutecie da membrana
atraveacutes da glicoproteiacutena do envelope (E) a receptores especiacuteficos e satildeo internalizados por
endocitose Uma vez dentro do endossoma a acidificaccedilatildeo provocada pela ligaccedilatildeo de
lisossomos desencadeia uma trimerizaccedilatildeo irreversiacutevel da proteiacutena E que atua na fusatildeo das
membranas virais e endossomais celulares Apoacutes essa fusatildeo o nucleocapsideo eacute liberado no
citoplasma onde o mesmo eacute desnudado e a replicaccedilatildeo do genoma de RNA e montagem de
partiacuteculas eacute iniciada As partiacuteculas virais imaturas satildeo acumuladas no luacutemen do retiacuteculo
endoplasmaacutetico (RE) Essas partiacuteculas imaturas que contecircm proteiacutenas prM proteiacutena E
membrana lipiacutedica e nuacutecleo capsiacutedeo natildeo pode induzir a fusatildeo da ceacutelula hospedeira ou seja
4
neste estaacutegio elas natildeo satildeo infecciosas (Mukhopadhyay 2005) O processo de maturaccedilatildeo
desses viacuterus ocorre apoacutes a clivagem proteoliacutetica da proteiacutena precursora de membrana (prM)
transformando viacuterus inerte em partiacuteculas infecciosas (Li 2008) Partiacuteculas subvirais satildeo
tambeacutem produzidas no RE mas apenas contecircm as glicoproteiacutenas de membrana fazendo com
que estas partiacuteculas sejam natildeo infecciosas Os viacuterus maduros e as partiacuteculas sub-virais satildeo
liberados da ceacutelula hospedeira por exocitose (Mukhopadhyay 2005)
Na pele o DENV tende a infectar ceacutelulas dendriacuteticas imaturas Estas ceacutelulas infectadas
amadurecem e migram para os gacircnglios linfaacuteticos regionais ou locais onde apresentam
antiacutegenos virais agraves ceacutelulas T iniciando as respostas imunes Existe tambeacutem evidecircncia de
replicaccedilatildeo abundante de DENV em ceacutelulas do parecircnquima do fiacutegado e em macroacutefagos nos
gacircnglios linfaacuteticos fiacutegado e baccedilo bem como em monoacutecitos de sangue perifeacuterico (Guzman
2010)
Proteiacutena E
(diacutemero)
Proteiacutena
M
Proteiacutena C
ssRNA (+)
Figura 1 Estrutura da partiacutecula viral de Dengue viacuterus A partiacutecula viral eacute composta
por trecircs proteiacutenas estruturais proteiacutena de envelope (E) disposta em diacutemeros a proteiacutena
associada agrave membrana (M) e a proteiacutena do nucleocapsiacutedeo (C) O genoma de RNA fita-
simples de polaridade positiva se encontra dentro do nucleocapsiacutedeo (Adaptado de
httpviralzoneexpasyorgviralzoneall_by_species24html)
5
Figura 2 Ciclo de multiplicaccedilatildeo de DENV A Os viacuterus se ligam aos receptores na superfiacutecie da
ceacutelula e satildeo endocitados B Devido ao baixo pH dentro dos endossomas ocorre a fusatildeo de
membranas viral-celular mediada por proteiacutenas virais resultando na liberaccedilatildeo do RNA viral em um
processo chamado de desnudamento C O genoma viral eacute traduzido em uma uacutenica poliproteiacutena que
eacute processada por proteases do viacuterus e da ceacutelula hospedeira D O RNA eacute replicado por proteiacutenas
natildeo-estruturais do proacuteprio viacuterus E A montagem do viacuterus ocorre na membrana do Reticulo
endoplasmaacutetico no qual a proteiacutena do capsiacutedeo e o RNA viral satildeo envolvidos por glicoproteiacutenas e
pela membrana da organela para formar partiacuteculas virais imaturas F Partiacuteculas virais imaturas
utilizam a via secretora da ceacutelula hospedeira e sob o baixo pH do Complexo de Golgi a proteiacutena
precursora prM eacute clivada em proteiacutena M completando a maturaccedilatildeo do viacuterus GOs viacuterus maduros
satildeo entatildeo liberados das ceacutelulas por exocitose Os nuacutemeros indicados nas caixas coloridas referem-se
ao valor de pH dos respectivos compartimentos Imagem adaptada de PERERA 2009
Adsorccedilatildeo
Siacutentese e processamento
Fusatildeo e
Desnudamento
Replicaccedilatildeo do RNA
Montagem
Maturaccedilatildeo
Liberaccedilatildeo de
viacuterus
maduro
A
B
C
D
E
F
G
6
13 Epidemiologia
Ao longo das uacuteltimas deacutecadas a dengue se tornou a doenccedila viral transmitida por
mosquitos mais prevalente no mundo Estimativas de infecccedilatildeo pela OMS indicam que a
patologia eacute endecircmica em mais de 100 paiacuteses em todos os continentes exceto a Antaacutertida e
aflige principalmente paiacuteses pobres em recursos nas regiotildees tropicais e subtropicais (Perry
2011) Epidemias globais de DENV ocorreram ao longo das uacuteltimas deacutecadas em parte devido
agrave diminuiccedilatildeo dos esforccedilos no controle de mosquitos Satildeo estimados mais de 50 milhotildees de
casos de dengue anualmente (Mukhopadhyay 2005)
A Dengue eacute uma doenccedila viral sistecircmica aguda que se estabeleceu em todo o mundo
em ambos os ciclos de transmissatildeo endecircmicas e epidecircmicas A infecccedilatildeo pelo DENV em seres
humanos eacute frequentemente inaparente mas pode levar a uma grande variedade de
manifestaccedilotildees cliacutenicas de febre leve a siacutendrome do choque da dengue potencialmente fatal A
imunidade vitaliacutecia desenvolvida apoacutes a infecccedilatildeo com um dos quatro tipos de viacuterus eacute
especiacutefica para cada tipo e a progressatildeo para uma doenccedila mais grave eacute frequente mas natildeo
exclusivamente relacionada com infecccedilatildeo secundaacuteria por tipos heteroacutelogos No entanto
enquanto a expansatildeo histoacuterica desta doenccedila eacute bem documentada o elevado fardo de
problemas de sauacutede atribuiacuteveis agrave dengue em grande parte do mundo tropical e sub-tropical
permanecem pouco enumerados (Bhatt 2013)
O Brasil eacute um paiacutes de grande extensatildeo (8512000 km2) situado em uma zona
predominantemente tropical com extensas aacutereas de florestas na regiatildeo amazocircnica bem como
restos de uma floresta tropical na costa leste sudeste e sul entre outros ecossistemas A maior
parte do paiacutes tem um clima tropical e uma grande diversidade de plantas e animais portanto
um local adequado para a ocorrecircncia de patologias causadas por viacuterus transmitidos por
artroacutepodes (Figueiredo 2000) Segundo o boletim epidemioloacutegico do ministeacuterio da sauacutede em
2016 jaacute foram registrados 170103 casos provaacuteveis de dengue no paiacutes ateacute a semana
epidemioloacutegica 5 Nesse periacuteodo a regiatildeo Sudeste registrou o maior nuacutemero de casos
provaacuteveis (96664 casos 568) Em Minas Gerais jaacute foram registradas 19 mortes em
decorrecircncia da Dengue entre 1deg de janeiro e 14 de marccedilo deste ano Outros 91 oacutebitos estatildeo
sob investigaccedilatildeo (BRASIL 2016)
7
Figura 3 Distribuiccedilatildeo geograacutefica da Dengue Aacutereas de risco de transmissatildeo em amarelo
(Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede Adaptado de httpwwwwhointen)
As manifestaccedilotildees da doenccedila foram descritas pela primeira vez apoacutes a Segunda Guerra
Mundial coincidente com o aumento da urbanizaccedilatildeo particularmente na Aacutesia (Weaver 2010)
Atualmente o DENV eacute hiperendecircmico em muitas regiotildees tropicais onde 2 ou mais sorotipos
circulam endemicamente Embora DENV foi provavelmente introduzido periodicamente para
as Ameacutericas atraveacutes de navios desde o seacuteculo 17 o surgimento de DENV no Hemisfeacuterio
Ocidental comeccedilou mais tarde devido a uma campanha de sucesso parcial para erradicar o
vetor A aegypti para controlar a febre amarela Esta campanha teve sucesso na maior parte
das Ameacutericas da deacutecada de 1950 agrave deacutecada de 1970 mas foi interrompida O vetor entatildeo
rapidamente recolonizou quase toda a regiatildeo neotropical e subtropicais e a invasatildeo do DENV
seguiu logo depois Em 1985 A albopictus foi introduzido nos EUA e no Brasil
proporcionando um vetor para a transmissatildeo secundaacuteria de DENV nas Ameacutericas (Hawley
1987)
Os mosquitos vetores principalmente A aegypti tornam-se infectados quando eles se
alimentam do sangue de seres humanos durante o periacuteodo de cinco dias da viremia A
infecccedilatildeo produz um amplo espectro da doenccedila cliacutenica e varia de assintomaacutetica a doenccedila febril
auto-limitante A dengue tambeacutem conhecida como ldquofebre osso quebradordquo devido agraves fortes
dores nas articulaccedilotildees e inclui sintomas de febre alta dores musculares articulares e erupccedilatildeo
cutacircnea Uma pequena porcentagem de indiviacuteduos pode apresentar a siacutendrome do choque da
8
dengue (dengue hemorraacutegica) com risco de vida grave O tratamento eacute amplamente favoraacutevel
usando de reidrataccedilatildeo oral ou intravenosa acompanhamento e atenccedilatildeo meacutedica adequada No
entanto uma das principais consequecircncias da doenccedila eacute a sua capacidade de sobrecarregar
instalaccedilotildees meacutedicas durante um surto e em paiacuteses onde os recursos de sauacutede jaacute estatildeo no
limite isso pode ter efeitos catastroacuteficos Prevenccedilatildeo e tratamento portanto se fazem
altamente necessaacuterios (Perry 2011)
A prevalecircncia global de DENV cresceu drasticamente nas uacuteltimas deacutecadas e ateacute o
momento natildeo haacute nenhum medicamento especiacutefico para combater a infecccedilatildeo as medidas de
prevenccedilatildeo mais eficazes satildeo voltadas para o controle do vetor (Silva 2011) Diante disso a
Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) elegeu o desenvolvimento de vacinas contra o viacuterus da
dengue como prioridade mundial (Kinney 2001) Por conseguinte a busca de substacircncias
naturais ou sinteacuteticas com atividade antiviral especiacutefica sem toxicidade para as ceacutelulas
normais em seres humanos eacute uma estrateacutegia desejada para evitar que a dengue se agrave e
ajudar a controlar a difusatildeo da doenccedila As vaacuterias fases do ciclo viral representam alvos
terapecircuticos individuais que podem ser exploradas (Costa 2013) Nesse sentido vaacuterios
grupos de pesquisa e organizaccedilotildees estatildeo trabalhando com diversas abordagens para o
desenvolvimento de compostos antivirais com atividade protetora contra dengue Dentre elas
uma vasta gama de produtos naturais incluindo plantas numa tentativa de isolar e
caracterizar novos compostos que podem inibir a replicaccedilatildeo do viacuterus ou tratar a infecccedilatildeo
viral Por essa razatildeo extratos e componentes da planta satildeo cada vez mais importantes como
fontes potenciais para agentes antivirais (Silva 2011)
14 Naftoquinonas
As quinonas satildeo compostos aromaacuteticos amplamente distribuiacutedos na natureza e podem
ser encontrados em vaacuterias famiacutelias de plantas bem como isolado de fungos algas e
bacteacuterias Elas satildeo classificadas em benzoquinonas antraquinonas e naftoquinonas de acordo
com as suas estruturas quiacutemicas Naftoquinonas satildeo compostos orgacircnicos altamente reativos
utilizados como corantes naturais ou sinteacuteticos cujas cores variam de amarelo para vermelho
Apresentam cadeia carbocircnica similar ao naftaleno e satildeo caracterizadas por seus dois grupos
carbonila na posiccedilatildeo 1 e 4 por isso satildeo nomeadas de 14-naftoquinonas Os grupos carbonila
tambeacutem podem estar presente na posiccedilatildeo 12 com menor incidecircncia (Loacutepez 2014)
9
Figura 4 Estrutura quiacutemica da 12-naftoquinona (1) e 14-naftoquinona (2)
Entre as quinonas estatildeo compostos biologicamente importantes tais como o grupo da
vitamina K e a coenzima Q (ubiquinona) Estes compostos tecircm um papel importante no
metabolismo celular especialmente como carreadores de eleacutetrons Aleacutem de quinonas que
possuam uma funccedilatildeo bioloacutegica outros compostos desta classe tecircm sido encontrados
mostrando atividade antibioacutetica Alguns deles estatildeo presentes na natureza mas a maior parte
satildeo obtidos sinteticamente entre eles 2-hidroxi-3-alquil-14-naftoquinonas que possuem
evidecircncias de serem ativos in vitro contra os parasitas da malaacuteria e como coccidiostaacuteticos
(Ambrogi 1970)
A atividade bioloacutegica de quinonas estaacute muitas vezes relacionada com o seu
comportamento eletroquiacutemico A capacidade de aceitar um ou dois eleacutetrons para formar o
acircnion radical correspondente ou dianion pode ser o motivo da induccedilatildeo da formaccedilatildeo de
espeacutecies reativas de oxigecircnio responsaacuteveis pelo estresse oxidativo nas ceacutelulas A capacidade
de aceitar eleacutetrons de naftoquinonas pode ser alterada por mudanccedilas de posiccedilatildeo do grupo
carbonila (12- 14-naftoquinonas) ou diferentes substituintes ou funccedilotildees associadas agrave porccedilatildeo
de naftoquinona (Francisco 2010)
As naftoquinonas satildeo largamente encontradas em plantas micro-organismos e alguns
animais Estes compostos tecircm sido amplamente utilizados em diversas culturas como corantes
para cosmeacuteticos tecidos alimentos (Brandelli 2004) e para fins medicinais incluindo
antitumoral (Oliveira 1990 Ferreira 1996) anti-inflamatoacuterios antimalaacuterico antiviral
(Fonseca 2003 Hussain 2007) atibacterianos e antifuacutengicos (Nagata 1998) Estas atividades
bioloacutegicas tecircm justificado o grande nuacutemero de trabalhos (aproximadamente 42 ateacute abril 2016
ndash Pubmed) encontrados na literatura que visa a siacutentese e avaliaccedilatildeo de qualquer das quinonas
naturais ou seus anaacutelogos como agentes farmacoloacutegicos potenciais (Rahmoun 2013)
10
O Lapachol foi descoberto e estudado desde o seacuteculo XIX Foi isolado primeiramente
do lenho da aacutervore argentina ldquolapachordquo Tabebuia avellanedae (Bignoniaceae) conhecida
como Ipecirc roxo Os estudos quiacutemicos foram desenvolvidos inicialmente em 1892 (Fonseca
2003) O lapachol foi descrito pela primeira vez por Paterno em 1821 tendo sua estrutura
quiacutemica estabelecida em 1896 por Hooker que o identificou como uma naftoquinona Esta
naftoquinona possui accedilatildeo antiinflamatoacuteria analgeacutesica antibioacutetica e anti-neoplaacutesica
reconhecida (Arauacutejo 2002)
A β-lapachona (34-di-hidro-22-dimetil-2H-naptho [12-b] pirano-56-diona) eacute uma
quinona obtida de fontes naturais derivada da aacutervore Lapacho (Tabebuia avellanedae) nativa
da Ameacuterica do Sul e Central A siacutentese e quiacutemica da β-lapachona e compostos relacionados
foi inicialmente investigado no final do seacuteculo XIX e iniacutecio do seacuteculo XX pelo quiacutemico
Samuel Hooker Apesar de alguns estudos cliacutenicos sobre a bioatividade de naftoquinonas
terem sido relatados no iniacutecio de 1940 foi o relatoacuterio do potencial da β-lapachona como um
agente anti-tripanossoma em 1977 que revitalizou o estudo e caracterizaccedilatildeo deste composto
natural A β-lapachona tambeacutem apresenta vaacuterias accedilotildees farmacoloacutegicas incluindo accedilatildeo
formaccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (Hussain 2007)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do Lapachol (1) da α- Lapachona (2) e da β-
Lapachona (Fonseca et al 2003 Ferreira et al 2010)
11
Figura 6 Tabebuia avellanedae (Hussain 2007)
A β-lapachona eacute uma substacircncia natural facilmente obtida a partir do lapachol Esta
naftoquinona eacute o grande destaque desta classe de substacircncias porque se encontra em testes
cliacutenicos de fase II para o tratamento do cacircncer de pacircncreas (Ferreira 2010) O mecanismo de
accedilatildeo da β-lapachona diferencia-se de outros antineoplaacutesicos por atuar na topoisomerase I
promovendo a recuperaccedilatildeo da capacidade de apoptose celular Alguns estudos reportam sua
accedilatildeo sineacutergica de potenciaccedilatildeo com o Taxolreg
promovendo a inibiccedilatildeo em diferentes pontos de
replicaccedilatildeo celular aleacutem de sua combinaccedilatildeo com outros tratamentos como a aplicaccedilatildeo de
radiaccedilatildeo ionizante (Cunha 2005)
Vaacuterios estudos jaacute foram publicados demonstrando a atividade antiviral de
naftoquinonas naturais e sinteacuteticas A β-lapachona inibe seletivamente a replicaccedilatildeo do viacuterus
HIV-1 atuando na inibiccedilatildeo da enzima LTR117 Da mesma forma este composto eacute um
potente inibidor da enzima transcriptase reversa dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e
leucemia murina de Rauscher (RLV) inibindo tambeacutem a DNA polimerase A accedilatildeo inibitoacuteria
sobre estas enzimas revelou-se especiacutefica se comparada com a de outros inibidores
conhecidos (Silva 2003)
O Lapachol jaacute demonstrou atividade contra certas cepas virais incluindo Herpes virus
tipos I e II Outras naftoquinonas jaacute mostraram eficaacutecia contra cepas de Influenza virus
Poliomielite virus e estomatite vesicular Supotildee-se que o mecanismo de accedilatildeo destas quinonas
seja atraveacutes da inibiccedilatildeo da transcriptase reversa de retroviacuterus e da RNA polimerase Eacute relatado
12
que lapachol diminui a replicaccedilatildeo do viacuterus em seres humanos mas ainda natildeo existem
resultados de testes cliacutenicos disponiacuteveis (Hussain 2007)
Na avaliaccedilatildeo da atividade antiviral do Lapachol in vitro verificou-se que esta
substacircncia eacute ativa contra viacuterus RNA atuando tanto sobre viacuterus envelopados quanto sobre
partiacuteculas sem esta estrutura em concentraccedilotildees de 5 a 10 microgmL e ainda apresentou uma
pequena atividade sobre HSV (Herpes simplex I) e Ad5 (Adeno tipo 5) mas nenhuma
atividade sobre CoxB4 (Coxsackie B4) Em trabalho posterior demonstrou-se que nem o
Lapachol nem diversos dos seus derivados apresentaram atividade antiviral in vitro sobre
Poliovirus tipo 1 Ecovirus 19 e Coxsackie B tipo 4 Apenas os derivados 12-naftoquinonicos
e um intermediaacuterio da siacutentese Hoocker foram ativos contra o Echovirus 19 (Fonseca 2003)
Costa et al (2013) relataram que piranonaftoquinonas isocircmeras do lapachol possuem
atividade de inibiccedilatildeo da replicaccedilatildeo de DENV-2 atuando sobre a atividade da ATPase de NS3
(proteiacutena natildeo estrutural de DENV)
A utilizaccedilatildeo de testes in vitro por meio de ensaios de viabilidade celular constitui o
primeiro passo para a avaliaccedilatildeo da compatibilidade bioloacutegica de uma substacircncia e pode
fornecer elementos importantes para a anaacutelise da biocompatibilidade dos diferentes materiais
Para ser considerado natildeo citotoacutexico no teste de citotoxicidade in vitro um produto natildeo deve
ocasionar a morte das ceacutelulas nem afetar suas funccedilotildees celulares A prova do MTT eacute um dos
indicadores colorimeacutetricos de viabilidade celular mais utilizados sendo capaz de avaliar a
funccedilatildeo celular mitocondrial de acordo com a reduccedilatildeo enzimaacutetica do sal de tetrazoacutelio pelas
desidrogenases mitocondriais nas ceacutelulas viaacutevies (Arauacutejo et al 2008) Supotildee-se que o
mecanismo responsaacutevel pela citotoxicidade apresentada pelas quinonas esteja relacionado
com o estresse oxidativo causado por esses compostos poreacutem a capacidade de alquilaccedilatildeo de
nucleoacutefilos celulares tambeacutem representa correlaccedilatildeo com tais efeitos bioloacutegicos (Goulart
2004)
13
II JUSTIFICATIVA
14
2 JUSTIFICATIVA
Aleacutem do controle do mosquito transmissor e do desenvolvimento de vacinas que tem
sido exaustivamente estudado nos uacuteltimos anos uma alternativa para o combate agrave dengue
seria o desenvolvimento de faacutermacos para reduzir a viremia ou mesmo para controlar a
resposta imune do hospedeiro agrave infecccedilatildeo que tem sido apontada como principal fator de risco
nos casos mais graves Em funccedilatildeo disso o nuacutemero de pesquisas visando o desenvolvimento
de drogas com accedilatildeo antiviral ou com accedilatildeo imunomodulatoacuteria tem aumentado
significativamente As naftoquinonas vecircm ganhando bastante importacircncia na pesquisa de
novas drogas antivirais devido agrave algumas atividades apresentadas A szlig-lapachona-orto-
naftoquinona por exemplo se mostrou um potente inibidor da enzima transcriptase reversa
dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e leucemia murina de Rauscher (RLV)
Diante da inexistecircncia de drogas com accedilatildeo anti DENV e o elevado nuacutemero e casos da
patogenia nos uacuteltimos anos a organizaccedilatildeo mundial da sauacutede classificou a Dengue como uma
epidemia de proporccedilotildees globais e um problema de sauacutede puacuteblica Como as naftoquinonas jaacute
demonstraram na literatura possuir um potencial efeito terapecircutico contra alguns viacuterus eacute
possiacutevel que estes compostos possam apresentar atividade antiviral contra DENV Portanto
este trabalho visou atraveacutes de ensaios de MTT e titulaccedilotildees virais em placa avaliar a potencial
atividade antiviral de oito compostos derivados de naftoquinonas naturais e sinteacuteticas
15
III OBJETIVOS
16
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar oito compostos (2 naturais e 6 sinteacuteticos) derivados de naftoquinonas como potenciais
agentes antivirais em ceacutelulas BHK-21 frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1 e 2
32 Objetivos especiacuteficos
1 Calcular o iacutendice de citotoxicidade e a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) dos compostos
atraveacutes de ensaio de reduccedilatildeo de MTT
2 Avaliar os efeitos dos compostos sobre o crescimento a viabilidade e o volume celular
pela teacutecnica de exclusatildeo do azul de tripan
3 Determinar a multiplicidade de infecccedilatildeo de DENV 1 e 2 a ser utilizada nos ensaios
antivirais
4 Avaliar a atividade antiviral dos compostos frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1
e 2 atraveacutes do ensaio de MTT
5 Verificar um possiacutevel efeito direto dos compostos agraves partiacuteculas virais de Dengue virus
6 Quantificar a produccedilatildeo de partiacuteculas virais infecciosas no sobrenadante de ceacutelulas
infectadas atraveacutes de titulaccedilatildeo viral pela contagem de unidades formadoras de placas
17
IV MATERIAL E MEacuteTODOS
18
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Linhagens celulares
411 Ceacutelulas C636
As ceacutelulas C636 satildeo ceacutelulas de linhagem contiacutenua de larvas de mosquito Aedes
albopictus Estas ceacutelulas foram utilizadas na produccedilatildeo de estoque viral de DENV sorotipos 1
e 2 para isso foram mantidas em meio de cultura Leibovitz-15 (L-15) (Cultilab)
suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (Cultilab) antibioacuteticos (Penicilina 100 UmL
Streptomicina 100 microgmL) e antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL) a 28degC
412 Ceacutelulas BHK-21
As ceacutelulas BHK-21 satildeo fibroblastos de linhagem contiacutenua derivados de rim de hamster
neonato Estas ceacutelulas foram utilizadas para os experimentos in vitro e para as titulaccedilotildees de
DENV 1 e 2 para isso foram mantidas em meio miacutenimo essencial modificado por Dulbecco
ndash DMEM (Cultilab) suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (SFB) com antibioacuteticos
(Penicilina 100 UmL Streptomicina 100 microgmL) e com antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL)
sendo mantidas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5
42 Viacuterus
421 DENV 1 e DENV 2
O Sorotipo 1 do Dengue virus (DENV-1) estirpe Mochizuki foi replicado em ceacutelulas
C636 para gerar estoques de trabalho durante 2 e 5 dias a 28degC O sobrenadante da cultura de
ceacutelulas infectadas foi recolhido e clarificado por centrifugaccedilatildeo a 4000 G durante 10 minutos agrave
4degC e entatildeo foi aliquotado e armazenado a -70 deg C como reserva de viacuterus ateacute agrave sua utilizaccedilatildeo
A replicaccedilatildeo geraccedilatildeo de estoque e titulaccedilatildeo do Sorotipo 2 do Dengue virus (DENV-2)
estirpe Nova Guineacute C ocorreu nos mesmos moldes do DENV-1
19
422 Titulaccedilatildeo viral
Os estoques virais foram diluiacutedos (10-1
a 10-7
) e inoculados em monocamadas de
ceacutelulas BHK-21 implantadas em placas de 6 poccedilos com confluecircncia de aproximadamente
60 (3x105 ceacutelulas por poccedilo) sendo um poccedilo natildeo infectado mantido para controle celular
Apoacutes uma hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus foram adicionados 3 mL de meio DMEM (Cultilab)
suplementado com 15 de SFB e contendo 15 de Carboximetilcelulose (CMC Synth) As
placas foram entatildeo incubadas a 37degC (CO2 a 5) por 96 horas As ceacutelulas foram entatildeo
fixadas com 2 mL de soluccedilatildeo de formol a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo
1 (pv) de cristal violeta em PBS para contagem das placas de lise O tiacutetulo viral foi
expresso atraveacutes do nuacutemero de unidades formadoras de placa por mL (UFPmL) segundo a
formula abaixo representada
Tiacutetulo viral (UFPmL) = N x FC x 10
N = nuacutemero de placas de lise contadas
FC = Fator de correccedilatildeo
= Inverso da diluiccedilatildeo na qual foram contadas as placas de lise
43 Compostos de naftoquinonas
Os compostos utilizados neste estudo foram fornecidos pelo Dr Geraldo Ceacutelio
Brandatildeo do laboratoacuterio de pesquisa da Escola de Farmaacutecia da Universidade Federal de Ouro
Preto
20
Tabela 1 Relaccedilatildeo de nome estrutura e coacutedigo dos compostos utilizados Na tabela estatildeo
presentes a relaccedilatildeo dos nomes dos compostos utilizados neste trabalho bem como sua
estrutura Os coacutedigos representantes de cada composto seratildeo utilizados no decorrer da escrita
Nome do composto Estrutura Coacutedigo
Lapachol
A1
β-lapachona
A2
2-Hidroxi-3-(ββ-dimetilvinil)-14-naftoquinona
A3
2-Cloro-14-naftoquinona
A4
Lapachol derivado 1
A5
Lapachol derivado 2 A6
Lapachol derivado 3 A7
Lapachol derivado 4 A8
44 Ensaio de citotoxicidade
Para avaliar a citotoxicidade dos compostos ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas foram incubadas com diferentes concentraccedilotildees dos compostos em triplicata num
volume de 200 microL de meio de cultura por poccedilo na presenccedila de 1 de SFB Os controles natildeo
tratados apresentaram adiccedilatildeo de 200 microL de meio de cultura As ceacutelulas foram entatildeo incubadas
durante 72 horas O meio foi removido e 28 microL de soluccedilatildeo de 5 mg mL MTT (brometo de 3-
21
[45-dimetil-tiazol-2-il]-25 difeniltertrazoacutelio) foi adicionado a cada poccedilo As placas foram re-
incubadas durante 1 hora e 30 minutos e entatildeo 122 microL de DMSO foi adicionado a cada poccedilo e
placas foram agitadas suavemente durante 15 minutos para dissolver os cristais de formazan
A absorbacircncia foi lida em um equipamento leitor de placas Victor X3 (PerkinElmer) a 490
nm A concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC 50) foi definida como a concentraccedilatildeo da amostra que
reduziu a viabilidade celular de 50 em comparaccedilatildeo com controles natildeo tratados Os dados
foram analisados utilizando o programa Prisma
45 Avaliaccedilatildeo da viabilidade e crescimento celular por exclusatildeo de azul de tripan
Ceacutelulas BHK-21 foram cultivadas em placas de 24 poccedilos (7x104 ceacutelulaspoccedilo) e apoacutes
24 horas foram tratadas com as concentraccedilotildees de uso de cada composto e incubadas por 72
horas na presenccedila de 1 de SFB A seguir as ceacutelulas foram tripsinizadas e incubadas com
azul de tripan e entatildeo foi utilizado um contador automatizado de ceacutelulas (Countess II FL
Automated Cell Counter ndash Thermo Fisher Scientific) para contagem das ceacutelulas e avaliaccedilatildeo da
porcentagem de viabilidade e diacircmetro celular do controle nos tempos de 0 24 e 96 horas e
avaliaccedilatildeo dos mesmos paracircmetros para os compostos no tempo de 96 horas (72 horas poacutes
tratamento)
Outra curva de multiplicaccedilatildeo celular foi feita para os compostos A1 A3 A4 e A5 onde as
ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos no momento da confecccedilatildeo da placa e
foram avaliados os mesmos paracircmetros nos tempos de 0 12 24 48 e 72 horas O
equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
46 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
Para determinar a menor Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) responsaacutevel pela letalidade
celular total 2x104 de ceacutelulas BHK-21 foram semeadas em placa de 96 poccedilos Apoacutes a
incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o
meio de cultura foi removido e as ceacutelulas foram expostas a diferentes diluiccedilotildees dos dois
sorotipos de DENV (100 microL de cada diluiccedilatildeo + 100 microL de meio DEMEM 1 SFB) As
diluiccedilotildees seriadas foram realizadas da suspensatildeo viral na razatildeo de 5 para o primeiro poccedilo e de
2 para os demais poccedilos Apoacutes 72 horas as ceacutelulas foram entatildeo fixadas com 200 microL de soluccedilatildeo
22
formalina a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo 1 (pv) de cristal violeta em
PBS para avaliaccedilatildeo da maior diluiccedilatildeo responsaacutevel pela letalidade de 100 das ceacutelulas
47 Ensaio Dose-resposta
Para cada composto foram realizados ensaios de dose-resposta para definiccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de cada composto capaz de promover a reduccedilatildeo na produccedilatildeo viral A atividade
antiviral foi avaliada tambeacutem pelo meacutetodo de MTT Ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas expostas a diferentes concentraccedilotildees dos extratos determinadas a partir das maiores
concentraccedilotildees em que natildeo foram observados efeitos citotoacutexicos As ceacutelulas foram tratadas
com as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de cada composto e em seguida infectadas com DENV
1 (MOI= 5) ou 2 (MOI= 2) Mantendo uma coluna para controle com DMSO uma coluna
para controle de viacuterus uma coluna para controle de citotoxicidade dos compostos e por fim
uma coluna para controle celular As ceacutelulas foram entatildeo incubadas durante 72 horas Apoacutes
este tempo procedeu-se a leitura pelo ensaio de MTT como descrito anteriormente Os dados
foram analisados levando-se em consideraccedilatildeo a leitura das absorbacircncias dos poccedilos dos
controles de viacuterus e do controle celular
Para realizacao destes experimentos os seguintes controles foram adotados
Controle de ceacutelulas poccedilos contendo somente ceacutelulas acrescidas do meio de cultura DMEM
1 SFB Utilizado para avaliar o comportamento das ceacutelulas sem que as mesmas tivessem
contato com qualquer interferente durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo Com isso os poccedilos
reservados para esse controle serviram de padratildeo para comparaccedilatildeo com aqueles em que fosse
observada atividade citotoacutexica ou citopaacutetica
Controle de viacuterus poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM 1 SFB
sem nenhum tratamento e de suspensatildeo de viacuterus Utilizando como referecircncia para anaacutelise da
atividade citopaacutetica provocada pelo viacuterus testado durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo das placas
23
Controle de viacuterus com DMSO Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura
DMEM 1 SFB e DMSO Foi utilizado para avaliar se havia influecircncia prejudicial do
solvente utilizado para diluiccedilatildeo das amostras no meio de cultivo das ceacutelulas e se o mesmo
poderia apresentar alguma potencial atividade antiviral aparente
Controle de citotoxicidade Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM
1 SFB e as quatro principais concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos Foi utilizado
para avaliar se haveria alguma possiacutevel atividade citotoacutexica das concentraccedilotildees dos compostos
em relaccedilatildeo agraves ceacutelulas
48 Ensaio Virucida
Para a realizaccedilatildeo deste ensaio aliacutequotas de 950 microL (diluiccedilatildeo de 20 vezes) do DENV 1 (tiacutetulo
6 x 107 UFPmL) foram incubadas com 50 microL de uma soluccedilatildeo de meio DMEM preparada
com 20x a concentraccedilatildeo natildeo citotoacutexica de cada composto A1 a A8 em banho-maria 37deg C
por 1 hora Apoacutes a incubaccedilatildeo as aliacutequotas foram imediatamente tituladas em ceacutelulas BHK-21
em placas de 6 poccedilos utilizando-se 3 diluiccedilotildees para cada incubaccedilatildeo (20x 20 x 10-1
e 20 x 10-
2) Foram titulados tambeacutem uma aliacutequota incubada apenas com meio DMEM sem nenhum
tratamento e outra aliacutequota incubada com DMSO (Dimetilsulfoacutexido) Estas foram tituladas
utilizando um controle e mais cinco diluiccedilotildees (20x 20 x 10-1
20 x 10-2
20 x 10-3
e 20 x 10-4
)
49 Ensaio antiviral
Neste ensaio ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em placas de 24 poccedilos no dia
seguinte foram tratadas durante 4 horas com as concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas de cada
composto em duplicata Apoacutes o preacute-tratamento as monocamadas foram infectadas com
DENV-1 a uma MOI=5 na presenccedila das concentraccedilotildees de uso respectivas de cada composto
Apoacutes 1 hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus as monocamadas foram lavadas duas vezes com PBS e
foi adicionado 500 microL por poccedilo de meio preparado com as mesmas concentraccedilotildees dos
diferentes compostos e mantidos durante 48 horas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5 Em
quatro poccedilos as ceacutelulas foram infectadas e natildeo tratadas e em outros quatro poccedilos as ceacutelulas
natildeo foram tratadas e nem infectadas (controle de ceacutelulas) destes uacuteltimos dois foram
tripsinizados e contados no momento da infecccedilatildeo e os outros dois apoacutes o teacutermino do ensaio
24
para avaliar o crescimento celular Decorridas as 48 horas o sobrenadante foi coletado e
centrifugado por 10 minutos a 4000 xG para separaccedilatildeo dos debris celulares e prontamente
titulado em placa de 6 poccedilos
410 Anaacutelise estatiacutestica
Os valores de CC50 foram obtidos a partir de anaacutelise de regressatildeo linear das curvas de
concentraccedilatildeocitotoxicidade A anaacutelise estatiacutestica dos dados foi realizada pelo programa
GraphPad Prism software Uma anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi utilizada para determinar
as diferenccedilas estatiacutesticas seguida do poacutes teste de Tukey A significacircncia estatiacutestica foi fixada
em p lt005
25
V RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
26
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Ensaio de citotoxicidade celular
Para avaliar a viabilidade da linhagem celular BHK-21 frente ao tratamento com oito
diferentes concentraccedilotildees dos compostos (A1 a A8) realizou-se um ensaio de MTT (brometo
de 3-[45-dimetil-tiazol-2-il]-25-difeniltetrazoacutelio) Este ensaio tem o objetivo de quantificar
espectrofotometricamente o crescimento celular a viabilidade e proliferaccedilatildeo podendo ser
utilizado como um indicador direto de citotoxicidade Trata-se de um ensaio colorimeacutetrico
para medir a atividade da redutase mitocondrial em ceacutelulas vivas Ele se baseia na reduccedilatildeo do
sal amarelo tetrazoacutelio (permeaacutevel agrave membrana celular) para cristais de formazan azuis
puacuterpura por ceacutelulas metabolicamente ativas a quantidade de formazan gerada medida por
espectrofotometria eacute proporcional ao nuacutemero de ceacutelulas viaacuteveis
A CC50 foi calculada plotando-se uma curva de porcentagem de viabilidade celular por
concentraccedilatildeo melhor representada na figura 7 pelo composto A7 e os resultados de CC50
para todos os compostos estatildeo representados na tabela 2 Foram feitos ensaios de
citotoxicidade com oito concentraccedilotildees diferentes sendo escolhida a maior concentraccedilatildeo que
natildeo apresentou citotoxicidade
Viabilidade Celular = [ ( A ndash B ) A ] x 100
Onde
A = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas natildeo tratadas
B = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas tratadas com
as respectivas concentraccedilotildees de cada composto
27
28
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (A curva dose resposta do composto A7 eacute a que
melhor representa a curva dose resposta esperada) Avaliou-se a viabilidade da linhagem
celular BHK-21 frente agrave diferentes concentraccedilotildees dos compostos realizando o ensaio de MTT
e determinando assim as concentraccedilotildees a serem utilizadas nos proacuteximos ensaios bem como
calculando a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) agrave partir da curva
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo
da concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50)
Composto Concentraccedilatildeo utilizada
[ ] microgmL
Concentraccedilatildeo citotoacutexica 50
(CC50) [ ] microgmL plusmn Desvio
Padratildeo
A1 ([ ]=1 mgmL) 00200 10010 plusmn 0014
A2 ([ ]=1 mgmL) 00025 09561 plusmn 0023
A3 ([ ]=1 mgmL) 00025 09988 plusmn 0017
A4 ([ ]=5 mgmL) 00125 10150 plusmn 0036
A5 ([ ]=10 mgmL) 00250 10590 plusmn 0047
A6 ([ ]=5 mgmL) 00250 08183 plusmn 0030
A7 ([ ]=5 mgmL) 00125 10280 plusmn 0052
A8 ([ ]=5 mgmL) 00125 09758 plusmn 0036
52 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan
Para corroborar o ensaio anterior de citotoxicidade utilizou -se o teste de viabilidade
celular pela teacutecnica da exclusatildeo do azul de tripan com a finalidade de determinar a
viabilidade das ceacutelulas Os procedimentos adotados no ensaio seguiram o manual do
equipamento contador automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL Automated Cell Counter) entatildeo
foi acrescentado agrave 10 microL da suspensatildeo celular 10 microL de azul de tripan (04) Apoacutes
homogeneizaccedilatildeo 10 microL da suspensatildeo foi colocada no local indicado da lacircmina proacutepria para
leitura e foi realizada a contagem sendo consideradas mortas (inviaacuteveis) as ceacutelulas que
incorporavam o corante e viaacuteveis as que excluiacuteam o azul de tripan
29
O equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
(A)
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan A avaliaccedilatildeo da
viabilidade celular foi realizada atraveacutes de um contador automaacutetico de ceacutelulas Este
equipamento possibilita explorar ferramentas de fotografia e avaliar alguns paracircmetros
importantes (A) fotografia das ceacutelulas (B) Zoom na fotografia das ceacutelulas com marcaccedilotildees
(em verde para ceacutelulas vivas e vermelho para mortas) e (D) contagem das ceacutelulas totais
ceacutelulas vivas e mortas graacutefico e meacutedia dos diacircmetros celulares das ceacutelulas vivas e mortas
(B)
(C)
30
O crescimento celular de ceacutelulas natildeo tratadas foi avaliado nos tempos de 0h (momento
da confecccedilatildeo da placa) 24h (momento de tratamento com os compostos) e 96 horas
(Momento em que todas as ceacutelulas foram tripsinizadas e contadas) para avaliar o perfil do
crescimento celular em ceacutelulas natildeo tratadas Foi observado um crescimento celular no periacuteodo
de 24 horas onde as ceacutelulas estavam incubadas com meio acrescido de 10 SFB Em 24
horas o meio foi trocado por 1 SFB e acrescido das substacircncias testes nas menores diluiccedilotildees
natildeo citotoacutexicas determinadas pelo ensaio do MTT Em 96 horas pode ser observado um
decaimento no nuacutemero de ceacutelulas vivas provavelmente devido ao crescimento celular (morte
por confluecircncia)
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas)
(A) (B)
31
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas (A)
Contagem de ceacutelulas vivas (B) Percentual de ceacutelulas viaacuteveis (Viabilidade celular ) e (C)
Meacutedia do diacircmetro apresentado pelas ceacutelulas vivas
Em 96 horas as ceacutelulas natildeo tratadas bem como as ceacutelulas tratadas por 72 horas com as
concentraccedilotildees de uso dos compostos foram tripsinizadas e avaliadas quanto ao nuacutemero de
ceacutelulas vivas viabilidade e diacircmetro celular apresentados na figura 10
Segundo se observa natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo aparente que possa demonstrar que
as concentraccedilotildees de uso dos compostos tenham causado alguma atividade citotoacutexica
corroborando assim os ensaios de citotoxicidade anteriores
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
A infectividade de um viacuterus depende de vaacuterios fatores entre eles da proporccedilatildeo de
partiacuteculas virais completas ou infecciosas da suscetibilidade da ceacutelula hospedeira e da
chance desta partiacutecula encontrar o receptor e penetrar na ceacutelula Quando ceacutelulas suscetiacuteveis
satildeo misturadas com uma suspensatildeo de viacuterus estas podem receber uma duas trecircs ou dez
partiacuteculas virais ou nenhuma Isto depende da proporccedilatildeo entre a quantidade de viacuterus
infecciosos presente no inoculo e a quantidade de ceacutelulas utilizada Esta relaccedilatildeo eacute denominada
de multiplicidade de infecccedilatildeo ou MOI Uma MOI=1 indica que a infecccedilatildeo foi feita em
principio com 1 viacuterus ou 1 dose infectante por ceacutelula
A determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo dos Dengue virus 1 e 2 a serem
utilizadas nos proacuteximos ensaios foi feita a partir da infecccedilatildeo de ceacutelulas BHK-21 por diferentes
(C)
32
concentraccedilotildees de viacuterus e revelaccedilatildeo com cristal violeta Escolheu-se a maior diluiccedilatildeo viral que
possibilitou a letalidade total das ceacutelulas (faixa onde todas as ceacutelulas estatildeo mortas utilizando
menor concentraccedilatildeo de viacuterus) As faixas escolhidas foram entatildeo calculadas levando-se em
consideraccedilatildeo o nuacutemero de ceacutelulas presentes no poccedilo e o nuacutemero de partiacuteculas virais que foram
adicionadas (Faixa3 para DENV2 e 2 para DENV1) Figura 11 Foi estipulado portanto a
Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 2 para DENV 2 e 5 para DENV 1
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI A partir da infecccedilatildeo da linhagem celular BHK-21 em
placa de 96 poccedilos com diferentes diluiccedilotildees de DENV foi determinado que a Multiplicidade
de infecccedilatildeo para o Dengue viacuterus sorotipos 1 e 2 seria de 5 e 2 respectivamente (colunas 2 -
DENV1 e 3 - DENV2)
54 Ensaio dose resposta
Apoacutes a determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas ideais realizou-se um
ensaio dose resposta tratando as ceacutelulas com oito concentraccedilotildees agrave partir das concentraccedilotildees natildeo
citotoacutexicas escolhidas para cada composto e em seguida infectando com DENV sorotipos 1 e
2 nas MOIs estipuladas anteriormente (5 e 2 respectivamente) A porcentagem do efeito
protetor conferida agraves ceacutelulas para cada concentraccedilatildeo de amostra testada foi calculada da
seguinte forma
33
EP = [ (A ndash B) (C ndash B) ] x 100
Onde
A Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas tratadas e infectadas
B Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e infectadas
C Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e natildeo infectadas
Este ensaio tem por objetivo identificar a resposta celular agrave infecccedilatildeo frente ao
tratamento com os compostos em diferentes concentraccedilotildees Assim como o ensaio de
toxicidade este ensaio feito utilizando a teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT permite o teste de vaacuterias
concentraccedilotildees diferentes em um menor tempo e com baixo gasto de material
34
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV1
(MOI=5)
35
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV2
(MOI=2)
36
Takegami et al (1998) demonstraram atividade de furanonaftoquinonas contra o viacuterus
da Encefalite Japonesa (Flavivirus) utilizando a concentraccedilatildeo de 3microgmL poreacutem para os
compostos apresentados avaliados pela teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT nenhuma das
concentraccedilotildees apresentadas produziu efeito antiviral significativo em relaccedilatildeo ao controle
celular como observado nas figuras 12 e 13
Apesar da teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT ser interessante como triagem de atividade
antiviral permitindo o teste de vaacuterias concentraccedilotildees dos compostos em menor tempo e
utilizando uma quantidade razoaacutevel de materiais optou-se por utilizar as maiores
concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas encontradas avaliando sua atividade antiviral por outras
teacutecnicas Como natildeo foi avaliada atividade antiviral preacutevia para nenhum dos compostos frente
agrave infecccedilatildeo por DENV1 e 2 foi selecionado o Dengue virus 1 para dar prosseguimento aos
ensaios
55 Ensaio Virucida
O ensaio virucida foi realizado para avaliar um potencial efeito dos compostos
diretamente sobre a partiacutecula viral Este ensaio eacute importante pois possibilita elucidar se o
composto pode produzir algum efeito sobre a partiacutecula viral impedindo que esta possa infectar
as ceacutelulas
Figura 14 Ensaio virucida Neste ensaio as aliacutequotas de DENV1 foram incubadas com as
concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos e titulados (NT) Controle natildeo tratado
37
Tabela 3 Ensaio virucida Caacutelculo do tiacutetulo viral (UFPmL) e porcentagem representante de
cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 254 x 105 100
DMSO 263 x 105 10335
A1 199 x 105 7835
A2 205 x 105 8071
A3 237 x 105 9311
A4 775 x 104 3049
A5 153 x 105 6024
A6 219 x 105 8602
A7 243 x 105 9547
A8 254 x 105 100
Lagrota et al (1988) demonstraram atividade de 2-HO-3-N-benzil-N(N-benzil-2-
etilamina) -14-naftoquinona sobre a partiacutecula viral de enterovirus De forma contraacuteria apesar
de se verificar a reduccedilatildeo de quase uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais
para o composto A4 natildeo considerou-se esta uma alteraccedilatildeo significativa pois devido agrave
magnitude do nuacutemero de UFPs se trata de uma alteraccedilatildeo muito pequena Portanto os
compostos avaliados neste trabalho natildeo produziram atividade virucida aparente frente ao
tratamento com as concentraccedilotildees de uso
56 Ensaio Antiviral
O sobrenadante de ceacutelulas tratadas previamente e infectadas por DENV1 coletado 48
horas poacutes infecccedilatildeo foi avaliado quanto agrave produccedilatildeo viral de partiacuteculas infecciosas pela
contagem de placas de lise e caacutelculo de Unidades Formadoras de Placa (Titulaccedilatildeo viral em
placa ndash UFPmL)
38
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral Sobrenadante de ceacutelulas tratadas e infectadas por DENV1
coletado apoacutes 48 horas e titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado
Tabela 4 Ensaio Antiviral Coleta do sobrenadante de ceacutelulas infectadas por DENV1 Tiacutetulo
viral (UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o
controle natildeo tratado como 100
Ao perceber um aumento no tiacutetulo viral frente ao tratamento com os compostos A1
A2 e A3 e uma reduccedilatildeo frente ao tratamento com A4 A5 e A6 foram escolhidos dois
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 119 x 105 10000
A1 235 x 105 19748
A2 228 x 105 19160
A3 318 x 105 26723
A4 128 x 104 1076
A5 186 x 103 156
A6 190 x 104 1597
A7 280 x 104 2353
A8 350 x 104 2941
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
40
Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
2
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Flavivirus
O Gecircnero Flavivirus pertencente agrave famiacutelia Flaviviridae inclui 53 espeacutecies
taxonomicamente reconhecidas (ICTV 2016) muitas das quais satildeo importantes patoacutegenos
humanos tais como o Dengue virus (DENV) Yellow fever virus (YFV - viacuterus da febre
amarela ndash protoacutetipo deste gecircnero) Japanese encephalitis virus (JEV - viacuterus da encefalite
japonesa) West Nile virus (WNV - virus do Nilo Ocidental) Zika virus (ZV) entre outros
(Villordo 2016) O nome flavivirus eacute derivado da palavra latina flavus que significa amarelo
significando a icteriacutecia causada pelo YFV Os sintomas da infecccedilatildeo por flavivirus pode variar
de leve febre e mal-estar a encefalite fatal e febre hemorraacutegica (Mukhopadhyay 2005)
Estes viacuterus regulam o metabolismo e a sobrevivecircncia das ceacutelulas infectadas
assegurando a sua proacutepria reproduccedilatildeo e propagaccedilatildeo O viacuterus da dengue tambeacutem provoca a
autofagia uma resposta homeostaacutetica geral que ajuda a ceacutelula infectada sobreviver e produzir
viacuterus (Datan 2016)
Os Flavivirus podem ser agrupados em complexos e sub-complexos antigecircnicos
baseados em criteacuterios soroloacutegicos ou em grupos clados e espeacutecies segundo a sua filogenia
molecular (Lindenbach 2007) A maioria dos membros deste gecircnero satildeo arbovirus (arthropod
borne virus) ou seja satildeo essencialmente transmitidos por Artroacutepodes (Mackenzie 2004)
onde 27 satildeo transmitidos por mosquitos 12 por carrapatos e 14 natildeo possuem vetor
conhecido Os viacuterus transmitidos pela fecircmea do gecircnero Aedes incluem DENV e YFV satildeo
viscerotroacutepicos e possuem primatas como reservatoacuterio natural (Gaunt 2001)
A patogenia da Dengue causada pelo DENV constitui uma das doenccedilas virais mais
importantes em seres humanos transmitidos por insetos e eacute responsaacutevel por cerca de 390
milhotildees de infecccedilotildees por ano O YFV por sua vez causador da febre amarela eacute endecircmico em
vaacuterios paiacuteses do continente Africano e da Ameacuterica do Sul resultando em 200000 casos e
30000 mortes na Aacutefrica mesmo com vacinas eficazes disponiacuteveis Outras doenccedilas causadas
por flaviviacuterus incluem a encefalite do Nilo Ocidental (West Nile virus) e febre Zika (Zika
virus) que satildeo consideradas doenccedilas emergentes com surtos importantes em todo o mundo
(Villordo 2016)
3
12 Dengue virus
Os DENV pertencem ao gecircnero flaviviacuterus e evoluiram em primatas natildeo-humanos a
partir de um ancestral comum Eacute composto por quatro sorotipos antigenicamente distintos
(DENV1-4) que co-circulam por todo o Sudeste da Aacutesia Aacutefrica e Ameacutericas (McArthur 2013)
e em outubro de 2013 foi anunciado um novo sorotipo circulante denominado entatildeo de DENV
5 (Normile 2013) A partiacutecula infecciosa eacute esfeacuterica com 40-50 nm de diacircmetro possuindo
um envelope de lipopolissacariacutedeo O genoma consiste em RNA de fita simples natildeo
segmentado e senso positivo de aproximadamente 11 kb de comprimento e possui uma uacutenica
janela aberta de leitura (start codon) (Guzman 2010) Apoacutes a traduccedilatildeo a uacutenica poliproteiacutena
formada eacute clivada por proteases virais e celulares em trecircs proteiacutenas estruturais que compotildeem
a partiacutecula viral C (capsideo) prM M (membrana e o seu precursor) e E (envelope) e sete
proteiacutenas natildeo estruturais essenciais para a replicaccedilatildeo viral (NS) (NS1 NS2a NS2b NS3
NS4a NS4b e NS5) (Robertson 2009)
A transmissatildeo do viacuterus ocorre atraveacutes da picada por fecircmeas infectadas de mosquitos
do gecircnero Aedes sendo responsaacutevel pelas maiores taxas de doenccedila e mortalidade entre os
membros do gecircnero Flavivirus (Mukhopadhyay 2005) No Brasil o Aedes aegypti eacute o
principal vetor de dengue enquanto o Aedes albopictus atua como um vector secundaacuterio
(Weaver 2010)
O diagnoacutestico soroloacutegico da Dengue se baseia na detecccedilatildeo de niacuteveis elevados de
anticorpos anti-Dengue-IgM ou anti-Dengue-IgG que reconhecem e se ligam ao antiacutegeno de
DENV A Glicoproteiacutena do envelope (E) uma proteiacutena estrutural de DENV eacute o alvo
antigecircnico mais importante destes anticorpos neutralizantes porque estaacute exposta na superfiacutecie
do viacuterus e medeia os receptores de ligaccedilatildeo e fusatildeo da ceacutelula hospedeira (Lee 2015)
Durante a infecccedilatildeo celular os virions de DENV se ligam agrave superfiacutecie da membrana
atraveacutes da glicoproteiacutena do envelope (E) a receptores especiacuteficos e satildeo internalizados por
endocitose Uma vez dentro do endossoma a acidificaccedilatildeo provocada pela ligaccedilatildeo de
lisossomos desencadeia uma trimerizaccedilatildeo irreversiacutevel da proteiacutena E que atua na fusatildeo das
membranas virais e endossomais celulares Apoacutes essa fusatildeo o nucleocapsideo eacute liberado no
citoplasma onde o mesmo eacute desnudado e a replicaccedilatildeo do genoma de RNA e montagem de
partiacuteculas eacute iniciada As partiacuteculas virais imaturas satildeo acumuladas no luacutemen do retiacuteculo
endoplasmaacutetico (RE) Essas partiacuteculas imaturas que contecircm proteiacutenas prM proteiacutena E
membrana lipiacutedica e nuacutecleo capsiacutedeo natildeo pode induzir a fusatildeo da ceacutelula hospedeira ou seja
4
neste estaacutegio elas natildeo satildeo infecciosas (Mukhopadhyay 2005) O processo de maturaccedilatildeo
desses viacuterus ocorre apoacutes a clivagem proteoliacutetica da proteiacutena precursora de membrana (prM)
transformando viacuterus inerte em partiacuteculas infecciosas (Li 2008) Partiacuteculas subvirais satildeo
tambeacutem produzidas no RE mas apenas contecircm as glicoproteiacutenas de membrana fazendo com
que estas partiacuteculas sejam natildeo infecciosas Os viacuterus maduros e as partiacuteculas sub-virais satildeo
liberados da ceacutelula hospedeira por exocitose (Mukhopadhyay 2005)
Na pele o DENV tende a infectar ceacutelulas dendriacuteticas imaturas Estas ceacutelulas infectadas
amadurecem e migram para os gacircnglios linfaacuteticos regionais ou locais onde apresentam
antiacutegenos virais agraves ceacutelulas T iniciando as respostas imunes Existe tambeacutem evidecircncia de
replicaccedilatildeo abundante de DENV em ceacutelulas do parecircnquima do fiacutegado e em macroacutefagos nos
gacircnglios linfaacuteticos fiacutegado e baccedilo bem como em monoacutecitos de sangue perifeacuterico (Guzman
2010)
Proteiacutena E
(diacutemero)
Proteiacutena
M
Proteiacutena C
ssRNA (+)
Figura 1 Estrutura da partiacutecula viral de Dengue viacuterus A partiacutecula viral eacute composta
por trecircs proteiacutenas estruturais proteiacutena de envelope (E) disposta em diacutemeros a proteiacutena
associada agrave membrana (M) e a proteiacutena do nucleocapsiacutedeo (C) O genoma de RNA fita-
simples de polaridade positiva se encontra dentro do nucleocapsiacutedeo (Adaptado de
httpviralzoneexpasyorgviralzoneall_by_species24html)
5
Figura 2 Ciclo de multiplicaccedilatildeo de DENV A Os viacuterus se ligam aos receptores na superfiacutecie da
ceacutelula e satildeo endocitados B Devido ao baixo pH dentro dos endossomas ocorre a fusatildeo de
membranas viral-celular mediada por proteiacutenas virais resultando na liberaccedilatildeo do RNA viral em um
processo chamado de desnudamento C O genoma viral eacute traduzido em uma uacutenica poliproteiacutena que
eacute processada por proteases do viacuterus e da ceacutelula hospedeira D O RNA eacute replicado por proteiacutenas
natildeo-estruturais do proacuteprio viacuterus E A montagem do viacuterus ocorre na membrana do Reticulo
endoplasmaacutetico no qual a proteiacutena do capsiacutedeo e o RNA viral satildeo envolvidos por glicoproteiacutenas e
pela membrana da organela para formar partiacuteculas virais imaturas F Partiacuteculas virais imaturas
utilizam a via secretora da ceacutelula hospedeira e sob o baixo pH do Complexo de Golgi a proteiacutena
precursora prM eacute clivada em proteiacutena M completando a maturaccedilatildeo do viacuterus GOs viacuterus maduros
satildeo entatildeo liberados das ceacutelulas por exocitose Os nuacutemeros indicados nas caixas coloridas referem-se
ao valor de pH dos respectivos compartimentos Imagem adaptada de PERERA 2009
Adsorccedilatildeo
Siacutentese e processamento
Fusatildeo e
Desnudamento
Replicaccedilatildeo do RNA
Montagem
Maturaccedilatildeo
Liberaccedilatildeo de
viacuterus
maduro
A
B
C
D
E
F
G
6
13 Epidemiologia
Ao longo das uacuteltimas deacutecadas a dengue se tornou a doenccedila viral transmitida por
mosquitos mais prevalente no mundo Estimativas de infecccedilatildeo pela OMS indicam que a
patologia eacute endecircmica em mais de 100 paiacuteses em todos os continentes exceto a Antaacutertida e
aflige principalmente paiacuteses pobres em recursos nas regiotildees tropicais e subtropicais (Perry
2011) Epidemias globais de DENV ocorreram ao longo das uacuteltimas deacutecadas em parte devido
agrave diminuiccedilatildeo dos esforccedilos no controle de mosquitos Satildeo estimados mais de 50 milhotildees de
casos de dengue anualmente (Mukhopadhyay 2005)
A Dengue eacute uma doenccedila viral sistecircmica aguda que se estabeleceu em todo o mundo
em ambos os ciclos de transmissatildeo endecircmicas e epidecircmicas A infecccedilatildeo pelo DENV em seres
humanos eacute frequentemente inaparente mas pode levar a uma grande variedade de
manifestaccedilotildees cliacutenicas de febre leve a siacutendrome do choque da dengue potencialmente fatal A
imunidade vitaliacutecia desenvolvida apoacutes a infecccedilatildeo com um dos quatro tipos de viacuterus eacute
especiacutefica para cada tipo e a progressatildeo para uma doenccedila mais grave eacute frequente mas natildeo
exclusivamente relacionada com infecccedilatildeo secundaacuteria por tipos heteroacutelogos No entanto
enquanto a expansatildeo histoacuterica desta doenccedila eacute bem documentada o elevado fardo de
problemas de sauacutede atribuiacuteveis agrave dengue em grande parte do mundo tropical e sub-tropical
permanecem pouco enumerados (Bhatt 2013)
O Brasil eacute um paiacutes de grande extensatildeo (8512000 km2) situado em uma zona
predominantemente tropical com extensas aacutereas de florestas na regiatildeo amazocircnica bem como
restos de uma floresta tropical na costa leste sudeste e sul entre outros ecossistemas A maior
parte do paiacutes tem um clima tropical e uma grande diversidade de plantas e animais portanto
um local adequado para a ocorrecircncia de patologias causadas por viacuterus transmitidos por
artroacutepodes (Figueiredo 2000) Segundo o boletim epidemioloacutegico do ministeacuterio da sauacutede em
2016 jaacute foram registrados 170103 casos provaacuteveis de dengue no paiacutes ateacute a semana
epidemioloacutegica 5 Nesse periacuteodo a regiatildeo Sudeste registrou o maior nuacutemero de casos
provaacuteveis (96664 casos 568) Em Minas Gerais jaacute foram registradas 19 mortes em
decorrecircncia da Dengue entre 1deg de janeiro e 14 de marccedilo deste ano Outros 91 oacutebitos estatildeo
sob investigaccedilatildeo (BRASIL 2016)
7
Figura 3 Distribuiccedilatildeo geograacutefica da Dengue Aacutereas de risco de transmissatildeo em amarelo
(Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede Adaptado de httpwwwwhointen)
As manifestaccedilotildees da doenccedila foram descritas pela primeira vez apoacutes a Segunda Guerra
Mundial coincidente com o aumento da urbanizaccedilatildeo particularmente na Aacutesia (Weaver 2010)
Atualmente o DENV eacute hiperendecircmico em muitas regiotildees tropicais onde 2 ou mais sorotipos
circulam endemicamente Embora DENV foi provavelmente introduzido periodicamente para
as Ameacutericas atraveacutes de navios desde o seacuteculo 17 o surgimento de DENV no Hemisfeacuterio
Ocidental comeccedilou mais tarde devido a uma campanha de sucesso parcial para erradicar o
vetor A aegypti para controlar a febre amarela Esta campanha teve sucesso na maior parte
das Ameacutericas da deacutecada de 1950 agrave deacutecada de 1970 mas foi interrompida O vetor entatildeo
rapidamente recolonizou quase toda a regiatildeo neotropical e subtropicais e a invasatildeo do DENV
seguiu logo depois Em 1985 A albopictus foi introduzido nos EUA e no Brasil
proporcionando um vetor para a transmissatildeo secundaacuteria de DENV nas Ameacutericas (Hawley
1987)
Os mosquitos vetores principalmente A aegypti tornam-se infectados quando eles se
alimentam do sangue de seres humanos durante o periacuteodo de cinco dias da viremia A
infecccedilatildeo produz um amplo espectro da doenccedila cliacutenica e varia de assintomaacutetica a doenccedila febril
auto-limitante A dengue tambeacutem conhecida como ldquofebre osso quebradordquo devido agraves fortes
dores nas articulaccedilotildees e inclui sintomas de febre alta dores musculares articulares e erupccedilatildeo
cutacircnea Uma pequena porcentagem de indiviacuteduos pode apresentar a siacutendrome do choque da
8
dengue (dengue hemorraacutegica) com risco de vida grave O tratamento eacute amplamente favoraacutevel
usando de reidrataccedilatildeo oral ou intravenosa acompanhamento e atenccedilatildeo meacutedica adequada No
entanto uma das principais consequecircncias da doenccedila eacute a sua capacidade de sobrecarregar
instalaccedilotildees meacutedicas durante um surto e em paiacuteses onde os recursos de sauacutede jaacute estatildeo no
limite isso pode ter efeitos catastroacuteficos Prevenccedilatildeo e tratamento portanto se fazem
altamente necessaacuterios (Perry 2011)
A prevalecircncia global de DENV cresceu drasticamente nas uacuteltimas deacutecadas e ateacute o
momento natildeo haacute nenhum medicamento especiacutefico para combater a infecccedilatildeo as medidas de
prevenccedilatildeo mais eficazes satildeo voltadas para o controle do vetor (Silva 2011) Diante disso a
Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) elegeu o desenvolvimento de vacinas contra o viacuterus da
dengue como prioridade mundial (Kinney 2001) Por conseguinte a busca de substacircncias
naturais ou sinteacuteticas com atividade antiviral especiacutefica sem toxicidade para as ceacutelulas
normais em seres humanos eacute uma estrateacutegia desejada para evitar que a dengue se agrave e
ajudar a controlar a difusatildeo da doenccedila As vaacuterias fases do ciclo viral representam alvos
terapecircuticos individuais que podem ser exploradas (Costa 2013) Nesse sentido vaacuterios
grupos de pesquisa e organizaccedilotildees estatildeo trabalhando com diversas abordagens para o
desenvolvimento de compostos antivirais com atividade protetora contra dengue Dentre elas
uma vasta gama de produtos naturais incluindo plantas numa tentativa de isolar e
caracterizar novos compostos que podem inibir a replicaccedilatildeo do viacuterus ou tratar a infecccedilatildeo
viral Por essa razatildeo extratos e componentes da planta satildeo cada vez mais importantes como
fontes potenciais para agentes antivirais (Silva 2011)
14 Naftoquinonas
As quinonas satildeo compostos aromaacuteticos amplamente distribuiacutedos na natureza e podem
ser encontrados em vaacuterias famiacutelias de plantas bem como isolado de fungos algas e
bacteacuterias Elas satildeo classificadas em benzoquinonas antraquinonas e naftoquinonas de acordo
com as suas estruturas quiacutemicas Naftoquinonas satildeo compostos orgacircnicos altamente reativos
utilizados como corantes naturais ou sinteacuteticos cujas cores variam de amarelo para vermelho
Apresentam cadeia carbocircnica similar ao naftaleno e satildeo caracterizadas por seus dois grupos
carbonila na posiccedilatildeo 1 e 4 por isso satildeo nomeadas de 14-naftoquinonas Os grupos carbonila
tambeacutem podem estar presente na posiccedilatildeo 12 com menor incidecircncia (Loacutepez 2014)
9
Figura 4 Estrutura quiacutemica da 12-naftoquinona (1) e 14-naftoquinona (2)
Entre as quinonas estatildeo compostos biologicamente importantes tais como o grupo da
vitamina K e a coenzima Q (ubiquinona) Estes compostos tecircm um papel importante no
metabolismo celular especialmente como carreadores de eleacutetrons Aleacutem de quinonas que
possuam uma funccedilatildeo bioloacutegica outros compostos desta classe tecircm sido encontrados
mostrando atividade antibioacutetica Alguns deles estatildeo presentes na natureza mas a maior parte
satildeo obtidos sinteticamente entre eles 2-hidroxi-3-alquil-14-naftoquinonas que possuem
evidecircncias de serem ativos in vitro contra os parasitas da malaacuteria e como coccidiostaacuteticos
(Ambrogi 1970)
A atividade bioloacutegica de quinonas estaacute muitas vezes relacionada com o seu
comportamento eletroquiacutemico A capacidade de aceitar um ou dois eleacutetrons para formar o
acircnion radical correspondente ou dianion pode ser o motivo da induccedilatildeo da formaccedilatildeo de
espeacutecies reativas de oxigecircnio responsaacuteveis pelo estresse oxidativo nas ceacutelulas A capacidade
de aceitar eleacutetrons de naftoquinonas pode ser alterada por mudanccedilas de posiccedilatildeo do grupo
carbonila (12- 14-naftoquinonas) ou diferentes substituintes ou funccedilotildees associadas agrave porccedilatildeo
de naftoquinona (Francisco 2010)
As naftoquinonas satildeo largamente encontradas em plantas micro-organismos e alguns
animais Estes compostos tecircm sido amplamente utilizados em diversas culturas como corantes
para cosmeacuteticos tecidos alimentos (Brandelli 2004) e para fins medicinais incluindo
antitumoral (Oliveira 1990 Ferreira 1996) anti-inflamatoacuterios antimalaacuterico antiviral
(Fonseca 2003 Hussain 2007) atibacterianos e antifuacutengicos (Nagata 1998) Estas atividades
bioloacutegicas tecircm justificado o grande nuacutemero de trabalhos (aproximadamente 42 ateacute abril 2016
ndash Pubmed) encontrados na literatura que visa a siacutentese e avaliaccedilatildeo de qualquer das quinonas
naturais ou seus anaacutelogos como agentes farmacoloacutegicos potenciais (Rahmoun 2013)
10
O Lapachol foi descoberto e estudado desde o seacuteculo XIX Foi isolado primeiramente
do lenho da aacutervore argentina ldquolapachordquo Tabebuia avellanedae (Bignoniaceae) conhecida
como Ipecirc roxo Os estudos quiacutemicos foram desenvolvidos inicialmente em 1892 (Fonseca
2003) O lapachol foi descrito pela primeira vez por Paterno em 1821 tendo sua estrutura
quiacutemica estabelecida em 1896 por Hooker que o identificou como uma naftoquinona Esta
naftoquinona possui accedilatildeo antiinflamatoacuteria analgeacutesica antibioacutetica e anti-neoplaacutesica
reconhecida (Arauacutejo 2002)
A β-lapachona (34-di-hidro-22-dimetil-2H-naptho [12-b] pirano-56-diona) eacute uma
quinona obtida de fontes naturais derivada da aacutervore Lapacho (Tabebuia avellanedae) nativa
da Ameacuterica do Sul e Central A siacutentese e quiacutemica da β-lapachona e compostos relacionados
foi inicialmente investigado no final do seacuteculo XIX e iniacutecio do seacuteculo XX pelo quiacutemico
Samuel Hooker Apesar de alguns estudos cliacutenicos sobre a bioatividade de naftoquinonas
terem sido relatados no iniacutecio de 1940 foi o relatoacuterio do potencial da β-lapachona como um
agente anti-tripanossoma em 1977 que revitalizou o estudo e caracterizaccedilatildeo deste composto
natural A β-lapachona tambeacutem apresenta vaacuterias accedilotildees farmacoloacutegicas incluindo accedilatildeo
formaccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (Hussain 2007)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do Lapachol (1) da α- Lapachona (2) e da β-
Lapachona (Fonseca et al 2003 Ferreira et al 2010)
11
Figura 6 Tabebuia avellanedae (Hussain 2007)
A β-lapachona eacute uma substacircncia natural facilmente obtida a partir do lapachol Esta
naftoquinona eacute o grande destaque desta classe de substacircncias porque se encontra em testes
cliacutenicos de fase II para o tratamento do cacircncer de pacircncreas (Ferreira 2010) O mecanismo de
accedilatildeo da β-lapachona diferencia-se de outros antineoplaacutesicos por atuar na topoisomerase I
promovendo a recuperaccedilatildeo da capacidade de apoptose celular Alguns estudos reportam sua
accedilatildeo sineacutergica de potenciaccedilatildeo com o Taxolreg
promovendo a inibiccedilatildeo em diferentes pontos de
replicaccedilatildeo celular aleacutem de sua combinaccedilatildeo com outros tratamentos como a aplicaccedilatildeo de
radiaccedilatildeo ionizante (Cunha 2005)
Vaacuterios estudos jaacute foram publicados demonstrando a atividade antiviral de
naftoquinonas naturais e sinteacuteticas A β-lapachona inibe seletivamente a replicaccedilatildeo do viacuterus
HIV-1 atuando na inibiccedilatildeo da enzima LTR117 Da mesma forma este composto eacute um
potente inibidor da enzima transcriptase reversa dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e
leucemia murina de Rauscher (RLV) inibindo tambeacutem a DNA polimerase A accedilatildeo inibitoacuteria
sobre estas enzimas revelou-se especiacutefica se comparada com a de outros inibidores
conhecidos (Silva 2003)
O Lapachol jaacute demonstrou atividade contra certas cepas virais incluindo Herpes virus
tipos I e II Outras naftoquinonas jaacute mostraram eficaacutecia contra cepas de Influenza virus
Poliomielite virus e estomatite vesicular Supotildee-se que o mecanismo de accedilatildeo destas quinonas
seja atraveacutes da inibiccedilatildeo da transcriptase reversa de retroviacuterus e da RNA polimerase Eacute relatado
12
que lapachol diminui a replicaccedilatildeo do viacuterus em seres humanos mas ainda natildeo existem
resultados de testes cliacutenicos disponiacuteveis (Hussain 2007)
Na avaliaccedilatildeo da atividade antiviral do Lapachol in vitro verificou-se que esta
substacircncia eacute ativa contra viacuterus RNA atuando tanto sobre viacuterus envelopados quanto sobre
partiacuteculas sem esta estrutura em concentraccedilotildees de 5 a 10 microgmL e ainda apresentou uma
pequena atividade sobre HSV (Herpes simplex I) e Ad5 (Adeno tipo 5) mas nenhuma
atividade sobre CoxB4 (Coxsackie B4) Em trabalho posterior demonstrou-se que nem o
Lapachol nem diversos dos seus derivados apresentaram atividade antiviral in vitro sobre
Poliovirus tipo 1 Ecovirus 19 e Coxsackie B tipo 4 Apenas os derivados 12-naftoquinonicos
e um intermediaacuterio da siacutentese Hoocker foram ativos contra o Echovirus 19 (Fonseca 2003)
Costa et al (2013) relataram que piranonaftoquinonas isocircmeras do lapachol possuem
atividade de inibiccedilatildeo da replicaccedilatildeo de DENV-2 atuando sobre a atividade da ATPase de NS3
(proteiacutena natildeo estrutural de DENV)
A utilizaccedilatildeo de testes in vitro por meio de ensaios de viabilidade celular constitui o
primeiro passo para a avaliaccedilatildeo da compatibilidade bioloacutegica de uma substacircncia e pode
fornecer elementos importantes para a anaacutelise da biocompatibilidade dos diferentes materiais
Para ser considerado natildeo citotoacutexico no teste de citotoxicidade in vitro um produto natildeo deve
ocasionar a morte das ceacutelulas nem afetar suas funccedilotildees celulares A prova do MTT eacute um dos
indicadores colorimeacutetricos de viabilidade celular mais utilizados sendo capaz de avaliar a
funccedilatildeo celular mitocondrial de acordo com a reduccedilatildeo enzimaacutetica do sal de tetrazoacutelio pelas
desidrogenases mitocondriais nas ceacutelulas viaacutevies (Arauacutejo et al 2008) Supotildee-se que o
mecanismo responsaacutevel pela citotoxicidade apresentada pelas quinonas esteja relacionado
com o estresse oxidativo causado por esses compostos poreacutem a capacidade de alquilaccedilatildeo de
nucleoacutefilos celulares tambeacutem representa correlaccedilatildeo com tais efeitos bioloacutegicos (Goulart
2004)
13
II JUSTIFICATIVA
14
2 JUSTIFICATIVA
Aleacutem do controle do mosquito transmissor e do desenvolvimento de vacinas que tem
sido exaustivamente estudado nos uacuteltimos anos uma alternativa para o combate agrave dengue
seria o desenvolvimento de faacutermacos para reduzir a viremia ou mesmo para controlar a
resposta imune do hospedeiro agrave infecccedilatildeo que tem sido apontada como principal fator de risco
nos casos mais graves Em funccedilatildeo disso o nuacutemero de pesquisas visando o desenvolvimento
de drogas com accedilatildeo antiviral ou com accedilatildeo imunomodulatoacuteria tem aumentado
significativamente As naftoquinonas vecircm ganhando bastante importacircncia na pesquisa de
novas drogas antivirais devido agrave algumas atividades apresentadas A szlig-lapachona-orto-
naftoquinona por exemplo se mostrou um potente inibidor da enzima transcriptase reversa
dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e leucemia murina de Rauscher (RLV)
Diante da inexistecircncia de drogas com accedilatildeo anti DENV e o elevado nuacutemero e casos da
patogenia nos uacuteltimos anos a organizaccedilatildeo mundial da sauacutede classificou a Dengue como uma
epidemia de proporccedilotildees globais e um problema de sauacutede puacuteblica Como as naftoquinonas jaacute
demonstraram na literatura possuir um potencial efeito terapecircutico contra alguns viacuterus eacute
possiacutevel que estes compostos possam apresentar atividade antiviral contra DENV Portanto
este trabalho visou atraveacutes de ensaios de MTT e titulaccedilotildees virais em placa avaliar a potencial
atividade antiviral de oito compostos derivados de naftoquinonas naturais e sinteacuteticas
15
III OBJETIVOS
16
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar oito compostos (2 naturais e 6 sinteacuteticos) derivados de naftoquinonas como potenciais
agentes antivirais em ceacutelulas BHK-21 frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1 e 2
32 Objetivos especiacuteficos
1 Calcular o iacutendice de citotoxicidade e a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) dos compostos
atraveacutes de ensaio de reduccedilatildeo de MTT
2 Avaliar os efeitos dos compostos sobre o crescimento a viabilidade e o volume celular
pela teacutecnica de exclusatildeo do azul de tripan
3 Determinar a multiplicidade de infecccedilatildeo de DENV 1 e 2 a ser utilizada nos ensaios
antivirais
4 Avaliar a atividade antiviral dos compostos frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1
e 2 atraveacutes do ensaio de MTT
5 Verificar um possiacutevel efeito direto dos compostos agraves partiacuteculas virais de Dengue virus
6 Quantificar a produccedilatildeo de partiacuteculas virais infecciosas no sobrenadante de ceacutelulas
infectadas atraveacutes de titulaccedilatildeo viral pela contagem de unidades formadoras de placas
17
IV MATERIAL E MEacuteTODOS
18
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Linhagens celulares
411 Ceacutelulas C636
As ceacutelulas C636 satildeo ceacutelulas de linhagem contiacutenua de larvas de mosquito Aedes
albopictus Estas ceacutelulas foram utilizadas na produccedilatildeo de estoque viral de DENV sorotipos 1
e 2 para isso foram mantidas em meio de cultura Leibovitz-15 (L-15) (Cultilab)
suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (Cultilab) antibioacuteticos (Penicilina 100 UmL
Streptomicina 100 microgmL) e antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL) a 28degC
412 Ceacutelulas BHK-21
As ceacutelulas BHK-21 satildeo fibroblastos de linhagem contiacutenua derivados de rim de hamster
neonato Estas ceacutelulas foram utilizadas para os experimentos in vitro e para as titulaccedilotildees de
DENV 1 e 2 para isso foram mantidas em meio miacutenimo essencial modificado por Dulbecco
ndash DMEM (Cultilab) suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (SFB) com antibioacuteticos
(Penicilina 100 UmL Streptomicina 100 microgmL) e com antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL)
sendo mantidas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5
42 Viacuterus
421 DENV 1 e DENV 2
O Sorotipo 1 do Dengue virus (DENV-1) estirpe Mochizuki foi replicado em ceacutelulas
C636 para gerar estoques de trabalho durante 2 e 5 dias a 28degC O sobrenadante da cultura de
ceacutelulas infectadas foi recolhido e clarificado por centrifugaccedilatildeo a 4000 G durante 10 minutos agrave
4degC e entatildeo foi aliquotado e armazenado a -70 deg C como reserva de viacuterus ateacute agrave sua utilizaccedilatildeo
A replicaccedilatildeo geraccedilatildeo de estoque e titulaccedilatildeo do Sorotipo 2 do Dengue virus (DENV-2)
estirpe Nova Guineacute C ocorreu nos mesmos moldes do DENV-1
19
422 Titulaccedilatildeo viral
Os estoques virais foram diluiacutedos (10-1
a 10-7
) e inoculados em monocamadas de
ceacutelulas BHK-21 implantadas em placas de 6 poccedilos com confluecircncia de aproximadamente
60 (3x105 ceacutelulas por poccedilo) sendo um poccedilo natildeo infectado mantido para controle celular
Apoacutes uma hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus foram adicionados 3 mL de meio DMEM (Cultilab)
suplementado com 15 de SFB e contendo 15 de Carboximetilcelulose (CMC Synth) As
placas foram entatildeo incubadas a 37degC (CO2 a 5) por 96 horas As ceacutelulas foram entatildeo
fixadas com 2 mL de soluccedilatildeo de formol a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo
1 (pv) de cristal violeta em PBS para contagem das placas de lise O tiacutetulo viral foi
expresso atraveacutes do nuacutemero de unidades formadoras de placa por mL (UFPmL) segundo a
formula abaixo representada
Tiacutetulo viral (UFPmL) = N x FC x 10
N = nuacutemero de placas de lise contadas
FC = Fator de correccedilatildeo
= Inverso da diluiccedilatildeo na qual foram contadas as placas de lise
43 Compostos de naftoquinonas
Os compostos utilizados neste estudo foram fornecidos pelo Dr Geraldo Ceacutelio
Brandatildeo do laboratoacuterio de pesquisa da Escola de Farmaacutecia da Universidade Federal de Ouro
Preto
20
Tabela 1 Relaccedilatildeo de nome estrutura e coacutedigo dos compostos utilizados Na tabela estatildeo
presentes a relaccedilatildeo dos nomes dos compostos utilizados neste trabalho bem como sua
estrutura Os coacutedigos representantes de cada composto seratildeo utilizados no decorrer da escrita
Nome do composto Estrutura Coacutedigo
Lapachol
A1
β-lapachona
A2
2-Hidroxi-3-(ββ-dimetilvinil)-14-naftoquinona
A3
2-Cloro-14-naftoquinona
A4
Lapachol derivado 1
A5
Lapachol derivado 2 A6
Lapachol derivado 3 A7
Lapachol derivado 4 A8
44 Ensaio de citotoxicidade
Para avaliar a citotoxicidade dos compostos ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas foram incubadas com diferentes concentraccedilotildees dos compostos em triplicata num
volume de 200 microL de meio de cultura por poccedilo na presenccedila de 1 de SFB Os controles natildeo
tratados apresentaram adiccedilatildeo de 200 microL de meio de cultura As ceacutelulas foram entatildeo incubadas
durante 72 horas O meio foi removido e 28 microL de soluccedilatildeo de 5 mg mL MTT (brometo de 3-
21
[45-dimetil-tiazol-2-il]-25 difeniltertrazoacutelio) foi adicionado a cada poccedilo As placas foram re-
incubadas durante 1 hora e 30 minutos e entatildeo 122 microL de DMSO foi adicionado a cada poccedilo e
placas foram agitadas suavemente durante 15 minutos para dissolver os cristais de formazan
A absorbacircncia foi lida em um equipamento leitor de placas Victor X3 (PerkinElmer) a 490
nm A concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC 50) foi definida como a concentraccedilatildeo da amostra que
reduziu a viabilidade celular de 50 em comparaccedilatildeo com controles natildeo tratados Os dados
foram analisados utilizando o programa Prisma
45 Avaliaccedilatildeo da viabilidade e crescimento celular por exclusatildeo de azul de tripan
Ceacutelulas BHK-21 foram cultivadas em placas de 24 poccedilos (7x104 ceacutelulaspoccedilo) e apoacutes
24 horas foram tratadas com as concentraccedilotildees de uso de cada composto e incubadas por 72
horas na presenccedila de 1 de SFB A seguir as ceacutelulas foram tripsinizadas e incubadas com
azul de tripan e entatildeo foi utilizado um contador automatizado de ceacutelulas (Countess II FL
Automated Cell Counter ndash Thermo Fisher Scientific) para contagem das ceacutelulas e avaliaccedilatildeo da
porcentagem de viabilidade e diacircmetro celular do controle nos tempos de 0 24 e 96 horas e
avaliaccedilatildeo dos mesmos paracircmetros para os compostos no tempo de 96 horas (72 horas poacutes
tratamento)
Outra curva de multiplicaccedilatildeo celular foi feita para os compostos A1 A3 A4 e A5 onde as
ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos no momento da confecccedilatildeo da placa e
foram avaliados os mesmos paracircmetros nos tempos de 0 12 24 48 e 72 horas O
equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
46 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
Para determinar a menor Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) responsaacutevel pela letalidade
celular total 2x104 de ceacutelulas BHK-21 foram semeadas em placa de 96 poccedilos Apoacutes a
incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o
meio de cultura foi removido e as ceacutelulas foram expostas a diferentes diluiccedilotildees dos dois
sorotipos de DENV (100 microL de cada diluiccedilatildeo + 100 microL de meio DEMEM 1 SFB) As
diluiccedilotildees seriadas foram realizadas da suspensatildeo viral na razatildeo de 5 para o primeiro poccedilo e de
2 para os demais poccedilos Apoacutes 72 horas as ceacutelulas foram entatildeo fixadas com 200 microL de soluccedilatildeo
22
formalina a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo 1 (pv) de cristal violeta em
PBS para avaliaccedilatildeo da maior diluiccedilatildeo responsaacutevel pela letalidade de 100 das ceacutelulas
47 Ensaio Dose-resposta
Para cada composto foram realizados ensaios de dose-resposta para definiccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de cada composto capaz de promover a reduccedilatildeo na produccedilatildeo viral A atividade
antiviral foi avaliada tambeacutem pelo meacutetodo de MTT Ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas expostas a diferentes concentraccedilotildees dos extratos determinadas a partir das maiores
concentraccedilotildees em que natildeo foram observados efeitos citotoacutexicos As ceacutelulas foram tratadas
com as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de cada composto e em seguida infectadas com DENV
1 (MOI= 5) ou 2 (MOI= 2) Mantendo uma coluna para controle com DMSO uma coluna
para controle de viacuterus uma coluna para controle de citotoxicidade dos compostos e por fim
uma coluna para controle celular As ceacutelulas foram entatildeo incubadas durante 72 horas Apoacutes
este tempo procedeu-se a leitura pelo ensaio de MTT como descrito anteriormente Os dados
foram analisados levando-se em consideraccedilatildeo a leitura das absorbacircncias dos poccedilos dos
controles de viacuterus e do controle celular
Para realizacao destes experimentos os seguintes controles foram adotados
Controle de ceacutelulas poccedilos contendo somente ceacutelulas acrescidas do meio de cultura DMEM
1 SFB Utilizado para avaliar o comportamento das ceacutelulas sem que as mesmas tivessem
contato com qualquer interferente durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo Com isso os poccedilos
reservados para esse controle serviram de padratildeo para comparaccedilatildeo com aqueles em que fosse
observada atividade citotoacutexica ou citopaacutetica
Controle de viacuterus poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM 1 SFB
sem nenhum tratamento e de suspensatildeo de viacuterus Utilizando como referecircncia para anaacutelise da
atividade citopaacutetica provocada pelo viacuterus testado durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo das placas
23
Controle de viacuterus com DMSO Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura
DMEM 1 SFB e DMSO Foi utilizado para avaliar se havia influecircncia prejudicial do
solvente utilizado para diluiccedilatildeo das amostras no meio de cultivo das ceacutelulas e se o mesmo
poderia apresentar alguma potencial atividade antiviral aparente
Controle de citotoxicidade Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM
1 SFB e as quatro principais concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos Foi utilizado
para avaliar se haveria alguma possiacutevel atividade citotoacutexica das concentraccedilotildees dos compostos
em relaccedilatildeo agraves ceacutelulas
48 Ensaio Virucida
Para a realizaccedilatildeo deste ensaio aliacutequotas de 950 microL (diluiccedilatildeo de 20 vezes) do DENV 1 (tiacutetulo
6 x 107 UFPmL) foram incubadas com 50 microL de uma soluccedilatildeo de meio DMEM preparada
com 20x a concentraccedilatildeo natildeo citotoacutexica de cada composto A1 a A8 em banho-maria 37deg C
por 1 hora Apoacutes a incubaccedilatildeo as aliacutequotas foram imediatamente tituladas em ceacutelulas BHK-21
em placas de 6 poccedilos utilizando-se 3 diluiccedilotildees para cada incubaccedilatildeo (20x 20 x 10-1
e 20 x 10-
2) Foram titulados tambeacutem uma aliacutequota incubada apenas com meio DMEM sem nenhum
tratamento e outra aliacutequota incubada com DMSO (Dimetilsulfoacutexido) Estas foram tituladas
utilizando um controle e mais cinco diluiccedilotildees (20x 20 x 10-1
20 x 10-2
20 x 10-3
e 20 x 10-4
)
49 Ensaio antiviral
Neste ensaio ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em placas de 24 poccedilos no dia
seguinte foram tratadas durante 4 horas com as concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas de cada
composto em duplicata Apoacutes o preacute-tratamento as monocamadas foram infectadas com
DENV-1 a uma MOI=5 na presenccedila das concentraccedilotildees de uso respectivas de cada composto
Apoacutes 1 hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus as monocamadas foram lavadas duas vezes com PBS e
foi adicionado 500 microL por poccedilo de meio preparado com as mesmas concentraccedilotildees dos
diferentes compostos e mantidos durante 48 horas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5 Em
quatro poccedilos as ceacutelulas foram infectadas e natildeo tratadas e em outros quatro poccedilos as ceacutelulas
natildeo foram tratadas e nem infectadas (controle de ceacutelulas) destes uacuteltimos dois foram
tripsinizados e contados no momento da infecccedilatildeo e os outros dois apoacutes o teacutermino do ensaio
24
para avaliar o crescimento celular Decorridas as 48 horas o sobrenadante foi coletado e
centrifugado por 10 minutos a 4000 xG para separaccedilatildeo dos debris celulares e prontamente
titulado em placa de 6 poccedilos
410 Anaacutelise estatiacutestica
Os valores de CC50 foram obtidos a partir de anaacutelise de regressatildeo linear das curvas de
concentraccedilatildeocitotoxicidade A anaacutelise estatiacutestica dos dados foi realizada pelo programa
GraphPad Prism software Uma anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi utilizada para determinar
as diferenccedilas estatiacutesticas seguida do poacutes teste de Tukey A significacircncia estatiacutestica foi fixada
em p lt005
25
V RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
26
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Ensaio de citotoxicidade celular
Para avaliar a viabilidade da linhagem celular BHK-21 frente ao tratamento com oito
diferentes concentraccedilotildees dos compostos (A1 a A8) realizou-se um ensaio de MTT (brometo
de 3-[45-dimetil-tiazol-2-il]-25-difeniltetrazoacutelio) Este ensaio tem o objetivo de quantificar
espectrofotometricamente o crescimento celular a viabilidade e proliferaccedilatildeo podendo ser
utilizado como um indicador direto de citotoxicidade Trata-se de um ensaio colorimeacutetrico
para medir a atividade da redutase mitocondrial em ceacutelulas vivas Ele se baseia na reduccedilatildeo do
sal amarelo tetrazoacutelio (permeaacutevel agrave membrana celular) para cristais de formazan azuis
puacuterpura por ceacutelulas metabolicamente ativas a quantidade de formazan gerada medida por
espectrofotometria eacute proporcional ao nuacutemero de ceacutelulas viaacuteveis
A CC50 foi calculada plotando-se uma curva de porcentagem de viabilidade celular por
concentraccedilatildeo melhor representada na figura 7 pelo composto A7 e os resultados de CC50
para todos os compostos estatildeo representados na tabela 2 Foram feitos ensaios de
citotoxicidade com oito concentraccedilotildees diferentes sendo escolhida a maior concentraccedilatildeo que
natildeo apresentou citotoxicidade
Viabilidade Celular = [ ( A ndash B ) A ] x 100
Onde
A = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas natildeo tratadas
B = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas tratadas com
as respectivas concentraccedilotildees de cada composto
27
28
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (A curva dose resposta do composto A7 eacute a que
melhor representa a curva dose resposta esperada) Avaliou-se a viabilidade da linhagem
celular BHK-21 frente agrave diferentes concentraccedilotildees dos compostos realizando o ensaio de MTT
e determinando assim as concentraccedilotildees a serem utilizadas nos proacuteximos ensaios bem como
calculando a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) agrave partir da curva
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo
da concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50)
Composto Concentraccedilatildeo utilizada
[ ] microgmL
Concentraccedilatildeo citotoacutexica 50
(CC50) [ ] microgmL plusmn Desvio
Padratildeo
A1 ([ ]=1 mgmL) 00200 10010 plusmn 0014
A2 ([ ]=1 mgmL) 00025 09561 plusmn 0023
A3 ([ ]=1 mgmL) 00025 09988 plusmn 0017
A4 ([ ]=5 mgmL) 00125 10150 plusmn 0036
A5 ([ ]=10 mgmL) 00250 10590 plusmn 0047
A6 ([ ]=5 mgmL) 00250 08183 plusmn 0030
A7 ([ ]=5 mgmL) 00125 10280 plusmn 0052
A8 ([ ]=5 mgmL) 00125 09758 plusmn 0036
52 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan
Para corroborar o ensaio anterior de citotoxicidade utilizou -se o teste de viabilidade
celular pela teacutecnica da exclusatildeo do azul de tripan com a finalidade de determinar a
viabilidade das ceacutelulas Os procedimentos adotados no ensaio seguiram o manual do
equipamento contador automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL Automated Cell Counter) entatildeo
foi acrescentado agrave 10 microL da suspensatildeo celular 10 microL de azul de tripan (04) Apoacutes
homogeneizaccedilatildeo 10 microL da suspensatildeo foi colocada no local indicado da lacircmina proacutepria para
leitura e foi realizada a contagem sendo consideradas mortas (inviaacuteveis) as ceacutelulas que
incorporavam o corante e viaacuteveis as que excluiacuteam o azul de tripan
29
O equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
(A)
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan A avaliaccedilatildeo da
viabilidade celular foi realizada atraveacutes de um contador automaacutetico de ceacutelulas Este
equipamento possibilita explorar ferramentas de fotografia e avaliar alguns paracircmetros
importantes (A) fotografia das ceacutelulas (B) Zoom na fotografia das ceacutelulas com marcaccedilotildees
(em verde para ceacutelulas vivas e vermelho para mortas) e (D) contagem das ceacutelulas totais
ceacutelulas vivas e mortas graacutefico e meacutedia dos diacircmetros celulares das ceacutelulas vivas e mortas
(B)
(C)
30
O crescimento celular de ceacutelulas natildeo tratadas foi avaliado nos tempos de 0h (momento
da confecccedilatildeo da placa) 24h (momento de tratamento com os compostos) e 96 horas
(Momento em que todas as ceacutelulas foram tripsinizadas e contadas) para avaliar o perfil do
crescimento celular em ceacutelulas natildeo tratadas Foi observado um crescimento celular no periacuteodo
de 24 horas onde as ceacutelulas estavam incubadas com meio acrescido de 10 SFB Em 24
horas o meio foi trocado por 1 SFB e acrescido das substacircncias testes nas menores diluiccedilotildees
natildeo citotoacutexicas determinadas pelo ensaio do MTT Em 96 horas pode ser observado um
decaimento no nuacutemero de ceacutelulas vivas provavelmente devido ao crescimento celular (morte
por confluecircncia)
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas)
(A) (B)
31
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas (A)
Contagem de ceacutelulas vivas (B) Percentual de ceacutelulas viaacuteveis (Viabilidade celular ) e (C)
Meacutedia do diacircmetro apresentado pelas ceacutelulas vivas
Em 96 horas as ceacutelulas natildeo tratadas bem como as ceacutelulas tratadas por 72 horas com as
concentraccedilotildees de uso dos compostos foram tripsinizadas e avaliadas quanto ao nuacutemero de
ceacutelulas vivas viabilidade e diacircmetro celular apresentados na figura 10
Segundo se observa natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo aparente que possa demonstrar que
as concentraccedilotildees de uso dos compostos tenham causado alguma atividade citotoacutexica
corroborando assim os ensaios de citotoxicidade anteriores
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
A infectividade de um viacuterus depende de vaacuterios fatores entre eles da proporccedilatildeo de
partiacuteculas virais completas ou infecciosas da suscetibilidade da ceacutelula hospedeira e da
chance desta partiacutecula encontrar o receptor e penetrar na ceacutelula Quando ceacutelulas suscetiacuteveis
satildeo misturadas com uma suspensatildeo de viacuterus estas podem receber uma duas trecircs ou dez
partiacuteculas virais ou nenhuma Isto depende da proporccedilatildeo entre a quantidade de viacuterus
infecciosos presente no inoculo e a quantidade de ceacutelulas utilizada Esta relaccedilatildeo eacute denominada
de multiplicidade de infecccedilatildeo ou MOI Uma MOI=1 indica que a infecccedilatildeo foi feita em
principio com 1 viacuterus ou 1 dose infectante por ceacutelula
A determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo dos Dengue virus 1 e 2 a serem
utilizadas nos proacuteximos ensaios foi feita a partir da infecccedilatildeo de ceacutelulas BHK-21 por diferentes
(C)
32
concentraccedilotildees de viacuterus e revelaccedilatildeo com cristal violeta Escolheu-se a maior diluiccedilatildeo viral que
possibilitou a letalidade total das ceacutelulas (faixa onde todas as ceacutelulas estatildeo mortas utilizando
menor concentraccedilatildeo de viacuterus) As faixas escolhidas foram entatildeo calculadas levando-se em
consideraccedilatildeo o nuacutemero de ceacutelulas presentes no poccedilo e o nuacutemero de partiacuteculas virais que foram
adicionadas (Faixa3 para DENV2 e 2 para DENV1) Figura 11 Foi estipulado portanto a
Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 2 para DENV 2 e 5 para DENV 1
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI A partir da infecccedilatildeo da linhagem celular BHK-21 em
placa de 96 poccedilos com diferentes diluiccedilotildees de DENV foi determinado que a Multiplicidade
de infecccedilatildeo para o Dengue viacuterus sorotipos 1 e 2 seria de 5 e 2 respectivamente (colunas 2 -
DENV1 e 3 - DENV2)
54 Ensaio dose resposta
Apoacutes a determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas ideais realizou-se um
ensaio dose resposta tratando as ceacutelulas com oito concentraccedilotildees agrave partir das concentraccedilotildees natildeo
citotoacutexicas escolhidas para cada composto e em seguida infectando com DENV sorotipos 1 e
2 nas MOIs estipuladas anteriormente (5 e 2 respectivamente) A porcentagem do efeito
protetor conferida agraves ceacutelulas para cada concentraccedilatildeo de amostra testada foi calculada da
seguinte forma
33
EP = [ (A ndash B) (C ndash B) ] x 100
Onde
A Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas tratadas e infectadas
B Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e infectadas
C Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e natildeo infectadas
Este ensaio tem por objetivo identificar a resposta celular agrave infecccedilatildeo frente ao
tratamento com os compostos em diferentes concentraccedilotildees Assim como o ensaio de
toxicidade este ensaio feito utilizando a teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT permite o teste de vaacuterias
concentraccedilotildees diferentes em um menor tempo e com baixo gasto de material
34
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV1
(MOI=5)
35
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV2
(MOI=2)
36
Takegami et al (1998) demonstraram atividade de furanonaftoquinonas contra o viacuterus
da Encefalite Japonesa (Flavivirus) utilizando a concentraccedilatildeo de 3microgmL poreacutem para os
compostos apresentados avaliados pela teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT nenhuma das
concentraccedilotildees apresentadas produziu efeito antiviral significativo em relaccedilatildeo ao controle
celular como observado nas figuras 12 e 13
Apesar da teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT ser interessante como triagem de atividade
antiviral permitindo o teste de vaacuterias concentraccedilotildees dos compostos em menor tempo e
utilizando uma quantidade razoaacutevel de materiais optou-se por utilizar as maiores
concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas encontradas avaliando sua atividade antiviral por outras
teacutecnicas Como natildeo foi avaliada atividade antiviral preacutevia para nenhum dos compostos frente
agrave infecccedilatildeo por DENV1 e 2 foi selecionado o Dengue virus 1 para dar prosseguimento aos
ensaios
55 Ensaio Virucida
O ensaio virucida foi realizado para avaliar um potencial efeito dos compostos
diretamente sobre a partiacutecula viral Este ensaio eacute importante pois possibilita elucidar se o
composto pode produzir algum efeito sobre a partiacutecula viral impedindo que esta possa infectar
as ceacutelulas
Figura 14 Ensaio virucida Neste ensaio as aliacutequotas de DENV1 foram incubadas com as
concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos e titulados (NT) Controle natildeo tratado
37
Tabela 3 Ensaio virucida Caacutelculo do tiacutetulo viral (UFPmL) e porcentagem representante de
cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 254 x 105 100
DMSO 263 x 105 10335
A1 199 x 105 7835
A2 205 x 105 8071
A3 237 x 105 9311
A4 775 x 104 3049
A5 153 x 105 6024
A6 219 x 105 8602
A7 243 x 105 9547
A8 254 x 105 100
Lagrota et al (1988) demonstraram atividade de 2-HO-3-N-benzil-N(N-benzil-2-
etilamina) -14-naftoquinona sobre a partiacutecula viral de enterovirus De forma contraacuteria apesar
de se verificar a reduccedilatildeo de quase uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais
para o composto A4 natildeo considerou-se esta uma alteraccedilatildeo significativa pois devido agrave
magnitude do nuacutemero de UFPs se trata de uma alteraccedilatildeo muito pequena Portanto os
compostos avaliados neste trabalho natildeo produziram atividade virucida aparente frente ao
tratamento com as concentraccedilotildees de uso
56 Ensaio Antiviral
O sobrenadante de ceacutelulas tratadas previamente e infectadas por DENV1 coletado 48
horas poacutes infecccedilatildeo foi avaliado quanto agrave produccedilatildeo viral de partiacuteculas infecciosas pela
contagem de placas de lise e caacutelculo de Unidades Formadoras de Placa (Titulaccedilatildeo viral em
placa ndash UFPmL)
38
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral Sobrenadante de ceacutelulas tratadas e infectadas por DENV1
coletado apoacutes 48 horas e titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado
Tabela 4 Ensaio Antiviral Coleta do sobrenadante de ceacutelulas infectadas por DENV1 Tiacutetulo
viral (UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o
controle natildeo tratado como 100
Ao perceber um aumento no tiacutetulo viral frente ao tratamento com os compostos A1
A2 e A3 e uma reduccedilatildeo frente ao tratamento com A4 A5 e A6 foram escolhidos dois
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 119 x 105 10000
A1 235 x 105 19748
A2 228 x 105 19160
A3 318 x 105 26723
A4 128 x 104 1076
A5 186 x 103 156
A6 190 x 104 1597
A7 280 x 104 2353
A8 350 x 104 2941
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
40
Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
3
12 Dengue virus
Os DENV pertencem ao gecircnero flaviviacuterus e evoluiram em primatas natildeo-humanos a
partir de um ancestral comum Eacute composto por quatro sorotipos antigenicamente distintos
(DENV1-4) que co-circulam por todo o Sudeste da Aacutesia Aacutefrica e Ameacutericas (McArthur 2013)
e em outubro de 2013 foi anunciado um novo sorotipo circulante denominado entatildeo de DENV
5 (Normile 2013) A partiacutecula infecciosa eacute esfeacuterica com 40-50 nm de diacircmetro possuindo
um envelope de lipopolissacariacutedeo O genoma consiste em RNA de fita simples natildeo
segmentado e senso positivo de aproximadamente 11 kb de comprimento e possui uma uacutenica
janela aberta de leitura (start codon) (Guzman 2010) Apoacutes a traduccedilatildeo a uacutenica poliproteiacutena
formada eacute clivada por proteases virais e celulares em trecircs proteiacutenas estruturais que compotildeem
a partiacutecula viral C (capsideo) prM M (membrana e o seu precursor) e E (envelope) e sete
proteiacutenas natildeo estruturais essenciais para a replicaccedilatildeo viral (NS) (NS1 NS2a NS2b NS3
NS4a NS4b e NS5) (Robertson 2009)
A transmissatildeo do viacuterus ocorre atraveacutes da picada por fecircmeas infectadas de mosquitos
do gecircnero Aedes sendo responsaacutevel pelas maiores taxas de doenccedila e mortalidade entre os
membros do gecircnero Flavivirus (Mukhopadhyay 2005) No Brasil o Aedes aegypti eacute o
principal vetor de dengue enquanto o Aedes albopictus atua como um vector secundaacuterio
(Weaver 2010)
O diagnoacutestico soroloacutegico da Dengue se baseia na detecccedilatildeo de niacuteveis elevados de
anticorpos anti-Dengue-IgM ou anti-Dengue-IgG que reconhecem e se ligam ao antiacutegeno de
DENV A Glicoproteiacutena do envelope (E) uma proteiacutena estrutural de DENV eacute o alvo
antigecircnico mais importante destes anticorpos neutralizantes porque estaacute exposta na superfiacutecie
do viacuterus e medeia os receptores de ligaccedilatildeo e fusatildeo da ceacutelula hospedeira (Lee 2015)
Durante a infecccedilatildeo celular os virions de DENV se ligam agrave superfiacutecie da membrana
atraveacutes da glicoproteiacutena do envelope (E) a receptores especiacuteficos e satildeo internalizados por
endocitose Uma vez dentro do endossoma a acidificaccedilatildeo provocada pela ligaccedilatildeo de
lisossomos desencadeia uma trimerizaccedilatildeo irreversiacutevel da proteiacutena E que atua na fusatildeo das
membranas virais e endossomais celulares Apoacutes essa fusatildeo o nucleocapsideo eacute liberado no
citoplasma onde o mesmo eacute desnudado e a replicaccedilatildeo do genoma de RNA e montagem de
partiacuteculas eacute iniciada As partiacuteculas virais imaturas satildeo acumuladas no luacutemen do retiacuteculo
endoplasmaacutetico (RE) Essas partiacuteculas imaturas que contecircm proteiacutenas prM proteiacutena E
membrana lipiacutedica e nuacutecleo capsiacutedeo natildeo pode induzir a fusatildeo da ceacutelula hospedeira ou seja
4
neste estaacutegio elas natildeo satildeo infecciosas (Mukhopadhyay 2005) O processo de maturaccedilatildeo
desses viacuterus ocorre apoacutes a clivagem proteoliacutetica da proteiacutena precursora de membrana (prM)
transformando viacuterus inerte em partiacuteculas infecciosas (Li 2008) Partiacuteculas subvirais satildeo
tambeacutem produzidas no RE mas apenas contecircm as glicoproteiacutenas de membrana fazendo com
que estas partiacuteculas sejam natildeo infecciosas Os viacuterus maduros e as partiacuteculas sub-virais satildeo
liberados da ceacutelula hospedeira por exocitose (Mukhopadhyay 2005)
Na pele o DENV tende a infectar ceacutelulas dendriacuteticas imaturas Estas ceacutelulas infectadas
amadurecem e migram para os gacircnglios linfaacuteticos regionais ou locais onde apresentam
antiacutegenos virais agraves ceacutelulas T iniciando as respostas imunes Existe tambeacutem evidecircncia de
replicaccedilatildeo abundante de DENV em ceacutelulas do parecircnquima do fiacutegado e em macroacutefagos nos
gacircnglios linfaacuteticos fiacutegado e baccedilo bem como em monoacutecitos de sangue perifeacuterico (Guzman
2010)
Proteiacutena E
(diacutemero)
Proteiacutena
M
Proteiacutena C
ssRNA (+)
Figura 1 Estrutura da partiacutecula viral de Dengue viacuterus A partiacutecula viral eacute composta
por trecircs proteiacutenas estruturais proteiacutena de envelope (E) disposta em diacutemeros a proteiacutena
associada agrave membrana (M) e a proteiacutena do nucleocapsiacutedeo (C) O genoma de RNA fita-
simples de polaridade positiva se encontra dentro do nucleocapsiacutedeo (Adaptado de
httpviralzoneexpasyorgviralzoneall_by_species24html)
5
Figura 2 Ciclo de multiplicaccedilatildeo de DENV A Os viacuterus se ligam aos receptores na superfiacutecie da
ceacutelula e satildeo endocitados B Devido ao baixo pH dentro dos endossomas ocorre a fusatildeo de
membranas viral-celular mediada por proteiacutenas virais resultando na liberaccedilatildeo do RNA viral em um
processo chamado de desnudamento C O genoma viral eacute traduzido em uma uacutenica poliproteiacutena que
eacute processada por proteases do viacuterus e da ceacutelula hospedeira D O RNA eacute replicado por proteiacutenas
natildeo-estruturais do proacuteprio viacuterus E A montagem do viacuterus ocorre na membrana do Reticulo
endoplasmaacutetico no qual a proteiacutena do capsiacutedeo e o RNA viral satildeo envolvidos por glicoproteiacutenas e
pela membrana da organela para formar partiacuteculas virais imaturas F Partiacuteculas virais imaturas
utilizam a via secretora da ceacutelula hospedeira e sob o baixo pH do Complexo de Golgi a proteiacutena
precursora prM eacute clivada em proteiacutena M completando a maturaccedilatildeo do viacuterus GOs viacuterus maduros
satildeo entatildeo liberados das ceacutelulas por exocitose Os nuacutemeros indicados nas caixas coloridas referem-se
ao valor de pH dos respectivos compartimentos Imagem adaptada de PERERA 2009
Adsorccedilatildeo
Siacutentese e processamento
Fusatildeo e
Desnudamento
Replicaccedilatildeo do RNA
Montagem
Maturaccedilatildeo
Liberaccedilatildeo de
viacuterus
maduro
A
B
C
D
E
F
G
6
13 Epidemiologia
Ao longo das uacuteltimas deacutecadas a dengue se tornou a doenccedila viral transmitida por
mosquitos mais prevalente no mundo Estimativas de infecccedilatildeo pela OMS indicam que a
patologia eacute endecircmica em mais de 100 paiacuteses em todos os continentes exceto a Antaacutertida e
aflige principalmente paiacuteses pobres em recursos nas regiotildees tropicais e subtropicais (Perry
2011) Epidemias globais de DENV ocorreram ao longo das uacuteltimas deacutecadas em parte devido
agrave diminuiccedilatildeo dos esforccedilos no controle de mosquitos Satildeo estimados mais de 50 milhotildees de
casos de dengue anualmente (Mukhopadhyay 2005)
A Dengue eacute uma doenccedila viral sistecircmica aguda que se estabeleceu em todo o mundo
em ambos os ciclos de transmissatildeo endecircmicas e epidecircmicas A infecccedilatildeo pelo DENV em seres
humanos eacute frequentemente inaparente mas pode levar a uma grande variedade de
manifestaccedilotildees cliacutenicas de febre leve a siacutendrome do choque da dengue potencialmente fatal A
imunidade vitaliacutecia desenvolvida apoacutes a infecccedilatildeo com um dos quatro tipos de viacuterus eacute
especiacutefica para cada tipo e a progressatildeo para uma doenccedila mais grave eacute frequente mas natildeo
exclusivamente relacionada com infecccedilatildeo secundaacuteria por tipos heteroacutelogos No entanto
enquanto a expansatildeo histoacuterica desta doenccedila eacute bem documentada o elevado fardo de
problemas de sauacutede atribuiacuteveis agrave dengue em grande parte do mundo tropical e sub-tropical
permanecem pouco enumerados (Bhatt 2013)
O Brasil eacute um paiacutes de grande extensatildeo (8512000 km2) situado em uma zona
predominantemente tropical com extensas aacutereas de florestas na regiatildeo amazocircnica bem como
restos de uma floresta tropical na costa leste sudeste e sul entre outros ecossistemas A maior
parte do paiacutes tem um clima tropical e uma grande diversidade de plantas e animais portanto
um local adequado para a ocorrecircncia de patologias causadas por viacuterus transmitidos por
artroacutepodes (Figueiredo 2000) Segundo o boletim epidemioloacutegico do ministeacuterio da sauacutede em
2016 jaacute foram registrados 170103 casos provaacuteveis de dengue no paiacutes ateacute a semana
epidemioloacutegica 5 Nesse periacuteodo a regiatildeo Sudeste registrou o maior nuacutemero de casos
provaacuteveis (96664 casos 568) Em Minas Gerais jaacute foram registradas 19 mortes em
decorrecircncia da Dengue entre 1deg de janeiro e 14 de marccedilo deste ano Outros 91 oacutebitos estatildeo
sob investigaccedilatildeo (BRASIL 2016)
7
Figura 3 Distribuiccedilatildeo geograacutefica da Dengue Aacutereas de risco de transmissatildeo em amarelo
(Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede Adaptado de httpwwwwhointen)
As manifestaccedilotildees da doenccedila foram descritas pela primeira vez apoacutes a Segunda Guerra
Mundial coincidente com o aumento da urbanizaccedilatildeo particularmente na Aacutesia (Weaver 2010)
Atualmente o DENV eacute hiperendecircmico em muitas regiotildees tropicais onde 2 ou mais sorotipos
circulam endemicamente Embora DENV foi provavelmente introduzido periodicamente para
as Ameacutericas atraveacutes de navios desde o seacuteculo 17 o surgimento de DENV no Hemisfeacuterio
Ocidental comeccedilou mais tarde devido a uma campanha de sucesso parcial para erradicar o
vetor A aegypti para controlar a febre amarela Esta campanha teve sucesso na maior parte
das Ameacutericas da deacutecada de 1950 agrave deacutecada de 1970 mas foi interrompida O vetor entatildeo
rapidamente recolonizou quase toda a regiatildeo neotropical e subtropicais e a invasatildeo do DENV
seguiu logo depois Em 1985 A albopictus foi introduzido nos EUA e no Brasil
proporcionando um vetor para a transmissatildeo secundaacuteria de DENV nas Ameacutericas (Hawley
1987)
Os mosquitos vetores principalmente A aegypti tornam-se infectados quando eles se
alimentam do sangue de seres humanos durante o periacuteodo de cinco dias da viremia A
infecccedilatildeo produz um amplo espectro da doenccedila cliacutenica e varia de assintomaacutetica a doenccedila febril
auto-limitante A dengue tambeacutem conhecida como ldquofebre osso quebradordquo devido agraves fortes
dores nas articulaccedilotildees e inclui sintomas de febre alta dores musculares articulares e erupccedilatildeo
cutacircnea Uma pequena porcentagem de indiviacuteduos pode apresentar a siacutendrome do choque da
8
dengue (dengue hemorraacutegica) com risco de vida grave O tratamento eacute amplamente favoraacutevel
usando de reidrataccedilatildeo oral ou intravenosa acompanhamento e atenccedilatildeo meacutedica adequada No
entanto uma das principais consequecircncias da doenccedila eacute a sua capacidade de sobrecarregar
instalaccedilotildees meacutedicas durante um surto e em paiacuteses onde os recursos de sauacutede jaacute estatildeo no
limite isso pode ter efeitos catastroacuteficos Prevenccedilatildeo e tratamento portanto se fazem
altamente necessaacuterios (Perry 2011)
A prevalecircncia global de DENV cresceu drasticamente nas uacuteltimas deacutecadas e ateacute o
momento natildeo haacute nenhum medicamento especiacutefico para combater a infecccedilatildeo as medidas de
prevenccedilatildeo mais eficazes satildeo voltadas para o controle do vetor (Silva 2011) Diante disso a
Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) elegeu o desenvolvimento de vacinas contra o viacuterus da
dengue como prioridade mundial (Kinney 2001) Por conseguinte a busca de substacircncias
naturais ou sinteacuteticas com atividade antiviral especiacutefica sem toxicidade para as ceacutelulas
normais em seres humanos eacute uma estrateacutegia desejada para evitar que a dengue se agrave e
ajudar a controlar a difusatildeo da doenccedila As vaacuterias fases do ciclo viral representam alvos
terapecircuticos individuais que podem ser exploradas (Costa 2013) Nesse sentido vaacuterios
grupos de pesquisa e organizaccedilotildees estatildeo trabalhando com diversas abordagens para o
desenvolvimento de compostos antivirais com atividade protetora contra dengue Dentre elas
uma vasta gama de produtos naturais incluindo plantas numa tentativa de isolar e
caracterizar novos compostos que podem inibir a replicaccedilatildeo do viacuterus ou tratar a infecccedilatildeo
viral Por essa razatildeo extratos e componentes da planta satildeo cada vez mais importantes como
fontes potenciais para agentes antivirais (Silva 2011)
14 Naftoquinonas
As quinonas satildeo compostos aromaacuteticos amplamente distribuiacutedos na natureza e podem
ser encontrados em vaacuterias famiacutelias de plantas bem como isolado de fungos algas e
bacteacuterias Elas satildeo classificadas em benzoquinonas antraquinonas e naftoquinonas de acordo
com as suas estruturas quiacutemicas Naftoquinonas satildeo compostos orgacircnicos altamente reativos
utilizados como corantes naturais ou sinteacuteticos cujas cores variam de amarelo para vermelho
Apresentam cadeia carbocircnica similar ao naftaleno e satildeo caracterizadas por seus dois grupos
carbonila na posiccedilatildeo 1 e 4 por isso satildeo nomeadas de 14-naftoquinonas Os grupos carbonila
tambeacutem podem estar presente na posiccedilatildeo 12 com menor incidecircncia (Loacutepez 2014)
9
Figura 4 Estrutura quiacutemica da 12-naftoquinona (1) e 14-naftoquinona (2)
Entre as quinonas estatildeo compostos biologicamente importantes tais como o grupo da
vitamina K e a coenzima Q (ubiquinona) Estes compostos tecircm um papel importante no
metabolismo celular especialmente como carreadores de eleacutetrons Aleacutem de quinonas que
possuam uma funccedilatildeo bioloacutegica outros compostos desta classe tecircm sido encontrados
mostrando atividade antibioacutetica Alguns deles estatildeo presentes na natureza mas a maior parte
satildeo obtidos sinteticamente entre eles 2-hidroxi-3-alquil-14-naftoquinonas que possuem
evidecircncias de serem ativos in vitro contra os parasitas da malaacuteria e como coccidiostaacuteticos
(Ambrogi 1970)
A atividade bioloacutegica de quinonas estaacute muitas vezes relacionada com o seu
comportamento eletroquiacutemico A capacidade de aceitar um ou dois eleacutetrons para formar o
acircnion radical correspondente ou dianion pode ser o motivo da induccedilatildeo da formaccedilatildeo de
espeacutecies reativas de oxigecircnio responsaacuteveis pelo estresse oxidativo nas ceacutelulas A capacidade
de aceitar eleacutetrons de naftoquinonas pode ser alterada por mudanccedilas de posiccedilatildeo do grupo
carbonila (12- 14-naftoquinonas) ou diferentes substituintes ou funccedilotildees associadas agrave porccedilatildeo
de naftoquinona (Francisco 2010)
As naftoquinonas satildeo largamente encontradas em plantas micro-organismos e alguns
animais Estes compostos tecircm sido amplamente utilizados em diversas culturas como corantes
para cosmeacuteticos tecidos alimentos (Brandelli 2004) e para fins medicinais incluindo
antitumoral (Oliveira 1990 Ferreira 1996) anti-inflamatoacuterios antimalaacuterico antiviral
(Fonseca 2003 Hussain 2007) atibacterianos e antifuacutengicos (Nagata 1998) Estas atividades
bioloacutegicas tecircm justificado o grande nuacutemero de trabalhos (aproximadamente 42 ateacute abril 2016
ndash Pubmed) encontrados na literatura que visa a siacutentese e avaliaccedilatildeo de qualquer das quinonas
naturais ou seus anaacutelogos como agentes farmacoloacutegicos potenciais (Rahmoun 2013)
10
O Lapachol foi descoberto e estudado desde o seacuteculo XIX Foi isolado primeiramente
do lenho da aacutervore argentina ldquolapachordquo Tabebuia avellanedae (Bignoniaceae) conhecida
como Ipecirc roxo Os estudos quiacutemicos foram desenvolvidos inicialmente em 1892 (Fonseca
2003) O lapachol foi descrito pela primeira vez por Paterno em 1821 tendo sua estrutura
quiacutemica estabelecida em 1896 por Hooker que o identificou como uma naftoquinona Esta
naftoquinona possui accedilatildeo antiinflamatoacuteria analgeacutesica antibioacutetica e anti-neoplaacutesica
reconhecida (Arauacutejo 2002)
A β-lapachona (34-di-hidro-22-dimetil-2H-naptho [12-b] pirano-56-diona) eacute uma
quinona obtida de fontes naturais derivada da aacutervore Lapacho (Tabebuia avellanedae) nativa
da Ameacuterica do Sul e Central A siacutentese e quiacutemica da β-lapachona e compostos relacionados
foi inicialmente investigado no final do seacuteculo XIX e iniacutecio do seacuteculo XX pelo quiacutemico
Samuel Hooker Apesar de alguns estudos cliacutenicos sobre a bioatividade de naftoquinonas
terem sido relatados no iniacutecio de 1940 foi o relatoacuterio do potencial da β-lapachona como um
agente anti-tripanossoma em 1977 que revitalizou o estudo e caracterizaccedilatildeo deste composto
natural A β-lapachona tambeacutem apresenta vaacuterias accedilotildees farmacoloacutegicas incluindo accedilatildeo
formaccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (Hussain 2007)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do Lapachol (1) da α- Lapachona (2) e da β-
Lapachona (Fonseca et al 2003 Ferreira et al 2010)
11
Figura 6 Tabebuia avellanedae (Hussain 2007)
A β-lapachona eacute uma substacircncia natural facilmente obtida a partir do lapachol Esta
naftoquinona eacute o grande destaque desta classe de substacircncias porque se encontra em testes
cliacutenicos de fase II para o tratamento do cacircncer de pacircncreas (Ferreira 2010) O mecanismo de
accedilatildeo da β-lapachona diferencia-se de outros antineoplaacutesicos por atuar na topoisomerase I
promovendo a recuperaccedilatildeo da capacidade de apoptose celular Alguns estudos reportam sua
accedilatildeo sineacutergica de potenciaccedilatildeo com o Taxolreg
promovendo a inibiccedilatildeo em diferentes pontos de
replicaccedilatildeo celular aleacutem de sua combinaccedilatildeo com outros tratamentos como a aplicaccedilatildeo de
radiaccedilatildeo ionizante (Cunha 2005)
Vaacuterios estudos jaacute foram publicados demonstrando a atividade antiviral de
naftoquinonas naturais e sinteacuteticas A β-lapachona inibe seletivamente a replicaccedilatildeo do viacuterus
HIV-1 atuando na inibiccedilatildeo da enzima LTR117 Da mesma forma este composto eacute um
potente inibidor da enzima transcriptase reversa dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e
leucemia murina de Rauscher (RLV) inibindo tambeacutem a DNA polimerase A accedilatildeo inibitoacuteria
sobre estas enzimas revelou-se especiacutefica se comparada com a de outros inibidores
conhecidos (Silva 2003)
O Lapachol jaacute demonstrou atividade contra certas cepas virais incluindo Herpes virus
tipos I e II Outras naftoquinonas jaacute mostraram eficaacutecia contra cepas de Influenza virus
Poliomielite virus e estomatite vesicular Supotildee-se que o mecanismo de accedilatildeo destas quinonas
seja atraveacutes da inibiccedilatildeo da transcriptase reversa de retroviacuterus e da RNA polimerase Eacute relatado
12
que lapachol diminui a replicaccedilatildeo do viacuterus em seres humanos mas ainda natildeo existem
resultados de testes cliacutenicos disponiacuteveis (Hussain 2007)
Na avaliaccedilatildeo da atividade antiviral do Lapachol in vitro verificou-se que esta
substacircncia eacute ativa contra viacuterus RNA atuando tanto sobre viacuterus envelopados quanto sobre
partiacuteculas sem esta estrutura em concentraccedilotildees de 5 a 10 microgmL e ainda apresentou uma
pequena atividade sobre HSV (Herpes simplex I) e Ad5 (Adeno tipo 5) mas nenhuma
atividade sobre CoxB4 (Coxsackie B4) Em trabalho posterior demonstrou-se que nem o
Lapachol nem diversos dos seus derivados apresentaram atividade antiviral in vitro sobre
Poliovirus tipo 1 Ecovirus 19 e Coxsackie B tipo 4 Apenas os derivados 12-naftoquinonicos
e um intermediaacuterio da siacutentese Hoocker foram ativos contra o Echovirus 19 (Fonseca 2003)
Costa et al (2013) relataram que piranonaftoquinonas isocircmeras do lapachol possuem
atividade de inibiccedilatildeo da replicaccedilatildeo de DENV-2 atuando sobre a atividade da ATPase de NS3
(proteiacutena natildeo estrutural de DENV)
A utilizaccedilatildeo de testes in vitro por meio de ensaios de viabilidade celular constitui o
primeiro passo para a avaliaccedilatildeo da compatibilidade bioloacutegica de uma substacircncia e pode
fornecer elementos importantes para a anaacutelise da biocompatibilidade dos diferentes materiais
Para ser considerado natildeo citotoacutexico no teste de citotoxicidade in vitro um produto natildeo deve
ocasionar a morte das ceacutelulas nem afetar suas funccedilotildees celulares A prova do MTT eacute um dos
indicadores colorimeacutetricos de viabilidade celular mais utilizados sendo capaz de avaliar a
funccedilatildeo celular mitocondrial de acordo com a reduccedilatildeo enzimaacutetica do sal de tetrazoacutelio pelas
desidrogenases mitocondriais nas ceacutelulas viaacutevies (Arauacutejo et al 2008) Supotildee-se que o
mecanismo responsaacutevel pela citotoxicidade apresentada pelas quinonas esteja relacionado
com o estresse oxidativo causado por esses compostos poreacutem a capacidade de alquilaccedilatildeo de
nucleoacutefilos celulares tambeacutem representa correlaccedilatildeo com tais efeitos bioloacutegicos (Goulart
2004)
13
II JUSTIFICATIVA
14
2 JUSTIFICATIVA
Aleacutem do controle do mosquito transmissor e do desenvolvimento de vacinas que tem
sido exaustivamente estudado nos uacuteltimos anos uma alternativa para o combate agrave dengue
seria o desenvolvimento de faacutermacos para reduzir a viremia ou mesmo para controlar a
resposta imune do hospedeiro agrave infecccedilatildeo que tem sido apontada como principal fator de risco
nos casos mais graves Em funccedilatildeo disso o nuacutemero de pesquisas visando o desenvolvimento
de drogas com accedilatildeo antiviral ou com accedilatildeo imunomodulatoacuteria tem aumentado
significativamente As naftoquinonas vecircm ganhando bastante importacircncia na pesquisa de
novas drogas antivirais devido agrave algumas atividades apresentadas A szlig-lapachona-orto-
naftoquinona por exemplo se mostrou um potente inibidor da enzima transcriptase reversa
dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e leucemia murina de Rauscher (RLV)
Diante da inexistecircncia de drogas com accedilatildeo anti DENV e o elevado nuacutemero e casos da
patogenia nos uacuteltimos anos a organizaccedilatildeo mundial da sauacutede classificou a Dengue como uma
epidemia de proporccedilotildees globais e um problema de sauacutede puacuteblica Como as naftoquinonas jaacute
demonstraram na literatura possuir um potencial efeito terapecircutico contra alguns viacuterus eacute
possiacutevel que estes compostos possam apresentar atividade antiviral contra DENV Portanto
este trabalho visou atraveacutes de ensaios de MTT e titulaccedilotildees virais em placa avaliar a potencial
atividade antiviral de oito compostos derivados de naftoquinonas naturais e sinteacuteticas
15
III OBJETIVOS
16
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar oito compostos (2 naturais e 6 sinteacuteticos) derivados de naftoquinonas como potenciais
agentes antivirais em ceacutelulas BHK-21 frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1 e 2
32 Objetivos especiacuteficos
1 Calcular o iacutendice de citotoxicidade e a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) dos compostos
atraveacutes de ensaio de reduccedilatildeo de MTT
2 Avaliar os efeitos dos compostos sobre o crescimento a viabilidade e o volume celular
pela teacutecnica de exclusatildeo do azul de tripan
3 Determinar a multiplicidade de infecccedilatildeo de DENV 1 e 2 a ser utilizada nos ensaios
antivirais
4 Avaliar a atividade antiviral dos compostos frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1
e 2 atraveacutes do ensaio de MTT
5 Verificar um possiacutevel efeito direto dos compostos agraves partiacuteculas virais de Dengue virus
6 Quantificar a produccedilatildeo de partiacuteculas virais infecciosas no sobrenadante de ceacutelulas
infectadas atraveacutes de titulaccedilatildeo viral pela contagem de unidades formadoras de placas
17
IV MATERIAL E MEacuteTODOS
18
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Linhagens celulares
411 Ceacutelulas C636
As ceacutelulas C636 satildeo ceacutelulas de linhagem contiacutenua de larvas de mosquito Aedes
albopictus Estas ceacutelulas foram utilizadas na produccedilatildeo de estoque viral de DENV sorotipos 1
e 2 para isso foram mantidas em meio de cultura Leibovitz-15 (L-15) (Cultilab)
suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (Cultilab) antibioacuteticos (Penicilina 100 UmL
Streptomicina 100 microgmL) e antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL) a 28degC
412 Ceacutelulas BHK-21
As ceacutelulas BHK-21 satildeo fibroblastos de linhagem contiacutenua derivados de rim de hamster
neonato Estas ceacutelulas foram utilizadas para os experimentos in vitro e para as titulaccedilotildees de
DENV 1 e 2 para isso foram mantidas em meio miacutenimo essencial modificado por Dulbecco
ndash DMEM (Cultilab) suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (SFB) com antibioacuteticos
(Penicilina 100 UmL Streptomicina 100 microgmL) e com antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL)
sendo mantidas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5
42 Viacuterus
421 DENV 1 e DENV 2
O Sorotipo 1 do Dengue virus (DENV-1) estirpe Mochizuki foi replicado em ceacutelulas
C636 para gerar estoques de trabalho durante 2 e 5 dias a 28degC O sobrenadante da cultura de
ceacutelulas infectadas foi recolhido e clarificado por centrifugaccedilatildeo a 4000 G durante 10 minutos agrave
4degC e entatildeo foi aliquotado e armazenado a -70 deg C como reserva de viacuterus ateacute agrave sua utilizaccedilatildeo
A replicaccedilatildeo geraccedilatildeo de estoque e titulaccedilatildeo do Sorotipo 2 do Dengue virus (DENV-2)
estirpe Nova Guineacute C ocorreu nos mesmos moldes do DENV-1
19
422 Titulaccedilatildeo viral
Os estoques virais foram diluiacutedos (10-1
a 10-7
) e inoculados em monocamadas de
ceacutelulas BHK-21 implantadas em placas de 6 poccedilos com confluecircncia de aproximadamente
60 (3x105 ceacutelulas por poccedilo) sendo um poccedilo natildeo infectado mantido para controle celular
Apoacutes uma hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus foram adicionados 3 mL de meio DMEM (Cultilab)
suplementado com 15 de SFB e contendo 15 de Carboximetilcelulose (CMC Synth) As
placas foram entatildeo incubadas a 37degC (CO2 a 5) por 96 horas As ceacutelulas foram entatildeo
fixadas com 2 mL de soluccedilatildeo de formol a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo
1 (pv) de cristal violeta em PBS para contagem das placas de lise O tiacutetulo viral foi
expresso atraveacutes do nuacutemero de unidades formadoras de placa por mL (UFPmL) segundo a
formula abaixo representada
Tiacutetulo viral (UFPmL) = N x FC x 10
N = nuacutemero de placas de lise contadas
FC = Fator de correccedilatildeo
= Inverso da diluiccedilatildeo na qual foram contadas as placas de lise
43 Compostos de naftoquinonas
Os compostos utilizados neste estudo foram fornecidos pelo Dr Geraldo Ceacutelio
Brandatildeo do laboratoacuterio de pesquisa da Escola de Farmaacutecia da Universidade Federal de Ouro
Preto
20
Tabela 1 Relaccedilatildeo de nome estrutura e coacutedigo dos compostos utilizados Na tabela estatildeo
presentes a relaccedilatildeo dos nomes dos compostos utilizados neste trabalho bem como sua
estrutura Os coacutedigos representantes de cada composto seratildeo utilizados no decorrer da escrita
Nome do composto Estrutura Coacutedigo
Lapachol
A1
β-lapachona
A2
2-Hidroxi-3-(ββ-dimetilvinil)-14-naftoquinona
A3
2-Cloro-14-naftoquinona
A4
Lapachol derivado 1
A5
Lapachol derivado 2 A6
Lapachol derivado 3 A7
Lapachol derivado 4 A8
44 Ensaio de citotoxicidade
Para avaliar a citotoxicidade dos compostos ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas foram incubadas com diferentes concentraccedilotildees dos compostos em triplicata num
volume de 200 microL de meio de cultura por poccedilo na presenccedila de 1 de SFB Os controles natildeo
tratados apresentaram adiccedilatildeo de 200 microL de meio de cultura As ceacutelulas foram entatildeo incubadas
durante 72 horas O meio foi removido e 28 microL de soluccedilatildeo de 5 mg mL MTT (brometo de 3-
21
[45-dimetil-tiazol-2-il]-25 difeniltertrazoacutelio) foi adicionado a cada poccedilo As placas foram re-
incubadas durante 1 hora e 30 minutos e entatildeo 122 microL de DMSO foi adicionado a cada poccedilo e
placas foram agitadas suavemente durante 15 minutos para dissolver os cristais de formazan
A absorbacircncia foi lida em um equipamento leitor de placas Victor X3 (PerkinElmer) a 490
nm A concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC 50) foi definida como a concentraccedilatildeo da amostra que
reduziu a viabilidade celular de 50 em comparaccedilatildeo com controles natildeo tratados Os dados
foram analisados utilizando o programa Prisma
45 Avaliaccedilatildeo da viabilidade e crescimento celular por exclusatildeo de azul de tripan
Ceacutelulas BHK-21 foram cultivadas em placas de 24 poccedilos (7x104 ceacutelulaspoccedilo) e apoacutes
24 horas foram tratadas com as concentraccedilotildees de uso de cada composto e incubadas por 72
horas na presenccedila de 1 de SFB A seguir as ceacutelulas foram tripsinizadas e incubadas com
azul de tripan e entatildeo foi utilizado um contador automatizado de ceacutelulas (Countess II FL
Automated Cell Counter ndash Thermo Fisher Scientific) para contagem das ceacutelulas e avaliaccedilatildeo da
porcentagem de viabilidade e diacircmetro celular do controle nos tempos de 0 24 e 96 horas e
avaliaccedilatildeo dos mesmos paracircmetros para os compostos no tempo de 96 horas (72 horas poacutes
tratamento)
Outra curva de multiplicaccedilatildeo celular foi feita para os compostos A1 A3 A4 e A5 onde as
ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos no momento da confecccedilatildeo da placa e
foram avaliados os mesmos paracircmetros nos tempos de 0 12 24 48 e 72 horas O
equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
46 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
Para determinar a menor Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) responsaacutevel pela letalidade
celular total 2x104 de ceacutelulas BHK-21 foram semeadas em placa de 96 poccedilos Apoacutes a
incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o
meio de cultura foi removido e as ceacutelulas foram expostas a diferentes diluiccedilotildees dos dois
sorotipos de DENV (100 microL de cada diluiccedilatildeo + 100 microL de meio DEMEM 1 SFB) As
diluiccedilotildees seriadas foram realizadas da suspensatildeo viral na razatildeo de 5 para o primeiro poccedilo e de
2 para os demais poccedilos Apoacutes 72 horas as ceacutelulas foram entatildeo fixadas com 200 microL de soluccedilatildeo
22
formalina a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo 1 (pv) de cristal violeta em
PBS para avaliaccedilatildeo da maior diluiccedilatildeo responsaacutevel pela letalidade de 100 das ceacutelulas
47 Ensaio Dose-resposta
Para cada composto foram realizados ensaios de dose-resposta para definiccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de cada composto capaz de promover a reduccedilatildeo na produccedilatildeo viral A atividade
antiviral foi avaliada tambeacutem pelo meacutetodo de MTT Ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas expostas a diferentes concentraccedilotildees dos extratos determinadas a partir das maiores
concentraccedilotildees em que natildeo foram observados efeitos citotoacutexicos As ceacutelulas foram tratadas
com as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de cada composto e em seguida infectadas com DENV
1 (MOI= 5) ou 2 (MOI= 2) Mantendo uma coluna para controle com DMSO uma coluna
para controle de viacuterus uma coluna para controle de citotoxicidade dos compostos e por fim
uma coluna para controle celular As ceacutelulas foram entatildeo incubadas durante 72 horas Apoacutes
este tempo procedeu-se a leitura pelo ensaio de MTT como descrito anteriormente Os dados
foram analisados levando-se em consideraccedilatildeo a leitura das absorbacircncias dos poccedilos dos
controles de viacuterus e do controle celular
Para realizacao destes experimentos os seguintes controles foram adotados
Controle de ceacutelulas poccedilos contendo somente ceacutelulas acrescidas do meio de cultura DMEM
1 SFB Utilizado para avaliar o comportamento das ceacutelulas sem que as mesmas tivessem
contato com qualquer interferente durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo Com isso os poccedilos
reservados para esse controle serviram de padratildeo para comparaccedilatildeo com aqueles em que fosse
observada atividade citotoacutexica ou citopaacutetica
Controle de viacuterus poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM 1 SFB
sem nenhum tratamento e de suspensatildeo de viacuterus Utilizando como referecircncia para anaacutelise da
atividade citopaacutetica provocada pelo viacuterus testado durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo das placas
23
Controle de viacuterus com DMSO Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura
DMEM 1 SFB e DMSO Foi utilizado para avaliar se havia influecircncia prejudicial do
solvente utilizado para diluiccedilatildeo das amostras no meio de cultivo das ceacutelulas e se o mesmo
poderia apresentar alguma potencial atividade antiviral aparente
Controle de citotoxicidade Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM
1 SFB e as quatro principais concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos Foi utilizado
para avaliar se haveria alguma possiacutevel atividade citotoacutexica das concentraccedilotildees dos compostos
em relaccedilatildeo agraves ceacutelulas
48 Ensaio Virucida
Para a realizaccedilatildeo deste ensaio aliacutequotas de 950 microL (diluiccedilatildeo de 20 vezes) do DENV 1 (tiacutetulo
6 x 107 UFPmL) foram incubadas com 50 microL de uma soluccedilatildeo de meio DMEM preparada
com 20x a concentraccedilatildeo natildeo citotoacutexica de cada composto A1 a A8 em banho-maria 37deg C
por 1 hora Apoacutes a incubaccedilatildeo as aliacutequotas foram imediatamente tituladas em ceacutelulas BHK-21
em placas de 6 poccedilos utilizando-se 3 diluiccedilotildees para cada incubaccedilatildeo (20x 20 x 10-1
e 20 x 10-
2) Foram titulados tambeacutem uma aliacutequota incubada apenas com meio DMEM sem nenhum
tratamento e outra aliacutequota incubada com DMSO (Dimetilsulfoacutexido) Estas foram tituladas
utilizando um controle e mais cinco diluiccedilotildees (20x 20 x 10-1
20 x 10-2
20 x 10-3
e 20 x 10-4
)
49 Ensaio antiviral
Neste ensaio ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em placas de 24 poccedilos no dia
seguinte foram tratadas durante 4 horas com as concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas de cada
composto em duplicata Apoacutes o preacute-tratamento as monocamadas foram infectadas com
DENV-1 a uma MOI=5 na presenccedila das concentraccedilotildees de uso respectivas de cada composto
Apoacutes 1 hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus as monocamadas foram lavadas duas vezes com PBS e
foi adicionado 500 microL por poccedilo de meio preparado com as mesmas concentraccedilotildees dos
diferentes compostos e mantidos durante 48 horas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5 Em
quatro poccedilos as ceacutelulas foram infectadas e natildeo tratadas e em outros quatro poccedilos as ceacutelulas
natildeo foram tratadas e nem infectadas (controle de ceacutelulas) destes uacuteltimos dois foram
tripsinizados e contados no momento da infecccedilatildeo e os outros dois apoacutes o teacutermino do ensaio
24
para avaliar o crescimento celular Decorridas as 48 horas o sobrenadante foi coletado e
centrifugado por 10 minutos a 4000 xG para separaccedilatildeo dos debris celulares e prontamente
titulado em placa de 6 poccedilos
410 Anaacutelise estatiacutestica
Os valores de CC50 foram obtidos a partir de anaacutelise de regressatildeo linear das curvas de
concentraccedilatildeocitotoxicidade A anaacutelise estatiacutestica dos dados foi realizada pelo programa
GraphPad Prism software Uma anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi utilizada para determinar
as diferenccedilas estatiacutesticas seguida do poacutes teste de Tukey A significacircncia estatiacutestica foi fixada
em p lt005
25
V RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
26
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Ensaio de citotoxicidade celular
Para avaliar a viabilidade da linhagem celular BHK-21 frente ao tratamento com oito
diferentes concentraccedilotildees dos compostos (A1 a A8) realizou-se um ensaio de MTT (brometo
de 3-[45-dimetil-tiazol-2-il]-25-difeniltetrazoacutelio) Este ensaio tem o objetivo de quantificar
espectrofotometricamente o crescimento celular a viabilidade e proliferaccedilatildeo podendo ser
utilizado como um indicador direto de citotoxicidade Trata-se de um ensaio colorimeacutetrico
para medir a atividade da redutase mitocondrial em ceacutelulas vivas Ele se baseia na reduccedilatildeo do
sal amarelo tetrazoacutelio (permeaacutevel agrave membrana celular) para cristais de formazan azuis
puacuterpura por ceacutelulas metabolicamente ativas a quantidade de formazan gerada medida por
espectrofotometria eacute proporcional ao nuacutemero de ceacutelulas viaacuteveis
A CC50 foi calculada plotando-se uma curva de porcentagem de viabilidade celular por
concentraccedilatildeo melhor representada na figura 7 pelo composto A7 e os resultados de CC50
para todos os compostos estatildeo representados na tabela 2 Foram feitos ensaios de
citotoxicidade com oito concentraccedilotildees diferentes sendo escolhida a maior concentraccedilatildeo que
natildeo apresentou citotoxicidade
Viabilidade Celular = [ ( A ndash B ) A ] x 100
Onde
A = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas natildeo tratadas
B = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas tratadas com
as respectivas concentraccedilotildees de cada composto
27
28
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (A curva dose resposta do composto A7 eacute a que
melhor representa a curva dose resposta esperada) Avaliou-se a viabilidade da linhagem
celular BHK-21 frente agrave diferentes concentraccedilotildees dos compostos realizando o ensaio de MTT
e determinando assim as concentraccedilotildees a serem utilizadas nos proacuteximos ensaios bem como
calculando a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) agrave partir da curva
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo
da concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50)
Composto Concentraccedilatildeo utilizada
[ ] microgmL
Concentraccedilatildeo citotoacutexica 50
(CC50) [ ] microgmL plusmn Desvio
Padratildeo
A1 ([ ]=1 mgmL) 00200 10010 plusmn 0014
A2 ([ ]=1 mgmL) 00025 09561 plusmn 0023
A3 ([ ]=1 mgmL) 00025 09988 plusmn 0017
A4 ([ ]=5 mgmL) 00125 10150 plusmn 0036
A5 ([ ]=10 mgmL) 00250 10590 plusmn 0047
A6 ([ ]=5 mgmL) 00250 08183 plusmn 0030
A7 ([ ]=5 mgmL) 00125 10280 plusmn 0052
A8 ([ ]=5 mgmL) 00125 09758 plusmn 0036
52 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan
Para corroborar o ensaio anterior de citotoxicidade utilizou -se o teste de viabilidade
celular pela teacutecnica da exclusatildeo do azul de tripan com a finalidade de determinar a
viabilidade das ceacutelulas Os procedimentos adotados no ensaio seguiram o manual do
equipamento contador automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL Automated Cell Counter) entatildeo
foi acrescentado agrave 10 microL da suspensatildeo celular 10 microL de azul de tripan (04) Apoacutes
homogeneizaccedilatildeo 10 microL da suspensatildeo foi colocada no local indicado da lacircmina proacutepria para
leitura e foi realizada a contagem sendo consideradas mortas (inviaacuteveis) as ceacutelulas que
incorporavam o corante e viaacuteveis as que excluiacuteam o azul de tripan
29
O equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
(A)
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan A avaliaccedilatildeo da
viabilidade celular foi realizada atraveacutes de um contador automaacutetico de ceacutelulas Este
equipamento possibilita explorar ferramentas de fotografia e avaliar alguns paracircmetros
importantes (A) fotografia das ceacutelulas (B) Zoom na fotografia das ceacutelulas com marcaccedilotildees
(em verde para ceacutelulas vivas e vermelho para mortas) e (D) contagem das ceacutelulas totais
ceacutelulas vivas e mortas graacutefico e meacutedia dos diacircmetros celulares das ceacutelulas vivas e mortas
(B)
(C)
30
O crescimento celular de ceacutelulas natildeo tratadas foi avaliado nos tempos de 0h (momento
da confecccedilatildeo da placa) 24h (momento de tratamento com os compostos) e 96 horas
(Momento em que todas as ceacutelulas foram tripsinizadas e contadas) para avaliar o perfil do
crescimento celular em ceacutelulas natildeo tratadas Foi observado um crescimento celular no periacuteodo
de 24 horas onde as ceacutelulas estavam incubadas com meio acrescido de 10 SFB Em 24
horas o meio foi trocado por 1 SFB e acrescido das substacircncias testes nas menores diluiccedilotildees
natildeo citotoacutexicas determinadas pelo ensaio do MTT Em 96 horas pode ser observado um
decaimento no nuacutemero de ceacutelulas vivas provavelmente devido ao crescimento celular (morte
por confluecircncia)
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas)
(A) (B)
31
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas (A)
Contagem de ceacutelulas vivas (B) Percentual de ceacutelulas viaacuteveis (Viabilidade celular ) e (C)
Meacutedia do diacircmetro apresentado pelas ceacutelulas vivas
Em 96 horas as ceacutelulas natildeo tratadas bem como as ceacutelulas tratadas por 72 horas com as
concentraccedilotildees de uso dos compostos foram tripsinizadas e avaliadas quanto ao nuacutemero de
ceacutelulas vivas viabilidade e diacircmetro celular apresentados na figura 10
Segundo se observa natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo aparente que possa demonstrar que
as concentraccedilotildees de uso dos compostos tenham causado alguma atividade citotoacutexica
corroborando assim os ensaios de citotoxicidade anteriores
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
A infectividade de um viacuterus depende de vaacuterios fatores entre eles da proporccedilatildeo de
partiacuteculas virais completas ou infecciosas da suscetibilidade da ceacutelula hospedeira e da
chance desta partiacutecula encontrar o receptor e penetrar na ceacutelula Quando ceacutelulas suscetiacuteveis
satildeo misturadas com uma suspensatildeo de viacuterus estas podem receber uma duas trecircs ou dez
partiacuteculas virais ou nenhuma Isto depende da proporccedilatildeo entre a quantidade de viacuterus
infecciosos presente no inoculo e a quantidade de ceacutelulas utilizada Esta relaccedilatildeo eacute denominada
de multiplicidade de infecccedilatildeo ou MOI Uma MOI=1 indica que a infecccedilatildeo foi feita em
principio com 1 viacuterus ou 1 dose infectante por ceacutelula
A determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo dos Dengue virus 1 e 2 a serem
utilizadas nos proacuteximos ensaios foi feita a partir da infecccedilatildeo de ceacutelulas BHK-21 por diferentes
(C)
32
concentraccedilotildees de viacuterus e revelaccedilatildeo com cristal violeta Escolheu-se a maior diluiccedilatildeo viral que
possibilitou a letalidade total das ceacutelulas (faixa onde todas as ceacutelulas estatildeo mortas utilizando
menor concentraccedilatildeo de viacuterus) As faixas escolhidas foram entatildeo calculadas levando-se em
consideraccedilatildeo o nuacutemero de ceacutelulas presentes no poccedilo e o nuacutemero de partiacuteculas virais que foram
adicionadas (Faixa3 para DENV2 e 2 para DENV1) Figura 11 Foi estipulado portanto a
Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 2 para DENV 2 e 5 para DENV 1
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI A partir da infecccedilatildeo da linhagem celular BHK-21 em
placa de 96 poccedilos com diferentes diluiccedilotildees de DENV foi determinado que a Multiplicidade
de infecccedilatildeo para o Dengue viacuterus sorotipos 1 e 2 seria de 5 e 2 respectivamente (colunas 2 -
DENV1 e 3 - DENV2)
54 Ensaio dose resposta
Apoacutes a determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas ideais realizou-se um
ensaio dose resposta tratando as ceacutelulas com oito concentraccedilotildees agrave partir das concentraccedilotildees natildeo
citotoacutexicas escolhidas para cada composto e em seguida infectando com DENV sorotipos 1 e
2 nas MOIs estipuladas anteriormente (5 e 2 respectivamente) A porcentagem do efeito
protetor conferida agraves ceacutelulas para cada concentraccedilatildeo de amostra testada foi calculada da
seguinte forma
33
EP = [ (A ndash B) (C ndash B) ] x 100
Onde
A Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas tratadas e infectadas
B Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e infectadas
C Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e natildeo infectadas
Este ensaio tem por objetivo identificar a resposta celular agrave infecccedilatildeo frente ao
tratamento com os compostos em diferentes concentraccedilotildees Assim como o ensaio de
toxicidade este ensaio feito utilizando a teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT permite o teste de vaacuterias
concentraccedilotildees diferentes em um menor tempo e com baixo gasto de material
34
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV1
(MOI=5)
35
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV2
(MOI=2)
36
Takegami et al (1998) demonstraram atividade de furanonaftoquinonas contra o viacuterus
da Encefalite Japonesa (Flavivirus) utilizando a concentraccedilatildeo de 3microgmL poreacutem para os
compostos apresentados avaliados pela teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT nenhuma das
concentraccedilotildees apresentadas produziu efeito antiviral significativo em relaccedilatildeo ao controle
celular como observado nas figuras 12 e 13
Apesar da teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT ser interessante como triagem de atividade
antiviral permitindo o teste de vaacuterias concentraccedilotildees dos compostos em menor tempo e
utilizando uma quantidade razoaacutevel de materiais optou-se por utilizar as maiores
concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas encontradas avaliando sua atividade antiviral por outras
teacutecnicas Como natildeo foi avaliada atividade antiviral preacutevia para nenhum dos compostos frente
agrave infecccedilatildeo por DENV1 e 2 foi selecionado o Dengue virus 1 para dar prosseguimento aos
ensaios
55 Ensaio Virucida
O ensaio virucida foi realizado para avaliar um potencial efeito dos compostos
diretamente sobre a partiacutecula viral Este ensaio eacute importante pois possibilita elucidar se o
composto pode produzir algum efeito sobre a partiacutecula viral impedindo que esta possa infectar
as ceacutelulas
Figura 14 Ensaio virucida Neste ensaio as aliacutequotas de DENV1 foram incubadas com as
concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos e titulados (NT) Controle natildeo tratado
37
Tabela 3 Ensaio virucida Caacutelculo do tiacutetulo viral (UFPmL) e porcentagem representante de
cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 254 x 105 100
DMSO 263 x 105 10335
A1 199 x 105 7835
A2 205 x 105 8071
A3 237 x 105 9311
A4 775 x 104 3049
A5 153 x 105 6024
A6 219 x 105 8602
A7 243 x 105 9547
A8 254 x 105 100
Lagrota et al (1988) demonstraram atividade de 2-HO-3-N-benzil-N(N-benzil-2-
etilamina) -14-naftoquinona sobre a partiacutecula viral de enterovirus De forma contraacuteria apesar
de se verificar a reduccedilatildeo de quase uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais
para o composto A4 natildeo considerou-se esta uma alteraccedilatildeo significativa pois devido agrave
magnitude do nuacutemero de UFPs se trata de uma alteraccedilatildeo muito pequena Portanto os
compostos avaliados neste trabalho natildeo produziram atividade virucida aparente frente ao
tratamento com as concentraccedilotildees de uso
56 Ensaio Antiviral
O sobrenadante de ceacutelulas tratadas previamente e infectadas por DENV1 coletado 48
horas poacutes infecccedilatildeo foi avaliado quanto agrave produccedilatildeo viral de partiacuteculas infecciosas pela
contagem de placas de lise e caacutelculo de Unidades Formadoras de Placa (Titulaccedilatildeo viral em
placa ndash UFPmL)
38
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral Sobrenadante de ceacutelulas tratadas e infectadas por DENV1
coletado apoacutes 48 horas e titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado
Tabela 4 Ensaio Antiviral Coleta do sobrenadante de ceacutelulas infectadas por DENV1 Tiacutetulo
viral (UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o
controle natildeo tratado como 100
Ao perceber um aumento no tiacutetulo viral frente ao tratamento com os compostos A1
A2 e A3 e uma reduccedilatildeo frente ao tratamento com A4 A5 e A6 foram escolhidos dois
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 119 x 105 10000
A1 235 x 105 19748
A2 228 x 105 19160
A3 318 x 105 26723
A4 128 x 104 1076
A5 186 x 103 156
A6 190 x 104 1597
A7 280 x 104 2353
A8 350 x 104 2941
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
40
Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
4
neste estaacutegio elas natildeo satildeo infecciosas (Mukhopadhyay 2005) O processo de maturaccedilatildeo
desses viacuterus ocorre apoacutes a clivagem proteoliacutetica da proteiacutena precursora de membrana (prM)
transformando viacuterus inerte em partiacuteculas infecciosas (Li 2008) Partiacuteculas subvirais satildeo
tambeacutem produzidas no RE mas apenas contecircm as glicoproteiacutenas de membrana fazendo com
que estas partiacuteculas sejam natildeo infecciosas Os viacuterus maduros e as partiacuteculas sub-virais satildeo
liberados da ceacutelula hospedeira por exocitose (Mukhopadhyay 2005)
Na pele o DENV tende a infectar ceacutelulas dendriacuteticas imaturas Estas ceacutelulas infectadas
amadurecem e migram para os gacircnglios linfaacuteticos regionais ou locais onde apresentam
antiacutegenos virais agraves ceacutelulas T iniciando as respostas imunes Existe tambeacutem evidecircncia de
replicaccedilatildeo abundante de DENV em ceacutelulas do parecircnquima do fiacutegado e em macroacutefagos nos
gacircnglios linfaacuteticos fiacutegado e baccedilo bem como em monoacutecitos de sangue perifeacuterico (Guzman
2010)
Proteiacutena E
(diacutemero)
Proteiacutena
M
Proteiacutena C
ssRNA (+)
Figura 1 Estrutura da partiacutecula viral de Dengue viacuterus A partiacutecula viral eacute composta
por trecircs proteiacutenas estruturais proteiacutena de envelope (E) disposta em diacutemeros a proteiacutena
associada agrave membrana (M) e a proteiacutena do nucleocapsiacutedeo (C) O genoma de RNA fita-
simples de polaridade positiva se encontra dentro do nucleocapsiacutedeo (Adaptado de
httpviralzoneexpasyorgviralzoneall_by_species24html)
5
Figura 2 Ciclo de multiplicaccedilatildeo de DENV A Os viacuterus se ligam aos receptores na superfiacutecie da
ceacutelula e satildeo endocitados B Devido ao baixo pH dentro dos endossomas ocorre a fusatildeo de
membranas viral-celular mediada por proteiacutenas virais resultando na liberaccedilatildeo do RNA viral em um
processo chamado de desnudamento C O genoma viral eacute traduzido em uma uacutenica poliproteiacutena que
eacute processada por proteases do viacuterus e da ceacutelula hospedeira D O RNA eacute replicado por proteiacutenas
natildeo-estruturais do proacuteprio viacuterus E A montagem do viacuterus ocorre na membrana do Reticulo
endoplasmaacutetico no qual a proteiacutena do capsiacutedeo e o RNA viral satildeo envolvidos por glicoproteiacutenas e
pela membrana da organela para formar partiacuteculas virais imaturas F Partiacuteculas virais imaturas
utilizam a via secretora da ceacutelula hospedeira e sob o baixo pH do Complexo de Golgi a proteiacutena
precursora prM eacute clivada em proteiacutena M completando a maturaccedilatildeo do viacuterus GOs viacuterus maduros
satildeo entatildeo liberados das ceacutelulas por exocitose Os nuacutemeros indicados nas caixas coloridas referem-se
ao valor de pH dos respectivos compartimentos Imagem adaptada de PERERA 2009
Adsorccedilatildeo
Siacutentese e processamento
Fusatildeo e
Desnudamento
Replicaccedilatildeo do RNA
Montagem
Maturaccedilatildeo
Liberaccedilatildeo de
viacuterus
maduro
A
B
C
D
E
F
G
6
13 Epidemiologia
Ao longo das uacuteltimas deacutecadas a dengue se tornou a doenccedila viral transmitida por
mosquitos mais prevalente no mundo Estimativas de infecccedilatildeo pela OMS indicam que a
patologia eacute endecircmica em mais de 100 paiacuteses em todos os continentes exceto a Antaacutertida e
aflige principalmente paiacuteses pobres em recursos nas regiotildees tropicais e subtropicais (Perry
2011) Epidemias globais de DENV ocorreram ao longo das uacuteltimas deacutecadas em parte devido
agrave diminuiccedilatildeo dos esforccedilos no controle de mosquitos Satildeo estimados mais de 50 milhotildees de
casos de dengue anualmente (Mukhopadhyay 2005)
A Dengue eacute uma doenccedila viral sistecircmica aguda que se estabeleceu em todo o mundo
em ambos os ciclos de transmissatildeo endecircmicas e epidecircmicas A infecccedilatildeo pelo DENV em seres
humanos eacute frequentemente inaparente mas pode levar a uma grande variedade de
manifestaccedilotildees cliacutenicas de febre leve a siacutendrome do choque da dengue potencialmente fatal A
imunidade vitaliacutecia desenvolvida apoacutes a infecccedilatildeo com um dos quatro tipos de viacuterus eacute
especiacutefica para cada tipo e a progressatildeo para uma doenccedila mais grave eacute frequente mas natildeo
exclusivamente relacionada com infecccedilatildeo secundaacuteria por tipos heteroacutelogos No entanto
enquanto a expansatildeo histoacuterica desta doenccedila eacute bem documentada o elevado fardo de
problemas de sauacutede atribuiacuteveis agrave dengue em grande parte do mundo tropical e sub-tropical
permanecem pouco enumerados (Bhatt 2013)
O Brasil eacute um paiacutes de grande extensatildeo (8512000 km2) situado em uma zona
predominantemente tropical com extensas aacutereas de florestas na regiatildeo amazocircnica bem como
restos de uma floresta tropical na costa leste sudeste e sul entre outros ecossistemas A maior
parte do paiacutes tem um clima tropical e uma grande diversidade de plantas e animais portanto
um local adequado para a ocorrecircncia de patologias causadas por viacuterus transmitidos por
artroacutepodes (Figueiredo 2000) Segundo o boletim epidemioloacutegico do ministeacuterio da sauacutede em
2016 jaacute foram registrados 170103 casos provaacuteveis de dengue no paiacutes ateacute a semana
epidemioloacutegica 5 Nesse periacuteodo a regiatildeo Sudeste registrou o maior nuacutemero de casos
provaacuteveis (96664 casos 568) Em Minas Gerais jaacute foram registradas 19 mortes em
decorrecircncia da Dengue entre 1deg de janeiro e 14 de marccedilo deste ano Outros 91 oacutebitos estatildeo
sob investigaccedilatildeo (BRASIL 2016)
7
Figura 3 Distribuiccedilatildeo geograacutefica da Dengue Aacutereas de risco de transmissatildeo em amarelo
(Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede Adaptado de httpwwwwhointen)
As manifestaccedilotildees da doenccedila foram descritas pela primeira vez apoacutes a Segunda Guerra
Mundial coincidente com o aumento da urbanizaccedilatildeo particularmente na Aacutesia (Weaver 2010)
Atualmente o DENV eacute hiperendecircmico em muitas regiotildees tropicais onde 2 ou mais sorotipos
circulam endemicamente Embora DENV foi provavelmente introduzido periodicamente para
as Ameacutericas atraveacutes de navios desde o seacuteculo 17 o surgimento de DENV no Hemisfeacuterio
Ocidental comeccedilou mais tarde devido a uma campanha de sucesso parcial para erradicar o
vetor A aegypti para controlar a febre amarela Esta campanha teve sucesso na maior parte
das Ameacutericas da deacutecada de 1950 agrave deacutecada de 1970 mas foi interrompida O vetor entatildeo
rapidamente recolonizou quase toda a regiatildeo neotropical e subtropicais e a invasatildeo do DENV
seguiu logo depois Em 1985 A albopictus foi introduzido nos EUA e no Brasil
proporcionando um vetor para a transmissatildeo secundaacuteria de DENV nas Ameacutericas (Hawley
1987)
Os mosquitos vetores principalmente A aegypti tornam-se infectados quando eles se
alimentam do sangue de seres humanos durante o periacuteodo de cinco dias da viremia A
infecccedilatildeo produz um amplo espectro da doenccedila cliacutenica e varia de assintomaacutetica a doenccedila febril
auto-limitante A dengue tambeacutem conhecida como ldquofebre osso quebradordquo devido agraves fortes
dores nas articulaccedilotildees e inclui sintomas de febre alta dores musculares articulares e erupccedilatildeo
cutacircnea Uma pequena porcentagem de indiviacuteduos pode apresentar a siacutendrome do choque da
8
dengue (dengue hemorraacutegica) com risco de vida grave O tratamento eacute amplamente favoraacutevel
usando de reidrataccedilatildeo oral ou intravenosa acompanhamento e atenccedilatildeo meacutedica adequada No
entanto uma das principais consequecircncias da doenccedila eacute a sua capacidade de sobrecarregar
instalaccedilotildees meacutedicas durante um surto e em paiacuteses onde os recursos de sauacutede jaacute estatildeo no
limite isso pode ter efeitos catastroacuteficos Prevenccedilatildeo e tratamento portanto se fazem
altamente necessaacuterios (Perry 2011)
A prevalecircncia global de DENV cresceu drasticamente nas uacuteltimas deacutecadas e ateacute o
momento natildeo haacute nenhum medicamento especiacutefico para combater a infecccedilatildeo as medidas de
prevenccedilatildeo mais eficazes satildeo voltadas para o controle do vetor (Silva 2011) Diante disso a
Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) elegeu o desenvolvimento de vacinas contra o viacuterus da
dengue como prioridade mundial (Kinney 2001) Por conseguinte a busca de substacircncias
naturais ou sinteacuteticas com atividade antiviral especiacutefica sem toxicidade para as ceacutelulas
normais em seres humanos eacute uma estrateacutegia desejada para evitar que a dengue se agrave e
ajudar a controlar a difusatildeo da doenccedila As vaacuterias fases do ciclo viral representam alvos
terapecircuticos individuais que podem ser exploradas (Costa 2013) Nesse sentido vaacuterios
grupos de pesquisa e organizaccedilotildees estatildeo trabalhando com diversas abordagens para o
desenvolvimento de compostos antivirais com atividade protetora contra dengue Dentre elas
uma vasta gama de produtos naturais incluindo plantas numa tentativa de isolar e
caracterizar novos compostos que podem inibir a replicaccedilatildeo do viacuterus ou tratar a infecccedilatildeo
viral Por essa razatildeo extratos e componentes da planta satildeo cada vez mais importantes como
fontes potenciais para agentes antivirais (Silva 2011)
14 Naftoquinonas
As quinonas satildeo compostos aromaacuteticos amplamente distribuiacutedos na natureza e podem
ser encontrados em vaacuterias famiacutelias de plantas bem como isolado de fungos algas e
bacteacuterias Elas satildeo classificadas em benzoquinonas antraquinonas e naftoquinonas de acordo
com as suas estruturas quiacutemicas Naftoquinonas satildeo compostos orgacircnicos altamente reativos
utilizados como corantes naturais ou sinteacuteticos cujas cores variam de amarelo para vermelho
Apresentam cadeia carbocircnica similar ao naftaleno e satildeo caracterizadas por seus dois grupos
carbonila na posiccedilatildeo 1 e 4 por isso satildeo nomeadas de 14-naftoquinonas Os grupos carbonila
tambeacutem podem estar presente na posiccedilatildeo 12 com menor incidecircncia (Loacutepez 2014)
9
Figura 4 Estrutura quiacutemica da 12-naftoquinona (1) e 14-naftoquinona (2)
Entre as quinonas estatildeo compostos biologicamente importantes tais como o grupo da
vitamina K e a coenzima Q (ubiquinona) Estes compostos tecircm um papel importante no
metabolismo celular especialmente como carreadores de eleacutetrons Aleacutem de quinonas que
possuam uma funccedilatildeo bioloacutegica outros compostos desta classe tecircm sido encontrados
mostrando atividade antibioacutetica Alguns deles estatildeo presentes na natureza mas a maior parte
satildeo obtidos sinteticamente entre eles 2-hidroxi-3-alquil-14-naftoquinonas que possuem
evidecircncias de serem ativos in vitro contra os parasitas da malaacuteria e como coccidiostaacuteticos
(Ambrogi 1970)
A atividade bioloacutegica de quinonas estaacute muitas vezes relacionada com o seu
comportamento eletroquiacutemico A capacidade de aceitar um ou dois eleacutetrons para formar o
acircnion radical correspondente ou dianion pode ser o motivo da induccedilatildeo da formaccedilatildeo de
espeacutecies reativas de oxigecircnio responsaacuteveis pelo estresse oxidativo nas ceacutelulas A capacidade
de aceitar eleacutetrons de naftoquinonas pode ser alterada por mudanccedilas de posiccedilatildeo do grupo
carbonila (12- 14-naftoquinonas) ou diferentes substituintes ou funccedilotildees associadas agrave porccedilatildeo
de naftoquinona (Francisco 2010)
As naftoquinonas satildeo largamente encontradas em plantas micro-organismos e alguns
animais Estes compostos tecircm sido amplamente utilizados em diversas culturas como corantes
para cosmeacuteticos tecidos alimentos (Brandelli 2004) e para fins medicinais incluindo
antitumoral (Oliveira 1990 Ferreira 1996) anti-inflamatoacuterios antimalaacuterico antiviral
(Fonseca 2003 Hussain 2007) atibacterianos e antifuacutengicos (Nagata 1998) Estas atividades
bioloacutegicas tecircm justificado o grande nuacutemero de trabalhos (aproximadamente 42 ateacute abril 2016
ndash Pubmed) encontrados na literatura que visa a siacutentese e avaliaccedilatildeo de qualquer das quinonas
naturais ou seus anaacutelogos como agentes farmacoloacutegicos potenciais (Rahmoun 2013)
10
O Lapachol foi descoberto e estudado desde o seacuteculo XIX Foi isolado primeiramente
do lenho da aacutervore argentina ldquolapachordquo Tabebuia avellanedae (Bignoniaceae) conhecida
como Ipecirc roxo Os estudos quiacutemicos foram desenvolvidos inicialmente em 1892 (Fonseca
2003) O lapachol foi descrito pela primeira vez por Paterno em 1821 tendo sua estrutura
quiacutemica estabelecida em 1896 por Hooker que o identificou como uma naftoquinona Esta
naftoquinona possui accedilatildeo antiinflamatoacuteria analgeacutesica antibioacutetica e anti-neoplaacutesica
reconhecida (Arauacutejo 2002)
A β-lapachona (34-di-hidro-22-dimetil-2H-naptho [12-b] pirano-56-diona) eacute uma
quinona obtida de fontes naturais derivada da aacutervore Lapacho (Tabebuia avellanedae) nativa
da Ameacuterica do Sul e Central A siacutentese e quiacutemica da β-lapachona e compostos relacionados
foi inicialmente investigado no final do seacuteculo XIX e iniacutecio do seacuteculo XX pelo quiacutemico
Samuel Hooker Apesar de alguns estudos cliacutenicos sobre a bioatividade de naftoquinonas
terem sido relatados no iniacutecio de 1940 foi o relatoacuterio do potencial da β-lapachona como um
agente anti-tripanossoma em 1977 que revitalizou o estudo e caracterizaccedilatildeo deste composto
natural A β-lapachona tambeacutem apresenta vaacuterias accedilotildees farmacoloacutegicas incluindo accedilatildeo
formaccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (Hussain 2007)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do Lapachol (1) da α- Lapachona (2) e da β-
Lapachona (Fonseca et al 2003 Ferreira et al 2010)
11
Figura 6 Tabebuia avellanedae (Hussain 2007)
A β-lapachona eacute uma substacircncia natural facilmente obtida a partir do lapachol Esta
naftoquinona eacute o grande destaque desta classe de substacircncias porque se encontra em testes
cliacutenicos de fase II para o tratamento do cacircncer de pacircncreas (Ferreira 2010) O mecanismo de
accedilatildeo da β-lapachona diferencia-se de outros antineoplaacutesicos por atuar na topoisomerase I
promovendo a recuperaccedilatildeo da capacidade de apoptose celular Alguns estudos reportam sua
accedilatildeo sineacutergica de potenciaccedilatildeo com o Taxolreg
promovendo a inibiccedilatildeo em diferentes pontos de
replicaccedilatildeo celular aleacutem de sua combinaccedilatildeo com outros tratamentos como a aplicaccedilatildeo de
radiaccedilatildeo ionizante (Cunha 2005)
Vaacuterios estudos jaacute foram publicados demonstrando a atividade antiviral de
naftoquinonas naturais e sinteacuteticas A β-lapachona inibe seletivamente a replicaccedilatildeo do viacuterus
HIV-1 atuando na inibiccedilatildeo da enzima LTR117 Da mesma forma este composto eacute um
potente inibidor da enzima transcriptase reversa dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e
leucemia murina de Rauscher (RLV) inibindo tambeacutem a DNA polimerase A accedilatildeo inibitoacuteria
sobre estas enzimas revelou-se especiacutefica se comparada com a de outros inibidores
conhecidos (Silva 2003)
O Lapachol jaacute demonstrou atividade contra certas cepas virais incluindo Herpes virus
tipos I e II Outras naftoquinonas jaacute mostraram eficaacutecia contra cepas de Influenza virus
Poliomielite virus e estomatite vesicular Supotildee-se que o mecanismo de accedilatildeo destas quinonas
seja atraveacutes da inibiccedilatildeo da transcriptase reversa de retroviacuterus e da RNA polimerase Eacute relatado
12
que lapachol diminui a replicaccedilatildeo do viacuterus em seres humanos mas ainda natildeo existem
resultados de testes cliacutenicos disponiacuteveis (Hussain 2007)
Na avaliaccedilatildeo da atividade antiviral do Lapachol in vitro verificou-se que esta
substacircncia eacute ativa contra viacuterus RNA atuando tanto sobre viacuterus envelopados quanto sobre
partiacuteculas sem esta estrutura em concentraccedilotildees de 5 a 10 microgmL e ainda apresentou uma
pequena atividade sobre HSV (Herpes simplex I) e Ad5 (Adeno tipo 5) mas nenhuma
atividade sobre CoxB4 (Coxsackie B4) Em trabalho posterior demonstrou-se que nem o
Lapachol nem diversos dos seus derivados apresentaram atividade antiviral in vitro sobre
Poliovirus tipo 1 Ecovirus 19 e Coxsackie B tipo 4 Apenas os derivados 12-naftoquinonicos
e um intermediaacuterio da siacutentese Hoocker foram ativos contra o Echovirus 19 (Fonseca 2003)
Costa et al (2013) relataram que piranonaftoquinonas isocircmeras do lapachol possuem
atividade de inibiccedilatildeo da replicaccedilatildeo de DENV-2 atuando sobre a atividade da ATPase de NS3
(proteiacutena natildeo estrutural de DENV)
A utilizaccedilatildeo de testes in vitro por meio de ensaios de viabilidade celular constitui o
primeiro passo para a avaliaccedilatildeo da compatibilidade bioloacutegica de uma substacircncia e pode
fornecer elementos importantes para a anaacutelise da biocompatibilidade dos diferentes materiais
Para ser considerado natildeo citotoacutexico no teste de citotoxicidade in vitro um produto natildeo deve
ocasionar a morte das ceacutelulas nem afetar suas funccedilotildees celulares A prova do MTT eacute um dos
indicadores colorimeacutetricos de viabilidade celular mais utilizados sendo capaz de avaliar a
funccedilatildeo celular mitocondrial de acordo com a reduccedilatildeo enzimaacutetica do sal de tetrazoacutelio pelas
desidrogenases mitocondriais nas ceacutelulas viaacutevies (Arauacutejo et al 2008) Supotildee-se que o
mecanismo responsaacutevel pela citotoxicidade apresentada pelas quinonas esteja relacionado
com o estresse oxidativo causado por esses compostos poreacutem a capacidade de alquilaccedilatildeo de
nucleoacutefilos celulares tambeacutem representa correlaccedilatildeo com tais efeitos bioloacutegicos (Goulart
2004)
13
II JUSTIFICATIVA
14
2 JUSTIFICATIVA
Aleacutem do controle do mosquito transmissor e do desenvolvimento de vacinas que tem
sido exaustivamente estudado nos uacuteltimos anos uma alternativa para o combate agrave dengue
seria o desenvolvimento de faacutermacos para reduzir a viremia ou mesmo para controlar a
resposta imune do hospedeiro agrave infecccedilatildeo que tem sido apontada como principal fator de risco
nos casos mais graves Em funccedilatildeo disso o nuacutemero de pesquisas visando o desenvolvimento
de drogas com accedilatildeo antiviral ou com accedilatildeo imunomodulatoacuteria tem aumentado
significativamente As naftoquinonas vecircm ganhando bastante importacircncia na pesquisa de
novas drogas antivirais devido agrave algumas atividades apresentadas A szlig-lapachona-orto-
naftoquinona por exemplo se mostrou um potente inibidor da enzima transcriptase reversa
dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e leucemia murina de Rauscher (RLV)
Diante da inexistecircncia de drogas com accedilatildeo anti DENV e o elevado nuacutemero e casos da
patogenia nos uacuteltimos anos a organizaccedilatildeo mundial da sauacutede classificou a Dengue como uma
epidemia de proporccedilotildees globais e um problema de sauacutede puacuteblica Como as naftoquinonas jaacute
demonstraram na literatura possuir um potencial efeito terapecircutico contra alguns viacuterus eacute
possiacutevel que estes compostos possam apresentar atividade antiviral contra DENV Portanto
este trabalho visou atraveacutes de ensaios de MTT e titulaccedilotildees virais em placa avaliar a potencial
atividade antiviral de oito compostos derivados de naftoquinonas naturais e sinteacuteticas
15
III OBJETIVOS
16
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar oito compostos (2 naturais e 6 sinteacuteticos) derivados de naftoquinonas como potenciais
agentes antivirais em ceacutelulas BHK-21 frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1 e 2
32 Objetivos especiacuteficos
1 Calcular o iacutendice de citotoxicidade e a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) dos compostos
atraveacutes de ensaio de reduccedilatildeo de MTT
2 Avaliar os efeitos dos compostos sobre o crescimento a viabilidade e o volume celular
pela teacutecnica de exclusatildeo do azul de tripan
3 Determinar a multiplicidade de infecccedilatildeo de DENV 1 e 2 a ser utilizada nos ensaios
antivirais
4 Avaliar a atividade antiviral dos compostos frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1
e 2 atraveacutes do ensaio de MTT
5 Verificar um possiacutevel efeito direto dos compostos agraves partiacuteculas virais de Dengue virus
6 Quantificar a produccedilatildeo de partiacuteculas virais infecciosas no sobrenadante de ceacutelulas
infectadas atraveacutes de titulaccedilatildeo viral pela contagem de unidades formadoras de placas
17
IV MATERIAL E MEacuteTODOS
18
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Linhagens celulares
411 Ceacutelulas C636
As ceacutelulas C636 satildeo ceacutelulas de linhagem contiacutenua de larvas de mosquito Aedes
albopictus Estas ceacutelulas foram utilizadas na produccedilatildeo de estoque viral de DENV sorotipos 1
e 2 para isso foram mantidas em meio de cultura Leibovitz-15 (L-15) (Cultilab)
suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (Cultilab) antibioacuteticos (Penicilina 100 UmL
Streptomicina 100 microgmL) e antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL) a 28degC
412 Ceacutelulas BHK-21
As ceacutelulas BHK-21 satildeo fibroblastos de linhagem contiacutenua derivados de rim de hamster
neonato Estas ceacutelulas foram utilizadas para os experimentos in vitro e para as titulaccedilotildees de
DENV 1 e 2 para isso foram mantidas em meio miacutenimo essencial modificado por Dulbecco
ndash DMEM (Cultilab) suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (SFB) com antibioacuteticos
(Penicilina 100 UmL Streptomicina 100 microgmL) e com antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL)
sendo mantidas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5
42 Viacuterus
421 DENV 1 e DENV 2
O Sorotipo 1 do Dengue virus (DENV-1) estirpe Mochizuki foi replicado em ceacutelulas
C636 para gerar estoques de trabalho durante 2 e 5 dias a 28degC O sobrenadante da cultura de
ceacutelulas infectadas foi recolhido e clarificado por centrifugaccedilatildeo a 4000 G durante 10 minutos agrave
4degC e entatildeo foi aliquotado e armazenado a -70 deg C como reserva de viacuterus ateacute agrave sua utilizaccedilatildeo
A replicaccedilatildeo geraccedilatildeo de estoque e titulaccedilatildeo do Sorotipo 2 do Dengue virus (DENV-2)
estirpe Nova Guineacute C ocorreu nos mesmos moldes do DENV-1
19
422 Titulaccedilatildeo viral
Os estoques virais foram diluiacutedos (10-1
a 10-7
) e inoculados em monocamadas de
ceacutelulas BHK-21 implantadas em placas de 6 poccedilos com confluecircncia de aproximadamente
60 (3x105 ceacutelulas por poccedilo) sendo um poccedilo natildeo infectado mantido para controle celular
Apoacutes uma hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus foram adicionados 3 mL de meio DMEM (Cultilab)
suplementado com 15 de SFB e contendo 15 de Carboximetilcelulose (CMC Synth) As
placas foram entatildeo incubadas a 37degC (CO2 a 5) por 96 horas As ceacutelulas foram entatildeo
fixadas com 2 mL de soluccedilatildeo de formol a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo
1 (pv) de cristal violeta em PBS para contagem das placas de lise O tiacutetulo viral foi
expresso atraveacutes do nuacutemero de unidades formadoras de placa por mL (UFPmL) segundo a
formula abaixo representada
Tiacutetulo viral (UFPmL) = N x FC x 10
N = nuacutemero de placas de lise contadas
FC = Fator de correccedilatildeo
= Inverso da diluiccedilatildeo na qual foram contadas as placas de lise
43 Compostos de naftoquinonas
Os compostos utilizados neste estudo foram fornecidos pelo Dr Geraldo Ceacutelio
Brandatildeo do laboratoacuterio de pesquisa da Escola de Farmaacutecia da Universidade Federal de Ouro
Preto
20
Tabela 1 Relaccedilatildeo de nome estrutura e coacutedigo dos compostos utilizados Na tabela estatildeo
presentes a relaccedilatildeo dos nomes dos compostos utilizados neste trabalho bem como sua
estrutura Os coacutedigos representantes de cada composto seratildeo utilizados no decorrer da escrita
Nome do composto Estrutura Coacutedigo
Lapachol
A1
β-lapachona
A2
2-Hidroxi-3-(ββ-dimetilvinil)-14-naftoquinona
A3
2-Cloro-14-naftoquinona
A4
Lapachol derivado 1
A5
Lapachol derivado 2 A6
Lapachol derivado 3 A7
Lapachol derivado 4 A8
44 Ensaio de citotoxicidade
Para avaliar a citotoxicidade dos compostos ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas foram incubadas com diferentes concentraccedilotildees dos compostos em triplicata num
volume de 200 microL de meio de cultura por poccedilo na presenccedila de 1 de SFB Os controles natildeo
tratados apresentaram adiccedilatildeo de 200 microL de meio de cultura As ceacutelulas foram entatildeo incubadas
durante 72 horas O meio foi removido e 28 microL de soluccedilatildeo de 5 mg mL MTT (brometo de 3-
21
[45-dimetil-tiazol-2-il]-25 difeniltertrazoacutelio) foi adicionado a cada poccedilo As placas foram re-
incubadas durante 1 hora e 30 minutos e entatildeo 122 microL de DMSO foi adicionado a cada poccedilo e
placas foram agitadas suavemente durante 15 minutos para dissolver os cristais de formazan
A absorbacircncia foi lida em um equipamento leitor de placas Victor X3 (PerkinElmer) a 490
nm A concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC 50) foi definida como a concentraccedilatildeo da amostra que
reduziu a viabilidade celular de 50 em comparaccedilatildeo com controles natildeo tratados Os dados
foram analisados utilizando o programa Prisma
45 Avaliaccedilatildeo da viabilidade e crescimento celular por exclusatildeo de azul de tripan
Ceacutelulas BHK-21 foram cultivadas em placas de 24 poccedilos (7x104 ceacutelulaspoccedilo) e apoacutes
24 horas foram tratadas com as concentraccedilotildees de uso de cada composto e incubadas por 72
horas na presenccedila de 1 de SFB A seguir as ceacutelulas foram tripsinizadas e incubadas com
azul de tripan e entatildeo foi utilizado um contador automatizado de ceacutelulas (Countess II FL
Automated Cell Counter ndash Thermo Fisher Scientific) para contagem das ceacutelulas e avaliaccedilatildeo da
porcentagem de viabilidade e diacircmetro celular do controle nos tempos de 0 24 e 96 horas e
avaliaccedilatildeo dos mesmos paracircmetros para os compostos no tempo de 96 horas (72 horas poacutes
tratamento)
Outra curva de multiplicaccedilatildeo celular foi feita para os compostos A1 A3 A4 e A5 onde as
ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos no momento da confecccedilatildeo da placa e
foram avaliados os mesmos paracircmetros nos tempos de 0 12 24 48 e 72 horas O
equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
46 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
Para determinar a menor Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) responsaacutevel pela letalidade
celular total 2x104 de ceacutelulas BHK-21 foram semeadas em placa de 96 poccedilos Apoacutes a
incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o
meio de cultura foi removido e as ceacutelulas foram expostas a diferentes diluiccedilotildees dos dois
sorotipos de DENV (100 microL de cada diluiccedilatildeo + 100 microL de meio DEMEM 1 SFB) As
diluiccedilotildees seriadas foram realizadas da suspensatildeo viral na razatildeo de 5 para o primeiro poccedilo e de
2 para os demais poccedilos Apoacutes 72 horas as ceacutelulas foram entatildeo fixadas com 200 microL de soluccedilatildeo
22
formalina a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo 1 (pv) de cristal violeta em
PBS para avaliaccedilatildeo da maior diluiccedilatildeo responsaacutevel pela letalidade de 100 das ceacutelulas
47 Ensaio Dose-resposta
Para cada composto foram realizados ensaios de dose-resposta para definiccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de cada composto capaz de promover a reduccedilatildeo na produccedilatildeo viral A atividade
antiviral foi avaliada tambeacutem pelo meacutetodo de MTT Ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas expostas a diferentes concentraccedilotildees dos extratos determinadas a partir das maiores
concentraccedilotildees em que natildeo foram observados efeitos citotoacutexicos As ceacutelulas foram tratadas
com as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de cada composto e em seguida infectadas com DENV
1 (MOI= 5) ou 2 (MOI= 2) Mantendo uma coluna para controle com DMSO uma coluna
para controle de viacuterus uma coluna para controle de citotoxicidade dos compostos e por fim
uma coluna para controle celular As ceacutelulas foram entatildeo incubadas durante 72 horas Apoacutes
este tempo procedeu-se a leitura pelo ensaio de MTT como descrito anteriormente Os dados
foram analisados levando-se em consideraccedilatildeo a leitura das absorbacircncias dos poccedilos dos
controles de viacuterus e do controle celular
Para realizacao destes experimentos os seguintes controles foram adotados
Controle de ceacutelulas poccedilos contendo somente ceacutelulas acrescidas do meio de cultura DMEM
1 SFB Utilizado para avaliar o comportamento das ceacutelulas sem que as mesmas tivessem
contato com qualquer interferente durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo Com isso os poccedilos
reservados para esse controle serviram de padratildeo para comparaccedilatildeo com aqueles em que fosse
observada atividade citotoacutexica ou citopaacutetica
Controle de viacuterus poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM 1 SFB
sem nenhum tratamento e de suspensatildeo de viacuterus Utilizando como referecircncia para anaacutelise da
atividade citopaacutetica provocada pelo viacuterus testado durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo das placas
23
Controle de viacuterus com DMSO Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura
DMEM 1 SFB e DMSO Foi utilizado para avaliar se havia influecircncia prejudicial do
solvente utilizado para diluiccedilatildeo das amostras no meio de cultivo das ceacutelulas e se o mesmo
poderia apresentar alguma potencial atividade antiviral aparente
Controle de citotoxicidade Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM
1 SFB e as quatro principais concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos Foi utilizado
para avaliar se haveria alguma possiacutevel atividade citotoacutexica das concentraccedilotildees dos compostos
em relaccedilatildeo agraves ceacutelulas
48 Ensaio Virucida
Para a realizaccedilatildeo deste ensaio aliacutequotas de 950 microL (diluiccedilatildeo de 20 vezes) do DENV 1 (tiacutetulo
6 x 107 UFPmL) foram incubadas com 50 microL de uma soluccedilatildeo de meio DMEM preparada
com 20x a concentraccedilatildeo natildeo citotoacutexica de cada composto A1 a A8 em banho-maria 37deg C
por 1 hora Apoacutes a incubaccedilatildeo as aliacutequotas foram imediatamente tituladas em ceacutelulas BHK-21
em placas de 6 poccedilos utilizando-se 3 diluiccedilotildees para cada incubaccedilatildeo (20x 20 x 10-1
e 20 x 10-
2) Foram titulados tambeacutem uma aliacutequota incubada apenas com meio DMEM sem nenhum
tratamento e outra aliacutequota incubada com DMSO (Dimetilsulfoacutexido) Estas foram tituladas
utilizando um controle e mais cinco diluiccedilotildees (20x 20 x 10-1
20 x 10-2
20 x 10-3
e 20 x 10-4
)
49 Ensaio antiviral
Neste ensaio ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em placas de 24 poccedilos no dia
seguinte foram tratadas durante 4 horas com as concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas de cada
composto em duplicata Apoacutes o preacute-tratamento as monocamadas foram infectadas com
DENV-1 a uma MOI=5 na presenccedila das concentraccedilotildees de uso respectivas de cada composto
Apoacutes 1 hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus as monocamadas foram lavadas duas vezes com PBS e
foi adicionado 500 microL por poccedilo de meio preparado com as mesmas concentraccedilotildees dos
diferentes compostos e mantidos durante 48 horas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5 Em
quatro poccedilos as ceacutelulas foram infectadas e natildeo tratadas e em outros quatro poccedilos as ceacutelulas
natildeo foram tratadas e nem infectadas (controle de ceacutelulas) destes uacuteltimos dois foram
tripsinizados e contados no momento da infecccedilatildeo e os outros dois apoacutes o teacutermino do ensaio
24
para avaliar o crescimento celular Decorridas as 48 horas o sobrenadante foi coletado e
centrifugado por 10 minutos a 4000 xG para separaccedilatildeo dos debris celulares e prontamente
titulado em placa de 6 poccedilos
410 Anaacutelise estatiacutestica
Os valores de CC50 foram obtidos a partir de anaacutelise de regressatildeo linear das curvas de
concentraccedilatildeocitotoxicidade A anaacutelise estatiacutestica dos dados foi realizada pelo programa
GraphPad Prism software Uma anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi utilizada para determinar
as diferenccedilas estatiacutesticas seguida do poacutes teste de Tukey A significacircncia estatiacutestica foi fixada
em p lt005
25
V RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
26
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Ensaio de citotoxicidade celular
Para avaliar a viabilidade da linhagem celular BHK-21 frente ao tratamento com oito
diferentes concentraccedilotildees dos compostos (A1 a A8) realizou-se um ensaio de MTT (brometo
de 3-[45-dimetil-tiazol-2-il]-25-difeniltetrazoacutelio) Este ensaio tem o objetivo de quantificar
espectrofotometricamente o crescimento celular a viabilidade e proliferaccedilatildeo podendo ser
utilizado como um indicador direto de citotoxicidade Trata-se de um ensaio colorimeacutetrico
para medir a atividade da redutase mitocondrial em ceacutelulas vivas Ele se baseia na reduccedilatildeo do
sal amarelo tetrazoacutelio (permeaacutevel agrave membrana celular) para cristais de formazan azuis
puacuterpura por ceacutelulas metabolicamente ativas a quantidade de formazan gerada medida por
espectrofotometria eacute proporcional ao nuacutemero de ceacutelulas viaacuteveis
A CC50 foi calculada plotando-se uma curva de porcentagem de viabilidade celular por
concentraccedilatildeo melhor representada na figura 7 pelo composto A7 e os resultados de CC50
para todos os compostos estatildeo representados na tabela 2 Foram feitos ensaios de
citotoxicidade com oito concentraccedilotildees diferentes sendo escolhida a maior concentraccedilatildeo que
natildeo apresentou citotoxicidade
Viabilidade Celular = [ ( A ndash B ) A ] x 100
Onde
A = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas natildeo tratadas
B = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas tratadas com
as respectivas concentraccedilotildees de cada composto
27
28
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (A curva dose resposta do composto A7 eacute a que
melhor representa a curva dose resposta esperada) Avaliou-se a viabilidade da linhagem
celular BHK-21 frente agrave diferentes concentraccedilotildees dos compostos realizando o ensaio de MTT
e determinando assim as concentraccedilotildees a serem utilizadas nos proacuteximos ensaios bem como
calculando a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) agrave partir da curva
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo
da concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50)
Composto Concentraccedilatildeo utilizada
[ ] microgmL
Concentraccedilatildeo citotoacutexica 50
(CC50) [ ] microgmL plusmn Desvio
Padratildeo
A1 ([ ]=1 mgmL) 00200 10010 plusmn 0014
A2 ([ ]=1 mgmL) 00025 09561 plusmn 0023
A3 ([ ]=1 mgmL) 00025 09988 plusmn 0017
A4 ([ ]=5 mgmL) 00125 10150 plusmn 0036
A5 ([ ]=10 mgmL) 00250 10590 plusmn 0047
A6 ([ ]=5 mgmL) 00250 08183 plusmn 0030
A7 ([ ]=5 mgmL) 00125 10280 plusmn 0052
A8 ([ ]=5 mgmL) 00125 09758 plusmn 0036
52 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan
Para corroborar o ensaio anterior de citotoxicidade utilizou -se o teste de viabilidade
celular pela teacutecnica da exclusatildeo do azul de tripan com a finalidade de determinar a
viabilidade das ceacutelulas Os procedimentos adotados no ensaio seguiram o manual do
equipamento contador automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL Automated Cell Counter) entatildeo
foi acrescentado agrave 10 microL da suspensatildeo celular 10 microL de azul de tripan (04) Apoacutes
homogeneizaccedilatildeo 10 microL da suspensatildeo foi colocada no local indicado da lacircmina proacutepria para
leitura e foi realizada a contagem sendo consideradas mortas (inviaacuteveis) as ceacutelulas que
incorporavam o corante e viaacuteveis as que excluiacuteam o azul de tripan
29
O equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
(A)
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan A avaliaccedilatildeo da
viabilidade celular foi realizada atraveacutes de um contador automaacutetico de ceacutelulas Este
equipamento possibilita explorar ferramentas de fotografia e avaliar alguns paracircmetros
importantes (A) fotografia das ceacutelulas (B) Zoom na fotografia das ceacutelulas com marcaccedilotildees
(em verde para ceacutelulas vivas e vermelho para mortas) e (D) contagem das ceacutelulas totais
ceacutelulas vivas e mortas graacutefico e meacutedia dos diacircmetros celulares das ceacutelulas vivas e mortas
(B)
(C)
30
O crescimento celular de ceacutelulas natildeo tratadas foi avaliado nos tempos de 0h (momento
da confecccedilatildeo da placa) 24h (momento de tratamento com os compostos) e 96 horas
(Momento em que todas as ceacutelulas foram tripsinizadas e contadas) para avaliar o perfil do
crescimento celular em ceacutelulas natildeo tratadas Foi observado um crescimento celular no periacuteodo
de 24 horas onde as ceacutelulas estavam incubadas com meio acrescido de 10 SFB Em 24
horas o meio foi trocado por 1 SFB e acrescido das substacircncias testes nas menores diluiccedilotildees
natildeo citotoacutexicas determinadas pelo ensaio do MTT Em 96 horas pode ser observado um
decaimento no nuacutemero de ceacutelulas vivas provavelmente devido ao crescimento celular (morte
por confluecircncia)
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas)
(A) (B)
31
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas (A)
Contagem de ceacutelulas vivas (B) Percentual de ceacutelulas viaacuteveis (Viabilidade celular ) e (C)
Meacutedia do diacircmetro apresentado pelas ceacutelulas vivas
Em 96 horas as ceacutelulas natildeo tratadas bem como as ceacutelulas tratadas por 72 horas com as
concentraccedilotildees de uso dos compostos foram tripsinizadas e avaliadas quanto ao nuacutemero de
ceacutelulas vivas viabilidade e diacircmetro celular apresentados na figura 10
Segundo se observa natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo aparente que possa demonstrar que
as concentraccedilotildees de uso dos compostos tenham causado alguma atividade citotoacutexica
corroborando assim os ensaios de citotoxicidade anteriores
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
A infectividade de um viacuterus depende de vaacuterios fatores entre eles da proporccedilatildeo de
partiacuteculas virais completas ou infecciosas da suscetibilidade da ceacutelula hospedeira e da
chance desta partiacutecula encontrar o receptor e penetrar na ceacutelula Quando ceacutelulas suscetiacuteveis
satildeo misturadas com uma suspensatildeo de viacuterus estas podem receber uma duas trecircs ou dez
partiacuteculas virais ou nenhuma Isto depende da proporccedilatildeo entre a quantidade de viacuterus
infecciosos presente no inoculo e a quantidade de ceacutelulas utilizada Esta relaccedilatildeo eacute denominada
de multiplicidade de infecccedilatildeo ou MOI Uma MOI=1 indica que a infecccedilatildeo foi feita em
principio com 1 viacuterus ou 1 dose infectante por ceacutelula
A determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo dos Dengue virus 1 e 2 a serem
utilizadas nos proacuteximos ensaios foi feita a partir da infecccedilatildeo de ceacutelulas BHK-21 por diferentes
(C)
32
concentraccedilotildees de viacuterus e revelaccedilatildeo com cristal violeta Escolheu-se a maior diluiccedilatildeo viral que
possibilitou a letalidade total das ceacutelulas (faixa onde todas as ceacutelulas estatildeo mortas utilizando
menor concentraccedilatildeo de viacuterus) As faixas escolhidas foram entatildeo calculadas levando-se em
consideraccedilatildeo o nuacutemero de ceacutelulas presentes no poccedilo e o nuacutemero de partiacuteculas virais que foram
adicionadas (Faixa3 para DENV2 e 2 para DENV1) Figura 11 Foi estipulado portanto a
Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 2 para DENV 2 e 5 para DENV 1
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI A partir da infecccedilatildeo da linhagem celular BHK-21 em
placa de 96 poccedilos com diferentes diluiccedilotildees de DENV foi determinado que a Multiplicidade
de infecccedilatildeo para o Dengue viacuterus sorotipos 1 e 2 seria de 5 e 2 respectivamente (colunas 2 -
DENV1 e 3 - DENV2)
54 Ensaio dose resposta
Apoacutes a determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas ideais realizou-se um
ensaio dose resposta tratando as ceacutelulas com oito concentraccedilotildees agrave partir das concentraccedilotildees natildeo
citotoacutexicas escolhidas para cada composto e em seguida infectando com DENV sorotipos 1 e
2 nas MOIs estipuladas anteriormente (5 e 2 respectivamente) A porcentagem do efeito
protetor conferida agraves ceacutelulas para cada concentraccedilatildeo de amostra testada foi calculada da
seguinte forma
33
EP = [ (A ndash B) (C ndash B) ] x 100
Onde
A Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas tratadas e infectadas
B Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e infectadas
C Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e natildeo infectadas
Este ensaio tem por objetivo identificar a resposta celular agrave infecccedilatildeo frente ao
tratamento com os compostos em diferentes concentraccedilotildees Assim como o ensaio de
toxicidade este ensaio feito utilizando a teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT permite o teste de vaacuterias
concentraccedilotildees diferentes em um menor tempo e com baixo gasto de material
34
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV1
(MOI=5)
35
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV2
(MOI=2)
36
Takegami et al (1998) demonstraram atividade de furanonaftoquinonas contra o viacuterus
da Encefalite Japonesa (Flavivirus) utilizando a concentraccedilatildeo de 3microgmL poreacutem para os
compostos apresentados avaliados pela teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT nenhuma das
concentraccedilotildees apresentadas produziu efeito antiviral significativo em relaccedilatildeo ao controle
celular como observado nas figuras 12 e 13
Apesar da teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT ser interessante como triagem de atividade
antiviral permitindo o teste de vaacuterias concentraccedilotildees dos compostos em menor tempo e
utilizando uma quantidade razoaacutevel de materiais optou-se por utilizar as maiores
concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas encontradas avaliando sua atividade antiviral por outras
teacutecnicas Como natildeo foi avaliada atividade antiviral preacutevia para nenhum dos compostos frente
agrave infecccedilatildeo por DENV1 e 2 foi selecionado o Dengue virus 1 para dar prosseguimento aos
ensaios
55 Ensaio Virucida
O ensaio virucida foi realizado para avaliar um potencial efeito dos compostos
diretamente sobre a partiacutecula viral Este ensaio eacute importante pois possibilita elucidar se o
composto pode produzir algum efeito sobre a partiacutecula viral impedindo que esta possa infectar
as ceacutelulas
Figura 14 Ensaio virucida Neste ensaio as aliacutequotas de DENV1 foram incubadas com as
concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos e titulados (NT) Controle natildeo tratado
37
Tabela 3 Ensaio virucida Caacutelculo do tiacutetulo viral (UFPmL) e porcentagem representante de
cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 254 x 105 100
DMSO 263 x 105 10335
A1 199 x 105 7835
A2 205 x 105 8071
A3 237 x 105 9311
A4 775 x 104 3049
A5 153 x 105 6024
A6 219 x 105 8602
A7 243 x 105 9547
A8 254 x 105 100
Lagrota et al (1988) demonstraram atividade de 2-HO-3-N-benzil-N(N-benzil-2-
etilamina) -14-naftoquinona sobre a partiacutecula viral de enterovirus De forma contraacuteria apesar
de se verificar a reduccedilatildeo de quase uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais
para o composto A4 natildeo considerou-se esta uma alteraccedilatildeo significativa pois devido agrave
magnitude do nuacutemero de UFPs se trata de uma alteraccedilatildeo muito pequena Portanto os
compostos avaliados neste trabalho natildeo produziram atividade virucida aparente frente ao
tratamento com as concentraccedilotildees de uso
56 Ensaio Antiviral
O sobrenadante de ceacutelulas tratadas previamente e infectadas por DENV1 coletado 48
horas poacutes infecccedilatildeo foi avaliado quanto agrave produccedilatildeo viral de partiacuteculas infecciosas pela
contagem de placas de lise e caacutelculo de Unidades Formadoras de Placa (Titulaccedilatildeo viral em
placa ndash UFPmL)
38
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral Sobrenadante de ceacutelulas tratadas e infectadas por DENV1
coletado apoacutes 48 horas e titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado
Tabela 4 Ensaio Antiviral Coleta do sobrenadante de ceacutelulas infectadas por DENV1 Tiacutetulo
viral (UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o
controle natildeo tratado como 100
Ao perceber um aumento no tiacutetulo viral frente ao tratamento com os compostos A1
A2 e A3 e uma reduccedilatildeo frente ao tratamento com A4 A5 e A6 foram escolhidos dois
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 119 x 105 10000
A1 235 x 105 19748
A2 228 x 105 19160
A3 318 x 105 26723
A4 128 x 104 1076
A5 186 x 103 156
A6 190 x 104 1597
A7 280 x 104 2353
A8 350 x 104 2941
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
40
Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
5
Figura 2 Ciclo de multiplicaccedilatildeo de DENV A Os viacuterus se ligam aos receptores na superfiacutecie da
ceacutelula e satildeo endocitados B Devido ao baixo pH dentro dos endossomas ocorre a fusatildeo de
membranas viral-celular mediada por proteiacutenas virais resultando na liberaccedilatildeo do RNA viral em um
processo chamado de desnudamento C O genoma viral eacute traduzido em uma uacutenica poliproteiacutena que
eacute processada por proteases do viacuterus e da ceacutelula hospedeira D O RNA eacute replicado por proteiacutenas
natildeo-estruturais do proacuteprio viacuterus E A montagem do viacuterus ocorre na membrana do Reticulo
endoplasmaacutetico no qual a proteiacutena do capsiacutedeo e o RNA viral satildeo envolvidos por glicoproteiacutenas e
pela membrana da organela para formar partiacuteculas virais imaturas F Partiacuteculas virais imaturas
utilizam a via secretora da ceacutelula hospedeira e sob o baixo pH do Complexo de Golgi a proteiacutena
precursora prM eacute clivada em proteiacutena M completando a maturaccedilatildeo do viacuterus GOs viacuterus maduros
satildeo entatildeo liberados das ceacutelulas por exocitose Os nuacutemeros indicados nas caixas coloridas referem-se
ao valor de pH dos respectivos compartimentos Imagem adaptada de PERERA 2009
Adsorccedilatildeo
Siacutentese e processamento
Fusatildeo e
Desnudamento
Replicaccedilatildeo do RNA
Montagem
Maturaccedilatildeo
Liberaccedilatildeo de
viacuterus
maduro
A
B
C
D
E
F
G
6
13 Epidemiologia
Ao longo das uacuteltimas deacutecadas a dengue se tornou a doenccedila viral transmitida por
mosquitos mais prevalente no mundo Estimativas de infecccedilatildeo pela OMS indicam que a
patologia eacute endecircmica em mais de 100 paiacuteses em todos os continentes exceto a Antaacutertida e
aflige principalmente paiacuteses pobres em recursos nas regiotildees tropicais e subtropicais (Perry
2011) Epidemias globais de DENV ocorreram ao longo das uacuteltimas deacutecadas em parte devido
agrave diminuiccedilatildeo dos esforccedilos no controle de mosquitos Satildeo estimados mais de 50 milhotildees de
casos de dengue anualmente (Mukhopadhyay 2005)
A Dengue eacute uma doenccedila viral sistecircmica aguda que se estabeleceu em todo o mundo
em ambos os ciclos de transmissatildeo endecircmicas e epidecircmicas A infecccedilatildeo pelo DENV em seres
humanos eacute frequentemente inaparente mas pode levar a uma grande variedade de
manifestaccedilotildees cliacutenicas de febre leve a siacutendrome do choque da dengue potencialmente fatal A
imunidade vitaliacutecia desenvolvida apoacutes a infecccedilatildeo com um dos quatro tipos de viacuterus eacute
especiacutefica para cada tipo e a progressatildeo para uma doenccedila mais grave eacute frequente mas natildeo
exclusivamente relacionada com infecccedilatildeo secundaacuteria por tipos heteroacutelogos No entanto
enquanto a expansatildeo histoacuterica desta doenccedila eacute bem documentada o elevado fardo de
problemas de sauacutede atribuiacuteveis agrave dengue em grande parte do mundo tropical e sub-tropical
permanecem pouco enumerados (Bhatt 2013)
O Brasil eacute um paiacutes de grande extensatildeo (8512000 km2) situado em uma zona
predominantemente tropical com extensas aacutereas de florestas na regiatildeo amazocircnica bem como
restos de uma floresta tropical na costa leste sudeste e sul entre outros ecossistemas A maior
parte do paiacutes tem um clima tropical e uma grande diversidade de plantas e animais portanto
um local adequado para a ocorrecircncia de patologias causadas por viacuterus transmitidos por
artroacutepodes (Figueiredo 2000) Segundo o boletim epidemioloacutegico do ministeacuterio da sauacutede em
2016 jaacute foram registrados 170103 casos provaacuteveis de dengue no paiacutes ateacute a semana
epidemioloacutegica 5 Nesse periacuteodo a regiatildeo Sudeste registrou o maior nuacutemero de casos
provaacuteveis (96664 casos 568) Em Minas Gerais jaacute foram registradas 19 mortes em
decorrecircncia da Dengue entre 1deg de janeiro e 14 de marccedilo deste ano Outros 91 oacutebitos estatildeo
sob investigaccedilatildeo (BRASIL 2016)
7
Figura 3 Distribuiccedilatildeo geograacutefica da Dengue Aacutereas de risco de transmissatildeo em amarelo
(Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede Adaptado de httpwwwwhointen)
As manifestaccedilotildees da doenccedila foram descritas pela primeira vez apoacutes a Segunda Guerra
Mundial coincidente com o aumento da urbanizaccedilatildeo particularmente na Aacutesia (Weaver 2010)
Atualmente o DENV eacute hiperendecircmico em muitas regiotildees tropicais onde 2 ou mais sorotipos
circulam endemicamente Embora DENV foi provavelmente introduzido periodicamente para
as Ameacutericas atraveacutes de navios desde o seacuteculo 17 o surgimento de DENV no Hemisfeacuterio
Ocidental comeccedilou mais tarde devido a uma campanha de sucesso parcial para erradicar o
vetor A aegypti para controlar a febre amarela Esta campanha teve sucesso na maior parte
das Ameacutericas da deacutecada de 1950 agrave deacutecada de 1970 mas foi interrompida O vetor entatildeo
rapidamente recolonizou quase toda a regiatildeo neotropical e subtropicais e a invasatildeo do DENV
seguiu logo depois Em 1985 A albopictus foi introduzido nos EUA e no Brasil
proporcionando um vetor para a transmissatildeo secundaacuteria de DENV nas Ameacutericas (Hawley
1987)
Os mosquitos vetores principalmente A aegypti tornam-se infectados quando eles se
alimentam do sangue de seres humanos durante o periacuteodo de cinco dias da viremia A
infecccedilatildeo produz um amplo espectro da doenccedila cliacutenica e varia de assintomaacutetica a doenccedila febril
auto-limitante A dengue tambeacutem conhecida como ldquofebre osso quebradordquo devido agraves fortes
dores nas articulaccedilotildees e inclui sintomas de febre alta dores musculares articulares e erupccedilatildeo
cutacircnea Uma pequena porcentagem de indiviacuteduos pode apresentar a siacutendrome do choque da
8
dengue (dengue hemorraacutegica) com risco de vida grave O tratamento eacute amplamente favoraacutevel
usando de reidrataccedilatildeo oral ou intravenosa acompanhamento e atenccedilatildeo meacutedica adequada No
entanto uma das principais consequecircncias da doenccedila eacute a sua capacidade de sobrecarregar
instalaccedilotildees meacutedicas durante um surto e em paiacuteses onde os recursos de sauacutede jaacute estatildeo no
limite isso pode ter efeitos catastroacuteficos Prevenccedilatildeo e tratamento portanto se fazem
altamente necessaacuterios (Perry 2011)
A prevalecircncia global de DENV cresceu drasticamente nas uacuteltimas deacutecadas e ateacute o
momento natildeo haacute nenhum medicamento especiacutefico para combater a infecccedilatildeo as medidas de
prevenccedilatildeo mais eficazes satildeo voltadas para o controle do vetor (Silva 2011) Diante disso a
Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) elegeu o desenvolvimento de vacinas contra o viacuterus da
dengue como prioridade mundial (Kinney 2001) Por conseguinte a busca de substacircncias
naturais ou sinteacuteticas com atividade antiviral especiacutefica sem toxicidade para as ceacutelulas
normais em seres humanos eacute uma estrateacutegia desejada para evitar que a dengue se agrave e
ajudar a controlar a difusatildeo da doenccedila As vaacuterias fases do ciclo viral representam alvos
terapecircuticos individuais que podem ser exploradas (Costa 2013) Nesse sentido vaacuterios
grupos de pesquisa e organizaccedilotildees estatildeo trabalhando com diversas abordagens para o
desenvolvimento de compostos antivirais com atividade protetora contra dengue Dentre elas
uma vasta gama de produtos naturais incluindo plantas numa tentativa de isolar e
caracterizar novos compostos que podem inibir a replicaccedilatildeo do viacuterus ou tratar a infecccedilatildeo
viral Por essa razatildeo extratos e componentes da planta satildeo cada vez mais importantes como
fontes potenciais para agentes antivirais (Silva 2011)
14 Naftoquinonas
As quinonas satildeo compostos aromaacuteticos amplamente distribuiacutedos na natureza e podem
ser encontrados em vaacuterias famiacutelias de plantas bem como isolado de fungos algas e
bacteacuterias Elas satildeo classificadas em benzoquinonas antraquinonas e naftoquinonas de acordo
com as suas estruturas quiacutemicas Naftoquinonas satildeo compostos orgacircnicos altamente reativos
utilizados como corantes naturais ou sinteacuteticos cujas cores variam de amarelo para vermelho
Apresentam cadeia carbocircnica similar ao naftaleno e satildeo caracterizadas por seus dois grupos
carbonila na posiccedilatildeo 1 e 4 por isso satildeo nomeadas de 14-naftoquinonas Os grupos carbonila
tambeacutem podem estar presente na posiccedilatildeo 12 com menor incidecircncia (Loacutepez 2014)
9
Figura 4 Estrutura quiacutemica da 12-naftoquinona (1) e 14-naftoquinona (2)
Entre as quinonas estatildeo compostos biologicamente importantes tais como o grupo da
vitamina K e a coenzima Q (ubiquinona) Estes compostos tecircm um papel importante no
metabolismo celular especialmente como carreadores de eleacutetrons Aleacutem de quinonas que
possuam uma funccedilatildeo bioloacutegica outros compostos desta classe tecircm sido encontrados
mostrando atividade antibioacutetica Alguns deles estatildeo presentes na natureza mas a maior parte
satildeo obtidos sinteticamente entre eles 2-hidroxi-3-alquil-14-naftoquinonas que possuem
evidecircncias de serem ativos in vitro contra os parasitas da malaacuteria e como coccidiostaacuteticos
(Ambrogi 1970)
A atividade bioloacutegica de quinonas estaacute muitas vezes relacionada com o seu
comportamento eletroquiacutemico A capacidade de aceitar um ou dois eleacutetrons para formar o
acircnion radical correspondente ou dianion pode ser o motivo da induccedilatildeo da formaccedilatildeo de
espeacutecies reativas de oxigecircnio responsaacuteveis pelo estresse oxidativo nas ceacutelulas A capacidade
de aceitar eleacutetrons de naftoquinonas pode ser alterada por mudanccedilas de posiccedilatildeo do grupo
carbonila (12- 14-naftoquinonas) ou diferentes substituintes ou funccedilotildees associadas agrave porccedilatildeo
de naftoquinona (Francisco 2010)
As naftoquinonas satildeo largamente encontradas em plantas micro-organismos e alguns
animais Estes compostos tecircm sido amplamente utilizados em diversas culturas como corantes
para cosmeacuteticos tecidos alimentos (Brandelli 2004) e para fins medicinais incluindo
antitumoral (Oliveira 1990 Ferreira 1996) anti-inflamatoacuterios antimalaacuterico antiviral
(Fonseca 2003 Hussain 2007) atibacterianos e antifuacutengicos (Nagata 1998) Estas atividades
bioloacutegicas tecircm justificado o grande nuacutemero de trabalhos (aproximadamente 42 ateacute abril 2016
ndash Pubmed) encontrados na literatura que visa a siacutentese e avaliaccedilatildeo de qualquer das quinonas
naturais ou seus anaacutelogos como agentes farmacoloacutegicos potenciais (Rahmoun 2013)
10
O Lapachol foi descoberto e estudado desde o seacuteculo XIX Foi isolado primeiramente
do lenho da aacutervore argentina ldquolapachordquo Tabebuia avellanedae (Bignoniaceae) conhecida
como Ipecirc roxo Os estudos quiacutemicos foram desenvolvidos inicialmente em 1892 (Fonseca
2003) O lapachol foi descrito pela primeira vez por Paterno em 1821 tendo sua estrutura
quiacutemica estabelecida em 1896 por Hooker que o identificou como uma naftoquinona Esta
naftoquinona possui accedilatildeo antiinflamatoacuteria analgeacutesica antibioacutetica e anti-neoplaacutesica
reconhecida (Arauacutejo 2002)
A β-lapachona (34-di-hidro-22-dimetil-2H-naptho [12-b] pirano-56-diona) eacute uma
quinona obtida de fontes naturais derivada da aacutervore Lapacho (Tabebuia avellanedae) nativa
da Ameacuterica do Sul e Central A siacutentese e quiacutemica da β-lapachona e compostos relacionados
foi inicialmente investigado no final do seacuteculo XIX e iniacutecio do seacuteculo XX pelo quiacutemico
Samuel Hooker Apesar de alguns estudos cliacutenicos sobre a bioatividade de naftoquinonas
terem sido relatados no iniacutecio de 1940 foi o relatoacuterio do potencial da β-lapachona como um
agente anti-tripanossoma em 1977 que revitalizou o estudo e caracterizaccedilatildeo deste composto
natural A β-lapachona tambeacutem apresenta vaacuterias accedilotildees farmacoloacutegicas incluindo accedilatildeo
formaccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (Hussain 2007)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do Lapachol (1) da α- Lapachona (2) e da β-
Lapachona (Fonseca et al 2003 Ferreira et al 2010)
11
Figura 6 Tabebuia avellanedae (Hussain 2007)
A β-lapachona eacute uma substacircncia natural facilmente obtida a partir do lapachol Esta
naftoquinona eacute o grande destaque desta classe de substacircncias porque se encontra em testes
cliacutenicos de fase II para o tratamento do cacircncer de pacircncreas (Ferreira 2010) O mecanismo de
accedilatildeo da β-lapachona diferencia-se de outros antineoplaacutesicos por atuar na topoisomerase I
promovendo a recuperaccedilatildeo da capacidade de apoptose celular Alguns estudos reportam sua
accedilatildeo sineacutergica de potenciaccedilatildeo com o Taxolreg
promovendo a inibiccedilatildeo em diferentes pontos de
replicaccedilatildeo celular aleacutem de sua combinaccedilatildeo com outros tratamentos como a aplicaccedilatildeo de
radiaccedilatildeo ionizante (Cunha 2005)
Vaacuterios estudos jaacute foram publicados demonstrando a atividade antiviral de
naftoquinonas naturais e sinteacuteticas A β-lapachona inibe seletivamente a replicaccedilatildeo do viacuterus
HIV-1 atuando na inibiccedilatildeo da enzima LTR117 Da mesma forma este composto eacute um
potente inibidor da enzima transcriptase reversa dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e
leucemia murina de Rauscher (RLV) inibindo tambeacutem a DNA polimerase A accedilatildeo inibitoacuteria
sobre estas enzimas revelou-se especiacutefica se comparada com a de outros inibidores
conhecidos (Silva 2003)
O Lapachol jaacute demonstrou atividade contra certas cepas virais incluindo Herpes virus
tipos I e II Outras naftoquinonas jaacute mostraram eficaacutecia contra cepas de Influenza virus
Poliomielite virus e estomatite vesicular Supotildee-se que o mecanismo de accedilatildeo destas quinonas
seja atraveacutes da inibiccedilatildeo da transcriptase reversa de retroviacuterus e da RNA polimerase Eacute relatado
12
que lapachol diminui a replicaccedilatildeo do viacuterus em seres humanos mas ainda natildeo existem
resultados de testes cliacutenicos disponiacuteveis (Hussain 2007)
Na avaliaccedilatildeo da atividade antiviral do Lapachol in vitro verificou-se que esta
substacircncia eacute ativa contra viacuterus RNA atuando tanto sobre viacuterus envelopados quanto sobre
partiacuteculas sem esta estrutura em concentraccedilotildees de 5 a 10 microgmL e ainda apresentou uma
pequena atividade sobre HSV (Herpes simplex I) e Ad5 (Adeno tipo 5) mas nenhuma
atividade sobre CoxB4 (Coxsackie B4) Em trabalho posterior demonstrou-se que nem o
Lapachol nem diversos dos seus derivados apresentaram atividade antiviral in vitro sobre
Poliovirus tipo 1 Ecovirus 19 e Coxsackie B tipo 4 Apenas os derivados 12-naftoquinonicos
e um intermediaacuterio da siacutentese Hoocker foram ativos contra o Echovirus 19 (Fonseca 2003)
Costa et al (2013) relataram que piranonaftoquinonas isocircmeras do lapachol possuem
atividade de inibiccedilatildeo da replicaccedilatildeo de DENV-2 atuando sobre a atividade da ATPase de NS3
(proteiacutena natildeo estrutural de DENV)
A utilizaccedilatildeo de testes in vitro por meio de ensaios de viabilidade celular constitui o
primeiro passo para a avaliaccedilatildeo da compatibilidade bioloacutegica de uma substacircncia e pode
fornecer elementos importantes para a anaacutelise da biocompatibilidade dos diferentes materiais
Para ser considerado natildeo citotoacutexico no teste de citotoxicidade in vitro um produto natildeo deve
ocasionar a morte das ceacutelulas nem afetar suas funccedilotildees celulares A prova do MTT eacute um dos
indicadores colorimeacutetricos de viabilidade celular mais utilizados sendo capaz de avaliar a
funccedilatildeo celular mitocondrial de acordo com a reduccedilatildeo enzimaacutetica do sal de tetrazoacutelio pelas
desidrogenases mitocondriais nas ceacutelulas viaacutevies (Arauacutejo et al 2008) Supotildee-se que o
mecanismo responsaacutevel pela citotoxicidade apresentada pelas quinonas esteja relacionado
com o estresse oxidativo causado por esses compostos poreacutem a capacidade de alquilaccedilatildeo de
nucleoacutefilos celulares tambeacutem representa correlaccedilatildeo com tais efeitos bioloacutegicos (Goulart
2004)
13
II JUSTIFICATIVA
14
2 JUSTIFICATIVA
Aleacutem do controle do mosquito transmissor e do desenvolvimento de vacinas que tem
sido exaustivamente estudado nos uacuteltimos anos uma alternativa para o combate agrave dengue
seria o desenvolvimento de faacutermacos para reduzir a viremia ou mesmo para controlar a
resposta imune do hospedeiro agrave infecccedilatildeo que tem sido apontada como principal fator de risco
nos casos mais graves Em funccedilatildeo disso o nuacutemero de pesquisas visando o desenvolvimento
de drogas com accedilatildeo antiviral ou com accedilatildeo imunomodulatoacuteria tem aumentado
significativamente As naftoquinonas vecircm ganhando bastante importacircncia na pesquisa de
novas drogas antivirais devido agrave algumas atividades apresentadas A szlig-lapachona-orto-
naftoquinona por exemplo se mostrou um potente inibidor da enzima transcriptase reversa
dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e leucemia murina de Rauscher (RLV)
Diante da inexistecircncia de drogas com accedilatildeo anti DENV e o elevado nuacutemero e casos da
patogenia nos uacuteltimos anos a organizaccedilatildeo mundial da sauacutede classificou a Dengue como uma
epidemia de proporccedilotildees globais e um problema de sauacutede puacuteblica Como as naftoquinonas jaacute
demonstraram na literatura possuir um potencial efeito terapecircutico contra alguns viacuterus eacute
possiacutevel que estes compostos possam apresentar atividade antiviral contra DENV Portanto
este trabalho visou atraveacutes de ensaios de MTT e titulaccedilotildees virais em placa avaliar a potencial
atividade antiviral de oito compostos derivados de naftoquinonas naturais e sinteacuteticas
15
III OBJETIVOS
16
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar oito compostos (2 naturais e 6 sinteacuteticos) derivados de naftoquinonas como potenciais
agentes antivirais em ceacutelulas BHK-21 frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1 e 2
32 Objetivos especiacuteficos
1 Calcular o iacutendice de citotoxicidade e a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) dos compostos
atraveacutes de ensaio de reduccedilatildeo de MTT
2 Avaliar os efeitos dos compostos sobre o crescimento a viabilidade e o volume celular
pela teacutecnica de exclusatildeo do azul de tripan
3 Determinar a multiplicidade de infecccedilatildeo de DENV 1 e 2 a ser utilizada nos ensaios
antivirais
4 Avaliar a atividade antiviral dos compostos frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1
e 2 atraveacutes do ensaio de MTT
5 Verificar um possiacutevel efeito direto dos compostos agraves partiacuteculas virais de Dengue virus
6 Quantificar a produccedilatildeo de partiacuteculas virais infecciosas no sobrenadante de ceacutelulas
infectadas atraveacutes de titulaccedilatildeo viral pela contagem de unidades formadoras de placas
17
IV MATERIAL E MEacuteTODOS
18
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Linhagens celulares
411 Ceacutelulas C636
As ceacutelulas C636 satildeo ceacutelulas de linhagem contiacutenua de larvas de mosquito Aedes
albopictus Estas ceacutelulas foram utilizadas na produccedilatildeo de estoque viral de DENV sorotipos 1
e 2 para isso foram mantidas em meio de cultura Leibovitz-15 (L-15) (Cultilab)
suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (Cultilab) antibioacuteticos (Penicilina 100 UmL
Streptomicina 100 microgmL) e antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL) a 28degC
412 Ceacutelulas BHK-21
As ceacutelulas BHK-21 satildeo fibroblastos de linhagem contiacutenua derivados de rim de hamster
neonato Estas ceacutelulas foram utilizadas para os experimentos in vitro e para as titulaccedilotildees de
DENV 1 e 2 para isso foram mantidas em meio miacutenimo essencial modificado por Dulbecco
ndash DMEM (Cultilab) suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (SFB) com antibioacuteticos
(Penicilina 100 UmL Streptomicina 100 microgmL) e com antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL)
sendo mantidas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5
42 Viacuterus
421 DENV 1 e DENV 2
O Sorotipo 1 do Dengue virus (DENV-1) estirpe Mochizuki foi replicado em ceacutelulas
C636 para gerar estoques de trabalho durante 2 e 5 dias a 28degC O sobrenadante da cultura de
ceacutelulas infectadas foi recolhido e clarificado por centrifugaccedilatildeo a 4000 G durante 10 minutos agrave
4degC e entatildeo foi aliquotado e armazenado a -70 deg C como reserva de viacuterus ateacute agrave sua utilizaccedilatildeo
A replicaccedilatildeo geraccedilatildeo de estoque e titulaccedilatildeo do Sorotipo 2 do Dengue virus (DENV-2)
estirpe Nova Guineacute C ocorreu nos mesmos moldes do DENV-1
19
422 Titulaccedilatildeo viral
Os estoques virais foram diluiacutedos (10-1
a 10-7
) e inoculados em monocamadas de
ceacutelulas BHK-21 implantadas em placas de 6 poccedilos com confluecircncia de aproximadamente
60 (3x105 ceacutelulas por poccedilo) sendo um poccedilo natildeo infectado mantido para controle celular
Apoacutes uma hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus foram adicionados 3 mL de meio DMEM (Cultilab)
suplementado com 15 de SFB e contendo 15 de Carboximetilcelulose (CMC Synth) As
placas foram entatildeo incubadas a 37degC (CO2 a 5) por 96 horas As ceacutelulas foram entatildeo
fixadas com 2 mL de soluccedilatildeo de formol a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo
1 (pv) de cristal violeta em PBS para contagem das placas de lise O tiacutetulo viral foi
expresso atraveacutes do nuacutemero de unidades formadoras de placa por mL (UFPmL) segundo a
formula abaixo representada
Tiacutetulo viral (UFPmL) = N x FC x 10
N = nuacutemero de placas de lise contadas
FC = Fator de correccedilatildeo
= Inverso da diluiccedilatildeo na qual foram contadas as placas de lise
43 Compostos de naftoquinonas
Os compostos utilizados neste estudo foram fornecidos pelo Dr Geraldo Ceacutelio
Brandatildeo do laboratoacuterio de pesquisa da Escola de Farmaacutecia da Universidade Federal de Ouro
Preto
20
Tabela 1 Relaccedilatildeo de nome estrutura e coacutedigo dos compostos utilizados Na tabela estatildeo
presentes a relaccedilatildeo dos nomes dos compostos utilizados neste trabalho bem como sua
estrutura Os coacutedigos representantes de cada composto seratildeo utilizados no decorrer da escrita
Nome do composto Estrutura Coacutedigo
Lapachol
A1
β-lapachona
A2
2-Hidroxi-3-(ββ-dimetilvinil)-14-naftoquinona
A3
2-Cloro-14-naftoquinona
A4
Lapachol derivado 1
A5
Lapachol derivado 2 A6
Lapachol derivado 3 A7
Lapachol derivado 4 A8
44 Ensaio de citotoxicidade
Para avaliar a citotoxicidade dos compostos ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas foram incubadas com diferentes concentraccedilotildees dos compostos em triplicata num
volume de 200 microL de meio de cultura por poccedilo na presenccedila de 1 de SFB Os controles natildeo
tratados apresentaram adiccedilatildeo de 200 microL de meio de cultura As ceacutelulas foram entatildeo incubadas
durante 72 horas O meio foi removido e 28 microL de soluccedilatildeo de 5 mg mL MTT (brometo de 3-
21
[45-dimetil-tiazol-2-il]-25 difeniltertrazoacutelio) foi adicionado a cada poccedilo As placas foram re-
incubadas durante 1 hora e 30 minutos e entatildeo 122 microL de DMSO foi adicionado a cada poccedilo e
placas foram agitadas suavemente durante 15 minutos para dissolver os cristais de formazan
A absorbacircncia foi lida em um equipamento leitor de placas Victor X3 (PerkinElmer) a 490
nm A concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC 50) foi definida como a concentraccedilatildeo da amostra que
reduziu a viabilidade celular de 50 em comparaccedilatildeo com controles natildeo tratados Os dados
foram analisados utilizando o programa Prisma
45 Avaliaccedilatildeo da viabilidade e crescimento celular por exclusatildeo de azul de tripan
Ceacutelulas BHK-21 foram cultivadas em placas de 24 poccedilos (7x104 ceacutelulaspoccedilo) e apoacutes
24 horas foram tratadas com as concentraccedilotildees de uso de cada composto e incubadas por 72
horas na presenccedila de 1 de SFB A seguir as ceacutelulas foram tripsinizadas e incubadas com
azul de tripan e entatildeo foi utilizado um contador automatizado de ceacutelulas (Countess II FL
Automated Cell Counter ndash Thermo Fisher Scientific) para contagem das ceacutelulas e avaliaccedilatildeo da
porcentagem de viabilidade e diacircmetro celular do controle nos tempos de 0 24 e 96 horas e
avaliaccedilatildeo dos mesmos paracircmetros para os compostos no tempo de 96 horas (72 horas poacutes
tratamento)
Outra curva de multiplicaccedilatildeo celular foi feita para os compostos A1 A3 A4 e A5 onde as
ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos no momento da confecccedilatildeo da placa e
foram avaliados os mesmos paracircmetros nos tempos de 0 12 24 48 e 72 horas O
equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
46 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
Para determinar a menor Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) responsaacutevel pela letalidade
celular total 2x104 de ceacutelulas BHK-21 foram semeadas em placa de 96 poccedilos Apoacutes a
incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o
meio de cultura foi removido e as ceacutelulas foram expostas a diferentes diluiccedilotildees dos dois
sorotipos de DENV (100 microL de cada diluiccedilatildeo + 100 microL de meio DEMEM 1 SFB) As
diluiccedilotildees seriadas foram realizadas da suspensatildeo viral na razatildeo de 5 para o primeiro poccedilo e de
2 para os demais poccedilos Apoacutes 72 horas as ceacutelulas foram entatildeo fixadas com 200 microL de soluccedilatildeo
22
formalina a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo 1 (pv) de cristal violeta em
PBS para avaliaccedilatildeo da maior diluiccedilatildeo responsaacutevel pela letalidade de 100 das ceacutelulas
47 Ensaio Dose-resposta
Para cada composto foram realizados ensaios de dose-resposta para definiccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de cada composto capaz de promover a reduccedilatildeo na produccedilatildeo viral A atividade
antiviral foi avaliada tambeacutem pelo meacutetodo de MTT Ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas expostas a diferentes concentraccedilotildees dos extratos determinadas a partir das maiores
concentraccedilotildees em que natildeo foram observados efeitos citotoacutexicos As ceacutelulas foram tratadas
com as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de cada composto e em seguida infectadas com DENV
1 (MOI= 5) ou 2 (MOI= 2) Mantendo uma coluna para controle com DMSO uma coluna
para controle de viacuterus uma coluna para controle de citotoxicidade dos compostos e por fim
uma coluna para controle celular As ceacutelulas foram entatildeo incubadas durante 72 horas Apoacutes
este tempo procedeu-se a leitura pelo ensaio de MTT como descrito anteriormente Os dados
foram analisados levando-se em consideraccedilatildeo a leitura das absorbacircncias dos poccedilos dos
controles de viacuterus e do controle celular
Para realizacao destes experimentos os seguintes controles foram adotados
Controle de ceacutelulas poccedilos contendo somente ceacutelulas acrescidas do meio de cultura DMEM
1 SFB Utilizado para avaliar o comportamento das ceacutelulas sem que as mesmas tivessem
contato com qualquer interferente durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo Com isso os poccedilos
reservados para esse controle serviram de padratildeo para comparaccedilatildeo com aqueles em que fosse
observada atividade citotoacutexica ou citopaacutetica
Controle de viacuterus poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM 1 SFB
sem nenhum tratamento e de suspensatildeo de viacuterus Utilizando como referecircncia para anaacutelise da
atividade citopaacutetica provocada pelo viacuterus testado durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo das placas
23
Controle de viacuterus com DMSO Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura
DMEM 1 SFB e DMSO Foi utilizado para avaliar se havia influecircncia prejudicial do
solvente utilizado para diluiccedilatildeo das amostras no meio de cultivo das ceacutelulas e se o mesmo
poderia apresentar alguma potencial atividade antiviral aparente
Controle de citotoxicidade Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM
1 SFB e as quatro principais concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos Foi utilizado
para avaliar se haveria alguma possiacutevel atividade citotoacutexica das concentraccedilotildees dos compostos
em relaccedilatildeo agraves ceacutelulas
48 Ensaio Virucida
Para a realizaccedilatildeo deste ensaio aliacutequotas de 950 microL (diluiccedilatildeo de 20 vezes) do DENV 1 (tiacutetulo
6 x 107 UFPmL) foram incubadas com 50 microL de uma soluccedilatildeo de meio DMEM preparada
com 20x a concentraccedilatildeo natildeo citotoacutexica de cada composto A1 a A8 em banho-maria 37deg C
por 1 hora Apoacutes a incubaccedilatildeo as aliacutequotas foram imediatamente tituladas em ceacutelulas BHK-21
em placas de 6 poccedilos utilizando-se 3 diluiccedilotildees para cada incubaccedilatildeo (20x 20 x 10-1
e 20 x 10-
2) Foram titulados tambeacutem uma aliacutequota incubada apenas com meio DMEM sem nenhum
tratamento e outra aliacutequota incubada com DMSO (Dimetilsulfoacutexido) Estas foram tituladas
utilizando um controle e mais cinco diluiccedilotildees (20x 20 x 10-1
20 x 10-2
20 x 10-3
e 20 x 10-4
)
49 Ensaio antiviral
Neste ensaio ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em placas de 24 poccedilos no dia
seguinte foram tratadas durante 4 horas com as concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas de cada
composto em duplicata Apoacutes o preacute-tratamento as monocamadas foram infectadas com
DENV-1 a uma MOI=5 na presenccedila das concentraccedilotildees de uso respectivas de cada composto
Apoacutes 1 hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus as monocamadas foram lavadas duas vezes com PBS e
foi adicionado 500 microL por poccedilo de meio preparado com as mesmas concentraccedilotildees dos
diferentes compostos e mantidos durante 48 horas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5 Em
quatro poccedilos as ceacutelulas foram infectadas e natildeo tratadas e em outros quatro poccedilos as ceacutelulas
natildeo foram tratadas e nem infectadas (controle de ceacutelulas) destes uacuteltimos dois foram
tripsinizados e contados no momento da infecccedilatildeo e os outros dois apoacutes o teacutermino do ensaio
24
para avaliar o crescimento celular Decorridas as 48 horas o sobrenadante foi coletado e
centrifugado por 10 minutos a 4000 xG para separaccedilatildeo dos debris celulares e prontamente
titulado em placa de 6 poccedilos
410 Anaacutelise estatiacutestica
Os valores de CC50 foram obtidos a partir de anaacutelise de regressatildeo linear das curvas de
concentraccedilatildeocitotoxicidade A anaacutelise estatiacutestica dos dados foi realizada pelo programa
GraphPad Prism software Uma anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi utilizada para determinar
as diferenccedilas estatiacutesticas seguida do poacutes teste de Tukey A significacircncia estatiacutestica foi fixada
em p lt005
25
V RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
26
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Ensaio de citotoxicidade celular
Para avaliar a viabilidade da linhagem celular BHK-21 frente ao tratamento com oito
diferentes concentraccedilotildees dos compostos (A1 a A8) realizou-se um ensaio de MTT (brometo
de 3-[45-dimetil-tiazol-2-il]-25-difeniltetrazoacutelio) Este ensaio tem o objetivo de quantificar
espectrofotometricamente o crescimento celular a viabilidade e proliferaccedilatildeo podendo ser
utilizado como um indicador direto de citotoxicidade Trata-se de um ensaio colorimeacutetrico
para medir a atividade da redutase mitocondrial em ceacutelulas vivas Ele se baseia na reduccedilatildeo do
sal amarelo tetrazoacutelio (permeaacutevel agrave membrana celular) para cristais de formazan azuis
puacuterpura por ceacutelulas metabolicamente ativas a quantidade de formazan gerada medida por
espectrofotometria eacute proporcional ao nuacutemero de ceacutelulas viaacuteveis
A CC50 foi calculada plotando-se uma curva de porcentagem de viabilidade celular por
concentraccedilatildeo melhor representada na figura 7 pelo composto A7 e os resultados de CC50
para todos os compostos estatildeo representados na tabela 2 Foram feitos ensaios de
citotoxicidade com oito concentraccedilotildees diferentes sendo escolhida a maior concentraccedilatildeo que
natildeo apresentou citotoxicidade
Viabilidade Celular = [ ( A ndash B ) A ] x 100
Onde
A = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas natildeo tratadas
B = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas tratadas com
as respectivas concentraccedilotildees de cada composto
27
28
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (A curva dose resposta do composto A7 eacute a que
melhor representa a curva dose resposta esperada) Avaliou-se a viabilidade da linhagem
celular BHK-21 frente agrave diferentes concentraccedilotildees dos compostos realizando o ensaio de MTT
e determinando assim as concentraccedilotildees a serem utilizadas nos proacuteximos ensaios bem como
calculando a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) agrave partir da curva
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo
da concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50)
Composto Concentraccedilatildeo utilizada
[ ] microgmL
Concentraccedilatildeo citotoacutexica 50
(CC50) [ ] microgmL plusmn Desvio
Padratildeo
A1 ([ ]=1 mgmL) 00200 10010 plusmn 0014
A2 ([ ]=1 mgmL) 00025 09561 plusmn 0023
A3 ([ ]=1 mgmL) 00025 09988 plusmn 0017
A4 ([ ]=5 mgmL) 00125 10150 plusmn 0036
A5 ([ ]=10 mgmL) 00250 10590 plusmn 0047
A6 ([ ]=5 mgmL) 00250 08183 plusmn 0030
A7 ([ ]=5 mgmL) 00125 10280 plusmn 0052
A8 ([ ]=5 mgmL) 00125 09758 plusmn 0036
52 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan
Para corroborar o ensaio anterior de citotoxicidade utilizou -se o teste de viabilidade
celular pela teacutecnica da exclusatildeo do azul de tripan com a finalidade de determinar a
viabilidade das ceacutelulas Os procedimentos adotados no ensaio seguiram o manual do
equipamento contador automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL Automated Cell Counter) entatildeo
foi acrescentado agrave 10 microL da suspensatildeo celular 10 microL de azul de tripan (04) Apoacutes
homogeneizaccedilatildeo 10 microL da suspensatildeo foi colocada no local indicado da lacircmina proacutepria para
leitura e foi realizada a contagem sendo consideradas mortas (inviaacuteveis) as ceacutelulas que
incorporavam o corante e viaacuteveis as que excluiacuteam o azul de tripan
29
O equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
(A)
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan A avaliaccedilatildeo da
viabilidade celular foi realizada atraveacutes de um contador automaacutetico de ceacutelulas Este
equipamento possibilita explorar ferramentas de fotografia e avaliar alguns paracircmetros
importantes (A) fotografia das ceacutelulas (B) Zoom na fotografia das ceacutelulas com marcaccedilotildees
(em verde para ceacutelulas vivas e vermelho para mortas) e (D) contagem das ceacutelulas totais
ceacutelulas vivas e mortas graacutefico e meacutedia dos diacircmetros celulares das ceacutelulas vivas e mortas
(B)
(C)
30
O crescimento celular de ceacutelulas natildeo tratadas foi avaliado nos tempos de 0h (momento
da confecccedilatildeo da placa) 24h (momento de tratamento com os compostos) e 96 horas
(Momento em que todas as ceacutelulas foram tripsinizadas e contadas) para avaliar o perfil do
crescimento celular em ceacutelulas natildeo tratadas Foi observado um crescimento celular no periacuteodo
de 24 horas onde as ceacutelulas estavam incubadas com meio acrescido de 10 SFB Em 24
horas o meio foi trocado por 1 SFB e acrescido das substacircncias testes nas menores diluiccedilotildees
natildeo citotoacutexicas determinadas pelo ensaio do MTT Em 96 horas pode ser observado um
decaimento no nuacutemero de ceacutelulas vivas provavelmente devido ao crescimento celular (morte
por confluecircncia)
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas)
(A) (B)
31
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas (A)
Contagem de ceacutelulas vivas (B) Percentual de ceacutelulas viaacuteveis (Viabilidade celular ) e (C)
Meacutedia do diacircmetro apresentado pelas ceacutelulas vivas
Em 96 horas as ceacutelulas natildeo tratadas bem como as ceacutelulas tratadas por 72 horas com as
concentraccedilotildees de uso dos compostos foram tripsinizadas e avaliadas quanto ao nuacutemero de
ceacutelulas vivas viabilidade e diacircmetro celular apresentados na figura 10
Segundo se observa natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo aparente que possa demonstrar que
as concentraccedilotildees de uso dos compostos tenham causado alguma atividade citotoacutexica
corroborando assim os ensaios de citotoxicidade anteriores
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
A infectividade de um viacuterus depende de vaacuterios fatores entre eles da proporccedilatildeo de
partiacuteculas virais completas ou infecciosas da suscetibilidade da ceacutelula hospedeira e da
chance desta partiacutecula encontrar o receptor e penetrar na ceacutelula Quando ceacutelulas suscetiacuteveis
satildeo misturadas com uma suspensatildeo de viacuterus estas podem receber uma duas trecircs ou dez
partiacuteculas virais ou nenhuma Isto depende da proporccedilatildeo entre a quantidade de viacuterus
infecciosos presente no inoculo e a quantidade de ceacutelulas utilizada Esta relaccedilatildeo eacute denominada
de multiplicidade de infecccedilatildeo ou MOI Uma MOI=1 indica que a infecccedilatildeo foi feita em
principio com 1 viacuterus ou 1 dose infectante por ceacutelula
A determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo dos Dengue virus 1 e 2 a serem
utilizadas nos proacuteximos ensaios foi feita a partir da infecccedilatildeo de ceacutelulas BHK-21 por diferentes
(C)
32
concentraccedilotildees de viacuterus e revelaccedilatildeo com cristal violeta Escolheu-se a maior diluiccedilatildeo viral que
possibilitou a letalidade total das ceacutelulas (faixa onde todas as ceacutelulas estatildeo mortas utilizando
menor concentraccedilatildeo de viacuterus) As faixas escolhidas foram entatildeo calculadas levando-se em
consideraccedilatildeo o nuacutemero de ceacutelulas presentes no poccedilo e o nuacutemero de partiacuteculas virais que foram
adicionadas (Faixa3 para DENV2 e 2 para DENV1) Figura 11 Foi estipulado portanto a
Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 2 para DENV 2 e 5 para DENV 1
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI A partir da infecccedilatildeo da linhagem celular BHK-21 em
placa de 96 poccedilos com diferentes diluiccedilotildees de DENV foi determinado que a Multiplicidade
de infecccedilatildeo para o Dengue viacuterus sorotipos 1 e 2 seria de 5 e 2 respectivamente (colunas 2 -
DENV1 e 3 - DENV2)
54 Ensaio dose resposta
Apoacutes a determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas ideais realizou-se um
ensaio dose resposta tratando as ceacutelulas com oito concentraccedilotildees agrave partir das concentraccedilotildees natildeo
citotoacutexicas escolhidas para cada composto e em seguida infectando com DENV sorotipos 1 e
2 nas MOIs estipuladas anteriormente (5 e 2 respectivamente) A porcentagem do efeito
protetor conferida agraves ceacutelulas para cada concentraccedilatildeo de amostra testada foi calculada da
seguinte forma
33
EP = [ (A ndash B) (C ndash B) ] x 100
Onde
A Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas tratadas e infectadas
B Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e infectadas
C Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e natildeo infectadas
Este ensaio tem por objetivo identificar a resposta celular agrave infecccedilatildeo frente ao
tratamento com os compostos em diferentes concentraccedilotildees Assim como o ensaio de
toxicidade este ensaio feito utilizando a teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT permite o teste de vaacuterias
concentraccedilotildees diferentes em um menor tempo e com baixo gasto de material
34
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV1
(MOI=5)
35
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV2
(MOI=2)
36
Takegami et al (1998) demonstraram atividade de furanonaftoquinonas contra o viacuterus
da Encefalite Japonesa (Flavivirus) utilizando a concentraccedilatildeo de 3microgmL poreacutem para os
compostos apresentados avaliados pela teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT nenhuma das
concentraccedilotildees apresentadas produziu efeito antiviral significativo em relaccedilatildeo ao controle
celular como observado nas figuras 12 e 13
Apesar da teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT ser interessante como triagem de atividade
antiviral permitindo o teste de vaacuterias concentraccedilotildees dos compostos em menor tempo e
utilizando uma quantidade razoaacutevel de materiais optou-se por utilizar as maiores
concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas encontradas avaliando sua atividade antiviral por outras
teacutecnicas Como natildeo foi avaliada atividade antiviral preacutevia para nenhum dos compostos frente
agrave infecccedilatildeo por DENV1 e 2 foi selecionado o Dengue virus 1 para dar prosseguimento aos
ensaios
55 Ensaio Virucida
O ensaio virucida foi realizado para avaliar um potencial efeito dos compostos
diretamente sobre a partiacutecula viral Este ensaio eacute importante pois possibilita elucidar se o
composto pode produzir algum efeito sobre a partiacutecula viral impedindo que esta possa infectar
as ceacutelulas
Figura 14 Ensaio virucida Neste ensaio as aliacutequotas de DENV1 foram incubadas com as
concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos e titulados (NT) Controle natildeo tratado
37
Tabela 3 Ensaio virucida Caacutelculo do tiacutetulo viral (UFPmL) e porcentagem representante de
cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 254 x 105 100
DMSO 263 x 105 10335
A1 199 x 105 7835
A2 205 x 105 8071
A3 237 x 105 9311
A4 775 x 104 3049
A5 153 x 105 6024
A6 219 x 105 8602
A7 243 x 105 9547
A8 254 x 105 100
Lagrota et al (1988) demonstraram atividade de 2-HO-3-N-benzil-N(N-benzil-2-
etilamina) -14-naftoquinona sobre a partiacutecula viral de enterovirus De forma contraacuteria apesar
de se verificar a reduccedilatildeo de quase uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais
para o composto A4 natildeo considerou-se esta uma alteraccedilatildeo significativa pois devido agrave
magnitude do nuacutemero de UFPs se trata de uma alteraccedilatildeo muito pequena Portanto os
compostos avaliados neste trabalho natildeo produziram atividade virucida aparente frente ao
tratamento com as concentraccedilotildees de uso
56 Ensaio Antiviral
O sobrenadante de ceacutelulas tratadas previamente e infectadas por DENV1 coletado 48
horas poacutes infecccedilatildeo foi avaliado quanto agrave produccedilatildeo viral de partiacuteculas infecciosas pela
contagem de placas de lise e caacutelculo de Unidades Formadoras de Placa (Titulaccedilatildeo viral em
placa ndash UFPmL)
38
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral Sobrenadante de ceacutelulas tratadas e infectadas por DENV1
coletado apoacutes 48 horas e titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado
Tabela 4 Ensaio Antiviral Coleta do sobrenadante de ceacutelulas infectadas por DENV1 Tiacutetulo
viral (UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o
controle natildeo tratado como 100
Ao perceber um aumento no tiacutetulo viral frente ao tratamento com os compostos A1
A2 e A3 e uma reduccedilatildeo frente ao tratamento com A4 A5 e A6 foram escolhidos dois
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 119 x 105 10000
A1 235 x 105 19748
A2 228 x 105 19160
A3 318 x 105 26723
A4 128 x 104 1076
A5 186 x 103 156
A6 190 x 104 1597
A7 280 x 104 2353
A8 350 x 104 2941
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
40
Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
6
13 Epidemiologia
Ao longo das uacuteltimas deacutecadas a dengue se tornou a doenccedila viral transmitida por
mosquitos mais prevalente no mundo Estimativas de infecccedilatildeo pela OMS indicam que a
patologia eacute endecircmica em mais de 100 paiacuteses em todos os continentes exceto a Antaacutertida e
aflige principalmente paiacuteses pobres em recursos nas regiotildees tropicais e subtropicais (Perry
2011) Epidemias globais de DENV ocorreram ao longo das uacuteltimas deacutecadas em parte devido
agrave diminuiccedilatildeo dos esforccedilos no controle de mosquitos Satildeo estimados mais de 50 milhotildees de
casos de dengue anualmente (Mukhopadhyay 2005)
A Dengue eacute uma doenccedila viral sistecircmica aguda que se estabeleceu em todo o mundo
em ambos os ciclos de transmissatildeo endecircmicas e epidecircmicas A infecccedilatildeo pelo DENV em seres
humanos eacute frequentemente inaparente mas pode levar a uma grande variedade de
manifestaccedilotildees cliacutenicas de febre leve a siacutendrome do choque da dengue potencialmente fatal A
imunidade vitaliacutecia desenvolvida apoacutes a infecccedilatildeo com um dos quatro tipos de viacuterus eacute
especiacutefica para cada tipo e a progressatildeo para uma doenccedila mais grave eacute frequente mas natildeo
exclusivamente relacionada com infecccedilatildeo secundaacuteria por tipos heteroacutelogos No entanto
enquanto a expansatildeo histoacuterica desta doenccedila eacute bem documentada o elevado fardo de
problemas de sauacutede atribuiacuteveis agrave dengue em grande parte do mundo tropical e sub-tropical
permanecem pouco enumerados (Bhatt 2013)
O Brasil eacute um paiacutes de grande extensatildeo (8512000 km2) situado em uma zona
predominantemente tropical com extensas aacutereas de florestas na regiatildeo amazocircnica bem como
restos de uma floresta tropical na costa leste sudeste e sul entre outros ecossistemas A maior
parte do paiacutes tem um clima tropical e uma grande diversidade de plantas e animais portanto
um local adequado para a ocorrecircncia de patologias causadas por viacuterus transmitidos por
artroacutepodes (Figueiredo 2000) Segundo o boletim epidemioloacutegico do ministeacuterio da sauacutede em
2016 jaacute foram registrados 170103 casos provaacuteveis de dengue no paiacutes ateacute a semana
epidemioloacutegica 5 Nesse periacuteodo a regiatildeo Sudeste registrou o maior nuacutemero de casos
provaacuteveis (96664 casos 568) Em Minas Gerais jaacute foram registradas 19 mortes em
decorrecircncia da Dengue entre 1deg de janeiro e 14 de marccedilo deste ano Outros 91 oacutebitos estatildeo
sob investigaccedilatildeo (BRASIL 2016)
7
Figura 3 Distribuiccedilatildeo geograacutefica da Dengue Aacutereas de risco de transmissatildeo em amarelo
(Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede Adaptado de httpwwwwhointen)
As manifestaccedilotildees da doenccedila foram descritas pela primeira vez apoacutes a Segunda Guerra
Mundial coincidente com o aumento da urbanizaccedilatildeo particularmente na Aacutesia (Weaver 2010)
Atualmente o DENV eacute hiperendecircmico em muitas regiotildees tropicais onde 2 ou mais sorotipos
circulam endemicamente Embora DENV foi provavelmente introduzido periodicamente para
as Ameacutericas atraveacutes de navios desde o seacuteculo 17 o surgimento de DENV no Hemisfeacuterio
Ocidental comeccedilou mais tarde devido a uma campanha de sucesso parcial para erradicar o
vetor A aegypti para controlar a febre amarela Esta campanha teve sucesso na maior parte
das Ameacutericas da deacutecada de 1950 agrave deacutecada de 1970 mas foi interrompida O vetor entatildeo
rapidamente recolonizou quase toda a regiatildeo neotropical e subtropicais e a invasatildeo do DENV
seguiu logo depois Em 1985 A albopictus foi introduzido nos EUA e no Brasil
proporcionando um vetor para a transmissatildeo secundaacuteria de DENV nas Ameacutericas (Hawley
1987)
Os mosquitos vetores principalmente A aegypti tornam-se infectados quando eles se
alimentam do sangue de seres humanos durante o periacuteodo de cinco dias da viremia A
infecccedilatildeo produz um amplo espectro da doenccedila cliacutenica e varia de assintomaacutetica a doenccedila febril
auto-limitante A dengue tambeacutem conhecida como ldquofebre osso quebradordquo devido agraves fortes
dores nas articulaccedilotildees e inclui sintomas de febre alta dores musculares articulares e erupccedilatildeo
cutacircnea Uma pequena porcentagem de indiviacuteduos pode apresentar a siacutendrome do choque da
8
dengue (dengue hemorraacutegica) com risco de vida grave O tratamento eacute amplamente favoraacutevel
usando de reidrataccedilatildeo oral ou intravenosa acompanhamento e atenccedilatildeo meacutedica adequada No
entanto uma das principais consequecircncias da doenccedila eacute a sua capacidade de sobrecarregar
instalaccedilotildees meacutedicas durante um surto e em paiacuteses onde os recursos de sauacutede jaacute estatildeo no
limite isso pode ter efeitos catastroacuteficos Prevenccedilatildeo e tratamento portanto se fazem
altamente necessaacuterios (Perry 2011)
A prevalecircncia global de DENV cresceu drasticamente nas uacuteltimas deacutecadas e ateacute o
momento natildeo haacute nenhum medicamento especiacutefico para combater a infecccedilatildeo as medidas de
prevenccedilatildeo mais eficazes satildeo voltadas para o controle do vetor (Silva 2011) Diante disso a
Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) elegeu o desenvolvimento de vacinas contra o viacuterus da
dengue como prioridade mundial (Kinney 2001) Por conseguinte a busca de substacircncias
naturais ou sinteacuteticas com atividade antiviral especiacutefica sem toxicidade para as ceacutelulas
normais em seres humanos eacute uma estrateacutegia desejada para evitar que a dengue se agrave e
ajudar a controlar a difusatildeo da doenccedila As vaacuterias fases do ciclo viral representam alvos
terapecircuticos individuais que podem ser exploradas (Costa 2013) Nesse sentido vaacuterios
grupos de pesquisa e organizaccedilotildees estatildeo trabalhando com diversas abordagens para o
desenvolvimento de compostos antivirais com atividade protetora contra dengue Dentre elas
uma vasta gama de produtos naturais incluindo plantas numa tentativa de isolar e
caracterizar novos compostos que podem inibir a replicaccedilatildeo do viacuterus ou tratar a infecccedilatildeo
viral Por essa razatildeo extratos e componentes da planta satildeo cada vez mais importantes como
fontes potenciais para agentes antivirais (Silva 2011)
14 Naftoquinonas
As quinonas satildeo compostos aromaacuteticos amplamente distribuiacutedos na natureza e podem
ser encontrados em vaacuterias famiacutelias de plantas bem como isolado de fungos algas e
bacteacuterias Elas satildeo classificadas em benzoquinonas antraquinonas e naftoquinonas de acordo
com as suas estruturas quiacutemicas Naftoquinonas satildeo compostos orgacircnicos altamente reativos
utilizados como corantes naturais ou sinteacuteticos cujas cores variam de amarelo para vermelho
Apresentam cadeia carbocircnica similar ao naftaleno e satildeo caracterizadas por seus dois grupos
carbonila na posiccedilatildeo 1 e 4 por isso satildeo nomeadas de 14-naftoquinonas Os grupos carbonila
tambeacutem podem estar presente na posiccedilatildeo 12 com menor incidecircncia (Loacutepez 2014)
9
Figura 4 Estrutura quiacutemica da 12-naftoquinona (1) e 14-naftoquinona (2)
Entre as quinonas estatildeo compostos biologicamente importantes tais como o grupo da
vitamina K e a coenzima Q (ubiquinona) Estes compostos tecircm um papel importante no
metabolismo celular especialmente como carreadores de eleacutetrons Aleacutem de quinonas que
possuam uma funccedilatildeo bioloacutegica outros compostos desta classe tecircm sido encontrados
mostrando atividade antibioacutetica Alguns deles estatildeo presentes na natureza mas a maior parte
satildeo obtidos sinteticamente entre eles 2-hidroxi-3-alquil-14-naftoquinonas que possuem
evidecircncias de serem ativos in vitro contra os parasitas da malaacuteria e como coccidiostaacuteticos
(Ambrogi 1970)
A atividade bioloacutegica de quinonas estaacute muitas vezes relacionada com o seu
comportamento eletroquiacutemico A capacidade de aceitar um ou dois eleacutetrons para formar o
acircnion radical correspondente ou dianion pode ser o motivo da induccedilatildeo da formaccedilatildeo de
espeacutecies reativas de oxigecircnio responsaacuteveis pelo estresse oxidativo nas ceacutelulas A capacidade
de aceitar eleacutetrons de naftoquinonas pode ser alterada por mudanccedilas de posiccedilatildeo do grupo
carbonila (12- 14-naftoquinonas) ou diferentes substituintes ou funccedilotildees associadas agrave porccedilatildeo
de naftoquinona (Francisco 2010)
As naftoquinonas satildeo largamente encontradas em plantas micro-organismos e alguns
animais Estes compostos tecircm sido amplamente utilizados em diversas culturas como corantes
para cosmeacuteticos tecidos alimentos (Brandelli 2004) e para fins medicinais incluindo
antitumoral (Oliveira 1990 Ferreira 1996) anti-inflamatoacuterios antimalaacuterico antiviral
(Fonseca 2003 Hussain 2007) atibacterianos e antifuacutengicos (Nagata 1998) Estas atividades
bioloacutegicas tecircm justificado o grande nuacutemero de trabalhos (aproximadamente 42 ateacute abril 2016
ndash Pubmed) encontrados na literatura que visa a siacutentese e avaliaccedilatildeo de qualquer das quinonas
naturais ou seus anaacutelogos como agentes farmacoloacutegicos potenciais (Rahmoun 2013)
10
O Lapachol foi descoberto e estudado desde o seacuteculo XIX Foi isolado primeiramente
do lenho da aacutervore argentina ldquolapachordquo Tabebuia avellanedae (Bignoniaceae) conhecida
como Ipecirc roxo Os estudos quiacutemicos foram desenvolvidos inicialmente em 1892 (Fonseca
2003) O lapachol foi descrito pela primeira vez por Paterno em 1821 tendo sua estrutura
quiacutemica estabelecida em 1896 por Hooker que o identificou como uma naftoquinona Esta
naftoquinona possui accedilatildeo antiinflamatoacuteria analgeacutesica antibioacutetica e anti-neoplaacutesica
reconhecida (Arauacutejo 2002)
A β-lapachona (34-di-hidro-22-dimetil-2H-naptho [12-b] pirano-56-diona) eacute uma
quinona obtida de fontes naturais derivada da aacutervore Lapacho (Tabebuia avellanedae) nativa
da Ameacuterica do Sul e Central A siacutentese e quiacutemica da β-lapachona e compostos relacionados
foi inicialmente investigado no final do seacuteculo XIX e iniacutecio do seacuteculo XX pelo quiacutemico
Samuel Hooker Apesar de alguns estudos cliacutenicos sobre a bioatividade de naftoquinonas
terem sido relatados no iniacutecio de 1940 foi o relatoacuterio do potencial da β-lapachona como um
agente anti-tripanossoma em 1977 que revitalizou o estudo e caracterizaccedilatildeo deste composto
natural A β-lapachona tambeacutem apresenta vaacuterias accedilotildees farmacoloacutegicas incluindo accedilatildeo
formaccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (Hussain 2007)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do Lapachol (1) da α- Lapachona (2) e da β-
Lapachona (Fonseca et al 2003 Ferreira et al 2010)
11
Figura 6 Tabebuia avellanedae (Hussain 2007)
A β-lapachona eacute uma substacircncia natural facilmente obtida a partir do lapachol Esta
naftoquinona eacute o grande destaque desta classe de substacircncias porque se encontra em testes
cliacutenicos de fase II para o tratamento do cacircncer de pacircncreas (Ferreira 2010) O mecanismo de
accedilatildeo da β-lapachona diferencia-se de outros antineoplaacutesicos por atuar na topoisomerase I
promovendo a recuperaccedilatildeo da capacidade de apoptose celular Alguns estudos reportam sua
accedilatildeo sineacutergica de potenciaccedilatildeo com o Taxolreg
promovendo a inibiccedilatildeo em diferentes pontos de
replicaccedilatildeo celular aleacutem de sua combinaccedilatildeo com outros tratamentos como a aplicaccedilatildeo de
radiaccedilatildeo ionizante (Cunha 2005)
Vaacuterios estudos jaacute foram publicados demonstrando a atividade antiviral de
naftoquinonas naturais e sinteacuteticas A β-lapachona inibe seletivamente a replicaccedilatildeo do viacuterus
HIV-1 atuando na inibiccedilatildeo da enzima LTR117 Da mesma forma este composto eacute um
potente inibidor da enzima transcriptase reversa dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e
leucemia murina de Rauscher (RLV) inibindo tambeacutem a DNA polimerase A accedilatildeo inibitoacuteria
sobre estas enzimas revelou-se especiacutefica se comparada com a de outros inibidores
conhecidos (Silva 2003)
O Lapachol jaacute demonstrou atividade contra certas cepas virais incluindo Herpes virus
tipos I e II Outras naftoquinonas jaacute mostraram eficaacutecia contra cepas de Influenza virus
Poliomielite virus e estomatite vesicular Supotildee-se que o mecanismo de accedilatildeo destas quinonas
seja atraveacutes da inibiccedilatildeo da transcriptase reversa de retroviacuterus e da RNA polimerase Eacute relatado
12
que lapachol diminui a replicaccedilatildeo do viacuterus em seres humanos mas ainda natildeo existem
resultados de testes cliacutenicos disponiacuteveis (Hussain 2007)
Na avaliaccedilatildeo da atividade antiviral do Lapachol in vitro verificou-se que esta
substacircncia eacute ativa contra viacuterus RNA atuando tanto sobre viacuterus envelopados quanto sobre
partiacuteculas sem esta estrutura em concentraccedilotildees de 5 a 10 microgmL e ainda apresentou uma
pequena atividade sobre HSV (Herpes simplex I) e Ad5 (Adeno tipo 5) mas nenhuma
atividade sobre CoxB4 (Coxsackie B4) Em trabalho posterior demonstrou-se que nem o
Lapachol nem diversos dos seus derivados apresentaram atividade antiviral in vitro sobre
Poliovirus tipo 1 Ecovirus 19 e Coxsackie B tipo 4 Apenas os derivados 12-naftoquinonicos
e um intermediaacuterio da siacutentese Hoocker foram ativos contra o Echovirus 19 (Fonseca 2003)
Costa et al (2013) relataram que piranonaftoquinonas isocircmeras do lapachol possuem
atividade de inibiccedilatildeo da replicaccedilatildeo de DENV-2 atuando sobre a atividade da ATPase de NS3
(proteiacutena natildeo estrutural de DENV)
A utilizaccedilatildeo de testes in vitro por meio de ensaios de viabilidade celular constitui o
primeiro passo para a avaliaccedilatildeo da compatibilidade bioloacutegica de uma substacircncia e pode
fornecer elementos importantes para a anaacutelise da biocompatibilidade dos diferentes materiais
Para ser considerado natildeo citotoacutexico no teste de citotoxicidade in vitro um produto natildeo deve
ocasionar a morte das ceacutelulas nem afetar suas funccedilotildees celulares A prova do MTT eacute um dos
indicadores colorimeacutetricos de viabilidade celular mais utilizados sendo capaz de avaliar a
funccedilatildeo celular mitocondrial de acordo com a reduccedilatildeo enzimaacutetica do sal de tetrazoacutelio pelas
desidrogenases mitocondriais nas ceacutelulas viaacutevies (Arauacutejo et al 2008) Supotildee-se que o
mecanismo responsaacutevel pela citotoxicidade apresentada pelas quinonas esteja relacionado
com o estresse oxidativo causado por esses compostos poreacutem a capacidade de alquilaccedilatildeo de
nucleoacutefilos celulares tambeacutem representa correlaccedilatildeo com tais efeitos bioloacutegicos (Goulart
2004)
13
II JUSTIFICATIVA
14
2 JUSTIFICATIVA
Aleacutem do controle do mosquito transmissor e do desenvolvimento de vacinas que tem
sido exaustivamente estudado nos uacuteltimos anos uma alternativa para o combate agrave dengue
seria o desenvolvimento de faacutermacos para reduzir a viremia ou mesmo para controlar a
resposta imune do hospedeiro agrave infecccedilatildeo que tem sido apontada como principal fator de risco
nos casos mais graves Em funccedilatildeo disso o nuacutemero de pesquisas visando o desenvolvimento
de drogas com accedilatildeo antiviral ou com accedilatildeo imunomodulatoacuteria tem aumentado
significativamente As naftoquinonas vecircm ganhando bastante importacircncia na pesquisa de
novas drogas antivirais devido agrave algumas atividades apresentadas A szlig-lapachona-orto-
naftoquinona por exemplo se mostrou um potente inibidor da enzima transcriptase reversa
dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e leucemia murina de Rauscher (RLV)
Diante da inexistecircncia de drogas com accedilatildeo anti DENV e o elevado nuacutemero e casos da
patogenia nos uacuteltimos anos a organizaccedilatildeo mundial da sauacutede classificou a Dengue como uma
epidemia de proporccedilotildees globais e um problema de sauacutede puacuteblica Como as naftoquinonas jaacute
demonstraram na literatura possuir um potencial efeito terapecircutico contra alguns viacuterus eacute
possiacutevel que estes compostos possam apresentar atividade antiviral contra DENV Portanto
este trabalho visou atraveacutes de ensaios de MTT e titulaccedilotildees virais em placa avaliar a potencial
atividade antiviral de oito compostos derivados de naftoquinonas naturais e sinteacuteticas
15
III OBJETIVOS
16
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar oito compostos (2 naturais e 6 sinteacuteticos) derivados de naftoquinonas como potenciais
agentes antivirais em ceacutelulas BHK-21 frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1 e 2
32 Objetivos especiacuteficos
1 Calcular o iacutendice de citotoxicidade e a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) dos compostos
atraveacutes de ensaio de reduccedilatildeo de MTT
2 Avaliar os efeitos dos compostos sobre o crescimento a viabilidade e o volume celular
pela teacutecnica de exclusatildeo do azul de tripan
3 Determinar a multiplicidade de infecccedilatildeo de DENV 1 e 2 a ser utilizada nos ensaios
antivirais
4 Avaliar a atividade antiviral dos compostos frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1
e 2 atraveacutes do ensaio de MTT
5 Verificar um possiacutevel efeito direto dos compostos agraves partiacuteculas virais de Dengue virus
6 Quantificar a produccedilatildeo de partiacuteculas virais infecciosas no sobrenadante de ceacutelulas
infectadas atraveacutes de titulaccedilatildeo viral pela contagem de unidades formadoras de placas
17
IV MATERIAL E MEacuteTODOS
18
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Linhagens celulares
411 Ceacutelulas C636
As ceacutelulas C636 satildeo ceacutelulas de linhagem contiacutenua de larvas de mosquito Aedes
albopictus Estas ceacutelulas foram utilizadas na produccedilatildeo de estoque viral de DENV sorotipos 1
e 2 para isso foram mantidas em meio de cultura Leibovitz-15 (L-15) (Cultilab)
suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (Cultilab) antibioacuteticos (Penicilina 100 UmL
Streptomicina 100 microgmL) e antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL) a 28degC
412 Ceacutelulas BHK-21
As ceacutelulas BHK-21 satildeo fibroblastos de linhagem contiacutenua derivados de rim de hamster
neonato Estas ceacutelulas foram utilizadas para os experimentos in vitro e para as titulaccedilotildees de
DENV 1 e 2 para isso foram mantidas em meio miacutenimo essencial modificado por Dulbecco
ndash DMEM (Cultilab) suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (SFB) com antibioacuteticos
(Penicilina 100 UmL Streptomicina 100 microgmL) e com antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL)
sendo mantidas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5
42 Viacuterus
421 DENV 1 e DENV 2
O Sorotipo 1 do Dengue virus (DENV-1) estirpe Mochizuki foi replicado em ceacutelulas
C636 para gerar estoques de trabalho durante 2 e 5 dias a 28degC O sobrenadante da cultura de
ceacutelulas infectadas foi recolhido e clarificado por centrifugaccedilatildeo a 4000 G durante 10 minutos agrave
4degC e entatildeo foi aliquotado e armazenado a -70 deg C como reserva de viacuterus ateacute agrave sua utilizaccedilatildeo
A replicaccedilatildeo geraccedilatildeo de estoque e titulaccedilatildeo do Sorotipo 2 do Dengue virus (DENV-2)
estirpe Nova Guineacute C ocorreu nos mesmos moldes do DENV-1
19
422 Titulaccedilatildeo viral
Os estoques virais foram diluiacutedos (10-1
a 10-7
) e inoculados em monocamadas de
ceacutelulas BHK-21 implantadas em placas de 6 poccedilos com confluecircncia de aproximadamente
60 (3x105 ceacutelulas por poccedilo) sendo um poccedilo natildeo infectado mantido para controle celular
Apoacutes uma hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus foram adicionados 3 mL de meio DMEM (Cultilab)
suplementado com 15 de SFB e contendo 15 de Carboximetilcelulose (CMC Synth) As
placas foram entatildeo incubadas a 37degC (CO2 a 5) por 96 horas As ceacutelulas foram entatildeo
fixadas com 2 mL de soluccedilatildeo de formol a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo
1 (pv) de cristal violeta em PBS para contagem das placas de lise O tiacutetulo viral foi
expresso atraveacutes do nuacutemero de unidades formadoras de placa por mL (UFPmL) segundo a
formula abaixo representada
Tiacutetulo viral (UFPmL) = N x FC x 10
N = nuacutemero de placas de lise contadas
FC = Fator de correccedilatildeo
= Inverso da diluiccedilatildeo na qual foram contadas as placas de lise
43 Compostos de naftoquinonas
Os compostos utilizados neste estudo foram fornecidos pelo Dr Geraldo Ceacutelio
Brandatildeo do laboratoacuterio de pesquisa da Escola de Farmaacutecia da Universidade Federal de Ouro
Preto
20
Tabela 1 Relaccedilatildeo de nome estrutura e coacutedigo dos compostos utilizados Na tabela estatildeo
presentes a relaccedilatildeo dos nomes dos compostos utilizados neste trabalho bem como sua
estrutura Os coacutedigos representantes de cada composto seratildeo utilizados no decorrer da escrita
Nome do composto Estrutura Coacutedigo
Lapachol
A1
β-lapachona
A2
2-Hidroxi-3-(ββ-dimetilvinil)-14-naftoquinona
A3
2-Cloro-14-naftoquinona
A4
Lapachol derivado 1
A5
Lapachol derivado 2 A6
Lapachol derivado 3 A7
Lapachol derivado 4 A8
44 Ensaio de citotoxicidade
Para avaliar a citotoxicidade dos compostos ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas foram incubadas com diferentes concentraccedilotildees dos compostos em triplicata num
volume de 200 microL de meio de cultura por poccedilo na presenccedila de 1 de SFB Os controles natildeo
tratados apresentaram adiccedilatildeo de 200 microL de meio de cultura As ceacutelulas foram entatildeo incubadas
durante 72 horas O meio foi removido e 28 microL de soluccedilatildeo de 5 mg mL MTT (brometo de 3-
21
[45-dimetil-tiazol-2-il]-25 difeniltertrazoacutelio) foi adicionado a cada poccedilo As placas foram re-
incubadas durante 1 hora e 30 minutos e entatildeo 122 microL de DMSO foi adicionado a cada poccedilo e
placas foram agitadas suavemente durante 15 minutos para dissolver os cristais de formazan
A absorbacircncia foi lida em um equipamento leitor de placas Victor X3 (PerkinElmer) a 490
nm A concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC 50) foi definida como a concentraccedilatildeo da amostra que
reduziu a viabilidade celular de 50 em comparaccedilatildeo com controles natildeo tratados Os dados
foram analisados utilizando o programa Prisma
45 Avaliaccedilatildeo da viabilidade e crescimento celular por exclusatildeo de azul de tripan
Ceacutelulas BHK-21 foram cultivadas em placas de 24 poccedilos (7x104 ceacutelulaspoccedilo) e apoacutes
24 horas foram tratadas com as concentraccedilotildees de uso de cada composto e incubadas por 72
horas na presenccedila de 1 de SFB A seguir as ceacutelulas foram tripsinizadas e incubadas com
azul de tripan e entatildeo foi utilizado um contador automatizado de ceacutelulas (Countess II FL
Automated Cell Counter ndash Thermo Fisher Scientific) para contagem das ceacutelulas e avaliaccedilatildeo da
porcentagem de viabilidade e diacircmetro celular do controle nos tempos de 0 24 e 96 horas e
avaliaccedilatildeo dos mesmos paracircmetros para os compostos no tempo de 96 horas (72 horas poacutes
tratamento)
Outra curva de multiplicaccedilatildeo celular foi feita para os compostos A1 A3 A4 e A5 onde as
ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos no momento da confecccedilatildeo da placa e
foram avaliados os mesmos paracircmetros nos tempos de 0 12 24 48 e 72 horas O
equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
46 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
Para determinar a menor Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) responsaacutevel pela letalidade
celular total 2x104 de ceacutelulas BHK-21 foram semeadas em placa de 96 poccedilos Apoacutes a
incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o
meio de cultura foi removido e as ceacutelulas foram expostas a diferentes diluiccedilotildees dos dois
sorotipos de DENV (100 microL de cada diluiccedilatildeo + 100 microL de meio DEMEM 1 SFB) As
diluiccedilotildees seriadas foram realizadas da suspensatildeo viral na razatildeo de 5 para o primeiro poccedilo e de
2 para os demais poccedilos Apoacutes 72 horas as ceacutelulas foram entatildeo fixadas com 200 microL de soluccedilatildeo
22
formalina a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo 1 (pv) de cristal violeta em
PBS para avaliaccedilatildeo da maior diluiccedilatildeo responsaacutevel pela letalidade de 100 das ceacutelulas
47 Ensaio Dose-resposta
Para cada composto foram realizados ensaios de dose-resposta para definiccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de cada composto capaz de promover a reduccedilatildeo na produccedilatildeo viral A atividade
antiviral foi avaliada tambeacutem pelo meacutetodo de MTT Ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas expostas a diferentes concentraccedilotildees dos extratos determinadas a partir das maiores
concentraccedilotildees em que natildeo foram observados efeitos citotoacutexicos As ceacutelulas foram tratadas
com as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de cada composto e em seguida infectadas com DENV
1 (MOI= 5) ou 2 (MOI= 2) Mantendo uma coluna para controle com DMSO uma coluna
para controle de viacuterus uma coluna para controle de citotoxicidade dos compostos e por fim
uma coluna para controle celular As ceacutelulas foram entatildeo incubadas durante 72 horas Apoacutes
este tempo procedeu-se a leitura pelo ensaio de MTT como descrito anteriormente Os dados
foram analisados levando-se em consideraccedilatildeo a leitura das absorbacircncias dos poccedilos dos
controles de viacuterus e do controle celular
Para realizacao destes experimentos os seguintes controles foram adotados
Controle de ceacutelulas poccedilos contendo somente ceacutelulas acrescidas do meio de cultura DMEM
1 SFB Utilizado para avaliar o comportamento das ceacutelulas sem que as mesmas tivessem
contato com qualquer interferente durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo Com isso os poccedilos
reservados para esse controle serviram de padratildeo para comparaccedilatildeo com aqueles em que fosse
observada atividade citotoacutexica ou citopaacutetica
Controle de viacuterus poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM 1 SFB
sem nenhum tratamento e de suspensatildeo de viacuterus Utilizando como referecircncia para anaacutelise da
atividade citopaacutetica provocada pelo viacuterus testado durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo das placas
23
Controle de viacuterus com DMSO Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura
DMEM 1 SFB e DMSO Foi utilizado para avaliar se havia influecircncia prejudicial do
solvente utilizado para diluiccedilatildeo das amostras no meio de cultivo das ceacutelulas e se o mesmo
poderia apresentar alguma potencial atividade antiviral aparente
Controle de citotoxicidade Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM
1 SFB e as quatro principais concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos Foi utilizado
para avaliar se haveria alguma possiacutevel atividade citotoacutexica das concentraccedilotildees dos compostos
em relaccedilatildeo agraves ceacutelulas
48 Ensaio Virucida
Para a realizaccedilatildeo deste ensaio aliacutequotas de 950 microL (diluiccedilatildeo de 20 vezes) do DENV 1 (tiacutetulo
6 x 107 UFPmL) foram incubadas com 50 microL de uma soluccedilatildeo de meio DMEM preparada
com 20x a concentraccedilatildeo natildeo citotoacutexica de cada composto A1 a A8 em banho-maria 37deg C
por 1 hora Apoacutes a incubaccedilatildeo as aliacutequotas foram imediatamente tituladas em ceacutelulas BHK-21
em placas de 6 poccedilos utilizando-se 3 diluiccedilotildees para cada incubaccedilatildeo (20x 20 x 10-1
e 20 x 10-
2) Foram titulados tambeacutem uma aliacutequota incubada apenas com meio DMEM sem nenhum
tratamento e outra aliacutequota incubada com DMSO (Dimetilsulfoacutexido) Estas foram tituladas
utilizando um controle e mais cinco diluiccedilotildees (20x 20 x 10-1
20 x 10-2
20 x 10-3
e 20 x 10-4
)
49 Ensaio antiviral
Neste ensaio ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em placas de 24 poccedilos no dia
seguinte foram tratadas durante 4 horas com as concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas de cada
composto em duplicata Apoacutes o preacute-tratamento as monocamadas foram infectadas com
DENV-1 a uma MOI=5 na presenccedila das concentraccedilotildees de uso respectivas de cada composto
Apoacutes 1 hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus as monocamadas foram lavadas duas vezes com PBS e
foi adicionado 500 microL por poccedilo de meio preparado com as mesmas concentraccedilotildees dos
diferentes compostos e mantidos durante 48 horas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5 Em
quatro poccedilos as ceacutelulas foram infectadas e natildeo tratadas e em outros quatro poccedilos as ceacutelulas
natildeo foram tratadas e nem infectadas (controle de ceacutelulas) destes uacuteltimos dois foram
tripsinizados e contados no momento da infecccedilatildeo e os outros dois apoacutes o teacutermino do ensaio
24
para avaliar o crescimento celular Decorridas as 48 horas o sobrenadante foi coletado e
centrifugado por 10 minutos a 4000 xG para separaccedilatildeo dos debris celulares e prontamente
titulado em placa de 6 poccedilos
410 Anaacutelise estatiacutestica
Os valores de CC50 foram obtidos a partir de anaacutelise de regressatildeo linear das curvas de
concentraccedilatildeocitotoxicidade A anaacutelise estatiacutestica dos dados foi realizada pelo programa
GraphPad Prism software Uma anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi utilizada para determinar
as diferenccedilas estatiacutesticas seguida do poacutes teste de Tukey A significacircncia estatiacutestica foi fixada
em p lt005
25
V RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
26
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Ensaio de citotoxicidade celular
Para avaliar a viabilidade da linhagem celular BHK-21 frente ao tratamento com oito
diferentes concentraccedilotildees dos compostos (A1 a A8) realizou-se um ensaio de MTT (brometo
de 3-[45-dimetil-tiazol-2-il]-25-difeniltetrazoacutelio) Este ensaio tem o objetivo de quantificar
espectrofotometricamente o crescimento celular a viabilidade e proliferaccedilatildeo podendo ser
utilizado como um indicador direto de citotoxicidade Trata-se de um ensaio colorimeacutetrico
para medir a atividade da redutase mitocondrial em ceacutelulas vivas Ele se baseia na reduccedilatildeo do
sal amarelo tetrazoacutelio (permeaacutevel agrave membrana celular) para cristais de formazan azuis
puacuterpura por ceacutelulas metabolicamente ativas a quantidade de formazan gerada medida por
espectrofotometria eacute proporcional ao nuacutemero de ceacutelulas viaacuteveis
A CC50 foi calculada plotando-se uma curva de porcentagem de viabilidade celular por
concentraccedilatildeo melhor representada na figura 7 pelo composto A7 e os resultados de CC50
para todos os compostos estatildeo representados na tabela 2 Foram feitos ensaios de
citotoxicidade com oito concentraccedilotildees diferentes sendo escolhida a maior concentraccedilatildeo que
natildeo apresentou citotoxicidade
Viabilidade Celular = [ ( A ndash B ) A ] x 100
Onde
A = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas natildeo tratadas
B = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas tratadas com
as respectivas concentraccedilotildees de cada composto
27
28
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (A curva dose resposta do composto A7 eacute a que
melhor representa a curva dose resposta esperada) Avaliou-se a viabilidade da linhagem
celular BHK-21 frente agrave diferentes concentraccedilotildees dos compostos realizando o ensaio de MTT
e determinando assim as concentraccedilotildees a serem utilizadas nos proacuteximos ensaios bem como
calculando a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) agrave partir da curva
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo
da concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50)
Composto Concentraccedilatildeo utilizada
[ ] microgmL
Concentraccedilatildeo citotoacutexica 50
(CC50) [ ] microgmL plusmn Desvio
Padratildeo
A1 ([ ]=1 mgmL) 00200 10010 plusmn 0014
A2 ([ ]=1 mgmL) 00025 09561 plusmn 0023
A3 ([ ]=1 mgmL) 00025 09988 plusmn 0017
A4 ([ ]=5 mgmL) 00125 10150 plusmn 0036
A5 ([ ]=10 mgmL) 00250 10590 plusmn 0047
A6 ([ ]=5 mgmL) 00250 08183 plusmn 0030
A7 ([ ]=5 mgmL) 00125 10280 plusmn 0052
A8 ([ ]=5 mgmL) 00125 09758 plusmn 0036
52 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan
Para corroborar o ensaio anterior de citotoxicidade utilizou -se o teste de viabilidade
celular pela teacutecnica da exclusatildeo do azul de tripan com a finalidade de determinar a
viabilidade das ceacutelulas Os procedimentos adotados no ensaio seguiram o manual do
equipamento contador automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL Automated Cell Counter) entatildeo
foi acrescentado agrave 10 microL da suspensatildeo celular 10 microL de azul de tripan (04) Apoacutes
homogeneizaccedilatildeo 10 microL da suspensatildeo foi colocada no local indicado da lacircmina proacutepria para
leitura e foi realizada a contagem sendo consideradas mortas (inviaacuteveis) as ceacutelulas que
incorporavam o corante e viaacuteveis as que excluiacuteam o azul de tripan
29
O equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
(A)
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan A avaliaccedilatildeo da
viabilidade celular foi realizada atraveacutes de um contador automaacutetico de ceacutelulas Este
equipamento possibilita explorar ferramentas de fotografia e avaliar alguns paracircmetros
importantes (A) fotografia das ceacutelulas (B) Zoom na fotografia das ceacutelulas com marcaccedilotildees
(em verde para ceacutelulas vivas e vermelho para mortas) e (D) contagem das ceacutelulas totais
ceacutelulas vivas e mortas graacutefico e meacutedia dos diacircmetros celulares das ceacutelulas vivas e mortas
(B)
(C)
30
O crescimento celular de ceacutelulas natildeo tratadas foi avaliado nos tempos de 0h (momento
da confecccedilatildeo da placa) 24h (momento de tratamento com os compostos) e 96 horas
(Momento em que todas as ceacutelulas foram tripsinizadas e contadas) para avaliar o perfil do
crescimento celular em ceacutelulas natildeo tratadas Foi observado um crescimento celular no periacuteodo
de 24 horas onde as ceacutelulas estavam incubadas com meio acrescido de 10 SFB Em 24
horas o meio foi trocado por 1 SFB e acrescido das substacircncias testes nas menores diluiccedilotildees
natildeo citotoacutexicas determinadas pelo ensaio do MTT Em 96 horas pode ser observado um
decaimento no nuacutemero de ceacutelulas vivas provavelmente devido ao crescimento celular (morte
por confluecircncia)
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas)
(A) (B)
31
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas (A)
Contagem de ceacutelulas vivas (B) Percentual de ceacutelulas viaacuteveis (Viabilidade celular ) e (C)
Meacutedia do diacircmetro apresentado pelas ceacutelulas vivas
Em 96 horas as ceacutelulas natildeo tratadas bem como as ceacutelulas tratadas por 72 horas com as
concentraccedilotildees de uso dos compostos foram tripsinizadas e avaliadas quanto ao nuacutemero de
ceacutelulas vivas viabilidade e diacircmetro celular apresentados na figura 10
Segundo se observa natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo aparente que possa demonstrar que
as concentraccedilotildees de uso dos compostos tenham causado alguma atividade citotoacutexica
corroborando assim os ensaios de citotoxicidade anteriores
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
A infectividade de um viacuterus depende de vaacuterios fatores entre eles da proporccedilatildeo de
partiacuteculas virais completas ou infecciosas da suscetibilidade da ceacutelula hospedeira e da
chance desta partiacutecula encontrar o receptor e penetrar na ceacutelula Quando ceacutelulas suscetiacuteveis
satildeo misturadas com uma suspensatildeo de viacuterus estas podem receber uma duas trecircs ou dez
partiacuteculas virais ou nenhuma Isto depende da proporccedilatildeo entre a quantidade de viacuterus
infecciosos presente no inoculo e a quantidade de ceacutelulas utilizada Esta relaccedilatildeo eacute denominada
de multiplicidade de infecccedilatildeo ou MOI Uma MOI=1 indica que a infecccedilatildeo foi feita em
principio com 1 viacuterus ou 1 dose infectante por ceacutelula
A determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo dos Dengue virus 1 e 2 a serem
utilizadas nos proacuteximos ensaios foi feita a partir da infecccedilatildeo de ceacutelulas BHK-21 por diferentes
(C)
32
concentraccedilotildees de viacuterus e revelaccedilatildeo com cristal violeta Escolheu-se a maior diluiccedilatildeo viral que
possibilitou a letalidade total das ceacutelulas (faixa onde todas as ceacutelulas estatildeo mortas utilizando
menor concentraccedilatildeo de viacuterus) As faixas escolhidas foram entatildeo calculadas levando-se em
consideraccedilatildeo o nuacutemero de ceacutelulas presentes no poccedilo e o nuacutemero de partiacuteculas virais que foram
adicionadas (Faixa3 para DENV2 e 2 para DENV1) Figura 11 Foi estipulado portanto a
Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 2 para DENV 2 e 5 para DENV 1
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI A partir da infecccedilatildeo da linhagem celular BHK-21 em
placa de 96 poccedilos com diferentes diluiccedilotildees de DENV foi determinado que a Multiplicidade
de infecccedilatildeo para o Dengue viacuterus sorotipos 1 e 2 seria de 5 e 2 respectivamente (colunas 2 -
DENV1 e 3 - DENV2)
54 Ensaio dose resposta
Apoacutes a determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas ideais realizou-se um
ensaio dose resposta tratando as ceacutelulas com oito concentraccedilotildees agrave partir das concentraccedilotildees natildeo
citotoacutexicas escolhidas para cada composto e em seguida infectando com DENV sorotipos 1 e
2 nas MOIs estipuladas anteriormente (5 e 2 respectivamente) A porcentagem do efeito
protetor conferida agraves ceacutelulas para cada concentraccedilatildeo de amostra testada foi calculada da
seguinte forma
33
EP = [ (A ndash B) (C ndash B) ] x 100
Onde
A Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas tratadas e infectadas
B Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e infectadas
C Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e natildeo infectadas
Este ensaio tem por objetivo identificar a resposta celular agrave infecccedilatildeo frente ao
tratamento com os compostos em diferentes concentraccedilotildees Assim como o ensaio de
toxicidade este ensaio feito utilizando a teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT permite o teste de vaacuterias
concentraccedilotildees diferentes em um menor tempo e com baixo gasto de material
34
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV1
(MOI=5)
35
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV2
(MOI=2)
36
Takegami et al (1998) demonstraram atividade de furanonaftoquinonas contra o viacuterus
da Encefalite Japonesa (Flavivirus) utilizando a concentraccedilatildeo de 3microgmL poreacutem para os
compostos apresentados avaliados pela teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT nenhuma das
concentraccedilotildees apresentadas produziu efeito antiviral significativo em relaccedilatildeo ao controle
celular como observado nas figuras 12 e 13
Apesar da teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT ser interessante como triagem de atividade
antiviral permitindo o teste de vaacuterias concentraccedilotildees dos compostos em menor tempo e
utilizando uma quantidade razoaacutevel de materiais optou-se por utilizar as maiores
concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas encontradas avaliando sua atividade antiviral por outras
teacutecnicas Como natildeo foi avaliada atividade antiviral preacutevia para nenhum dos compostos frente
agrave infecccedilatildeo por DENV1 e 2 foi selecionado o Dengue virus 1 para dar prosseguimento aos
ensaios
55 Ensaio Virucida
O ensaio virucida foi realizado para avaliar um potencial efeito dos compostos
diretamente sobre a partiacutecula viral Este ensaio eacute importante pois possibilita elucidar se o
composto pode produzir algum efeito sobre a partiacutecula viral impedindo que esta possa infectar
as ceacutelulas
Figura 14 Ensaio virucida Neste ensaio as aliacutequotas de DENV1 foram incubadas com as
concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos e titulados (NT) Controle natildeo tratado
37
Tabela 3 Ensaio virucida Caacutelculo do tiacutetulo viral (UFPmL) e porcentagem representante de
cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 254 x 105 100
DMSO 263 x 105 10335
A1 199 x 105 7835
A2 205 x 105 8071
A3 237 x 105 9311
A4 775 x 104 3049
A5 153 x 105 6024
A6 219 x 105 8602
A7 243 x 105 9547
A8 254 x 105 100
Lagrota et al (1988) demonstraram atividade de 2-HO-3-N-benzil-N(N-benzil-2-
etilamina) -14-naftoquinona sobre a partiacutecula viral de enterovirus De forma contraacuteria apesar
de se verificar a reduccedilatildeo de quase uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais
para o composto A4 natildeo considerou-se esta uma alteraccedilatildeo significativa pois devido agrave
magnitude do nuacutemero de UFPs se trata de uma alteraccedilatildeo muito pequena Portanto os
compostos avaliados neste trabalho natildeo produziram atividade virucida aparente frente ao
tratamento com as concentraccedilotildees de uso
56 Ensaio Antiviral
O sobrenadante de ceacutelulas tratadas previamente e infectadas por DENV1 coletado 48
horas poacutes infecccedilatildeo foi avaliado quanto agrave produccedilatildeo viral de partiacuteculas infecciosas pela
contagem de placas de lise e caacutelculo de Unidades Formadoras de Placa (Titulaccedilatildeo viral em
placa ndash UFPmL)
38
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral Sobrenadante de ceacutelulas tratadas e infectadas por DENV1
coletado apoacutes 48 horas e titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado
Tabela 4 Ensaio Antiviral Coleta do sobrenadante de ceacutelulas infectadas por DENV1 Tiacutetulo
viral (UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o
controle natildeo tratado como 100
Ao perceber um aumento no tiacutetulo viral frente ao tratamento com os compostos A1
A2 e A3 e uma reduccedilatildeo frente ao tratamento com A4 A5 e A6 foram escolhidos dois
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 119 x 105 10000
A1 235 x 105 19748
A2 228 x 105 19160
A3 318 x 105 26723
A4 128 x 104 1076
A5 186 x 103 156
A6 190 x 104 1597
A7 280 x 104 2353
A8 350 x 104 2941
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
40
Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
7
Figura 3 Distribuiccedilatildeo geograacutefica da Dengue Aacutereas de risco de transmissatildeo em amarelo
(Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede Adaptado de httpwwwwhointen)
As manifestaccedilotildees da doenccedila foram descritas pela primeira vez apoacutes a Segunda Guerra
Mundial coincidente com o aumento da urbanizaccedilatildeo particularmente na Aacutesia (Weaver 2010)
Atualmente o DENV eacute hiperendecircmico em muitas regiotildees tropicais onde 2 ou mais sorotipos
circulam endemicamente Embora DENV foi provavelmente introduzido periodicamente para
as Ameacutericas atraveacutes de navios desde o seacuteculo 17 o surgimento de DENV no Hemisfeacuterio
Ocidental comeccedilou mais tarde devido a uma campanha de sucesso parcial para erradicar o
vetor A aegypti para controlar a febre amarela Esta campanha teve sucesso na maior parte
das Ameacutericas da deacutecada de 1950 agrave deacutecada de 1970 mas foi interrompida O vetor entatildeo
rapidamente recolonizou quase toda a regiatildeo neotropical e subtropicais e a invasatildeo do DENV
seguiu logo depois Em 1985 A albopictus foi introduzido nos EUA e no Brasil
proporcionando um vetor para a transmissatildeo secundaacuteria de DENV nas Ameacutericas (Hawley
1987)
Os mosquitos vetores principalmente A aegypti tornam-se infectados quando eles se
alimentam do sangue de seres humanos durante o periacuteodo de cinco dias da viremia A
infecccedilatildeo produz um amplo espectro da doenccedila cliacutenica e varia de assintomaacutetica a doenccedila febril
auto-limitante A dengue tambeacutem conhecida como ldquofebre osso quebradordquo devido agraves fortes
dores nas articulaccedilotildees e inclui sintomas de febre alta dores musculares articulares e erupccedilatildeo
cutacircnea Uma pequena porcentagem de indiviacuteduos pode apresentar a siacutendrome do choque da
8
dengue (dengue hemorraacutegica) com risco de vida grave O tratamento eacute amplamente favoraacutevel
usando de reidrataccedilatildeo oral ou intravenosa acompanhamento e atenccedilatildeo meacutedica adequada No
entanto uma das principais consequecircncias da doenccedila eacute a sua capacidade de sobrecarregar
instalaccedilotildees meacutedicas durante um surto e em paiacuteses onde os recursos de sauacutede jaacute estatildeo no
limite isso pode ter efeitos catastroacuteficos Prevenccedilatildeo e tratamento portanto se fazem
altamente necessaacuterios (Perry 2011)
A prevalecircncia global de DENV cresceu drasticamente nas uacuteltimas deacutecadas e ateacute o
momento natildeo haacute nenhum medicamento especiacutefico para combater a infecccedilatildeo as medidas de
prevenccedilatildeo mais eficazes satildeo voltadas para o controle do vetor (Silva 2011) Diante disso a
Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) elegeu o desenvolvimento de vacinas contra o viacuterus da
dengue como prioridade mundial (Kinney 2001) Por conseguinte a busca de substacircncias
naturais ou sinteacuteticas com atividade antiviral especiacutefica sem toxicidade para as ceacutelulas
normais em seres humanos eacute uma estrateacutegia desejada para evitar que a dengue se agrave e
ajudar a controlar a difusatildeo da doenccedila As vaacuterias fases do ciclo viral representam alvos
terapecircuticos individuais que podem ser exploradas (Costa 2013) Nesse sentido vaacuterios
grupos de pesquisa e organizaccedilotildees estatildeo trabalhando com diversas abordagens para o
desenvolvimento de compostos antivirais com atividade protetora contra dengue Dentre elas
uma vasta gama de produtos naturais incluindo plantas numa tentativa de isolar e
caracterizar novos compostos que podem inibir a replicaccedilatildeo do viacuterus ou tratar a infecccedilatildeo
viral Por essa razatildeo extratos e componentes da planta satildeo cada vez mais importantes como
fontes potenciais para agentes antivirais (Silva 2011)
14 Naftoquinonas
As quinonas satildeo compostos aromaacuteticos amplamente distribuiacutedos na natureza e podem
ser encontrados em vaacuterias famiacutelias de plantas bem como isolado de fungos algas e
bacteacuterias Elas satildeo classificadas em benzoquinonas antraquinonas e naftoquinonas de acordo
com as suas estruturas quiacutemicas Naftoquinonas satildeo compostos orgacircnicos altamente reativos
utilizados como corantes naturais ou sinteacuteticos cujas cores variam de amarelo para vermelho
Apresentam cadeia carbocircnica similar ao naftaleno e satildeo caracterizadas por seus dois grupos
carbonila na posiccedilatildeo 1 e 4 por isso satildeo nomeadas de 14-naftoquinonas Os grupos carbonila
tambeacutem podem estar presente na posiccedilatildeo 12 com menor incidecircncia (Loacutepez 2014)
9
Figura 4 Estrutura quiacutemica da 12-naftoquinona (1) e 14-naftoquinona (2)
Entre as quinonas estatildeo compostos biologicamente importantes tais como o grupo da
vitamina K e a coenzima Q (ubiquinona) Estes compostos tecircm um papel importante no
metabolismo celular especialmente como carreadores de eleacutetrons Aleacutem de quinonas que
possuam uma funccedilatildeo bioloacutegica outros compostos desta classe tecircm sido encontrados
mostrando atividade antibioacutetica Alguns deles estatildeo presentes na natureza mas a maior parte
satildeo obtidos sinteticamente entre eles 2-hidroxi-3-alquil-14-naftoquinonas que possuem
evidecircncias de serem ativos in vitro contra os parasitas da malaacuteria e como coccidiostaacuteticos
(Ambrogi 1970)
A atividade bioloacutegica de quinonas estaacute muitas vezes relacionada com o seu
comportamento eletroquiacutemico A capacidade de aceitar um ou dois eleacutetrons para formar o
acircnion radical correspondente ou dianion pode ser o motivo da induccedilatildeo da formaccedilatildeo de
espeacutecies reativas de oxigecircnio responsaacuteveis pelo estresse oxidativo nas ceacutelulas A capacidade
de aceitar eleacutetrons de naftoquinonas pode ser alterada por mudanccedilas de posiccedilatildeo do grupo
carbonila (12- 14-naftoquinonas) ou diferentes substituintes ou funccedilotildees associadas agrave porccedilatildeo
de naftoquinona (Francisco 2010)
As naftoquinonas satildeo largamente encontradas em plantas micro-organismos e alguns
animais Estes compostos tecircm sido amplamente utilizados em diversas culturas como corantes
para cosmeacuteticos tecidos alimentos (Brandelli 2004) e para fins medicinais incluindo
antitumoral (Oliveira 1990 Ferreira 1996) anti-inflamatoacuterios antimalaacuterico antiviral
(Fonseca 2003 Hussain 2007) atibacterianos e antifuacutengicos (Nagata 1998) Estas atividades
bioloacutegicas tecircm justificado o grande nuacutemero de trabalhos (aproximadamente 42 ateacute abril 2016
ndash Pubmed) encontrados na literatura que visa a siacutentese e avaliaccedilatildeo de qualquer das quinonas
naturais ou seus anaacutelogos como agentes farmacoloacutegicos potenciais (Rahmoun 2013)
10
O Lapachol foi descoberto e estudado desde o seacuteculo XIX Foi isolado primeiramente
do lenho da aacutervore argentina ldquolapachordquo Tabebuia avellanedae (Bignoniaceae) conhecida
como Ipecirc roxo Os estudos quiacutemicos foram desenvolvidos inicialmente em 1892 (Fonseca
2003) O lapachol foi descrito pela primeira vez por Paterno em 1821 tendo sua estrutura
quiacutemica estabelecida em 1896 por Hooker que o identificou como uma naftoquinona Esta
naftoquinona possui accedilatildeo antiinflamatoacuteria analgeacutesica antibioacutetica e anti-neoplaacutesica
reconhecida (Arauacutejo 2002)
A β-lapachona (34-di-hidro-22-dimetil-2H-naptho [12-b] pirano-56-diona) eacute uma
quinona obtida de fontes naturais derivada da aacutervore Lapacho (Tabebuia avellanedae) nativa
da Ameacuterica do Sul e Central A siacutentese e quiacutemica da β-lapachona e compostos relacionados
foi inicialmente investigado no final do seacuteculo XIX e iniacutecio do seacuteculo XX pelo quiacutemico
Samuel Hooker Apesar de alguns estudos cliacutenicos sobre a bioatividade de naftoquinonas
terem sido relatados no iniacutecio de 1940 foi o relatoacuterio do potencial da β-lapachona como um
agente anti-tripanossoma em 1977 que revitalizou o estudo e caracterizaccedilatildeo deste composto
natural A β-lapachona tambeacutem apresenta vaacuterias accedilotildees farmacoloacutegicas incluindo accedilatildeo
formaccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (Hussain 2007)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do Lapachol (1) da α- Lapachona (2) e da β-
Lapachona (Fonseca et al 2003 Ferreira et al 2010)
11
Figura 6 Tabebuia avellanedae (Hussain 2007)
A β-lapachona eacute uma substacircncia natural facilmente obtida a partir do lapachol Esta
naftoquinona eacute o grande destaque desta classe de substacircncias porque se encontra em testes
cliacutenicos de fase II para o tratamento do cacircncer de pacircncreas (Ferreira 2010) O mecanismo de
accedilatildeo da β-lapachona diferencia-se de outros antineoplaacutesicos por atuar na topoisomerase I
promovendo a recuperaccedilatildeo da capacidade de apoptose celular Alguns estudos reportam sua
accedilatildeo sineacutergica de potenciaccedilatildeo com o Taxolreg
promovendo a inibiccedilatildeo em diferentes pontos de
replicaccedilatildeo celular aleacutem de sua combinaccedilatildeo com outros tratamentos como a aplicaccedilatildeo de
radiaccedilatildeo ionizante (Cunha 2005)
Vaacuterios estudos jaacute foram publicados demonstrando a atividade antiviral de
naftoquinonas naturais e sinteacuteticas A β-lapachona inibe seletivamente a replicaccedilatildeo do viacuterus
HIV-1 atuando na inibiccedilatildeo da enzima LTR117 Da mesma forma este composto eacute um
potente inibidor da enzima transcriptase reversa dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e
leucemia murina de Rauscher (RLV) inibindo tambeacutem a DNA polimerase A accedilatildeo inibitoacuteria
sobre estas enzimas revelou-se especiacutefica se comparada com a de outros inibidores
conhecidos (Silva 2003)
O Lapachol jaacute demonstrou atividade contra certas cepas virais incluindo Herpes virus
tipos I e II Outras naftoquinonas jaacute mostraram eficaacutecia contra cepas de Influenza virus
Poliomielite virus e estomatite vesicular Supotildee-se que o mecanismo de accedilatildeo destas quinonas
seja atraveacutes da inibiccedilatildeo da transcriptase reversa de retroviacuterus e da RNA polimerase Eacute relatado
12
que lapachol diminui a replicaccedilatildeo do viacuterus em seres humanos mas ainda natildeo existem
resultados de testes cliacutenicos disponiacuteveis (Hussain 2007)
Na avaliaccedilatildeo da atividade antiviral do Lapachol in vitro verificou-se que esta
substacircncia eacute ativa contra viacuterus RNA atuando tanto sobre viacuterus envelopados quanto sobre
partiacuteculas sem esta estrutura em concentraccedilotildees de 5 a 10 microgmL e ainda apresentou uma
pequena atividade sobre HSV (Herpes simplex I) e Ad5 (Adeno tipo 5) mas nenhuma
atividade sobre CoxB4 (Coxsackie B4) Em trabalho posterior demonstrou-se que nem o
Lapachol nem diversos dos seus derivados apresentaram atividade antiviral in vitro sobre
Poliovirus tipo 1 Ecovirus 19 e Coxsackie B tipo 4 Apenas os derivados 12-naftoquinonicos
e um intermediaacuterio da siacutentese Hoocker foram ativos contra o Echovirus 19 (Fonseca 2003)
Costa et al (2013) relataram que piranonaftoquinonas isocircmeras do lapachol possuem
atividade de inibiccedilatildeo da replicaccedilatildeo de DENV-2 atuando sobre a atividade da ATPase de NS3
(proteiacutena natildeo estrutural de DENV)
A utilizaccedilatildeo de testes in vitro por meio de ensaios de viabilidade celular constitui o
primeiro passo para a avaliaccedilatildeo da compatibilidade bioloacutegica de uma substacircncia e pode
fornecer elementos importantes para a anaacutelise da biocompatibilidade dos diferentes materiais
Para ser considerado natildeo citotoacutexico no teste de citotoxicidade in vitro um produto natildeo deve
ocasionar a morte das ceacutelulas nem afetar suas funccedilotildees celulares A prova do MTT eacute um dos
indicadores colorimeacutetricos de viabilidade celular mais utilizados sendo capaz de avaliar a
funccedilatildeo celular mitocondrial de acordo com a reduccedilatildeo enzimaacutetica do sal de tetrazoacutelio pelas
desidrogenases mitocondriais nas ceacutelulas viaacutevies (Arauacutejo et al 2008) Supotildee-se que o
mecanismo responsaacutevel pela citotoxicidade apresentada pelas quinonas esteja relacionado
com o estresse oxidativo causado por esses compostos poreacutem a capacidade de alquilaccedilatildeo de
nucleoacutefilos celulares tambeacutem representa correlaccedilatildeo com tais efeitos bioloacutegicos (Goulart
2004)
13
II JUSTIFICATIVA
14
2 JUSTIFICATIVA
Aleacutem do controle do mosquito transmissor e do desenvolvimento de vacinas que tem
sido exaustivamente estudado nos uacuteltimos anos uma alternativa para o combate agrave dengue
seria o desenvolvimento de faacutermacos para reduzir a viremia ou mesmo para controlar a
resposta imune do hospedeiro agrave infecccedilatildeo que tem sido apontada como principal fator de risco
nos casos mais graves Em funccedilatildeo disso o nuacutemero de pesquisas visando o desenvolvimento
de drogas com accedilatildeo antiviral ou com accedilatildeo imunomodulatoacuteria tem aumentado
significativamente As naftoquinonas vecircm ganhando bastante importacircncia na pesquisa de
novas drogas antivirais devido agrave algumas atividades apresentadas A szlig-lapachona-orto-
naftoquinona por exemplo se mostrou um potente inibidor da enzima transcriptase reversa
dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e leucemia murina de Rauscher (RLV)
Diante da inexistecircncia de drogas com accedilatildeo anti DENV e o elevado nuacutemero e casos da
patogenia nos uacuteltimos anos a organizaccedilatildeo mundial da sauacutede classificou a Dengue como uma
epidemia de proporccedilotildees globais e um problema de sauacutede puacuteblica Como as naftoquinonas jaacute
demonstraram na literatura possuir um potencial efeito terapecircutico contra alguns viacuterus eacute
possiacutevel que estes compostos possam apresentar atividade antiviral contra DENV Portanto
este trabalho visou atraveacutes de ensaios de MTT e titulaccedilotildees virais em placa avaliar a potencial
atividade antiviral de oito compostos derivados de naftoquinonas naturais e sinteacuteticas
15
III OBJETIVOS
16
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar oito compostos (2 naturais e 6 sinteacuteticos) derivados de naftoquinonas como potenciais
agentes antivirais em ceacutelulas BHK-21 frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1 e 2
32 Objetivos especiacuteficos
1 Calcular o iacutendice de citotoxicidade e a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) dos compostos
atraveacutes de ensaio de reduccedilatildeo de MTT
2 Avaliar os efeitos dos compostos sobre o crescimento a viabilidade e o volume celular
pela teacutecnica de exclusatildeo do azul de tripan
3 Determinar a multiplicidade de infecccedilatildeo de DENV 1 e 2 a ser utilizada nos ensaios
antivirais
4 Avaliar a atividade antiviral dos compostos frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1
e 2 atraveacutes do ensaio de MTT
5 Verificar um possiacutevel efeito direto dos compostos agraves partiacuteculas virais de Dengue virus
6 Quantificar a produccedilatildeo de partiacuteculas virais infecciosas no sobrenadante de ceacutelulas
infectadas atraveacutes de titulaccedilatildeo viral pela contagem de unidades formadoras de placas
17
IV MATERIAL E MEacuteTODOS
18
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Linhagens celulares
411 Ceacutelulas C636
As ceacutelulas C636 satildeo ceacutelulas de linhagem contiacutenua de larvas de mosquito Aedes
albopictus Estas ceacutelulas foram utilizadas na produccedilatildeo de estoque viral de DENV sorotipos 1
e 2 para isso foram mantidas em meio de cultura Leibovitz-15 (L-15) (Cultilab)
suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (Cultilab) antibioacuteticos (Penicilina 100 UmL
Streptomicina 100 microgmL) e antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL) a 28degC
412 Ceacutelulas BHK-21
As ceacutelulas BHK-21 satildeo fibroblastos de linhagem contiacutenua derivados de rim de hamster
neonato Estas ceacutelulas foram utilizadas para os experimentos in vitro e para as titulaccedilotildees de
DENV 1 e 2 para isso foram mantidas em meio miacutenimo essencial modificado por Dulbecco
ndash DMEM (Cultilab) suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (SFB) com antibioacuteticos
(Penicilina 100 UmL Streptomicina 100 microgmL) e com antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL)
sendo mantidas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5
42 Viacuterus
421 DENV 1 e DENV 2
O Sorotipo 1 do Dengue virus (DENV-1) estirpe Mochizuki foi replicado em ceacutelulas
C636 para gerar estoques de trabalho durante 2 e 5 dias a 28degC O sobrenadante da cultura de
ceacutelulas infectadas foi recolhido e clarificado por centrifugaccedilatildeo a 4000 G durante 10 minutos agrave
4degC e entatildeo foi aliquotado e armazenado a -70 deg C como reserva de viacuterus ateacute agrave sua utilizaccedilatildeo
A replicaccedilatildeo geraccedilatildeo de estoque e titulaccedilatildeo do Sorotipo 2 do Dengue virus (DENV-2)
estirpe Nova Guineacute C ocorreu nos mesmos moldes do DENV-1
19
422 Titulaccedilatildeo viral
Os estoques virais foram diluiacutedos (10-1
a 10-7
) e inoculados em monocamadas de
ceacutelulas BHK-21 implantadas em placas de 6 poccedilos com confluecircncia de aproximadamente
60 (3x105 ceacutelulas por poccedilo) sendo um poccedilo natildeo infectado mantido para controle celular
Apoacutes uma hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus foram adicionados 3 mL de meio DMEM (Cultilab)
suplementado com 15 de SFB e contendo 15 de Carboximetilcelulose (CMC Synth) As
placas foram entatildeo incubadas a 37degC (CO2 a 5) por 96 horas As ceacutelulas foram entatildeo
fixadas com 2 mL de soluccedilatildeo de formol a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo
1 (pv) de cristal violeta em PBS para contagem das placas de lise O tiacutetulo viral foi
expresso atraveacutes do nuacutemero de unidades formadoras de placa por mL (UFPmL) segundo a
formula abaixo representada
Tiacutetulo viral (UFPmL) = N x FC x 10
N = nuacutemero de placas de lise contadas
FC = Fator de correccedilatildeo
= Inverso da diluiccedilatildeo na qual foram contadas as placas de lise
43 Compostos de naftoquinonas
Os compostos utilizados neste estudo foram fornecidos pelo Dr Geraldo Ceacutelio
Brandatildeo do laboratoacuterio de pesquisa da Escola de Farmaacutecia da Universidade Federal de Ouro
Preto
20
Tabela 1 Relaccedilatildeo de nome estrutura e coacutedigo dos compostos utilizados Na tabela estatildeo
presentes a relaccedilatildeo dos nomes dos compostos utilizados neste trabalho bem como sua
estrutura Os coacutedigos representantes de cada composto seratildeo utilizados no decorrer da escrita
Nome do composto Estrutura Coacutedigo
Lapachol
A1
β-lapachona
A2
2-Hidroxi-3-(ββ-dimetilvinil)-14-naftoquinona
A3
2-Cloro-14-naftoquinona
A4
Lapachol derivado 1
A5
Lapachol derivado 2 A6
Lapachol derivado 3 A7
Lapachol derivado 4 A8
44 Ensaio de citotoxicidade
Para avaliar a citotoxicidade dos compostos ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas foram incubadas com diferentes concentraccedilotildees dos compostos em triplicata num
volume de 200 microL de meio de cultura por poccedilo na presenccedila de 1 de SFB Os controles natildeo
tratados apresentaram adiccedilatildeo de 200 microL de meio de cultura As ceacutelulas foram entatildeo incubadas
durante 72 horas O meio foi removido e 28 microL de soluccedilatildeo de 5 mg mL MTT (brometo de 3-
21
[45-dimetil-tiazol-2-il]-25 difeniltertrazoacutelio) foi adicionado a cada poccedilo As placas foram re-
incubadas durante 1 hora e 30 minutos e entatildeo 122 microL de DMSO foi adicionado a cada poccedilo e
placas foram agitadas suavemente durante 15 minutos para dissolver os cristais de formazan
A absorbacircncia foi lida em um equipamento leitor de placas Victor X3 (PerkinElmer) a 490
nm A concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC 50) foi definida como a concentraccedilatildeo da amostra que
reduziu a viabilidade celular de 50 em comparaccedilatildeo com controles natildeo tratados Os dados
foram analisados utilizando o programa Prisma
45 Avaliaccedilatildeo da viabilidade e crescimento celular por exclusatildeo de azul de tripan
Ceacutelulas BHK-21 foram cultivadas em placas de 24 poccedilos (7x104 ceacutelulaspoccedilo) e apoacutes
24 horas foram tratadas com as concentraccedilotildees de uso de cada composto e incubadas por 72
horas na presenccedila de 1 de SFB A seguir as ceacutelulas foram tripsinizadas e incubadas com
azul de tripan e entatildeo foi utilizado um contador automatizado de ceacutelulas (Countess II FL
Automated Cell Counter ndash Thermo Fisher Scientific) para contagem das ceacutelulas e avaliaccedilatildeo da
porcentagem de viabilidade e diacircmetro celular do controle nos tempos de 0 24 e 96 horas e
avaliaccedilatildeo dos mesmos paracircmetros para os compostos no tempo de 96 horas (72 horas poacutes
tratamento)
Outra curva de multiplicaccedilatildeo celular foi feita para os compostos A1 A3 A4 e A5 onde as
ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos no momento da confecccedilatildeo da placa e
foram avaliados os mesmos paracircmetros nos tempos de 0 12 24 48 e 72 horas O
equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
46 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
Para determinar a menor Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) responsaacutevel pela letalidade
celular total 2x104 de ceacutelulas BHK-21 foram semeadas em placa de 96 poccedilos Apoacutes a
incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o
meio de cultura foi removido e as ceacutelulas foram expostas a diferentes diluiccedilotildees dos dois
sorotipos de DENV (100 microL de cada diluiccedilatildeo + 100 microL de meio DEMEM 1 SFB) As
diluiccedilotildees seriadas foram realizadas da suspensatildeo viral na razatildeo de 5 para o primeiro poccedilo e de
2 para os demais poccedilos Apoacutes 72 horas as ceacutelulas foram entatildeo fixadas com 200 microL de soluccedilatildeo
22
formalina a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo 1 (pv) de cristal violeta em
PBS para avaliaccedilatildeo da maior diluiccedilatildeo responsaacutevel pela letalidade de 100 das ceacutelulas
47 Ensaio Dose-resposta
Para cada composto foram realizados ensaios de dose-resposta para definiccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de cada composto capaz de promover a reduccedilatildeo na produccedilatildeo viral A atividade
antiviral foi avaliada tambeacutem pelo meacutetodo de MTT Ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas expostas a diferentes concentraccedilotildees dos extratos determinadas a partir das maiores
concentraccedilotildees em que natildeo foram observados efeitos citotoacutexicos As ceacutelulas foram tratadas
com as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de cada composto e em seguida infectadas com DENV
1 (MOI= 5) ou 2 (MOI= 2) Mantendo uma coluna para controle com DMSO uma coluna
para controle de viacuterus uma coluna para controle de citotoxicidade dos compostos e por fim
uma coluna para controle celular As ceacutelulas foram entatildeo incubadas durante 72 horas Apoacutes
este tempo procedeu-se a leitura pelo ensaio de MTT como descrito anteriormente Os dados
foram analisados levando-se em consideraccedilatildeo a leitura das absorbacircncias dos poccedilos dos
controles de viacuterus e do controle celular
Para realizacao destes experimentos os seguintes controles foram adotados
Controle de ceacutelulas poccedilos contendo somente ceacutelulas acrescidas do meio de cultura DMEM
1 SFB Utilizado para avaliar o comportamento das ceacutelulas sem que as mesmas tivessem
contato com qualquer interferente durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo Com isso os poccedilos
reservados para esse controle serviram de padratildeo para comparaccedilatildeo com aqueles em que fosse
observada atividade citotoacutexica ou citopaacutetica
Controle de viacuterus poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM 1 SFB
sem nenhum tratamento e de suspensatildeo de viacuterus Utilizando como referecircncia para anaacutelise da
atividade citopaacutetica provocada pelo viacuterus testado durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo das placas
23
Controle de viacuterus com DMSO Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura
DMEM 1 SFB e DMSO Foi utilizado para avaliar se havia influecircncia prejudicial do
solvente utilizado para diluiccedilatildeo das amostras no meio de cultivo das ceacutelulas e se o mesmo
poderia apresentar alguma potencial atividade antiviral aparente
Controle de citotoxicidade Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM
1 SFB e as quatro principais concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos Foi utilizado
para avaliar se haveria alguma possiacutevel atividade citotoacutexica das concentraccedilotildees dos compostos
em relaccedilatildeo agraves ceacutelulas
48 Ensaio Virucida
Para a realizaccedilatildeo deste ensaio aliacutequotas de 950 microL (diluiccedilatildeo de 20 vezes) do DENV 1 (tiacutetulo
6 x 107 UFPmL) foram incubadas com 50 microL de uma soluccedilatildeo de meio DMEM preparada
com 20x a concentraccedilatildeo natildeo citotoacutexica de cada composto A1 a A8 em banho-maria 37deg C
por 1 hora Apoacutes a incubaccedilatildeo as aliacutequotas foram imediatamente tituladas em ceacutelulas BHK-21
em placas de 6 poccedilos utilizando-se 3 diluiccedilotildees para cada incubaccedilatildeo (20x 20 x 10-1
e 20 x 10-
2) Foram titulados tambeacutem uma aliacutequota incubada apenas com meio DMEM sem nenhum
tratamento e outra aliacutequota incubada com DMSO (Dimetilsulfoacutexido) Estas foram tituladas
utilizando um controle e mais cinco diluiccedilotildees (20x 20 x 10-1
20 x 10-2
20 x 10-3
e 20 x 10-4
)
49 Ensaio antiviral
Neste ensaio ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em placas de 24 poccedilos no dia
seguinte foram tratadas durante 4 horas com as concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas de cada
composto em duplicata Apoacutes o preacute-tratamento as monocamadas foram infectadas com
DENV-1 a uma MOI=5 na presenccedila das concentraccedilotildees de uso respectivas de cada composto
Apoacutes 1 hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus as monocamadas foram lavadas duas vezes com PBS e
foi adicionado 500 microL por poccedilo de meio preparado com as mesmas concentraccedilotildees dos
diferentes compostos e mantidos durante 48 horas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5 Em
quatro poccedilos as ceacutelulas foram infectadas e natildeo tratadas e em outros quatro poccedilos as ceacutelulas
natildeo foram tratadas e nem infectadas (controle de ceacutelulas) destes uacuteltimos dois foram
tripsinizados e contados no momento da infecccedilatildeo e os outros dois apoacutes o teacutermino do ensaio
24
para avaliar o crescimento celular Decorridas as 48 horas o sobrenadante foi coletado e
centrifugado por 10 minutos a 4000 xG para separaccedilatildeo dos debris celulares e prontamente
titulado em placa de 6 poccedilos
410 Anaacutelise estatiacutestica
Os valores de CC50 foram obtidos a partir de anaacutelise de regressatildeo linear das curvas de
concentraccedilatildeocitotoxicidade A anaacutelise estatiacutestica dos dados foi realizada pelo programa
GraphPad Prism software Uma anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi utilizada para determinar
as diferenccedilas estatiacutesticas seguida do poacutes teste de Tukey A significacircncia estatiacutestica foi fixada
em p lt005
25
V RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
26
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Ensaio de citotoxicidade celular
Para avaliar a viabilidade da linhagem celular BHK-21 frente ao tratamento com oito
diferentes concentraccedilotildees dos compostos (A1 a A8) realizou-se um ensaio de MTT (brometo
de 3-[45-dimetil-tiazol-2-il]-25-difeniltetrazoacutelio) Este ensaio tem o objetivo de quantificar
espectrofotometricamente o crescimento celular a viabilidade e proliferaccedilatildeo podendo ser
utilizado como um indicador direto de citotoxicidade Trata-se de um ensaio colorimeacutetrico
para medir a atividade da redutase mitocondrial em ceacutelulas vivas Ele se baseia na reduccedilatildeo do
sal amarelo tetrazoacutelio (permeaacutevel agrave membrana celular) para cristais de formazan azuis
puacuterpura por ceacutelulas metabolicamente ativas a quantidade de formazan gerada medida por
espectrofotometria eacute proporcional ao nuacutemero de ceacutelulas viaacuteveis
A CC50 foi calculada plotando-se uma curva de porcentagem de viabilidade celular por
concentraccedilatildeo melhor representada na figura 7 pelo composto A7 e os resultados de CC50
para todos os compostos estatildeo representados na tabela 2 Foram feitos ensaios de
citotoxicidade com oito concentraccedilotildees diferentes sendo escolhida a maior concentraccedilatildeo que
natildeo apresentou citotoxicidade
Viabilidade Celular = [ ( A ndash B ) A ] x 100
Onde
A = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas natildeo tratadas
B = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas tratadas com
as respectivas concentraccedilotildees de cada composto
27
28
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (A curva dose resposta do composto A7 eacute a que
melhor representa a curva dose resposta esperada) Avaliou-se a viabilidade da linhagem
celular BHK-21 frente agrave diferentes concentraccedilotildees dos compostos realizando o ensaio de MTT
e determinando assim as concentraccedilotildees a serem utilizadas nos proacuteximos ensaios bem como
calculando a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) agrave partir da curva
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo
da concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50)
Composto Concentraccedilatildeo utilizada
[ ] microgmL
Concentraccedilatildeo citotoacutexica 50
(CC50) [ ] microgmL plusmn Desvio
Padratildeo
A1 ([ ]=1 mgmL) 00200 10010 plusmn 0014
A2 ([ ]=1 mgmL) 00025 09561 plusmn 0023
A3 ([ ]=1 mgmL) 00025 09988 plusmn 0017
A4 ([ ]=5 mgmL) 00125 10150 plusmn 0036
A5 ([ ]=10 mgmL) 00250 10590 plusmn 0047
A6 ([ ]=5 mgmL) 00250 08183 plusmn 0030
A7 ([ ]=5 mgmL) 00125 10280 plusmn 0052
A8 ([ ]=5 mgmL) 00125 09758 plusmn 0036
52 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan
Para corroborar o ensaio anterior de citotoxicidade utilizou -se o teste de viabilidade
celular pela teacutecnica da exclusatildeo do azul de tripan com a finalidade de determinar a
viabilidade das ceacutelulas Os procedimentos adotados no ensaio seguiram o manual do
equipamento contador automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL Automated Cell Counter) entatildeo
foi acrescentado agrave 10 microL da suspensatildeo celular 10 microL de azul de tripan (04) Apoacutes
homogeneizaccedilatildeo 10 microL da suspensatildeo foi colocada no local indicado da lacircmina proacutepria para
leitura e foi realizada a contagem sendo consideradas mortas (inviaacuteveis) as ceacutelulas que
incorporavam o corante e viaacuteveis as que excluiacuteam o azul de tripan
29
O equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
(A)
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan A avaliaccedilatildeo da
viabilidade celular foi realizada atraveacutes de um contador automaacutetico de ceacutelulas Este
equipamento possibilita explorar ferramentas de fotografia e avaliar alguns paracircmetros
importantes (A) fotografia das ceacutelulas (B) Zoom na fotografia das ceacutelulas com marcaccedilotildees
(em verde para ceacutelulas vivas e vermelho para mortas) e (D) contagem das ceacutelulas totais
ceacutelulas vivas e mortas graacutefico e meacutedia dos diacircmetros celulares das ceacutelulas vivas e mortas
(B)
(C)
30
O crescimento celular de ceacutelulas natildeo tratadas foi avaliado nos tempos de 0h (momento
da confecccedilatildeo da placa) 24h (momento de tratamento com os compostos) e 96 horas
(Momento em que todas as ceacutelulas foram tripsinizadas e contadas) para avaliar o perfil do
crescimento celular em ceacutelulas natildeo tratadas Foi observado um crescimento celular no periacuteodo
de 24 horas onde as ceacutelulas estavam incubadas com meio acrescido de 10 SFB Em 24
horas o meio foi trocado por 1 SFB e acrescido das substacircncias testes nas menores diluiccedilotildees
natildeo citotoacutexicas determinadas pelo ensaio do MTT Em 96 horas pode ser observado um
decaimento no nuacutemero de ceacutelulas vivas provavelmente devido ao crescimento celular (morte
por confluecircncia)
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas)
(A) (B)
31
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas (A)
Contagem de ceacutelulas vivas (B) Percentual de ceacutelulas viaacuteveis (Viabilidade celular ) e (C)
Meacutedia do diacircmetro apresentado pelas ceacutelulas vivas
Em 96 horas as ceacutelulas natildeo tratadas bem como as ceacutelulas tratadas por 72 horas com as
concentraccedilotildees de uso dos compostos foram tripsinizadas e avaliadas quanto ao nuacutemero de
ceacutelulas vivas viabilidade e diacircmetro celular apresentados na figura 10
Segundo se observa natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo aparente que possa demonstrar que
as concentraccedilotildees de uso dos compostos tenham causado alguma atividade citotoacutexica
corroborando assim os ensaios de citotoxicidade anteriores
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
A infectividade de um viacuterus depende de vaacuterios fatores entre eles da proporccedilatildeo de
partiacuteculas virais completas ou infecciosas da suscetibilidade da ceacutelula hospedeira e da
chance desta partiacutecula encontrar o receptor e penetrar na ceacutelula Quando ceacutelulas suscetiacuteveis
satildeo misturadas com uma suspensatildeo de viacuterus estas podem receber uma duas trecircs ou dez
partiacuteculas virais ou nenhuma Isto depende da proporccedilatildeo entre a quantidade de viacuterus
infecciosos presente no inoculo e a quantidade de ceacutelulas utilizada Esta relaccedilatildeo eacute denominada
de multiplicidade de infecccedilatildeo ou MOI Uma MOI=1 indica que a infecccedilatildeo foi feita em
principio com 1 viacuterus ou 1 dose infectante por ceacutelula
A determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo dos Dengue virus 1 e 2 a serem
utilizadas nos proacuteximos ensaios foi feita a partir da infecccedilatildeo de ceacutelulas BHK-21 por diferentes
(C)
32
concentraccedilotildees de viacuterus e revelaccedilatildeo com cristal violeta Escolheu-se a maior diluiccedilatildeo viral que
possibilitou a letalidade total das ceacutelulas (faixa onde todas as ceacutelulas estatildeo mortas utilizando
menor concentraccedilatildeo de viacuterus) As faixas escolhidas foram entatildeo calculadas levando-se em
consideraccedilatildeo o nuacutemero de ceacutelulas presentes no poccedilo e o nuacutemero de partiacuteculas virais que foram
adicionadas (Faixa3 para DENV2 e 2 para DENV1) Figura 11 Foi estipulado portanto a
Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 2 para DENV 2 e 5 para DENV 1
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI A partir da infecccedilatildeo da linhagem celular BHK-21 em
placa de 96 poccedilos com diferentes diluiccedilotildees de DENV foi determinado que a Multiplicidade
de infecccedilatildeo para o Dengue viacuterus sorotipos 1 e 2 seria de 5 e 2 respectivamente (colunas 2 -
DENV1 e 3 - DENV2)
54 Ensaio dose resposta
Apoacutes a determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas ideais realizou-se um
ensaio dose resposta tratando as ceacutelulas com oito concentraccedilotildees agrave partir das concentraccedilotildees natildeo
citotoacutexicas escolhidas para cada composto e em seguida infectando com DENV sorotipos 1 e
2 nas MOIs estipuladas anteriormente (5 e 2 respectivamente) A porcentagem do efeito
protetor conferida agraves ceacutelulas para cada concentraccedilatildeo de amostra testada foi calculada da
seguinte forma
33
EP = [ (A ndash B) (C ndash B) ] x 100
Onde
A Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas tratadas e infectadas
B Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e infectadas
C Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e natildeo infectadas
Este ensaio tem por objetivo identificar a resposta celular agrave infecccedilatildeo frente ao
tratamento com os compostos em diferentes concentraccedilotildees Assim como o ensaio de
toxicidade este ensaio feito utilizando a teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT permite o teste de vaacuterias
concentraccedilotildees diferentes em um menor tempo e com baixo gasto de material
34
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV1
(MOI=5)
35
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV2
(MOI=2)
36
Takegami et al (1998) demonstraram atividade de furanonaftoquinonas contra o viacuterus
da Encefalite Japonesa (Flavivirus) utilizando a concentraccedilatildeo de 3microgmL poreacutem para os
compostos apresentados avaliados pela teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT nenhuma das
concentraccedilotildees apresentadas produziu efeito antiviral significativo em relaccedilatildeo ao controle
celular como observado nas figuras 12 e 13
Apesar da teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT ser interessante como triagem de atividade
antiviral permitindo o teste de vaacuterias concentraccedilotildees dos compostos em menor tempo e
utilizando uma quantidade razoaacutevel de materiais optou-se por utilizar as maiores
concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas encontradas avaliando sua atividade antiviral por outras
teacutecnicas Como natildeo foi avaliada atividade antiviral preacutevia para nenhum dos compostos frente
agrave infecccedilatildeo por DENV1 e 2 foi selecionado o Dengue virus 1 para dar prosseguimento aos
ensaios
55 Ensaio Virucida
O ensaio virucida foi realizado para avaliar um potencial efeito dos compostos
diretamente sobre a partiacutecula viral Este ensaio eacute importante pois possibilita elucidar se o
composto pode produzir algum efeito sobre a partiacutecula viral impedindo que esta possa infectar
as ceacutelulas
Figura 14 Ensaio virucida Neste ensaio as aliacutequotas de DENV1 foram incubadas com as
concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos e titulados (NT) Controle natildeo tratado
37
Tabela 3 Ensaio virucida Caacutelculo do tiacutetulo viral (UFPmL) e porcentagem representante de
cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 254 x 105 100
DMSO 263 x 105 10335
A1 199 x 105 7835
A2 205 x 105 8071
A3 237 x 105 9311
A4 775 x 104 3049
A5 153 x 105 6024
A6 219 x 105 8602
A7 243 x 105 9547
A8 254 x 105 100
Lagrota et al (1988) demonstraram atividade de 2-HO-3-N-benzil-N(N-benzil-2-
etilamina) -14-naftoquinona sobre a partiacutecula viral de enterovirus De forma contraacuteria apesar
de se verificar a reduccedilatildeo de quase uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais
para o composto A4 natildeo considerou-se esta uma alteraccedilatildeo significativa pois devido agrave
magnitude do nuacutemero de UFPs se trata de uma alteraccedilatildeo muito pequena Portanto os
compostos avaliados neste trabalho natildeo produziram atividade virucida aparente frente ao
tratamento com as concentraccedilotildees de uso
56 Ensaio Antiviral
O sobrenadante de ceacutelulas tratadas previamente e infectadas por DENV1 coletado 48
horas poacutes infecccedilatildeo foi avaliado quanto agrave produccedilatildeo viral de partiacuteculas infecciosas pela
contagem de placas de lise e caacutelculo de Unidades Formadoras de Placa (Titulaccedilatildeo viral em
placa ndash UFPmL)
38
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral Sobrenadante de ceacutelulas tratadas e infectadas por DENV1
coletado apoacutes 48 horas e titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado
Tabela 4 Ensaio Antiviral Coleta do sobrenadante de ceacutelulas infectadas por DENV1 Tiacutetulo
viral (UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o
controle natildeo tratado como 100
Ao perceber um aumento no tiacutetulo viral frente ao tratamento com os compostos A1
A2 e A3 e uma reduccedilatildeo frente ao tratamento com A4 A5 e A6 foram escolhidos dois
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 119 x 105 10000
A1 235 x 105 19748
A2 228 x 105 19160
A3 318 x 105 26723
A4 128 x 104 1076
A5 186 x 103 156
A6 190 x 104 1597
A7 280 x 104 2353
A8 350 x 104 2941
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
40
Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
8
dengue (dengue hemorraacutegica) com risco de vida grave O tratamento eacute amplamente favoraacutevel
usando de reidrataccedilatildeo oral ou intravenosa acompanhamento e atenccedilatildeo meacutedica adequada No
entanto uma das principais consequecircncias da doenccedila eacute a sua capacidade de sobrecarregar
instalaccedilotildees meacutedicas durante um surto e em paiacuteses onde os recursos de sauacutede jaacute estatildeo no
limite isso pode ter efeitos catastroacuteficos Prevenccedilatildeo e tratamento portanto se fazem
altamente necessaacuterios (Perry 2011)
A prevalecircncia global de DENV cresceu drasticamente nas uacuteltimas deacutecadas e ateacute o
momento natildeo haacute nenhum medicamento especiacutefico para combater a infecccedilatildeo as medidas de
prevenccedilatildeo mais eficazes satildeo voltadas para o controle do vetor (Silva 2011) Diante disso a
Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) elegeu o desenvolvimento de vacinas contra o viacuterus da
dengue como prioridade mundial (Kinney 2001) Por conseguinte a busca de substacircncias
naturais ou sinteacuteticas com atividade antiviral especiacutefica sem toxicidade para as ceacutelulas
normais em seres humanos eacute uma estrateacutegia desejada para evitar que a dengue se agrave e
ajudar a controlar a difusatildeo da doenccedila As vaacuterias fases do ciclo viral representam alvos
terapecircuticos individuais que podem ser exploradas (Costa 2013) Nesse sentido vaacuterios
grupos de pesquisa e organizaccedilotildees estatildeo trabalhando com diversas abordagens para o
desenvolvimento de compostos antivirais com atividade protetora contra dengue Dentre elas
uma vasta gama de produtos naturais incluindo plantas numa tentativa de isolar e
caracterizar novos compostos que podem inibir a replicaccedilatildeo do viacuterus ou tratar a infecccedilatildeo
viral Por essa razatildeo extratos e componentes da planta satildeo cada vez mais importantes como
fontes potenciais para agentes antivirais (Silva 2011)
14 Naftoquinonas
As quinonas satildeo compostos aromaacuteticos amplamente distribuiacutedos na natureza e podem
ser encontrados em vaacuterias famiacutelias de plantas bem como isolado de fungos algas e
bacteacuterias Elas satildeo classificadas em benzoquinonas antraquinonas e naftoquinonas de acordo
com as suas estruturas quiacutemicas Naftoquinonas satildeo compostos orgacircnicos altamente reativos
utilizados como corantes naturais ou sinteacuteticos cujas cores variam de amarelo para vermelho
Apresentam cadeia carbocircnica similar ao naftaleno e satildeo caracterizadas por seus dois grupos
carbonila na posiccedilatildeo 1 e 4 por isso satildeo nomeadas de 14-naftoquinonas Os grupos carbonila
tambeacutem podem estar presente na posiccedilatildeo 12 com menor incidecircncia (Loacutepez 2014)
9
Figura 4 Estrutura quiacutemica da 12-naftoquinona (1) e 14-naftoquinona (2)
Entre as quinonas estatildeo compostos biologicamente importantes tais como o grupo da
vitamina K e a coenzima Q (ubiquinona) Estes compostos tecircm um papel importante no
metabolismo celular especialmente como carreadores de eleacutetrons Aleacutem de quinonas que
possuam uma funccedilatildeo bioloacutegica outros compostos desta classe tecircm sido encontrados
mostrando atividade antibioacutetica Alguns deles estatildeo presentes na natureza mas a maior parte
satildeo obtidos sinteticamente entre eles 2-hidroxi-3-alquil-14-naftoquinonas que possuem
evidecircncias de serem ativos in vitro contra os parasitas da malaacuteria e como coccidiostaacuteticos
(Ambrogi 1970)
A atividade bioloacutegica de quinonas estaacute muitas vezes relacionada com o seu
comportamento eletroquiacutemico A capacidade de aceitar um ou dois eleacutetrons para formar o
acircnion radical correspondente ou dianion pode ser o motivo da induccedilatildeo da formaccedilatildeo de
espeacutecies reativas de oxigecircnio responsaacuteveis pelo estresse oxidativo nas ceacutelulas A capacidade
de aceitar eleacutetrons de naftoquinonas pode ser alterada por mudanccedilas de posiccedilatildeo do grupo
carbonila (12- 14-naftoquinonas) ou diferentes substituintes ou funccedilotildees associadas agrave porccedilatildeo
de naftoquinona (Francisco 2010)
As naftoquinonas satildeo largamente encontradas em plantas micro-organismos e alguns
animais Estes compostos tecircm sido amplamente utilizados em diversas culturas como corantes
para cosmeacuteticos tecidos alimentos (Brandelli 2004) e para fins medicinais incluindo
antitumoral (Oliveira 1990 Ferreira 1996) anti-inflamatoacuterios antimalaacuterico antiviral
(Fonseca 2003 Hussain 2007) atibacterianos e antifuacutengicos (Nagata 1998) Estas atividades
bioloacutegicas tecircm justificado o grande nuacutemero de trabalhos (aproximadamente 42 ateacute abril 2016
ndash Pubmed) encontrados na literatura que visa a siacutentese e avaliaccedilatildeo de qualquer das quinonas
naturais ou seus anaacutelogos como agentes farmacoloacutegicos potenciais (Rahmoun 2013)
10
O Lapachol foi descoberto e estudado desde o seacuteculo XIX Foi isolado primeiramente
do lenho da aacutervore argentina ldquolapachordquo Tabebuia avellanedae (Bignoniaceae) conhecida
como Ipecirc roxo Os estudos quiacutemicos foram desenvolvidos inicialmente em 1892 (Fonseca
2003) O lapachol foi descrito pela primeira vez por Paterno em 1821 tendo sua estrutura
quiacutemica estabelecida em 1896 por Hooker que o identificou como uma naftoquinona Esta
naftoquinona possui accedilatildeo antiinflamatoacuteria analgeacutesica antibioacutetica e anti-neoplaacutesica
reconhecida (Arauacutejo 2002)
A β-lapachona (34-di-hidro-22-dimetil-2H-naptho [12-b] pirano-56-diona) eacute uma
quinona obtida de fontes naturais derivada da aacutervore Lapacho (Tabebuia avellanedae) nativa
da Ameacuterica do Sul e Central A siacutentese e quiacutemica da β-lapachona e compostos relacionados
foi inicialmente investigado no final do seacuteculo XIX e iniacutecio do seacuteculo XX pelo quiacutemico
Samuel Hooker Apesar de alguns estudos cliacutenicos sobre a bioatividade de naftoquinonas
terem sido relatados no iniacutecio de 1940 foi o relatoacuterio do potencial da β-lapachona como um
agente anti-tripanossoma em 1977 que revitalizou o estudo e caracterizaccedilatildeo deste composto
natural A β-lapachona tambeacutem apresenta vaacuterias accedilotildees farmacoloacutegicas incluindo accedilatildeo
formaccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (Hussain 2007)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do Lapachol (1) da α- Lapachona (2) e da β-
Lapachona (Fonseca et al 2003 Ferreira et al 2010)
11
Figura 6 Tabebuia avellanedae (Hussain 2007)
A β-lapachona eacute uma substacircncia natural facilmente obtida a partir do lapachol Esta
naftoquinona eacute o grande destaque desta classe de substacircncias porque se encontra em testes
cliacutenicos de fase II para o tratamento do cacircncer de pacircncreas (Ferreira 2010) O mecanismo de
accedilatildeo da β-lapachona diferencia-se de outros antineoplaacutesicos por atuar na topoisomerase I
promovendo a recuperaccedilatildeo da capacidade de apoptose celular Alguns estudos reportam sua
accedilatildeo sineacutergica de potenciaccedilatildeo com o Taxolreg
promovendo a inibiccedilatildeo em diferentes pontos de
replicaccedilatildeo celular aleacutem de sua combinaccedilatildeo com outros tratamentos como a aplicaccedilatildeo de
radiaccedilatildeo ionizante (Cunha 2005)
Vaacuterios estudos jaacute foram publicados demonstrando a atividade antiviral de
naftoquinonas naturais e sinteacuteticas A β-lapachona inibe seletivamente a replicaccedilatildeo do viacuterus
HIV-1 atuando na inibiccedilatildeo da enzima LTR117 Da mesma forma este composto eacute um
potente inibidor da enzima transcriptase reversa dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e
leucemia murina de Rauscher (RLV) inibindo tambeacutem a DNA polimerase A accedilatildeo inibitoacuteria
sobre estas enzimas revelou-se especiacutefica se comparada com a de outros inibidores
conhecidos (Silva 2003)
O Lapachol jaacute demonstrou atividade contra certas cepas virais incluindo Herpes virus
tipos I e II Outras naftoquinonas jaacute mostraram eficaacutecia contra cepas de Influenza virus
Poliomielite virus e estomatite vesicular Supotildee-se que o mecanismo de accedilatildeo destas quinonas
seja atraveacutes da inibiccedilatildeo da transcriptase reversa de retroviacuterus e da RNA polimerase Eacute relatado
12
que lapachol diminui a replicaccedilatildeo do viacuterus em seres humanos mas ainda natildeo existem
resultados de testes cliacutenicos disponiacuteveis (Hussain 2007)
Na avaliaccedilatildeo da atividade antiviral do Lapachol in vitro verificou-se que esta
substacircncia eacute ativa contra viacuterus RNA atuando tanto sobre viacuterus envelopados quanto sobre
partiacuteculas sem esta estrutura em concentraccedilotildees de 5 a 10 microgmL e ainda apresentou uma
pequena atividade sobre HSV (Herpes simplex I) e Ad5 (Adeno tipo 5) mas nenhuma
atividade sobre CoxB4 (Coxsackie B4) Em trabalho posterior demonstrou-se que nem o
Lapachol nem diversos dos seus derivados apresentaram atividade antiviral in vitro sobre
Poliovirus tipo 1 Ecovirus 19 e Coxsackie B tipo 4 Apenas os derivados 12-naftoquinonicos
e um intermediaacuterio da siacutentese Hoocker foram ativos contra o Echovirus 19 (Fonseca 2003)
Costa et al (2013) relataram que piranonaftoquinonas isocircmeras do lapachol possuem
atividade de inibiccedilatildeo da replicaccedilatildeo de DENV-2 atuando sobre a atividade da ATPase de NS3
(proteiacutena natildeo estrutural de DENV)
A utilizaccedilatildeo de testes in vitro por meio de ensaios de viabilidade celular constitui o
primeiro passo para a avaliaccedilatildeo da compatibilidade bioloacutegica de uma substacircncia e pode
fornecer elementos importantes para a anaacutelise da biocompatibilidade dos diferentes materiais
Para ser considerado natildeo citotoacutexico no teste de citotoxicidade in vitro um produto natildeo deve
ocasionar a morte das ceacutelulas nem afetar suas funccedilotildees celulares A prova do MTT eacute um dos
indicadores colorimeacutetricos de viabilidade celular mais utilizados sendo capaz de avaliar a
funccedilatildeo celular mitocondrial de acordo com a reduccedilatildeo enzimaacutetica do sal de tetrazoacutelio pelas
desidrogenases mitocondriais nas ceacutelulas viaacutevies (Arauacutejo et al 2008) Supotildee-se que o
mecanismo responsaacutevel pela citotoxicidade apresentada pelas quinonas esteja relacionado
com o estresse oxidativo causado por esses compostos poreacutem a capacidade de alquilaccedilatildeo de
nucleoacutefilos celulares tambeacutem representa correlaccedilatildeo com tais efeitos bioloacutegicos (Goulart
2004)
13
II JUSTIFICATIVA
14
2 JUSTIFICATIVA
Aleacutem do controle do mosquito transmissor e do desenvolvimento de vacinas que tem
sido exaustivamente estudado nos uacuteltimos anos uma alternativa para o combate agrave dengue
seria o desenvolvimento de faacutermacos para reduzir a viremia ou mesmo para controlar a
resposta imune do hospedeiro agrave infecccedilatildeo que tem sido apontada como principal fator de risco
nos casos mais graves Em funccedilatildeo disso o nuacutemero de pesquisas visando o desenvolvimento
de drogas com accedilatildeo antiviral ou com accedilatildeo imunomodulatoacuteria tem aumentado
significativamente As naftoquinonas vecircm ganhando bastante importacircncia na pesquisa de
novas drogas antivirais devido agrave algumas atividades apresentadas A szlig-lapachona-orto-
naftoquinona por exemplo se mostrou um potente inibidor da enzima transcriptase reversa
dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e leucemia murina de Rauscher (RLV)
Diante da inexistecircncia de drogas com accedilatildeo anti DENV e o elevado nuacutemero e casos da
patogenia nos uacuteltimos anos a organizaccedilatildeo mundial da sauacutede classificou a Dengue como uma
epidemia de proporccedilotildees globais e um problema de sauacutede puacuteblica Como as naftoquinonas jaacute
demonstraram na literatura possuir um potencial efeito terapecircutico contra alguns viacuterus eacute
possiacutevel que estes compostos possam apresentar atividade antiviral contra DENV Portanto
este trabalho visou atraveacutes de ensaios de MTT e titulaccedilotildees virais em placa avaliar a potencial
atividade antiviral de oito compostos derivados de naftoquinonas naturais e sinteacuteticas
15
III OBJETIVOS
16
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar oito compostos (2 naturais e 6 sinteacuteticos) derivados de naftoquinonas como potenciais
agentes antivirais em ceacutelulas BHK-21 frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1 e 2
32 Objetivos especiacuteficos
1 Calcular o iacutendice de citotoxicidade e a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) dos compostos
atraveacutes de ensaio de reduccedilatildeo de MTT
2 Avaliar os efeitos dos compostos sobre o crescimento a viabilidade e o volume celular
pela teacutecnica de exclusatildeo do azul de tripan
3 Determinar a multiplicidade de infecccedilatildeo de DENV 1 e 2 a ser utilizada nos ensaios
antivirais
4 Avaliar a atividade antiviral dos compostos frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1
e 2 atraveacutes do ensaio de MTT
5 Verificar um possiacutevel efeito direto dos compostos agraves partiacuteculas virais de Dengue virus
6 Quantificar a produccedilatildeo de partiacuteculas virais infecciosas no sobrenadante de ceacutelulas
infectadas atraveacutes de titulaccedilatildeo viral pela contagem de unidades formadoras de placas
17
IV MATERIAL E MEacuteTODOS
18
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Linhagens celulares
411 Ceacutelulas C636
As ceacutelulas C636 satildeo ceacutelulas de linhagem contiacutenua de larvas de mosquito Aedes
albopictus Estas ceacutelulas foram utilizadas na produccedilatildeo de estoque viral de DENV sorotipos 1
e 2 para isso foram mantidas em meio de cultura Leibovitz-15 (L-15) (Cultilab)
suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (Cultilab) antibioacuteticos (Penicilina 100 UmL
Streptomicina 100 microgmL) e antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL) a 28degC
412 Ceacutelulas BHK-21
As ceacutelulas BHK-21 satildeo fibroblastos de linhagem contiacutenua derivados de rim de hamster
neonato Estas ceacutelulas foram utilizadas para os experimentos in vitro e para as titulaccedilotildees de
DENV 1 e 2 para isso foram mantidas em meio miacutenimo essencial modificado por Dulbecco
ndash DMEM (Cultilab) suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (SFB) com antibioacuteticos
(Penicilina 100 UmL Streptomicina 100 microgmL) e com antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL)
sendo mantidas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5
42 Viacuterus
421 DENV 1 e DENV 2
O Sorotipo 1 do Dengue virus (DENV-1) estirpe Mochizuki foi replicado em ceacutelulas
C636 para gerar estoques de trabalho durante 2 e 5 dias a 28degC O sobrenadante da cultura de
ceacutelulas infectadas foi recolhido e clarificado por centrifugaccedilatildeo a 4000 G durante 10 minutos agrave
4degC e entatildeo foi aliquotado e armazenado a -70 deg C como reserva de viacuterus ateacute agrave sua utilizaccedilatildeo
A replicaccedilatildeo geraccedilatildeo de estoque e titulaccedilatildeo do Sorotipo 2 do Dengue virus (DENV-2)
estirpe Nova Guineacute C ocorreu nos mesmos moldes do DENV-1
19
422 Titulaccedilatildeo viral
Os estoques virais foram diluiacutedos (10-1
a 10-7
) e inoculados em monocamadas de
ceacutelulas BHK-21 implantadas em placas de 6 poccedilos com confluecircncia de aproximadamente
60 (3x105 ceacutelulas por poccedilo) sendo um poccedilo natildeo infectado mantido para controle celular
Apoacutes uma hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus foram adicionados 3 mL de meio DMEM (Cultilab)
suplementado com 15 de SFB e contendo 15 de Carboximetilcelulose (CMC Synth) As
placas foram entatildeo incubadas a 37degC (CO2 a 5) por 96 horas As ceacutelulas foram entatildeo
fixadas com 2 mL de soluccedilatildeo de formol a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo
1 (pv) de cristal violeta em PBS para contagem das placas de lise O tiacutetulo viral foi
expresso atraveacutes do nuacutemero de unidades formadoras de placa por mL (UFPmL) segundo a
formula abaixo representada
Tiacutetulo viral (UFPmL) = N x FC x 10
N = nuacutemero de placas de lise contadas
FC = Fator de correccedilatildeo
= Inverso da diluiccedilatildeo na qual foram contadas as placas de lise
43 Compostos de naftoquinonas
Os compostos utilizados neste estudo foram fornecidos pelo Dr Geraldo Ceacutelio
Brandatildeo do laboratoacuterio de pesquisa da Escola de Farmaacutecia da Universidade Federal de Ouro
Preto
20
Tabela 1 Relaccedilatildeo de nome estrutura e coacutedigo dos compostos utilizados Na tabela estatildeo
presentes a relaccedilatildeo dos nomes dos compostos utilizados neste trabalho bem como sua
estrutura Os coacutedigos representantes de cada composto seratildeo utilizados no decorrer da escrita
Nome do composto Estrutura Coacutedigo
Lapachol
A1
β-lapachona
A2
2-Hidroxi-3-(ββ-dimetilvinil)-14-naftoquinona
A3
2-Cloro-14-naftoquinona
A4
Lapachol derivado 1
A5
Lapachol derivado 2 A6
Lapachol derivado 3 A7
Lapachol derivado 4 A8
44 Ensaio de citotoxicidade
Para avaliar a citotoxicidade dos compostos ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas foram incubadas com diferentes concentraccedilotildees dos compostos em triplicata num
volume de 200 microL de meio de cultura por poccedilo na presenccedila de 1 de SFB Os controles natildeo
tratados apresentaram adiccedilatildeo de 200 microL de meio de cultura As ceacutelulas foram entatildeo incubadas
durante 72 horas O meio foi removido e 28 microL de soluccedilatildeo de 5 mg mL MTT (brometo de 3-
21
[45-dimetil-tiazol-2-il]-25 difeniltertrazoacutelio) foi adicionado a cada poccedilo As placas foram re-
incubadas durante 1 hora e 30 minutos e entatildeo 122 microL de DMSO foi adicionado a cada poccedilo e
placas foram agitadas suavemente durante 15 minutos para dissolver os cristais de formazan
A absorbacircncia foi lida em um equipamento leitor de placas Victor X3 (PerkinElmer) a 490
nm A concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC 50) foi definida como a concentraccedilatildeo da amostra que
reduziu a viabilidade celular de 50 em comparaccedilatildeo com controles natildeo tratados Os dados
foram analisados utilizando o programa Prisma
45 Avaliaccedilatildeo da viabilidade e crescimento celular por exclusatildeo de azul de tripan
Ceacutelulas BHK-21 foram cultivadas em placas de 24 poccedilos (7x104 ceacutelulaspoccedilo) e apoacutes
24 horas foram tratadas com as concentraccedilotildees de uso de cada composto e incubadas por 72
horas na presenccedila de 1 de SFB A seguir as ceacutelulas foram tripsinizadas e incubadas com
azul de tripan e entatildeo foi utilizado um contador automatizado de ceacutelulas (Countess II FL
Automated Cell Counter ndash Thermo Fisher Scientific) para contagem das ceacutelulas e avaliaccedilatildeo da
porcentagem de viabilidade e diacircmetro celular do controle nos tempos de 0 24 e 96 horas e
avaliaccedilatildeo dos mesmos paracircmetros para os compostos no tempo de 96 horas (72 horas poacutes
tratamento)
Outra curva de multiplicaccedilatildeo celular foi feita para os compostos A1 A3 A4 e A5 onde as
ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos no momento da confecccedilatildeo da placa e
foram avaliados os mesmos paracircmetros nos tempos de 0 12 24 48 e 72 horas O
equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
46 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
Para determinar a menor Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) responsaacutevel pela letalidade
celular total 2x104 de ceacutelulas BHK-21 foram semeadas em placa de 96 poccedilos Apoacutes a
incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o
meio de cultura foi removido e as ceacutelulas foram expostas a diferentes diluiccedilotildees dos dois
sorotipos de DENV (100 microL de cada diluiccedilatildeo + 100 microL de meio DEMEM 1 SFB) As
diluiccedilotildees seriadas foram realizadas da suspensatildeo viral na razatildeo de 5 para o primeiro poccedilo e de
2 para os demais poccedilos Apoacutes 72 horas as ceacutelulas foram entatildeo fixadas com 200 microL de soluccedilatildeo
22
formalina a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo 1 (pv) de cristal violeta em
PBS para avaliaccedilatildeo da maior diluiccedilatildeo responsaacutevel pela letalidade de 100 das ceacutelulas
47 Ensaio Dose-resposta
Para cada composto foram realizados ensaios de dose-resposta para definiccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de cada composto capaz de promover a reduccedilatildeo na produccedilatildeo viral A atividade
antiviral foi avaliada tambeacutem pelo meacutetodo de MTT Ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas expostas a diferentes concentraccedilotildees dos extratos determinadas a partir das maiores
concentraccedilotildees em que natildeo foram observados efeitos citotoacutexicos As ceacutelulas foram tratadas
com as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de cada composto e em seguida infectadas com DENV
1 (MOI= 5) ou 2 (MOI= 2) Mantendo uma coluna para controle com DMSO uma coluna
para controle de viacuterus uma coluna para controle de citotoxicidade dos compostos e por fim
uma coluna para controle celular As ceacutelulas foram entatildeo incubadas durante 72 horas Apoacutes
este tempo procedeu-se a leitura pelo ensaio de MTT como descrito anteriormente Os dados
foram analisados levando-se em consideraccedilatildeo a leitura das absorbacircncias dos poccedilos dos
controles de viacuterus e do controle celular
Para realizacao destes experimentos os seguintes controles foram adotados
Controle de ceacutelulas poccedilos contendo somente ceacutelulas acrescidas do meio de cultura DMEM
1 SFB Utilizado para avaliar o comportamento das ceacutelulas sem que as mesmas tivessem
contato com qualquer interferente durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo Com isso os poccedilos
reservados para esse controle serviram de padratildeo para comparaccedilatildeo com aqueles em que fosse
observada atividade citotoacutexica ou citopaacutetica
Controle de viacuterus poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM 1 SFB
sem nenhum tratamento e de suspensatildeo de viacuterus Utilizando como referecircncia para anaacutelise da
atividade citopaacutetica provocada pelo viacuterus testado durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo das placas
23
Controle de viacuterus com DMSO Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura
DMEM 1 SFB e DMSO Foi utilizado para avaliar se havia influecircncia prejudicial do
solvente utilizado para diluiccedilatildeo das amostras no meio de cultivo das ceacutelulas e se o mesmo
poderia apresentar alguma potencial atividade antiviral aparente
Controle de citotoxicidade Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM
1 SFB e as quatro principais concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos Foi utilizado
para avaliar se haveria alguma possiacutevel atividade citotoacutexica das concentraccedilotildees dos compostos
em relaccedilatildeo agraves ceacutelulas
48 Ensaio Virucida
Para a realizaccedilatildeo deste ensaio aliacutequotas de 950 microL (diluiccedilatildeo de 20 vezes) do DENV 1 (tiacutetulo
6 x 107 UFPmL) foram incubadas com 50 microL de uma soluccedilatildeo de meio DMEM preparada
com 20x a concentraccedilatildeo natildeo citotoacutexica de cada composto A1 a A8 em banho-maria 37deg C
por 1 hora Apoacutes a incubaccedilatildeo as aliacutequotas foram imediatamente tituladas em ceacutelulas BHK-21
em placas de 6 poccedilos utilizando-se 3 diluiccedilotildees para cada incubaccedilatildeo (20x 20 x 10-1
e 20 x 10-
2) Foram titulados tambeacutem uma aliacutequota incubada apenas com meio DMEM sem nenhum
tratamento e outra aliacutequota incubada com DMSO (Dimetilsulfoacutexido) Estas foram tituladas
utilizando um controle e mais cinco diluiccedilotildees (20x 20 x 10-1
20 x 10-2
20 x 10-3
e 20 x 10-4
)
49 Ensaio antiviral
Neste ensaio ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em placas de 24 poccedilos no dia
seguinte foram tratadas durante 4 horas com as concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas de cada
composto em duplicata Apoacutes o preacute-tratamento as monocamadas foram infectadas com
DENV-1 a uma MOI=5 na presenccedila das concentraccedilotildees de uso respectivas de cada composto
Apoacutes 1 hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus as monocamadas foram lavadas duas vezes com PBS e
foi adicionado 500 microL por poccedilo de meio preparado com as mesmas concentraccedilotildees dos
diferentes compostos e mantidos durante 48 horas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5 Em
quatro poccedilos as ceacutelulas foram infectadas e natildeo tratadas e em outros quatro poccedilos as ceacutelulas
natildeo foram tratadas e nem infectadas (controle de ceacutelulas) destes uacuteltimos dois foram
tripsinizados e contados no momento da infecccedilatildeo e os outros dois apoacutes o teacutermino do ensaio
24
para avaliar o crescimento celular Decorridas as 48 horas o sobrenadante foi coletado e
centrifugado por 10 minutos a 4000 xG para separaccedilatildeo dos debris celulares e prontamente
titulado em placa de 6 poccedilos
410 Anaacutelise estatiacutestica
Os valores de CC50 foram obtidos a partir de anaacutelise de regressatildeo linear das curvas de
concentraccedilatildeocitotoxicidade A anaacutelise estatiacutestica dos dados foi realizada pelo programa
GraphPad Prism software Uma anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi utilizada para determinar
as diferenccedilas estatiacutesticas seguida do poacutes teste de Tukey A significacircncia estatiacutestica foi fixada
em p lt005
25
V RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
26
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Ensaio de citotoxicidade celular
Para avaliar a viabilidade da linhagem celular BHK-21 frente ao tratamento com oito
diferentes concentraccedilotildees dos compostos (A1 a A8) realizou-se um ensaio de MTT (brometo
de 3-[45-dimetil-tiazol-2-il]-25-difeniltetrazoacutelio) Este ensaio tem o objetivo de quantificar
espectrofotometricamente o crescimento celular a viabilidade e proliferaccedilatildeo podendo ser
utilizado como um indicador direto de citotoxicidade Trata-se de um ensaio colorimeacutetrico
para medir a atividade da redutase mitocondrial em ceacutelulas vivas Ele se baseia na reduccedilatildeo do
sal amarelo tetrazoacutelio (permeaacutevel agrave membrana celular) para cristais de formazan azuis
puacuterpura por ceacutelulas metabolicamente ativas a quantidade de formazan gerada medida por
espectrofotometria eacute proporcional ao nuacutemero de ceacutelulas viaacuteveis
A CC50 foi calculada plotando-se uma curva de porcentagem de viabilidade celular por
concentraccedilatildeo melhor representada na figura 7 pelo composto A7 e os resultados de CC50
para todos os compostos estatildeo representados na tabela 2 Foram feitos ensaios de
citotoxicidade com oito concentraccedilotildees diferentes sendo escolhida a maior concentraccedilatildeo que
natildeo apresentou citotoxicidade
Viabilidade Celular = [ ( A ndash B ) A ] x 100
Onde
A = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas natildeo tratadas
B = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas tratadas com
as respectivas concentraccedilotildees de cada composto
27
28
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (A curva dose resposta do composto A7 eacute a que
melhor representa a curva dose resposta esperada) Avaliou-se a viabilidade da linhagem
celular BHK-21 frente agrave diferentes concentraccedilotildees dos compostos realizando o ensaio de MTT
e determinando assim as concentraccedilotildees a serem utilizadas nos proacuteximos ensaios bem como
calculando a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) agrave partir da curva
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo
da concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50)
Composto Concentraccedilatildeo utilizada
[ ] microgmL
Concentraccedilatildeo citotoacutexica 50
(CC50) [ ] microgmL plusmn Desvio
Padratildeo
A1 ([ ]=1 mgmL) 00200 10010 plusmn 0014
A2 ([ ]=1 mgmL) 00025 09561 plusmn 0023
A3 ([ ]=1 mgmL) 00025 09988 plusmn 0017
A4 ([ ]=5 mgmL) 00125 10150 plusmn 0036
A5 ([ ]=10 mgmL) 00250 10590 plusmn 0047
A6 ([ ]=5 mgmL) 00250 08183 plusmn 0030
A7 ([ ]=5 mgmL) 00125 10280 plusmn 0052
A8 ([ ]=5 mgmL) 00125 09758 plusmn 0036
52 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan
Para corroborar o ensaio anterior de citotoxicidade utilizou -se o teste de viabilidade
celular pela teacutecnica da exclusatildeo do azul de tripan com a finalidade de determinar a
viabilidade das ceacutelulas Os procedimentos adotados no ensaio seguiram o manual do
equipamento contador automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL Automated Cell Counter) entatildeo
foi acrescentado agrave 10 microL da suspensatildeo celular 10 microL de azul de tripan (04) Apoacutes
homogeneizaccedilatildeo 10 microL da suspensatildeo foi colocada no local indicado da lacircmina proacutepria para
leitura e foi realizada a contagem sendo consideradas mortas (inviaacuteveis) as ceacutelulas que
incorporavam o corante e viaacuteveis as que excluiacuteam o azul de tripan
29
O equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
(A)
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan A avaliaccedilatildeo da
viabilidade celular foi realizada atraveacutes de um contador automaacutetico de ceacutelulas Este
equipamento possibilita explorar ferramentas de fotografia e avaliar alguns paracircmetros
importantes (A) fotografia das ceacutelulas (B) Zoom na fotografia das ceacutelulas com marcaccedilotildees
(em verde para ceacutelulas vivas e vermelho para mortas) e (D) contagem das ceacutelulas totais
ceacutelulas vivas e mortas graacutefico e meacutedia dos diacircmetros celulares das ceacutelulas vivas e mortas
(B)
(C)
30
O crescimento celular de ceacutelulas natildeo tratadas foi avaliado nos tempos de 0h (momento
da confecccedilatildeo da placa) 24h (momento de tratamento com os compostos) e 96 horas
(Momento em que todas as ceacutelulas foram tripsinizadas e contadas) para avaliar o perfil do
crescimento celular em ceacutelulas natildeo tratadas Foi observado um crescimento celular no periacuteodo
de 24 horas onde as ceacutelulas estavam incubadas com meio acrescido de 10 SFB Em 24
horas o meio foi trocado por 1 SFB e acrescido das substacircncias testes nas menores diluiccedilotildees
natildeo citotoacutexicas determinadas pelo ensaio do MTT Em 96 horas pode ser observado um
decaimento no nuacutemero de ceacutelulas vivas provavelmente devido ao crescimento celular (morte
por confluecircncia)
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas)
(A) (B)
31
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas (A)
Contagem de ceacutelulas vivas (B) Percentual de ceacutelulas viaacuteveis (Viabilidade celular ) e (C)
Meacutedia do diacircmetro apresentado pelas ceacutelulas vivas
Em 96 horas as ceacutelulas natildeo tratadas bem como as ceacutelulas tratadas por 72 horas com as
concentraccedilotildees de uso dos compostos foram tripsinizadas e avaliadas quanto ao nuacutemero de
ceacutelulas vivas viabilidade e diacircmetro celular apresentados na figura 10
Segundo se observa natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo aparente que possa demonstrar que
as concentraccedilotildees de uso dos compostos tenham causado alguma atividade citotoacutexica
corroborando assim os ensaios de citotoxicidade anteriores
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
A infectividade de um viacuterus depende de vaacuterios fatores entre eles da proporccedilatildeo de
partiacuteculas virais completas ou infecciosas da suscetibilidade da ceacutelula hospedeira e da
chance desta partiacutecula encontrar o receptor e penetrar na ceacutelula Quando ceacutelulas suscetiacuteveis
satildeo misturadas com uma suspensatildeo de viacuterus estas podem receber uma duas trecircs ou dez
partiacuteculas virais ou nenhuma Isto depende da proporccedilatildeo entre a quantidade de viacuterus
infecciosos presente no inoculo e a quantidade de ceacutelulas utilizada Esta relaccedilatildeo eacute denominada
de multiplicidade de infecccedilatildeo ou MOI Uma MOI=1 indica que a infecccedilatildeo foi feita em
principio com 1 viacuterus ou 1 dose infectante por ceacutelula
A determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo dos Dengue virus 1 e 2 a serem
utilizadas nos proacuteximos ensaios foi feita a partir da infecccedilatildeo de ceacutelulas BHK-21 por diferentes
(C)
32
concentraccedilotildees de viacuterus e revelaccedilatildeo com cristal violeta Escolheu-se a maior diluiccedilatildeo viral que
possibilitou a letalidade total das ceacutelulas (faixa onde todas as ceacutelulas estatildeo mortas utilizando
menor concentraccedilatildeo de viacuterus) As faixas escolhidas foram entatildeo calculadas levando-se em
consideraccedilatildeo o nuacutemero de ceacutelulas presentes no poccedilo e o nuacutemero de partiacuteculas virais que foram
adicionadas (Faixa3 para DENV2 e 2 para DENV1) Figura 11 Foi estipulado portanto a
Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 2 para DENV 2 e 5 para DENV 1
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI A partir da infecccedilatildeo da linhagem celular BHK-21 em
placa de 96 poccedilos com diferentes diluiccedilotildees de DENV foi determinado que a Multiplicidade
de infecccedilatildeo para o Dengue viacuterus sorotipos 1 e 2 seria de 5 e 2 respectivamente (colunas 2 -
DENV1 e 3 - DENV2)
54 Ensaio dose resposta
Apoacutes a determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas ideais realizou-se um
ensaio dose resposta tratando as ceacutelulas com oito concentraccedilotildees agrave partir das concentraccedilotildees natildeo
citotoacutexicas escolhidas para cada composto e em seguida infectando com DENV sorotipos 1 e
2 nas MOIs estipuladas anteriormente (5 e 2 respectivamente) A porcentagem do efeito
protetor conferida agraves ceacutelulas para cada concentraccedilatildeo de amostra testada foi calculada da
seguinte forma
33
EP = [ (A ndash B) (C ndash B) ] x 100
Onde
A Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas tratadas e infectadas
B Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e infectadas
C Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e natildeo infectadas
Este ensaio tem por objetivo identificar a resposta celular agrave infecccedilatildeo frente ao
tratamento com os compostos em diferentes concentraccedilotildees Assim como o ensaio de
toxicidade este ensaio feito utilizando a teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT permite o teste de vaacuterias
concentraccedilotildees diferentes em um menor tempo e com baixo gasto de material
34
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV1
(MOI=5)
35
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV2
(MOI=2)
36
Takegami et al (1998) demonstraram atividade de furanonaftoquinonas contra o viacuterus
da Encefalite Japonesa (Flavivirus) utilizando a concentraccedilatildeo de 3microgmL poreacutem para os
compostos apresentados avaliados pela teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT nenhuma das
concentraccedilotildees apresentadas produziu efeito antiviral significativo em relaccedilatildeo ao controle
celular como observado nas figuras 12 e 13
Apesar da teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT ser interessante como triagem de atividade
antiviral permitindo o teste de vaacuterias concentraccedilotildees dos compostos em menor tempo e
utilizando uma quantidade razoaacutevel de materiais optou-se por utilizar as maiores
concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas encontradas avaliando sua atividade antiviral por outras
teacutecnicas Como natildeo foi avaliada atividade antiviral preacutevia para nenhum dos compostos frente
agrave infecccedilatildeo por DENV1 e 2 foi selecionado o Dengue virus 1 para dar prosseguimento aos
ensaios
55 Ensaio Virucida
O ensaio virucida foi realizado para avaliar um potencial efeito dos compostos
diretamente sobre a partiacutecula viral Este ensaio eacute importante pois possibilita elucidar se o
composto pode produzir algum efeito sobre a partiacutecula viral impedindo que esta possa infectar
as ceacutelulas
Figura 14 Ensaio virucida Neste ensaio as aliacutequotas de DENV1 foram incubadas com as
concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos e titulados (NT) Controle natildeo tratado
37
Tabela 3 Ensaio virucida Caacutelculo do tiacutetulo viral (UFPmL) e porcentagem representante de
cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 254 x 105 100
DMSO 263 x 105 10335
A1 199 x 105 7835
A2 205 x 105 8071
A3 237 x 105 9311
A4 775 x 104 3049
A5 153 x 105 6024
A6 219 x 105 8602
A7 243 x 105 9547
A8 254 x 105 100
Lagrota et al (1988) demonstraram atividade de 2-HO-3-N-benzil-N(N-benzil-2-
etilamina) -14-naftoquinona sobre a partiacutecula viral de enterovirus De forma contraacuteria apesar
de se verificar a reduccedilatildeo de quase uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais
para o composto A4 natildeo considerou-se esta uma alteraccedilatildeo significativa pois devido agrave
magnitude do nuacutemero de UFPs se trata de uma alteraccedilatildeo muito pequena Portanto os
compostos avaliados neste trabalho natildeo produziram atividade virucida aparente frente ao
tratamento com as concentraccedilotildees de uso
56 Ensaio Antiviral
O sobrenadante de ceacutelulas tratadas previamente e infectadas por DENV1 coletado 48
horas poacutes infecccedilatildeo foi avaliado quanto agrave produccedilatildeo viral de partiacuteculas infecciosas pela
contagem de placas de lise e caacutelculo de Unidades Formadoras de Placa (Titulaccedilatildeo viral em
placa ndash UFPmL)
38
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral Sobrenadante de ceacutelulas tratadas e infectadas por DENV1
coletado apoacutes 48 horas e titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado
Tabela 4 Ensaio Antiviral Coleta do sobrenadante de ceacutelulas infectadas por DENV1 Tiacutetulo
viral (UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o
controle natildeo tratado como 100
Ao perceber um aumento no tiacutetulo viral frente ao tratamento com os compostos A1
A2 e A3 e uma reduccedilatildeo frente ao tratamento com A4 A5 e A6 foram escolhidos dois
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 119 x 105 10000
A1 235 x 105 19748
A2 228 x 105 19160
A3 318 x 105 26723
A4 128 x 104 1076
A5 186 x 103 156
A6 190 x 104 1597
A7 280 x 104 2353
A8 350 x 104 2941
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
40
Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
9
Figura 4 Estrutura quiacutemica da 12-naftoquinona (1) e 14-naftoquinona (2)
Entre as quinonas estatildeo compostos biologicamente importantes tais como o grupo da
vitamina K e a coenzima Q (ubiquinona) Estes compostos tecircm um papel importante no
metabolismo celular especialmente como carreadores de eleacutetrons Aleacutem de quinonas que
possuam uma funccedilatildeo bioloacutegica outros compostos desta classe tecircm sido encontrados
mostrando atividade antibioacutetica Alguns deles estatildeo presentes na natureza mas a maior parte
satildeo obtidos sinteticamente entre eles 2-hidroxi-3-alquil-14-naftoquinonas que possuem
evidecircncias de serem ativos in vitro contra os parasitas da malaacuteria e como coccidiostaacuteticos
(Ambrogi 1970)
A atividade bioloacutegica de quinonas estaacute muitas vezes relacionada com o seu
comportamento eletroquiacutemico A capacidade de aceitar um ou dois eleacutetrons para formar o
acircnion radical correspondente ou dianion pode ser o motivo da induccedilatildeo da formaccedilatildeo de
espeacutecies reativas de oxigecircnio responsaacuteveis pelo estresse oxidativo nas ceacutelulas A capacidade
de aceitar eleacutetrons de naftoquinonas pode ser alterada por mudanccedilas de posiccedilatildeo do grupo
carbonila (12- 14-naftoquinonas) ou diferentes substituintes ou funccedilotildees associadas agrave porccedilatildeo
de naftoquinona (Francisco 2010)
As naftoquinonas satildeo largamente encontradas em plantas micro-organismos e alguns
animais Estes compostos tecircm sido amplamente utilizados em diversas culturas como corantes
para cosmeacuteticos tecidos alimentos (Brandelli 2004) e para fins medicinais incluindo
antitumoral (Oliveira 1990 Ferreira 1996) anti-inflamatoacuterios antimalaacuterico antiviral
(Fonseca 2003 Hussain 2007) atibacterianos e antifuacutengicos (Nagata 1998) Estas atividades
bioloacutegicas tecircm justificado o grande nuacutemero de trabalhos (aproximadamente 42 ateacute abril 2016
ndash Pubmed) encontrados na literatura que visa a siacutentese e avaliaccedilatildeo de qualquer das quinonas
naturais ou seus anaacutelogos como agentes farmacoloacutegicos potenciais (Rahmoun 2013)
10
O Lapachol foi descoberto e estudado desde o seacuteculo XIX Foi isolado primeiramente
do lenho da aacutervore argentina ldquolapachordquo Tabebuia avellanedae (Bignoniaceae) conhecida
como Ipecirc roxo Os estudos quiacutemicos foram desenvolvidos inicialmente em 1892 (Fonseca
2003) O lapachol foi descrito pela primeira vez por Paterno em 1821 tendo sua estrutura
quiacutemica estabelecida em 1896 por Hooker que o identificou como uma naftoquinona Esta
naftoquinona possui accedilatildeo antiinflamatoacuteria analgeacutesica antibioacutetica e anti-neoplaacutesica
reconhecida (Arauacutejo 2002)
A β-lapachona (34-di-hidro-22-dimetil-2H-naptho [12-b] pirano-56-diona) eacute uma
quinona obtida de fontes naturais derivada da aacutervore Lapacho (Tabebuia avellanedae) nativa
da Ameacuterica do Sul e Central A siacutentese e quiacutemica da β-lapachona e compostos relacionados
foi inicialmente investigado no final do seacuteculo XIX e iniacutecio do seacuteculo XX pelo quiacutemico
Samuel Hooker Apesar de alguns estudos cliacutenicos sobre a bioatividade de naftoquinonas
terem sido relatados no iniacutecio de 1940 foi o relatoacuterio do potencial da β-lapachona como um
agente anti-tripanossoma em 1977 que revitalizou o estudo e caracterizaccedilatildeo deste composto
natural A β-lapachona tambeacutem apresenta vaacuterias accedilotildees farmacoloacutegicas incluindo accedilatildeo
formaccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (Hussain 2007)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do Lapachol (1) da α- Lapachona (2) e da β-
Lapachona (Fonseca et al 2003 Ferreira et al 2010)
11
Figura 6 Tabebuia avellanedae (Hussain 2007)
A β-lapachona eacute uma substacircncia natural facilmente obtida a partir do lapachol Esta
naftoquinona eacute o grande destaque desta classe de substacircncias porque se encontra em testes
cliacutenicos de fase II para o tratamento do cacircncer de pacircncreas (Ferreira 2010) O mecanismo de
accedilatildeo da β-lapachona diferencia-se de outros antineoplaacutesicos por atuar na topoisomerase I
promovendo a recuperaccedilatildeo da capacidade de apoptose celular Alguns estudos reportam sua
accedilatildeo sineacutergica de potenciaccedilatildeo com o Taxolreg
promovendo a inibiccedilatildeo em diferentes pontos de
replicaccedilatildeo celular aleacutem de sua combinaccedilatildeo com outros tratamentos como a aplicaccedilatildeo de
radiaccedilatildeo ionizante (Cunha 2005)
Vaacuterios estudos jaacute foram publicados demonstrando a atividade antiviral de
naftoquinonas naturais e sinteacuteticas A β-lapachona inibe seletivamente a replicaccedilatildeo do viacuterus
HIV-1 atuando na inibiccedilatildeo da enzima LTR117 Da mesma forma este composto eacute um
potente inibidor da enzima transcriptase reversa dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e
leucemia murina de Rauscher (RLV) inibindo tambeacutem a DNA polimerase A accedilatildeo inibitoacuteria
sobre estas enzimas revelou-se especiacutefica se comparada com a de outros inibidores
conhecidos (Silva 2003)
O Lapachol jaacute demonstrou atividade contra certas cepas virais incluindo Herpes virus
tipos I e II Outras naftoquinonas jaacute mostraram eficaacutecia contra cepas de Influenza virus
Poliomielite virus e estomatite vesicular Supotildee-se que o mecanismo de accedilatildeo destas quinonas
seja atraveacutes da inibiccedilatildeo da transcriptase reversa de retroviacuterus e da RNA polimerase Eacute relatado
12
que lapachol diminui a replicaccedilatildeo do viacuterus em seres humanos mas ainda natildeo existem
resultados de testes cliacutenicos disponiacuteveis (Hussain 2007)
Na avaliaccedilatildeo da atividade antiviral do Lapachol in vitro verificou-se que esta
substacircncia eacute ativa contra viacuterus RNA atuando tanto sobre viacuterus envelopados quanto sobre
partiacuteculas sem esta estrutura em concentraccedilotildees de 5 a 10 microgmL e ainda apresentou uma
pequena atividade sobre HSV (Herpes simplex I) e Ad5 (Adeno tipo 5) mas nenhuma
atividade sobre CoxB4 (Coxsackie B4) Em trabalho posterior demonstrou-se que nem o
Lapachol nem diversos dos seus derivados apresentaram atividade antiviral in vitro sobre
Poliovirus tipo 1 Ecovirus 19 e Coxsackie B tipo 4 Apenas os derivados 12-naftoquinonicos
e um intermediaacuterio da siacutentese Hoocker foram ativos contra o Echovirus 19 (Fonseca 2003)
Costa et al (2013) relataram que piranonaftoquinonas isocircmeras do lapachol possuem
atividade de inibiccedilatildeo da replicaccedilatildeo de DENV-2 atuando sobre a atividade da ATPase de NS3
(proteiacutena natildeo estrutural de DENV)
A utilizaccedilatildeo de testes in vitro por meio de ensaios de viabilidade celular constitui o
primeiro passo para a avaliaccedilatildeo da compatibilidade bioloacutegica de uma substacircncia e pode
fornecer elementos importantes para a anaacutelise da biocompatibilidade dos diferentes materiais
Para ser considerado natildeo citotoacutexico no teste de citotoxicidade in vitro um produto natildeo deve
ocasionar a morte das ceacutelulas nem afetar suas funccedilotildees celulares A prova do MTT eacute um dos
indicadores colorimeacutetricos de viabilidade celular mais utilizados sendo capaz de avaliar a
funccedilatildeo celular mitocondrial de acordo com a reduccedilatildeo enzimaacutetica do sal de tetrazoacutelio pelas
desidrogenases mitocondriais nas ceacutelulas viaacutevies (Arauacutejo et al 2008) Supotildee-se que o
mecanismo responsaacutevel pela citotoxicidade apresentada pelas quinonas esteja relacionado
com o estresse oxidativo causado por esses compostos poreacutem a capacidade de alquilaccedilatildeo de
nucleoacutefilos celulares tambeacutem representa correlaccedilatildeo com tais efeitos bioloacutegicos (Goulart
2004)
13
II JUSTIFICATIVA
14
2 JUSTIFICATIVA
Aleacutem do controle do mosquito transmissor e do desenvolvimento de vacinas que tem
sido exaustivamente estudado nos uacuteltimos anos uma alternativa para o combate agrave dengue
seria o desenvolvimento de faacutermacos para reduzir a viremia ou mesmo para controlar a
resposta imune do hospedeiro agrave infecccedilatildeo que tem sido apontada como principal fator de risco
nos casos mais graves Em funccedilatildeo disso o nuacutemero de pesquisas visando o desenvolvimento
de drogas com accedilatildeo antiviral ou com accedilatildeo imunomodulatoacuteria tem aumentado
significativamente As naftoquinonas vecircm ganhando bastante importacircncia na pesquisa de
novas drogas antivirais devido agrave algumas atividades apresentadas A szlig-lapachona-orto-
naftoquinona por exemplo se mostrou um potente inibidor da enzima transcriptase reversa
dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e leucemia murina de Rauscher (RLV)
Diante da inexistecircncia de drogas com accedilatildeo anti DENV e o elevado nuacutemero e casos da
patogenia nos uacuteltimos anos a organizaccedilatildeo mundial da sauacutede classificou a Dengue como uma
epidemia de proporccedilotildees globais e um problema de sauacutede puacuteblica Como as naftoquinonas jaacute
demonstraram na literatura possuir um potencial efeito terapecircutico contra alguns viacuterus eacute
possiacutevel que estes compostos possam apresentar atividade antiviral contra DENV Portanto
este trabalho visou atraveacutes de ensaios de MTT e titulaccedilotildees virais em placa avaliar a potencial
atividade antiviral de oito compostos derivados de naftoquinonas naturais e sinteacuteticas
15
III OBJETIVOS
16
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar oito compostos (2 naturais e 6 sinteacuteticos) derivados de naftoquinonas como potenciais
agentes antivirais em ceacutelulas BHK-21 frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1 e 2
32 Objetivos especiacuteficos
1 Calcular o iacutendice de citotoxicidade e a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) dos compostos
atraveacutes de ensaio de reduccedilatildeo de MTT
2 Avaliar os efeitos dos compostos sobre o crescimento a viabilidade e o volume celular
pela teacutecnica de exclusatildeo do azul de tripan
3 Determinar a multiplicidade de infecccedilatildeo de DENV 1 e 2 a ser utilizada nos ensaios
antivirais
4 Avaliar a atividade antiviral dos compostos frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1
e 2 atraveacutes do ensaio de MTT
5 Verificar um possiacutevel efeito direto dos compostos agraves partiacuteculas virais de Dengue virus
6 Quantificar a produccedilatildeo de partiacuteculas virais infecciosas no sobrenadante de ceacutelulas
infectadas atraveacutes de titulaccedilatildeo viral pela contagem de unidades formadoras de placas
17
IV MATERIAL E MEacuteTODOS
18
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Linhagens celulares
411 Ceacutelulas C636
As ceacutelulas C636 satildeo ceacutelulas de linhagem contiacutenua de larvas de mosquito Aedes
albopictus Estas ceacutelulas foram utilizadas na produccedilatildeo de estoque viral de DENV sorotipos 1
e 2 para isso foram mantidas em meio de cultura Leibovitz-15 (L-15) (Cultilab)
suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (Cultilab) antibioacuteticos (Penicilina 100 UmL
Streptomicina 100 microgmL) e antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL) a 28degC
412 Ceacutelulas BHK-21
As ceacutelulas BHK-21 satildeo fibroblastos de linhagem contiacutenua derivados de rim de hamster
neonato Estas ceacutelulas foram utilizadas para os experimentos in vitro e para as titulaccedilotildees de
DENV 1 e 2 para isso foram mantidas em meio miacutenimo essencial modificado por Dulbecco
ndash DMEM (Cultilab) suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (SFB) com antibioacuteticos
(Penicilina 100 UmL Streptomicina 100 microgmL) e com antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL)
sendo mantidas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5
42 Viacuterus
421 DENV 1 e DENV 2
O Sorotipo 1 do Dengue virus (DENV-1) estirpe Mochizuki foi replicado em ceacutelulas
C636 para gerar estoques de trabalho durante 2 e 5 dias a 28degC O sobrenadante da cultura de
ceacutelulas infectadas foi recolhido e clarificado por centrifugaccedilatildeo a 4000 G durante 10 minutos agrave
4degC e entatildeo foi aliquotado e armazenado a -70 deg C como reserva de viacuterus ateacute agrave sua utilizaccedilatildeo
A replicaccedilatildeo geraccedilatildeo de estoque e titulaccedilatildeo do Sorotipo 2 do Dengue virus (DENV-2)
estirpe Nova Guineacute C ocorreu nos mesmos moldes do DENV-1
19
422 Titulaccedilatildeo viral
Os estoques virais foram diluiacutedos (10-1
a 10-7
) e inoculados em monocamadas de
ceacutelulas BHK-21 implantadas em placas de 6 poccedilos com confluecircncia de aproximadamente
60 (3x105 ceacutelulas por poccedilo) sendo um poccedilo natildeo infectado mantido para controle celular
Apoacutes uma hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus foram adicionados 3 mL de meio DMEM (Cultilab)
suplementado com 15 de SFB e contendo 15 de Carboximetilcelulose (CMC Synth) As
placas foram entatildeo incubadas a 37degC (CO2 a 5) por 96 horas As ceacutelulas foram entatildeo
fixadas com 2 mL de soluccedilatildeo de formol a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo
1 (pv) de cristal violeta em PBS para contagem das placas de lise O tiacutetulo viral foi
expresso atraveacutes do nuacutemero de unidades formadoras de placa por mL (UFPmL) segundo a
formula abaixo representada
Tiacutetulo viral (UFPmL) = N x FC x 10
N = nuacutemero de placas de lise contadas
FC = Fator de correccedilatildeo
= Inverso da diluiccedilatildeo na qual foram contadas as placas de lise
43 Compostos de naftoquinonas
Os compostos utilizados neste estudo foram fornecidos pelo Dr Geraldo Ceacutelio
Brandatildeo do laboratoacuterio de pesquisa da Escola de Farmaacutecia da Universidade Federal de Ouro
Preto
20
Tabela 1 Relaccedilatildeo de nome estrutura e coacutedigo dos compostos utilizados Na tabela estatildeo
presentes a relaccedilatildeo dos nomes dos compostos utilizados neste trabalho bem como sua
estrutura Os coacutedigos representantes de cada composto seratildeo utilizados no decorrer da escrita
Nome do composto Estrutura Coacutedigo
Lapachol
A1
β-lapachona
A2
2-Hidroxi-3-(ββ-dimetilvinil)-14-naftoquinona
A3
2-Cloro-14-naftoquinona
A4
Lapachol derivado 1
A5
Lapachol derivado 2 A6
Lapachol derivado 3 A7
Lapachol derivado 4 A8
44 Ensaio de citotoxicidade
Para avaliar a citotoxicidade dos compostos ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas foram incubadas com diferentes concentraccedilotildees dos compostos em triplicata num
volume de 200 microL de meio de cultura por poccedilo na presenccedila de 1 de SFB Os controles natildeo
tratados apresentaram adiccedilatildeo de 200 microL de meio de cultura As ceacutelulas foram entatildeo incubadas
durante 72 horas O meio foi removido e 28 microL de soluccedilatildeo de 5 mg mL MTT (brometo de 3-
21
[45-dimetil-tiazol-2-il]-25 difeniltertrazoacutelio) foi adicionado a cada poccedilo As placas foram re-
incubadas durante 1 hora e 30 minutos e entatildeo 122 microL de DMSO foi adicionado a cada poccedilo e
placas foram agitadas suavemente durante 15 minutos para dissolver os cristais de formazan
A absorbacircncia foi lida em um equipamento leitor de placas Victor X3 (PerkinElmer) a 490
nm A concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC 50) foi definida como a concentraccedilatildeo da amostra que
reduziu a viabilidade celular de 50 em comparaccedilatildeo com controles natildeo tratados Os dados
foram analisados utilizando o programa Prisma
45 Avaliaccedilatildeo da viabilidade e crescimento celular por exclusatildeo de azul de tripan
Ceacutelulas BHK-21 foram cultivadas em placas de 24 poccedilos (7x104 ceacutelulaspoccedilo) e apoacutes
24 horas foram tratadas com as concentraccedilotildees de uso de cada composto e incubadas por 72
horas na presenccedila de 1 de SFB A seguir as ceacutelulas foram tripsinizadas e incubadas com
azul de tripan e entatildeo foi utilizado um contador automatizado de ceacutelulas (Countess II FL
Automated Cell Counter ndash Thermo Fisher Scientific) para contagem das ceacutelulas e avaliaccedilatildeo da
porcentagem de viabilidade e diacircmetro celular do controle nos tempos de 0 24 e 96 horas e
avaliaccedilatildeo dos mesmos paracircmetros para os compostos no tempo de 96 horas (72 horas poacutes
tratamento)
Outra curva de multiplicaccedilatildeo celular foi feita para os compostos A1 A3 A4 e A5 onde as
ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos no momento da confecccedilatildeo da placa e
foram avaliados os mesmos paracircmetros nos tempos de 0 12 24 48 e 72 horas O
equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
46 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
Para determinar a menor Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) responsaacutevel pela letalidade
celular total 2x104 de ceacutelulas BHK-21 foram semeadas em placa de 96 poccedilos Apoacutes a
incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o
meio de cultura foi removido e as ceacutelulas foram expostas a diferentes diluiccedilotildees dos dois
sorotipos de DENV (100 microL de cada diluiccedilatildeo + 100 microL de meio DEMEM 1 SFB) As
diluiccedilotildees seriadas foram realizadas da suspensatildeo viral na razatildeo de 5 para o primeiro poccedilo e de
2 para os demais poccedilos Apoacutes 72 horas as ceacutelulas foram entatildeo fixadas com 200 microL de soluccedilatildeo
22
formalina a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo 1 (pv) de cristal violeta em
PBS para avaliaccedilatildeo da maior diluiccedilatildeo responsaacutevel pela letalidade de 100 das ceacutelulas
47 Ensaio Dose-resposta
Para cada composto foram realizados ensaios de dose-resposta para definiccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de cada composto capaz de promover a reduccedilatildeo na produccedilatildeo viral A atividade
antiviral foi avaliada tambeacutem pelo meacutetodo de MTT Ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas expostas a diferentes concentraccedilotildees dos extratos determinadas a partir das maiores
concentraccedilotildees em que natildeo foram observados efeitos citotoacutexicos As ceacutelulas foram tratadas
com as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de cada composto e em seguida infectadas com DENV
1 (MOI= 5) ou 2 (MOI= 2) Mantendo uma coluna para controle com DMSO uma coluna
para controle de viacuterus uma coluna para controle de citotoxicidade dos compostos e por fim
uma coluna para controle celular As ceacutelulas foram entatildeo incubadas durante 72 horas Apoacutes
este tempo procedeu-se a leitura pelo ensaio de MTT como descrito anteriormente Os dados
foram analisados levando-se em consideraccedilatildeo a leitura das absorbacircncias dos poccedilos dos
controles de viacuterus e do controle celular
Para realizacao destes experimentos os seguintes controles foram adotados
Controle de ceacutelulas poccedilos contendo somente ceacutelulas acrescidas do meio de cultura DMEM
1 SFB Utilizado para avaliar o comportamento das ceacutelulas sem que as mesmas tivessem
contato com qualquer interferente durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo Com isso os poccedilos
reservados para esse controle serviram de padratildeo para comparaccedilatildeo com aqueles em que fosse
observada atividade citotoacutexica ou citopaacutetica
Controle de viacuterus poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM 1 SFB
sem nenhum tratamento e de suspensatildeo de viacuterus Utilizando como referecircncia para anaacutelise da
atividade citopaacutetica provocada pelo viacuterus testado durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo das placas
23
Controle de viacuterus com DMSO Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura
DMEM 1 SFB e DMSO Foi utilizado para avaliar se havia influecircncia prejudicial do
solvente utilizado para diluiccedilatildeo das amostras no meio de cultivo das ceacutelulas e se o mesmo
poderia apresentar alguma potencial atividade antiviral aparente
Controle de citotoxicidade Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM
1 SFB e as quatro principais concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos Foi utilizado
para avaliar se haveria alguma possiacutevel atividade citotoacutexica das concentraccedilotildees dos compostos
em relaccedilatildeo agraves ceacutelulas
48 Ensaio Virucida
Para a realizaccedilatildeo deste ensaio aliacutequotas de 950 microL (diluiccedilatildeo de 20 vezes) do DENV 1 (tiacutetulo
6 x 107 UFPmL) foram incubadas com 50 microL de uma soluccedilatildeo de meio DMEM preparada
com 20x a concentraccedilatildeo natildeo citotoacutexica de cada composto A1 a A8 em banho-maria 37deg C
por 1 hora Apoacutes a incubaccedilatildeo as aliacutequotas foram imediatamente tituladas em ceacutelulas BHK-21
em placas de 6 poccedilos utilizando-se 3 diluiccedilotildees para cada incubaccedilatildeo (20x 20 x 10-1
e 20 x 10-
2) Foram titulados tambeacutem uma aliacutequota incubada apenas com meio DMEM sem nenhum
tratamento e outra aliacutequota incubada com DMSO (Dimetilsulfoacutexido) Estas foram tituladas
utilizando um controle e mais cinco diluiccedilotildees (20x 20 x 10-1
20 x 10-2
20 x 10-3
e 20 x 10-4
)
49 Ensaio antiviral
Neste ensaio ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em placas de 24 poccedilos no dia
seguinte foram tratadas durante 4 horas com as concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas de cada
composto em duplicata Apoacutes o preacute-tratamento as monocamadas foram infectadas com
DENV-1 a uma MOI=5 na presenccedila das concentraccedilotildees de uso respectivas de cada composto
Apoacutes 1 hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus as monocamadas foram lavadas duas vezes com PBS e
foi adicionado 500 microL por poccedilo de meio preparado com as mesmas concentraccedilotildees dos
diferentes compostos e mantidos durante 48 horas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5 Em
quatro poccedilos as ceacutelulas foram infectadas e natildeo tratadas e em outros quatro poccedilos as ceacutelulas
natildeo foram tratadas e nem infectadas (controle de ceacutelulas) destes uacuteltimos dois foram
tripsinizados e contados no momento da infecccedilatildeo e os outros dois apoacutes o teacutermino do ensaio
24
para avaliar o crescimento celular Decorridas as 48 horas o sobrenadante foi coletado e
centrifugado por 10 minutos a 4000 xG para separaccedilatildeo dos debris celulares e prontamente
titulado em placa de 6 poccedilos
410 Anaacutelise estatiacutestica
Os valores de CC50 foram obtidos a partir de anaacutelise de regressatildeo linear das curvas de
concentraccedilatildeocitotoxicidade A anaacutelise estatiacutestica dos dados foi realizada pelo programa
GraphPad Prism software Uma anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi utilizada para determinar
as diferenccedilas estatiacutesticas seguida do poacutes teste de Tukey A significacircncia estatiacutestica foi fixada
em p lt005
25
V RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
26
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Ensaio de citotoxicidade celular
Para avaliar a viabilidade da linhagem celular BHK-21 frente ao tratamento com oito
diferentes concentraccedilotildees dos compostos (A1 a A8) realizou-se um ensaio de MTT (brometo
de 3-[45-dimetil-tiazol-2-il]-25-difeniltetrazoacutelio) Este ensaio tem o objetivo de quantificar
espectrofotometricamente o crescimento celular a viabilidade e proliferaccedilatildeo podendo ser
utilizado como um indicador direto de citotoxicidade Trata-se de um ensaio colorimeacutetrico
para medir a atividade da redutase mitocondrial em ceacutelulas vivas Ele se baseia na reduccedilatildeo do
sal amarelo tetrazoacutelio (permeaacutevel agrave membrana celular) para cristais de formazan azuis
puacuterpura por ceacutelulas metabolicamente ativas a quantidade de formazan gerada medida por
espectrofotometria eacute proporcional ao nuacutemero de ceacutelulas viaacuteveis
A CC50 foi calculada plotando-se uma curva de porcentagem de viabilidade celular por
concentraccedilatildeo melhor representada na figura 7 pelo composto A7 e os resultados de CC50
para todos os compostos estatildeo representados na tabela 2 Foram feitos ensaios de
citotoxicidade com oito concentraccedilotildees diferentes sendo escolhida a maior concentraccedilatildeo que
natildeo apresentou citotoxicidade
Viabilidade Celular = [ ( A ndash B ) A ] x 100
Onde
A = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas natildeo tratadas
B = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas tratadas com
as respectivas concentraccedilotildees de cada composto
27
28
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (A curva dose resposta do composto A7 eacute a que
melhor representa a curva dose resposta esperada) Avaliou-se a viabilidade da linhagem
celular BHK-21 frente agrave diferentes concentraccedilotildees dos compostos realizando o ensaio de MTT
e determinando assim as concentraccedilotildees a serem utilizadas nos proacuteximos ensaios bem como
calculando a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) agrave partir da curva
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo
da concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50)
Composto Concentraccedilatildeo utilizada
[ ] microgmL
Concentraccedilatildeo citotoacutexica 50
(CC50) [ ] microgmL plusmn Desvio
Padratildeo
A1 ([ ]=1 mgmL) 00200 10010 plusmn 0014
A2 ([ ]=1 mgmL) 00025 09561 plusmn 0023
A3 ([ ]=1 mgmL) 00025 09988 plusmn 0017
A4 ([ ]=5 mgmL) 00125 10150 plusmn 0036
A5 ([ ]=10 mgmL) 00250 10590 plusmn 0047
A6 ([ ]=5 mgmL) 00250 08183 plusmn 0030
A7 ([ ]=5 mgmL) 00125 10280 plusmn 0052
A8 ([ ]=5 mgmL) 00125 09758 plusmn 0036
52 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan
Para corroborar o ensaio anterior de citotoxicidade utilizou -se o teste de viabilidade
celular pela teacutecnica da exclusatildeo do azul de tripan com a finalidade de determinar a
viabilidade das ceacutelulas Os procedimentos adotados no ensaio seguiram o manual do
equipamento contador automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL Automated Cell Counter) entatildeo
foi acrescentado agrave 10 microL da suspensatildeo celular 10 microL de azul de tripan (04) Apoacutes
homogeneizaccedilatildeo 10 microL da suspensatildeo foi colocada no local indicado da lacircmina proacutepria para
leitura e foi realizada a contagem sendo consideradas mortas (inviaacuteveis) as ceacutelulas que
incorporavam o corante e viaacuteveis as que excluiacuteam o azul de tripan
29
O equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
(A)
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan A avaliaccedilatildeo da
viabilidade celular foi realizada atraveacutes de um contador automaacutetico de ceacutelulas Este
equipamento possibilita explorar ferramentas de fotografia e avaliar alguns paracircmetros
importantes (A) fotografia das ceacutelulas (B) Zoom na fotografia das ceacutelulas com marcaccedilotildees
(em verde para ceacutelulas vivas e vermelho para mortas) e (D) contagem das ceacutelulas totais
ceacutelulas vivas e mortas graacutefico e meacutedia dos diacircmetros celulares das ceacutelulas vivas e mortas
(B)
(C)
30
O crescimento celular de ceacutelulas natildeo tratadas foi avaliado nos tempos de 0h (momento
da confecccedilatildeo da placa) 24h (momento de tratamento com os compostos) e 96 horas
(Momento em que todas as ceacutelulas foram tripsinizadas e contadas) para avaliar o perfil do
crescimento celular em ceacutelulas natildeo tratadas Foi observado um crescimento celular no periacuteodo
de 24 horas onde as ceacutelulas estavam incubadas com meio acrescido de 10 SFB Em 24
horas o meio foi trocado por 1 SFB e acrescido das substacircncias testes nas menores diluiccedilotildees
natildeo citotoacutexicas determinadas pelo ensaio do MTT Em 96 horas pode ser observado um
decaimento no nuacutemero de ceacutelulas vivas provavelmente devido ao crescimento celular (morte
por confluecircncia)
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas)
(A) (B)
31
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas (A)
Contagem de ceacutelulas vivas (B) Percentual de ceacutelulas viaacuteveis (Viabilidade celular ) e (C)
Meacutedia do diacircmetro apresentado pelas ceacutelulas vivas
Em 96 horas as ceacutelulas natildeo tratadas bem como as ceacutelulas tratadas por 72 horas com as
concentraccedilotildees de uso dos compostos foram tripsinizadas e avaliadas quanto ao nuacutemero de
ceacutelulas vivas viabilidade e diacircmetro celular apresentados na figura 10
Segundo se observa natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo aparente que possa demonstrar que
as concentraccedilotildees de uso dos compostos tenham causado alguma atividade citotoacutexica
corroborando assim os ensaios de citotoxicidade anteriores
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
A infectividade de um viacuterus depende de vaacuterios fatores entre eles da proporccedilatildeo de
partiacuteculas virais completas ou infecciosas da suscetibilidade da ceacutelula hospedeira e da
chance desta partiacutecula encontrar o receptor e penetrar na ceacutelula Quando ceacutelulas suscetiacuteveis
satildeo misturadas com uma suspensatildeo de viacuterus estas podem receber uma duas trecircs ou dez
partiacuteculas virais ou nenhuma Isto depende da proporccedilatildeo entre a quantidade de viacuterus
infecciosos presente no inoculo e a quantidade de ceacutelulas utilizada Esta relaccedilatildeo eacute denominada
de multiplicidade de infecccedilatildeo ou MOI Uma MOI=1 indica que a infecccedilatildeo foi feita em
principio com 1 viacuterus ou 1 dose infectante por ceacutelula
A determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo dos Dengue virus 1 e 2 a serem
utilizadas nos proacuteximos ensaios foi feita a partir da infecccedilatildeo de ceacutelulas BHK-21 por diferentes
(C)
32
concentraccedilotildees de viacuterus e revelaccedilatildeo com cristal violeta Escolheu-se a maior diluiccedilatildeo viral que
possibilitou a letalidade total das ceacutelulas (faixa onde todas as ceacutelulas estatildeo mortas utilizando
menor concentraccedilatildeo de viacuterus) As faixas escolhidas foram entatildeo calculadas levando-se em
consideraccedilatildeo o nuacutemero de ceacutelulas presentes no poccedilo e o nuacutemero de partiacuteculas virais que foram
adicionadas (Faixa3 para DENV2 e 2 para DENV1) Figura 11 Foi estipulado portanto a
Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 2 para DENV 2 e 5 para DENV 1
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI A partir da infecccedilatildeo da linhagem celular BHK-21 em
placa de 96 poccedilos com diferentes diluiccedilotildees de DENV foi determinado que a Multiplicidade
de infecccedilatildeo para o Dengue viacuterus sorotipos 1 e 2 seria de 5 e 2 respectivamente (colunas 2 -
DENV1 e 3 - DENV2)
54 Ensaio dose resposta
Apoacutes a determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas ideais realizou-se um
ensaio dose resposta tratando as ceacutelulas com oito concentraccedilotildees agrave partir das concentraccedilotildees natildeo
citotoacutexicas escolhidas para cada composto e em seguida infectando com DENV sorotipos 1 e
2 nas MOIs estipuladas anteriormente (5 e 2 respectivamente) A porcentagem do efeito
protetor conferida agraves ceacutelulas para cada concentraccedilatildeo de amostra testada foi calculada da
seguinte forma
33
EP = [ (A ndash B) (C ndash B) ] x 100
Onde
A Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas tratadas e infectadas
B Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e infectadas
C Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e natildeo infectadas
Este ensaio tem por objetivo identificar a resposta celular agrave infecccedilatildeo frente ao
tratamento com os compostos em diferentes concentraccedilotildees Assim como o ensaio de
toxicidade este ensaio feito utilizando a teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT permite o teste de vaacuterias
concentraccedilotildees diferentes em um menor tempo e com baixo gasto de material
34
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV1
(MOI=5)
35
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV2
(MOI=2)
36
Takegami et al (1998) demonstraram atividade de furanonaftoquinonas contra o viacuterus
da Encefalite Japonesa (Flavivirus) utilizando a concentraccedilatildeo de 3microgmL poreacutem para os
compostos apresentados avaliados pela teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT nenhuma das
concentraccedilotildees apresentadas produziu efeito antiviral significativo em relaccedilatildeo ao controle
celular como observado nas figuras 12 e 13
Apesar da teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT ser interessante como triagem de atividade
antiviral permitindo o teste de vaacuterias concentraccedilotildees dos compostos em menor tempo e
utilizando uma quantidade razoaacutevel de materiais optou-se por utilizar as maiores
concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas encontradas avaliando sua atividade antiviral por outras
teacutecnicas Como natildeo foi avaliada atividade antiviral preacutevia para nenhum dos compostos frente
agrave infecccedilatildeo por DENV1 e 2 foi selecionado o Dengue virus 1 para dar prosseguimento aos
ensaios
55 Ensaio Virucida
O ensaio virucida foi realizado para avaliar um potencial efeito dos compostos
diretamente sobre a partiacutecula viral Este ensaio eacute importante pois possibilita elucidar se o
composto pode produzir algum efeito sobre a partiacutecula viral impedindo que esta possa infectar
as ceacutelulas
Figura 14 Ensaio virucida Neste ensaio as aliacutequotas de DENV1 foram incubadas com as
concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos e titulados (NT) Controle natildeo tratado
37
Tabela 3 Ensaio virucida Caacutelculo do tiacutetulo viral (UFPmL) e porcentagem representante de
cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 254 x 105 100
DMSO 263 x 105 10335
A1 199 x 105 7835
A2 205 x 105 8071
A3 237 x 105 9311
A4 775 x 104 3049
A5 153 x 105 6024
A6 219 x 105 8602
A7 243 x 105 9547
A8 254 x 105 100
Lagrota et al (1988) demonstraram atividade de 2-HO-3-N-benzil-N(N-benzil-2-
etilamina) -14-naftoquinona sobre a partiacutecula viral de enterovirus De forma contraacuteria apesar
de se verificar a reduccedilatildeo de quase uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais
para o composto A4 natildeo considerou-se esta uma alteraccedilatildeo significativa pois devido agrave
magnitude do nuacutemero de UFPs se trata de uma alteraccedilatildeo muito pequena Portanto os
compostos avaliados neste trabalho natildeo produziram atividade virucida aparente frente ao
tratamento com as concentraccedilotildees de uso
56 Ensaio Antiviral
O sobrenadante de ceacutelulas tratadas previamente e infectadas por DENV1 coletado 48
horas poacutes infecccedilatildeo foi avaliado quanto agrave produccedilatildeo viral de partiacuteculas infecciosas pela
contagem de placas de lise e caacutelculo de Unidades Formadoras de Placa (Titulaccedilatildeo viral em
placa ndash UFPmL)
38
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral Sobrenadante de ceacutelulas tratadas e infectadas por DENV1
coletado apoacutes 48 horas e titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado
Tabela 4 Ensaio Antiviral Coleta do sobrenadante de ceacutelulas infectadas por DENV1 Tiacutetulo
viral (UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o
controle natildeo tratado como 100
Ao perceber um aumento no tiacutetulo viral frente ao tratamento com os compostos A1
A2 e A3 e uma reduccedilatildeo frente ao tratamento com A4 A5 e A6 foram escolhidos dois
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 119 x 105 10000
A1 235 x 105 19748
A2 228 x 105 19160
A3 318 x 105 26723
A4 128 x 104 1076
A5 186 x 103 156
A6 190 x 104 1597
A7 280 x 104 2353
A8 350 x 104 2941
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
40
Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
10
O Lapachol foi descoberto e estudado desde o seacuteculo XIX Foi isolado primeiramente
do lenho da aacutervore argentina ldquolapachordquo Tabebuia avellanedae (Bignoniaceae) conhecida
como Ipecirc roxo Os estudos quiacutemicos foram desenvolvidos inicialmente em 1892 (Fonseca
2003) O lapachol foi descrito pela primeira vez por Paterno em 1821 tendo sua estrutura
quiacutemica estabelecida em 1896 por Hooker que o identificou como uma naftoquinona Esta
naftoquinona possui accedilatildeo antiinflamatoacuteria analgeacutesica antibioacutetica e anti-neoplaacutesica
reconhecida (Arauacutejo 2002)
A β-lapachona (34-di-hidro-22-dimetil-2H-naptho [12-b] pirano-56-diona) eacute uma
quinona obtida de fontes naturais derivada da aacutervore Lapacho (Tabebuia avellanedae) nativa
da Ameacuterica do Sul e Central A siacutentese e quiacutemica da β-lapachona e compostos relacionados
foi inicialmente investigado no final do seacuteculo XIX e iniacutecio do seacuteculo XX pelo quiacutemico
Samuel Hooker Apesar de alguns estudos cliacutenicos sobre a bioatividade de naftoquinonas
terem sido relatados no iniacutecio de 1940 foi o relatoacuterio do potencial da β-lapachona como um
agente anti-tripanossoma em 1977 que revitalizou o estudo e caracterizaccedilatildeo deste composto
natural A β-lapachona tambeacutem apresenta vaacuterias accedilotildees farmacoloacutegicas incluindo accedilatildeo
formaccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (Hussain 2007)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do Lapachol (1) da α- Lapachona (2) e da β-
Lapachona (Fonseca et al 2003 Ferreira et al 2010)
11
Figura 6 Tabebuia avellanedae (Hussain 2007)
A β-lapachona eacute uma substacircncia natural facilmente obtida a partir do lapachol Esta
naftoquinona eacute o grande destaque desta classe de substacircncias porque se encontra em testes
cliacutenicos de fase II para o tratamento do cacircncer de pacircncreas (Ferreira 2010) O mecanismo de
accedilatildeo da β-lapachona diferencia-se de outros antineoplaacutesicos por atuar na topoisomerase I
promovendo a recuperaccedilatildeo da capacidade de apoptose celular Alguns estudos reportam sua
accedilatildeo sineacutergica de potenciaccedilatildeo com o Taxolreg
promovendo a inibiccedilatildeo em diferentes pontos de
replicaccedilatildeo celular aleacutem de sua combinaccedilatildeo com outros tratamentos como a aplicaccedilatildeo de
radiaccedilatildeo ionizante (Cunha 2005)
Vaacuterios estudos jaacute foram publicados demonstrando a atividade antiviral de
naftoquinonas naturais e sinteacuteticas A β-lapachona inibe seletivamente a replicaccedilatildeo do viacuterus
HIV-1 atuando na inibiccedilatildeo da enzima LTR117 Da mesma forma este composto eacute um
potente inibidor da enzima transcriptase reversa dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e
leucemia murina de Rauscher (RLV) inibindo tambeacutem a DNA polimerase A accedilatildeo inibitoacuteria
sobre estas enzimas revelou-se especiacutefica se comparada com a de outros inibidores
conhecidos (Silva 2003)
O Lapachol jaacute demonstrou atividade contra certas cepas virais incluindo Herpes virus
tipos I e II Outras naftoquinonas jaacute mostraram eficaacutecia contra cepas de Influenza virus
Poliomielite virus e estomatite vesicular Supotildee-se que o mecanismo de accedilatildeo destas quinonas
seja atraveacutes da inibiccedilatildeo da transcriptase reversa de retroviacuterus e da RNA polimerase Eacute relatado
12
que lapachol diminui a replicaccedilatildeo do viacuterus em seres humanos mas ainda natildeo existem
resultados de testes cliacutenicos disponiacuteveis (Hussain 2007)
Na avaliaccedilatildeo da atividade antiviral do Lapachol in vitro verificou-se que esta
substacircncia eacute ativa contra viacuterus RNA atuando tanto sobre viacuterus envelopados quanto sobre
partiacuteculas sem esta estrutura em concentraccedilotildees de 5 a 10 microgmL e ainda apresentou uma
pequena atividade sobre HSV (Herpes simplex I) e Ad5 (Adeno tipo 5) mas nenhuma
atividade sobre CoxB4 (Coxsackie B4) Em trabalho posterior demonstrou-se que nem o
Lapachol nem diversos dos seus derivados apresentaram atividade antiviral in vitro sobre
Poliovirus tipo 1 Ecovirus 19 e Coxsackie B tipo 4 Apenas os derivados 12-naftoquinonicos
e um intermediaacuterio da siacutentese Hoocker foram ativos contra o Echovirus 19 (Fonseca 2003)
Costa et al (2013) relataram que piranonaftoquinonas isocircmeras do lapachol possuem
atividade de inibiccedilatildeo da replicaccedilatildeo de DENV-2 atuando sobre a atividade da ATPase de NS3
(proteiacutena natildeo estrutural de DENV)
A utilizaccedilatildeo de testes in vitro por meio de ensaios de viabilidade celular constitui o
primeiro passo para a avaliaccedilatildeo da compatibilidade bioloacutegica de uma substacircncia e pode
fornecer elementos importantes para a anaacutelise da biocompatibilidade dos diferentes materiais
Para ser considerado natildeo citotoacutexico no teste de citotoxicidade in vitro um produto natildeo deve
ocasionar a morte das ceacutelulas nem afetar suas funccedilotildees celulares A prova do MTT eacute um dos
indicadores colorimeacutetricos de viabilidade celular mais utilizados sendo capaz de avaliar a
funccedilatildeo celular mitocondrial de acordo com a reduccedilatildeo enzimaacutetica do sal de tetrazoacutelio pelas
desidrogenases mitocondriais nas ceacutelulas viaacutevies (Arauacutejo et al 2008) Supotildee-se que o
mecanismo responsaacutevel pela citotoxicidade apresentada pelas quinonas esteja relacionado
com o estresse oxidativo causado por esses compostos poreacutem a capacidade de alquilaccedilatildeo de
nucleoacutefilos celulares tambeacutem representa correlaccedilatildeo com tais efeitos bioloacutegicos (Goulart
2004)
13
II JUSTIFICATIVA
14
2 JUSTIFICATIVA
Aleacutem do controle do mosquito transmissor e do desenvolvimento de vacinas que tem
sido exaustivamente estudado nos uacuteltimos anos uma alternativa para o combate agrave dengue
seria o desenvolvimento de faacutermacos para reduzir a viremia ou mesmo para controlar a
resposta imune do hospedeiro agrave infecccedilatildeo que tem sido apontada como principal fator de risco
nos casos mais graves Em funccedilatildeo disso o nuacutemero de pesquisas visando o desenvolvimento
de drogas com accedilatildeo antiviral ou com accedilatildeo imunomodulatoacuteria tem aumentado
significativamente As naftoquinonas vecircm ganhando bastante importacircncia na pesquisa de
novas drogas antivirais devido agrave algumas atividades apresentadas A szlig-lapachona-orto-
naftoquinona por exemplo se mostrou um potente inibidor da enzima transcriptase reversa
dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e leucemia murina de Rauscher (RLV)
Diante da inexistecircncia de drogas com accedilatildeo anti DENV e o elevado nuacutemero e casos da
patogenia nos uacuteltimos anos a organizaccedilatildeo mundial da sauacutede classificou a Dengue como uma
epidemia de proporccedilotildees globais e um problema de sauacutede puacuteblica Como as naftoquinonas jaacute
demonstraram na literatura possuir um potencial efeito terapecircutico contra alguns viacuterus eacute
possiacutevel que estes compostos possam apresentar atividade antiviral contra DENV Portanto
este trabalho visou atraveacutes de ensaios de MTT e titulaccedilotildees virais em placa avaliar a potencial
atividade antiviral de oito compostos derivados de naftoquinonas naturais e sinteacuteticas
15
III OBJETIVOS
16
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar oito compostos (2 naturais e 6 sinteacuteticos) derivados de naftoquinonas como potenciais
agentes antivirais em ceacutelulas BHK-21 frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1 e 2
32 Objetivos especiacuteficos
1 Calcular o iacutendice de citotoxicidade e a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) dos compostos
atraveacutes de ensaio de reduccedilatildeo de MTT
2 Avaliar os efeitos dos compostos sobre o crescimento a viabilidade e o volume celular
pela teacutecnica de exclusatildeo do azul de tripan
3 Determinar a multiplicidade de infecccedilatildeo de DENV 1 e 2 a ser utilizada nos ensaios
antivirais
4 Avaliar a atividade antiviral dos compostos frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1
e 2 atraveacutes do ensaio de MTT
5 Verificar um possiacutevel efeito direto dos compostos agraves partiacuteculas virais de Dengue virus
6 Quantificar a produccedilatildeo de partiacuteculas virais infecciosas no sobrenadante de ceacutelulas
infectadas atraveacutes de titulaccedilatildeo viral pela contagem de unidades formadoras de placas
17
IV MATERIAL E MEacuteTODOS
18
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Linhagens celulares
411 Ceacutelulas C636
As ceacutelulas C636 satildeo ceacutelulas de linhagem contiacutenua de larvas de mosquito Aedes
albopictus Estas ceacutelulas foram utilizadas na produccedilatildeo de estoque viral de DENV sorotipos 1
e 2 para isso foram mantidas em meio de cultura Leibovitz-15 (L-15) (Cultilab)
suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (Cultilab) antibioacuteticos (Penicilina 100 UmL
Streptomicina 100 microgmL) e antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL) a 28degC
412 Ceacutelulas BHK-21
As ceacutelulas BHK-21 satildeo fibroblastos de linhagem contiacutenua derivados de rim de hamster
neonato Estas ceacutelulas foram utilizadas para os experimentos in vitro e para as titulaccedilotildees de
DENV 1 e 2 para isso foram mantidas em meio miacutenimo essencial modificado por Dulbecco
ndash DMEM (Cultilab) suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (SFB) com antibioacuteticos
(Penicilina 100 UmL Streptomicina 100 microgmL) e com antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL)
sendo mantidas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5
42 Viacuterus
421 DENV 1 e DENV 2
O Sorotipo 1 do Dengue virus (DENV-1) estirpe Mochizuki foi replicado em ceacutelulas
C636 para gerar estoques de trabalho durante 2 e 5 dias a 28degC O sobrenadante da cultura de
ceacutelulas infectadas foi recolhido e clarificado por centrifugaccedilatildeo a 4000 G durante 10 minutos agrave
4degC e entatildeo foi aliquotado e armazenado a -70 deg C como reserva de viacuterus ateacute agrave sua utilizaccedilatildeo
A replicaccedilatildeo geraccedilatildeo de estoque e titulaccedilatildeo do Sorotipo 2 do Dengue virus (DENV-2)
estirpe Nova Guineacute C ocorreu nos mesmos moldes do DENV-1
19
422 Titulaccedilatildeo viral
Os estoques virais foram diluiacutedos (10-1
a 10-7
) e inoculados em monocamadas de
ceacutelulas BHK-21 implantadas em placas de 6 poccedilos com confluecircncia de aproximadamente
60 (3x105 ceacutelulas por poccedilo) sendo um poccedilo natildeo infectado mantido para controle celular
Apoacutes uma hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus foram adicionados 3 mL de meio DMEM (Cultilab)
suplementado com 15 de SFB e contendo 15 de Carboximetilcelulose (CMC Synth) As
placas foram entatildeo incubadas a 37degC (CO2 a 5) por 96 horas As ceacutelulas foram entatildeo
fixadas com 2 mL de soluccedilatildeo de formol a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo
1 (pv) de cristal violeta em PBS para contagem das placas de lise O tiacutetulo viral foi
expresso atraveacutes do nuacutemero de unidades formadoras de placa por mL (UFPmL) segundo a
formula abaixo representada
Tiacutetulo viral (UFPmL) = N x FC x 10
N = nuacutemero de placas de lise contadas
FC = Fator de correccedilatildeo
= Inverso da diluiccedilatildeo na qual foram contadas as placas de lise
43 Compostos de naftoquinonas
Os compostos utilizados neste estudo foram fornecidos pelo Dr Geraldo Ceacutelio
Brandatildeo do laboratoacuterio de pesquisa da Escola de Farmaacutecia da Universidade Federal de Ouro
Preto
20
Tabela 1 Relaccedilatildeo de nome estrutura e coacutedigo dos compostos utilizados Na tabela estatildeo
presentes a relaccedilatildeo dos nomes dos compostos utilizados neste trabalho bem como sua
estrutura Os coacutedigos representantes de cada composto seratildeo utilizados no decorrer da escrita
Nome do composto Estrutura Coacutedigo
Lapachol
A1
β-lapachona
A2
2-Hidroxi-3-(ββ-dimetilvinil)-14-naftoquinona
A3
2-Cloro-14-naftoquinona
A4
Lapachol derivado 1
A5
Lapachol derivado 2 A6
Lapachol derivado 3 A7
Lapachol derivado 4 A8
44 Ensaio de citotoxicidade
Para avaliar a citotoxicidade dos compostos ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas foram incubadas com diferentes concentraccedilotildees dos compostos em triplicata num
volume de 200 microL de meio de cultura por poccedilo na presenccedila de 1 de SFB Os controles natildeo
tratados apresentaram adiccedilatildeo de 200 microL de meio de cultura As ceacutelulas foram entatildeo incubadas
durante 72 horas O meio foi removido e 28 microL de soluccedilatildeo de 5 mg mL MTT (brometo de 3-
21
[45-dimetil-tiazol-2-il]-25 difeniltertrazoacutelio) foi adicionado a cada poccedilo As placas foram re-
incubadas durante 1 hora e 30 minutos e entatildeo 122 microL de DMSO foi adicionado a cada poccedilo e
placas foram agitadas suavemente durante 15 minutos para dissolver os cristais de formazan
A absorbacircncia foi lida em um equipamento leitor de placas Victor X3 (PerkinElmer) a 490
nm A concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC 50) foi definida como a concentraccedilatildeo da amostra que
reduziu a viabilidade celular de 50 em comparaccedilatildeo com controles natildeo tratados Os dados
foram analisados utilizando o programa Prisma
45 Avaliaccedilatildeo da viabilidade e crescimento celular por exclusatildeo de azul de tripan
Ceacutelulas BHK-21 foram cultivadas em placas de 24 poccedilos (7x104 ceacutelulaspoccedilo) e apoacutes
24 horas foram tratadas com as concentraccedilotildees de uso de cada composto e incubadas por 72
horas na presenccedila de 1 de SFB A seguir as ceacutelulas foram tripsinizadas e incubadas com
azul de tripan e entatildeo foi utilizado um contador automatizado de ceacutelulas (Countess II FL
Automated Cell Counter ndash Thermo Fisher Scientific) para contagem das ceacutelulas e avaliaccedilatildeo da
porcentagem de viabilidade e diacircmetro celular do controle nos tempos de 0 24 e 96 horas e
avaliaccedilatildeo dos mesmos paracircmetros para os compostos no tempo de 96 horas (72 horas poacutes
tratamento)
Outra curva de multiplicaccedilatildeo celular foi feita para os compostos A1 A3 A4 e A5 onde as
ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos no momento da confecccedilatildeo da placa e
foram avaliados os mesmos paracircmetros nos tempos de 0 12 24 48 e 72 horas O
equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
46 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
Para determinar a menor Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) responsaacutevel pela letalidade
celular total 2x104 de ceacutelulas BHK-21 foram semeadas em placa de 96 poccedilos Apoacutes a
incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o
meio de cultura foi removido e as ceacutelulas foram expostas a diferentes diluiccedilotildees dos dois
sorotipos de DENV (100 microL de cada diluiccedilatildeo + 100 microL de meio DEMEM 1 SFB) As
diluiccedilotildees seriadas foram realizadas da suspensatildeo viral na razatildeo de 5 para o primeiro poccedilo e de
2 para os demais poccedilos Apoacutes 72 horas as ceacutelulas foram entatildeo fixadas com 200 microL de soluccedilatildeo
22
formalina a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo 1 (pv) de cristal violeta em
PBS para avaliaccedilatildeo da maior diluiccedilatildeo responsaacutevel pela letalidade de 100 das ceacutelulas
47 Ensaio Dose-resposta
Para cada composto foram realizados ensaios de dose-resposta para definiccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de cada composto capaz de promover a reduccedilatildeo na produccedilatildeo viral A atividade
antiviral foi avaliada tambeacutem pelo meacutetodo de MTT Ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas expostas a diferentes concentraccedilotildees dos extratos determinadas a partir das maiores
concentraccedilotildees em que natildeo foram observados efeitos citotoacutexicos As ceacutelulas foram tratadas
com as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de cada composto e em seguida infectadas com DENV
1 (MOI= 5) ou 2 (MOI= 2) Mantendo uma coluna para controle com DMSO uma coluna
para controle de viacuterus uma coluna para controle de citotoxicidade dos compostos e por fim
uma coluna para controle celular As ceacutelulas foram entatildeo incubadas durante 72 horas Apoacutes
este tempo procedeu-se a leitura pelo ensaio de MTT como descrito anteriormente Os dados
foram analisados levando-se em consideraccedilatildeo a leitura das absorbacircncias dos poccedilos dos
controles de viacuterus e do controle celular
Para realizacao destes experimentos os seguintes controles foram adotados
Controle de ceacutelulas poccedilos contendo somente ceacutelulas acrescidas do meio de cultura DMEM
1 SFB Utilizado para avaliar o comportamento das ceacutelulas sem que as mesmas tivessem
contato com qualquer interferente durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo Com isso os poccedilos
reservados para esse controle serviram de padratildeo para comparaccedilatildeo com aqueles em que fosse
observada atividade citotoacutexica ou citopaacutetica
Controle de viacuterus poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM 1 SFB
sem nenhum tratamento e de suspensatildeo de viacuterus Utilizando como referecircncia para anaacutelise da
atividade citopaacutetica provocada pelo viacuterus testado durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo das placas
23
Controle de viacuterus com DMSO Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura
DMEM 1 SFB e DMSO Foi utilizado para avaliar se havia influecircncia prejudicial do
solvente utilizado para diluiccedilatildeo das amostras no meio de cultivo das ceacutelulas e se o mesmo
poderia apresentar alguma potencial atividade antiviral aparente
Controle de citotoxicidade Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM
1 SFB e as quatro principais concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos Foi utilizado
para avaliar se haveria alguma possiacutevel atividade citotoacutexica das concentraccedilotildees dos compostos
em relaccedilatildeo agraves ceacutelulas
48 Ensaio Virucida
Para a realizaccedilatildeo deste ensaio aliacutequotas de 950 microL (diluiccedilatildeo de 20 vezes) do DENV 1 (tiacutetulo
6 x 107 UFPmL) foram incubadas com 50 microL de uma soluccedilatildeo de meio DMEM preparada
com 20x a concentraccedilatildeo natildeo citotoacutexica de cada composto A1 a A8 em banho-maria 37deg C
por 1 hora Apoacutes a incubaccedilatildeo as aliacutequotas foram imediatamente tituladas em ceacutelulas BHK-21
em placas de 6 poccedilos utilizando-se 3 diluiccedilotildees para cada incubaccedilatildeo (20x 20 x 10-1
e 20 x 10-
2) Foram titulados tambeacutem uma aliacutequota incubada apenas com meio DMEM sem nenhum
tratamento e outra aliacutequota incubada com DMSO (Dimetilsulfoacutexido) Estas foram tituladas
utilizando um controle e mais cinco diluiccedilotildees (20x 20 x 10-1
20 x 10-2
20 x 10-3
e 20 x 10-4
)
49 Ensaio antiviral
Neste ensaio ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em placas de 24 poccedilos no dia
seguinte foram tratadas durante 4 horas com as concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas de cada
composto em duplicata Apoacutes o preacute-tratamento as monocamadas foram infectadas com
DENV-1 a uma MOI=5 na presenccedila das concentraccedilotildees de uso respectivas de cada composto
Apoacutes 1 hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus as monocamadas foram lavadas duas vezes com PBS e
foi adicionado 500 microL por poccedilo de meio preparado com as mesmas concentraccedilotildees dos
diferentes compostos e mantidos durante 48 horas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5 Em
quatro poccedilos as ceacutelulas foram infectadas e natildeo tratadas e em outros quatro poccedilos as ceacutelulas
natildeo foram tratadas e nem infectadas (controle de ceacutelulas) destes uacuteltimos dois foram
tripsinizados e contados no momento da infecccedilatildeo e os outros dois apoacutes o teacutermino do ensaio
24
para avaliar o crescimento celular Decorridas as 48 horas o sobrenadante foi coletado e
centrifugado por 10 minutos a 4000 xG para separaccedilatildeo dos debris celulares e prontamente
titulado em placa de 6 poccedilos
410 Anaacutelise estatiacutestica
Os valores de CC50 foram obtidos a partir de anaacutelise de regressatildeo linear das curvas de
concentraccedilatildeocitotoxicidade A anaacutelise estatiacutestica dos dados foi realizada pelo programa
GraphPad Prism software Uma anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi utilizada para determinar
as diferenccedilas estatiacutesticas seguida do poacutes teste de Tukey A significacircncia estatiacutestica foi fixada
em p lt005
25
V RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
26
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Ensaio de citotoxicidade celular
Para avaliar a viabilidade da linhagem celular BHK-21 frente ao tratamento com oito
diferentes concentraccedilotildees dos compostos (A1 a A8) realizou-se um ensaio de MTT (brometo
de 3-[45-dimetil-tiazol-2-il]-25-difeniltetrazoacutelio) Este ensaio tem o objetivo de quantificar
espectrofotometricamente o crescimento celular a viabilidade e proliferaccedilatildeo podendo ser
utilizado como um indicador direto de citotoxicidade Trata-se de um ensaio colorimeacutetrico
para medir a atividade da redutase mitocondrial em ceacutelulas vivas Ele se baseia na reduccedilatildeo do
sal amarelo tetrazoacutelio (permeaacutevel agrave membrana celular) para cristais de formazan azuis
puacuterpura por ceacutelulas metabolicamente ativas a quantidade de formazan gerada medida por
espectrofotometria eacute proporcional ao nuacutemero de ceacutelulas viaacuteveis
A CC50 foi calculada plotando-se uma curva de porcentagem de viabilidade celular por
concentraccedilatildeo melhor representada na figura 7 pelo composto A7 e os resultados de CC50
para todos os compostos estatildeo representados na tabela 2 Foram feitos ensaios de
citotoxicidade com oito concentraccedilotildees diferentes sendo escolhida a maior concentraccedilatildeo que
natildeo apresentou citotoxicidade
Viabilidade Celular = [ ( A ndash B ) A ] x 100
Onde
A = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas natildeo tratadas
B = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas tratadas com
as respectivas concentraccedilotildees de cada composto
27
28
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (A curva dose resposta do composto A7 eacute a que
melhor representa a curva dose resposta esperada) Avaliou-se a viabilidade da linhagem
celular BHK-21 frente agrave diferentes concentraccedilotildees dos compostos realizando o ensaio de MTT
e determinando assim as concentraccedilotildees a serem utilizadas nos proacuteximos ensaios bem como
calculando a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) agrave partir da curva
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo
da concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50)
Composto Concentraccedilatildeo utilizada
[ ] microgmL
Concentraccedilatildeo citotoacutexica 50
(CC50) [ ] microgmL plusmn Desvio
Padratildeo
A1 ([ ]=1 mgmL) 00200 10010 plusmn 0014
A2 ([ ]=1 mgmL) 00025 09561 plusmn 0023
A3 ([ ]=1 mgmL) 00025 09988 plusmn 0017
A4 ([ ]=5 mgmL) 00125 10150 plusmn 0036
A5 ([ ]=10 mgmL) 00250 10590 plusmn 0047
A6 ([ ]=5 mgmL) 00250 08183 plusmn 0030
A7 ([ ]=5 mgmL) 00125 10280 plusmn 0052
A8 ([ ]=5 mgmL) 00125 09758 plusmn 0036
52 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan
Para corroborar o ensaio anterior de citotoxicidade utilizou -se o teste de viabilidade
celular pela teacutecnica da exclusatildeo do azul de tripan com a finalidade de determinar a
viabilidade das ceacutelulas Os procedimentos adotados no ensaio seguiram o manual do
equipamento contador automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL Automated Cell Counter) entatildeo
foi acrescentado agrave 10 microL da suspensatildeo celular 10 microL de azul de tripan (04) Apoacutes
homogeneizaccedilatildeo 10 microL da suspensatildeo foi colocada no local indicado da lacircmina proacutepria para
leitura e foi realizada a contagem sendo consideradas mortas (inviaacuteveis) as ceacutelulas que
incorporavam o corante e viaacuteveis as que excluiacuteam o azul de tripan
29
O equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
(A)
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan A avaliaccedilatildeo da
viabilidade celular foi realizada atraveacutes de um contador automaacutetico de ceacutelulas Este
equipamento possibilita explorar ferramentas de fotografia e avaliar alguns paracircmetros
importantes (A) fotografia das ceacutelulas (B) Zoom na fotografia das ceacutelulas com marcaccedilotildees
(em verde para ceacutelulas vivas e vermelho para mortas) e (D) contagem das ceacutelulas totais
ceacutelulas vivas e mortas graacutefico e meacutedia dos diacircmetros celulares das ceacutelulas vivas e mortas
(B)
(C)
30
O crescimento celular de ceacutelulas natildeo tratadas foi avaliado nos tempos de 0h (momento
da confecccedilatildeo da placa) 24h (momento de tratamento com os compostos) e 96 horas
(Momento em que todas as ceacutelulas foram tripsinizadas e contadas) para avaliar o perfil do
crescimento celular em ceacutelulas natildeo tratadas Foi observado um crescimento celular no periacuteodo
de 24 horas onde as ceacutelulas estavam incubadas com meio acrescido de 10 SFB Em 24
horas o meio foi trocado por 1 SFB e acrescido das substacircncias testes nas menores diluiccedilotildees
natildeo citotoacutexicas determinadas pelo ensaio do MTT Em 96 horas pode ser observado um
decaimento no nuacutemero de ceacutelulas vivas provavelmente devido ao crescimento celular (morte
por confluecircncia)
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas)
(A) (B)
31
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas (A)
Contagem de ceacutelulas vivas (B) Percentual de ceacutelulas viaacuteveis (Viabilidade celular ) e (C)
Meacutedia do diacircmetro apresentado pelas ceacutelulas vivas
Em 96 horas as ceacutelulas natildeo tratadas bem como as ceacutelulas tratadas por 72 horas com as
concentraccedilotildees de uso dos compostos foram tripsinizadas e avaliadas quanto ao nuacutemero de
ceacutelulas vivas viabilidade e diacircmetro celular apresentados na figura 10
Segundo se observa natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo aparente que possa demonstrar que
as concentraccedilotildees de uso dos compostos tenham causado alguma atividade citotoacutexica
corroborando assim os ensaios de citotoxicidade anteriores
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
A infectividade de um viacuterus depende de vaacuterios fatores entre eles da proporccedilatildeo de
partiacuteculas virais completas ou infecciosas da suscetibilidade da ceacutelula hospedeira e da
chance desta partiacutecula encontrar o receptor e penetrar na ceacutelula Quando ceacutelulas suscetiacuteveis
satildeo misturadas com uma suspensatildeo de viacuterus estas podem receber uma duas trecircs ou dez
partiacuteculas virais ou nenhuma Isto depende da proporccedilatildeo entre a quantidade de viacuterus
infecciosos presente no inoculo e a quantidade de ceacutelulas utilizada Esta relaccedilatildeo eacute denominada
de multiplicidade de infecccedilatildeo ou MOI Uma MOI=1 indica que a infecccedilatildeo foi feita em
principio com 1 viacuterus ou 1 dose infectante por ceacutelula
A determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo dos Dengue virus 1 e 2 a serem
utilizadas nos proacuteximos ensaios foi feita a partir da infecccedilatildeo de ceacutelulas BHK-21 por diferentes
(C)
32
concentraccedilotildees de viacuterus e revelaccedilatildeo com cristal violeta Escolheu-se a maior diluiccedilatildeo viral que
possibilitou a letalidade total das ceacutelulas (faixa onde todas as ceacutelulas estatildeo mortas utilizando
menor concentraccedilatildeo de viacuterus) As faixas escolhidas foram entatildeo calculadas levando-se em
consideraccedilatildeo o nuacutemero de ceacutelulas presentes no poccedilo e o nuacutemero de partiacuteculas virais que foram
adicionadas (Faixa3 para DENV2 e 2 para DENV1) Figura 11 Foi estipulado portanto a
Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 2 para DENV 2 e 5 para DENV 1
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI A partir da infecccedilatildeo da linhagem celular BHK-21 em
placa de 96 poccedilos com diferentes diluiccedilotildees de DENV foi determinado que a Multiplicidade
de infecccedilatildeo para o Dengue viacuterus sorotipos 1 e 2 seria de 5 e 2 respectivamente (colunas 2 -
DENV1 e 3 - DENV2)
54 Ensaio dose resposta
Apoacutes a determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas ideais realizou-se um
ensaio dose resposta tratando as ceacutelulas com oito concentraccedilotildees agrave partir das concentraccedilotildees natildeo
citotoacutexicas escolhidas para cada composto e em seguida infectando com DENV sorotipos 1 e
2 nas MOIs estipuladas anteriormente (5 e 2 respectivamente) A porcentagem do efeito
protetor conferida agraves ceacutelulas para cada concentraccedilatildeo de amostra testada foi calculada da
seguinte forma
33
EP = [ (A ndash B) (C ndash B) ] x 100
Onde
A Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas tratadas e infectadas
B Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e infectadas
C Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e natildeo infectadas
Este ensaio tem por objetivo identificar a resposta celular agrave infecccedilatildeo frente ao
tratamento com os compostos em diferentes concentraccedilotildees Assim como o ensaio de
toxicidade este ensaio feito utilizando a teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT permite o teste de vaacuterias
concentraccedilotildees diferentes em um menor tempo e com baixo gasto de material
34
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV1
(MOI=5)
35
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV2
(MOI=2)
36
Takegami et al (1998) demonstraram atividade de furanonaftoquinonas contra o viacuterus
da Encefalite Japonesa (Flavivirus) utilizando a concentraccedilatildeo de 3microgmL poreacutem para os
compostos apresentados avaliados pela teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT nenhuma das
concentraccedilotildees apresentadas produziu efeito antiviral significativo em relaccedilatildeo ao controle
celular como observado nas figuras 12 e 13
Apesar da teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT ser interessante como triagem de atividade
antiviral permitindo o teste de vaacuterias concentraccedilotildees dos compostos em menor tempo e
utilizando uma quantidade razoaacutevel de materiais optou-se por utilizar as maiores
concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas encontradas avaliando sua atividade antiviral por outras
teacutecnicas Como natildeo foi avaliada atividade antiviral preacutevia para nenhum dos compostos frente
agrave infecccedilatildeo por DENV1 e 2 foi selecionado o Dengue virus 1 para dar prosseguimento aos
ensaios
55 Ensaio Virucida
O ensaio virucida foi realizado para avaliar um potencial efeito dos compostos
diretamente sobre a partiacutecula viral Este ensaio eacute importante pois possibilita elucidar se o
composto pode produzir algum efeito sobre a partiacutecula viral impedindo que esta possa infectar
as ceacutelulas
Figura 14 Ensaio virucida Neste ensaio as aliacutequotas de DENV1 foram incubadas com as
concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos e titulados (NT) Controle natildeo tratado
37
Tabela 3 Ensaio virucida Caacutelculo do tiacutetulo viral (UFPmL) e porcentagem representante de
cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 254 x 105 100
DMSO 263 x 105 10335
A1 199 x 105 7835
A2 205 x 105 8071
A3 237 x 105 9311
A4 775 x 104 3049
A5 153 x 105 6024
A6 219 x 105 8602
A7 243 x 105 9547
A8 254 x 105 100
Lagrota et al (1988) demonstraram atividade de 2-HO-3-N-benzil-N(N-benzil-2-
etilamina) -14-naftoquinona sobre a partiacutecula viral de enterovirus De forma contraacuteria apesar
de se verificar a reduccedilatildeo de quase uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais
para o composto A4 natildeo considerou-se esta uma alteraccedilatildeo significativa pois devido agrave
magnitude do nuacutemero de UFPs se trata de uma alteraccedilatildeo muito pequena Portanto os
compostos avaliados neste trabalho natildeo produziram atividade virucida aparente frente ao
tratamento com as concentraccedilotildees de uso
56 Ensaio Antiviral
O sobrenadante de ceacutelulas tratadas previamente e infectadas por DENV1 coletado 48
horas poacutes infecccedilatildeo foi avaliado quanto agrave produccedilatildeo viral de partiacuteculas infecciosas pela
contagem de placas de lise e caacutelculo de Unidades Formadoras de Placa (Titulaccedilatildeo viral em
placa ndash UFPmL)
38
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral Sobrenadante de ceacutelulas tratadas e infectadas por DENV1
coletado apoacutes 48 horas e titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado
Tabela 4 Ensaio Antiviral Coleta do sobrenadante de ceacutelulas infectadas por DENV1 Tiacutetulo
viral (UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o
controle natildeo tratado como 100
Ao perceber um aumento no tiacutetulo viral frente ao tratamento com os compostos A1
A2 e A3 e uma reduccedilatildeo frente ao tratamento com A4 A5 e A6 foram escolhidos dois
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 119 x 105 10000
A1 235 x 105 19748
A2 228 x 105 19160
A3 318 x 105 26723
A4 128 x 104 1076
A5 186 x 103 156
A6 190 x 104 1597
A7 280 x 104 2353
A8 350 x 104 2941
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
40
Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
11
Figura 6 Tabebuia avellanedae (Hussain 2007)
A β-lapachona eacute uma substacircncia natural facilmente obtida a partir do lapachol Esta
naftoquinona eacute o grande destaque desta classe de substacircncias porque se encontra em testes
cliacutenicos de fase II para o tratamento do cacircncer de pacircncreas (Ferreira 2010) O mecanismo de
accedilatildeo da β-lapachona diferencia-se de outros antineoplaacutesicos por atuar na topoisomerase I
promovendo a recuperaccedilatildeo da capacidade de apoptose celular Alguns estudos reportam sua
accedilatildeo sineacutergica de potenciaccedilatildeo com o Taxolreg
promovendo a inibiccedilatildeo em diferentes pontos de
replicaccedilatildeo celular aleacutem de sua combinaccedilatildeo com outros tratamentos como a aplicaccedilatildeo de
radiaccedilatildeo ionizante (Cunha 2005)
Vaacuterios estudos jaacute foram publicados demonstrando a atividade antiviral de
naftoquinonas naturais e sinteacuteticas A β-lapachona inibe seletivamente a replicaccedilatildeo do viacuterus
HIV-1 atuando na inibiccedilatildeo da enzima LTR117 Da mesma forma este composto eacute um
potente inibidor da enzima transcriptase reversa dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e
leucemia murina de Rauscher (RLV) inibindo tambeacutem a DNA polimerase A accedilatildeo inibitoacuteria
sobre estas enzimas revelou-se especiacutefica se comparada com a de outros inibidores
conhecidos (Silva 2003)
O Lapachol jaacute demonstrou atividade contra certas cepas virais incluindo Herpes virus
tipos I e II Outras naftoquinonas jaacute mostraram eficaacutecia contra cepas de Influenza virus
Poliomielite virus e estomatite vesicular Supotildee-se que o mecanismo de accedilatildeo destas quinonas
seja atraveacutes da inibiccedilatildeo da transcriptase reversa de retroviacuterus e da RNA polimerase Eacute relatado
12
que lapachol diminui a replicaccedilatildeo do viacuterus em seres humanos mas ainda natildeo existem
resultados de testes cliacutenicos disponiacuteveis (Hussain 2007)
Na avaliaccedilatildeo da atividade antiviral do Lapachol in vitro verificou-se que esta
substacircncia eacute ativa contra viacuterus RNA atuando tanto sobre viacuterus envelopados quanto sobre
partiacuteculas sem esta estrutura em concentraccedilotildees de 5 a 10 microgmL e ainda apresentou uma
pequena atividade sobre HSV (Herpes simplex I) e Ad5 (Adeno tipo 5) mas nenhuma
atividade sobre CoxB4 (Coxsackie B4) Em trabalho posterior demonstrou-se que nem o
Lapachol nem diversos dos seus derivados apresentaram atividade antiviral in vitro sobre
Poliovirus tipo 1 Ecovirus 19 e Coxsackie B tipo 4 Apenas os derivados 12-naftoquinonicos
e um intermediaacuterio da siacutentese Hoocker foram ativos contra o Echovirus 19 (Fonseca 2003)
Costa et al (2013) relataram que piranonaftoquinonas isocircmeras do lapachol possuem
atividade de inibiccedilatildeo da replicaccedilatildeo de DENV-2 atuando sobre a atividade da ATPase de NS3
(proteiacutena natildeo estrutural de DENV)
A utilizaccedilatildeo de testes in vitro por meio de ensaios de viabilidade celular constitui o
primeiro passo para a avaliaccedilatildeo da compatibilidade bioloacutegica de uma substacircncia e pode
fornecer elementos importantes para a anaacutelise da biocompatibilidade dos diferentes materiais
Para ser considerado natildeo citotoacutexico no teste de citotoxicidade in vitro um produto natildeo deve
ocasionar a morte das ceacutelulas nem afetar suas funccedilotildees celulares A prova do MTT eacute um dos
indicadores colorimeacutetricos de viabilidade celular mais utilizados sendo capaz de avaliar a
funccedilatildeo celular mitocondrial de acordo com a reduccedilatildeo enzimaacutetica do sal de tetrazoacutelio pelas
desidrogenases mitocondriais nas ceacutelulas viaacutevies (Arauacutejo et al 2008) Supotildee-se que o
mecanismo responsaacutevel pela citotoxicidade apresentada pelas quinonas esteja relacionado
com o estresse oxidativo causado por esses compostos poreacutem a capacidade de alquilaccedilatildeo de
nucleoacutefilos celulares tambeacutem representa correlaccedilatildeo com tais efeitos bioloacutegicos (Goulart
2004)
13
II JUSTIFICATIVA
14
2 JUSTIFICATIVA
Aleacutem do controle do mosquito transmissor e do desenvolvimento de vacinas que tem
sido exaustivamente estudado nos uacuteltimos anos uma alternativa para o combate agrave dengue
seria o desenvolvimento de faacutermacos para reduzir a viremia ou mesmo para controlar a
resposta imune do hospedeiro agrave infecccedilatildeo que tem sido apontada como principal fator de risco
nos casos mais graves Em funccedilatildeo disso o nuacutemero de pesquisas visando o desenvolvimento
de drogas com accedilatildeo antiviral ou com accedilatildeo imunomodulatoacuteria tem aumentado
significativamente As naftoquinonas vecircm ganhando bastante importacircncia na pesquisa de
novas drogas antivirais devido agrave algumas atividades apresentadas A szlig-lapachona-orto-
naftoquinona por exemplo se mostrou um potente inibidor da enzima transcriptase reversa
dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e leucemia murina de Rauscher (RLV)
Diante da inexistecircncia de drogas com accedilatildeo anti DENV e o elevado nuacutemero e casos da
patogenia nos uacuteltimos anos a organizaccedilatildeo mundial da sauacutede classificou a Dengue como uma
epidemia de proporccedilotildees globais e um problema de sauacutede puacuteblica Como as naftoquinonas jaacute
demonstraram na literatura possuir um potencial efeito terapecircutico contra alguns viacuterus eacute
possiacutevel que estes compostos possam apresentar atividade antiviral contra DENV Portanto
este trabalho visou atraveacutes de ensaios de MTT e titulaccedilotildees virais em placa avaliar a potencial
atividade antiviral de oito compostos derivados de naftoquinonas naturais e sinteacuteticas
15
III OBJETIVOS
16
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar oito compostos (2 naturais e 6 sinteacuteticos) derivados de naftoquinonas como potenciais
agentes antivirais em ceacutelulas BHK-21 frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1 e 2
32 Objetivos especiacuteficos
1 Calcular o iacutendice de citotoxicidade e a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) dos compostos
atraveacutes de ensaio de reduccedilatildeo de MTT
2 Avaliar os efeitos dos compostos sobre o crescimento a viabilidade e o volume celular
pela teacutecnica de exclusatildeo do azul de tripan
3 Determinar a multiplicidade de infecccedilatildeo de DENV 1 e 2 a ser utilizada nos ensaios
antivirais
4 Avaliar a atividade antiviral dos compostos frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1
e 2 atraveacutes do ensaio de MTT
5 Verificar um possiacutevel efeito direto dos compostos agraves partiacuteculas virais de Dengue virus
6 Quantificar a produccedilatildeo de partiacuteculas virais infecciosas no sobrenadante de ceacutelulas
infectadas atraveacutes de titulaccedilatildeo viral pela contagem de unidades formadoras de placas
17
IV MATERIAL E MEacuteTODOS
18
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Linhagens celulares
411 Ceacutelulas C636
As ceacutelulas C636 satildeo ceacutelulas de linhagem contiacutenua de larvas de mosquito Aedes
albopictus Estas ceacutelulas foram utilizadas na produccedilatildeo de estoque viral de DENV sorotipos 1
e 2 para isso foram mantidas em meio de cultura Leibovitz-15 (L-15) (Cultilab)
suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (Cultilab) antibioacuteticos (Penicilina 100 UmL
Streptomicina 100 microgmL) e antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL) a 28degC
412 Ceacutelulas BHK-21
As ceacutelulas BHK-21 satildeo fibroblastos de linhagem contiacutenua derivados de rim de hamster
neonato Estas ceacutelulas foram utilizadas para os experimentos in vitro e para as titulaccedilotildees de
DENV 1 e 2 para isso foram mantidas em meio miacutenimo essencial modificado por Dulbecco
ndash DMEM (Cultilab) suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (SFB) com antibioacuteticos
(Penicilina 100 UmL Streptomicina 100 microgmL) e com antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL)
sendo mantidas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5
42 Viacuterus
421 DENV 1 e DENV 2
O Sorotipo 1 do Dengue virus (DENV-1) estirpe Mochizuki foi replicado em ceacutelulas
C636 para gerar estoques de trabalho durante 2 e 5 dias a 28degC O sobrenadante da cultura de
ceacutelulas infectadas foi recolhido e clarificado por centrifugaccedilatildeo a 4000 G durante 10 minutos agrave
4degC e entatildeo foi aliquotado e armazenado a -70 deg C como reserva de viacuterus ateacute agrave sua utilizaccedilatildeo
A replicaccedilatildeo geraccedilatildeo de estoque e titulaccedilatildeo do Sorotipo 2 do Dengue virus (DENV-2)
estirpe Nova Guineacute C ocorreu nos mesmos moldes do DENV-1
19
422 Titulaccedilatildeo viral
Os estoques virais foram diluiacutedos (10-1
a 10-7
) e inoculados em monocamadas de
ceacutelulas BHK-21 implantadas em placas de 6 poccedilos com confluecircncia de aproximadamente
60 (3x105 ceacutelulas por poccedilo) sendo um poccedilo natildeo infectado mantido para controle celular
Apoacutes uma hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus foram adicionados 3 mL de meio DMEM (Cultilab)
suplementado com 15 de SFB e contendo 15 de Carboximetilcelulose (CMC Synth) As
placas foram entatildeo incubadas a 37degC (CO2 a 5) por 96 horas As ceacutelulas foram entatildeo
fixadas com 2 mL de soluccedilatildeo de formol a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo
1 (pv) de cristal violeta em PBS para contagem das placas de lise O tiacutetulo viral foi
expresso atraveacutes do nuacutemero de unidades formadoras de placa por mL (UFPmL) segundo a
formula abaixo representada
Tiacutetulo viral (UFPmL) = N x FC x 10
N = nuacutemero de placas de lise contadas
FC = Fator de correccedilatildeo
= Inverso da diluiccedilatildeo na qual foram contadas as placas de lise
43 Compostos de naftoquinonas
Os compostos utilizados neste estudo foram fornecidos pelo Dr Geraldo Ceacutelio
Brandatildeo do laboratoacuterio de pesquisa da Escola de Farmaacutecia da Universidade Federal de Ouro
Preto
20
Tabela 1 Relaccedilatildeo de nome estrutura e coacutedigo dos compostos utilizados Na tabela estatildeo
presentes a relaccedilatildeo dos nomes dos compostos utilizados neste trabalho bem como sua
estrutura Os coacutedigos representantes de cada composto seratildeo utilizados no decorrer da escrita
Nome do composto Estrutura Coacutedigo
Lapachol
A1
β-lapachona
A2
2-Hidroxi-3-(ββ-dimetilvinil)-14-naftoquinona
A3
2-Cloro-14-naftoquinona
A4
Lapachol derivado 1
A5
Lapachol derivado 2 A6
Lapachol derivado 3 A7
Lapachol derivado 4 A8
44 Ensaio de citotoxicidade
Para avaliar a citotoxicidade dos compostos ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas foram incubadas com diferentes concentraccedilotildees dos compostos em triplicata num
volume de 200 microL de meio de cultura por poccedilo na presenccedila de 1 de SFB Os controles natildeo
tratados apresentaram adiccedilatildeo de 200 microL de meio de cultura As ceacutelulas foram entatildeo incubadas
durante 72 horas O meio foi removido e 28 microL de soluccedilatildeo de 5 mg mL MTT (brometo de 3-
21
[45-dimetil-tiazol-2-il]-25 difeniltertrazoacutelio) foi adicionado a cada poccedilo As placas foram re-
incubadas durante 1 hora e 30 minutos e entatildeo 122 microL de DMSO foi adicionado a cada poccedilo e
placas foram agitadas suavemente durante 15 minutos para dissolver os cristais de formazan
A absorbacircncia foi lida em um equipamento leitor de placas Victor X3 (PerkinElmer) a 490
nm A concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC 50) foi definida como a concentraccedilatildeo da amostra que
reduziu a viabilidade celular de 50 em comparaccedilatildeo com controles natildeo tratados Os dados
foram analisados utilizando o programa Prisma
45 Avaliaccedilatildeo da viabilidade e crescimento celular por exclusatildeo de azul de tripan
Ceacutelulas BHK-21 foram cultivadas em placas de 24 poccedilos (7x104 ceacutelulaspoccedilo) e apoacutes
24 horas foram tratadas com as concentraccedilotildees de uso de cada composto e incubadas por 72
horas na presenccedila de 1 de SFB A seguir as ceacutelulas foram tripsinizadas e incubadas com
azul de tripan e entatildeo foi utilizado um contador automatizado de ceacutelulas (Countess II FL
Automated Cell Counter ndash Thermo Fisher Scientific) para contagem das ceacutelulas e avaliaccedilatildeo da
porcentagem de viabilidade e diacircmetro celular do controle nos tempos de 0 24 e 96 horas e
avaliaccedilatildeo dos mesmos paracircmetros para os compostos no tempo de 96 horas (72 horas poacutes
tratamento)
Outra curva de multiplicaccedilatildeo celular foi feita para os compostos A1 A3 A4 e A5 onde as
ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos no momento da confecccedilatildeo da placa e
foram avaliados os mesmos paracircmetros nos tempos de 0 12 24 48 e 72 horas O
equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
46 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
Para determinar a menor Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) responsaacutevel pela letalidade
celular total 2x104 de ceacutelulas BHK-21 foram semeadas em placa de 96 poccedilos Apoacutes a
incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o
meio de cultura foi removido e as ceacutelulas foram expostas a diferentes diluiccedilotildees dos dois
sorotipos de DENV (100 microL de cada diluiccedilatildeo + 100 microL de meio DEMEM 1 SFB) As
diluiccedilotildees seriadas foram realizadas da suspensatildeo viral na razatildeo de 5 para o primeiro poccedilo e de
2 para os demais poccedilos Apoacutes 72 horas as ceacutelulas foram entatildeo fixadas com 200 microL de soluccedilatildeo
22
formalina a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo 1 (pv) de cristal violeta em
PBS para avaliaccedilatildeo da maior diluiccedilatildeo responsaacutevel pela letalidade de 100 das ceacutelulas
47 Ensaio Dose-resposta
Para cada composto foram realizados ensaios de dose-resposta para definiccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de cada composto capaz de promover a reduccedilatildeo na produccedilatildeo viral A atividade
antiviral foi avaliada tambeacutem pelo meacutetodo de MTT Ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas expostas a diferentes concentraccedilotildees dos extratos determinadas a partir das maiores
concentraccedilotildees em que natildeo foram observados efeitos citotoacutexicos As ceacutelulas foram tratadas
com as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de cada composto e em seguida infectadas com DENV
1 (MOI= 5) ou 2 (MOI= 2) Mantendo uma coluna para controle com DMSO uma coluna
para controle de viacuterus uma coluna para controle de citotoxicidade dos compostos e por fim
uma coluna para controle celular As ceacutelulas foram entatildeo incubadas durante 72 horas Apoacutes
este tempo procedeu-se a leitura pelo ensaio de MTT como descrito anteriormente Os dados
foram analisados levando-se em consideraccedilatildeo a leitura das absorbacircncias dos poccedilos dos
controles de viacuterus e do controle celular
Para realizacao destes experimentos os seguintes controles foram adotados
Controle de ceacutelulas poccedilos contendo somente ceacutelulas acrescidas do meio de cultura DMEM
1 SFB Utilizado para avaliar o comportamento das ceacutelulas sem que as mesmas tivessem
contato com qualquer interferente durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo Com isso os poccedilos
reservados para esse controle serviram de padratildeo para comparaccedilatildeo com aqueles em que fosse
observada atividade citotoacutexica ou citopaacutetica
Controle de viacuterus poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM 1 SFB
sem nenhum tratamento e de suspensatildeo de viacuterus Utilizando como referecircncia para anaacutelise da
atividade citopaacutetica provocada pelo viacuterus testado durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo das placas
23
Controle de viacuterus com DMSO Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura
DMEM 1 SFB e DMSO Foi utilizado para avaliar se havia influecircncia prejudicial do
solvente utilizado para diluiccedilatildeo das amostras no meio de cultivo das ceacutelulas e se o mesmo
poderia apresentar alguma potencial atividade antiviral aparente
Controle de citotoxicidade Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM
1 SFB e as quatro principais concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos Foi utilizado
para avaliar se haveria alguma possiacutevel atividade citotoacutexica das concentraccedilotildees dos compostos
em relaccedilatildeo agraves ceacutelulas
48 Ensaio Virucida
Para a realizaccedilatildeo deste ensaio aliacutequotas de 950 microL (diluiccedilatildeo de 20 vezes) do DENV 1 (tiacutetulo
6 x 107 UFPmL) foram incubadas com 50 microL de uma soluccedilatildeo de meio DMEM preparada
com 20x a concentraccedilatildeo natildeo citotoacutexica de cada composto A1 a A8 em banho-maria 37deg C
por 1 hora Apoacutes a incubaccedilatildeo as aliacutequotas foram imediatamente tituladas em ceacutelulas BHK-21
em placas de 6 poccedilos utilizando-se 3 diluiccedilotildees para cada incubaccedilatildeo (20x 20 x 10-1
e 20 x 10-
2) Foram titulados tambeacutem uma aliacutequota incubada apenas com meio DMEM sem nenhum
tratamento e outra aliacutequota incubada com DMSO (Dimetilsulfoacutexido) Estas foram tituladas
utilizando um controle e mais cinco diluiccedilotildees (20x 20 x 10-1
20 x 10-2
20 x 10-3
e 20 x 10-4
)
49 Ensaio antiviral
Neste ensaio ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em placas de 24 poccedilos no dia
seguinte foram tratadas durante 4 horas com as concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas de cada
composto em duplicata Apoacutes o preacute-tratamento as monocamadas foram infectadas com
DENV-1 a uma MOI=5 na presenccedila das concentraccedilotildees de uso respectivas de cada composto
Apoacutes 1 hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus as monocamadas foram lavadas duas vezes com PBS e
foi adicionado 500 microL por poccedilo de meio preparado com as mesmas concentraccedilotildees dos
diferentes compostos e mantidos durante 48 horas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5 Em
quatro poccedilos as ceacutelulas foram infectadas e natildeo tratadas e em outros quatro poccedilos as ceacutelulas
natildeo foram tratadas e nem infectadas (controle de ceacutelulas) destes uacuteltimos dois foram
tripsinizados e contados no momento da infecccedilatildeo e os outros dois apoacutes o teacutermino do ensaio
24
para avaliar o crescimento celular Decorridas as 48 horas o sobrenadante foi coletado e
centrifugado por 10 minutos a 4000 xG para separaccedilatildeo dos debris celulares e prontamente
titulado em placa de 6 poccedilos
410 Anaacutelise estatiacutestica
Os valores de CC50 foram obtidos a partir de anaacutelise de regressatildeo linear das curvas de
concentraccedilatildeocitotoxicidade A anaacutelise estatiacutestica dos dados foi realizada pelo programa
GraphPad Prism software Uma anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi utilizada para determinar
as diferenccedilas estatiacutesticas seguida do poacutes teste de Tukey A significacircncia estatiacutestica foi fixada
em p lt005
25
V RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
26
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Ensaio de citotoxicidade celular
Para avaliar a viabilidade da linhagem celular BHK-21 frente ao tratamento com oito
diferentes concentraccedilotildees dos compostos (A1 a A8) realizou-se um ensaio de MTT (brometo
de 3-[45-dimetil-tiazol-2-il]-25-difeniltetrazoacutelio) Este ensaio tem o objetivo de quantificar
espectrofotometricamente o crescimento celular a viabilidade e proliferaccedilatildeo podendo ser
utilizado como um indicador direto de citotoxicidade Trata-se de um ensaio colorimeacutetrico
para medir a atividade da redutase mitocondrial em ceacutelulas vivas Ele se baseia na reduccedilatildeo do
sal amarelo tetrazoacutelio (permeaacutevel agrave membrana celular) para cristais de formazan azuis
puacuterpura por ceacutelulas metabolicamente ativas a quantidade de formazan gerada medida por
espectrofotometria eacute proporcional ao nuacutemero de ceacutelulas viaacuteveis
A CC50 foi calculada plotando-se uma curva de porcentagem de viabilidade celular por
concentraccedilatildeo melhor representada na figura 7 pelo composto A7 e os resultados de CC50
para todos os compostos estatildeo representados na tabela 2 Foram feitos ensaios de
citotoxicidade com oito concentraccedilotildees diferentes sendo escolhida a maior concentraccedilatildeo que
natildeo apresentou citotoxicidade
Viabilidade Celular = [ ( A ndash B ) A ] x 100
Onde
A = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas natildeo tratadas
B = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas tratadas com
as respectivas concentraccedilotildees de cada composto
27
28
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (A curva dose resposta do composto A7 eacute a que
melhor representa a curva dose resposta esperada) Avaliou-se a viabilidade da linhagem
celular BHK-21 frente agrave diferentes concentraccedilotildees dos compostos realizando o ensaio de MTT
e determinando assim as concentraccedilotildees a serem utilizadas nos proacuteximos ensaios bem como
calculando a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) agrave partir da curva
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo
da concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50)
Composto Concentraccedilatildeo utilizada
[ ] microgmL
Concentraccedilatildeo citotoacutexica 50
(CC50) [ ] microgmL plusmn Desvio
Padratildeo
A1 ([ ]=1 mgmL) 00200 10010 plusmn 0014
A2 ([ ]=1 mgmL) 00025 09561 plusmn 0023
A3 ([ ]=1 mgmL) 00025 09988 plusmn 0017
A4 ([ ]=5 mgmL) 00125 10150 plusmn 0036
A5 ([ ]=10 mgmL) 00250 10590 plusmn 0047
A6 ([ ]=5 mgmL) 00250 08183 plusmn 0030
A7 ([ ]=5 mgmL) 00125 10280 plusmn 0052
A8 ([ ]=5 mgmL) 00125 09758 plusmn 0036
52 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan
Para corroborar o ensaio anterior de citotoxicidade utilizou -se o teste de viabilidade
celular pela teacutecnica da exclusatildeo do azul de tripan com a finalidade de determinar a
viabilidade das ceacutelulas Os procedimentos adotados no ensaio seguiram o manual do
equipamento contador automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL Automated Cell Counter) entatildeo
foi acrescentado agrave 10 microL da suspensatildeo celular 10 microL de azul de tripan (04) Apoacutes
homogeneizaccedilatildeo 10 microL da suspensatildeo foi colocada no local indicado da lacircmina proacutepria para
leitura e foi realizada a contagem sendo consideradas mortas (inviaacuteveis) as ceacutelulas que
incorporavam o corante e viaacuteveis as que excluiacuteam o azul de tripan
29
O equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
(A)
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan A avaliaccedilatildeo da
viabilidade celular foi realizada atraveacutes de um contador automaacutetico de ceacutelulas Este
equipamento possibilita explorar ferramentas de fotografia e avaliar alguns paracircmetros
importantes (A) fotografia das ceacutelulas (B) Zoom na fotografia das ceacutelulas com marcaccedilotildees
(em verde para ceacutelulas vivas e vermelho para mortas) e (D) contagem das ceacutelulas totais
ceacutelulas vivas e mortas graacutefico e meacutedia dos diacircmetros celulares das ceacutelulas vivas e mortas
(B)
(C)
30
O crescimento celular de ceacutelulas natildeo tratadas foi avaliado nos tempos de 0h (momento
da confecccedilatildeo da placa) 24h (momento de tratamento com os compostos) e 96 horas
(Momento em que todas as ceacutelulas foram tripsinizadas e contadas) para avaliar o perfil do
crescimento celular em ceacutelulas natildeo tratadas Foi observado um crescimento celular no periacuteodo
de 24 horas onde as ceacutelulas estavam incubadas com meio acrescido de 10 SFB Em 24
horas o meio foi trocado por 1 SFB e acrescido das substacircncias testes nas menores diluiccedilotildees
natildeo citotoacutexicas determinadas pelo ensaio do MTT Em 96 horas pode ser observado um
decaimento no nuacutemero de ceacutelulas vivas provavelmente devido ao crescimento celular (morte
por confluecircncia)
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas)
(A) (B)
31
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas (A)
Contagem de ceacutelulas vivas (B) Percentual de ceacutelulas viaacuteveis (Viabilidade celular ) e (C)
Meacutedia do diacircmetro apresentado pelas ceacutelulas vivas
Em 96 horas as ceacutelulas natildeo tratadas bem como as ceacutelulas tratadas por 72 horas com as
concentraccedilotildees de uso dos compostos foram tripsinizadas e avaliadas quanto ao nuacutemero de
ceacutelulas vivas viabilidade e diacircmetro celular apresentados na figura 10
Segundo se observa natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo aparente que possa demonstrar que
as concentraccedilotildees de uso dos compostos tenham causado alguma atividade citotoacutexica
corroborando assim os ensaios de citotoxicidade anteriores
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
A infectividade de um viacuterus depende de vaacuterios fatores entre eles da proporccedilatildeo de
partiacuteculas virais completas ou infecciosas da suscetibilidade da ceacutelula hospedeira e da
chance desta partiacutecula encontrar o receptor e penetrar na ceacutelula Quando ceacutelulas suscetiacuteveis
satildeo misturadas com uma suspensatildeo de viacuterus estas podem receber uma duas trecircs ou dez
partiacuteculas virais ou nenhuma Isto depende da proporccedilatildeo entre a quantidade de viacuterus
infecciosos presente no inoculo e a quantidade de ceacutelulas utilizada Esta relaccedilatildeo eacute denominada
de multiplicidade de infecccedilatildeo ou MOI Uma MOI=1 indica que a infecccedilatildeo foi feita em
principio com 1 viacuterus ou 1 dose infectante por ceacutelula
A determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo dos Dengue virus 1 e 2 a serem
utilizadas nos proacuteximos ensaios foi feita a partir da infecccedilatildeo de ceacutelulas BHK-21 por diferentes
(C)
32
concentraccedilotildees de viacuterus e revelaccedilatildeo com cristal violeta Escolheu-se a maior diluiccedilatildeo viral que
possibilitou a letalidade total das ceacutelulas (faixa onde todas as ceacutelulas estatildeo mortas utilizando
menor concentraccedilatildeo de viacuterus) As faixas escolhidas foram entatildeo calculadas levando-se em
consideraccedilatildeo o nuacutemero de ceacutelulas presentes no poccedilo e o nuacutemero de partiacuteculas virais que foram
adicionadas (Faixa3 para DENV2 e 2 para DENV1) Figura 11 Foi estipulado portanto a
Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 2 para DENV 2 e 5 para DENV 1
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI A partir da infecccedilatildeo da linhagem celular BHK-21 em
placa de 96 poccedilos com diferentes diluiccedilotildees de DENV foi determinado que a Multiplicidade
de infecccedilatildeo para o Dengue viacuterus sorotipos 1 e 2 seria de 5 e 2 respectivamente (colunas 2 -
DENV1 e 3 - DENV2)
54 Ensaio dose resposta
Apoacutes a determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas ideais realizou-se um
ensaio dose resposta tratando as ceacutelulas com oito concentraccedilotildees agrave partir das concentraccedilotildees natildeo
citotoacutexicas escolhidas para cada composto e em seguida infectando com DENV sorotipos 1 e
2 nas MOIs estipuladas anteriormente (5 e 2 respectivamente) A porcentagem do efeito
protetor conferida agraves ceacutelulas para cada concentraccedilatildeo de amostra testada foi calculada da
seguinte forma
33
EP = [ (A ndash B) (C ndash B) ] x 100
Onde
A Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas tratadas e infectadas
B Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e infectadas
C Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e natildeo infectadas
Este ensaio tem por objetivo identificar a resposta celular agrave infecccedilatildeo frente ao
tratamento com os compostos em diferentes concentraccedilotildees Assim como o ensaio de
toxicidade este ensaio feito utilizando a teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT permite o teste de vaacuterias
concentraccedilotildees diferentes em um menor tempo e com baixo gasto de material
34
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV1
(MOI=5)
35
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV2
(MOI=2)
36
Takegami et al (1998) demonstraram atividade de furanonaftoquinonas contra o viacuterus
da Encefalite Japonesa (Flavivirus) utilizando a concentraccedilatildeo de 3microgmL poreacutem para os
compostos apresentados avaliados pela teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT nenhuma das
concentraccedilotildees apresentadas produziu efeito antiviral significativo em relaccedilatildeo ao controle
celular como observado nas figuras 12 e 13
Apesar da teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT ser interessante como triagem de atividade
antiviral permitindo o teste de vaacuterias concentraccedilotildees dos compostos em menor tempo e
utilizando uma quantidade razoaacutevel de materiais optou-se por utilizar as maiores
concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas encontradas avaliando sua atividade antiviral por outras
teacutecnicas Como natildeo foi avaliada atividade antiviral preacutevia para nenhum dos compostos frente
agrave infecccedilatildeo por DENV1 e 2 foi selecionado o Dengue virus 1 para dar prosseguimento aos
ensaios
55 Ensaio Virucida
O ensaio virucida foi realizado para avaliar um potencial efeito dos compostos
diretamente sobre a partiacutecula viral Este ensaio eacute importante pois possibilita elucidar se o
composto pode produzir algum efeito sobre a partiacutecula viral impedindo que esta possa infectar
as ceacutelulas
Figura 14 Ensaio virucida Neste ensaio as aliacutequotas de DENV1 foram incubadas com as
concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos e titulados (NT) Controle natildeo tratado
37
Tabela 3 Ensaio virucida Caacutelculo do tiacutetulo viral (UFPmL) e porcentagem representante de
cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 254 x 105 100
DMSO 263 x 105 10335
A1 199 x 105 7835
A2 205 x 105 8071
A3 237 x 105 9311
A4 775 x 104 3049
A5 153 x 105 6024
A6 219 x 105 8602
A7 243 x 105 9547
A8 254 x 105 100
Lagrota et al (1988) demonstraram atividade de 2-HO-3-N-benzil-N(N-benzil-2-
etilamina) -14-naftoquinona sobre a partiacutecula viral de enterovirus De forma contraacuteria apesar
de se verificar a reduccedilatildeo de quase uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais
para o composto A4 natildeo considerou-se esta uma alteraccedilatildeo significativa pois devido agrave
magnitude do nuacutemero de UFPs se trata de uma alteraccedilatildeo muito pequena Portanto os
compostos avaliados neste trabalho natildeo produziram atividade virucida aparente frente ao
tratamento com as concentraccedilotildees de uso
56 Ensaio Antiviral
O sobrenadante de ceacutelulas tratadas previamente e infectadas por DENV1 coletado 48
horas poacutes infecccedilatildeo foi avaliado quanto agrave produccedilatildeo viral de partiacuteculas infecciosas pela
contagem de placas de lise e caacutelculo de Unidades Formadoras de Placa (Titulaccedilatildeo viral em
placa ndash UFPmL)
38
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral Sobrenadante de ceacutelulas tratadas e infectadas por DENV1
coletado apoacutes 48 horas e titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado
Tabela 4 Ensaio Antiviral Coleta do sobrenadante de ceacutelulas infectadas por DENV1 Tiacutetulo
viral (UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o
controle natildeo tratado como 100
Ao perceber um aumento no tiacutetulo viral frente ao tratamento com os compostos A1
A2 e A3 e uma reduccedilatildeo frente ao tratamento com A4 A5 e A6 foram escolhidos dois
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 119 x 105 10000
A1 235 x 105 19748
A2 228 x 105 19160
A3 318 x 105 26723
A4 128 x 104 1076
A5 186 x 103 156
A6 190 x 104 1597
A7 280 x 104 2353
A8 350 x 104 2941
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
40
Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
12
que lapachol diminui a replicaccedilatildeo do viacuterus em seres humanos mas ainda natildeo existem
resultados de testes cliacutenicos disponiacuteveis (Hussain 2007)
Na avaliaccedilatildeo da atividade antiviral do Lapachol in vitro verificou-se que esta
substacircncia eacute ativa contra viacuterus RNA atuando tanto sobre viacuterus envelopados quanto sobre
partiacuteculas sem esta estrutura em concentraccedilotildees de 5 a 10 microgmL e ainda apresentou uma
pequena atividade sobre HSV (Herpes simplex I) e Ad5 (Adeno tipo 5) mas nenhuma
atividade sobre CoxB4 (Coxsackie B4) Em trabalho posterior demonstrou-se que nem o
Lapachol nem diversos dos seus derivados apresentaram atividade antiviral in vitro sobre
Poliovirus tipo 1 Ecovirus 19 e Coxsackie B tipo 4 Apenas os derivados 12-naftoquinonicos
e um intermediaacuterio da siacutentese Hoocker foram ativos contra o Echovirus 19 (Fonseca 2003)
Costa et al (2013) relataram que piranonaftoquinonas isocircmeras do lapachol possuem
atividade de inibiccedilatildeo da replicaccedilatildeo de DENV-2 atuando sobre a atividade da ATPase de NS3
(proteiacutena natildeo estrutural de DENV)
A utilizaccedilatildeo de testes in vitro por meio de ensaios de viabilidade celular constitui o
primeiro passo para a avaliaccedilatildeo da compatibilidade bioloacutegica de uma substacircncia e pode
fornecer elementos importantes para a anaacutelise da biocompatibilidade dos diferentes materiais
Para ser considerado natildeo citotoacutexico no teste de citotoxicidade in vitro um produto natildeo deve
ocasionar a morte das ceacutelulas nem afetar suas funccedilotildees celulares A prova do MTT eacute um dos
indicadores colorimeacutetricos de viabilidade celular mais utilizados sendo capaz de avaliar a
funccedilatildeo celular mitocondrial de acordo com a reduccedilatildeo enzimaacutetica do sal de tetrazoacutelio pelas
desidrogenases mitocondriais nas ceacutelulas viaacutevies (Arauacutejo et al 2008) Supotildee-se que o
mecanismo responsaacutevel pela citotoxicidade apresentada pelas quinonas esteja relacionado
com o estresse oxidativo causado por esses compostos poreacutem a capacidade de alquilaccedilatildeo de
nucleoacutefilos celulares tambeacutem representa correlaccedilatildeo com tais efeitos bioloacutegicos (Goulart
2004)
13
II JUSTIFICATIVA
14
2 JUSTIFICATIVA
Aleacutem do controle do mosquito transmissor e do desenvolvimento de vacinas que tem
sido exaustivamente estudado nos uacuteltimos anos uma alternativa para o combate agrave dengue
seria o desenvolvimento de faacutermacos para reduzir a viremia ou mesmo para controlar a
resposta imune do hospedeiro agrave infecccedilatildeo que tem sido apontada como principal fator de risco
nos casos mais graves Em funccedilatildeo disso o nuacutemero de pesquisas visando o desenvolvimento
de drogas com accedilatildeo antiviral ou com accedilatildeo imunomodulatoacuteria tem aumentado
significativamente As naftoquinonas vecircm ganhando bastante importacircncia na pesquisa de
novas drogas antivirais devido agrave algumas atividades apresentadas A szlig-lapachona-orto-
naftoquinona por exemplo se mostrou um potente inibidor da enzima transcriptase reversa
dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e leucemia murina de Rauscher (RLV)
Diante da inexistecircncia de drogas com accedilatildeo anti DENV e o elevado nuacutemero e casos da
patogenia nos uacuteltimos anos a organizaccedilatildeo mundial da sauacutede classificou a Dengue como uma
epidemia de proporccedilotildees globais e um problema de sauacutede puacuteblica Como as naftoquinonas jaacute
demonstraram na literatura possuir um potencial efeito terapecircutico contra alguns viacuterus eacute
possiacutevel que estes compostos possam apresentar atividade antiviral contra DENV Portanto
este trabalho visou atraveacutes de ensaios de MTT e titulaccedilotildees virais em placa avaliar a potencial
atividade antiviral de oito compostos derivados de naftoquinonas naturais e sinteacuteticas
15
III OBJETIVOS
16
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar oito compostos (2 naturais e 6 sinteacuteticos) derivados de naftoquinonas como potenciais
agentes antivirais em ceacutelulas BHK-21 frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1 e 2
32 Objetivos especiacuteficos
1 Calcular o iacutendice de citotoxicidade e a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) dos compostos
atraveacutes de ensaio de reduccedilatildeo de MTT
2 Avaliar os efeitos dos compostos sobre o crescimento a viabilidade e o volume celular
pela teacutecnica de exclusatildeo do azul de tripan
3 Determinar a multiplicidade de infecccedilatildeo de DENV 1 e 2 a ser utilizada nos ensaios
antivirais
4 Avaliar a atividade antiviral dos compostos frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1
e 2 atraveacutes do ensaio de MTT
5 Verificar um possiacutevel efeito direto dos compostos agraves partiacuteculas virais de Dengue virus
6 Quantificar a produccedilatildeo de partiacuteculas virais infecciosas no sobrenadante de ceacutelulas
infectadas atraveacutes de titulaccedilatildeo viral pela contagem de unidades formadoras de placas
17
IV MATERIAL E MEacuteTODOS
18
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Linhagens celulares
411 Ceacutelulas C636
As ceacutelulas C636 satildeo ceacutelulas de linhagem contiacutenua de larvas de mosquito Aedes
albopictus Estas ceacutelulas foram utilizadas na produccedilatildeo de estoque viral de DENV sorotipos 1
e 2 para isso foram mantidas em meio de cultura Leibovitz-15 (L-15) (Cultilab)
suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (Cultilab) antibioacuteticos (Penicilina 100 UmL
Streptomicina 100 microgmL) e antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL) a 28degC
412 Ceacutelulas BHK-21
As ceacutelulas BHK-21 satildeo fibroblastos de linhagem contiacutenua derivados de rim de hamster
neonato Estas ceacutelulas foram utilizadas para os experimentos in vitro e para as titulaccedilotildees de
DENV 1 e 2 para isso foram mantidas em meio miacutenimo essencial modificado por Dulbecco
ndash DMEM (Cultilab) suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (SFB) com antibioacuteticos
(Penicilina 100 UmL Streptomicina 100 microgmL) e com antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL)
sendo mantidas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5
42 Viacuterus
421 DENV 1 e DENV 2
O Sorotipo 1 do Dengue virus (DENV-1) estirpe Mochizuki foi replicado em ceacutelulas
C636 para gerar estoques de trabalho durante 2 e 5 dias a 28degC O sobrenadante da cultura de
ceacutelulas infectadas foi recolhido e clarificado por centrifugaccedilatildeo a 4000 G durante 10 minutos agrave
4degC e entatildeo foi aliquotado e armazenado a -70 deg C como reserva de viacuterus ateacute agrave sua utilizaccedilatildeo
A replicaccedilatildeo geraccedilatildeo de estoque e titulaccedilatildeo do Sorotipo 2 do Dengue virus (DENV-2)
estirpe Nova Guineacute C ocorreu nos mesmos moldes do DENV-1
19
422 Titulaccedilatildeo viral
Os estoques virais foram diluiacutedos (10-1
a 10-7
) e inoculados em monocamadas de
ceacutelulas BHK-21 implantadas em placas de 6 poccedilos com confluecircncia de aproximadamente
60 (3x105 ceacutelulas por poccedilo) sendo um poccedilo natildeo infectado mantido para controle celular
Apoacutes uma hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus foram adicionados 3 mL de meio DMEM (Cultilab)
suplementado com 15 de SFB e contendo 15 de Carboximetilcelulose (CMC Synth) As
placas foram entatildeo incubadas a 37degC (CO2 a 5) por 96 horas As ceacutelulas foram entatildeo
fixadas com 2 mL de soluccedilatildeo de formol a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo
1 (pv) de cristal violeta em PBS para contagem das placas de lise O tiacutetulo viral foi
expresso atraveacutes do nuacutemero de unidades formadoras de placa por mL (UFPmL) segundo a
formula abaixo representada
Tiacutetulo viral (UFPmL) = N x FC x 10
N = nuacutemero de placas de lise contadas
FC = Fator de correccedilatildeo
= Inverso da diluiccedilatildeo na qual foram contadas as placas de lise
43 Compostos de naftoquinonas
Os compostos utilizados neste estudo foram fornecidos pelo Dr Geraldo Ceacutelio
Brandatildeo do laboratoacuterio de pesquisa da Escola de Farmaacutecia da Universidade Federal de Ouro
Preto
20
Tabela 1 Relaccedilatildeo de nome estrutura e coacutedigo dos compostos utilizados Na tabela estatildeo
presentes a relaccedilatildeo dos nomes dos compostos utilizados neste trabalho bem como sua
estrutura Os coacutedigos representantes de cada composto seratildeo utilizados no decorrer da escrita
Nome do composto Estrutura Coacutedigo
Lapachol
A1
β-lapachona
A2
2-Hidroxi-3-(ββ-dimetilvinil)-14-naftoquinona
A3
2-Cloro-14-naftoquinona
A4
Lapachol derivado 1
A5
Lapachol derivado 2 A6
Lapachol derivado 3 A7
Lapachol derivado 4 A8
44 Ensaio de citotoxicidade
Para avaliar a citotoxicidade dos compostos ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas foram incubadas com diferentes concentraccedilotildees dos compostos em triplicata num
volume de 200 microL de meio de cultura por poccedilo na presenccedila de 1 de SFB Os controles natildeo
tratados apresentaram adiccedilatildeo de 200 microL de meio de cultura As ceacutelulas foram entatildeo incubadas
durante 72 horas O meio foi removido e 28 microL de soluccedilatildeo de 5 mg mL MTT (brometo de 3-
21
[45-dimetil-tiazol-2-il]-25 difeniltertrazoacutelio) foi adicionado a cada poccedilo As placas foram re-
incubadas durante 1 hora e 30 minutos e entatildeo 122 microL de DMSO foi adicionado a cada poccedilo e
placas foram agitadas suavemente durante 15 minutos para dissolver os cristais de formazan
A absorbacircncia foi lida em um equipamento leitor de placas Victor X3 (PerkinElmer) a 490
nm A concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC 50) foi definida como a concentraccedilatildeo da amostra que
reduziu a viabilidade celular de 50 em comparaccedilatildeo com controles natildeo tratados Os dados
foram analisados utilizando o programa Prisma
45 Avaliaccedilatildeo da viabilidade e crescimento celular por exclusatildeo de azul de tripan
Ceacutelulas BHK-21 foram cultivadas em placas de 24 poccedilos (7x104 ceacutelulaspoccedilo) e apoacutes
24 horas foram tratadas com as concentraccedilotildees de uso de cada composto e incubadas por 72
horas na presenccedila de 1 de SFB A seguir as ceacutelulas foram tripsinizadas e incubadas com
azul de tripan e entatildeo foi utilizado um contador automatizado de ceacutelulas (Countess II FL
Automated Cell Counter ndash Thermo Fisher Scientific) para contagem das ceacutelulas e avaliaccedilatildeo da
porcentagem de viabilidade e diacircmetro celular do controle nos tempos de 0 24 e 96 horas e
avaliaccedilatildeo dos mesmos paracircmetros para os compostos no tempo de 96 horas (72 horas poacutes
tratamento)
Outra curva de multiplicaccedilatildeo celular foi feita para os compostos A1 A3 A4 e A5 onde as
ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos no momento da confecccedilatildeo da placa e
foram avaliados os mesmos paracircmetros nos tempos de 0 12 24 48 e 72 horas O
equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
46 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
Para determinar a menor Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) responsaacutevel pela letalidade
celular total 2x104 de ceacutelulas BHK-21 foram semeadas em placa de 96 poccedilos Apoacutes a
incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o
meio de cultura foi removido e as ceacutelulas foram expostas a diferentes diluiccedilotildees dos dois
sorotipos de DENV (100 microL de cada diluiccedilatildeo + 100 microL de meio DEMEM 1 SFB) As
diluiccedilotildees seriadas foram realizadas da suspensatildeo viral na razatildeo de 5 para o primeiro poccedilo e de
2 para os demais poccedilos Apoacutes 72 horas as ceacutelulas foram entatildeo fixadas com 200 microL de soluccedilatildeo
22
formalina a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo 1 (pv) de cristal violeta em
PBS para avaliaccedilatildeo da maior diluiccedilatildeo responsaacutevel pela letalidade de 100 das ceacutelulas
47 Ensaio Dose-resposta
Para cada composto foram realizados ensaios de dose-resposta para definiccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de cada composto capaz de promover a reduccedilatildeo na produccedilatildeo viral A atividade
antiviral foi avaliada tambeacutem pelo meacutetodo de MTT Ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas expostas a diferentes concentraccedilotildees dos extratos determinadas a partir das maiores
concentraccedilotildees em que natildeo foram observados efeitos citotoacutexicos As ceacutelulas foram tratadas
com as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de cada composto e em seguida infectadas com DENV
1 (MOI= 5) ou 2 (MOI= 2) Mantendo uma coluna para controle com DMSO uma coluna
para controle de viacuterus uma coluna para controle de citotoxicidade dos compostos e por fim
uma coluna para controle celular As ceacutelulas foram entatildeo incubadas durante 72 horas Apoacutes
este tempo procedeu-se a leitura pelo ensaio de MTT como descrito anteriormente Os dados
foram analisados levando-se em consideraccedilatildeo a leitura das absorbacircncias dos poccedilos dos
controles de viacuterus e do controle celular
Para realizacao destes experimentos os seguintes controles foram adotados
Controle de ceacutelulas poccedilos contendo somente ceacutelulas acrescidas do meio de cultura DMEM
1 SFB Utilizado para avaliar o comportamento das ceacutelulas sem que as mesmas tivessem
contato com qualquer interferente durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo Com isso os poccedilos
reservados para esse controle serviram de padratildeo para comparaccedilatildeo com aqueles em que fosse
observada atividade citotoacutexica ou citopaacutetica
Controle de viacuterus poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM 1 SFB
sem nenhum tratamento e de suspensatildeo de viacuterus Utilizando como referecircncia para anaacutelise da
atividade citopaacutetica provocada pelo viacuterus testado durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo das placas
23
Controle de viacuterus com DMSO Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura
DMEM 1 SFB e DMSO Foi utilizado para avaliar se havia influecircncia prejudicial do
solvente utilizado para diluiccedilatildeo das amostras no meio de cultivo das ceacutelulas e se o mesmo
poderia apresentar alguma potencial atividade antiviral aparente
Controle de citotoxicidade Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM
1 SFB e as quatro principais concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos Foi utilizado
para avaliar se haveria alguma possiacutevel atividade citotoacutexica das concentraccedilotildees dos compostos
em relaccedilatildeo agraves ceacutelulas
48 Ensaio Virucida
Para a realizaccedilatildeo deste ensaio aliacutequotas de 950 microL (diluiccedilatildeo de 20 vezes) do DENV 1 (tiacutetulo
6 x 107 UFPmL) foram incubadas com 50 microL de uma soluccedilatildeo de meio DMEM preparada
com 20x a concentraccedilatildeo natildeo citotoacutexica de cada composto A1 a A8 em banho-maria 37deg C
por 1 hora Apoacutes a incubaccedilatildeo as aliacutequotas foram imediatamente tituladas em ceacutelulas BHK-21
em placas de 6 poccedilos utilizando-se 3 diluiccedilotildees para cada incubaccedilatildeo (20x 20 x 10-1
e 20 x 10-
2) Foram titulados tambeacutem uma aliacutequota incubada apenas com meio DMEM sem nenhum
tratamento e outra aliacutequota incubada com DMSO (Dimetilsulfoacutexido) Estas foram tituladas
utilizando um controle e mais cinco diluiccedilotildees (20x 20 x 10-1
20 x 10-2
20 x 10-3
e 20 x 10-4
)
49 Ensaio antiviral
Neste ensaio ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em placas de 24 poccedilos no dia
seguinte foram tratadas durante 4 horas com as concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas de cada
composto em duplicata Apoacutes o preacute-tratamento as monocamadas foram infectadas com
DENV-1 a uma MOI=5 na presenccedila das concentraccedilotildees de uso respectivas de cada composto
Apoacutes 1 hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus as monocamadas foram lavadas duas vezes com PBS e
foi adicionado 500 microL por poccedilo de meio preparado com as mesmas concentraccedilotildees dos
diferentes compostos e mantidos durante 48 horas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5 Em
quatro poccedilos as ceacutelulas foram infectadas e natildeo tratadas e em outros quatro poccedilos as ceacutelulas
natildeo foram tratadas e nem infectadas (controle de ceacutelulas) destes uacuteltimos dois foram
tripsinizados e contados no momento da infecccedilatildeo e os outros dois apoacutes o teacutermino do ensaio
24
para avaliar o crescimento celular Decorridas as 48 horas o sobrenadante foi coletado e
centrifugado por 10 minutos a 4000 xG para separaccedilatildeo dos debris celulares e prontamente
titulado em placa de 6 poccedilos
410 Anaacutelise estatiacutestica
Os valores de CC50 foram obtidos a partir de anaacutelise de regressatildeo linear das curvas de
concentraccedilatildeocitotoxicidade A anaacutelise estatiacutestica dos dados foi realizada pelo programa
GraphPad Prism software Uma anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi utilizada para determinar
as diferenccedilas estatiacutesticas seguida do poacutes teste de Tukey A significacircncia estatiacutestica foi fixada
em p lt005
25
V RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
26
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Ensaio de citotoxicidade celular
Para avaliar a viabilidade da linhagem celular BHK-21 frente ao tratamento com oito
diferentes concentraccedilotildees dos compostos (A1 a A8) realizou-se um ensaio de MTT (brometo
de 3-[45-dimetil-tiazol-2-il]-25-difeniltetrazoacutelio) Este ensaio tem o objetivo de quantificar
espectrofotometricamente o crescimento celular a viabilidade e proliferaccedilatildeo podendo ser
utilizado como um indicador direto de citotoxicidade Trata-se de um ensaio colorimeacutetrico
para medir a atividade da redutase mitocondrial em ceacutelulas vivas Ele se baseia na reduccedilatildeo do
sal amarelo tetrazoacutelio (permeaacutevel agrave membrana celular) para cristais de formazan azuis
puacuterpura por ceacutelulas metabolicamente ativas a quantidade de formazan gerada medida por
espectrofotometria eacute proporcional ao nuacutemero de ceacutelulas viaacuteveis
A CC50 foi calculada plotando-se uma curva de porcentagem de viabilidade celular por
concentraccedilatildeo melhor representada na figura 7 pelo composto A7 e os resultados de CC50
para todos os compostos estatildeo representados na tabela 2 Foram feitos ensaios de
citotoxicidade com oito concentraccedilotildees diferentes sendo escolhida a maior concentraccedilatildeo que
natildeo apresentou citotoxicidade
Viabilidade Celular = [ ( A ndash B ) A ] x 100
Onde
A = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas natildeo tratadas
B = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas tratadas com
as respectivas concentraccedilotildees de cada composto
27
28
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (A curva dose resposta do composto A7 eacute a que
melhor representa a curva dose resposta esperada) Avaliou-se a viabilidade da linhagem
celular BHK-21 frente agrave diferentes concentraccedilotildees dos compostos realizando o ensaio de MTT
e determinando assim as concentraccedilotildees a serem utilizadas nos proacuteximos ensaios bem como
calculando a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) agrave partir da curva
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo
da concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50)
Composto Concentraccedilatildeo utilizada
[ ] microgmL
Concentraccedilatildeo citotoacutexica 50
(CC50) [ ] microgmL plusmn Desvio
Padratildeo
A1 ([ ]=1 mgmL) 00200 10010 plusmn 0014
A2 ([ ]=1 mgmL) 00025 09561 plusmn 0023
A3 ([ ]=1 mgmL) 00025 09988 plusmn 0017
A4 ([ ]=5 mgmL) 00125 10150 plusmn 0036
A5 ([ ]=10 mgmL) 00250 10590 plusmn 0047
A6 ([ ]=5 mgmL) 00250 08183 plusmn 0030
A7 ([ ]=5 mgmL) 00125 10280 plusmn 0052
A8 ([ ]=5 mgmL) 00125 09758 plusmn 0036
52 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan
Para corroborar o ensaio anterior de citotoxicidade utilizou -se o teste de viabilidade
celular pela teacutecnica da exclusatildeo do azul de tripan com a finalidade de determinar a
viabilidade das ceacutelulas Os procedimentos adotados no ensaio seguiram o manual do
equipamento contador automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL Automated Cell Counter) entatildeo
foi acrescentado agrave 10 microL da suspensatildeo celular 10 microL de azul de tripan (04) Apoacutes
homogeneizaccedilatildeo 10 microL da suspensatildeo foi colocada no local indicado da lacircmina proacutepria para
leitura e foi realizada a contagem sendo consideradas mortas (inviaacuteveis) as ceacutelulas que
incorporavam o corante e viaacuteveis as que excluiacuteam o azul de tripan
29
O equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
(A)
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan A avaliaccedilatildeo da
viabilidade celular foi realizada atraveacutes de um contador automaacutetico de ceacutelulas Este
equipamento possibilita explorar ferramentas de fotografia e avaliar alguns paracircmetros
importantes (A) fotografia das ceacutelulas (B) Zoom na fotografia das ceacutelulas com marcaccedilotildees
(em verde para ceacutelulas vivas e vermelho para mortas) e (D) contagem das ceacutelulas totais
ceacutelulas vivas e mortas graacutefico e meacutedia dos diacircmetros celulares das ceacutelulas vivas e mortas
(B)
(C)
30
O crescimento celular de ceacutelulas natildeo tratadas foi avaliado nos tempos de 0h (momento
da confecccedilatildeo da placa) 24h (momento de tratamento com os compostos) e 96 horas
(Momento em que todas as ceacutelulas foram tripsinizadas e contadas) para avaliar o perfil do
crescimento celular em ceacutelulas natildeo tratadas Foi observado um crescimento celular no periacuteodo
de 24 horas onde as ceacutelulas estavam incubadas com meio acrescido de 10 SFB Em 24
horas o meio foi trocado por 1 SFB e acrescido das substacircncias testes nas menores diluiccedilotildees
natildeo citotoacutexicas determinadas pelo ensaio do MTT Em 96 horas pode ser observado um
decaimento no nuacutemero de ceacutelulas vivas provavelmente devido ao crescimento celular (morte
por confluecircncia)
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas)
(A) (B)
31
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas (A)
Contagem de ceacutelulas vivas (B) Percentual de ceacutelulas viaacuteveis (Viabilidade celular ) e (C)
Meacutedia do diacircmetro apresentado pelas ceacutelulas vivas
Em 96 horas as ceacutelulas natildeo tratadas bem como as ceacutelulas tratadas por 72 horas com as
concentraccedilotildees de uso dos compostos foram tripsinizadas e avaliadas quanto ao nuacutemero de
ceacutelulas vivas viabilidade e diacircmetro celular apresentados na figura 10
Segundo se observa natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo aparente que possa demonstrar que
as concentraccedilotildees de uso dos compostos tenham causado alguma atividade citotoacutexica
corroborando assim os ensaios de citotoxicidade anteriores
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
A infectividade de um viacuterus depende de vaacuterios fatores entre eles da proporccedilatildeo de
partiacuteculas virais completas ou infecciosas da suscetibilidade da ceacutelula hospedeira e da
chance desta partiacutecula encontrar o receptor e penetrar na ceacutelula Quando ceacutelulas suscetiacuteveis
satildeo misturadas com uma suspensatildeo de viacuterus estas podem receber uma duas trecircs ou dez
partiacuteculas virais ou nenhuma Isto depende da proporccedilatildeo entre a quantidade de viacuterus
infecciosos presente no inoculo e a quantidade de ceacutelulas utilizada Esta relaccedilatildeo eacute denominada
de multiplicidade de infecccedilatildeo ou MOI Uma MOI=1 indica que a infecccedilatildeo foi feita em
principio com 1 viacuterus ou 1 dose infectante por ceacutelula
A determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo dos Dengue virus 1 e 2 a serem
utilizadas nos proacuteximos ensaios foi feita a partir da infecccedilatildeo de ceacutelulas BHK-21 por diferentes
(C)
32
concentraccedilotildees de viacuterus e revelaccedilatildeo com cristal violeta Escolheu-se a maior diluiccedilatildeo viral que
possibilitou a letalidade total das ceacutelulas (faixa onde todas as ceacutelulas estatildeo mortas utilizando
menor concentraccedilatildeo de viacuterus) As faixas escolhidas foram entatildeo calculadas levando-se em
consideraccedilatildeo o nuacutemero de ceacutelulas presentes no poccedilo e o nuacutemero de partiacuteculas virais que foram
adicionadas (Faixa3 para DENV2 e 2 para DENV1) Figura 11 Foi estipulado portanto a
Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 2 para DENV 2 e 5 para DENV 1
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI A partir da infecccedilatildeo da linhagem celular BHK-21 em
placa de 96 poccedilos com diferentes diluiccedilotildees de DENV foi determinado que a Multiplicidade
de infecccedilatildeo para o Dengue viacuterus sorotipos 1 e 2 seria de 5 e 2 respectivamente (colunas 2 -
DENV1 e 3 - DENV2)
54 Ensaio dose resposta
Apoacutes a determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas ideais realizou-se um
ensaio dose resposta tratando as ceacutelulas com oito concentraccedilotildees agrave partir das concentraccedilotildees natildeo
citotoacutexicas escolhidas para cada composto e em seguida infectando com DENV sorotipos 1 e
2 nas MOIs estipuladas anteriormente (5 e 2 respectivamente) A porcentagem do efeito
protetor conferida agraves ceacutelulas para cada concentraccedilatildeo de amostra testada foi calculada da
seguinte forma
33
EP = [ (A ndash B) (C ndash B) ] x 100
Onde
A Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas tratadas e infectadas
B Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e infectadas
C Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e natildeo infectadas
Este ensaio tem por objetivo identificar a resposta celular agrave infecccedilatildeo frente ao
tratamento com os compostos em diferentes concentraccedilotildees Assim como o ensaio de
toxicidade este ensaio feito utilizando a teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT permite o teste de vaacuterias
concentraccedilotildees diferentes em um menor tempo e com baixo gasto de material
34
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV1
(MOI=5)
35
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV2
(MOI=2)
36
Takegami et al (1998) demonstraram atividade de furanonaftoquinonas contra o viacuterus
da Encefalite Japonesa (Flavivirus) utilizando a concentraccedilatildeo de 3microgmL poreacutem para os
compostos apresentados avaliados pela teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT nenhuma das
concentraccedilotildees apresentadas produziu efeito antiviral significativo em relaccedilatildeo ao controle
celular como observado nas figuras 12 e 13
Apesar da teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT ser interessante como triagem de atividade
antiviral permitindo o teste de vaacuterias concentraccedilotildees dos compostos em menor tempo e
utilizando uma quantidade razoaacutevel de materiais optou-se por utilizar as maiores
concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas encontradas avaliando sua atividade antiviral por outras
teacutecnicas Como natildeo foi avaliada atividade antiviral preacutevia para nenhum dos compostos frente
agrave infecccedilatildeo por DENV1 e 2 foi selecionado o Dengue virus 1 para dar prosseguimento aos
ensaios
55 Ensaio Virucida
O ensaio virucida foi realizado para avaliar um potencial efeito dos compostos
diretamente sobre a partiacutecula viral Este ensaio eacute importante pois possibilita elucidar se o
composto pode produzir algum efeito sobre a partiacutecula viral impedindo que esta possa infectar
as ceacutelulas
Figura 14 Ensaio virucida Neste ensaio as aliacutequotas de DENV1 foram incubadas com as
concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos e titulados (NT) Controle natildeo tratado
37
Tabela 3 Ensaio virucida Caacutelculo do tiacutetulo viral (UFPmL) e porcentagem representante de
cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 254 x 105 100
DMSO 263 x 105 10335
A1 199 x 105 7835
A2 205 x 105 8071
A3 237 x 105 9311
A4 775 x 104 3049
A5 153 x 105 6024
A6 219 x 105 8602
A7 243 x 105 9547
A8 254 x 105 100
Lagrota et al (1988) demonstraram atividade de 2-HO-3-N-benzil-N(N-benzil-2-
etilamina) -14-naftoquinona sobre a partiacutecula viral de enterovirus De forma contraacuteria apesar
de se verificar a reduccedilatildeo de quase uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais
para o composto A4 natildeo considerou-se esta uma alteraccedilatildeo significativa pois devido agrave
magnitude do nuacutemero de UFPs se trata de uma alteraccedilatildeo muito pequena Portanto os
compostos avaliados neste trabalho natildeo produziram atividade virucida aparente frente ao
tratamento com as concentraccedilotildees de uso
56 Ensaio Antiviral
O sobrenadante de ceacutelulas tratadas previamente e infectadas por DENV1 coletado 48
horas poacutes infecccedilatildeo foi avaliado quanto agrave produccedilatildeo viral de partiacuteculas infecciosas pela
contagem de placas de lise e caacutelculo de Unidades Formadoras de Placa (Titulaccedilatildeo viral em
placa ndash UFPmL)
38
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral Sobrenadante de ceacutelulas tratadas e infectadas por DENV1
coletado apoacutes 48 horas e titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado
Tabela 4 Ensaio Antiviral Coleta do sobrenadante de ceacutelulas infectadas por DENV1 Tiacutetulo
viral (UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o
controle natildeo tratado como 100
Ao perceber um aumento no tiacutetulo viral frente ao tratamento com os compostos A1
A2 e A3 e uma reduccedilatildeo frente ao tratamento com A4 A5 e A6 foram escolhidos dois
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 119 x 105 10000
A1 235 x 105 19748
A2 228 x 105 19160
A3 318 x 105 26723
A4 128 x 104 1076
A5 186 x 103 156
A6 190 x 104 1597
A7 280 x 104 2353
A8 350 x 104 2941
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
40
Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
13
II JUSTIFICATIVA
14
2 JUSTIFICATIVA
Aleacutem do controle do mosquito transmissor e do desenvolvimento de vacinas que tem
sido exaustivamente estudado nos uacuteltimos anos uma alternativa para o combate agrave dengue
seria o desenvolvimento de faacutermacos para reduzir a viremia ou mesmo para controlar a
resposta imune do hospedeiro agrave infecccedilatildeo que tem sido apontada como principal fator de risco
nos casos mais graves Em funccedilatildeo disso o nuacutemero de pesquisas visando o desenvolvimento
de drogas com accedilatildeo antiviral ou com accedilatildeo imunomodulatoacuteria tem aumentado
significativamente As naftoquinonas vecircm ganhando bastante importacircncia na pesquisa de
novas drogas antivirais devido agrave algumas atividades apresentadas A szlig-lapachona-orto-
naftoquinona por exemplo se mostrou um potente inibidor da enzima transcriptase reversa
dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e leucemia murina de Rauscher (RLV)
Diante da inexistecircncia de drogas com accedilatildeo anti DENV e o elevado nuacutemero e casos da
patogenia nos uacuteltimos anos a organizaccedilatildeo mundial da sauacutede classificou a Dengue como uma
epidemia de proporccedilotildees globais e um problema de sauacutede puacuteblica Como as naftoquinonas jaacute
demonstraram na literatura possuir um potencial efeito terapecircutico contra alguns viacuterus eacute
possiacutevel que estes compostos possam apresentar atividade antiviral contra DENV Portanto
este trabalho visou atraveacutes de ensaios de MTT e titulaccedilotildees virais em placa avaliar a potencial
atividade antiviral de oito compostos derivados de naftoquinonas naturais e sinteacuteticas
15
III OBJETIVOS
16
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar oito compostos (2 naturais e 6 sinteacuteticos) derivados de naftoquinonas como potenciais
agentes antivirais em ceacutelulas BHK-21 frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1 e 2
32 Objetivos especiacuteficos
1 Calcular o iacutendice de citotoxicidade e a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) dos compostos
atraveacutes de ensaio de reduccedilatildeo de MTT
2 Avaliar os efeitos dos compostos sobre o crescimento a viabilidade e o volume celular
pela teacutecnica de exclusatildeo do azul de tripan
3 Determinar a multiplicidade de infecccedilatildeo de DENV 1 e 2 a ser utilizada nos ensaios
antivirais
4 Avaliar a atividade antiviral dos compostos frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1
e 2 atraveacutes do ensaio de MTT
5 Verificar um possiacutevel efeito direto dos compostos agraves partiacuteculas virais de Dengue virus
6 Quantificar a produccedilatildeo de partiacuteculas virais infecciosas no sobrenadante de ceacutelulas
infectadas atraveacutes de titulaccedilatildeo viral pela contagem de unidades formadoras de placas
17
IV MATERIAL E MEacuteTODOS
18
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Linhagens celulares
411 Ceacutelulas C636
As ceacutelulas C636 satildeo ceacutelulas de linhagem contiacutenua de larvas de mosquito Aedes
albopictus Estas ceacutelulas foram utilizadas na produccedilatildeo de estoque viral de DENV sorotipos 1
e 2 para isso foram mantidas em meio de cultura Leibovitz-15 (L-15) (Cultilab)
suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (Cultilab) antibioacuteticos (Penicilina 100 UmL
Streptomicina 100 microgmL) e antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL) a 28degC
412 Ceacutelulas BHK-21
As ceacutelulas BHK-21 satildeo fibroblastos de linhagem contiacutenua derivados de rim de hamster
neonato Estas ceacutelulas foram utilizadas para os experimentos in vitro e para as titulaccedilotildees de
DENV 1 e 2 para isso foram mantidas em meio miacutenimo essencial modificado por Dulbecco
ndash DMEM (Cultilab) suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (SFB) com antibioacuteticos
(Penicilina 100 UmL Streptomicina 100 microgmL) e com antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL)
sendo mantidas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5
42 Viacuterus
421 DENV 1 e DENV 2
O Sorotipo 1 do Dengue virus (DENV-1) estirpe Mochizuki foi replicado em ceacutelulas
C636 para gerar estoques de trabalho durante 2 e 5 dias a 28degC O sobrenadante da cultura de
ceacutelulas infectadas foi recolhido e clarificado por centrifugaccedilatildeo a 4000 G durante 10 minutos agrave
4degC e entatildeo foi aliquotado e armazenado a -70 deg C como reserva de viacuterus ateacute agrave sua utilizaccedilatildeo
A replicaccedilatildeo geraccedilatildeo de estoque e titulaccedilatildeo do Sorotipo 2 do Dengue virus (DENV-2)
estirpe Nova Guineacute C ocorreu nos mesmos moldes do DENV-1
19
422 Titulaccedilatildeo viral
Os estoques virais foram diluiacutedos (10-1
a 10-7
) e inoculados em monocamadas de
ceacutelulas BHK-21 implantadas em placas de 6 poccedilos com confluecircncia de aproximadamente
60 (3x105 ceacutelulas por poccedilo) sendo um poccedilo natildeo infectado mantido para controle celular
Apoacutes uma hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus foram adicionados 3 mL de meio DMEM (Cultilab)
suplementado com 15 de SFB e contendo 15 de Carboximetilcelulose (CMC Synth) As
placas foram entatildeo incubadas a 37degC (CO2 a 5) por 96 horas As ceacutelulas foram entatildeo
fixadas com 2 mL de soluccedilatildeo de formol a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo
1 (pv) de cristal violeta em PBS para contagem das placas de lise O tiacutetulo viral foi
expresso atraveacutes do nuacutemero de unidades formadoras de placa por mL (UFPmL) segundo a
formula abaixo representada
Tiacutetulo viral (UFPmL) = N x FC x 10
N = nuacutemero de placas de lise contadas
FC = Fator de correccedilatildeo
= Inverso da diluiccedilatildeo na qual foram contadas as placas de lise
43 Compostos de naftoquinonas
Os compostos utilizados neste estudo foram fornecidos pelo Dr Geraldo Ceacutelio
Brandatildeo do laboratoacuterio de pesquisa da Escola de Farmaacutecia da Universidade Federal de Ouro
Preto
20
Tabela 1 Relaccedilatildeo de nome estrutura e coacutedigo dos compostos utilizados Na tabela estatildeo
presentes a relaccedilatildeo dos nomes dos compostos utilizados neste trabalho bem como sua
estrutura Os coacutedigos representantes de cada composto seratildeo utilizados no decorrer da escrita
Nome do composto Estrutura Coacutedigo
Lapachol
A1
β-lapachona
A2
2-Hidroxi-3-(ββ-dimetilvinil)-14-naftoquinona
A3
2-Cloro-14-naftoquinona
A4
Lapachol derivado 1
A5
Lapachol derivado 2 A6
Lapachol derivado 3 A7
Lapachol derivado 4 A8
44 Ensaio de citotoxicidade
Para avaliar a citotoxicidade dos compostos ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas foram incubadas com diferentes concentraccedilotildees dos compostos em triplicata num
volume de 200 microL de meio de cultura por poccedilo na presenccedila de 1 de SFB Os controles natildeo
tratados apresentaram adiccedilatildeo de 200 microL de meio de cultura As ceacutelulas foram entatildeo incubadas
durante 72 horas O meio foi removido e 28 microL de soluccedilatildeo de 5 mg mL MTT (brometo de 3-
21
[45-dimetil-tiazol-2-il]-25 difeniltertrazoacutelio) foi adicionado a cada poccedilo As placas foram re-
incubadas durante 1 hora e 30 minutos e entatildeo 122 microL de DMSO foi adicionado a cada poccedilo e
placas foram agitadas suavemente durante 15 minutos para dissolver os cristais de formazan
A absorbacircncia foi lida em um equipamento leitor de placas Victor X3 (PerkinElmer) a 490
nm A concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC 50) foi definida como a concentraccedilatildeo da amostra que
reduziu a viabilidade celular de 50 em comparaccedilatildeo com controles natildeo tratados Os dados
foram analisados utilizando o programa Prisma
45 Avaliaccedilatildeo da viabilidade e crescimento celular por exclusatildeo de azul de tripan
Ceacutelulas BHK-21 foram cultivadas em placas de 24 poccedilos (7x104 ceacutelulaspoccedilo) e apoacutes
24 horas foram tratadas com as concentraccedilotildees de uso de cada composto e incubadas por 72
horas na presenccedila de 1 de SFB A seguir as ceacutelulas foram tripsinizadas e incubadas com
azul de tripan e entatildeo foi utilizado um contador automatizado de ceacutelulas (Countess II FL
Automated Cell Counter ndash Thermo Fisher Scientific) para contagem das ceacutelulas e avaliaccedilatildeo da
porcentagem de viabilidade e diacircmetro celular do controle nos tempos de 0 24 e 96 horas e
avaliaccedilatildeo dos mesmos paracircmetros para os compostos no tempo de 96 horas (72 horas poacutes
tratamento)
Outra curva de multiplicaccedilatildeo celular foi feita para os compostos A1 A3 A4 e A5 onde as
ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos no momento da confecccedilatildeo da placa e
foram avaliados os mesmos paracircmetros nos tempos de 0 12 24 48 e 72 horas O
equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
46 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
Para determinar a menor Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) responsaacutevel pela letalidade
celular total 2x104 de ceacutelulas BHK-21 foram semeadas em placa de 96 poccedilos Apoacutes a
incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o
meio de cultura foi removido e as ceacutelulas foram expostas a diferentes diluiccedilotildees dos dois
sorotipos de DENV (100 microL de cada diluiccedilatildeo + 100 microL de meio DEMEM 1 SFB) As
diluiccedilotildees seriadas foram realizadas da suspensatildeo viral na razatildeo de 5 para o primeiro poccedilo e de
2 para os demais poccedilos Apoacutes 72 horas as ceacutelulas foram entatildeo fixadas com 200 microL de soluccedilatildeo
22
formalina a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo 1 (pv) de cristal violeta em
PBS para avaliaccedilatildeo da maior diluiccedilatildeo responsaacutevel pela letalidade de 100 das ceacutelulas
47 Ensaio Dose-resposta
Para cada composto foram realizados ensaios de dose-resposta para definiccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de cada composto capaz de promover a reduccedilatildeo na produccedilatildeo viral A atividade
antiviral foi avaliada tambeacutem pelo meacutetodo de MTT Ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas expostas a diferentes concentraccedilotildees dos extratos determinadas a partir das maiores
concentraccedilotildees em que natildeo foram observados efeitos citotoacutexicos As ceacutelulas foram tratadas
com as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de cada composto e em seguida infectadas com DENV
1 (MOI= 5) ou 2 (MOI= 2) Mantendo uma coluna para controle com DMSO uma coluna
para controle de viacuterus uma coluna para controle de citotoxicidade dos compostos e por fim
uma coluna para controle celular As ceacutelulas foram entatildeo incubadas durante 72 horas Apoacutes
este tempo procedeu-se a leitura pelo ensaio de MTT como descrito anteriormente Os dados
foram analisados levando-se em consideraccedilatildeo a leitura das absorbacircncias dos poccedilos dos
controles de viacuterus e do controle celular
Para realizacao destes experimentos os seguintes controles foram adotados
Controle de ceacutelulas poccedilos contendo somente ceacutelulas acrescidas do meio de cultura DMEM
1 SFB Utilizado para avaliar o comportamento das ceacutelulas sem que as mesmas tivessem
contato com qualquer interferente durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo Com isso os poccedilos
reservados para esse controle serviram de padratildeo para comparaccedilatildeo com aqueles em que fosse
observada atividade citotoacutexica ou citopaacutetica
Controle de viacuterus poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM 1 SFB
sem nenhum tratamento e de suspensatildeo de viacuterus Utilizando como referecircncia para anaacutelise da
atividade citopaacutetica provocada pelo viacuterus testado durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo das placas
23
Controle de viacuterus com DMSO Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura
DMEM 1 SFB e DMSO Foi utilizado para avaliar se havia influecircncia prejudicial do
solvente utilizado para diluiccedilatildeo das amostras no meio de cultivo das ceacutelulas e se o mesmo
poderia apresentar alguma potencial atividade antiviral aparente
Controle de citotoxicidade Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM
1 SFB e as quatro principais concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos Foi utilizado
para avaliar se haveria alguma possiacutevel atividade citotoacutexica das concentraccedilotildees dos compostos
em relaccedilatildeo agraves ceacutelulas
48 Ensaio Virucida
Para a realizaccedilatildeo deste ensaio aliacutequotas de 950 microL (diluiccedilatildeo de 20 vezes) do DENV 1 (tiacutetulo
6 x 107 UFPmL) foram incubadas com 50 microL de uma soluccedilatildeo de meio DMEM preparada
com 20x a concentraccedilatildeo natildeo citotoacutexica de cada composto A1 a A8 em banho-maria 37deg C
por 1 hora Apoacutes a incubaccedilatildeo as aliacutequotas foram imediatamente tituladas em ceacutelulas BHK-21
em placas de 6 poccedilos utilizando-se 3 diluiccedilotildees para cada incubaccedilatildeo (20x 20 x 10-1
e 20 x 10-
2) Foram titulados tambeacutem uma aliacutequota incubada apenas com meio DMEM sem nenhum
tratamento e outra aliacutequota incubada com DMSO (Dimetilsulfoacutexido) Estas foram tituladas
utilizando um controle e mais cinco diluiccedilotildees (20x 20 x 10-1
20 x 10-2
20 x 10-3
e 20 x 10-4
)
49 Ensaio antiviral
Neste ensaio ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em placas de 24 poccedilos no dia
seguinte foram tratadas durante 4 horas com as concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas de cada
composto em duplicata Apoacutes o preacute-tratamento as monocamadas foram infectadas com
DENV-1 a uma MOI=5 na presenccedila das concentraccedilotildees de uso respectivas de cada composto
Apoacutes 1 hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus as monocamadas foram lavadas duas vezes com PBS e
foi adicionado 500 microL por poccedilo de meio preparado com as mesmas concentraccedilotildees dos
diferentes compostos e mantidos durante 48 horas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5 Em
quatro poccedilos as ceacutelulas foram infectadas e natildeo tratadas e em outros quatro poccedilos as ceacutelulas
natildeo foram tratadas e nem infectadas (controle de ceacutelulas) destes uacuteltimos dois foram
tripsinizados e contados no momento da infecccedilatildeo e os outros dois apoacutes o teacutermino do ensaio
24
para avaliar o crescimento celular Decorridas as 48 horas o sobrenadante foi coletado e
centrifugado por 10 minutos a 4000 xG para separaccedilatildeo dos debris celulares e prontamente
titulado em placa de 6 poccedilos
410 Anaacutelise estatiacutestica
Os valores de CC50 foram obtidos a partir de anaacutelise de regressatildeo linear das curvas de
concentraccedilatildeocitotoxicidade A anaacutelise estatiacutestica dos dados foi realizada pelo programa
GraphPad Prism software Uma anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi utilizada para determinar
as diferenccedilas estatiacutesticas seguida do poacutes teste de Tukey A significacircncia estatiacutestica foi fixada
em p lt005
25
V RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
26
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Ensaio de citotoxicidade celular
Para avaliar a viabilidade da linhagem celular BHK-21 frente ao tratamento com oito
diferentes concentraccedilotildees dos compostos (A1 a A8) realizou-se um ensaio de MTT (brometo
de 3-[45-dimetil-tiazol-2-il]-25-difeniltetrazoacutelio) Este ensaio tem o objetivo de quantificar
espectrofotometricamente o crescimento celular a viabilidade e proliferaccedilatildeo podendo ser
utilizado como um indicador direto de citotoxicidade Trata-se de um ensaio colorimeacutetrico
para medir a atividade da redutase mitocondrial em ceacutelulas vivas Ele se baseia na reduccedilatildeo do
sal amarelo tetrazoacutelio (permeaacutevel agrave membrana celular) para cristais de formazan azuis
puacuterpura por ceacutelulas metabolicamente ativas a quantidade de formazan gerada medida por
espectrofotometria eacute proporcional ao nuacutemero de ceacutelulas viaacuteveis
A CC50 foi calculada plotando-se uma curva de porcentagem de viabilidade celular por
concentraccedilatildeo melhor representada na figura 7 pelo composto A7 e os resultados de CC50
para todos os compostos estatildeo representados na tabela 2 Foram feitos ensaios de
citotoxicidade com oito concentraccedilotildees diferentes sendo escolhida a maior concentraccedilatildeo que
natildeo apresentou citotoxicidade
Viabilidade Celular = [ ( A ndash B ) A ] x 100
Onde
A = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas natildeo tratadas
B = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas tratadas com
as respectivas concentraccedilotildees de cada composto
27
28
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (A curva dose resposta do composto A7 eacute a que
melhor representa a curva dose resposta esperada) Avaliou-se a viabilidade da linhagem
celular BHK-21 frente agrave diferentes concentraccedilotildees dos compostos realizando o ensaio de MTT
e determinando assim as concentraccedilotildees a serem utilizadas nos proacuteximos ensaios bem como
calculando a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) agrave partir da curva
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo
da concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50)
Composto Concentraccedilatildeo utilizada
[ ] microgmL
Concentraccedilatildeo citotoacutexica 50
(CC50) [ ] microgmL plusmn Desvio
Padratildeo
A1 ([ ]=1 mgmL) 00200 10010 plusmn 0014
A2 ([ ]=1 mgmL) 00025 09561 plusmn 0023
A3 ([ ]=1 mgmL) 00025 09988 plusmn 0017
A4 ([ ]=5 mgmL) 00125 10150 plusmn 0036
A5 ([ ]=10 mgmL) 00250 10590 plusmn 0047
A6 ([ ]=5 mgmL) 00250 08183 plusmn 0030
A7 ([ ]=5 mgmL) 00125 10280 plusmn 0052
A8 ([ ]=5 mgmL) 00125 09758 plusmn 0036
52 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan
Para corroborar o ensaio anterior de citotoxicidade utilizou -se o teste de viabilidade
celular pela teacutecnica da exclusatildeo do azul de tripan com a finalidade de determinar a
viabilidade das ceacutelulas Os procedimentos adotados no ensaio seguiram o manual do
equipamento contador automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL Automated Cell Counter) entatildeo
foi acrescentado agrave 10 microL da suspensatildeo celular 10 microL de azul de tripan (04) Apoacutes
homogeneizaccedilatildeo 10 microL da suspensatildeo foi colocada no local indicado da lacircmina proacutepria para
leitura e foi realizada a contagem sendo consideradas mortas (inviaacuteveis) as ceacutelulas que
incorporavam o corante e viaacuteveis as que excluiacuteam o azul de tripan
29
O equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
(A)
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan A avaliaccedilatildeo da
viabilidade celular foi realizada atraveacutes de um contador automaacutetico de ceacutelulas Este
equipamento possibilita explorar ferramentas de fotografia e avaliar alguns paracircmetros
importantes (A) fotografia das ceacutelulas (B) Zoom na fotografia das ceacutelulas com marcaccedilotildees
(em verde para ceacutelulas vivas e vermelho para mortas) e (D) contagem das ceacutelulas totais
ceacutelulas vivas e mortas graacutefico e meacutedia dos diacircmetros celulares das ceacutelulas vivas e mortas
(B)
(C)
30
O crescimento celular de ceacutelulas natildeo tratadas foi avaliado nos tempos de 0h (momento
da confecccedilatildeo da placa) 24h (momento de tratamento com os compostos) e 96 horas
(Momento em que todas as ceacutelulas foram tripsinizadas e contadas) para avaliar o perfil do
crescimento celular em ceacutelulas natildeo tratadas Foi observado um crescimento celular no periacuteodo
de 24 horas onde as ceacutelulas estavam incubadas com meio acrescido de 10 SFB Em 24
horas o meio foi trocado por 1 SFB e acrescido das substacircncias testes nas menores diluiccedilotildees
natildeo citotoacutexicas determinadas pelo ensaio do MTT Em 96 horas pode ser observado um
decaimento no nuacutemero de ceacutelulas vivas provavelmente devido ao crescimento celular (morte
por confluecircncia)
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas)
(A) (B)
31
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas (A)
Contagem de ceacutelulas vivas (B) Percentual de ceacutelulas viaacuteveis (Viabilidade celular ) e (C)
Meacutedia do diacircmetro apresentado pelas ceacutelulas vivas
Em 96 horas as ceacutelulas natildeo tratadas bem como as ceacutelulas tratadas por 72 horas com as
concentraccedilotildees de uso dos compostos foram tripsinizadas e avaliadas quanto ao nuacutemero de
ceacutelulas vivas viabilidade e diacircmetro celular apresentados na figura 10
Segundo se observa natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo aparente que possa demonstrar que
as concentraccedilotildees de uso dos compostos tenham causado alguma atividade citotoacutexica
corroborando assim os ensaios de citotoxicidade anteriores
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
A infectividade de um viacuterus depende de vaacuterios fatores entre eles da proporccedilatildeo de
partiacuteculas virais completas ou infecciosas da suscetibilidade da ceacutelula hospedeira e da
chance desta partiacutecula encontrar o receptor e penetrar na ceacutelula Quando ceacutelulas suscetiacuteveis
satildeo misturadas com uma suspensatildeo de viacuterus estas podem receber uma duas trecircs ou dez
partiacuteculas virais ou nenhuma Isto depende da proporccedilatildeo entre a quantidade de viacuterus
infecciosos presente no inoculo e a quantidade de ceacutelulas utilizada Esta relaccedilatildeo eacute denominada
de multiplicidade de infecccedilatildeo ou MOI Uma MOI=1 indica que a infecccedilatildeo foi feita em
principio com 1 viacuterus ou 1 dose infectante por ceacutelula
A determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo dos Dengue virus 1 e 2 a serem
utilizadas nos proacuteximos ensaios foi feita a partir da infecccedilatildeo de ceacutelulas BHK-21 por diferentes
(C)
32
concentraccedilotildees de viacuterus e revelaccedilatildeo com cristal violeta Escolheu-se a maior diluiccedilatildeo viral que
possibilitou a letalidade total das ceacutelulas (faixa onde todas as ceacutelulas estatildeo mortas utilizando
menor concentraccedilatildeo de viacuterus) As faixas escolhidas foram entatildeo calculadas levando-se em
consideraccedilatildeo o nuacutemero de ceacutelulas presentes no poccedilo e o nuacutemero de partiacuteculas virais que foram
adicionadas (Faixa3 para DENV2 e 2 para DENV1) Figura 11 Foi estipulado portanto a
Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 2 para DENV 2 e 5 para DENV 1
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI A partir da infecccedilatildeo da linhagem celular BHK-21 em
placa de 96 poccedilos com diferentes diluiccedilotildees de DENV foi determinado que a Multiplicidade
de infecccedilatildeo para o Dengue viacuterus sorotipos 1 e 2 seria de 5 e 2 respectivamente (colunas 2 -
DENV1 e 3 - DENV2)
54 Ensaio dose resposta
Apoacutes a determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas ideais realizou-se um
ensaio dose resposta tratando as ceacutelulas com oito concentraccedilotildees agrave partir das concentraccedilotildees natildeo
citotoacutexicas escolhidas para cada composto e em seguida infectando com DENV sorotipos 1 e
2 nas MOIs estipuladas anteriormente (5 e 2 respectivamente) A porcentagem do efeito
protetor conferida agraves ceacutelulas para cada concentraccedilatildeo de amostra testada foi calculada da
seguinte forma
33
EP = [ (A ndash B) (C ndash B) ] x 100
Onde
A Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas tratadas e infectadas
B Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e infectadas
C Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e natildeo infectadas
Este ensaio tem por objetivo identificar a resposta celular agrave infecccedilatildeo frente ao
tratamento com os compostos em diferentes concentraccedilotildees Assim como o ensaio de
toxicidade este ensaio feito utilizando a teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT permite o teste de vaacuterias
concentraccedilotildees diferentes em um menor tempo e com baixo gasto de material
34
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV1
(MOI=5)
35
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV2
(MOI=2)
36
Takegami et al (1998) demonstraram atividade de furanonaftoquinonas contra o viacuterus
da Encefalite Japonesa (Flavivirus) utilizando a concentraccedilatildeo de 3microgmL poreacutem para os
compostos apresentados avaliados pela teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT nenhuma das
concentraccedilotildees apresentadas produziu efeito antiviral significativo em relaccedilatildeo ao controle
celular como observado nas figuras 12 e 13
Apesar da teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT ser interessante como triagem de atividade
antiviral permitindo o teste de vaacuterias concentraccedilotildees dos compostos em menor tempo e
utilizando uma quantidade razoaacutevel de materiais optou-se por utilizar as maiores
concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas encontradas avaliando sua atividade antiviral por outras
teacutecnicas Como natildeo foi avaliada atividade antiviral preacutevia para nenhum dos compostos frente
agrave infecccedilatildeo por DENV1 e 2 foi selecionado o Dengue virus 1 para dar prosseguimento aos
ensaios
55 Ensaio Virucida
O ensaio virucida foi realizado para avaliar um potencial efeito dos compostos
diretamente sobre a partiacutecula viral Este ensaio eacute importante pois possibilita elucidar se o
composto pode produzir algum efeito sobre a partiacutecula viral impedindo que esta possa infectar
as ceacutelulas
Figura 14 Ensaio virucida Neste ensaio as aliacutequotas de DENV1 foram incubadas com as
concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos e titulados (NT) Controle natildeo tratado
37
Tabela 3 Ensaio virucida Caacutelculo do tiacutetulo viral (UFPmL) e porcentagem representante de
cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 254 x 105 100
DMSO 263 x 105 10335
A1 199 x 105 7835
A2 205 x 105 8071
A3 237 x 105 9311
A4 775 x 104 3049
A5 153 x 105 6024
A6 219 x 105 8602
A7 243 x 105 9547
A8 254 x 105 100
Lagrota et al (1988) demonstraram atividade de 2-HO-3-N-benzil-N(N-benzil-2-
etilamina) -14-naftoquinona sobre a partiacutecula viral de enterovirus De forma contraacuteria apesar
de se verificar a reduccedilatildeo de quase uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais
para o composto A4 natildeo considerou-se esta uma alteraccedilatildeo significativa pois devido agrave
magnitude do nuacutemero de UFPs se trata de uma alteraccedilatildeo muito pequena Portanto os
compostos avaliados neste trabalho natildeo produziram atividade virucida aparente frente ao
tratamento com as concentraccedilotildees de uso
56 Ensaio Antiviral
O sobrenadante de ceacutelulas tratadas previamente e infectadas por DENV1 coletado 48
horas poacutes infecccedilatildeo foi avaliado quanto agrave produccedilatildeo viral de partiacuteculas infecciosas pela
contagem de placas de lise e caacutelculo de Unidades Formadoras de Placa (Titulaccedilatildeo viral em
placa ndash UFPmL)
38
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral Sobrenadante de ceacutelulas tratadas e infectadas por DENV1
coletado apoacutes 48 horas e titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado
Tabela 4 Ensaio Antiviral Coleta do sobrenadante de ceacutelulas infectadas por DENV1 Tiacutetulo
viral (UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o
controle natildeo tratado como 100
Ao perceber um aumento no tiacutetulo viral frente ao tratamento com os compostos A1
A2 e A3 e uma reduccedilatildeo frente ao tratamento com A4 A5 e A6 foram escolhidos dois
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 119 x 105 10000
A1 235 x 105 19748
A2 228 x 105 19160
A3 318 x 105 26723
A4 128 x 104 1076
A5 186 x 103 156
A6 190 x 104 1597
A7 280 x 104 2353
A8 350 x 104 2941
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
40
Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
14
2 JUSTIFICATIVA
Aleacutem do controle do mosquito transmissor e do desenvolvimento de vacinas que tem
sido exaustivamente estudado nos uacuteltimos anos uma alternativa para o combate agrave dengue
seria o desenvolvimento de faacutermacos para reduzir a viremia ou mesmo para controlar a
resposta imune do hospedeiro agrave infecccedilatildeo que tem sido apontada como principal fator de risco
nos casos mais graves Em funccedilatildeo disso o nuacutemero de pesquisas visando o desenvolvimento
de drogas com accedilatildeo antiviral ou com accedilatildeo imunomodulatoacuteria tem aumentado
significativamente As naftoquinonas vecircm ganhando bastante importacircncia na pesquisa de
novas drogas antivirais devido agrave algumas atividades apresentadas A szlig-lapachona-orto-
naftoquinona por exemplo se mostrou um potente inibidor da enzima transcriptase reversa
dos viacuterus mieloblastose aviaacuteria (AMV) e leucemia murina de Rauscher (RLV)
Diante da inexistecircncia de drogas com accedilatildeo anti DENV e o elevado nuacutemero e casos da
patogenia nos uacuteltimos anos a organizaccedilatildeo mundial da sauacutede classificou a Dengue como uma
epidemia de proporccedilotildees globais e um problema de sauacutede puacuteblica Como as naftoquinonas jaacute
demonstraram na literatura possuir um potencial efeito terapecircutico contra alguns viacuterus eacute
possiacutevel que estes compostos possam apresentar atividade antiviral contra DENV Portanto
este trabalho visou atraveacutes de ensaios de MTT e titulaccedilotildees virais em placa avaliar a potencial
atividade antiviral de oito compostos derivados de naftoquinonas naturais e sinteacuteticas
15
III OBJETIVOS
16
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar oito compostos (2 naturais e 6 sinteacuteticos) derivados de naftoquinonas como potenciais
agentes antivirais em ceacutelulas BHK-21 frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1 e 2
32 Objetivos especiacuteficos
1 Calcular o iacutendice de citotoxicidade e a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) dos compostos
atraveacutes de ensaio de reduccedilatildeo de MTT
2 Avaliar os efeitos dos compostos sobre o crescimento a viabilidade e o volume celular
pela teacutecnica de exclusatildeo do azul de tripan
3 Determinar a multiplicidade de infecccedilatildeo de DENV 1 e 2 a ser utilizada nos ensaios
antivirais
4 Avaliar a atividade antiviral dos compostos frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1
e 2 atraveacutes do ensaio de MTT
5 Verificar um possiacutevel efeito direto dos compostos agraves partiacuteculas virais de Dengue virus
6 Quantificar a produccedilatildeo de partiacuteculas virais infecciosas no sobrenadante de ceacutelulas
infectadas atraveacutes de titulaccedilatildeo viral pela contagem de unidades formadoras de placas
17
IV MATERIAL E MEacuteTODOS
18
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Linhagens celulares
411 Ceacutelulas C636
As ceacutelulas C636 satildeo ceacutelulas de linhagem contiacutenua de larvas de mosquito Aedes
albopictus Estas ceacutelulas foram utilizadas na produccedilatildeo de estoque viral de DENV sorotipos 1
e 2 para isso foram mantidas em meio de cultura Leibovitz-15 (L-15) (Cultilab)
suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (Cultilab) antibioacuteticos (Penicilina 100 UmL
Streptomicina 100 microgmL) e antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL) a 28degC
412 Ceacutelulas BHK-21
As ceacutelulas BHK-21 satildeo fibroblastos de linhagem contiacutenua derivados de rim de hamster
neonato Estas ceacutelulas foram utilizadas para os experimentos in vitro e para as titulaccedilotildees de
DENV 1 e 2 para isso foram mantidas em meio miacutenimo essencial modificado por Dulbecco
ndash DMEM (Cultilab) suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (SFB) com antibioacuteticos
(Penicilina 100 UmL Streptomicina 100 microgmL) e com antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL)
sendo mantidas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5
42 Viacuterus
421 DENV 1 e DENV 2
O Sorotipo 1 do Dengue virus (DENV-1) estirpe Mochizuki foi replicado em ceacutelulas
C636 para gerar estoques de trabalho durante 2 e 5 dias a 28degC O sobrenadante da cultura de
ceacutelulas infectadas foi recolhido e clarificado por centrifugaccedilatildeo a 4000 G durante 10 minutos agrave
4degC e entatildeo foi aliquotado e armazenado a -70 deg C como reserva de viacuterus ateacute agrave sua utilizaccedilatildeo
A replicaccedilatildeo geraccedilatildeo de estoque e titulaccedilatildeo do Sorotipo 2 do Dengue virus (DENV-2)
estirpe Nova Guineacute C ocorreu nos mesmos moldes do DENV-1
19
422 Titulaccedilatildeo viral
Os estoques virais foram diluiacutedos (10-1
a 10-7
) e inoculados em monocamadas de
ceacutelulas BHK-21 implantadas em placas de 6 poccedilos com confluecircncia de aproximadamente
60 (3x105 ceacutelulas por poccedilo) sendo um poccedilo natildeo infectado mantido para controle celular
Apoacutes uma hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus foram adicionados 3 mL de meio DMEM (Cultilab)
suplementado com 15 de SFB e contendo 15 de Carboximetilcelulose (CMC Synth) As
placas foram entatildeo incubadas a 37degC (CO2 a 5) por 96 horas As ceacutelulas foram entatildeo
fixadas com 2 mL de soluccedilatildeo de formol a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo
1 (pv) de cristal violeta em PBS para contagem das placas de lise O tiacutetulo viral foi
expresso atraveacutes do nuacutemero de unidades formadoras de placa por mL (UFPmL) segundo a
formula abaixo representada
Tiacutetulo viral (UFPmL) = N x FC x 10
N = nuacutemero de placas de lise contadas
FC = Fator de correccedilatildeo
= Inverso da diluiccedilatildeo na qual foram contadas as placas de lise
43 Compostos de naftoquinonas
Os compostos utilizados neste estudo foram fornecidos pelo Dr Geraldo Ceacutelio
Brandatildeo do laboratoacuterio de pesquisa da Escola de Farmaacutecia da Universidade Federal de Ouro
Preto
20
Tabela 1 Relaccedilatildeo de nome estrutura e coacutedigo dos compostos utilizados Na tabela estatildeo
presentes a relaccedilatildeo dos nomes dos compostos utilizados neste trabalho bem como sua
estrutura Os coacutedigos representantes de cada composto seratildeo utilizados no decorrer da escrita
Nome do composto Estrutura Coacutedigo
Lapachol
A1
β-lapachona
A2
2-Hidroxi-3-(ββ-dimetilvinil)-14-naftoquinona
A3
2-Cloro-14-naftoquinona
A4
Lapachol derivado 1
A5
Lapachol derivado 2 A6
Lapachol derivado 3 A7
Lapachol derivado 4 A8
44 Ensaio de citotoxicidade
Para avaliar a citotoxicidade dos compostos ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas foram incubadas com diferentes concentraccedilotildees dos compostos em triplicata num
volume de 200 microL de meio de cultura por poccedilo na presenccedila de 1 de SFB Os controles natildeo
tratados apresentaram adiccedilatildeo de 200 microL de meio de cultura As ceacutelulas foram entatildeo incubadas
durante 72 horas O meio foi removido e 28 microL de soluccedilatildeo de 5 mg mL MTT (brometo de 3-
21
[45-dimetil-tiazol-2-il]-25 difeniltertrazoacutelio) foi adicionado a cada poccedilo As placas foram re-
incubadas durante 1 hora e 30 minutos e entatildeo 122 microL de DMSO foi adicionado a cada poccedilo e
placas foram agitadas suavemente durante 15 minutos para dissolver os cristais de formazan
A absorbacircncia foi lida em um equipamento leitor de placas Victor X3 (PerkinElmer) a 490
nm A concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC 50) foi definida como a concentraccedilatildeo da amostra que
reduziu a viabilidade celular de 50 em comparaccedilatildeo com controles natildeo tratados Os dados
foram analisados utilizando o programa Prisma
45 Avaliaccedilatildeo da viabilidade e crescimento celular por exclusatildeo de azul de tripan
Ceacutelulas BHK-21 foram cultivadas em placas de 24 poccedilos (7x104 ceacutelulaspoccedilo) e apoacutes
24 horas foram tratadas com as concentraccedilotildees de uso de cada composto e incubadas por 72
horas na presenccedila de 1 de SFB A seguir as ceacutelulas foram tripsinizadas e incubadas com
azul de tripan e entatildeo foi utilizado um contador automatizado de ceacutelulas (Countess II FL
Automated Cell Counter ndash Thermo Fisher Scientific) para contagem das ceacutelulas e avaliaccedilatildeo da
porcentagem de viabilidade e diacircmetro celular do controle nos tempos de 0 24 e 96 horas e
avaliaccedilatildeo dos mesmos paracircmetros para os compostos no tempo de 96 horas (72 horas poacutes
tratamento)
Outra curva de multiplicaccedilatildeo celular foi feita para os compostos A1 A3 A4 e A5 onde as
ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos no momento da confecccedilatildeo da placa e
foram avaliados os mesmos paracircmetros nos tempos de 0 12 24 48 e 72 horas O
equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
46 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
Para determinar a menor Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) responsaacutevel pela letalidade
celular total 2x104 de ceacutelulas BHK-21 foram semeadas em placa de 96 poccedilos Apoacutes a
incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o
meio de cultura foi removido e as ceacutelulas foram expostas a diferentes diluiccedilotildees dos dois
sorotipos de DENV (100 microL de cada diluiccedilatildeo + 100 microL de meio DEMEM 1 SFB) As
diluiccedilotildees seriadas foram realizadas da suspensatildeo viral na razatildeo de 5 para o primeiro poccedilo e de
2 para os demais poccedilos Apoacutes 72 horas as ceacutelulas foram entatildeo fixadas com 200 microL de soluccedilatildeo
22
formalina a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo 1 (pv) de cristal violeta em
PBS para avaliaccedilatildeo da maior diluiccedilatildeo responsaacutevel pela letalidade de 100 das ceacutelulas
47 Ensaio Dose-resposta
Para cada composto foram realizados ensaios de dose-resposta para definiccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de cada composto capaz de promover a reduccedilatildeo na produccedilatildeo viral A atividade
antiviral foi avaliada tambeacutem pelo meacutetodo de MTT Ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas expostas a diferentes concentraccedilotildees dos extratos determinadas a partir das maiores
concentraccedilotildees em que natildeo foram observados efeitos citotoacutexicos As ceacutelulas foram tratadas
com as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de cada composto e em seguida infectadas com DENV
1 (MOI= 5) ou 2 (MOI= 2) Mantendo uma coluna para controle com DMSO uma coluna
para controle de viacuterus uma coluna para controle de citotoxicidade dos compostos e por fim
uma coluna para controle celular As ceacutelulas foram entatildeo incubadas durante 72 horas Apoacutes
este tempo procedeu-se a leitura pelo ensaio de MTT como descrito anteriormente Os dados
foram analisados levando-se em consideraccedilatildeo a leitura das absorbacircncias dos poccedilos dos
controles de viacuterus e do controle celular
Para realizacao destes experimentos os seguintes controles foram adotados
Controle de ceacutelulas poccedilos contendo somente ceacutelulas acrescidas do meio de cultura DMEM
1 SFB Utilizado para avaliar o comportamento das ceacutelulas sem que as mesmas tivessem
contato com qualquer interferente durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo Com isso os poccedilos
reservados para esse controle serviram de padratildeo para comparaccedilatildeo com aqueles em que fosse
observada atividade citotoacutexica ou citopaacutetica
Controle de viacuterus poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM 1 SFB
sem nenhum tratamento e de suspensatildeo de viacuterus Utilizando como referecircncia para anaacutelise da
atividade citopaacutetica provocada pelo viacuterus testado durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo das placas
23
Controle de viacuterus com DMSO Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura
DMEM 1 SFB e DMSO Foi utilizado para avaliar se havia influecircncia prejudicial do
solvente utilizado para diluiccedilatildeo das amostras no meio de cultivo das ceacutelulas e se o mesmo
poderia apresentar alguma potencial atividade antiviral aparente
Controle de citotoxicidade Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM
1 SFB e as quatro principais concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos Foi utilizado
para avaliar se haveria alguma possiacutevel atividade citotoacutexica das concentraccedilotildees dos compostos
em relaccedilatildeo agraves ceacutelulas
48 Ensaio Virucida
Para a realizaccedilatildeo deste ensaio aliacutequotas de 950 microL (diluiccedilatildeo de 20 vezes) do DENV 1 (tiacutetulo
6 x 107 UFPmL) foram incubadas com 50 microL de uma soluccedilatildeo de meio DMEM preparada
com 20x a concentraccedilatildeo natildeo citotoacutexica de cada composto A1 a A8 em banho-maria 37deg C
por 1 hora Apoacutes a incubaccedilatildeo as aliacutequotas foram imediatamente tituladas em ceacutelulas BHK-21
em placas de 6 poccedilos utilizando-se 3 diluiccedilotildees para cada incubaccedilatildeo (20x 20 x 10-1
e 20 x 10-
2) Foram titulados tambeacutem uma aliacutequota incubada apenas com meio DMEM sem nenhum
tratamento e outra aliacutequota incubada com DMSO (Dimetilsulfoacutexido) Estas foram tituladas
utilizando um controle e mais cinco diluiccedilotildees (20x 20 x 10-1
20 x 10-2
20 x 10-3
e 20 x 10-4
)
49 Ensaio antiviral
Neste ensaio ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em placas de 24 poccedilos no dia
seguinte foram tratadas durante 4 horas com as concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas de cada
composto em duplicata Apoacutes o preacute-tratamento as monocamadas foram infectadas com
DENV-1 a uma MOI=5 na presenccedila das concentraccedilotildees de uso respectivas de cada composto
Apoacutes 1 hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus as monocamadas foram lavadas duas vezes com PBS e
foi adicionado 500 microL por poccedilo de meio preparado com as mesmas concentraccedilotildees dos
diferentes compostos e mantidos durante 48 horas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5 Em
quatro poccedilos as ceacutelulas foram infectadas e natildeo tratadas e em outros quatro poccedilos as ceacutelulas
natildeo foram tratadas e nem infectadas (controle de ceacutelulas) destes uacuteltimos dois foram
tripsinizados e contados no momento da infecccedilatildeo e os outros dois apoacutes o teacutermino do ensaio
24
para avaliar o crescimento celular Decorridas as 48 horas o sobrenadante foi coletado e
centrifugado por 10 minutos a 4000 xG para separaccedilatildeo dos debris celulares e prontamente
titulado em placa de 6 poccedilos
410 Anaacutelise estatiacutestica
Os valores de CC50 foram obtidos a partir de anaacutelise de regressatildeo linear das curvas de
concentraccedilatildeocitotoxicidade A anaacutelise estatiacutestica dos dados foi realizada pelo programa
GraphPad Prism software Uma anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi utilizada para determinar
as diferenccedilas estatiacutesticas seguida do poacutes teste de Tukey A significacircncia estatiacutestica foi fixada
em p lt005
25
V RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
26
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Ensaio de citotoxicidade celular
Para avaliar a viabilidade da linhagem celular BHK-21 frente ao tratamento com oito
diferentes concentraccedilotildees dos compostos (A1 a A8) realizou-se um ensaio de MTT (brometo
de 3-[45-dimetil-tiazol-2-il]-25-difeniltetrazoacutelio) Este ensaio tem o objetivo de quantificar
espectrofotometricamente o crescimento celular a viabilidade e proliferaccedilatildeo podendo ser
utilizado como um indicador direto de citotoxicidade Trata-se de um ensaio colorimeacutetrico
para medir a atividade da redutase mitocondrial em ceacutelulas vivas Ele se baseia na reduccedilatildeo do
sal amarelo tetrazoacutelio (permeaacutevel agrave membrana celular) para cristais de formazan azuis
puacuterpura por ceacutelulas metabolicamente ativas a quantidade de formazan gerada medida por
espectrofotometria eacute proporcional ao nuacutemero de ceacutelulas viaacuteveis
A CC50 foi calculada plotando-se uma curva de porcentagem de viabilidade celular por
concentraccedilatildeo melhor representada na figura 7 pelo composto A7 e os resultados de CC50
para todos os compostos estatildeo representados na tabela 2 Foram feitos ensaios de
citotoxicidade com oito concentraccedilotildees diferentes sendo escolhida a maior concentraccedilatildeo que
natildeo apresentou citotoxicidade
Viabilidade Celular = [ ( A ndash B ) A ] x 100
Onde
A = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas natildeo tratadas
B = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas tratadas com
as respectivas concentraccedilotildees de cada composto
27
28
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (A curva dose resposta do composto A7 eacute a que
melhor representa a curva dose resposta esperada) Avaliou-se a viabilidade da linhagem
celular BHK-21 frente agrave diferentes concentraccedilotildees dos compostos realizando o ensaio de MTT
e determinando assim as concentraccedilotildees a serem utilizadas nos proacuteximos ensaios bem como
calculando a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) agrave partir da curva
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo
da concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50)
Composto Concentraccedilatildeo utilizada
[ ] microgmL
Concentraccedilatildeo citotoacutexica 50
(CC50) [ ] microgmL plusmn Desvio
Padratildeo
A1 ([ ]=1 mgmL) 00200 10010 plusmn 0014
A2 ([ ]=1 mgmL) 00025 09561 plusmn 0023
A3 ([ ]=1 mgmL) 00025 09988 plusmn 0017
A4 ([ ]=5 mgmL) 00125 10150 plusmn 0036
A5 ([ ]=10 mgmL) 00250 10590 plusmn 0047
A6 ([ ]=5 mgmL) 00250 08183 plusmn 0030
A7 ([ ]=5 mgmL) 00125 10280 plusmn 0052
A8 ([ ]=5 mgmL) 00125 09758 plusmn 0036
52 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan
Para corroborar o ensaio anterior de citotoxicidade utilizou -se o teste de viabilidade
celular pela teacutecnica da exclusatildeo do azul de tripan com a finalidade de determinar a
viabilidade das ceacutelulas Os procedimentos adotados no ensaio seguiram o manual do
equipamento contador automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL Automated Cell Counter) entatildeo
foi acrescentado agrave 10 microL da suspensatildeo celular 10 microL de azul de tripan (04) Apoacutes
homogeneizaccedilatildeo 10 microL da suspensatildeo foi colocada no local indicado da lacircmina proacutepria para
leitura e foi realizada a contagem sendo consideradas mortas (inviaacuteveis) as ceacutelulas que
incorporavam o corante e viaacuteveis as que excluiacuteam o azul de tripan
29
O equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
(A)
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan A avaliaccedilatildeo da
viabilidade celular foi realizada atraveacutes de um contador automaacutetico de ceacutelulas Este
equipamento possibilita explorar ferramentas de fotografia e avaliar alguns paracircmetros
importantes (A) fotografia das ceacutelulas (B) Zoom na fotografia das ceacutelulas com marcaccedilotildees
(em verde para ceacutelulas vivas e vermelho para mortas) e (D) contagem das ceacutelulas totais
ceacutelulas vivas e mortas graacutefico e meacutedia dos diacircmetros celulares das ceacutelulas vivas e mortas
(B)
(C)
30
O crescimento celular de ceacutelulas natildeo tratadas foi avaliado nos tempos de 0h (momento
da confecccedilatildeo da placa) 24h (momento de tratamento com os compostos) e 96 horas
(Momento em que todas as ceacutelulas foram tripsinizadas e contadas) para avaliar o perfil do
crescimento celular em ceacutelulas natildeo tratadas Foi observado um crescimento celular no periacuteodo
de 24 horas onde as ceacutelulas estavam incubadas com meio acrescido de 10 SFB Em 24
horas o meio foi trocado por 1 SFB e acrescido das substacircncias testes nas menores diluiccedilotildees
natildeo citotoacutexicas determinadas pelo ensaio do MTT Em 96 horas pode ser observado um
decaimento no nuacutemero de ceacutelulas vivas provavelmente devido ao crescimento celular (morte
por confluecircncia)
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas)
(A) (B)
31
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas (A)
Contagem de ceacutelulas vivas (B) Percentual de ceacutelulas viaacuteveis (Viabilidade celular ) e (C)
Meacutedia do diacircmetro apresentado pelas ceacutelulas vivas
Em 96 horas as ceacutelulas natildeo tratadas bem como as ceacutelulas tratadas por 72 horas com as
concentraccedilotildees de uso dos compostos foram tripsinizadas e avaliadas quanto ao nuacutemero de
ceacutelulas vivas viabilidade e diacircmetro celular apresentados na figura 10
Segundo se observa natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo aparente que possa demonstrar que
as concentraccedilotildees de uso dos compostos tenham causado alguma atividade citotoacutexica
corroborando assim os ensaios de citotoxicidade anteriores
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
A infectividade de um viacuterus depende de vaacuterios fatores entre eles da proporccedilatildeo de
partiacuteculas virais completas ou infecciosas da suscetibilidade da ceacutelula hospedeira e da
chance desta partiacutecula encontrar o receptor e penetrar na ceacutelula Quando ceacutelulas suscetiacuteveis
satildeo misturadas com uma suspensatildeo de viacuterus estas podem receber uma duas trecircs ou dez
partiacuteculas virais ou nenhuma Isto depende da proporccedilatildeo entre a quantidade de viacuterus
infecciosos presente no inoculo e a quantidade de ceacutelulas utilizada Esta relaccedilatildeo eacute denominada
de multiplicidade de infecccedilatildeo ou MOI Uma MOI=1 indica que a infecccedilatildeo foi feita em
principio com 1 viacuterus ou 1 dose infectante por ceacutelula
A determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo dos Dengue virus 1 e 2 a serem
utilizadas nos proacuteximos ensaios foi feita a partir da infecccedilatildeo de ceacutelulas BHK-21 por diferentes
(C)
32
concentraccedilotildees de viacuterus e revelaccedilatildeo com cristal violeta Escolheu-se a maior diluiccedilatildeo viral que
possibilitou a letalidade total das ceacutelulas (faixa onde todas as ceacutelulas estatildeo mortas utilizando
menor concentraccedilatildeo de viacuterus) As faixas escolhidas foram entatildeo calculadas levando-se em
consideraccedilatildeo o nuacutemero de ceacutelulas presentes no poccedilo e o nuacutemero de partiacuteculas virais que foram
adicionadas (Faixa3 para DENV2 e 2 para DENV1) Figura 11 Foi estipulado portanto a
Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 2 para DENV 2 e 5 para DENV 1
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI A partir da infecccedilatildeo da linhagem celular BHK-21 em
placa de 96 poccedilos com diferentes diluiccedilotildees de DENV foi determinado que a Multiplicidade
de infecccedilatildeo para o Dengue viacuterus sorotipos 1 e 2 seria de 5 e 2 respectivamente (colunas 2 -
DENV1 e 3 - DENV2)
54 Ensaio dose resposta
Apoacutes a determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas ideais realizou-se um
ensaio dose resposta tratando as ceacutelulas com oito concentraccedilotildees agrave partir das concentraccedilotildees natildeo
citotoacutexicas escolhidas para cada composto e em seguida infectando com DENV sorotipos 1 e
2 nas MOIs estipuladas anteriormente (5 e 2 respectivamente) A porcentagem do efeito
protetor conferida agraves ceacutelulas para cada concentraccedilatildeo de amostra testada foi calculada da
seguinte forma
33
EP = [ (A ndash B) (C ndash B) ] x 100
Onde
A Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas tratadas e infectadas
B Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e infectadas
C Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e natildeo infectadas
Este ensaio tem por objetivo identificar a resposta celular agrave infecccedilatildeo frente ao
tratamento com os compostos em diferentes concentraccedilotildees Assim como o ensaio de
toxicidade este ensaio feito utilizando a teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT permite o teste de vaacuterias
concentraccedilotildees diferentes em um menor tempo e com baixo gasto de material
34
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV1
(MOI=5)
35
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV2
(MOI=2)
36
Takegami et al (1998) demonstraram atividade de furanonaftoquinonas contra o viacuterus
da Encefalite Japonesa (Flavivirus) utilizando a concentraccedilatildeo de 3microgmL poreacutem para os
compostos apresentados avaliados pela teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT nenhuma das
concentraccedilotildees apresentadas produziu efeito antiviral significativo em relaccedilatildeo ao controle
celular como observado nas figuras 12 e 13
Apesar da teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT ser interessante como triagem de atividade
antiviral permitindo o teste de vaacuterias concentraccedilotildees dos compostos em menor tempo e
utilizando uma quantidade razoaacutevel de materiais optou-se por utilizar as maiores
concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas encontradas avaliando sua atividade antiviral por outras
teacutecnicas Como natildeo foi avaliada atividade antiviral preacutevia para nenhum dos compostos frente
agrave infecccedilatildeo por DENV1 e 2 foi selecionado o Dengue virus 1 para dar prosseguimento aos
ensaios
55 Ensaio Virucida
O ensaio virucida foi realizado para avaliar um potencial efeito dos compostos
diretamente sobre a partiacutecula viral Este ensaio eacute importante pois possibilita elucidar se o
composto pode produzir algum efeito sobre a partiacutecula viral impedindo que esta possa infectar
as ceacutelulas
Figura 14 Ensaio virucida Neste ensaio as aliacutequotas de DENV1 foram incubadas com as
concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos e titulados (NT) Controle natildeo tratado
37
Tabela 3 Ensaio virucida Caacutelculo do tiacutetulo viral (UFPmL) e porcentagem representante de
cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 254 x 105 100
DMSO 263 x 105 10335
A1 199 x 105 7835
A2 205 x 105 8071
A3 237 x 105 9311
A4 775 x 104 3049
A5 153 x 105 6024
A6 219 x 105 8602
A7 243 x 105 9547
A8 254 x 105 100
Lagrota et al (1988) demonstraram atividade de 2-HO-3-N-benzil-N(N-benzil-2-
etilamina) -14-naftoquinona sobre a partiacutecula viral de enterovirus De forma contraacuteria apesar
de se verificar a reduccedilatildeo de quase uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais
para o composto A4 natildeo considerou-se esta uma alteraccedilatildeo significativa pois devido agrave
magnitude do nuacutemero de UFPs se trata de uma alteraccedilatildeo muito pequena Portanto os
compostos avaliados neste trabalho natildeo produziram atividade virucida aparente frente ao
tratamento com as concentraccedilotildees de uso
56 Ensaio Antiviral
O sobrenadante de ceacutelulas tratadas previamente e infectadas por DENV1 coletado 48
horas poacutes infecccedilatildeo foi avaliado quanto agrave produccedilatildeo viral de partiacuteculas infecciosas pela
contagem de placas de lise e caacutelculo de Unidades Formadoras de Placa (Titulaccedilatildeo viral em
placa ndash UFPmL)
38
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral Sobrenadante de ceacutelulas tratadas e infectadas por DENV1
coletado apoacutes 48 horas e titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado
Tabela 4 Ensaio Antiviral Coleta do sobrenadante de ceacutelulas infectadas por DENV1 Tiacutetulo
viral (UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o
controle natildeo tratado como 100
Ao perceber um aumento no tiacutetulo viral frente ao tratamento com os compostos A1
A2 e A3 e uma reduccedilatildeo frente ao tratamento com A4 A5 e A6 foram escolhidos dois
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 119 x 105 10000
A1 235 x 105 19748
A2 228 x 105 19160
A3 318 x 105 26723
A4 128 x 104 1076
A5 186 x 103 156
A6 190 x 104 1597
A7 280 x 104 2353
A8 350 x 104 2941
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
40
Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
15
III OBJETIVOS
16
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar oito compostos (2 naturais e 6 sinteacuteticos) derivados de naftoquinonas como potenciais
agentes antivirais em ceacutelulas BHK-21 frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1 e 2
32 Objetivos especiacuteficos
1 Calcular o iacutendice de citotoxicidade e a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) dos compostos
atraveacutes de ensaio de reduccedilatildeo de MTT
2 Avaliar os efeitos dos compostos sobre o crescimento a viabilidade e o volume celular
pela teacutecnica de exclusatildeo do azul de tripan
3 Determinar a multiplicidade de infecccedilatildeo de DENV 1 e 2 a ser utilizada nos ensaios
antivirais
4 Avaliar a atividade antiviral dos compostos frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1
e 2 atraveacutes do ensaio de MTT
5 Verificar um possiacutevel efeito direto dos compostos agraves partiacuteculas virais de Dengue virus
6 Quantificar a produccedilatildeo de partiacuteculas virais infecciosas no sobrenadante de ceacutelulas
infectadas atraveacutes de titulaccedilatildeo viral pela contagem de unidades formadoras de placas
17
IV MATERIAL E MEacuteTODOS
18
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Linhagens celulares
411 Ceacutelulas C636
As ceacutelulas C636 satildeo ceacutelulas de linhagem contiacutenua de larvas de mosquito Aedes
albopictus Estas ceacutelulas foram utilizadas na produccedilatildeo de estoque viral de DENV sorotipos 1
e 2 para isso foram mantidas em meio de cultura Leibovitz-15 (L-15) (Cultilab)
suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (Cultilab) antibioacuteticos (Penicilina 100 UmL
Streptomicina 100 microgmL) e antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL) a 28degC
412 Ceacutelulas BHK-21
As ceacutelulas BHK-21 satildeo fibroblastos de linhagem contiacutenua derivados de rim de hamster
neonato Estas ceacutelulas foram utilizadas para os experimentos in vitro e para as titulaccedilotildees de
DENV 1 e 2 para isso foram mantidas em meio miacutenimo essencial modificado por Dulbecco
ndash DMEM (Cultilab) suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (SFB) com antibioacuteticos
(Penicilina 100 UmL Streptomicina 100 microgmL) e com antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL)
sendo mantidas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5
42 Viacuterus
421 DENV 1 e DENV 2
O Sorotipo 1 do Dengue virus (DENV-1) estirpe Mochizuki foi replicado em ceacutelulas
C636 para gerar estoques de trabalho durante 2 e 5 dias a 28degC O sobrenadante da cultura de
ceacutelulas infectadas foi recolhido e clarificado por centrifugaccedilatildeo a 4000 G durante 10 minutos agrave
4degC e entatildeo foi aliquotado e armazenado a -70 deg C como reserva de viacuterus ateacute agrave sua utilizaccedilatildeo
A replicaccedilatildeo geraccedilatildeo de estoque e titulaccedilatildeo do Sorotipo 2 do Dengue virus (DENV-2)
estirpe Nova Guineacute C ocorreu nos mesmos moldes do DENV-1
19
422 Titulaccedilatildeo viral
Os estoques virais foram diluiacutedos (10-1
a 10-7
) e inoculados em monocamadas de
ceacutelulas BHK-21 implantadas em placas de 6 poccedilos com confluecircncia de aproximadamente
60 (3x105 ceacutelulas por poccedilo) sendo um poccedilo natildeo infectado mantido para controle celular
Apoacutes uma hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus foram adicionados 3 mL de meio DMEM (Cultilab)
suplementado com 15 de SFB e contendo 15 de Carboximetilcelulose (CMC Synth) As
placas foram entatildeo incubadas a 37degC (CO2 a 5) por 96 horas As ceacutelulas foram entatildeo
fixadas com 2 mL de soluccedilatildeo de formol a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo
1 (pv) de cristal violeta em PBS para contagem das placas de lise O tiacutetulo viral foi
expresso atraveacutes do nuacutemero de unidades formadoras de placa por mL (UFPmL) segundo a
formula abaixo representada
Tiacutetulo viral (UFPmL) = N x FC x 10
N = nuacutemero de placas de lise contadas
FC = Fator de correccedilatildeo
= Inverso da diluiccedilatildeo na qual foram contadas as placas de lise
43 Compostos de naftoquinonas
Os compostos utilizados neste estudo foram fornecidos pelo Dr Geraldo Ceacutelio
Brandatildeo do laboratoacuterio de pesquisa da Escola de Farmaacutecia da Universidade Federal de Ouro
Preto
20
Tabela 1 Relaccedilatildeo de nome estrutura e coacutedigo dos compostos utilizados Na tabela estatildeo
presentes a relaccedilatildeo dos nomes dos compostos utilizados neste trabalho bem como sua
estrutura Os coacutedigos representantes de cada composto seratildeo utilizados no decorrer da escrita
Nome do composto Estrutura Coacutedigo
Lapachol
A1
β-lapachona
A2
2-Hidroxi-3-(ββ-dimetilvinil)-14-naftoquinona
A3
2-Cloro-14-naftoquinona
A4
Lapachol derivado 1
A5
Lapachol derivado 2 A6
Lapachol derivado 3 A7
Lapachol derivado 4 A8
44 Ensaio de citotoxicidade
Para avaliar a citotoxicidade dos compostos ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas foram incubadas com diferentes concentraccedilotildees dos compostos em triplicata num
volume de 200 microL de meio de cultura por poccedilo na presenccedila de 1 de SFB Os controles natildeo
tratados apresentaram adiccedilatildeo de 200 microL de meio de cultura As ceacutelulas foram entatildeo incubadas
durante 72 horas O meio foi removido e 28 microL de soluccedilatildeo de 5 mg mL MTT (brometo de 3-
21
[45-dimetil-tiazol-2-il]-25 difeniltertrazoacutelio) foi adicionado a cada poccedilo As placas foram re-
incubadas durante 1 hora e 30 minutos e entatildeo 122 microL de DMSO foi adicionado a cada poccedilo e
placas foram agitadas suavemente durante 15 minutos para dissolver os cristais de formazan
A absorbacircncia foi lida em um equipamento leitor de placas Victor X3 (PerkinElmer) a 490
nm A concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC 50) foi definida como a concentraccedilatildeo da amostra que
reduziu a viabilidade celular de 50 em comparaccedilatildeo com controles natildeo tratados Os dados
foram analisados utilizando o programa Prisma
45 Avaliaccedilatildeo da viabilidade e crescimento celular por exclusatildeo de azul de tripan
Ceacutelulas BHK-21 foram cultivadas em placas de 24 poccedilos (7x104 ceacutelulaspoccedilo) e apoacutes
24 horas foram tratadas com as concentraccedilotildees de uso de cada composto e incubadas por 72
horas na presenccedila de 1 de SFB A seguir as ceacutelulas foram tripsinizadas e incubadas com
azul de tripan e entatildeo foi utilizado um contador automatizado de ceacutelulas (Countess II FL
Automated Cell Counter ndash Thermo Fisher Scientific) para contagem das ceacutelulas e avaliaccedilatildeo da
porcentagem de viabilidade e diacircmetro celular do controle nos tempos de 0 24 e 96 horas e
avaliaccedilatildeo dos mesmos paracircmetros para os compostos no tempo de 96 horas (72 horas poacutes
tratamento)
Outra curva de multiplicaccedilatildeo celular foi feita para os compostos A1 A3 A4 e A5 onde as
ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos no momento da confecccedilatildeo da placa e
foram avaliados os mesmos paracircmetros nos tempos de 0 12 24 48 e 72 horas O
equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
46 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
Para determinar a menor Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) responsaacutevel pela letalidade
celular total 2x104 de ceacutelulas BHK-21 foram semeadas em placa de 96 poccedilos Apoacutes a
incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o
meio de cultura foi removido e as ceacutelulas foram expostas a diferentes diluiccedilotildees dos dois
sorotipos de DENV (100 microL de cada diluiccedilatildeo + 100 microL de meio DEMEM 1 SFB) As
diluiccedilotildees seriadas foram realizadas da suspensatildeo viral na razatildeo de 5 para o primeiro poccedilo e de
2 para os demais poccedilos Apoacutes 72 horas as ceacutelulas foram entatildeo fixadas com 200 microL de soluccedilatildeo
22
formalina a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo 1 (pv) de cristal violeta em
PBS para avaliaccedilatildeo da maior diluiccedilatildeo responsaacutevel pela letalidade de 100 das ceacutelulas
47 Ensaio Dose-resposta
Para cada composto foram realizados ensaios de dose-resposta para definiccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de cada composto capaz de promover a reduccedilatildeo na produccedilatildeo viral A atividade
antiviral foi avaliada tambeacutem pelo meacutetodo de MTT Ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas expostas a diferentes concentraccedilotildees dos extratos determinadas a partir das maiores
concentraccedilotildees em que natildeo foram observados efeitos citotoacutexicos As ceacutelulas foram tratadas
com as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de cada composto e em seguida infectadas com DENV
1 (MOI= 5) ou 2 (MOI= 2) Mantendo uma coluna para controle com DMSO uma coluna
para controle de viacuterus uma coluna para controle de citotoxicidade dos compostos e por fim
uma coluna para controle celular As ceacutelulas foram entatildeo incubadas durante 72 horas Apoacutes
este tempo procedeu-se a leitura pelo ensaio de MTT como descrito anteriormente Os dados
foram analisados levando-se em consideraccedilatildeo a leitura das absorbacircncias dos poccedilos dos
controles de viacuterus e do controle celular
Para realizacao destes experimentos os seguintes controles foram adotados
Controle de ceacutelulas poccedilos contendo somente ceacutelulas acrescidas do meio de cultura DMEM
1 SFB Utilizado para avaliar o comportamento das ceacutelulas sem que as mesmas tivessem
contato com qualquer interferente durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo Com isso os poccedilos
reservados para esse controle serviram de padratildeo para comparaccedilatildeo com aqueles em que fosse
observada atividade citotoacutexica ou citopaacutetica
Controle de viacuterus poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM 1 SFB
sem nenhum tratamento e de suspensatildeo de viacuterus Utilizando como referecircncia para anaacutelise da
atividade citopaacutetica provocada pelo viacuterus testado durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo das placas
23
Controle de viacuterus com DMSO Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura
DMEM 1 SFB e DMSO Foi utilizado para avaliar se havia influecircncia prejudicial do
solvente utilizado para diluiccedilatildeo das amostras no meio de cultivo das ceacutelulas e se o mesmo
poderia apresentar alguma potencial atividade antiviral aparente
Controle de citotoxicidade Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM
1 SFB e as quatro principais concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos Foi utilizado
para avaliar se haveria alguma possiacutevel atividade citotoacutexica das concentraccedilotildees dos compostos
em relaccedilatildeo agraves ceacutelulas
48 Ensaio Virucida
Para a realizaccedilatildeo deste ensaio aliacutequotas de 950 microL (diluiccedilatildeo de 20 vezes) do DENV 1 (tiacutetulo
6 x 107 UFPmL) foram incubadas com 50 microL de uma soluccedilatildeo de meio DMEM preparada
com 20x a concentraccedilatildeo natildeo citotoacutexica de cada composto A1 a A8 em banho-maria 37deg C
por 1 hora Apoacutes a incubaccedilatildeo as aliacutequotas foram imediatamente tituladas em ceacutelulas BHK-21
em placas de 6 poccedilos utilizando-se 3 diluiccedilotildees para cada incubaccedilatildeo (20x 20 x 10-1
e 20 x 10-
2) Foram titulados tambeacutem uma aliacutequota incubada apenas com meio DMEM sem nenhum
tratamento e outra aliacutequota incubada com DMSO (Dimetilsulfoacutexido) Estas foram tituladas
utilizando um controle e mais cinco diluiccedilotildees (20x 20 x 10-1
20 x 10-2
20 x 10-3
e 20 x 10-4
)
49 Ensaio antiviral
Neste ensaio ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em placas de 24 poccedilos no dia
seguinte foram tratadas durante 4 horas com as concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas de cada
composto em duplicata Apoacutes o preacute-tratamento as monocamadas foram infectadas com
DENV-1 a uma MOI=5 na presenccedila das concentraccedilotildees de uso respectivas de cada composto
Apoacutes 1 hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus as monocamadas foram lavadas duas vezes com PBS e
foi adicionado 500 microL por poccedilo de meio preparado com as mesmas concentraccedilotildees dos
diferentes compostos e mantidos durante 48 horas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5 Em
quatro poccedilos as ceacutelulas foram infectadas e natildeo tratadas e em outros quatro poccedilos as ceacutelulas
natildeo foram tratadas e nem infectadas (controle de ceacutelulas) destes uacuteltimos dois foram
tripsinizados e contados no momento da infecccedilatildeo e os outros dois apoacutes o teacutermino do ensaio
24
para avaliar o crescimento celular Decorridas as 48 horas o sobrenadante foi coletado e
centrifugado por 10 minutos a 4000 xG para separaccedilatildeo dos debris celulares e prontamente
titulado em placa de 6 poccedilos
410 Anaacutelise estatiacutestica
Os valores de CC50 foram obtidos a partir de anaacutelise de regressatildeo linear das curvas de
concentraccedilatildeocitotoxicidade A anaacutelise estatiacutestica dos dados foi realizada pelo programa
GraphPad Prism software Uma anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi utilizada para determinar
as diferenccedilas estatiacutesticas seguida do poacutes teste de Tukey A significacircncia estatiacutestica foi fixada
em p lt005
25
V RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
26
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Ensaio de citotoxicidade celular
Para avaliar a viabilidade da linhagem celular BHK-21 frente ao tratamento com oito
diferentes concentraccedilotildees dos compostos (A1 a A8) realizou-se um ensaio de MTT (brometo
de 3-[45-dimetil-tiazol-2-il]-25-difeniltetrazoacutelio) Este ensaio tem o objetivo de quantificar
espectrofotometricamente o crescimento celular a viabilidade e proliferaccedilatildeo podendo ser
utilizado como um indicador direto de citotoxicidade Trata-se de um ensaio colorimeacutetrico
para medir a atividade da redutase mitocondrial em ceacutelulas vivas Ele se baseia na reduccedilatildeo do
sal amarelo tetrazoacutelio (permeaacutevel agrave membrana celular) para cristais de formazan azuis
puacuterpura por ceacutelulas metabolicamente ativas a quantidade de formazan gerada medida por
espectrofotometria eacute proporcional ao nuacutemero de ceacutelulas viaacuteveis
A CC50 foi calculada plotando-se uma curva de porcentagem de viabilidade celular por
concentraccedilatildeo melhor representada na figura 7 pelo composto A7 e os resultados de CC50
para todos os compostos estatildeo representados na tabela 2 Foram feitos ensaios de
citotoxicidade com oito concentraccedilotildees diferentes sendo escolhida a maior concentraccedilatildeo que
natildeo apresentou citotoxicidade
Viabilidade Celular = [ ( A ndash B ) A ] x 100
Onde
A = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas natildeo tratadas
B = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas tratadas com
as respectivas concentraccedilotildees de cada composto
27
28
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (A curva dose resposta do composto A7 eacute a que
melhor representa a curva dose resposta esperada) Avaliou-se a viabilidade da linhagem
celular BHK-21 frente agrave diferentes concentraccedilotildees dos compostos realizando o ensaio de MTT
e determinando assim as concentraccedilotildees a serem utilizadas nos proacuteximos ensaios bem como
calculando a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) agrave partir da curva
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo
da concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50)
Composto Concentraccedilatildeo utilizada
[ ] microgmL
Concentraccedilatildeo citotoacutexica 50
(CC50) [ ] microgmL plusmn Desvio
Padratildeo
A1 ([ ]=1 mgmL) 00200 10010 plusmn 0014
A2 ([ ]=1 mgmL) 00025 09561 plusmn 0023
A3 ([ ]=1 mgmL) 00025 09988 plusmn 0017
A4 ([ ]=5 mgmL) 00125 10150 plusmn 0036
A5 ([ ]=10 mgmL) 00250 10590 plusmn 0047
A6 ([ ]=5 mgmL) 00250 08183 plusmn 0030
A7 ([ ]=5 mgmL) 00125 10280 plusmn 0052
A8 ([ ]=5 mgmL) 00125 09758 plusmn 0036
52 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan
Para corroborar o ensaio anterior de citotoxicidade utilizou -se o teste de viabilidade
celular pela teacutecnica da exclusatildeo do azul de tripan com a finalidade de determinar a
viabilidade das ceacutelulas Os procedimentos adotados no ensaio seguiram o manual do
equipamento contador automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL Automated Cell Counter) entatildeo
foi acrescentado agrave 10 microL da suspensatildeo celular 10 microL de azul de tripan (04) Apoacutes
homogeneizaccedilatildeo 10 microL da suspensatildeo foi colocada no local indicado da lacircmina proacutepria para
leitura e foi realizada a contagem sendo consideradas mortas (inviaacuteveis) as ceacutelulas que
incorporavam o corante e viaacuteveis as que excluiacuteam o azul de tripan
29
O equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
(A)
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan A avaliaccedilatildeo da
viabilidade celular foi realizada atraveacutes de um contador automaacutetico de ceacutelulas Este
equipamento possibilita explorar ferramentas de fotografia e avaliar alguns paracircmetros
importantes (A) fotografia das ceacutelulas (B) Zoom na fotografia das ceacutelulas com marcaccedilotildees
(em verde para ceacutelulas vivas e vermelho para mortas) e (D) contagem das ceacutelulas totais
ceacutelulas vivas e mortas graacutefico e meacutedia dos diacircmetros celulares das ceacutelulas vivas e mortas
(B)
(C)
30
O crescimento celular de ceacutelulas natildeo tratadas foi avaliado nos tempos de 0h (momento
da confecccedilatildeo da placa) 24h (momento de tratamento com os compostos) e 96 horas
(Momento em que todas as ceacutelulas foram tripsinizadas e contadas) para avaliar o perfil do
crescimento celular em ceacutelulas natildeo tratadas Foi observado um crescimento celular no periacuteodo
de 24 horas onde as ceacutelulas estavam incubadas com meio acrescido de 10 SFB Em 24
horas o meio foi trocado por 1 SFB e acrescido das substacircncias testes nas menores diluiccedilotildees
natildeo citotoacutexicas determinadas pelo ensaio do MTT Em 96 horas pode ser observado um
decaimento no nuacutemero de ceacutelulas vivas provavelmente devido ao crescimento celular (morte
por confluecircncia)
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas)
(A) (B)
31
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas (A)
Contagem de ceacutelulas vivas (B) Percentual de ceacutelulas viaacuteveis (Viabilidade celular ) e (C)
Meacutedia do diacircmetro apresentado pelas ceacutelulas vivas
Em 96 horas as ceacutelulas natildeo tratadas bem como as ceacutelulas tratadas por 72 horas com as
concentraccedilotildees de uso dos compostos foram tripsinizadas e avaliadas quanto ao nuacutemero de
ceacutelulas vivas viabilidade e diacircmetro celular apresentados na figura 10
Segundo se observa natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo aparente que possa demonstrar que
as concentraccedilotildees de uso dos compostos tenham causado alguma atividade citotoacutexica
corroborando assim os ensaios de citotoxicidade anteriores
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
A infectividade de um viacuterus depende de vaacuterios fatores entre eles da proporccedilatildeo de
partiacuteculas virais completas ou infecciosas da suscetibilidade da ceacutelula hospedeira e da
chance desta partiacutecula encontrar o receptor e penetrar na ceacutelula Quando ceacutelulas suscetiacuteveis
satildeo misturadas com uma suspensatildeo de viacuterus estas podem receber uma duas trecircs ou dez
partiacuteculas virais ou nenhuma Isto depende da proporccedilatildeo entre a quantidade de viacuterus
infecciosos presente no inoculo e a quantidade de ceacutelulas utilizada Esta relaccedilatildeo eacute denominada
de multiplicidade de infecccedilatildeo ou MOI Uma MOI=1 indica que a infecccedilatildeo foi feita em
principio com 1 viacuterus ou 1 dose infectante por ceacutelula
A determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo dos Dengue virus 1 e 2 a serem
utilizadas nos proacuteximos ensaios foi feita a partir da infecccedilatildeo de ceacutelulas BHK-21 por diferentes
(C)
32
concentraccedilotildees de viacuterus e revelaccedilatildeo com cristal violeta Escolheu-se a maior diluiccedilatildeo viral que
possibilitou a letalidade total das ceacutelulas (faixa onde todas as ceacutelulas estatildeo mortas utilizando
menor concentraccedilatildeo de viacuterus) As faixas escolhidas foram entatildeo calculadas levando-se em
consideraccedilatildeo o nuacutemero de ceacutelulas presentes no poccedilo e o nuacutemero de partiacuteculas virais que foram
adicionadas (Faixa3 para DENV2 e 2 para DENV1) Figura 11 Foi estipulado portanto a
Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 2 para DENV 2 e 5 para DENV 1
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI A partir da infecccedilatildeo da linhagem celular BHK-21 em
placa de 96 poccedilos com diferentes diluiccedilotildees de DENV foi determinado que a Multiplicidade
de infecccedilatildeo para o Dengue viacuterus sorotipos 1 e 2 seria de 5 e 2 respectivamente (colunas 2 -
DENV1 e 3 - DENV2)
54 Ensaio dose resposta
Apoacutes a determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas ideais realizou-se um
ensaio dose resposta tratando as ceacutelulas com oito concentraccedilotildees agrave partir das concentraccedilotildees natildeo
citotoacutexicas escolhidas para cada composto e em seguida infectando com DENV sorotipos 1 e
2 nas MOIs estipuladas anteriormente (5 e 2 respectivamente) A porcentagem do efeito
protetor conferida agraves ceacutelulas para cada concentraccedilatildeo de amostra testada foi calculada da
seguinte forma
33
EP = [ (A ndash B) (C ndash B) ] x 100
Onde
A Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas tratadas e infectadas
B Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e infectadas
C Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e natildeo infectadas
Este ensaio tem por objetivo identificar a resposta celular agrave infecccedilatildeo frente ao
tratamento com os compostos em diferentes concentraccedilotildees Assim como o ensaio de
toxicidade este ensaio feito utilizando a teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT permite o teste de vaacuterias
concentraccedilotildees diferentes em um menor tempo e com baixo gasto de material
34
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV1
(MOI=5)
35
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV2
(MOI=2)
36
Takegami et al (1998) demonstraram atividade de furanonaftoquinonas contra o viacuterus
da Encefalite Japonesa (Flavivirus) utilizando a concentraccedilatildeo de 3microgmL poreacutem para os
compostos apresentados avaliados pela teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT nenhuma das
concentraccedilotildees apresentadas produziu efeito antiviral significativo em relaccedilatildeo ao controle
celular como observado nas figuras 12 e 13
Apesar da teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT ser interessante como triagem de atividade
antiviral permitindo o teste de vaacuterias concentraccedilotildees dos compostos em menor tempo e
utilizando uma quantidade razoaacutevel de materiais optou-se por utilizar as maiores
concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas encontradas avaliando sua atividade antiviral por outras
teacutecnicas Como natildeo foi avaliada atividade antiviral preacutevia para nenhum dos compostos frente
agrave infecccedilatildeo por DENV1 e 2 foi selecionado o Dengue virus 1 para dar prosseguimento aos
ensaios
55 Ensaio Virucida
O ensaio virucida foi realizado para avaliar um potencial efeito dos compostos
diretamente sobre a partiacutecula viral Este ensaio eacute importante pois possibilita elucidar se o
composto pode produzir algum efeito sobre a partiacutecula viral impedindo que esta possa infectar
as ceacutelulas
Figura 14 Ensaio virucida Neste ensaio as aliacutequotas de DENV1 foram incubadas com as
concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos e titulados (NT) Controle natildeo tratado
37
Tabela 3 Ensaio virucida Caacutelculo do tiacutetulo viral (UFPmL) e porcentagem representante de
cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 254 x 105 100
DMSO 263 x 105 10335
A1 199 x 105 7835
A2 205 x 105 8071
A3 237 x 105 9311
A4 775 x 104 3049
A5 153 x 105 6024
A6 219 x 105 8602
A7 243 x 105 9547
A8 254 x 105 100
Lagrota et al (1988) demonstraram atividade de 2-HO-3-N-benzil-N(N-benzil-2-
etilamina) -14-naftoquinona sobre a partiacutecula viral de enterovirus De forma contraacuteria apesar
de se verificar a reduccedilatildeo de quase uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais
para o composto A4 natildeo considerou-se esta uma alteraccedilatildeo significativa pois devido agrave
magnitude do nuacutemero de UFPs se trata de uma alteraccedilatildeo muito pequena Portanto os
compostos avaliados neste trabalho natildeo produziram atividade virucida aparente frente ao
tratamento com as concentraccedilotildees de uso
56 Ensaio Antiviral
O sobrenadante de ceacutelulas tratadas previamente e infectadas por DENV1 coletado 48
horas poacutes infecccedilatildeo foi avaliado quanto agrave produccedilatildeo viral de partiacuteculas infecciosas pela
contagem de placas de lise e caacutelculo de Unidades Formadoras de Placa (Titulaccedilatildeo viral em
placa ndash UFPmL)
38
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral Sobrenadante de ceacutelulas tratadas e infectadas por DENV1
coletado apoacutes 48 horas e titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado
Tabela 4 Ensaio Antiviral Coleta do sobrenadante de ceacutelulas infectadas por DENV1 Tiacutetulo
viral (UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o
controle natildeo tratado como 100
Ao perceber um aumento no tiacutetulo viral frente ao tratamento com os compostos A1
A2 e A3 e uma reduccedilatildeo frente ao tratamento com A4 A5 e A6 foram escolhidos dois
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 119 x 105 10000
A1 235 x 105 19748
A2 228 x 105 19160
A3 318 x 105 26723
A4 128 x 104 1076
A5 186 x 103 156
A6 190 x 104 1597
A7 280 x 104 2353
A8 350 x 104 2941
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
40
Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
16
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar oito compostos (2 naturais e 6 sinteacuteticos) derivados de naftoquinonas como potenciais
agentes antivirais em ceacutelulas BHK-21 frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1 e 2
32 Objetivos especiacuteficos
1 Calcular o iacutendice de citotoxicidade e a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) dos compostos
atraveacutes de ensaio de reduccedilatildeo de MTT
2 Avaliar os efeitos dos compostos sobre o crescimento a viabilidade e o volume celular
pela teacutecnica de exclusatildeo do azul de tripan
3 Determinar a multiplicidade de infecccedilatildeo de DENV 1 e 2 a ser utilizada nos ensaios
antivirais
4 Avaliar a atividade antiviral dos compostos frente agrave infecccedilatildeo por Dengue virus sorotipos 1
e 2 atraveacutes do ensaio de MTT
5 Verificar um possiacutevel efeito direto dos compostos agraves partiacuteculas virais de Dengue virus
6 Quantificar a produccedilatildeo de partiacuteculas virais infecciosas no sobrenadante de ceacutelulas
infectadas atraveacutes de titulaccedilatildeo viral pela contagem de unidades formadoras de placas
17
IV MATERIAL E MEacuteTODOS
18
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Linhagens celulares
411 Ceacutelulas C636
As ceacutelulas C636 satildeo ceacutelulas de linhagem contiacutenua de larvas de mosquito Aedes
albopictus Estas ceacutelulas foram utilizadas na produccedilatildeo de estoque viral de DENV sorotipos 1
e 2 para isso foram mantidas em meio de cultura Leibovitz-15 (L-15) (Cultilab)
suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (Cultilab) antibioacuteticos (Penicilina 100 UmL
Streptomicina 100 microgmL) e antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL) a 28degC
412 Ceacutelulas BHK-21
As ceacutelulas BHK-21 satildeo fibroblastos de linhagem contiacutenua derivados de rim de hamster
neonato Estas ceacutelulas foram utilizadas para os experimentos in vitro e para as titulaccedilotildees de
DENV 1 e 2 para isso foram mantidas em meio miacutenimo essencial modificado por Dulbecco
ndash DMEM (Cultilab) suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (SFB) com antibioacuteticos
(Penicilina 100 UmL Streptomicina 100 microgmL) e com antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL)
sendo mantidas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5
42 Viacuterus
421 DENV 1 e DENV 2
O Sorotipo 1 do Dengue virus (DENV-1) estirpe Mochizuki foi replicado em ceacutelulas
C636 para gerar estoques de trabalho durante 2 e 5 dias a 28degC O sobrenadante da cultura de
ceacutelulas infectadas foi recolhido e clarificado por centrifugaccedilatildeo a 4000 G durante 10 minutos agrave
4degC e entatildeo foi aliquotado e armazenado a -70 deg C como reserva de viacuterus ateacute agrave sua utilizaccedilatildeo
A replicaccedilatildeo geraccedilatildeo de estoque e titulaccedilatildeo do Sorotipo 2 do Dengue virus (DENV-2)
estirpe Nova Guineacute C ocorreu nos mesmos moldes do DENV-1
19
422 Titulaccedilatildeo viral
Os estoques virais foram diluiacutedos (10-1
a 10-7
) e inoculados em monocamadas de
ceacutelulas BHK-21 implantadas em placas de 6 poccedilos com confluecircncia de aproximadamente
60 (3x105 ceacutelulas por poccedilo) sendo um poccedilo natildeo infectado mantido para controle celular
Apoacutes uma hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus foram adicionados 3 mL de meio DMEM (Cultilab)
suplementado com 15 de SFB e contendo 15 de Carboximetilcelulose (CMC Synth) As
placas foram entatildeo incubadas a 37degC (CO2 a 5) por 96 horas As ceacutelulas foram entatildeo
fixadas com 2 mL de soluccedilatildeo de formol a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo
1 (pv) de cristal violeta em PBS para contagem das placas de lise O tiacutetulo viral foi
expresso atraveacutes do nuacutemero de unidades formadoras de placa por mL (UFPmL) segundo a
formula abaixo representada
Tiacutetulo viral (UFPmL) = N x FC x 10
N = nuacutemero de placas de lise contadas
FC = Fator de correccedilatildeo
= Inverso da diluiccedilatildeo na qual foram contadas as placas de lise
43 Compostos de naftoquinonas
Os compostos utilizados neste estudo foram fornecidos pelo Dr Geraldo Ceacutelio
Brandatildeo do laboratoacuterio de pesquisa da Escola de Farmaacutecia da Universidade Federal de Ouro
Preto
20
Tabela 1 Relaccedilatildeo de nome estrutura e coacutedigo dos compostos utilizados Na tabela estatildeo
presentes a relaccedilatildeo dos nomes dos compostos utilizados neste trabalho bem como sua
estrutura Os coacutedigos representantes de cada composto seratildeo utilizados no decorrer da escrita
Nome do composto Estrutura Coacutedigo
Lapachol
A1
β-lapachona
A2
2-Hidroxi-3-(ββ-dimetilvinil)-14-naftoquinona
A3
2-Cloro-14-naftoquinona
A4
Lapachol derivado 1
A5
Lapachol derivado 2 A6
Lapachol derivado 3 A7
Lapachol derivado 4 A8
44 Ensaio de citotoxicidade
Para avaliar a citotoxicidade dos compostos ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas foram incubadas com diferentes concentraccedilotildees dos compostos em triplicata num
volume de 200 microL de meio de cultura por poccedilo na presenccedila de 1 de SFB Os controles natildeo
tratados apresentaram adiccedilatildeo de 200 microL de meio de cultura As ceacutelulas foram entatildeo incubadas
durante 72 horas O meio foi removido e 28 microL de soluccedilatildeo de 5 mg mL MTT (brometo de 3-
21
[45-dimetil-tiazol-2-il]-25 difeniltertrazoacutelio) foi adicionado a cada poccedilo As placas foram re-
incubadas durante 1 hora e 30 minutos e entatildeo 122 microL de DMSO foi adicionado a cada poccedilo e
placas foram agitadas suavemente durante 15 minutos para dissolver os cristais de formazan
A absorbacircncia foi lida em um equipamento leitor de placas Victor X3 (PerkinElmer) a 490
nm A concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC 50) foi definida como a concentraccedilatildeo da amostra que
reduziu a viabilidade celular de 50 em comparaccedilatildeo com controles natildeo tratados Os dados
foram analisados utilizando o programa Prisma
45 Avaliaccedilatildeo da viabilidade e crescimento celular por exclusatildeo de azul de tripan
Ceacutelulas BHK-21 foram cultivadas em placas de 24 poccedilos (7x104 ceacutelulaspoccedilo) e apoacutes
24 horas foram tratadas com as concentraccedilotildees de uso de cada composto e incubadas por 72
horas na presenccedila de 1 de SFB A seguir as ceacutelulas foram tripsinizadas e incubadas com
azul de tripan e entatildeo foi utilizado um contador automatizado de ceacutelulas (Countess II FL
Automated Cell Counter ndash Thermo Fisher Scientific) para contagem das ceacutelulas e avaliaccedilatildeo da
porcentagem de viabilidade e diacircmetro celular do controle nos tempos de 0 24 e 96 horas e
avaliaccedilatildeo dos mesmos paracircmetros para os compostos no tempo de 96 horas (72 horas poacutes
tratamento)
Outra curva de multiplicaccedilatildeo celular foi feita para os compostos A1 A3 A4 e A5 onde as
ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos no momento da confecccedilatildeo da placa e
foram avaliados os mesmos paracircmetros nos tempos de 0 12 24 48 e 72 horas O
equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
46 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
Para determinar a menor Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) responsaacutevel pela letalidade
celular total 2x104 de ceacutelulas BHK-21 foram semeadas em placa de 96 poccedilos Apoacutes a
incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o
meio de cultura foi removido e as ceacutelulas foram expostas a diferentes diluiccedilotildees dos dois
sorotipos de DENV (100 microL de cada diluiccedilatildeo + 100 microL de meio DEMEM 1 SFB) As
diluiccedilotildees seriadas foram realizadas da suspensatildeo viral na razatildeo de 5 para o primeiro poccedilo e de
2 para os demais poccedilos Apoacutes 72 horas as ceacutelulas foram entatildeo fixadas com 200 microL de soluccedilatildeo
22
formalina a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo 1 (pv) de cristal violeta em
PBS para avaliaccedilatildeo da maior diluiccedilatildeo responsaacutevel pela letalidade de 100 das ceacutelulas
47 Ensaio Dose-resposta
Para cada composto foram realizados ensaios de dose-resposta para definiccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de cada composto capaz de promover a reduccedilatildeo na produccedilatildeo viral A atividade
antiviral foi avaliada tambeacutem pelo meacutetodo de MTT Ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas expostas a diferentes concentraccedilotildees dos extratos determinadas a partir das maiores
concentraccedilotildees em que natildeo foram observados efeitos citotoacutexicos As ceacutelulas foram tratadas
com as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de cada composto e em seguida infectadas com DENV
1 (MOI= 5) ou 2 (MOI= 2) Mantendo uma coluna para controle com DMSO uma coluna
para controle de viacuterus uma coluna para controle de citotoxicidade dos compostos e por fim
uma coluna para controle celular As ceacutelulas foram entatildeo incubadas durante 72 horas Apoacutes
este tempo procedeu-se a leitura pelo ensaio de MTT como descrito anteriormente Os dados
foram analisados levando-se em consideraccedilatildeo a leitura das absorbacircncias dos poccedilos dos
controles de viacuterus e do controle celular
Para realizacao destes experimentos os seguintes controles foram adotados
Controle de ceacutelulas poccedilos contendo somente ceacutelulas acrescidas do meio de cultura DMEM
1 SFB Utilizado para avaliar o comportamento das ceacutelulas sem que as mesmas tivessem
contato com qualquer interferente durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo Com isso os poccedilos
reservados para esse controle serviram de padratildeo para comparaccedilatildeo com aqueles em que fosse
observada atividade citotoacutexica ou citopaacutetica
Controle de viacuterus poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM 1 SFB
sem nenhum tratamento e de suspensatildeo de viacuterus Utilizando como referecircncia para anaacutelise da
atividade citopaacutetica provocada pelo viacuterus testado durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo das placas
23
Controle de viacuterus com DMSO Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura
DMEM 1 SFB e DMSO Foi utilizado para avaliar se havia influecircncia prejudicial do
solvente utilizado para diluiccedilatildeo das amostras no meio de cultivo das ceacutelulas e se o mesmo
poderia apresentar alguma potencial atividade antiviral aparente
Controle de citotoxicidade Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM
1 SFB e as quatro principais concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos Foi utilizado
para avaliar se haveria alguma possiacutevel atividade citotoacutexica das concentraccedilotildees dos compostos
em relaccedilatildeo agraves ceacutelulas
48 Ensaio Virucida
Para a realizaccedilatildeo deste ensaio aliacutequotas de 950 microL (diluiccedilatildeo de 20 vezes) do DENV 1 (tiacutetulo
6 x 107 UFPmL) foram incubadas com 50 microL de uma soluccedilatildeo de meio DMEM preparada
com 20x a concentraccedilatildeo natildeo citotoacutexica de cada composto A1 a A8 em banho-maria 37deg C
por 1 hora Apoacutes a incubaccedilatildeo as aliacutequotas foram imediatamente tituladas em ceacutelulas BHK-21
em placas de 6 poccedilos utilizando-se 3 diluiccedilotildees para cada incubaccedilatildeo (20x 20 x 10-1
e 20 x 10-
2) Foram titulados tambeacutem uma aliacutequota incubada apenas com meio DMEM sem nenhum
tratamento e outra aliacutequota incubada com DMSO (Dimetilsulfoacutexido) Estas foram tituladas
utilizando um controle e mais cinco diluiccedilotildees (20x 20 x 10-1
20 x 10-2
20 x 10-3
e 20 x 10-4
)
49 Ensaio antiviral
Neste ensaio ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em placas de 24 poccedilos no dia
seguinte foram tratadas durante 4 horas com as concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas de cada
composto em duplicata Apoacutes o preacute-tratamento as monocamadas foram infectadas com
DENV-1 a uma MOI=5 na presenccedila das concentraccedilotildees de uso respectivas de cada composto
Apoacutes 1 hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus as monocamadas foram lavadas duas vezes com PBS e
foi adicionado 500 microL por poccedilo de meio preparado com as mesmas concentraccedilotildees dos
diferentes compostos e mantidos durante 48 horas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5 Em
quatro poccedilos as ceacutelulas foram infectadas e natildeo tratadas e em outros quatro poccedilos as ceacutelulas
natildeo foram tratadas e nem infectadas (controle de ceacutelulas) destes uacuteltimos dois foram
tripsinizados e contados no momento da infecccedilatildeo e os outros dois apoacutes o teacutermino do ensaio
24
para avaliar o crescimento celular Decorridas as 48 horas o sobrenadante foi coletado e
centrifugado por 10 minutos a 4000 xG para separaccedilatildeo dos debris celulares e prontamente
titulado em placa de 6 poccedilos
410 Anaacutelise estatiacutestica
Os valores de CC50 foram obtidos a partir de anaacutelise de regressatildeo linear das curvas de
concentraccedilatildeocitotoxicidade A anaacutelise estatiacutestica dos dados foi realizada pelo programa
GraphPad Prism software Uma anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi utilizada para determinar
as diferenccedilas estatiacutesticas seguida do poacutes teste de Tukey A significacircncia estatiacutestica foi fixada
em p lt005
25
V RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
26
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Ensaio de citotoxicidade celular
Para avaliar a viabilidade da linhagem celular BHK-21 frente ao tratamento com oito
diferentes concentraccedilotildees dos compostos (A1 a A8) realizou-se um ensaio de MTT (brometo
de 3-[45-dimetil-tiazol-2-il]-25-difeniltetrazoacutelio) Este ensaio tem o objetivo de quantificar
espectrofotometricamente o crescimento celular a viabilidade e proliferaccedilatildeo podendo ser
utilizado como um indicador direto de citotoxicidade Trata-se de um ensaio colorimeacutetrico
para medir a atividade da redutase mitocondrial em ceacutelulas vivas Ele se baseia na reduccedilatildeo do
sal amarelo tetrazoacutelio (permeaacutevel agrave membrana celular) para cristais de formazan azuis
puacuterpura por ceacutelulas metabolicamente ativas a quantidade de formazan gerada medida por
espectrofotometria eacute proporcional ao nuacutemero de ceacutelulas viaacuteveis
A CC50 foi calculada plotando-se uma curva de porcentagem de viabilidade celular por
concentraccedilatildeo melhor representada na figura 7 pelo composto A7 e os resultados de CC50
para todos os compostos estatildeo representados na tabela 2 Foram feitos ensaios de
citotoxicidade com oito concentraccedilotildees diferentes sendo escolhida a maior concentraccedilatildeo que
natildeo apresentou citotoxicidade
Viabilidade Celular = [ ( A ndash B ) A ] x 100
Onde
A = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas natildeo tratadas
B = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas tratadas com
as respectivas concentraccedilotildees de cada composto
27
28
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (A curva dose resposta do composto A7 eacute a que
melhor representa a curva dose resposta esperada) Avaliou-se a viabilidade da linhagem
celular BHK-21 frente agrave diferentes concentraccedilotildees dos compostos realizando o ensaio de MTT
e determinando assim as concentraccedilotildees a serem utilizadas nos proacuteximos ensaios bem como
calculando a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) agrave partir da curva
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo
da concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50)
Composto Concentraccedilatildeo utilizada
[ ] microgmL
Concentraccedilatildeo citotoacutexica 50
(CC50) [ ] microgmL plusmn Desvio
Padratildeo
A1 ([ ]=1 mgmL) 00200 10010 plusmn 0014
A2 ([ ]=1 mgmL) 00025 09561 plusmn 0023
A3 ([ ]=1 mgmL) 00025 09988 plusmn 0017
A4 ([ ]=5 mgmL) 00125 10150 plusmn 0036
A5 ([ ]=10 mgmL) 00250 10590 plusmn 0047
A6 ([ ]=5 mgmL) 00250 08183 plusmn 0030
A7 ([ ]=5 mgmL) 00125 10280 plusmn 0052
A8 ([ ]=5 mgmL) 00125 09758 plusmn 0036
52 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan
Para corroborar o ensaio anterior de citotoxicidade utilizou -se o teste de viabilidade
celular pela teacutecnica da exclusatildeo do azul de tripan com a finalidade de determinar a
viabilidade das ceacutelulas Os procedimentos adotados no ensaio seguiram o manual do
equipamento contador automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL Automated Cell Counter) entatildeo
foi acrescentado agrave 10 microL da suspensatildeo celular 10 microL de azul de tripan (04) Apoacutes
homogeneizaccedilatildeo 10 microL da suspensatildeo foi colocada no local indicado da lacircmina proacutepria para
leitura e foi realizada a contagem sendo consideradas mortas (inviaacuteveis) as ceacutelulas que
incorporavam o corante e viaacuteveis as que excluiacuteam o azul de tripan
29
O equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
(A)
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan A avaliaccedilatildeo da
viabilidade celular foi realizada atraveacutes de um contador automaacutetico de ceacutelulas Este
equipamento possibilita explorar ferramentas de fotografia e avaliar alguns paracircmetros
importantes (A) fotografia das ceacutelulas (B) Zoom na fotografia das ceacutelulas com marcaccedilotildees
(em verde para ceacutelulas vivas e vermelho para mortas) e (D) contagem das ceacutelulas totais
ceacutelulas vivas e mortas graacutefico e meacutedia dos diacircmetros celulares das ceacutelulas vivas e mortas
(B)
(C)
30
O crescimento celular de ceacutelulas natildeo tratadas foi avaliado nos tempos de 0h (momento
da confecccedilatildeo da placa) 24h (momento de tratamento com os compostos) e 96 horas
(Momento em que todas as ceacutelulas foram tripsinizadas e contadas) para avaliar o perfil do
crescimento celular em ceacutelulas natildeo tratadas Foi observado um crescimento celular no periacuteodo
de 24 horas onde as ceacutelulas estavam incubadas com meio acrescido de 10 SFB Em 24
horas o meio foi trocado por 1 SFB e acrescido das substacircncias testes nas menores diluiccedilotildees
natildeo citotoacutexicas determinadas pelo ensaio do MTT Em 96 horas pode ser observado um
decaimento no nuacutemero de ceacutelulas vivas provavelmente devido ao crescimento celular (morte
por confluecircncia)
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas)
(A) (B)
31
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas (A)
Contagem de ceacutelulas vivas (B) Percentual de ceacutelulas viaacuteveis (Viabilidade celular ) e (C)
Meacutedia do diacircmetro apresentado pelas ceacutelulas vivas
Em 96 horas as ceacutelulas natildeo tratadas bem como as ceacutelulas tratadas por 72 horas com as
concentraccedilotildees de uso dos compostos foram tripsinizadas e avaliadas quanto ao nuacutemero de
ceacutelulas vivas viabilidade e diacircmetro celular apresentados na figura 10
Segundo se observa natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo aparente que possa demonstrar que
as concentraccedilotildees de uso dos compostos tenham causado alguma atividade citotoacutexica
corroborando assim os ensaios de citotoxicidade anteriores
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
A infectividade de um viacuterus depende de vaacuterios fatores entre eles da proporccedilatildeo de
partiacuteculas virais completas ou infecciosas da suscetibilidade da ceacutelula hospedeira e da
chance desta partiacutecula encontrar o receptor e penetrar na ceacutelula Quando ceacutelulas suscetiacuteveis
satildeo misturadas com uma suspensatildeo de viacuterus estas podem receber uma duas trecircs ou dez
partiacuteculas virais ou nenhuma Isto depende da proporccedilatildeo entre a quantidade de viacuterus
infecciosos presente no inoculo e a quantidade de ceacutelulas utilizada Esta relaccedilatildeo eacute denominada
de multiplicidade de infecccedilatildeo ou MOI Uma MOI=1 indica que a infecccedilatildeo foi feita em
principio com 1 viacuterus ou 1 dose infectante por ceacutelula
A determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo dos Dengue virus 1 e 2 a serem
utilizadas nos proacuteximos ensaios foi feita a partir da infecccedilatildeo de ceacutelulas BHK-21 por diferentes
(C)
32
concentraccedilotildees de viacuterus e revelaccedilatildeo com cristal violeta Escolheu-se a maior diluiccedilatildeo viral que
possibilitou a letalidade total das ceacutelulas (faixa onde todas as ceacutelulas estatildeo mortas utilizando
menor concentraccedilatildeo de viacuterus) As faixas escolhidas foram entatildeo calculadas levando-se em
consideraccedilatildeo o nuacutemero de ceacutelulas presentes no poccedilo e o nuacutemero de partiacuteculas virais que foram
adicionadas (Faixa3 para DENV2 e 2 para DENV1) Figura 11 Foi estipulado portanto a
Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 2 para DENV 2 e 5 para DENV 1
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI A partir da infecccedilatildeo da linhagem celular BHK-21 em
placa de 96 poccedilos com diferentes diluiccedilotildees de DENV foi determinado que a Multiplicidade
de infecccedilatildeo para o Dengue viacuterus sorotipos 1 e 2 seria de 5 e 2 respectivamente (colunas 2 -
DENV1 e 3 - DENV2)
54 Ensaio dose resposta
Apoacutes a determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas ideais realizou-se um
ensaio dose resposta tratando as ceacutelulas com oito concentraccedilotildees agrave partir das concentraccedilotildees natildeo
citotoacutexicas escolhidas para cada composto e em seguida infectando com DENV sorotipos 1 e
2 nas MOIs estipuladas anteriormente (5 e 2 respectivamente) A porcentagem do efeito
protetor conferida agraves ceacutelulas para cada concentraccedilatildeo de amostra testada foi calculada da
seguinte forma
33
EP = [ (A ndash B) (C ndash B) ] x 100
Onde
A Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas tratadas e infectadas
B Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e infectadas
C Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e natildeo infectadas
Este ensaio tem por objetivo identificar a resposta celular agrave infecccedilatildeo frente ao
tratamento com os compostos em diferentes concentraccedilotildees Assim como o ensaio de
toxicidade este ensaio feito utilizando a teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT permite o teste de vaacuterias
concentraccedilotildees diferentes em um menor tempo e com baixo gasto de material
34
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV1
(MOI=5)
35
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV2
(MOI=2)
36
Takegami et al (1998) demonstraram atividade de furanonaftoquinonas contra o viacuterus
da Encefalite Japonesa (Flavivirus) utilizando a concentraccedilatildeo de 3microgmL poreacutem para os
compostos apresentados avaliados pela teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT nenhuma das
concentraccedilotildees apresentadas produziu efeito antiviral significativo em relaccedilatildeo ao controle
celular como observado nas figuras 12 e 13
Apesar da teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT ser interessante como triagem de atividade
antiviral permitindo o teste de vaacuterias concentraccedilotildees dos compostos em menor tempo e
utilizando uma quantidade razoaacutevel de materiais optou-se por utilizar as maiores
concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas encontradas avaliando sua atividade antiviral por outras
teacutecnicas Como natildeo foi avaliada atividade antiviral preacutevia para nenhum dos compostos frente
agrave infecccedilatildeo por DENV1 e 2 foi selecionado o Dengue virus 1 para dar prosseguimento aos
ensaios
55 Ensaio Virucida
O ensaio virucida foi realizado para avaliar um potencial efeito dos compostos
diretamente sobre a partiacutecula viral Este ensaio eacute importante pois possibilita elucidar se o
composto pode produzir algum efeito sobre a partiacutecula viral impedindo que esta possa infectar
as ceacutelulas
Figura 14 Ensaio virucida Neste ensaio as aliacutequotas de DENV1 foram incubadas com as
concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos e titulados (NT) Controle natildeo tratado
37
Tabela 3 Ensaio virucida Caacutelculo do tiacutetulo viral (UFPmL) e porcentagem representante de
cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 254 x 105 100
DMSO 263 x 105 10335
A1 199 x 105 7835
A2 205 x 105 8071
A3 237 x 105 9311
A4 775 x 104 3049
A5 153 x 105 6024
A6 219 x 105 8602
A7 243 x 105 9547
A8 254 x 105 100
Lagrota et al (1988) demonstraram atividade de 2-HO-3-N-benzil-N(N-benzil-2-
etilamina) -14-naftoquinona sobre a partiacutecula viral de enterovirus De forma contraacuteria apesar
de se verificar a reduccedilatildeo de quase uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais
para o composto A4 natildeo considerou-se esta uma alteraccedilatildeo significativa pois devido agrave
magnitude do nuacutemero de UFPs se trata de uma alteraccedilatildeo muito pequena Portanto os
compostos avaliados neste trabalho natildeo produziram atividade virucida aparente frente ao
tratamento com as concentraccedilotildees de uso
56 Ensaio Antiviral
O sobrenadante de ceacutelulas tratadas previamente e infectadas por DENV1 coletado 48
horas poacutes infecccedilatildeo foi avaliado quanto agrave produccedilatildeo viral de partiacuteculas infecciosas pela
contagem de placas de lise e caacutelculo de Unidades Formadoras de Placa (Titulaccedilatildeo viral em
placa ndash UFPmL)
38
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral Sobrenadante de ceacutelulas tratadas e infectadas por DENV1
coletado apoacutes 48 horas e titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado
Tabela 4 Ensaio Antiviral Coleta do sobrenadante de ceacutelulas infectadas por DENV1 Tiacutetulo
viral (UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o
controle natildeo tratado como 100
Ao perceber um aumento no tiacutetulo viral frente ao tratamento com os compostos A1
A2 e A3 e uma reduccedilatildeo frente ao tratamento com A4 A5 e A6 foram escolhidos dois
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 119 x 105 10000
A1 235 x 105 19748
A2 228 x 105 19160
A3 318 x 105 26723
A4 128 x 104 1076
A5 186 x 103 156
A6 190 x 104 1597
A7 280 x 104 2353
A8 350 x 104 2941
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
40
Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
17
IV MATERIAL E MEacuteTODOS
18
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Linhagens celulares
411 Ceacutelulas C636
As ceacutelulas C636 satildeo ceacutelulas de linhagem contiacutenua de larvas de mosquito Aedes
albopictus Estas ceacutelulas foram utilizadas na produccedilatildeo de estoque viral de DENV sorotipos 1
e 2 para isso foram mantidas em meio de cultura Leibovitz-15 (L-15) (Cultilab)
suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (Cultilab) antibioacuteticos (Penicilina 100 UmL
Streptomicina 100 microgmL) e antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL) a 28degC
412 Ceacutelulas BHK-21
As ceacutelulas BHK-21 satildeo fibroblastos de linhagem contiacutenua derivados de rim de hamster
neonato Estas ceacutelulas foram utilizadas para os experimentos in vitro e para as titulaccedilotildees de
DENV 1 e 2 para isso foram mantidas em meio miacutenimo essencial modificado por Dulbecco
ndash DMEM (Cultilab) suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (SFB) com antibioacuteticos
(Penicilina 100 UmL Streptomicina 100 microgmL) e com antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL)
sendo mantidas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5
42 Viacuterus
421 DENV 1 e DENV 2
O Sorotipo 1 do Dengue virus (DENV-1) estirpe Mochizuki foi replicado em ceacutelulas
C636 para gerar estoques de trabalho durante 2 e 5 dias a 28degC O sobrenadante da cultura de
ceacutelulas infectadas foi recolhido e clarificado por centrifugaccedilatildeo a 4000 G durante 10 minutos agrave
4degC e entatildeo foi aliquotado e armazenado a -70 deg C como reserva de viacuterus ateacute agrave sua utilizaccedilatildeo
A replicaccedilatildeo geraccedilatildeo de estoque e titulaccedilatildeo do Sorotipo 2 do Dengue virus (DENV-2)
estirpe Nova Guineacute C ocorreu nos mesmos moldes do DENV-1
19
422 Titulaccedilatildeo viral
Os estoques virais foram diluiacutedos (10-1
a 10-7
) e inoculados em monocamadas de
ceacutelulas BHK-21 implantadas em placas de 6 poccedilos com confluecircncia de aproximadamente
60 (3x105 ceacutelulas por poccedilo) sendo um poccedilo natildeo infectado mantido para controle celular
Apoacutes uma hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus foram adicionados 3 mL de meio DMEM (Cultilab)
suplementado com 15 de SFB e contendo 15 de Carboximetilcelulose (CMC Synth) As
placas foram entatildeo incubadas a 37degC (CO2 a 5) por 96 horas As ceacutelulas foram entatildeo
fixadas com 2 mL de soluccedilatildeo de formol a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo
1 (pv) de cristal violeta em PBS para contagem das placas de lise O tiacutetulo viral foi
expresso atraveacutes do nuacutemero de unidades formadoras de placa por mL (UFPmL) segundo a
formula abaixo representada
Tiacutetulo viral (UFPmL) = N x FC x 10
N = nuacutemero de placas de lise contadas
FC = Fator de correccedilatildeo
= Inverso da diluiccedilatildeo na qual foram contadas as placas de lise
43 Compostos de naftoquinonas
Os compostos utilizados neste estudo foram fornecidos pelo Dr Geraldo Ceacutelio
Brandatildeo do laboratoacuterio de pesquisa da Escola de Farmaacutecia da Universidade Federal de Ouro
Preto
20
Tabela 1 Relaccedilatildeo de nome estrutura e coacutedigo dos compostos utilizados Na tabela estatildeo
presentes a relaccedilatildeo dos nomes dos compostos utilizados neste trabalho bem como sua
estrutura Os coacutedigos representantes de cada composto seratildeo utilizados no decorrer da escrita
Nome do composto Estrutura Coacutedigo
Lapachol
A1
β-lapachona
A2
2-Hidroxi-3-(ββ-dimetilvinil)-14-naftoquinona
A3
2-Cloro-14-naftoquinona
A4
Lapachol derivado 1
A5
Lapachol derivado 2 A6
Lapachol derivado 3 A7
Lapachol derivado 4 A8
44 Ensaio de citotoxicidade
Para avaliar a citotoxicidade dos compostos ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas foram incubadas com diferentes concentraccedilotildees dos compostos em triplicata num
volume de 200 microL de meio de cultura por poccedilo na presenccedila de 1 de SFB Os controles natildeo
tratados apresentaram adiccedilatildeo de 200 microL de meio de cultura As ceacutelulas foram entatildeo incubadas
durante 72 horas O meio foi removido e 28 microL de soluccedilatildeo de 5 mg mL MTT (brometo de 3-
21
[45-dimetil-tiazol-2-il]-25 difeniltertrazoacutelio) foi adicionado a cada poccedilo As placas foram re-
incubadas durante 1 hora e 30 minutos e entatildeo 122 microL de DMSO foi adicionado a cada poccedilo e
placas foram agitadas suavemente durante 15 minutos para dissolver os cristais de formazan
A absorbacircncia foi lida em um equipamento leitor de placas Victor X3 (PerkinElmer) a 490
nm A concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC 50) foi definida como a concentraccedilatildeo da amostra que
reduziu a viabilidade celular de 50 em comparaccedilatildeo com controles natildeo tratados Os dados
foram analisados utilizando o programa Prisma
45 Avaliaccedilatildeo da viabilidade e crescimento celular por exclusatildeo de azul de tripan
Ceacutelulas BHK-21 foram cultivadas em placas de 24 poccedilos (7x104 ceacutelulaspoccedilo) e apoacutes
24 horas foram tratadas com as concentraccedilotildees de uso de cada composto e incubadas por 72
horas na presenccedila de 1 de SFB A seguir as ceacutelulas foram tripsinizadas e incubadas com
azul de tripan e entatildeo foi utilizado um contador automatizado de ceacutelulas (Countess II FL
Automated Cell Counter ndash Thermo Fisher Scientific) para contagem das ceacutelulas e avaliaccedilatildeo da
porcentagem de viabilidade e diacircmetro celular do controle nos tempos de 0 24 e 96 horas e
avaliaccedilatildeo dos mesmos paracircmetros para os compostos no tempo de 96 horas (72 horas poacutes
tratamento)
Outra curva de multiplicaccedilatildeo celular foi feita para os compostos A1 A3 A4 e A5 onde as
ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos no momento da confecccedilatildeo da placa e
foram avaliados os mesmos paracircmetros nos tempos de 0 12 24 48 e 72 horas O
equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
46 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
Para determinar a menor Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) responsaacutevel pela letalidade
celular total 2x104 de ceacutelulas BHK-21 foram semeadas em placa de 96 poccedilos Apoacutes a
incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o
meio de cultura foi removido e as ceacutelulas foram expostas a diferentes diluiccedilotildees dos dois
sorotipos de DENV (100 microL de cada diluiccedilatildeo + 100 microL de meio DEMEM 1 SFB) As
diluiccedilotildees seriadas foram realizadas da suspensatildeo viral na razatildeo de 5 para o primeiro poccedilo e de
2 para os demais poccedilos Apoacutes 72 horas as ceacutelulas foram entatildeo fixadas com 200 microL de soluccedilatildeo
22
formalina a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo 1 (pv) de cristal violeta em
PBS para avaliaccedilatildeo da maior diluiccedilatildeo responsaacutevel pela letalidade de 100 das ceacutelulas
47 Ensaio Dose-resposta
Para cada composto foram realizados ensaios de dose-resposta para definiccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de cada composto capaz de promover a reduccedilatildeo na produccedilatildeo viral A atividade
antiviral foi avaliada tambeacutem pelo meacutetodo de MTT Ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas expostas a diferentes concentraccedilotildees dos extratos determinadas a partir das maiores
concentraccedilotildees em que natildeo foram observados efeitos citotoacutexicos As ceacutelulas foram tratadas
com as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de cada composto e em seguida infectadas com DENV
1 (MOI= 5) ou 2 (MOI= 2) Mantendo uma coluna para controle com DMSO uma coluna
para controle de viacuterus uma coluna para controle de citotoxicidade dos compostos e por fim
uma coluna para controle celular As ceacutelulas foram entatildeo incubadas durante 72 horas Apoacutes
este tempo procedeu-se a leitura pelo ensaio de MTT como descrito anteriormente Os dados
foram analisados levando-se em consideraccedilatildeo a leitura das absorbacircncias dos poccedilos dos
controles de viacuterus e do controle celular
Para realizacao destes experimentos os seguintes controles foram adotados
Controle de ceacutelulas poccedilos contendo somente ceacutelulas acrescidas do meio de cultura DMEM
1 SFB Utilizado para avaliar o comportamento das ceacutelulas sem que as mesmas tivessem
contato com qualquer interferente durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo Com isso os poccedilos
reservados para esse controle serviram de padratildeo para comparaccedilatildeo com aqueles em que fosse
observada atividade citotoacutexica ou citopaacutetica
Controle de viacuterus poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM 1 SFB
sem nenhum tratamento e de suspensatildeo de viacuterus Utilizando como referecircncia para anaacutelise da
atividade citopaacutetica provocada pelo viacuterus testado durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo das placas
23
Controle de viacuterus com DMSO Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura
DMEM 1 SFB e DMSO Foi utilizado para avaliar se havia influecircncia prejudicial do
solvente utilizado para diluiccedilatildeo das amostras no meio de cultivo das ceacutelulas e se o mesmo
poderia apresentar alguma potencial atividade antiviral aparente
Controle de citotoxicidade Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM
1 SFB e as quatro principais concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos Foi utilizado
para avaliar se haveria alguma possiacutevel atividade citotoacutexica das concentraccedilotildees dos compostos
em relaccedilatildeo agraves ceacutelulas
48 Ensaio Virucida
Para a realizaccedilatildeo deste ensaio aliacutequotas de 950 microL (diluiccedilatildeo de 20 vezes) do DENV 1 (tiacutetulo
6 x 107 UFPmL) foram incubadas com 50 microL de uma soluccedilatildeo de meio DMEM preparada
com 20x a concentraccedilatildeo natildeo citotoacutexica de cada composto A1 a A8 em banho-maria 37deg C
por 1 hora Apoacutes a incubaccedilatildeo as aliacutequotas foram imediatamente tituladas em ceacutelulas BHK-21
em placas de 6 poccedilos utilizando-se 3 diluiccedilotildees para cada incubaccedilatildeo (20x 20 x 10-1
e 20 x 10-
2) Foram titulados tambeacutem uma aliacutequota incubada apenas com meio DMEM sem nenhum
tratamento e outra aliacutequota incubada com DMSO (Dimetilsulfoacutexido) Estas foram tituladas
utilizando um controle e mais cinco diluiccedilotildees (20x 20 x 10-1
20 x 10-2
20 x 10-3
e 20 x 10-4
)
49 Ensaio antiviral
Neste ensaio ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em placas de 24 poccedilos no dia
seguinte foram tratadas durante 4 horas com as concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas de cada
composto em duplicata Apoacutes o preacute-tratamento as monocamadas foram infectadas com
DENV-1 a uma MOI=5 na presenccedila das concentraccedilotildees de uso respectivas de cada composto
Apoacutes 1 hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus as monocamadas foram lavadas duas vezes com PBS e
foi adicionado 500 microL por poccedilo de meio preparado com as mesmas concentraccedilotildees dos
diferentes compostos e mantidos durante 48 horas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5 Em
quatro poccedilos as ceacutelulas foram infectadas e natildeo tratadas e em outros quatro poccedilos as ceacutelulas
natildeo foram tratadas e nem infectadas (controle de ceacutelulas) destes uacuteltimos dois foram
tripsinizados e contados no momento da infecccedilatildeo e os outros dois apoacutes o teacutermino do ensaio
24
para avaliar o crescimento celular Decorridas as 48 horas o sobrenadante foi coletado e
centrifugado por 10 minutos a 4000 xG para separaccedilatildeo dos debris celulares e prontamente
titulado em placa de 6 poccedilos
410 Anaacutelise estatiacutestica
Os valores de CC50 foram obtidos a partir de anaacutelise de regressatildeo linear das curvas de
concentraccedilatildeocitotoxicidade A anaacutelise estatiacutestica dos dados foi realizada pelo programa
GraphPad Prism software Uma anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi utilizada para determinar
as diferenccedilas estatiacutesticas seguida do poacutes teste de Tukey A significacircncia estatiacutestica foi fixada
em p lt005
25
V RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
26
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Ensaio de citotoxicidade celular
Para avaliar a viabilidade da linhagem celular BHK-21 frente ao tratamento com oito
diferentes concentraccedilotildees dos compostos (A1 a A8) realizou-se um ensaio de MTT (brometo
de 3-[45-dimetil-tiazol-2-il]-25-difeniltetrazoacutelio) Este ensaio tem o objetivo de quantificar
espectrofotometricamente o crescimento celular a viabilidade e proliferaccedilatildeo podendo ser
utilizado como um indicador direto de citotoxicidade Trata-se de um ensaio colorimeacutetrico
para medir a atividade da redutase mitocondrial em ceacutelulas vivas Ele se baseia na reduccedilatildeo do
sal amarelo tetrazoacutelio (permeaacutevel agrave membrana celular) para cristais de formazan azuis
puacuterpura por ceacutelulas metabolicamente ativas a quantidade de formazan gerada medida por
espectrofotometria eacute proporcional ao nuacutemero de ceacutelulas viaacuteveis
A CC50 foi calculada plotando-se uma curva de porcentagem de viabilidade celular por
concentraccedilatildeo melhor representada na figura 7 pelo composto A7 e os resultados de CC50
para todos os compostos estatildeo representados na tabela 2 Foram feitos ensaios de
citotoxicidade com oito concentraccedilotildees diferentes sendo escolhida a maior concentraccedilatildeo que
natildeo apresentou citotoxicidade
Viabilidade Celular = [ ( A ndash B ) A ] x 100
Onde
A = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas natildeo tratadas
B = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas tratadas com
as respectivas concentraccedilotildees de cada composto
27
28
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (A curva dose resposta do composto A7 eacute a que
melhor representa a curva dose resposta esperada) Avaliou-se a viabilidade da linhagem
celular BHK-21 frente agrave diferentes concentraccedilotildees dos compostos realizando o ensaio de MTT
e determinando assim as concentraccedilotildees a serem utilizadas nos proacuteximos ensaios bem como
calculando a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) agrave partir da curva
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo
da concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50)
Composto Concentraccedilatildeo utilizada
[ ] microgmL
Concentraccedilatildeo citotoacutexica 50
(CC50) [ ] microgmL plusmn Desvio
Padratildeo
A1 ([ ]=1 mgmL) 00200 10010 plusmn 0014
A2 ([ ]=1 mgmL) 00025 09561 plusmn 0023
A3 ([ ]=1 mgmL) 00025 09988 plusmn 0017
A4 ([ ]=5 mgmL) 00125 10150 plusmn 0036
A5 ([ ]=10 mgmL) 00250 10590 plusmn 0047
A6 ([ ]=5 mgmL) 00250 08183 plusmn 0030
A7 ([ ]=5 mgmL) 00125 10280 plusmn 0052
A8 ([ ]=5 mgmL) 00125 09758 plusmn 0036
52 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan
Para corroborar o ensaio anterior de citotoxicidade utilizou -se o teste de viabilidade
celular pela teacutecnica da exclusatildeo do azul de tripan com a finalidade de determinar a
viabilidade das ceacutelulas Os procedimentos adotados no ensaio seguiram o manual do
equipamento contador automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL Automated Cell Counter) entatildeo
foi acrescentado agrave 10 microL da suspensatildeo celular 10 microL de azul de tripan (04) Apoacutes
homogeneizaccedilatildeo 10 microL da suspensatildeo foi colocada no local indicado da lacircmina proacutepria para
leitura e foi realizada a contagem sendo consideradas mortas (inviaacuteveis) as ceacutelulas que
incorporavam o corante e viaacuteveis as que excluiacuteam o azul de tripan
29
O equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
(A)
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan A avaliaccedilatildeo da
viabilidade celular foi realizada atraveacutes de um contador automaacutetico de ceacutelulas Este
equipamento possibilita explorar ferramentas de fotografia e avaliar alguns paracircmetros
importantes (A) fotografia das ceacutelulas (B) Zoom na fotografia das ceacutelulas com marcaccedilotildees
(em verde para ceacutelulas vivas e vermelho para mortas) e (D) contagem das ceacutelulas totais
ceacutelulas vivas e mortas graacutefico e meacutedia dos diacircmetros celulares das ceacutelulas vivas e mortas
(B)
(C)
30
O crescimento celular de ceacutelulas natildeo tratadas foi avaliado nos tempos de 0h (momento
da confecccedilatildeo da placa) 24h (momento de tratamento com os compostos) e 96 horas
(Momento em que todas as ceacutelulas foram tripsinizadas e contadas) para avaliar o perfil do
crescimento celular em ceacutelulas natildeo tratadas Foi observado um crescimento celular no periacuteodo
de 24 horas onde as ceacutelulas estavam incubadas com meio acrescido de 10 SFB Em 24
horas o meio foi trocado por 1 SFB e acrescido das substacircncias testes nas menores diluiccedilotildees
natildeo citotoacutexicas determinadas pelo ensaio do MTT Em 96 horas pode ser observado um
decaimento no nuacutemero de ceacutelulas vivas provavelmente devido ao crescimento celular (morte
por confluecircncia)
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas)
(A) (B)
31
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas (A)
Contagem de ceacutelulas vivas (B) Percentual de ceacutelulas viaacuteveis (Viabilidade celular ) e (C)
Meacutedia do diacircmetro apresentado pelas ceacutelulas vivas
Em 96 horas as ceacutelulas natildeo tratadas bem como as ceacutelulas tratadas por 72 horas com as
concentraccedilotildees de uso dos compostos foram tripsinizadas e avaliadas quanto ao nuacutemero de
ceacutelulas vivas viabilidade e diacircmetro celular apresentados na figura 10
Segundo se observa natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo aparente que possa demonstrar que
as concentraccedilotildees de uso dos compostos tenham causado alguma atividade citotoacutexica
corroborando assim os ensaios de citotoxicidade anteriores
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
A infectividade de um viacuterus depende de vaacuterios fatores entre eles da proporccedilatildeo de
partiacuteculas virais completas ou infecciosas da suscetibilidade da ceacutelula hospedeira e da
chance desta partiacutecula encontrar o receptor e penetrar na ceacutelula Quando ceacutelulas suscetiacuteveis
satildeo misturadas com uma suspensatildeo de viacuterus estas podem receber uma duas trecircs ou dez
partiacuteculas virais ou nenhuma Isto depende da proporccedilatildeo entre a quantidade de viacuterus
infecciosos presente no inoculo e a quantidade de ceacutelulas utilizada Esta relaccedilatildeo eacute denominada
de multiplicidade de infecccedilatildeo ou MOI Uma MOI=1 indica que a infecccedilatildeo foi feita em
principio com 1 viacuterus ou 1 dose infectante por ceacutelula
A determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo dos Dengue virus 1 e 2 a serem
utilizadas nos proacuteximos ensaios foi feita a partir da infecccedilatildeo de ceacutelulas BHK-21 por diferentes
(C)
32
concentraccedilotildees de viacuterus e revelaccedilatildeo com cristal violeta Escolheu-se a maior diluiccedilatildeo viral que
possibilitou a letalidade total das ceacutelulas (faixa onde todas as ceacutelulas estatildeo mortas utilizando
menor concentraccedilatildeo de viacuterus) As faixas escolhidas foram entatildeo calculadas levando-se em
consideraccedilatildeo o nuacutemero de ceacutelulas presentes no poccedilo e o nuacutemero de partiacuteculas virais que foram
adicionadas (Faixa3 para DENV2 e 2 para DENV1) Figura 11 Foi estipulado portanto a
Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 2 para DENV 2 e 5 para DENV 1
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI A partir da infecccedilatildeo da linhagem celular BHK-21 em
placa de 96 poccedilos com diferentes diluiccedilotildees de DENV foi determinado que a Multiplicidade
de infecccedilatildeo para o Dengue viacuterus sorotipos 1 e 2 seria de 5 e 2 respectivamente (colunas 2 -
DENV1 e 3 - DENV2)
54 Ensaio dose resposta
Apoacutes a determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas ideais realizou-se um
ensaio dose resposta tratando as ceacutelulas com oito concentraccedilotildees agrave partir das concentraccedilotildees natildeo
citotoacutexicas escolhidas para cada composto e em seguida infectando com DENV sorotipos 1 e
2 nas MOIs estipuladas anteriormente (5 e 2 respectivamente) A porcentagem do efeito
protetor conferida agraves ceacutelulas para cada concentraccedilatildeo de amostra testada foi calculada da
seguinte forma
33
EP = [ (A ndash B) (C ndash B) ] x 100
Onde
A Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas tratadas e infectadas
B Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e infectadas
C Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e natildeo infectadas
Este ensaio tem por objetivo identificar a resposta celular agrave infecccedilatildeo frente ao
tratamento com os compostos em diferentes concentraccedilotildees Assim como o ensaio de
toxicidade este ensaio feito utilizando a teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT permite o teste de vaacuterias
concentraccedilotildees diferentes em um menor tempo e com baixo gasto de material
34
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV1
(MOI=5)
35
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV2
(MOI=2)
36
Takegami et al (1998) demonstraram atividade de furanonaftoquinonas contra o viacuterus
da Encefalite Japonesa (Flavivirus) utilizando a concentraccedilatildeo de 3microgmL poreacutem para os
compostos apresentados avaliados pela teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT nenhuma das
concentraccedilotildees apresentadas produziu efeito antiviral significativo em relaccedilatildeo ao controle
celular como observado nas figuras 12 e 13
Apesar da teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT ser interessante como triagem de atividade
antiviral permitindo o teste de vaacuterias concentraccedilotildees dos compostos em menor tempo e
utilizando uma quantidade razoaacutevel de materiais optou-se por utilizar as maiores
concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas encontradas avaliando sua atividade antiviral por outras
teacutecnicas Como natildeo foi avaliada atividade antiviral preacutevia para nenhum dos compostos frente
agrave infecccedilatildeo por DENV1 e 2 foi selecionado o Dengue virus 1 para dar prosseguimento aos
ensaios
55 Ensaio Virucida
O ensaio virucida foi realizado para avaliar um potencial efeito dos compostos
diretamente sobre a partiacutecula viral Este ensaio eacute importante pois possibilita elucidar se o
composto pode produzir algum efeito sobre a partiacutecula viral impedindo que esta possa infectar
as ceacutelulas
Figura 14 Ensaio virucida Neste ensaio as aliacutequotas de DENV1 foram incubadas com as
concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos e titulados (NT) Controle natildeo tratado
37
Tabela 3 Ensaio virucida Caacutelculo do tiacutetulo viral (UFPmL) e porcentagem representante de
cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 254 x 105 100
DMSO 263 x 105 10335
A1 199 x 105 7835
A2 205 x 105 8071
A3 237 x 105 9311
A4 775 x 104 3049
A5 153 x 105 6024
A6 219 x 105 8602
A7 243 x 105 9547
A8 254 x 105 100
Lagrota et al (1988) demonstraram atividade de 2-HO-3-N-benzil-N(N-benzil-2-
etilamina) -14-naftoquinona sobre a partiacutecula viral de enterovirus De forma contraacuteria apesar
de se verificar a reduccedilatildeo de quase uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais
para o composto A4 natildeo considerou-se esta uma alteraccedilatildeo significativa pois devido agrave
magnitude do nuacutemero de UFPs se trata de uma alteraccedilatildeo muito pequena Portanto os
compostos avaliados neste trabalho natildeo produziram atividade virucida aparente frente ao
tratamento com as concentraccedilotildees de uso
56 Ensaio Antiviral
O sobrenadante de ceacutelulas tratadas previamente e infectadas por DENV1 coletado 48
horas poacutes infecccedilatildeo foi avaliado quanto agrave produccedilatildeo viral de partiacuteculas infecciosas pela
contagem de placas de lise e caacutelculo de Unidades Formadoras de Placa (Titulaccedilatildeo viral em
placa ndash UFPmL)
38
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral Sobrenadante de ceacutelulas tratadas e infectadas por DENV1
coletado apoacutes 48 horas e titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado
Tabela 4 Ensaio Antiviral Coleta do sobrenadante de ceacutelulas infectadas por DENV1 Tiacutetulo
viral (UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o
controle natildeo tratado como 100
Ao perceber um aumento no tiacutetulo viral frente ao tratamento com os compostos A1
A2 e A3 e uma reduccedilatildeo frente ao tratamento com A4 A5 e A6 foram escolhidos dois
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 119 x 105 10000
A1 235 x 105 19748
A2 228 x 105 19160
A3 318 x 105 26723
A4 128 x 104 1076
A5 186 x 103 156
A6 190 x 104 1597
A7 280 x 104 2353
A8 350 x 104 2941
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
40
Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
18
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Linhagens celulares
411 Ceacutelulas C636
As ceacutelulas C636 satildeo ceacutelulas de linhagem contiacutenua de larvas de mosquito Aedes
albopictus Estas ceacutelulas foram utilizadas na produccedilatildeo de estoque viral de DENV sorotipos 1
e 2 para isso foram mantidas em meio de cultura Leibovitz-15 (L-15) (Cultilab)
suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (Cultilab) antibioacuteticos (Penicilina 100 UmL
Streptomicina 100 microgmL) e antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL) a 28degC
412 Ceacutelulas BHK-21
As ceacutelulas BHK-21 satildeo fibroblastos de linhagem contiacutenua derivados de rim de hamster
neonato Estas ceacutelulas foram utilizadas para os experimentos in vitro e para as titulaccedilotildees de
DENV 1 e 2 para isso foram mantidas em meio miacutenimo essencial modificado por Dulbecco
ndash DMEM (Cultilab) suplementado com 5 de Soro Fetal Bovino (SFB) com antibioacuteticos
(Penicilina 100 UmL Streptomicina 100 microgmL) e com antifuacutengico (Fungizona 25 microgmL)
sendo mantidas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5
42 Viacuterus
421 DENV 1 e DENV 2
O Sorotipo 1 do Dengue virus (DENV-1) estirpe Mochizuki foi replicado em ceacutelulas
C636 para gerar estoques de trabalho durante 2 e 5 dias a 28degC O sobrenadante da cultura de
ceacutelulas infectadas foi recolhido e clarificado por centrifugaccedilatildeo a 4000 G durante 10 minutos agrave
4degC e entatildeo foi aliquotado e armazenado a -70 deg C como reserva de viacuterus ateacute agrave sua utilizaccedilatildeo
A replicaccedilatildeo geraccedilatildeo de estoque e titulaccedilatildeo do Sorotipo 2 do Dengue virus (DENV-2)
estirpe Nova Guineacute C ocorreu nos mesmos moldes do DENV-1
19
422 Titulaccedilatildeo viral
Os estoques virais foram diluiacutedos (10-1
a 10-7
) e inoculados em monocamadas de
ceacutelulas BHK-21 implantadas em placas de 6 poccedilos com confluecircncia de aproximadamente
60 (3x105 ceacutelulas por poccedilo) sendo um poccedilo natildeo infectado mantido para controle celular
Apoacutes uma hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus foram adicionados 3 mL de meio DMEM (Cultilab)
suplementado com 15 de SFB e contendo 15 de Carboximetilcelulose (CMC Synth) As
placas foram entatildeo incubadas a 37degC (CO2 a 5) por 96 horas As ceacutelulas foram entatildeo
fixadas com 2 mL de soluccedilatildeo de formol a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo
1 (pv) de cristal violeta em PBS para contagem das placas de lise O tiacutetulo viral foi
expresso atraveacutes do nuacutemero de unidades formadoras de placa por mL (UFPmL) segundo a
formula abaixo representada
Tiacutetulo viral (UFPmL) = N x FC x 10
N = nuacutemero de placas de lise contadas
FC = Fator de correccedilatildeo
= Inverso da diluiccedilatildeo na qual foram contadas as placas de lise
43 Compostos de naftoquinonas
Os compostos utilizados neste estudo foram fornecidos pelo Dr Geraldo Ceacutelio
Brandatildeo do laboratoacuterio de pesquisa da Escola de Farmaacutecia da Universidade Federal de Ouro
Preto
20
Tabela 1 Relaccedilatildeo de nome estrutura e coacutedigo dos compostos utilizados Na tabela estatildeo
presentes a relaccedilatildeo dos nomes dos compostos utilizados neste trabalho bem como sua
estrutura Os coacutedigos representantes de cada composto seratildeo utilizados no decorrer da escrita
Nome do composto Estrutura Coacutedigo
Lapachol
A1
β-lapachona
A2
2-Hidroxi-3-(ββ-dimetilvinil)-14-naftoquinona
A3
2-Cloro-14-naftoquinona
A4
Lapachol derivado 1
A5
Lapachol derivado 2 A6
Lapachol derivado 3 A7
Lapachol derivado 4 A8
44 Ensaio de citotoxicidade
Para avaliar a citotoxicidade dos compostos ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas foram incubadas com diferentes concentraccedilotildees dos compostos em triplicata num
volume de 200 microL de meio de cultura por poccedilo na presenccedila de 1 de SFB Os controles natildeo
tratados apresentaram adiccedilatildeo de 200 microL de meio de cultura As ceacutelulas foram entatildeo incubadas
durante 72 horas O meio foi removido e 28 microL de soluccedilatildeo de 5 mg mL MTT (brometo de 3-
21
[45-dimetil-tiazol-2-il]-25 difeniltertrazoacutelio) foi adicionado a cada poccedilo As placas foram re-
incubadas durante 1 hora e 30 minutos e entatildeo 122 microL de DMSO foi adicionado a cada poccedilo e
placas foram agitadas suavemente durante 15 minutos para dissolver os cristais de formazan
A absorbacircncia foi lida em um equipamento leitor de placas Victor X3 (PerkinElmer) a 490
nm A concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC 50) foi definida como a concentraccedilatildeo da amostra que
reduziu a viabilidade celular de 50 em comparaccedilatildeo com controles natildeo tratados Os dados
foram analisados utilizando o programa Prisma
45 Avaliaccedilatildeo da viabilidade e crescimento celular por exclusatildeo de azul de tripan
Ceacutelulas BHK-21 foram cultivadas em placas de 24 poccedilos (7x104 ceacutelulaspoccedilo) e apoacutes
24 horas foram tratadas com as concentraccedilotildees de uso de cada composto e incubadas por 72
horas na presenccedila de 1 de SFB A seguir as ceacutelulas foram tripsinizadas e incubadas com
azul de tripan e entatildeo foi utilizado um contador automatizado de ceacutelulas (Countess II FL
Automated Cell Counter ndash Thermo Fisher Scientific) para contagem das ceacutelulas e avaliaccedilatildeo da
porcentagem de viabilidade e diacircmetro celular do controle nos tempos de 0 24 e 96 horas e
avaliaccedilatildeo dos mesmos paracircmetros para os compostos no tempo de 96 horas (72 horas poacutes
tratamento)
Outra curva de multiplicaccedilatildeo celular foi feita para os compostos A1 A3 A4 e A5 onde as
ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos no momento da confecccedilatildeo da placa e
foram avaliados os mesmos paracircmetros nos tempos de 0 12 24 48 e 72 horas O
equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
46 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
Para determinar a menor Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) responsaacutevel pela letalidade
celular total 2x104 de ceacutelulas BHK-21 foram semeadas em placa de 96 poccedilos Apoacutes a
incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o
meio de cultura foi removido e as ceacutelulas foram expostas a diferentes diluiccedilotildees dos dois
sorotipos de DENV (100 microL de cada diluiccedilatildeo + 100 microL de meio DEMEM 1 SFB) As
diluiccedilotildees seriadas foram realizadas da suspensatildeo viral na razatildeo de 5 para o primeiro poccedilo e de
2 para os demais poccedilos Apoacutes 72 horas as ceacutelulas foram entatildeo fixadas com 200 microL de soluccedilatildeo
22
formalina a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo 1 (pv) de cristal violeta em
PBS para avaliaccedilatildeo da maior diluiccedilatildeo responsaacutevel pela letalidade de 100 das ceacutelulas
47 Ensaio Dose-resposta
Para cada composto foram realizados ensaios de dose-resposta para definiccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de cada composto capaz de promover a reduccedilatildeo na produccedilatildeo viral A atividade
antiviral foi avaliada tambeacutem pelo meacutetodo de MTT Ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas expostas a diferentes concentraccedilotildees dos extratos determinadas a partir das maiores
concentraccedilotildees em que natildeo foram observados efeitos citotoacutexicos As ceacutelulas foram tratadas
com as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de cada composto e em seguida infectadas com DENV
1 (MOI= 5) ou 2 (MOI= 2) Mantendo uma coluna para controle com DMSO uma coluna
para controle de viacuterus uma coluna para controle de citotoxicidade dos compostos e por fim
uma coluna para controle celular As ceacutelulas foram entatildeo incubadas durante 72 horas Apoacutes
este tempo procedeu-se a leitura pelo ensaio de MTT como descrito anteriormente Os dados
foram analisados levando-se em consideraccedilatildeo a leitura das absorbacircncias dos poccedilos dos
controles de viacuterus e do controle celular
Para realizacao destes experimentos os seguintes controles foram adotados
Controle de ceacutelulas poccedilos contendo somente ceacutelulas acrescidas do meio de cultura DMEM
1 SFB Utilizado para avaliar o comportamento das ceacutelulas sem que as mesmas tivessem
contato com qualquer interferente durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo Com isso os poccedilos
reservados para esse controle serviram de padratildeo para comparaccedilatildeo com aqueles em que fosse
observada atividade citotoacutexica ou citopaacutetica
Controle de viacuterus poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM 1 SFB
sem nenhum tratamento e de suspensatildeo de viacuterus Utilizando como referecircncia para anaacutelise da
atividade citopaacutetica provocada pelo viacuterus testado durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo das placas
23
Controle de viacuterus com DMSO Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura
DMEM 1 SFB e DMSO Foi utilizado para avaliar se havia influecircncia prejudicial do
solvente utilizado para diluiccedilatildeo das amostras no meio de cultivo das ceacutelulas e se o mesmo
poderia apresentar alguma potencial atividade antiviral aparente
Controle de citotoxicidade Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM
1 SFB e as quatro principais concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos Foi utilizado
para avaliar se haveria alguma possiacutevel atividade citotoacutexica das concentraccedilotildees dos compostos
em relaccedilatildeo agraves ceacutelulas
48 Ensaio Virucida
Para a realizaccedilatildeo deste ensaio aliacutequotas de 950 microL (diluiccedilatildeo de 20 vezes) do DENV 1 (tiacutetulo
6 x 107 UFPmL) foram incubadas com 50 microL de uma soluccedilatildeo de meio DMEM preparada
com 20x a concentraccedilatildeo natildeo citotoacutexica de cada composto A1 a A8 em banho-maria 37deg C
por 1 hora Apoacutes a incubaccedilatildeo as aliacutequotas foram imediatamente tituladas em ceacutelulas BHK-21
em placas de 6 poccedilos utilizando-se 3 diluiccedilotildees para cada incubaccedilatildeo (20x 20 x 10-1
e 20 x 10-
2) Foram titulados tambeacutem uma aliacutequota incubada apenas com meio DMEM sem nenhum
tratamento e outra aliacutequota incubada com DMSO (Dimetilsulfoacutexido) Estas foram tituladas
utilizando um controle e mais cinco diluiccedilotildees (20x 20 x 10-1
20 x 10-2
20 x 10-3
e 20 x 10-4
)
49 Ensaio antiviral
Neste ensaio ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em placas de 24 poccedilos no dia
seguinte foram tratadas durante 4 horas com as concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas de cada
composto em duplicata Apoacutes o preacute-tratamento as monocamadas foram infectadas com
DENV-1 a uma MOI=5 na presenccedila das concentraccedilotildees de uso respectivas de cada composto
Apoacutes 1 hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus as monocamadas foram lavadas duas vezes com PBS e
foi adicionado 500 microL por poccedilo de meio preparado com as mesmas concentraccedilotildees dos
diferentes compostos e mantidos durante 48 horas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5 Em
quatro poccedilos as ceacutelulas foram infectadas e natildeo tratadas e em outros quatro poccedilos as ceacutelulas
natildeo foram tratadas e nem infectadas (controle de ceacutelulas) destes uacuteltimos dois foram
tripsinizados e contados no momento da infecccedilatildeo e os outros dois apoacutes o teacutermino do ensaio
24
para avaliar o crescimento celular Decorridas as 48 horas o sobrenadante foi coletado e
centrifugado por 10 minutos a 4000 xG para separaccedilatildeo dos debris celulares e prontamente
titulado em placa de 6 poccedilos
410 Anaacutelise estatiacutestica
Os valores de CC50 foram obtidos a partir de anaacutelise de regressatildeo linear das curvas de
concentraccedilatildeocitotoxicidade A anaacutelise estatiacutestica dos dados foi realizada pelo programa
GraphPad Prism software Uma anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi utilizada para determinar
as diferenccedilas estatiacutesticas seguida do poacutes teste de Tukey A significacircncia estatiacutestica foi fixada
em p lt005
25
V RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
26
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Ensaio de citotoxicidade celular
Para avaliar a viabilidade da linhagem celular BHK-21 frente ao tratamento com oito
diferentes concentraccedilotildees dos compostos (A1 a A8) realizou-se um ensaio de MTT (brometo
de 3-[45-dimetil-tiazol-2-il]-25-difeniltetrazoacutelio) Este ensaio tem o objetivo de quantificar
espectrofotometricamente o crescimento celular a viabilidade e proliferaccedilatildeo podendo ser
utilizado como um indicador direto de citotoxicidade Trata-se de um ensaio colorimeacutetrico
para medir a atividade da redutase mitocondrial em ceacutelulas vivas Ele se baseia na reduccedilatildeo do
sal amarelo tetrazoacutelio (permeaacutevel agrave membrana celular) para cristais de formazan azuis
puacuterpura por ceacutelulas metabolicamente ativas a quantidade de formazan gerada medida por
espectrofotometria eacute proporcional ao nuacutemero de ceacutelulas viaacuteveis
A CC50 foi calculada plotando-se uma curva de porcentagem de viabilidade celular por
concentraccedilatildeo melhor representada na figura 7 pelo composto A7 e os resultados de CC50
para todos os compostos estatildeo representados na tabela 2 Foram feitos ensaios de
citotoxicidade com oito concentraccedilotildees diferentes sendo escolhida a maior concentraccedilatildeo que
natildeo apresentou citotoxicidade
Viabilidade Celular = [ ( A ndash B ) A ] x 100
Onde
A = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas natildeo tratadas
B = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas tratadas com
as respectivas concentraccedilotildees de cada composto
27
28
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (A curva dose resposta do composto A7 eacute a que
melhor representa a curva dose resposta esperada) Avaliou-se a viabilidade da linhagem
celular BHK-21 frente agrave diferentes concentraccedilotildees dos compostos realizando o ensaio de MTT
e determinando assim as concentraccedilotildees a serem utilizadas nos proacuteximos ensaios bem como
calculando a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) agrave partir da curva
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo
da concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50)
Composto Concentraccedilatildeo utilizada
[ ] microgmL
Concentraccedilatildeo citotoacutexica 50
(CC50) [ ] microgmL plusmn Desvio
Padratildeo
A1 ([ ]=1 mgmL) 00200 10010 plusmn 0014
A2 ([ ]=1 mgmL) 00025 09561 plusmn 0023
A3 ([ ]=1 mgmL) 00025 09988 plusmn 0017
A4 ([ ]=5 mgmL) 00125 10150 plusmn 0036
A5 ([ ]=10 mgmL) 00250 10590 plusmn 0047
A6 ([ ]=5 mgmL) 00250 08183 plusmn 0030
A7 ([ ]=5 mgmL) 00125 10280 plusmn 0052
A8 ([ ]=5 mgmL) 00125 09758 plusmn 0036
52 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan
Para corroborar o ensaio anterior de citotoxicidade utilizou -se o teste de viabilidade
celular pela teacutecnica da exclusatildeo do azul de tripan com a finalidade de determinar a
viabilidade das ceacutelulas Os procedimentos adotados no ensaio seguiram o manual do
equipamento contador automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL Automated Cell Counter) entatildeo
foi acrescentado agrave 10 microL da suspensatildeo celular 10 microL de azul de tripan (04) Apoacutes
homogeneizaccedilatildeo 10 microL da suspensatildeo foi colocada no local indicado da lacircmina proacutepria para
leitura e foi realizada a contagem sendo consideradas mortas (inviaacuteveis) as ceacutelulas que
incorporavam o corante e viaacuteveis as que excluiacuteam o azul de tripan
29
O equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
(A)
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan A avaliaccedilatildeo da
viabilidade celular foi realizada atraveacutes de um contador automaacutetico de ceacutelulas Este
equipamento possibilita explorar ferramentas de fotografia e avaliar alguns paracircmetros
importantes (A) fotografia das ceacutelulas (B) Zoom na fotografia das ceacutelulas com marcaccedilotildees
(em verde para ceacutelulas vivas e vermelho para mortas) e (D) contagem das ceacutelulas totais
ceacutelulas vivas e mortas graacutefico e meacutedia dos diacircmetros celulares das ceacutelulas vivas e mortas
(B)
(C)
30
O crescimento celular de ceacutelulas natildeo tratadas foi avaliado nos tempos de 0h (momento
da confecccedilatildeo da placa) 24h (momento de tratamento com os compostos) e 96 horas
(Momento em que todas as ceacutelulas foram tripsinizadas e contadas) para avaliar o perfil do
crescimento celular em ceacutelulas natildeo tratadas Foi observado um crescimento celular no periacuteodo
de 24 horas onde as ceacutelulas estavam incubadas com meio acrescido de 10 SFB Em 24
horas o meio foi trocado por 1 SFB e acrescido das substacircncias testes nas menores diluiccedilotildees
natildeo citotoacutexicas determinadas pelo ensaio do MTT Em 96 horas pode ser observado um
decaimento no nuacutemero de ceacutelulas vivas provavelmente devido ao crescimento celular (morte
por confluecircncia)
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas)
(A) (B)
31
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas (A)
Contagem de ceacutelulas vivas (B) Percentual de ceacutelulas viaacuteveis (Viabilidade celular ) e (C)
Meacutedia do diacircmetro apresentado pelas ceacutelulas vivas
Em 96 horas as ceacutelulas natildeo tratadas bem como as ceacutelulas tratadas por 72 horas com as
concentraccedilotildees de uso dos compostos foram tripsinizadas e avaliadas quanto ao nuacutemero de
ceacutelulas vivas viabilidade e diacircmetro celular apresentados na figura 10
Segundo se observa natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo aparente que possa demonstrar que
as concentraccedilotildees de uso dos compostos tenham causado alguma atividade citotoacutexica
corroborando assim os ensaios de citotoxicidade anteriores
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
A infectividade de um viacuterus depende de vaacuterios fatores entre eles da proporccedilatildeo de
partiacuteculas virais completas ou infecciosas da suscetibilidade da ceacutelula hospedeira e da
chance desta partiacutecula encontrar o receptor e penetrar na ceacutelula Quando ceacutelulas suscetiacuteveis
satildeo misturadas com uma suspensatildeo de viacuterus estas podem receber uma duas trecircs ou dez
partiacuteculas virais ou nenhuma Isto depende da proporccedilatildeo entre a quantidade de viacuterus
infecciosos presente no inoculo e a quantidade de ceacutelulas utilizada Esta relaccedilatildeo eacute denominada
de multiplicidade de infecccedilatildeo ou MOI Uma MOI=1 indica que a infecccedilatildeo foi feita em
principio com 1 viacuterus ou 1 dose infectante por ceacutelula
A determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo dos Dengue virus 1 e 2 a serem
utilizadas nos proacuteximos ensaios foi feita a partir da infecccedilatildeo de ceacutelulas BHK-21 por diferentes
(C)
32
concentraccedilotildees de viacuterus e revelaccedilatildeo com cristal violeta Escolheu-se a maior diluiccedilatildeo viral que
possibilitou a letalidade total das ceacutelulas (faixa onde todas as ceacutelulas estatildeo mortas utilizando
menor concentraccedilatildeo de viacuterus) As faixas escolhidas foram entatildeo calculadas levando-se em
consideraccedilatildeo o nuacutemero de ceacutelulas presentes no poccedilo e o nuacutemero de partiacuteculas virais que foram
adicionadas (Faixa3 para DENV2 e 2 para DENV1) Figura 11 Foi estipulado portanto a
Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 2 para DENV 2 e 5 para DENV 1
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI A partir da infecccedilatildeo da linhagem celular BHK-21 em
placa de 96 poccedilos com diferentes diluiccedilotildees de DENV foi determinado que a Multiplicidade
de infecccedilatildeo para o Dengue viacuterus sorotipos 1 e 2 seria de 5 e 2 respectivamente (colunas 2 -
DENV1 e 3 - DENV2)
54 Ensaio dose resposta
Apoacutes a determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas ideais realizou-se um
ensaio dose resposta tratando as ceacutelulas com oito concentraccedilotildees agrave partir das concentraccedilotildees natildeo
citotoacutexicas escolhidas para cada composto e em seguida infectando com DENV sorotipos 1 e
2 nas MOIs estipuladas anteriormente (5 e 2 respectivamente) A porcentagem do efeito
protetor conferida agraves ceacutelulas para cada concentraccedilatildeo de amostra testada foi calculada da
seguinte forma
33
EP = [ (A ndash B) (C ndash B) ] x 100
Onde
A Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas tratadas e infectadas
B Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e infectadas
C Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e natildeo infectadas
Este ensaio tem por objetivo identificar a resposta celular agrave infecccedilatildeo frente ao
tratamento com os compostos em diferentes concentraccedilotildees Assim como o ensaio de
toxicidade este ensaio feito utilizando a teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT permite o teste de vaacuterias
concentraccedilotildees diferentes em um menor tempo e com baixo gasto de material
34
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV1
(MOI=5)
35
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV2
(MOI=2)
36
Takegami et al (1998) demonstraram atividade de furanonaftoquinonas contra o viacuterus
da Encefalite Japonesa (Flavivirus) utilizando a concentraccedilatildeo de 3microgmL poreacutem para os
compostos apresentados avaliados pela teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT nenhuma das
concentraccedilotildees apresentadas produziu efeito antiviral significativo em relaccedilatildeo ao controle
celular como observado nas figuras 12 e 13
Apesar da teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT ser interessante como triagem de atividade
antiviral permitindo o teste de vaacuterias concentraccedilotildees dos compostos em menor tempo e
utilizando uma quantidade razoaacutevel de materiais optou-se por utilizar as maiores
concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas encontradas avaliando sua atividade antiviral por outras
teacutecnicas Como natildeo foi avaliada atividade antiviral preacutevia para nenhum dos compostos frente
agrave infecccedilatildeo por DENV1 e 2 foi selecionado o Dengue virus 1 para dar prosseguimento aos
ensaios
55 Ensaio Virucida
O ensaio virucida foi realizado para avaliar um potencial efeito dos compostos
diretamente sobre a partiacutecula viral Este ensaio eacute importante pois possibilita elucidar se o
composto pode produzir algum efeito sobre a partiacutecula viral impedindo que esta possa infectar
as ceacutelulas
Figura 14 Ensaio virucida Neste ensaio as aliacutequotas de DENV1 foram incubadas com as
concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos e titulados (NT) Controle natildeo tratado
37
Tabela 3 Ensaio virucida Caacutelculo do tiacutetulo viral (UFPmL) e porcentagem representante de
cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 254 x 105 100
DMSO 263 x 105 10335
A1 199 x 105 7835
A2 205 x 105 8071
A3 237 x 105 9311
A4 775 x 104 3049
A5 153 x 105 6024
A6 219 x 105 8602
A7 243 x 105 9547
A8 254 x 105 100
Lagrota et al (1988) demonstraram atividade de 2-HO-3-N-benzil-N(N-benzil-2-
etilamina) -14-naftoquinona sobre a partiacutecula viral de enterovirus De forma contraacuteria apesar
de se verificar a reduccedilatildeo de quase uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais
para o composto A4 natildeo considerou-se esta uma alteraccedilatildeo significativa pois devido agrave
magnitude do nuacutemero de UFPs se trata de uma alteraccedilatildeo muito pequena Portanto os
compostos avaliados neste trabalho natildeo produziram atividade virucida aparente frente ao
tratamento com as concentraccedilotildees de uso
56 Ensaio Antiviral
O sobrenadante de ceacutelulas tratadas previamente e infectadas por DENV1 coletado 48
horas poacutes infecccedilatildeo foi avaliado quanto agrave produccedilatildeo viral de partiacuteculas infecciosas pela
contagem de placas de lise e caacutelculo de Unidades Formadoras de Placa (Titulaccedilatildeo viral em
placa ndash UFPmL)
38
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral Sobrenadante de ceacutelulas tratadas e infectadas por DENV1
coletado apoacutes 48 horas e titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado
Tabela 4 Ensaio Antiviral Coleta do sobrenadante de ceacutelulas infectadas por DENV1 Tiacutetulo
viral (UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o
controle natildeo tratado como 100
Ao perceber um aumento no tiacutetulo viral frente ao tratamento com os compostos A1
A2 e A3 e uma reduccedilatildeo frente ao tratamento com A4 A5 e A6 foram escolhidos dois
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 119 x 105 10000
A1 235 x 105 19748
A2 228 x 105 19160
A3 318 x 105 26723
A4 128 x 104 1076
A5 186 x 103 156
A6 190 x 104 1597
A7 280 x 104 2353
A8 350 x 104 2941
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
40
Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
19
422 Titulaccedilatildeo viral
Os estoques virais foram diluiacutedos (10-1
a 10-7
) e inoculados em monocamadas de
ceacutelulas BHK-21 implantadas em placas de 6 poccedilos com confluecircncia de aproximadamente
60 (3x105 ceacutelulas por poccedilo) sendo um poccedilo natildeo infectado mantido para controle celular
Apoacutes uma hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus foram adicionados 3 mL de meio DMEM (Cultilab)
suplementado com 15 de SFB e contendo 15 de Carboximetilcelulose (CMC Synth) As
placas foram entatildeo incubadas a 37degC (CO2 a 5) por 96 horas As ceacutelulas foram entatildeo
fixadas com 2 mL de soluccedilatildeo de formol a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo
1 (pv) de cristal violeta em PBS para contagem das placas de lise O tiacutetulo viral foi
expresso atraveacutes do nuacutemero de unidades formadoras de placa por mL (UFPmL) segundo a
formula abaixo representada
Tiacutetulo viral (UFPmL) = N x FC x 10
N = nuacutemero de placas de lise contadas
FC = Fator de correccedilatildeo
= Inverso da diluiccedilatildeo na qual foram contadas as placas de lise
43 Compostos de naftoquinonas
Os compostos utilizados neste estudo foram fornecidos pelo Dr Geraldo Ceacutelio
Brandatildeo do laboratoacuterio de pesquisa da Escola de Farmaacutecia da Universidade Federal de Ouro
Preto
20
Tabela 1 Relaccedilatildeo de nome estrutura e coacutedigo dos compostos utilizados Na tabela estatildeo
presentes a relaccedilatildeo dos nomes dos compostos utilizados neste trabalho bem como sua
estrutura Os coacutedigos representantes de cada composto seratildeo utilizados no decorrer da escrita
Nome do composto Estrutura Coacutedigo
Lapachol
A1
β-lapachona
A2
2-Hidroxi-3-(ββ-dimetilvinil)-14-naftoquinona
A3
2-Cloro-14-naftoquinona
A4
Lapachol derivado 1
A5
Lapachol derivado 2 A6
Lapachol derivado 3 A7
Lapachol derivado 4 A8
44 Ensaio de citotoxicidade
Para avaliar a citotoxicidade dos compostos ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas foram incubadas com diferentes concentraccedilotildees dos compostos em triplicata num
volume de 200 microL de meio de cultura por poccedilo na presenccedila de 1 de SFB Os controles natildeo
tratados apresentaram adiccedilatildeo de 200 microL de meio de cultura As ceacutelulas foram entatildeo incubadas
durante 72 horas O meio foi removido e 28 microL de soluccedilatildeo de 5 mg mL MTT (brometo de 3-
21
[45-dimetil-tiazol-2-il]-25 difeniltertrazoacutelio) foi adicionado a cada poccedilo As placas foram re-
incubadas durante 1 hora e 30 minutos e entatildeo 122 microL de DMSO foi adicionado a cada poccedilo e
placas foram agitadas suavemente durante 15 minutos para dissolver os cristais de formazan
A absorbacircncia foi lida em um equipamento leitor de placas Victor X3 (PerkinElmer) a 490
nm A concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC 50) foi definida como a concentraccedilatildeo da amostra que
reduziu a viabilidade celular de 50 em comparaccedilatildeo com controles natildeo tratados Os dados
foram analisados utilizando o programa Prisma
45 Avaliaccedilatildeo da viabilidade e crescimento celular por exclusatildeo de azul de tripan
Ceacutelulas BHK-21 foram cultivadas em placas de 24 poccedilos (7x104 ceacutelulaspoccedilo) e apoacutes
24 horas foram tratadas com as concentraccedilotildees de uso de cada composto e incubadas por 72
horas na presenccedila de 1 de SFB A seguir as ceacutelulas foram tripsinizadas e incubadas com
azul de tripan e entatildeo foi utilizado um contador automatizado de ceacutelulas (Countess II FL
Automated Cell Counter ndash Thermo Fisher Scientific) para contagem das ceacutelulas e avaliaccedilatildeo da
porcentagem de viabilidade e diacircmetro celular do controle nos tempos de 0 24 e 96 horas e
avaliaccedilatildeo dos mesmos paracircmetros para os compostos no tempo de 96 horas (72 horas poacutes
tratamento)
Outra curva de multiplicaccedilatildeo celular foi feita para os compostos A1 A3 A4 e A5 onde as
ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos no momento da confecccedilatildeo da placa e
foram avaliados os mesmos paracircmetros nos tempos de 0 12 24 48 e 72 horas O
equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
46 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
Para determinar a menor Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) responsaacutevel pela letalidade
celular total 2x104 de ceacutelulas BHK-21 foram semeadas em placa de 96 poccedilos Apoacutes a
incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o
meio de cultura foi removido e as ceacutelulas foram expostas a diferentes diluiccedilotildees dos dois
sorotipos de DENV (100 microL de cada diluiccedilatildeo + 100 microL de meio DEMEM 1 SFB) As
diluiccedilotildees seriadas foram realizadas da suspensatildeo viral na razatildeo de 5 para o primeiro poccedilo e de
2 para os demais poccedilos Apoacutes 72 horas as ceacutelulas foram entatildeo fixadas com 200 microL de soluccedilatildeo
22
formalina a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo 1 (pv) de cristal violeta em
PBS para avaliaccedilatildeo da maior diluiccedilatildeo responsaacutevel pela letalidade de 100 das ceacutelulas
47 Ensaio Dose-resposta
Para cada composto foram realizados ensaios de dose-resposta para definiccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de cada composto capaz de promover a reduccedilatildeo na produccedilatildeo viral A atividade
antiviral foi avaliada tambeacutem pelo meacutetodo de MTT Ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas expostas a diferentes concentraccedilotildees dos extratos determinadas a partir das maiores
concentraccedilotildees em que natildeo foram observados efeitos citotoacutexicos As ceacutelulas foram tratadas
com as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de cada composto e em seguida infectadas com DENV
1 (MOI= 5) ou 2 (MOI= 2) Mantendo uma coluna para controle com DMSO uma coluna
para controle de viacuterus uma coluna para controle de citotoxicidade dos compostos e por fim
uma coluna para controle celular As ceacutelulas foram entatildeo incubadas durante 72 horas Apoacutes
este tempo procedeu-se a leitura pelo ensaio de MTT como descrito anteriormente Os dados
foram analisados levando-se em consideraccedilatildeo a leitura das absorbacircncias dos poccedilos dos
controles de viacuterus e do controle celular
Para realizacao destes experimentos os seguintes controles foram adotados
Controle de ceacutelulas poccedilos contendo somente ceacutelulas acrescidas do meio de cultura DMEM
1 SFB Utilizado para avaliar o comportamento das ceacutelulas sem que as mesmas tivessem
contato com qualquer interferente durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo Com isso os poccedilos
reservados para esse controle serviram de padratildeo para comparaccedilatildeo com aqueles em que fosse
observada atividade citotoacutexica ou citopaacutetica
Controle de viacuterus poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM 1 SFB
sem nenhum tratamento e de suspensatildeo de viacuterus Utilizando como referecircncia para anaacutelise da
atividade citopaacutetica provocada pelo viacuterus testado durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo das placas
23
Controle de viacuterus com DMSO Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura
DMEM 1 SFB e DMSO Foi utilizado para avaliar se havia influecircncia prejudicial do
solvente utilizado para diluiccedilatildeo das amostras no meio de cultivo das ceacutelulas e se o mesmo
poderia apresentar alguma potencial atividade antiviral aparente
Controle de citotoxicidade Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM
1 SFB e as quatro principais concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos Foi utilizado
para avaliar se haveria alguma possiacutevel atividade citotoacutexica das concentraccedilotildees dos compostos
em relaccedilatildeo agraves ceacutelulas
48 Ensaio Virucida
Para a realizaccedilatildeo deste ensaio aliacutequotas de 950 microL (diluiccedilatildeo de 20 vezes) do DENV 1 (tiacutetulo
6 x 107 UFPmL) foram incubadas com 50 microL de uma soluccedilatildeo de meio DMEM preparada
com 20x a concentraccedilatildeo natildeo citotoacutexica de cada composto A1 a A8 em banho-maria 37deg C
por 1 hora Apoacutes a incubaccedilatildeo as aliacutequotas foram imediatamente tituladas em ceacutelulas BHK-21
em placas de 6 poccedilos utilizando-se 3 diluiccedilotildees para cada incubaccedilatildeo (20x 20 x 10-1
e 20 x 10-
2) Foram titulados tambeacutem uma aliacutequota incubada apenas com meio DMEM sem nenhum
tratamento e outra aliacutequota incubada com DMSO (Dimetilsulfoacutexido) Estas foram tituladas
utilizando um controle e mais cinco diluiccedilotildees (20x 20 x 10-1
20 x 10-2
20 x 10-3
e 20 x 10-4
)
49 Ensaio antiviral
Neste ensaio ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em placas de 24 poccedilos no dia
seguinte foram tratadas durante 4 horas com as concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas de cada
composto em duplicata Apoacutes o preacute-tratamento as monocamadas foram infectadas com
DENV-1 a uma MOI=5 na presenccedila das concentraccedilotildees de uso respectivas de cada composto
Apoacutes 1 hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus as monocamadas foram lavadas duas vezes com PBS e
foi adicionado 500 microL por poccedilo de meio preparado com as mesmas concentraccedilotildees dos
diferentes compostos e mantidos durante 48 horas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5 Em
quatro poccedilos as ceacutelulas foram infectadas e natildeo tratadas e em outros quatro poccedilos as ceacutelulas
natildeo foram tratadas e nem infectadas (controle de ceacutelulas) destes uacuteltimos dois foram
tripsinizados e contados no momento da infecccedilatildeo e os outros dois apoacutes o teacutermino do ensaio
24
para avaliar o crescimento celular Decorridas as 48 horas o sobrenadante foi coletado e
centrifugado por 10 minutos a 4000 xG para separaccedilatildeo dos debris celulares e prontamente
titulado em placa de 6 poccedilos
410 Anaacutelise estatiacutestica
Os valores de CC50 foram obtidos a partir de anaacutelise de regressatildeo linear das curvas de
concentraccedilatildeocitotoxicidade A anaacutelise estatiacutestica dos dados foi realizada pelo programa
GraphPad Prism software Uma anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi utilizada para determinar
as diferenccedilas estatiacutesticas seguida do poacutes teste de Tukey A significacircncia estatiacutestica foi fixada
em p lt005
25
V RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
26
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Ensaio de citotoxicidade celular
Para avaliar a viabilidade da linhagem celular BHK-21 frente ao tratamento com oito
diferentes concentraccedilotildees dos compostos (A1 a A8) realizou-se um ensaio de MTT (brometo
de 3-[45-dimetil-tiazol-2-il]-25-difeniltetrazoacutelio) Este ensaio tem o objetivo de quantificar
espectrofotometricamente o crescimento celular a viabilidade e proliferaccedilatildeo podendo ser
utilizado como um indicador direto de citotoxicidade Trata-se de um ensaio colorimeacutetrico
para medir a atividade da redutase mitocondrial em ceacutelulas vivas Ele se baseia na reduccedilatildeo do
sal amarelo tetrazoacutelio (permeaacutevel agrave membrana celular) para cristais de formazan azuis
puacuterpura por ceacutelulas metabolicamente ativas a quantidade de formazan gerada medida por
espectrofotometria eacute proporcional ao nuacutemero de ceacutelulas viaacuteveis
A CC50 foi calculada plotando-se uma curva de porcentagem de viabilidade celular por
concentraccedilatildeo melhor representada na figura 7 pelo composto A7 e os resultados de CC50
para todos os compostos estatildeo representados na tabela 2 Foram feitos ensaios de
citotoxicidade com oito concentraccedilotildees diferentes sendo escolhida a maior concentraccedilatildeo que
natildeo apresentou citotoxicidade
Viabilidade Celular = [ ( A ndash B ) A ] x 100
Onde
A = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas natildeo tratadas
B = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas tratadas com
as respectivas concentraccedilotildees de cada composto
27
28
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (A curva dose resposta do composto A7 eacute a que
melhor representa a curva dose resposta esperada) Avaliou-se a viabilidade da linhagem
celular BHK-21 frente agrave diferentes concentraccedilotildees dos compostos realizando o ensaio de MTT
e determinando assim as concentraccedilotildees a serem utilizadas nos proacuteximos ensaios bem como
calculando a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) agrave partir da curva
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo
da concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50)
Composto Concentraccedilatildeo utilizada
[ ] microgmL
Concentraccedilatildeo citotoacutexica 50
(CC50) [ ] microgmL plusmn Desvio
Padratildeo
A1 ([ ]=1 mgmL) 00200 10010 plusmn 0014
A2 ([ ]=1 mgmL) 00025 09561 plusmn 0023
A3 ([ ]=1 mgmL) 00025 09988 plusmn 0017
A4 ([ ]=5 mgmL) 00125 10150 plusmn 0036
A5 ([ ]=10 mgmL) 00250 10590 plusmn 0047
A6 ([ ]=5 mgmL) 00250 08183 plusmn 0030
A7 ([ ]=5 mgmL) 00125 10280 plusmn 0052
A8 ([ ]=5 mgmL) 00125 09758 plusmn 0036
52 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan
Para corroborar o ensaio anterior de citotoxicidade utilizou -se o teste de viabilidade
celular pela teacutecnica da exclusatildeo do azul de tripan com a finalidade de determinar a
viabilidade das ceacutelulas Os procedimentos adotados no ensaio seguiram o manual do
equipamento contador automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL Automated Cell Counter) entatildeo
foi acrescentado agrave 10 microL da suspensatildeo celular 10 microL de azul de tripan (04) Apoacutes
homogeneizaccedilatildeo 10 microL da suspensatildeo foi colocada no local indicado da lacircmina proacutepria para
leitura e foi realizada a contagem sendo consideradas mortas (inviaacuteveis) as ceacutelulas que
incorporavam o corante e viaacuteveis as que excluiacuteam o azul de tripan
29
O equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
(A)
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan A avaliaccedilatildeo da
viabilidade celular foi realizada atraveacutes de um contador automaacutetico de ceacutelulas Este
equipamento possibilita explorar ferramentas de fotografia e avaliar alguns paracircmetros
importantes (A) fotografia das ceacutelulas (B) Zoom na fotografia das ceacutelulas com marcaccedilotildees
(em verde para ceacutelulas vivas e vermelho para mortas) e (D) contagem das ceacutelulas totais
ceacutelulas vivas e mortas graacutefico e meacutedia dos diacircmetros celulares das ceacutelulas vivas e mortas
(B)
(C)
30
O crescimento celular de ceacutelulas natildeo tratadas foi avaliado nos tempos de 0h (momento
da confecccedilatildeo da placa) 24h (momento de tratamento com os compostos) e 96 horas
(Momento em que todas as ceacutelulas foram tripsinizadas e contadas) para avaliar o perfil do
crescimento celular em ceacutelulas natildeo tratadas Foi observado um crescimento celular no periacuteodo
de 24 horas onde as ceacutelulas estavam incubadas com meio acrescido de 10 SFB Em 24
horas o meio foi trocado por 1 SFB e acrescido das substacircncias testes nas menores diluiccedilotildees
natildeo citotoacutexicas determinadas pelo ensaio do MTT Em 96 horas pode ser observado um
decaimento no nuacutemero de ceacutelulas vivas provavelmente devido ao crescimento celular (morte
por confluecircncia)
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas)
(A) (B)
31
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas (A)
Contagem de ceacutelulas vivas (B) Percentual de ceacutelulas viaacuteveis (Viabilidade celular ) e (C)
Meacutedia do diacircmetro apresentado pelas ceacutelulas vivas
Em 96 horas as ceacutelulas natildeo tratadas bem como as ceacutelulas tratadas por 72 horas com as
concentraccedilotildees de uso dos compostos foram tripsinizadas e avaliadas quanto ao nuacutemero de
ceacutelulas vivas viabilidade e diacircmetro celular apresentados na figura 10
Segundo se observa natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo aparente que possa demonstrar que
as concentraccedilotildees de uso dos compostos tenham causado alguma atividade citotoacutexica
corroborando assim os ensaios de citotoxicidade anteriores
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
A infectividade de um viacuterus depende de vaacuterios fatores entre eles da proporccedilatildeo de
partiacuteculas virais completas ou infecciosas da suscetibilidade da ceacutelula hospedeira e da
chance desta partiacutecula encontrar o receptor e penetrar na ceacutelula Quando ceacutelulas suscetiacuteveis
satildeo misturadas com uma suspensatildeo de viacuterus estas podem receber uma duas trecircs ou dez
partiacuteculas virais ou nenhuma Isto depende da proporccedilatildeo entre a quantidade de viacuterus
infecciosos presente no inoculo e a quantidade de ceacutelulas utilizada Esta relaccedilatildeo eacute denominada
de multiplicidade de infecccedilatildeo ou MOI Uma MOI=1 indica que a infecccedilatildeo foi feita em
principio com 1 viacuterus ou 1 dose infectante por ceacutelula
A determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo dos Dengue virus 1 e 2 a serem
utilizadas nos proacuteximos ensaios foi feita a partir da infecccedilatildeo de ceacutelulas BHK-21 por diferentes
(C)
32
concentraccedilotildees de viacuterus e revelaccedilatildeo com cristal violeta Escolheu-se a maior diluiccedilatildeo viral que
possibilitou a letalidade total das ceacutelulas (faixa onde todas as ceacutelulas estatildeo mortas utilizando
menor concentraccedilatildeo de viacuterus) As faixas escolhidas foram entatildeo calculadas levando-se em
consideraccedilatildeo o nuacutemero de ceacutelulas presentes no poccedilo e o nuacutemero de partiacuteculas virais que foram
adicionadas (Faixa3 para DENV2 e 2 para DENV1) Figura 11 Foi estipulado portanto a
Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 2 para DENV 2 e 5 para DENV 1
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI A partir da infecccedilatildeo da linhagem celular BHK-21 em
placa de 96 poccedilos com diferentes diluiccedilotildees de DENV foi determinado que a Multiplicidade
de infecccedilatildeo para o Dengue viacuterus sorotipos 1 e 2 seria de 5 e 2 respectivamente (colunas 2 -
DENV1 e 3 - DENV2)
54 Ensaio dose resposta
Apoacutes a determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas ideais realizou-se um
ensaio dose resposta tratando as ceacutelulas com oito concentraccedilotildees agrave partir das concentraccedilotildees natildeo
citotoacutexicas escolhidas para cada composto e em seguida infectando com DENV sorotipos 1 e
2 nas MOIs estipuladas anteriormente (5 e 2 respectivamente) A porcentagem do efeito
protetor conferida agraves ceacutelulas para cada concentraccedilatildeo de amostra testada foi calculada da
seguinte forma
33
EP = [ (A ndash B) (C ndash B) ] x 100
Onde
A Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas tratadas e infectadas
B Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e infectadas
C Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e natildeo infectadas
Este ensaio tem por objetivo identificar a resposta celular agrave infecccedilatildeo frente ao
tratamento com os compostos em diferentes concentraccedilotildees Assim como o ensaio de
toxicidade este ensaio feito utilizando a teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT permite o teste de vaacuterias
concentraccedilotildees diferentes em um menor tempo e com baixo gasto de material
34
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV1
(MOI=5)
35
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV2
(MOI=2)
36
Takegami et al (1998) demonstraram atividade de furanonaftoquinonas contra o viacuterus
da Encefalite Japonesa (Flavivirus) utilizando a concentraccedilatildeo de 3microgmL poreacutem para os
compostos apresentados avaliados pela teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT nenhuma das
concentraccedilotildees apresentadas produziu efeito antiviral significativo em relaccedilatildeo ao controle
celular como observado nas figuras 12 e 13
Apesar da teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT ser interessante como triagem de atividade
antiviral permitindo o teste de vaacuterias concentraccedilotildees dos compostos em menor tempo e
utilizando uma quantidade razoaacutevel de materiais optou-se por utilizar as maiores
concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas encontradas avaliando sua atividade antiviral por outras
teacutecnicas Como natildeo foi avaliada atividade antiviral preacutevia para nenhum dos compostos frente
agrave infecccedilatildeo por DENV1 e 2 foi selecionado o Dengue virus 1 para dar prosseguimento aos
ensaios
55 Ensaio Virucida
O ensaio virucida foi realizado para avaliar um potencial efeito dos compostos
diretamente sobre a partiacutecula viral Este ensaio eacute importante pois possibilita elucidar se o
composto pode produzir algum efeito sobre a partiacutecula viral impedindo que esta possa infectar
as ceacutelulas
Figura 14 Ensaio virucida Neste ensaio as aliacutequotas de DENV1 foram incubadas com as
concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos e titulados (NT) Controle natildeo tratado
37
Tabela 3 Ensaio virucida Caacutelculo do tiacutetulo viral (UFPmL) e porcentagem representante de
cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 254 x 105 100
DMSO 263 x 105 10335
A1 199 x 105 7835
A2 205 x 105 8071
A3 237 x 105 9311
A4 775 x 104 3049
A5 153 x 105 6024
A6 219 x 105 8602
A7 243 x 105 9547
A8 254 x 105 100
Lagrota et al (1988) demonstraram atividade de 2-HO-3-N-benzil-N(N-benzil-2-
etilamina) -14-naftoquinona sobre a partiacutecula viral de enterovirus De forma contraacuteria apesar
de se verificar a reduccedilatildeo de quase uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais
para o composto A4 natildeo considerou-se esta uma alteraccedilatildeo significativa pois devido agrave
magnitude do nuacutemero de UFPs se trata de uma alteraccedilatildeo muito pequena Portanto os
compostos avaliados neste trabalho natildeo produziram atividade virucida aparente frente ao
tratamento com as concentraccedilotildees de uso
56 Ensaio Antiviral
O sobrenadante de ceacutelulas tratadas previamente e infectadas por DENV1 coletado 48
horas poacutes infecccedilatildeo foi avaliado quanto agrave produccedilatildeo viral de partiacuteculas infecciosas pela
contagem de placas de lise e caacutelculo de Unidades Formadoras de Placa (Titulaccedilatildeo viral em
placa ndash UFPmL)
38
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral Sobrenadante de ceacutelulas tratadas e infectadas por DENV1
coletado apoacutes 48 horas e titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado
Tabela 4 Ensaio Antiviral Coleta do sobrenadante de ceacutelulas infectadas por DENV1 Tiacutetulo
viral (UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o
controle natildeo tratado como 100
Ao perceber um aumento no tiacutetulo viral frente ao tratamento com os compostos A1
A2 e A3 e uma reduccedilatildeo frente ao tratamento com A4 A5 e A6 foram escolhidos dois
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 119 x 105 10000
A1 235 x 105 19748
A2 228 x 105 19160
A3 318 x 105 26723
A4 128 x 104 1076
A5 186 x 103 156
A6 190 x 104 1597
A7 280 x 104 2353
A8 350 x 104 2941
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
40
Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
20
Tabela 1 Relaccedilatildeo de nome estrutura e coacutedigo dos compostos utilizados Na tabela estatildeo
presentes a relaccedilatildeo dos nomes dos compostos utilizados neste trabalho bem como sua
estrutura Os coacutedigos representantes de cada composto seratildeo utilizados no decorrer da escrita
Nome do composto Estrutura Coacutedigo
Lapachol
A1
β-lapachona
A2
2-Hidroxi-3-(ββ-dimetilvinil)-14-naftoquinona
A3
2-Cloro-14-naftoquinona
A4
Lapachol derivado 1
A5
Lapachol derivado 2 A6
Lapachol derivado 3 A7
Lapachol derivado 4 A8
44 Ensaio de citotoxicidade
Para avaliar a citotoxicidade dos compostos ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas foram incubadas com diferentes concentraccedilotildees dos compostos em triplicata num
volume de 200 microL de meio de cultura por poccedilo na presenccedila de 1 de SFB Os controles natildeo
tratados apresentaram adiccedilatildeo de 200 microL de meio de cultura As ceacutelulas foram entatildeo incubadas
durante 72 horas O meio foi removido e 28 microL de soluccedilatildeo de 5 mg mL MTT (brometo de 3-
21
[45-dimetil-tiazol-2-il]-25 difeniltertrazoacutelio) foi adicionado a cada poccedilo As placas foram re-
incubadas durante 1 hora e 30 minutos e entatildeo 122 microL de DMSO foi adicionado a cada poccedilo e
placas foram agitadas suavemente durante 15 minutos para dissolver os cristais de formazan
A absorbacircncia foi lida em um equipamento leitor de placas Victor X3 (PerkinElmer) a 490
nm A concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC 50) foi definida como a concentraccedilatildeo da amostra que
reduziu a viabilidade celular de 50 em comparaccedilatildeo com controles natildeo tratados Os dados
foram analisados utilizando o programa Prisma
45 Avaliaccedilatildeo da viabilidade e crescimento celular por exclusatildeo de azul de tripan
Ceacutelulas BHK-21 foram cultivadas em placas de 24 poccedilos (7x104 ceacutelulaspoccedilo) e apoacutes
24 horas foram tratadas com as concentraccedilotildees de uso de cada composto e incubadas por 72
horas na presenccedila de 1 de SFB A seguir as ceacutelulas foram tripsinizadas e incubadas com
azul de tripan e entatildeo foi utilizado um contador automatizado de ceacutelulas (Countess II FL
Automated Cell Counter ndash Thermo Fisher Scientific) para contagem das ceacutelulas e avaliaccedilatildeo da
porcentagem de viabilidade e diacircmetro celular do controle nos tempos de 0 24 e 96 horas e
avaliaccedilatildeo dos mesmos paracircmetros para os compostos no tempo de 96 horas (72 horas poacutes
tratamento)
Outra curva de multiplicaccedilatildeo celular foi feita para os compostos A1 A3 A4 e A5 onde as
ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos no momento da confecccedilatildeo da placa e
foram avaliados os mesmos paracircmetros nos tempos de 0 12 24 48 e 72 horas O
equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
46 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
Para determinar a menor Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) responsaacutevel pela letalidade
celular total 2x104 de ceacutelulas BHK-21 foram semeadas em placa de 96 poccedilos Apoacutes a
incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o
meio de cultura foi removido e as ceacutelulas foram expostas a diferentes diluiccedilotildees dos dois
sorotipos de DENV (100 microL de cada diluiccedilatildeo + 100 microL de meio DEMEM 1 SFB) As
diluiccedilotildees seriadas foram realizadas da suspensatildeo viral na razatildeo de 5 para o primeiro poccedilo e de
2 para os demais poccedilos Apoacutes 72 horas as ceacutelulas foram entatildeo fixadas com 200 microL de soluccedilatildeo
22
formalina a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo 1 (pv) de cristal violeta em
PBS para avaliaccedilatildeo da maior diluiccedilatildeo responsaacutevel pela letalidade de 100 das ceacutelulas
47 Ensaio Dose-resposta
Para cada composto foram realizados ensaios de dose-resposta para definiccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de cada composto capaz de promover a reduccedilatildeo na produccedilatildeo viral A atividade
antiviral foi avaliada tambeacutem pelo meacutetodo de MTT Ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas expostas a diferentes concentraccedilotildees dos extratos determinadas a partir das maiores
concentraccedilotildees em que natildeo foram observados efeitos citotoacutexicos As ceacutelulas foram tratadas
com as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de cada composto e em seguida infectadas com DENV
1 (MOI= 5) ou 2 (MOI= 2) Mantendo uma coluna para controle com DMSO uma coluna
para controle de viacuterus uma coluna para controle de citotoxicidade dos compostos e por fim
uma coluna para controle celular As ceacutelulas foram entatildeo incubadas durante 72 horas Apoacutes
este tempo procedeu-se a leitura pelo ensaio de MTT como descrito anteriormente Os dados
foram analisados levando-se em consideraccedilatildeo a leitura das absorbacircncias dos poccedilos dos
controles de viacuterus e do controle celular
Para realizacao destes experimentos os seguintes controles foram adotados
Controle de ceacutelulas poccedilos contendo somente ceacutelulas acrescidas do meio de cultura DMEM
1 SFB Utilizado para avaliar o comportamento das ceacutelulas sem que as mesmas tivessem
contato com qualquer interferente durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo Com isso os poccedilos
reservados para esse controle serviram de padratildeo para comparaccedilatildeo com aqueles em que fosse
observada atividade citotoacutexica ou citopaacutetica
Controle de viacuterus poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM 1 SFB
sem nenhum tratamento e de suspensatildeo de viacuterus Utilizando como referecircncia para anaacutelise da
atividade citopaacutetica provocada pelo viacuterus testado durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo das placas
23
Controle de viacuterus com DMSO Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura
DMEM 1 SFB e DMSO Foi utilizado para avaliar se havia influecircncia prejudicial do
solvente utilizado para diluiccedilatildeo das amostras no meio de cultivo das ceacutelulas e se o mesmo
poderia apresentar alguma potencial atividade antiviral aparente
Controle de citotoxicidade Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM
1 SFB e as quatro principais concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos Foi utilizado
para avaliar se haveria alguma possiacutevel atividade citotoacutexica das concentraccedilotildees dos compostos
em relaccedilatildeo agraves ceacutelulas
48 Ensaio Virucida
Para a realizaccedilatildeo deste ensaio aliacutequotas de 950 microL (diluiccedilatildeo de 20 vezes) do DENV 1 (tiacutetulo
6 x 107 UFPmL) foram incubadas com 50 microL de uma soluccedilatildeo de meio DMEM preparada
com 20x a concentraccedilatildeo natildeo citotoacutexica de cada composto A1 a A8 em banho-maria 37deg C
por 1 hora Apoacutes a incubaccedilatildeo as aliacutequotas foram imediatamente tituladas em ceacutelulas BHK-21
em placas de 6 poccedilos utilizando-se 3 diluiccedilotildees para cada incubaccedilatildeo (20x 20 x 10-1
e 20 x 10-
2) Foram titulados tambeacutem uma aliacutequota incubada apenas com meio DMEM sem nenhum
tratamento e outra aliacutequota incubada com DMSO (Dimetilsulfoacutexido) Estas foram tituladas
utilizando um controle e mais cinco diluiccedilotildees (20x 20 x 10-1
20 x 10-2
20 x 10-3
e 20 x 10-4
)
49 Ensaio antiviral
Neste ensaio ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em placas de 24 poccedilos no dia
seguinte foram tratadas durante 4 horas com as concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas de cada
composto em duplicata Apoacutes o preacute-tratamento as monocamadas foram infectadas com
DENV-1 a uma MOI=5 na presenccedila das concentraccedilotildees de uso respectivas de cada composto
Apoacutes 1 hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus as monocamadas foram lavadas duas vezes com PBS e
foi adicionado 500 microL por poccedilo de meio preparado com as mesmas concentraccedilotildees dos
diferentes compostos e mantidos durante 48 horas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5 Em
quatro poccedilos as ceacutelulas foram infectadas e natildeo tratadas e em outros quatro poccedilos as ceacutelulas
natildeo foram tratadas e nem infectadas (controle de ceacutelulas) destes uacuteltimos dois foram
tripsinizados e contados no momento da infecccedilatildeo e os outros dois apoacutes o teacutermino do ensaio
24
para avaliar o crescimento celular Decorridas as 48 horas o sobrenadante foi coletado e
centrifugado por 10 minutos a 4000 xG para separaccedilatildeo dos debris celulares e prontamente
titulado em placa de 6 poccedilos
410 Anaacutelise estatiacutestica
Os valores de CC50 foram obtidos a partir de anaacutelise de regressatildeo linear das curvas de
concentraccedilatildeocitotoxicidade A anaacutelise estatiacutestica dos dados foi realizada pelo programa
GraphPad Prism software Uma anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi utilizada para determinar
as diferenccedilas estatiacutesticas seguida do poacutes teste de Tukey A significacircncia estatiacutestica foi fixada
em p lt005
25
V RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
26
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Ensaio de citotoxicidade celular
Para avaliar a viabilidade da linhagem celular BHK-21 frente ao tratamento com oito
diferentes concentraccedilotildees dos compostos (A1 a A8) realizou-se um ensaio de MTT (brometo
de 3-[45-dimetil-tiazol-2-il]-25-difeniltetrazoacutelio) Este ensaio tem o objetivo de quantificar
espectrofotometricamente o crescimento celular a viabilidade e proliferaccedilatildeo podendo ser
utilizado como um indicador direto de citotoxicidade Trata-se de um ensaio colorimeacutetrico
para medir a atividade da redutase mitocondrial em ceacutelulas vivas Ele se baseia na reduccedilatildeo do
sal amarelo tetrazoacutelio (permeaacutevel agrave membrana celular) para cristais de formazan azuis
puacuterpura por ceacutelulas metabolicamente ativas a quantidade de formazan gerada medida por
espectrofotometria eacute proporcional ao nuacutemero de ceacutelulas viaacuteveis
A CC50 foi calculada plotando-se uma curva de porcentagem de viabilidade celular por
concentraccedilatildeo melhor representada na figura 7 pelo composto A7 e os resultados de CC50
para todos os compostos estatildeo representados na tabela 2 Foram feitos ensaios de
citotoxicidade com oito concentraccedilotildees diferentes sendo escolhida a maior concentraccedilatildeo que
natildeo apresentou citotoxicidade
Viabilidade Celular = [ ( A ndash B ) A ] x 100
Onde
A = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas natildeo tratadas
B = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas tratadas com
as respectivas concentraccedilotildees de cada composto
27
28
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (A curva dose resposta do composto A7 eacute a que
melhor representa a curva dose resposta esperada) Avaliou-se a viabilidade da linhagem
celular BHK-21 frente agrave diferentes concentraccedilotildees dos compostos realizando o ensaio de MTT
e determinando assim as concentraccedilotildees a serem utilizadas nos proacuteximos ensaios bem como
calculando a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) agrave partir da curva
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo
da concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50)
Composto Concentraccedilatildeo utilizada
[ ] microgmL
Concentraccedilatildeo citotoacutexica 50
(CC50) [ ] microgmL plusmn Desvio
Padratildeo
A1 ([ ]=1 mgmL) 00200 10010 plusmn 0014
A2 ([ ]=1 mgmL) 00025 09561 plusmn 0023
A3 ([ ]=1 mgmL) 00025 09988 plusmn 0017
A4 ([ ]=5 mgmL) 00125 10150 plusmn 0036
A5 ([ ]=10 mgmL) 00250 10590 plusmn 0047
A6 ([ ]=5 mgmL) 00250 08183 plusmn 0030
A7 ([ ]=5 mgmL) 00125 10280 plusmn 0052
A8 ([ ]=5 mgmL) 00125 09758 plusmn 0036
52 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan
Para corroborar o ensaio anterior de citotoxicidade utilizou -se o teste de viabilidade
celular pela teacutecnica da exclusatildeo do azul de tripan com a finalidade de determinar a
viabilidade das ceacutelulas Os procedimentos adotados no ensaio seguiram o manual do
equipamento contador automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL Automated Cell Counter) entatildeo
foi acrescentado agrave 10 microL da suspensatildeo celular 10 microL de azul de tripan (04) Apoacutes
homogeneizaccedilatildeo 10 microL da suspensatildeo foi colocada no local indicado da lacircmina proacutepria para
leitura e foi realizada a contagem sendo consideradas mortas (inviaacuteveis) as ceacutelulas que
incorporavam o corante e viaacuteveis as que excluiacuteam o azul de tripan
29
O equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
(A)
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan A avaliaccedilatildeo da
viabilidade celular foi realizada atraveacutes de um contador automaacutetico de ceacutelulas Este
equipamento possibilita explorar ferramentas de fotografia e avaliar alguns paracircmetros
importantes (A) fotografia das ceacutelulas (B) Zoom na fotografia das ceacutelulas com marcaccedilotildees
(em verde para ceacutelulas vivas e vermelho para mortas) e (D) contagem das ceacutelulas totais
ceacutelulas vivas e mortas graacutefico e meacutedia dos diacircmetros celulares das ceacutelulas vivas e mortas
(B)
(C)
30
O crescimento celular de ceacutelulas natildeo tratadas foi avaliado nos tempos de 0h (momento
da confecccedilatildeo da placa) 24h (momento de tratamento com os compostos) e 96 horas
(Momento em que todas as ceacutelulas foram tripsinizadas e contadas) para avaliar o perfil do
crescimento celular em ceacutelulas natildeo tratadas Foi observado um crescimento celular no periacuteodo
de 24 horas onde as ceacutelulas estavam incubadas com meio acrescido de 10 SFB Em 24
horas o meio foi trocado por 1 SFB e acrescido das substacircncias testes nas menores diluiccedilotildees
natildeo citotoacutexicas determinadas pelo ensaio do MTT Em 96 horas pode ser observado um
decaimento no nuacutemero de ceacutelulas vivas provavelmente devido ao crescimento celular (morte
por confluecircncia)
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas)
(A) (B)
31
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas (A)
Contagem de ceacutelulas vivas (B) Percentual de ceacutelulas viaacuteveis (Viabilidade celular ) e (C)
Meacutedia do diacircmetro apresentado pelas ceacutelulas vivas
Em 96 horas as ceacutelulas natildeo tratadas bem como as ceacutelulas tratadas por 72 horas com as
concentraccedilotildees de uso dos compostos foram tripsinizadas e avaliadas quanto ao nuacutemero de
ceacutelulas vivas viabilidade e diacircmetro celular apresentados na figura 10
Segundo se observa natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo aparente que possa demonstrar que
as concentraccedilotildees de uso dos compostos tenham causado alguma atividade citotoacutexica
corroborando assim os ensaios de citotoxicidade anteriores
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
A infectividade de um viacuterus depende de vaacuterios fatores entre eles da proporccedilatildeo de
partiacuteculas virais completas ou infecciosas da suscetibilidade da ceacutelula hospedeira e da
chance desta partiacutecula encontrar o receptor e penetrar na ceacutelula Quando ceacutelulas suscetiacuteveis
satildeo misturadas com uma suspensatildeo de viacuterus estas podem receber uma duas trecircs ou dez
partiacuteculas virais ou nenhuma Isto depende da proporccedilatildeo entre a quantidade de viacuterus
infecciosos presente no inoculo e a quantidade de ceacutelulas utilizada Esta relaccedilatildeo eacute denominada
de multiplicidade de infecccedilatildeo ou MOI Uma MOI=1 indica que a infecccedilatildeo foi feita em
principio com 1 viacuterus ou 1 dose infectante por ceacutelula
A determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo dos Dengue virus 1 e 2 a serem
utilizadas nos proacuteximos ensaios foi feita a partir da infecccedilatildeo de ceacutelulas BHK-21 por diferentes
(C)
32
concentraccedilotildees de viacuterus e revelaccedilatildeo com cristal violeta Escolheu-se a maior diluiccedilatildeo viral que
possibilitou a letalidade total das ceacutelulas (faixa onde todas as ceacutelulas estatildeo mortas utilizando
menor concentraccedilatildeo de viacuterus) As faixas escolhidas foram entatildeo calculadas levando-se em
consideraccedilatildeo o nuacutemero de ceacutelulas presentes no poccedilo e o nuacutemero de partiacuteculas virais que foram
adicionadas (Faixa3 para DENV2 e 2 para DENV1) Figura 11 Foi estipulado portanto a
Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 2 para DENV 2 e 5 para DENV 1
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI A partir da infecccedilatildeo da linhagem celular BHK-21 em
placa de 96 poccedilos com diferentes diluiccedilotildees de DENV foi determinado que a Multiplicidade
de infecccedilatildeo para o Dengue viacuterus sorotipos 1 e 2 seria de 5 e 2 respectivamente (colunas 2 -
DENV1 e 3 - DENV2)
54 Ensaio dose resposta
Apoacutes a determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas ideais realizou-se um
ensaio dose resposta tratando as ceacutelulas com oito concentraccedilotildees agrave partir das concentraccedilotildees natildeo
citotoacutexicas escolhidas para cada composto e em seguida infectando com DENV sorotipos 1 e
2 nas MOIs estipuladas anteriormente (5 e 2 respectivamente) A porcentagem do efeito
protetor conferida agraves ceacutelulas para cada concentraccedilatildeo de amostra testada foi calculada da
seguinte forma
33
EP = [ (A ndash B) (C ndash B) ] x 100
Onde
A Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas tratadas e infectadas
B Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e infectadas
C Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e natildeo infectadas
Este ensaio tem por objetivo identificar a resposta celular agrave infecccedilatildeo frente ao
tratamento com os compostos em diferentes concentraccedilotildees Assim como o ensaio de
toxicidade este ensaio feito utilizando a teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT permite o teste de vaacuterias
concentraccedilotildees diferentes em um menor tempo e com baixo gasto de material
34
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV1
(MOI=5)
35
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV2
(MOI=2)
36
Takegami et al (1998) demonstraram atividade de furanonaftoquinonas contra o viacuterus
da Encefalite Japonesa (Flavivirus) utilizando a concentraccedilatildeo de 3microgmL poreacutem para os
compostos apresentados avaliados pela teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT nenhuma das
concentraccedilotildees apresentadas produziu efeito antiviral significativo em relaccedilatildeo ao controle
celular como observado nas figuras 12 e 13
Apesar da teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT ser interessante como triagem de atividade
antiviral permitindo o teste de vaacuterias concentraccedilotildees dos compostos em menor tempo e
utilizando uma quantidade razoaacutevel de materiais optou-se por utilizar as maiores
concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas encontradas avaliando sua atividade antiviral por outras
teacutecnicas Como natildeo foi avaliada atividade antiviral preacutevia para nenhum dos compostos frente
agrave infecccedilatildeo por DENV1 e 2 foi selecionado o Dengue virus 1 para dar prosseguimento aos
ensaios
55 Ensaio Virucida
O ensaio virucida foi realizado para avaliar um potencial efeito dos compostos
diretamente sobre a partiacutecula viral Este ensaio eacute importante pois possibilita elucidar se o
composto pode produzir algum efeito sobre a partiacutecula viral impedindo que esta possa infectar
as ceacutelulas
Figura 14 Ensaio virucida Neste ensaio as aliacutequotas de DENV1 foram incubadas com as
concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos e titulados (NT) Controle natildeo tratado
37
Tabela 3 Ensaio virucida Caacutelculo do tiacutetulo viral (UFPmL) e porcentagem representante de
cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 254 x 105 100
DMSO 263 x 105 10335
A1 199 x 105 7835
A2 205 x 105 8071
A3 237 x 105 9311
A4 775 x 104 3049
A5 153 x 105 6024
A6 219 x 105 8602
A7 243 x 105 9547
A8 254 x 105 100
Lagrota et al (1988) demonstraram atividade de 2-HO-3-N-benzil-N(N-benzil-2-
etilamina) -14-naftoquinona sobre a partiacutecula viral de enterovirus De forma contraacuteria apesar
de se verificar a reduccedilatildeo de quase uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais
para o composto A4 natildeo considerou-se esta uma alteraccedilatildeo significativa pois devido agrave
magnitude do nuacutemero de UFPs se trata de uma alteraccedilatildeo muito pequena Portanto os
compostos avaliados neste trabalho natildeo produziram atividade virucida aparente frente ao
tratamento com as concentraccedilotildees de uso
56 Ensaio Antiviral
O sobrenadante de ceacutelulas tratadas previamente e infectadas por DENV1 coletado 48
horas poacutes infecccedilatildeo foi avaliado quanto agrave produccedilatildeo viral de partiacuteculas infecciosas pela
contagem de placas de lise e caacutelculo de Unidades Formadoras de Placa (Titulaccedilatildeo viral em
placa ndash UFPmL)
38
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral Sobrenadante de ceacutelulas tratadas e infectadas por DENV1
coletado apoacutes 48 horas e titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado
Tabela 4 Ensaio Antiviral Coleta do sobrenadante de ceacutelulas infectadas por DENV1 Tiacutetulo
viral (UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o
controle natildeo tratado como 100
Ao perceber um aumento no tiacutetulo viral frente ao tratamento com os compostos A1
A2 e A3 e uma reduccedilatildeo frente ao tratamento com A4 A5 e A6 foram escolhidos dois
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 119 x 105 10000
A1 235 x 105 19748
A2 228 x 105 19160
A3 318 x 105 26723
A4 128 x 104 1076
A5 186 x 103 156
A6 190 x 104 1597
A7 280 x 104 2353
A8 350 x 104 2941
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
40
Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
21
[45-dimetil-tiazol-2-il]-25 difeniltertrazoacutelio) foi adicionado a cada poccedilo As placas foram re-
incubadas durante 1 hora e 30 minutos e entatildeo 122 microL de DMSO foi adicionado a cada poccedilo e
placas foram agitadas suavemente durante 15 minutos para dissolver os cristais de formazan
A absorbacircncia foi lida em um equipamento leitor de placas Victor X3 (PerkinElmer) a 490
nm A concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC 50) foi definida como a concentraccedilatildeo da amostra que
reduziu a viabilidade celular de 50 em comparaccedilatildeo com controles natildeo tratados Os dados
foram analisados utilizando o programa Prisma
45 Avaliaccedilatildeo da viabilidade e crescimento celular por exclusatildeo de azul de tripan
Ceacutelulas BHK-21 foram cultivadas em placas de 24 poccedilos (7x104 ceacutelulaspoccedilo) e apoacutes
24 horas foram tratadas com as concentraccedilotildees de uso de cada composto e incubadas por 72
horas na presenccedila de 1 de SFB A seguir as ceacutelulas foram tripsinizadas e incubadas com
azul de tripan e entatildeo foi utilizado um contador automatizado de ceacutelulas (Countess II FL
Automated Cell Counter ndash Thermo Fisher Scientific) para contagem das ceacutelulas e avaliaccedilatildeo da
porcentagem de viabilidade e diacircmetro celular do controle nos tempos de 0 24 e 96 horas e
avaliaccedilatildeo dos mesmos paracircmetros para os compostos no tempo de 96 horas (72 horas poacutes
tratamento)
Outra curva de multiplicaccedilatildeo celular foi feita para os compostos A1 A3 A4 e A5 onde as
ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos no momento da confecccedilatildeo da placa e
foram avaliados os mesmos paracircmetros nos tempos de 0 12 24 48 e 72 horas O
equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
46 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
Para determinar a menor Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) responsaacutevel pela letalidade
celular total 2x104 de ceacutelulas BHK-21 foram semeadas em placa de 96 poccedilos Apoacutes a
incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o
meio de cultura foi removido e as ceacutelulas foram expostas a diferentes diluiccedilotildees dos dois
sorotipos de DENV (100 microL de cada diluiccedilatildeo + 100 microL de meio DEMEM 1 SFB) As
diluiccedilotildees seriadas foram realizadas da suspensatildeo viral na razatildeo de 5 para o primeiro poccedilo e de
2 para os demais poccedilos Apoacutes 72 horas as ceacutelulas foram entatildeo fixadas com 200 microL de soluccedilatildeo
22
formalina a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo 1 (pv) de cristal violeta em
PBS para avaliaccedilatildeo da maior diluiccedilatildeo responsaacutevel pela letalidade de 100 das ceacutelulas
47 Ensaio Dose-resposta
Para cada composto foram realizados ensaios de dose-resposta para definiccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de cada composto capaz de promover a reduccedilatildeo na produccedilatildeo viral A atividade
antiviral foi avaliada tambeacutem pelo meacutetodo de MTT Ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas expostas a diferentes concentraccedilotildees dos extratos determinadas a partir das maiores
concentraccedilotildees em que natildeo foram observados efeitos citotoacutexicos As ceacutelulas foram tratadas
com as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de cada composto e em seguida infectadas com DENV
1 (MOI= 5) ou 2 (MOI= 2) Mantendo uma coluna para controle com DMSO uma coluna
para controle de viacuterus uma coluna para controle de citotoxicidade dos compostos e por fim
uma coluna para controle celular As ceacutelulas foram entatildeo incubadas durante 72 horas Apoacutes
este tempo procedeu-se a leitura pelo ensaio de MTT como descrito anteriormente Os dados
foram analisados levando-se em consideraccedilatildeo a leitura das absorbacircncias dos poccedilos dos
controles de viacuterus e do controle celular
Para realizacao destes experimentos os seguintes controles foram adotados
Controle de ceacutelulas poccedilos contendo somente ceacutelulas acrescidas do meio de cultura DMEM
1 SFB Utilizado para avaliar o comportamento das ceacutelulas sem que as mesmas tivessem
contato com qualquer interferente durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo Com isso os poccedilos
reservados para esse controle serviram de padratildeo para comparaccedilatildeo com aqueles em que fosse
observada atividade citotoacutexica ou citopaacutetica
Controle de viacuterus poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM 1 SFB
sem nenhum tratamento e de suspensatildeo de viacuterus Utilizando como referecircncia para anaacutelise da
atividade citopaacutetica provocada pelo viacuterus testado durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo das placas
23
Controle de viacuterus com DMSO Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura
DMEM 1 SFB e DMSO Foi utilizado para avaliar se havia influecircncia prejudicial do
solvente utilizado para diluiccedilatildeo das amostras no meio de cultivo das ceacutelulas e se o mesmo
poderia apresentar alguma potencial atividade antiviral aparente
Controle de citotoxicidade Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM
1 SFB e as quatro principais concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos Foi utilizado
para avaliar se haveria alguma possiacutevel atividade citotoacutexica das concentraccedilotildees dos compostos
em relaccedilatildeo agraves ceacutelulas
48 Ensaio Virucida
Para a realizaccedilatildeo deste ensaio aliacutequotas de 950 microL (diluiccedilatildeo de 20 vezes) do DENV 1 (tiacutetulo
6 x 107 UFPmL) foram incubadas com 50 microL de uma soluccedilatildeo de meio DMEM preparada
com 20x a concentraccedilatildeo natildeo citotoacutexica de cada composto A1 a A8 em banho-maria 37deg C
por 1 hora Apoacutes a incubaccedilatildeo as aliacutequotas foram imediatamente tituladas em ceacutelulas BHK-21
em placas de 6 poccedilos utilizando-se 3 diluiccedilotildees para cada incubaccedilatildeo (20x 20 x 10-1
e 20 x 10-
2) Foram titulados tambeacutem uma aliacutequota incubada apenas com meio DMEM sem nenhum
tratamento e outra aliacutequota incubada com DMSO (Dimetilsulfoacutexido) Estas foram tituladas
utilizando um controle e mais cinco diluiccedilotildees (20x 20 x 10-1
20 x 10-2
20 x 10-3
e 20 x 10-4
)
49 Ensaio antiviral
Neste ensaio ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em placas de 24 poccedilos no dia
seguinte foram tratadas durante 4 horas com as concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas de cada
composto em duplicata Apoacutes o preacute-tratamento as monocamadas foram infectadas com
DENV-1 a uma MOI=5 na presenccedila das concentraccedilotildees de uso respectivas de cada composto
Apoacutes 1 hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus as monocamadas foram lavadas duas vezes com PBS e
foi adicionado 500 microL por poccedilo de meio preparado com as mesmas concentraccedilotildees dos
diferentes compostos e mantidos durante 48 horas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5 Em
quatro poccedilos as ceacutelulas foram infectadas e natildeo tratadas e em outros quatro poccedilos as ceacutelulas
natildeo foram tratadas e nem infectadas (controle de ceacutelulas) destes uacuteltimos dois foram
tripsinizados e contados no momento da infecccedilatildeo e os outros dois apoacutes o teacutermino do ensaio
24
para avaliar o crescimento celular Decorridas as 48 horas o sobrenadante foi coletado e
centrifugado por 10 minutos a 4000 xG para separaccedilatildeo dos debris celulares e prontamente
titulado em placa de 6 poccedilos
410 Anaacutelise estatiacutestica
Os valores de CC50 foram obtidos a partir de anaacutelise de regressatildeo linear das curvas de
concentraccedilatildeocitotoxicidade A anaacutelise estatiacutestica dos dados foi realizada pelo programa
GraphPad Prism software Uma anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi utilizada para determinar
as diferenccedilas estatiacutesticas seguida do poacutes teste de Tukey A significacircncia estatiacutestica foi fixada
em p lt005
25
V RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
26
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Ensaio de citotoxicidade celular
Para avaliar a viabilidade da linhagem celular BHK-21 frente ao tratamento com oito
diferentes concentraccedilotildees dos compostos (A1 a A8) realizou-se um ensaio de MTT (brometo
de 3-[45-dimetil-tiazol-2-il]-25-difeniltetrazoacutelio) Este ensaio tem o objetivo de quantificar
espectrofotometricamente o crescimento celular a viabilidade e proliferaccedilatildeo podendo ser
utilizado como um indicador direto de citotoxicidade Trata-se de um ensaio colorimeacutetrico
para medir a atividade da redutase mitocondrial em ceacutelulas vivas Ele se baseia na reduccedilatildeo do
sal amarelo tetrazoacutelio (permeaacutevel agrave membrana celular) para cristais de formazan azuis
puacuterpura por ceacutelulas metabolicamente ativas a quantidade de formazan gerada medida por
espectrofotometria eacute proporcional ao nuacutemero de ceacutelulas viaacuteveis
A CC50 foi calculada plotando-se uma curva de porcentagem de viabilidade celular por
concentraccedilatildeo melhor representada na figura 7 pelo composto A7 e os resultados de CC50
para todos os compostos estatildeo representados na tabela 2 Foram feitos ensaios de
citotoxicidade com oito concentraccedilotildees diferentes sendo escolhida a maior concentraccedilatildeo que
natildeo apresentou citotoxicidade
Viabilidade Celular = [ ( A ndash B ) A ] x 100
Onde
A = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas natildeo tratadas
B = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas tratadas com
as respectivas concentraccedilotildees de cada composto
27
28
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (A curva dose resposta do composto A7 eacute a que
melhor representa a curva dose resposta esperada) Avaliou-se a viabilidade da linhagem
celular BHK-21 frente agrave diferentes concentraccedilotildees dos compostos realizando o ensaio de MTT
e determinando assim as concentraccedilotildees a serem utilizadas nos proacuteximos ensaios bem como
calculando a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) agrave partir da curva
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo
da concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50)
Composto Concentraccedilatildeo utilizada
[ ] microgmL
Concentraccedilatildeo citotoacutexica 50
(CC50) [ ] microgmL plusmn Desvio
Padratildeo
A1 ([ ]=1 mgmL) 00200 10010 plusmn 0014
A2 ([ ]=1 mgmL) 00025 09561 plusmn 0023
A3 ([ ]=1 mgmL) 00025 09988 plusmn 0017
A4 ([ ]=5 mgmL) 00125 10150 plusmn 0036
A5 ([ ]=10 mgmL) 00250 10590 plusmn 0047
A6 ([ ]=5 mgmL) 00250 08183 plusmn 0030
A7 ([ ]=5 mgmL) 00125 10280 plusmn 0052
A8 ([ ]=5 mgmL) 00125 09758 plusmn 0036
52 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan
Para corroborar o ensaio anterior de citotoxicidade utilizou -se o teste de viabilidade
celular pela teacutecnica da exclusatildeo do azul de tripan com a finalidade de determinar a
viabilidade das ceacutelulas Os procedimentos adotados no ensaio seguiram o manual do
equipamento contador automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL Automated Cell Counter) entatildeo
foi acrescentado agrave 10 microL da suspensatildeo celular 10 microL de azul de tripan (04) Apoacutes
homogeneizaccedilatildeo 10 microL da suspensatildeo foi colocada no local indicado da lacircmina proacutepria para
leitura e foi realizada a contagem sendo consideradas mortas (inviaacuteveis) as ceacutelulas que
incorporavam o corante e viaacuteveis as que excluiacuteam o azul de tripan
29
O equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
(A)
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan A avaliaccedilatildeo da
viabilidade celular foi realizada atraveacutes de um contador automaacutetico de ceacutelulas Este
equipamento possibilita explorar ferramentas de fotografia e avaliar alguns paracircmetros
importantes (A) fotografia das ceacutelulas (B) Zoom na fotografia das ceacutelulas com marcaccedilotildees
(em verde para ceacutelulas vivas e vermelho para mortas) e (D) contagem das ceacutelulas totais
ceacutelulas vivas e mortas graacutefico e meacutedia dos diacircmetros celulares das ceacutelulas vivas e mortas
(B)
(C)
30
O crescimento celular de ceacutelulas natildeo tratadas foi avaliado nos tempos de 0h (momento
da confecccedilatildeo da placa) 24h (momento de tratamento com os compostos) e 96 horas
(Momento em que todas as ceacutelulas foram tripsinizadas e contadas) para avaliar o perfil do
crescimento celular em ceacutelulas natildeo tratadas Foi observado um crescimento celular no periacuteodo
de 24 horas onde as ceacutelulas estavam incubadas com meio acrescido de 10 SFB Em 24
horas o meio foi trocado por 1 SFB e acrescido das substacircncias testes nas menores diluiccedilotildees
natildeo citotoacutexicas determinadas pelo ensaio do MTT Em 96 horas pode ser observado um
decaimento no nuacutemero de ceacutelulas vivas provavelmente devido ao crescimento celular (morte
por confluecircncia)
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas)
(A) (B)
31
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas (A)
Contagem de ceacutelulas vivas (B) Percentual de ceacutelulas viaacuteveis (Viabilidade celular ) e (C)
Meacutedia do diacircmetro apresentado pelas ceacutelulas vivas
Em 96 horas as ceacutelulas natildeo tratadas bem como as ceacutelulas tratadas por 72 horas com as
concentraccedilotildees de uso dos compostos foram tripsinizadas e avaliadas quanto ao nuacutemero de
ceacutelulas vivas viabilidade e diacircmetro celular apresentados na figura 10
Segundo se observa natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo aparente que possa demonstrar que
as concentraccedilotildees de uso dos compostos tenham causado alguma atividade citotoacutexica
corroborando assim os ensaios de citotoxicidade anteriores
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
A infectividade de um viacuterus depende de vaacuterios fatores entre eles da proporccedilatildeo de
partiacuteculas virais completas ou infecciosas da suscetibilidade da ceacutelula hospedeira e da
chance desta partiacutecula encontrar o receptor e penetrar na ceacutelula Quando ceacutelulas suscetiacuteveis
satildeo misturadas com uma suspensatildeo de viacuterus estas podem receber uma duas trecircs ou dez
partiacuteculas virais ou nenhuma Isto depende da proporccedilatildeo entre a quantidade de viacuterus
infecciosos presente no inoculo e a quantidade de ceacutelulas utilizada Esta relaccedilatildeo eacute denominada
de multiplicidade de infecccedilatildeo ou MOI Uma MOI=1 indica que a infecccedilatildeo foi feita em
principio com 1 viacuterus ou 1 dose infectante por ceacutelula
A determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo dos Dengue virus 1 e 2 a serem
utilizadas nos proacuteximos ensaios foi feita a partir da infecccedilatildeo de ceacutelulas BHK-21 por diferentes
(C)
32
concentraccedilotildees de viacuterus e revelaccedilatildeo com cristal violeta Escolheu-se a maior diluiccedilatildeo viral que
possibilitou a letalidade total das ceacutelulas (faixa onde todas as ceacutelulas estatildeo mortas utilizando
menor concentraccedilatildeo de viacuterus) As faixas escolhidas foram entatildeo calculadas levando-se em
consideraccedilatildeo o nuacutemero de ceacutelulas presentes no poccedilo e o nuacutemero de partiacuteculas virais que foram
adicionadas (Faixa3 para DENV2 e 2 para DENV1) Figura 11 Foi estipulado portanto a
Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 2 para DENV 2 e 5 para DENV 1
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI A partir da infecccedilatildeo da linhagem celular BHK-21 em
placa de 96 poccedilos com diferentes diluiccedilotildees de DENV foi determinado que a Multiplicidade
de infecccedilatildeo para o Dengue viacuterus sorotipos 1 e 2 seria de 5 e 2 respectivamente (colunas 2 -
DENV1 e 3 - DENV2)
54 Ensaio dose resposta
Apoacutes a determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas ideais realizou-se um
ensaio dose resposta tratando as ceacutelulas com oito concentraccedilotildees agrave partir das concentraccedilotildees natildeo
citotoacutexicas escolhidas para cada composto e em seguida infectando com DENV sorotipos 1 e
2 nas MOIs estipuladas anteriormente (5 e 2 respectivamente) A porcentagem do efeito
protetor conferida agraves ceacutelulas para cada concentraccedilatildeo de amostra testada foi calculada da
seguinte forma
33
EP = [ (A ndash B) (C ndash B) ] x 100
Onde
A Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas tratadas e infectadas
B Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e infectadas
C Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e natildeo infectadas
Este ensaio tem por objetivo identificar a resposta celular agrave infecccedilatildeo frente ao
tratamento com os compostos em diferentes concentraccedilotildees Assim como o ensaio de
toxicidade este ensaio feito utilizando a teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT permite o teste de vaacuterias
concentraccedilotildees diferentes em um menor tempo e com baixo gasto de material
34
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV1
(MOI=5)
35
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV2
(MOI=2)
36
Takegami et al (1998) demonstraram atividade de furanonaftoquinonas contra o viacuterus
da Encefalite Japonesa (Flavivirus) utilizando a concentraccedilatildeo de 3microgmL poreacutem para os
compostos apresentados avaliados pela teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT nenhuma das
concentraccedilotildees apresentadas produziu efeito antiviral significativo em relaccedilatildeo ao controle
celular como observado nas figuras 12 e 13
Apesar da teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT ser interessante como triagem de atividade
antiviral permitindo o teste de vaacuterias concentraccedilotildees dos compostos em menor tempo e
utilizando uma quantidade razoaacutevel de materiais optou-se por utilizar as maiores
concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas encontradas avaliando sua atividade antiviral por outras
teacutecnicas Como natildeo foi avaliada atividade antiviral preacutevia para nenhum dos compostos frente
agrave infecccedilatildeo por DENV1 e 2 foi selecionado o Dengue virus 1 para dar prosseguimento aos
ensaios
55 Ensaio Virucida
O ensaio virucida foi realizado para avaliar um potencial efeito dos compostos
diretamente sobre a partiacutecula viral Este ensaio eacute importante pois possibilita elucidar se o
composto pode produzir algum efeito sobre a partiacutecula viral impedindo que esta possa infectar
as ceacutelulas
Figura 14 Ensaio virucida Neste ensaio as aliacutequotas de DENV1 foram incubadas com as
concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos e titulados (NT) Controle natildeo tratado
37
Tabela 3 Ensaio virucida Caacutelculo do tiacutetulo viral (UFPmL) e porcentagem representante de
cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 254 x 105 100
DMSO 263 x 105 10335
A1 199 x 105 7835
A2 205 x 105 8071
A3 237 x 105 9311
A4 775 x 104 3049
A5 153 x 105 6024
A6 219 x 105 8602
A7 243 x 105 9547
A8 254 x 105 100
Lagrota et al (1988) demonstraram atividade de 2-HO-3-N-benzil-N(N-benzil-2-
etilamina) -14-naftoquinona sobre a partiacutecula viral de enterovirus De forma contraacuteria apesar
de se verificar a reduccedilatildeo de quase uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais
para o composto A4 natildeo considerou-se esta uma alteraccedilatildeo significativa pois devido agrave
magnitude do nuacutemero de UFPs se trata de uma alteraccedilatildeo muito pequena Portanto os
compostos avaliados neste trabalho natildeo produziram atividade virucida aparente frente ao
tratamento com as concentraccedilotildees de uso
56 Ensaio Antiviral
O sobrenadante de ceacutelulas tratadas previamente e infectadas por DENV1 coletado 48
horas poacutes infecccedilatildeo foi avaliado quanto agrave produccedilatildeo viral de partiacuteculas infecciosas pela
contagem de placas de lise e caacutelculo de Unidades Formadoras de Placa (Titulaccedilatildeo viral em
placa ndash UFPmL)
38
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral Sobrenadante de ceacutelulas tratadas e infectadas por DENV1
coletado apoacutes 48 horas e titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado
Tabela 4 Ensaio Antiviral Coleta do sobrenadante de ceacutelulas infectadas por DENV1 Tiacutetulo
viral (UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o
controle natildeo tratado como 100
Ao perceber um aumento no tiacutetulo viral frente ao tratamento com os compostos A1
A2 e A3 e uma reduccedilatildeo frente ao tratamento com A4 A5 e A6 foram escolhidos dois
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 119 x 105 10000
A1 235 x 105 19748
A2 228 x 105 19160
A3 318 x 105 26723
A4 128 x 104 1076
A5 186 x 103 156
A6 190 x 104 1597
A7 280 x 104 2353
A8 350 x 104 2941
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
40
Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
22
formalina a 10 por 1 hora e coradas com soluccedilatildeo contendo 1 (pv) de cristal violeta em
PBS para avaliaccedilatildeo da maior diluiccedilatildeo responsaacutevel pela letalidade de 100 das ceacutelulas
47 Ensaio Dose-resposta
Para cada composto foram realizados ensaios de dose-resposta para definiccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de cada composto capaz de promover a reduccedilatildeo na produccedilatildeo viral A atividade
antiviral foi avaliada tambeacutem pelo meacutetodo de MTT Ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em
placas de 96 poccedilos em 2x104 ceacutelulaspoccedilo Apoacutes a incubaccedilatildeo de 24 horas utilizando as
condiccedilotildees de crescimento jaacute descritas anteriormente o meio de cultura foi removido e as
ceacutelulas expostas a diferentes concentraccedilotildees dos extratos determinadas a partir das maiores
concentraccedilotildees em que natildeo foram observados efeitos citotoacutexicos As ceacutelulas foram tratadas
com as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de cada composto e em seguida infectadas com DENV
1 (MOI= 5) ou 2 (MOI= 2) Mantendo uma coluna para controle com DMSO uma coluna
para controle de viacuterus uma coluna para controle de citotoxicidade dos compostos e por fim
uma coluna para controle celular As ceacutelulas foram entatildeo incubadas durante 72 horas Apoacutes
este tempo procedeu-se a leitura pelo ensaio de MTT como descrito anteriormente Os dados
foram analisados levando-se em consideraccedilatildeo a leitura das absorbacircncias dos poccedilos dos
controles de viacuterus e do controle celular
Para realizacao destes experimentos os seguintes controles foram adotados
Controle de ceacutelulas poccedilos contendo somente ceacutelulas acrescidas do meio de cultura DMEM
1 SFB Utilizado para avaliar o comportamento das ceacutelulas sem que as mesmas tivessem
contato com qualquer interferente durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo Com isso os poccedilos
reservados para esse controle serviram de padratildeo para comparaccedilatildeo com aqueles em que fosse
observada atividade citotoacutexica ou citopaacutetica
Controle de viacuterus poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM 1 SFB
sem nenhum tratamento e de suspensatildeo de viacuterus Utilizando como referecircncia para anaacutelise da
atividade citopaacutetica provocada pelo viacuterus testado durante o periacuteodo de incubaccedilatildeo das placas
23
Controle de viacuterus com DMSO Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura
DMEM 1 SFB e DMSO Foi utilizado para avaliar se havia influecircncia prejudicial do
solvente utilizado para diluiccedilatildeo das amostras no meio de cultivo das ceacutelulas e se o mesmo
poderia apresentar alguma potencial atividade antiviral aparente
Controle de citotoxicidade Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM
1 SFB e as quatro principais concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos Foi utilizado
para avaliar se haveria alguma possiacutevel atividade citotoacutexica das concentraccedilotildees dos compostos
em relaccedilatildeo agraves ceacutelulas
48 Ensaio Virucida
Para a realizaccedilatildeo deste ensaio aliacutequotas de 950 microL (diluiccedilatildeo de 20 vezes) do DENV 1 (tiacutetulo
6 x 107 UFPmL) foram incubadas com 50 microL de uma soluccedilatildeo de meio DMEM preparada
com 20x a concentraccedilatildeo natildeo citotoacutexica de cada composto A1 a A8 em banho-maria 37deg C
por 1 hora Apoacutes a incubaccedilatildeo as aliacutequotas foram imediatamente tituladas em ceacutelulas BHK-21
em placas de 6 poccedilos utilizando-se 3 diluiccedilotildees para cada incubaccedilatildeo (20x 20 x 10-1
e 20 x 10-
2) Foram titulados tambeacutem uma aliacutequota incubada apenas com meio DMEM sem nenhum
tratamento e outra aliacutequota incubada com DMSO (Dimetilsulfoacutexido) Estas foram tituladas
utilizando um controle e mais cinco diluiccedilotildees (20x 20 x 10-1
20 x 10-2
20 x 10-3
e 20 x 10-4
)
49 Ensaio antiviral
Neste ensaio ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em placas de 24 poccedilos no dia
seguinte foram tratadas durante 4 horas com as concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas de cada
composto em duplicata Apoacutes o preacute-tratamento as monocamadas foram infectadas com
DENV-1 a uma MOI=5 na presenccedila das concentraccedilotildees de uso respectivas de cada composto
Apoacutes 1 hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus as monocamadas foram lavadas duas vezes com PBS e
foi adicionado 500 microL por poccedilo de meio preparado com as mesmas concentraccedilotildees dos
diferentes compostos e mantidos durante 48 horas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5 Em
quatro poccedilos as ceacutelulas foram infectadas e natildeo tratadas e em outros quatro poccedilos as ceacutelulas
natildeo foram tratadas e nem infectadas (controle de ceacutelulas) destes uacuteltimos dois foram
tripsinizados e contados no momento da infecccedilatildeo e os outros dois apoacutes o teacutermino do ensaio
24
para avaliar o crescimento celular Decorridas as 48 horas o sobrenadante foi coletado e
centrifugado por 10 minutos a 4000 xG para separaccedilatildeo dos debris celulares e prontamente
titulado em placa de 6 poccedilos
410 Anaacutelise estatiacutestica
Os valores de CC50 foram obtidos a partir de anaacutelise de regressatildeo linear das curvas de
concentraccedilatildeocitotoxicidade A anaacutelise estatiacutestica dos dados foi realizada pelo programa
GraphPad Prism software Uma anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi utilizada para determinar
as diferenccedilas estatiacutesticas seguida do poacutes teste de Tukey A significacircncia estatiacutestica foi fixada
em p lt005
25
V RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
26
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Ensaio de citotoxicidade celular
Para avaliar a viabilidade da linhagem celular BHK-21 frente ao tratamento com oito
diferentes concentraccedilotildees dos compostos (A1 a A8) realizou-se um ensaio de MTT (brometo
de 3-[45-dimetil-tiazol-2-il]-25-difeniltetrazoacutelio) Este ensaio tem o objetivo de quantificar
espectrofotometricamente o crescimento celular a viabilidade e proliferaccedilatildeo podendo ser
utilizado como um indicador direto de citotoxicidade Trata-se de um ensaio colorimeacutetrico
para medir a atividade da redutase mitocondrial em ceacutelulas vivas Ele se baseia na reduccedilatildeo do
sal amarelo tetrazoacutelio (permeaacutevel agrave membrana celular) para cristais de formazan azuis
puacuterpura por ceacutelulas metabolicamente ativas a quantidade de formazan gerada medida por
espectrofotometria eacute proporcional ao nuacutemero de ceacutelulas viaacuteveis
A CC50 foi calculada plotando-se uma curva de porcentagem de viabilidade celular por
concentraccedilatildeo melhor representada na figura 7 pelo composto A7 e os resultados de CC50
para todos os compostos estatildeo representados na tabela 2 Foram feitos ensaios de
citotoxicidade com oito concentraccedilotildees diferentes sendo escolhida a maior concentraccedilatildeo que
natildeo apresentou citotoxicidade
Viabilidade Celular = [ ( A ndash B ) A ] x 100
Onde
A = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas natildeo tratadas
B = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas tratadas com
as respectivas concentraccedilotildees de cada composto
27
28
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (A curva dose resposta do composto A7 eacute a que
melhor representa a curva dose resposta esperada) Avaliou-se a viabilidade da linhagem
celular BHK-21 frente agrave diferentes concentraccedilotildees dos compostos realizando o ensaio de MTT
e determinando assim as concentraccedilotildees a serem utilizadas nos proacuteximos ensaios bem como
calculando a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) agrave partir da curva
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo
da concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50)
Composto Concentraccedilatildeo utilizada
[ ] microgmL
Concentraccedilatildeo citotoacutexica 50
(CC50) [ ] microgmL plusmn Desvio
Padratildeo
A1 ([ ]=1 mgmL) 00200 10010 plusmn 0014
A2 ([ ]=1 mgmL) 00025 09561 plusmn 0023
A3 ([ ]=1 mgmL) 00025 09988 plusmn 0017
A4 ([ ]=5 mgmL) 00125 10150 plusmn 0036
A5 ([ ]=10 mgmL) 00250 10590 plusmn 0047
A6 ([ ]=5 mgmL) 00250 08183 plusmn 0030
A7 ([ ]=5 mgmL) 00125 10280 plusmn 0052
A8 ([ ]=5 mgmL) 00125 09758 plusmn 0036
52 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan
Para corroborar o ensaio anterior de citotoxicidade utilizou -se o teste de viabilidade
celular pela teacutecnica da exclusatildeo do azul de tripan com a finalidade de determinar a
viabilidade das ceacutelulas Os procedimentos adotados no ensaio seguiram o manual do
equipamento contador automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL Automated Cell Counter) entatildeo
foi acrescentado agrave 10 microL da suspensatildeo celular 10 microL de azul de tripan (04) Apoacutes
homogeneizaccedilatildeo 10 microL da suspensatildeo foi colocada no local indicado da lacircmina proacutepria para
leitura e foi realizada a contagem sendo consideradas mortas (inviaacuteveis) as ceacutelulas que
incorporavam o corante e viaacuteveis as que excluiacuteam o azul de tripan
29
O equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
(A)
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan A avaliaccedilatildeo da
viabilidade celular foi realizada atraveacutes de um contador automaacutetico de ceacutelulas Este
equipamento possibilita explorar ferramentas de fotografia e avaliar alguns paracircmetros
importantes (A) fotografia das ceacutelulas (B) Zoom na fotografia das ceacutelulas com marcaccedilotildees
(em verde para ceacutelulas vivas e vermelho para mortas) e (D) contagem das ceacutelulas totais
ceacutelulas vivas e mortas graacutefico e meacutedia dos diacircmetros celulares das ceacutelulas vivas e mortas
(B)
(C)
30
O crescimento celular de ceacutelulas natildeo tratadas foi avaliado nos tempos de 0h (momento
da confecccedilatildeo da placa) 24h (momento de tratamento com os compostos) e 96 horas
(Momento em que todas as ceacutelulas foram tripsinizadas e contadas) para avaliar o perfil do
crescimento celular em ceacutelulas natildeo tratadas Foi observado um crescimento celular no periacuteodo
de 24 horas onde as ceacutelulas estavam incubadas com meio acrescido de 10 SFB Em 24
horas o meio foi trocado por 1 SFB e acrescido das substacircncias testes nas menores diluiccedilotildees
natildeo citotoacutexicas determinadas pelo ensaio do MTT Em 96 horas pode ser observado um
decaimento no nuacutemero de ceacutelulas vivas provavelmente devido ao crescimento celular (morte
por confluecircncia)
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas)
(A) (B)
31
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas (A)
Contagem de ceacutelulas vivas (B) Percentual de ceacutelulas viaacuteveis (Viabilidade celular ) e (C)
Meacutedia do diacircmetro apresentado pelas ceacutelulas vivas
Em 96 horas as ceacutelulas natildeo tratadas bem como as ceacutelulas tratadas por 72 horas com as
concentraccedilotildees de uso dos compostos foram tripsinizadas e avaliadas quanto ao nuacutemero de
ceacutelulas vivas viabilidade e diacircmetro celular apresentados na figura 10
Segundo se observa natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo aparente que possa demonstrar que
as concentraccedilotildees de uso dos compostos tenham causado alguma atividade citotoacutexica
corroborando assim os ensaios de citotoxicidade anteriores
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
A infectividade de um viacuterus depende de vaacuterios fatores entre eles da proporccedilatildeo de
partiacuteculas virais completas ou infecciosas da suscetibilidade da ceacutelula hospedeira e da
chance desta partiacutecula encontrar o receptor e penetrar na ceacutelula Quando ceacutelulas suscetiacuteveis
satildeo misturadas com uma suspensatildeo de viacuterus estas podem receber uma duas trecircs ou dez
partiacuteculas virais ou nenhuma Isto depende da proporccedilatildeo entre a quantidade de viacuterus
infecciosos presente no inoculo e a quantidade de ceacutelulas utilizada Esta relaccedilatildeo eacute denominada
de multiplicidade de infecccedilatildeo ou MOI Uma MOI=1 indica que a infecccedilatildeo foi feita em
principio com 1 viacuterus ou 1 dose infectante por ceacutelula
A determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo dos Dengue virus 1 e 2 a serem
utilizadas nos proacuteximos ensaios foi feita a partir da infecccedilatildeo de ceacutelulas BHK-21 por diferentes
(C)
32
concentraccedilotildees de viacuterus e revelaccedilatildeo com cristal violeta Escolheu-se a maior diluiccedilatildeo viral que
possibilitou a letalidade total das ceacutelulas (faixa onde todas as ceacutelulas estatildeo mortas utilizando
menor concentraccedilatildeo de viacuterus) As faixas escolhidas foram entatildeo calculadas levando-se em
consideraccedilatildeo o nuacutemero de ceacutelulas presentes no poccedilo e o nuacutemero de partiacuteculas virais que foram
adicionadas (Faixa3 para DENV2 e 2 para DENV1) Figura 11 Foi estipulado portanto a
Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 2 para DENV 2 e 5 para DENV 1
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI A partir da infecccedilatildeo da linhagem celular BHK-21 em
placa de 96 poccedilos com diferentes diluiccedilotildees de DENV foi determinado que a Multiplicidade
de infecccedilatildeo para o Dengue viacuterus sorotipos 1 e 2 seria de 5 e 2 respectivamente (colunas 2 -
DENV1 e 3 - DENV2)
54 Ensaio dose resposta
Apoacutes a determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas ideais realizou-se um
ensaio dose resposta tratando as ceacutelulas com oito concentraccedilotildees agrave partir das concentraccedilotildees natildeo
citotoacutexicas escolhidas para cada composto e em seguida infectando com DENV sorotipos 1 e
2 nas MOIs estipuladas anteriormente (5 e 2 respectivamente) A porcentagem do efeito
protetor conferida agraves ceacutelulas para cada concentraccedilatildeo de amostra testada foi calculada da
seguinte forma
33
EP = [ (A ndash B) (C ndash B) ] x 100
Onde
A Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas tratadas e infectadas
B Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e infectadas
C Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e natildeo infectadas
Este ensaio tem por objetivo identificar a resposta celular agrave infecccedilatildeo frente ao
tratamento com os compostos em diferentes concentraccedilotildees Assim como o ensaio de
toxicidade este ensaio feito utilizando a teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT permite o teste de vaacuterias
concentraccedilotildees diferentes em um menor tempo e com baixo gasto de material
34
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV1
(MOI=5)
35
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV2
(MOI=2)
36
Takegami et al (1998) demonstraram atividade de furanonaftoquinonas contra o viacuterus
da Encefalite Japonesa (Flavivirus) utilizando a concentraccedilatildeo de 3microgmL poreacutem para os
compostos apresentados avaliados pela teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT nenhuma das
concentraccedilotildees apresentadas produziu efeito antiviral significativo em relaccedilatildeo ao controle
celular como observado nas figuras 12 e 13
Apesar da teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT ser interessante como triagem de atividade
antiviral permitindo o teste de vaacuterias concentraccedilotildees dos compostos em menor tempo e
utilizando uma quantidade razoaacutevel de materiais optou-se por utilizar as maiores
concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas encontradas avaliando sua atividade antiviral por outras
teacutecnicas Como natildeo foi avaliada atividade antiviral preacutevia para nenhum dos compostos frente
agrave infecccedilatildeo por DENV1 e 2 foi selecionado o Dengue virus 1 para dar prosseguimento aos
ensaios
55 Ensaio Virucida
O ensaio virucida foi realizado para avaliar um potencial efeito dos compostos
diretamente sobre a partiacutecula viral Este ensaio eacute importante pois possibilita elucidar se o
composto pode produzir algum efeito sobre a partiacutecula viral impedindo que esta possa infectar
as ceacutelulas
Figura 14 Ensaio virucida Neste ensaio as aliacutequotas de DENV1 foram incubadas com as
concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos e titulados (NT) Controle natildeo tratado
37
Tabela 3 Ensaio virucida Caacutelculo do tiacutetulo viral (UFPmL) e porcentagem representante de
cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 254 x 105 100
DMSO 263 x 105 10335
A1 199 x 105 7835
A2 205 x 105 8071
A3 237 x 105 9311
A4 775 x 104 3049
A5 153 x 105 6024
A6 219 x 105 8602
A7 243 x 105 9547
A8 254 x 105 100
Lagrota et al (1988) demonstraram atividade de 2-HO-3-N-benzil-N(N-benzil-2-
etilamina) -14-naftoquinona sobre a partiacutecula viral de enterovirus De forma contraacuteria apesar
de se verificar a reduccedilatildeo de quase uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais
para o composto A4 natildeo considerou-se esta uma alteraccedilatildeo significativa pois devido agrave
magnitude do nuacutemero de UFPs se trata de uma alteraccedilatildeo muito pequena Portanto os
compostos avaliados neste trabalho natildeo produziram atividade virucida aparente frente ao
tratamento com as concentraccedilotildees de uso
56 Ensaio Antiviral
O sobrenadante de ceacutelulas tratadas previamente e infectadas por DENV1 coletado 48
horas poacutes infecccedilatildeo foi avaliado quanto agrave produccedilatildeo viral de partiacuteculas infecciosas pela
contagem de placas de lise e caacutelculo de Unidades Formadoras de Placa (Titulaccedilatildeo viral em
placa ndash UFPmL)
38
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral Sobrenadante de ceacutelulas tratadas e infectadas por DENV1
coletado apoacutes 48 horas e titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado
Tabela 4 Ensaio Antiviral Coleta do sobrenadante de ceacutelulas infectadas por DENV1 Tiacutetulo
viral (UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o
controle natildeo tratado como 100
Ao perceber um aumento no tiacutetulo viral frente ao tratamento com os compostos A1
A2 e A3 e uma reduccedilatildeo frente ao tratamento com A4 A5 e A6 foram escolhidos dois
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 119 x 105 10000
A1 235 x 105 19748
A2 228 x 105 19160
A3 318 x 105 26723
A4 128 x 104 1076
A5 186 x 103 156
A6 190 x 104 1597
A7 280 x 104 2353
A8 350 x 104 2941
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
40
Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
23
Controle de viacuterus com DMSO Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura
DMEM 1 SFB e DMSO Foi utilizado para avaliar se havia influecircncia prejudicial do
solvente utilizado para diluiccedilatildeo das amostras no meio de cultivo das ceacutelulas e se o mesmo
poderia apresentar alguma potencial atividade antiviral aparente
Controle de citotoxicidade Poccedilos contendo ceacutelulas acrescidas de meio de cultura DMEM
1 SFB e as quatro principais concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos Foi utilizado
para avaliar se haveria alguma possiacutevel atividade citotoacutexica das concentraccedilotildees dos compostos
em relaccedilatildeo agraves ceacutelulas
48 Ensaio Virucida
Para a realizaccedilatildeo deste ensaio aliacutequotas de 950 microL (diluiccedilatildeo de 20 vezes) do DENV 1 (tiacutetulo
6 x 107 UFPmL) foram incubadas com 50 microL de uma soluccedilatildeo de meio DMEM preparada
com 20x a concentraccedilatildeo natildeo citotoacutexica de cada composto A1 a A8 em banho-maria 37deg C
por 1 hora Apoacutes a incubaccedilatildeo as aliacutequotas foram imediatamente tituladas em ceacutelulas BHK-21
em placas de 6 poccedilos utilizando-se 3 diluiccedilotildees para cada incubaccedilatildeo (20x 20 x 10-1
e 20 x 10-
2) Foram titulados tambeacutem uma aliacutequota incubada apenas com meio DMEM sem nenhum
tratamento e outra aliacutequota incubada com DMSO (Dimetilsulfoacutexido) Estas foram tituladas
utilizando um controle e mais cinco diluiccedilotildees (20x 20 x 10-1
20 x 10-2
20 x 10-3
e 20 x 10-4
)
49 Ensaio antiviral
Neste ensaio ceacutelulas BHK-21 foram preparadas em placas de 24 poccedilos no dia
seguinte foram tratadas durante 4 horas com as concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas de cada
composto em duplicata Apoacutes o preacute-tratamento as monocamadas foram infectadas com
DENV-1 a uma MOI=5 na presenccedila das concentraccedilotildees de uso respectivas de cada composto
Apoacutes 1 hora de adsorccedilatildeo com o viacuterus as monocamadas foram lavadas duas vezes com PBS e
foi adicionado 500 microL por poccedilo de meio preparado com as mesmas concentraccedilotildees dos
diferentes compostos e mantidos durante 48 horas a 37deg C sob atmosfera de CO2 a 5 Em
quatro poccedilos as ceacutelulas foram infectadas e natildeo tratadas e em outros quatro poccedilos as ceacutelulas
natildeo foram tratadas e nem infectadas (controle de ceacutelulas) destes uacuteltimos dois foram
tripsinizados e contados no momento da infecccedilatildeo e os outros dois apoacutes o teacutermino do ensaio
24
para avaliar o crescimento celular Decorridas as 48 horas o sobrenadante foi coletado e
centrifugado por 10 minutos a 4000 xG para separaccedilatildeo dos debris celulares e prontamente
titulado em placa de 6 poccedilos
410 Anaacutelise estatiacutestica
Os valores de CC50 foram obtidos a partir de anaacutelise de regressatildeo linear das curvas de
concentraccedilatildeocitotoxicidade A anaacutelise estatiacutestica dos dados foi realizada pelo programa
GraphPad Prism software Uma anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi utilizada para determinar
as diferenccedilas estatiacutesticas seguida do poacutes teste de Tukey A significacircncia estatiacutestica foi fixada
em p lt005
25
V RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
26
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Ensaio de citotoxicidade celular
Para avaliar a viabilidade da linhagem celular BHK-21 frente ao tratamento com oito
diferentes concentraccedilotildees dos compostos (A1 a A8) realizou-se um ensaio de MTT (brometo
de 3-[45-dimetil-tiazol-2-il]-25-difeniltetrazoacutelio) Este ensaio tem o objetivo de quantificar
espectrofotometricamente o crescimento celular a viabilidade e proliferaccedilatildeo podendo ser
utilizado como um indicador direto de citotoxicidade Trata-se de um ensaio colorimeacutetrico
para medir a atividade da redutase mitocondrial em ceacutelulas vivas Ele se baseia na reduccedilatildeo do
sal amarelo tetrazoacutelio (permeaacutevel agrave membrana celular) para cristais de formazan azuis
puacuterpura por ceacutelulas metabolicamente ativas a quantidade de formazan gerada medida por
espectrofotometria eacute proporcional ao nuacutemero de ceacutelulas viaacuteveis
A CC50 foi calculada plotando-se uma curva de porcentagem de viabilidade celular por
concentraccedilatildeo melhor representada na figura 7 pelo composto A7 e os resultados de CC50
para todos os compostos estatildeo representados na tabela 2 Foram feitos ensaios de
citotoxicidade com oito concentraccedilotildees diferentes sendo escolhida a maior concentraccedilatildeo que
natildeo apresentou citotoxicidade
Viabilidade Celular = [ ( A ndash B ) A ] x 100
Onde
A = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas natildeo tratadas
B = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas tratadas com
as respectivas concentraccedilotildees de cada composto
27
28
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (A curva dose resposta do composto A7 eacute a que
melhor representa a curva dose resposta esperada) Avaliou-se a viabilidade da linhagem
celular BHK-21 frente agrave diferentes concentraccedilotildees dos compostos realizando o ensaio de MTT
e determinando assim as concentraccedilotildees a serem utilizadas nos proacuteximos ensaios bem como
calculando a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) agrave partir da curva
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo
da concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50)
Composto Concentraccedilatildeo utilizada
[ ] microgmL
Concentraccedilatildeo citotoacutexica 50
(CC50) [ ] microgmL plusmn Desvio
Padratildeo
A1 ([ ]=1 mgmL) 00200 10010 plusmn 0014
A2 ([ ]=1 mgmL) 00025 09561 plusmn 0023
A3 ([ ]=1 mgmL) 00025 09988 plusmn 0017
A4 ([ ]=5 mgmL) 00125 10150 plusmn 0036
A5 ([ ]=10 mgmL) 00250 10590 plusmn 0047
A6 ([ ]=5 mgmL) 00250 08183 plusmn 0030
A7 ([ ]=5 mgmL) 00125 10280 plusmn 0052
A8 ([ ]=5 mgmL) 00125 09758 plusmn 0036
52 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan
Para corroborar o ensaio anterior de citotoxicidade utilizou -se o teste de viabilidade
celular pela teacutecnica da exclusatildeo do azul de tripan com a finalidade de determinar a
viabilidade das ceacutelulas Os procedimentos adotados no ensaio seguiram o manual do
equipamento contador automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL Automated Cell Counter) entatildeo
foi acrescentado agrave 10 microL da suspensatildeo celular 10 microL de azul de tripan (04) Apoacutes
homogeneizaccedilatildeo 10 microL da suspensatildeo foi colocada no local indicado da lacircmina proacutepria para
leitura e foi realizada a contagem sendo consideradas mortas (inviaacuteveis) as ceacutelulas que
incorporavam o corante e viaacuteveis as que excluiacuteam o azul de tripan
29
O equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
(A)
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan A avaliaccedilatildeo da
viabilidade celular foi realizada atraveacutes de um contador automaacutetico de ceacutelulas Este
equipamento possibilita explorar ferramentas de fotografia e avaliar alguns paracircmetros
importantes (A) fotografia das ceacutelulas (B) Zoom na fotografia das ceacutelulas com marcaccedilotildees
(em verde para ceacutelulas vivas e vermelho para mortas) e (D) contagem das ceacutelulas totais
ceacutelulas vivas e mortas graacutefico e meacutedia dos diacircmetros celulares das ceacutelulas vivas e mortas
(B)
(C)
30
O crescimento celular de ceacutelulas natildeo tratadas foi avaliado nos tempos de 0h (momento
da confecccedilatildeo da placa) 24h (momento de tratamento com os compostos) e 96 horas
(Momento em que todas as ceacutelulas foram tripsinizadas e contadas) para avaliar o perfil do
crescimento celular em ceacutelulas natildeo tratadas Foi observado um crescimento celular no periacuteodo
de 24 horas onde as ceacutelulas estavam incubadas com meio acrescido de 10 SFB Em 24
horas o meio foi trocado por 1 SFB e acrescido das substacircncias testes nas menores diluiccedilotildees
natildeo citotoacutexicas determinadas pelo ensaio do MTT Em 96 horas pode ser observado um
decaimento no nuacutemero de ceacutelulas vivas provavelmente devido ao crescimento celular (morte
por confluecircncia)
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas)
(A) (B)
31
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas (A)
Contagem de ceacutelulas vivas (B) Percentual de ceacutelulas viaacuteveis (Viabilidade celular ) e (C)
Meacutedia do diacircmetro apresentado pelas ceacutelulas vivas
Em 96 horas as ceacutelulas natildeo tratadas bem como as ceacutelulas tratadas por 72 horas com as
concentraccedilotildees de uso dos compostos foram tripsinizadas e avaliadas quanto ao nuacutemero de
ceacutelulas vivas viabilidade e diacircmetro celular apresentados na figura 10
Segundo se observa natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo aparente que possa demonstrar que
as concentraccedilotildees de uso dos compostos tenham causado alguma atividade citotoacutexica
corroborando assim os ensaios de citotoxicidade anteriores
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
A infectividade de um viacuterus depende de vaacuterios fatores entre eles da proporccedilatildeo de
partiacuteculas virais completas ou infecciosas da suscetibilidade da ceacutelula hospedeira e da
chance desta partiacutecula encontrar o receptor e penetrar na ceacutelula Quando ceacutelulas suscetiacuteveis
satildeo misturadas com uma suspensatildeo de viacuterus estas podem receber uma duas trecircs ou dez
partiacuteculas virais ou nenhuma Isto depende da proporccedilatildeo entre a quantidade de viacuterus
infecciosos presente no inoculo e a quantidade de ceacutelulas utilizada Esta relaccedilatildeo eacute denominada
de multiplicidade de infecccedilatildeo ou MOI Uma MOI=1 indica que a infecccedilatildeo foi feita em
principio com 1 viacuterus ou 1 dose infectante por ceacutelula
A determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo dos Dengue virus 1 e 2 a serem
utilizadas nos proacuteximos ensaios foi feita a partir da infecccedilatildeo de ceacutelulas BHK-21 por diferentes
(C)
32
concentraccedilotildees de viacuterus e revelaccedilatildeo com cristal violeta Escolheu-se a maior diluiccedilatildeo viral que
possibilitou a letalidade total das ceacutelulas (faixa onde todas as ceacutelulas estatildeo mortas utilizando
menor concentraccedilatildeo de viacuterus) As faixas escolhidas foram entatildeo calculadas levando-se em
consideraccedilatildeo o nuacutemero de ceacutelulas presentes no poccedilo e o nuacutemero de partiacuteculas virais que foram
adicionadas (Faixa3 para DENV2 e 2 para DENV1) Figura 11 Foi estipulado portanto a
Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 2 para DENV 2 e 5 para DENV 1
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI A partir da infecccedilatildeo da linhagem celular BHK-21 em
placa de 96 poccedilos com diferentes diluiccedilotildees de DENV foi determinado que a Multiplicidade
de infecccedilatildeo para o Dengue viacuterus sorotipos 1 e 2 seria de 5 e 2 respectivamente (colunas 2 -
DENV1 e 3 - DENV2)
54 Ensaio dose resposta
Apoacutes a determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas ideais realizou-se um
ensaio dose resposta tratando as ceacutelulas com oito concentraccedilotildees agrave partir das concentraccedilotildees natildeo
citotoacutexicas escolhidas para cada composto e em seguida infectando com DENV sorotipos 1 e
2 nas MOIs estipuladas anteriormente (5 e 2 respectivamente) A porcentagem do efeito
protetor conferida agraves ceacutelulas para cada concentraccedilatildeo de amostra testada foi calculada da
seguinte forma
33
EP = [ (A ndash B) (C ndash B) ] x 100
Onde
A Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas tratadas e infectadas
B Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e infectadas
C Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e natildeo infectadas
Este ensaio tem por objetivo identificar a resposta celular agrave infecccedilatildeo frente ao
tratamento com os compostos em diferentes concentraccedilotildees Assim como o ensaio de
toxicidade este ensaio feito utilizando a teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT permite o teste de vaacuterias
concentraccedilotildees diferentes em um menor tempo e com baixo gasto de material
34
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV1
(MOI=5)
35
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV2
(MOI=2)
36
Takegami et al (1998) demonstraram atividade de furanonaftoquinonas contra o viacuterus
da Encefalite Japonesa (Flavivirus) utilizando a concentraccedilatildeo de 3microgmL poreacutem para os
compostos apresentados avaliados pela teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT nenhuma das
concentraccedilotildees apresentadas produziu efeito antiviral significativo em relaccedilatildeo ao controle
celular como observado nas figuras 12 e 13
Apesar da teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT ser interessante como triagem de atividade
antiviral permitindo o teste de vaacuterias concentraccedilotildees dos compostos em menor tempo e
utilizando uma quantidade razoaacutevel de materiais optou-se por utilizar as maiores
concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas encontradas avaliando sua atividade antiviral por outras
teacutecnicas Como natildeo foi avaliada atividade antiviral preacutevia para nenhum dos compostos frente
agrave infecccedilatildeo por DENV1 e 2 foi selecionado o Dengue virus 1 para dar prosseguimento aos
ensaios
55 Ensaio Virucida
O ensaio virucida foi realizado para avaliar um potencial efeito dos compostos
diretamente sobre a partiacutecula viral Este ensaio eacute importante pois possibilita elucidar se o
composto pode produzir algum efeito sobre a partiacutecula viral impedindo que esta possa infectar
as ceacutelulas
Figura 14 Ensaio virucida Neste ensaio as aliacutequotas de DENV1 foram incubadas com as
concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos e titulados (NT) Controle natildeo tratado
37
Tabela 3 Ensaio virucida Caacutelculo do tiacutetulo viral (UFPmL) e porcentagem representante de
cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 254 x 105 100
DMSO 263 x 105 10335
A1 199 x 105 7835
A2 205 x 105 8071
A3 237 x 105 9311
A4 775 x 104 3049
A5 153 x 105 6024
A6 219 x 105 8602
A7 243 x 105 9547
A8 254 x 105 100
Lagrota et al (1988) demonstraram atividade de 2-HO-3-N-benzil-N(N-benzil-2-
etilamina) -14-naftoquinona sobre a partiacutecula viral de enterovirus De forma contraacuteria apesar
de se verificar a reduccedilatildeo de quase uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais
para o composto A4 natildeo considerou-se esta uma alteraccedilatildeo significativa pois devido agrave
magnitude do nuacutemero de UFPs se trata de uma alteraccedilatildeo muito pequena Portanto os
compostos avaliados neste trabalho natildeo produziram atividade virucida aparente frente ao
tratamento com as concentraccedilotildees de uso
56 Ensaio Antiviral
O sobrenadante de ceacutelulas tratadas previamente e infectadas por DENV1 coletado 48
horas poacutes infecccedilatildeo foi avaliado quanto agrave produccedilatildeo viral de partiacuteculas infecciosas pela
contagem de placas de lise e caacutelculo de Unidades Formadoras de Placa (Titulaccedilatildeo viral em
placa ndash UFPmL)
38
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral Sobrenadante de ceacutelulas tratadas e infectadas por DENV1
coletado apoacutes 48 horas e titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado
Tabela 4 Ensaio Antiviral Coleta do sobrenadante de ceacutelulas infectadas por DENV1 Tiacutetulo
viral (UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o
controle natildeo tratado como 100
Ao perceber um aumento no tiacutetulo viral frente ao tratamento com os compostos A1
A2 e A3 e uma reduccedilatildeo frente ao tratamento com A4 A5 e A6 foram escolhidos dois
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 119 x 105 10000
A1 235 x 105 19748
A2 228 x 105 19160
A3 318 x 105 26723
A4 128 x 104 1076
A5 186 x 103 156
A6 190 x 104 1597
A7 280 x 104 2353
A8 350 x 104 2941
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
40
Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
24
para avaliar o crescimento celular Decorridas as 48 horas o sobrenadante foi coletado e
centrifugado por 10 minutos a 4000 xG para separaccedilatildeo dos debris celulares e prontamente
titulado em placa de 6 poccedilos
410 Anaacutelise estatiacutestica
Os valores de CC50 foram obtidos a partir de anaacutelise de regressatildeo linear das curvas de
concentraccedilatildeocitotoxicidade A anaacutelise estatiacutestica dos dados foi realizada pelo programa
GraphPad Prism software Uma anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi utilizada para determinar
as diferenccedilas estatiacutesticas seguida do poacutes teste de Tukey A significacircncia estatiacutestica foi fixada
em p lt005
25
V RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
26
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Ensaio de citotoxicidade celular
Para avaliar a viabilidade da linhagem celular BHK-21 frente ao tratamento com oito
diferentes concentraccedilotildees dos compostos (A1 a A8) realizou-se um ensaio de MTT (brometo
de 3-[45-dimetil-tiazol-2-il]-25-difeniltetrazoacutelio) Este ensaio tem o objetivo de quantificar
espectrofotometricamente o crescimento celular a viabilidade e proliferaccedilatildeo podendo ser
utilizado como um indicador direto de citotoxicidade Trata-se de um ensaio colorimeacutetrico
para medir a atividade da redutase mitocondrial em ceacutelulas vivas Ele se baseia na reduccedilatildeo do
sal amarelo tetrazoacutelio (permeaacutevel agrave membrana celular) para cristais de formazan azuis
puacuterpura por ceacutelulas metabolicamente ativas a quantidade de formazan gerada medida por
espectrofotometria eacute proporcional ao nuacutemero de ceacutelulas viaacuteveis
A CC50 foi calculada plotando-se uma curva de porcentagem de viabilidade celular por
concentraccedilatildeo melhor representada na figura 7 pelo composto A7 e os resultados de CC50
para todos os compostos estatildeo representados na tabela 2 Foram feitos ensaios de
citotoxicidade com oito concentraccedilotildees diferentes sendo escolhida a maior concentraccedilatildeo que
natildeo apresentou citotoxicidade
Viabilidade Celular = [ ( A ndash B ) A ] x 100
Onde
A = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas natildeo tratadas
B = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas tratadas com
as respectivas concentraccedilotildees de cada composto
27
28
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (A curva dose resposta do composto A7 eacute a que
melhor representa a curva dose resposta esperada) Avaliou-se a viabilidade da linhagem
celular BHK-21 frente agrave diferentes concentraccedilotildees dos compostos realizando o ensaio de MTT
e determinando assim as concentraccedilotildees a serem utilizadas nos proacuteximos ensaios bem como
calculando a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) agrave partir da curva
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo
da concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50)
Composto Concentraccedilatildeo utilizada
[ ] microgmL
Concentraccedilatildeo citotoacutexica 50
(CC50) [ ] microgmL plusmn Desvio
Padratildeo
A1 ([ ]=1 mgmL) 00200 10010 plusmn 0014
A2 ([ ]=1 mgmL) 00025 09561 plusmn 0023
A3 ([ ]=1 mgmL) 00025 09988 plusmn 0017
A4 ([ ]=5 mgmL) 00125 10150 plusmn 0036
A5 ([ ]=10 mgmL) 00250 10590 plusmn 0047
A6 ([ ]=5 mgmL) 00250 08183 plusmn 0030
A7 ([ ]=5 mgmL) 00125 10280 plusmn 0052
A8 ([ ]=5 mgmL) 00125 09758 plusmn 0036
52 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan
Para corroborar o ensaio anterior de citotoxicidade utilizou -se o teste de viabilidade
celular pela teacutecnica da exclusatildeo do azul de tripan com a finalidade de determinar a
viabilidade das ceacutelulas Os procedimentos adotados no ensaio seguiram o manual do
equipamento contador automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL Automated Cell Counter) entatildeo
foi acrescentado agrave 10 microL da suspensatildeo celular 10 microL de azul de tripan (04) Apoacutes
homogeneizaccedilatildeo 10 microL da suspensatildeo foi colocada no local indicado da lacircmina proacutepria para
leitura e foi realizada a contagem sendo consideradas mortas (inviaacuteveis) as ceacutelulas que
incorporavam o corante e viaacuteveis as que excluiacuteam o azul de tripan
29
O equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
(A)
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan A avaliaccedilatildeo da
viabilidade celular foi realizada atraveacutes de um contador automaacutetico de ceacutelulas Este
equipamento possibilita explorar ferramentas de fotografia e avaliar alguns paracircmetros
importantes (A) fotografia das ceacutelulas (B) Zoom na fotografia das ceacutelulas com marcaccedilotildees
(em verde para ceacutelulas vivas e vermelho para mortas) e (D) contagem das ceacutelulas totais
ceacutelulas vivas e mortas graacutefico e meacutedia dos diacircmetros celulares das ceacutelulas vivas e mortas
(B)
(C)
30
O crescimento celular de ceacutelulas natildeo tratadas foi avaliado nos tempos de 0h (momento
da confecccedilatildeo da placa) 24h (momento de tratamento com os compostos) e 96 horas
(Momento em que todas as ceacutelulas foram tripsinizadas e contadas) para avaliar o perfil do
crescimento celular em ceacutelulas natildeo tratadas Foi observado um crescimento celular no periacuteodo
de 24 horas onde as ceacutelulas estavam incubadas com meio acrescido de 10 SFB Em 24
horas o meio foi trocado por 1 SFB e acrescido das substacircncias testes nas menores diluiccedilotildees
natildeo citotoacutexicas determinadas pelo ensaio do MTT Em 96 horas pode ser observado um
decaimento no nuacutemero de ceacutelulas vivas provavelmente devido ao crescimento celular (morte
por confluecircncia)
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas)
(A) (B)
31
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas (A)
Contagem de ceacutelulas vivas (B) Percentual de ceacutelulas viaacuteveis (Viabilidade celular ) e (C)
Meacutedia do diacircmetro apresentado pelas ceacutelulas vivas
Em 96 horas as ceacutelulas natildeo tratadas bem como as ceacutelulas tratadas por 72 horas com as
concentraccedilotildees de uso dos compostos foram tripsinizadas e avaliadas quanto ao nuacutemero de
ceacutelulas vivas viabilidade e diacircmetro celular apresentados na figura 10
Segundo se observa natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo aparente que possa demonstrar que
as concentraccedilotildees de uso dos compostos tenham causado alguma atividade citotoacutexica
corroborando assim os ensaios de citotoxicidade anteriores
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
A infectividade de um viacuterus depende de vaacuterios fatores entre eles da proporccedilatildeo de
partiacuteculas virais completas ou infecciosas da suscetibilidade da ceacutelula hospedeira e da
chance desta partiacutecula encontrar o receptor e penetrar na ceacutelula Quando ceacutelulas suscetiacuteveis
satildeo misturadas com uma suspensatildeo de viacuterus estas podem receber uma duas trecircs ou dez
partiacuteculas virais ou nenhuma Isto depende da proporccedilatildeo entre a quantidade de viacuterus
infecciosos presente no inoculo e a quantidade de ceacutelulas utilizada Esta relaccedilatildeo eacute denominada
de multiplicidade de infecccedilatildeo ou MOI Uma MOI=1 indica que a infecccedilatildeo foi feita em
principio com 1 viacuterus ou 1 dose infectante por ceacutelula
A determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo dos Dengue virus 1 e 2 a serem
utilizadas nos proacuteximos ensaios foi feita a partir da infecccedilatildeo de ceacutelulas BHK-21 por diferentes
(C)
32
concentraccedilotildees de viacuterus e revelaccedilatildeo com cristal violeta Escolheu-se a maior diluiccedilatildeo viral que
possibilitou a letalidade total das ceacutelulas (faixa onde todas as ceacutelulas estatildeo mortas utilizando
menor concentraccedilatildeo de viacuterus) As faixas escolhidas foram entatildeo calculadas levando-se em
consideraccedilatildeo o nuacutemero de ceacutelulas presentes no poccedilo e o nuacutemero de partiacuteculas virais que foram
adicionadas (Faixa3 para DENV2 e 2 para DENV1) Figura 11 Foi estipulado portanto a
Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 2 para DENV 2 e 5 para DENV 1
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI A partir da infecccedilatildeo da linhagem celular BHK-21 em
placa de 96 poccedilos com diferentes diluiccedilotildees de DENV foi determinado que a Multiplicidade
de infecccedilatildeo para o Dengue viacuterus sorotipos 1 e 2 seria de 5 e 2 respectivamente (colunas 2 -
DENV1 e 3 - DENV2)
54 Ensaio dose resposta
Apoacutes a determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas ideais realizou-se um
ensaio dose resposta tratando as ceacutelulas com oito concentraccedilotildees agrave partir das concentraccedilotildees natildeo
citotoacutexicas escolhidas para cada composto e em seguida infectando com DENV sorotipos 1 e
2 nas MOIs estipuladas anteriormente (5 e 2 respectivamente) A porcentagem do efeito
protetor conferida agraves ceacutelulas para cada concentraccedilatildeo de amostra testada foi calculada da
seguinte forma
33
EP = [ (A ndash B) (C ndash B) ] x 100
Onde
A Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas tratadas e infectadas
B Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e infectadas
C Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e natildeo infectadas
Este ensaio tem por objetivo identificar a resposta celular agrave infecccedilatildeo frente ao
tratamento com os compostos em diferentes concentraccedilotildees Assim como o ensaio de
toxicidade este ensaio feito utilizando a teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT permite o teste de vaacuterias
concentraccedilotildees diferentes em um menor tempo e com baixo gasto de material
34
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV1
(MOI=5)
35
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV2
(MOI=2)
36
Takegami et al (1998) demonstraram atividade de furanonaftoquinonas contra o viacuterus
da Encefalite Japonesa (Flavivirus) utilizando a concentraccedilatildeo de 3microgmL poreacutem para os
compostos apresentados avaliados pela teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT nenhuma das
concentraccedilotildees apresentadas produziu efeito antiviral significativo em relaccedilatildeo ao controle
celular como observado nas figuras 12 e 13
Apesar da teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT ser interessante como triagem de atividade
antiviral permitindo o teste de vaacuterias concentraccedilotildees dos compostos em menor tempo e
utilizando uma quantidade razoaacutevel de materiais optou-se por utilizar as maiores
concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas encontradas avaliando sua atividade antiviral por outras
teacutecnicas Como natildeo foi avaliada atividade antiviral preacutevia para nenhum dos compostos frente
agrave infecccedilatildeo por DENV1 e 2 foi selecionado o Dengue virus 1 para dar prosseguimento aos
ensaios
55 Ensaio Virucida
O ensaio virucida foi realizado para avaliar um potencial efeito dos compostos
diretamente sobre a partiacutecula viral Este ensaio eacute importante pois possibilita elucidar se o
composto pode produzir algum efeito sobre a partiacutecula viral impedindo que esta possa infectar
as ceacutelulas
Figura 14 Ensaio virucida Neste ensaio as aliacutequotas de DENV1 foram incubadas com as
concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos e titulados (NT) Controle natildeo tratado
37
Tabela 3 Ensaio virucida Caacutelculo do tiacutetulo viral (UFPmL) e porcentagem representante de
cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 254 x 105 100
DMSO 263 x 105 10335
A1 199 x 105 7835
A2 205 x 105 8071
A3 237 x 105 9311
A4 775 x 104 3049
A5 153 x 105 6024
A6 219 x 105 8602
A7 243 x 105 9547
A8 254 x 105 100
Lagrota et al (1988) demonstraram atividade de 2-HO-3-N-benzil-N(N-benzil-2-
etilamina) -14-naftoquinona sobre a partiacutecula viral de enterovirus De forma contraacuteria apesar
de se verificar a reduccedilatildeo de quase uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais
para o composto A4 natildeo considerou-se esta uma alteraccedilatildeo significativa pois devido agrave
magnitude do nuacutemero de UFPs se trata de uma alteraccedilatildeo muito pequena Portanto os
compostos avaliados neste trabalho natildeo produziram atividade virucida aparente frente ao
tratamento com as concentraccedilotildees de uso
56 Ensaio Antiviral
O sobrenadante de ceacutelulas tratadas previamente e infectadas por DENV1 coletado 48
horas poacutes infecccedilatildeo foi avaliado quanto agrave produccedilatildeo viral de partiacuteculas infecciosas pela
contagem de placas de lise e caacutelculo de Unidades Formadoras de Placa (Titulaccedilatildeo viral em
placa ndash UFPmL)
38
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral Sobrenadante de ceacutelulas tratadas e infectadas por DENV1
coletado apoacutes 48 horas e titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado
Tabela 4 Ensaio Antiviral Coleta do sobrenadante de ceacutelulas infectadas por DENV1 Tiacutetulo
viral (UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o
controle natildeo tratado como 100
Ao perceber um aumento no tiacutetulo viral frente ao tratamento com os compostos A1
A2 e A3 e uma reduccedilatildeo frente ao tratamento com A4 A5 e A6 foram escolhidos dois
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 119 x 105 10000
A1 235 x 105 19748
A2 228 x 105 19160
A3 318 x 105 26723
A4 128 x 104 1076
A5 186 x 103 156
A6 190 x 104 1597
A7 280 x 104 2353
A8 350 x 104 2941
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
40
Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
25
V RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
26
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Ensaio de citotoxicidade celular
Para avaliar a viabilidade da linhagem celular BHK-21 frente ao tratamento com oito
diferentes concentraccedilotildees dos compostos (A1 a A8) realizou-se um ensaio de MTT (brometo
de 3-[45-dimetil-tiazol-2-il]-25-difeniltetrazoacutelio) Este ensaio tem o objetivo de quantificar
espectrofotometricamente o crescimento celular a viabilidade e proliferaccedilatildeo podendo ser
utilizado como um indicador direto de citotoxicidade Trata-se de um ensaio colorimeacutetrico
para medir a atividade da redutase mitocondrial em ceacutelulas vivas Ele se baseia na reduccedilatildeo do
sal amarelo tetrazoacutelio (permeaacutevel agrave membrana celular) para cristais de formazan azuis
puacuterpura por ceacutelulas metabolicamente ativas a quantidade de formazan gerada medida por
espectrofotometria eacute proporcional ao nuacutemero de ceacutelulas viaacuteveis
A CC50 foi calculada plotando-se uma curva de porcentagem de viabilidade celular por
concentraccedilatildeo melhor representada na figura 7 pelo composto A7 e os resultados de CC50
para todos os compostos estatildeo representados na tabela 2 Foram feitos ensaios de
citotoxicidade com oito concentraccedilotildees diferentes sendo escolhida a maior concentraccedilatildeo que
natildeo apresentou citotoxicidade
Viabilidade Celular = [ ( A ndash B ) A ] x 100
Onde
A = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas natildeo tratadas
B = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas tratadas com
as respectivas concentraccedilotildees de cada composto
27
28
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (A curva dose resposta do composto A7 eacute a que
melhor representa a curva dose resposta esperada) Avaliou-se a viabilidade da linhagem
celular BHK-21 frente agrave diferentes concentraccedilotildees dos compostos realizando o ensaio de MTT
e determinando assim as concentraccedilotildees a serem utilizadas nos proacuteximos ensaios bem como
calculando a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) agrave partir da curva
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo
da concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50)
Composto Concentraccedilatildeo utilizada
[ ] microgmL
Concentraccedilatildeo citotoacutexica 50
(CC50) [ ] microgmL plusmn Desvio
Padratildeo
A1 ([ ]=1 mgmL) 00200 10010 plusmn 0014
A2 ([ ]=1 mgmL) 00025 09561 plusmn 0023
A3 ([ ]=1 mgmL) 00025 09988 plusmn 0017
A4 ([ ]=5 mgmL) 00125 10150 plusmn 0036
A5 ([ ]=10 mgmL) 00250 10590 plusmn 0047
A6 ([ ]=5 mgmL) 00250 08183 plusmn 0030
A7 ([ ]=5 mgmL) 00125 10280 plusmn 0052
A8 ([ ]=5 mgmL) 00125 09758 plusmn 0036
52 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan
Para corroborar o ensaio anterior de citotoxicidade utilizou -se o teste de viabilidade
celular pela teacutecnica da exclusatildeo do azul de tripan com a finalidade de determinar a
viabilidade das ceacutelulas Os procedimentos adotados no ensaio seguiram o manual do
equipamento contador automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL Automated Cell Counter) entatildeo
foi acrescentado agrave 10 microL da suspensatildeo celular 10 microL de azul de tripan (04) Apoacutes
homogeneizaccedilatildeo 10 microL da suspensatildeo foi colocada no local indicado da lacircmina proacutepria para
leitura e foi realizada a contagem sendo consideradas mortas (inviaacuteveis) as ceacutelulas que
incorporavam o corante e viaacuteveis as que excluiacuteam o azul de tripan
29
O equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
(A)
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan A avaliaccedilatildeo da
viabilidade celular foi realizada atraveacutes de um contador automaacutetico de ceacutelulas Este
equipamento possibilita explorar ferramentas de fotografia e avaliar alguns paracircmetros
importantes (A) fotografia das ceacutelulas (B) Zoom na fotografia das ceacutelulas com marcaccedilotildees
(em verde para ceacutelulas vivas e vermelho para mortas) e (D) contagem das ceacutelulas totais
ceacutelulas vivas e mortas graacutefico e meacutedia dos diacircmetros celulares das ceacutelulas vivas e mortas
(B)
(C)
30
O crescimento celular de ceacutelulas natildeo tratadas foi avaliado nos tempos de 0h (momento
da confecccedilatildeo da placa) 24h (momento de tratamento com os compostos) e 96 horas
(Momento em que todas as ceacutelulas foram tripsinizadas e contadas) para avaliar o perfil do
crescimento celular em ceacutelulas natildeo tratadas Foi observado um crescimento celular no periacuteodo
de 24 horas onde as ceacutelulas estavam incubadas com meio acrescido de 10 SFB Em 24
horas o meio foi trocado por 1 SFB e acrescido das substacircncias testes nas menores diluiccedilotildees
natildeo citotoacutexicas determinadas pelo ensaio do MTT Em 96 horas pode ser observado um
decaimento no nuacutemero de ceacutelulas vivas provavelmente devido ao crescimento celular (morte
por confluecircncia)
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas)
(A) (B)
31
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas (A)
Contagem de ceacutelulas vivas (B) Percentual de ceacutelulas viaacuteveis (Viabilidade celular ) e (C)
Meacutedia do diacircmetro apresentado pelas ceacutelulas vivas
Em 96 horas as ceacutelulas natildeo tratadas bem como as ceacutelulas tratadas por 72 horas com as
concentraccedilotildees de uso dos compostos foram tripsinizadas e avaliadas quanto ao nuacutemero de
ceacutelulas vivas viabilidade e diacircmetro celular apresentados na figura 10
Segundo se observa natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo aparente que possa demonstrar que
as concentraccedilotildees de uso dos compostos tenham causado alguma atividade citotoacutexica
corroborando assim os ensaios de citotoxicidade anteriores
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
A infectividade de um viacuterus depende de vaacuterios fatores entre eles da proporccedilatildeo de
partiacuteculas virais completas ou infecciosas da suscetibilidade da ceacutelula hospedeira e da
chance desta partiacutecula encontrar o receptor e penetrar na ceacutelula Quando ceacutelulas suscetiacuteveis
satildeo misturadas com uma suspensatildeo de viacuterus estas podem receber uma duas trecircs ou dez
partiacuteculas virais ou nenhuma Isto depende da proporccedilatildeo entre a quantidade de viacuterus
infecciosos presente no inoculo e a quantidade de ceacutelulas utilizada Esta relaccedilatildeo eacute denominada
de multiplicidade de infecccedilatildeo ou MOI Uma MOI=1 indica que a infecccedilatildeo foi feita em
principio com 1 viacuterus ou 1 dose infectante por ceacutelula
A determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo dos Dengue virus 1 e 2 a serem
utilizadas nos proacuteximos ensaios foi feita a partir da infecccedilatildeo de ceacutelulas BHK-21 por diferentes
(C)
32
concentraccedilotildees de viacuterus e revelaccedilatildeo com cristal violeta Escolheu-se a maior diluiccedilatildeo viral que
possibilitou a letalidade total das ceacutelulas (faixa onde todas as ceacutelulas estatildeo mortas utilizando
menor concentraccedilatildeo de viacuterus) As faixas escolhidas foram entatildeo calculadas levando-se em
consideraccedilatildeo o nuacutemero de ceacutelulas presentes no poccedilo e o nuacutemero de partiacuteculas virais que foram
adicionadas (Faixa3 para DENV2 e 2 para DENV1) Figura 11 Foi estipulado portanto a
Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 2 para DENV 2 e 5 para DENV 1
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI A partir da infecccedilatildeo da linhagem celular BHK-21 em
placa de 96 poccedilos com diferentes diluiccedilotildees de DENV foi determinado que a Multiplicidade
de infecccedilatildeo para o Dengue viacuterus sorotipos 1 e 2 seria de 5 e 2 respectivamente (colunas 2 -
DENV1 e 3 - DENV2)
54 Ensaio dose resposta
Apoacutes a determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas ideais realizou-se um
ensaio dose resposta tratando as ceacutelulas com oito concentraccedilotildees agrave partir das concentraccedilotildees natildeo
citotoacutexicas escolhidas para cada composto e em seguida infectando com DENV sorotipos 1 e
2 nas MOIs estipuladas anteriormente (5 e 2 respectivamente) A porcentagem do efeito
protetor conferida agraves ceacutelulas para cada concentraccedilatildeo de amostra testada foi calculada da
seguinte forma
33
EP = [ (A ndash B) (C ndash B) ] x 100
Onde
A Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas tratadas e infectadas
B Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e infectadas
C Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e natildeo infectadas
Este ensaio tem por objetivo identificar a resposta celular agrave infecccedilatildeo frente ao
tratamento com os compostos em diferentes concentraccedilotildees Assim como o ensaio de
toxicidade este ensaio feito utilizando a teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT permite o teste de vaacuterias
concentraccedilotildees diferentes em um menor tempo e com baixo gasto de material
34
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV1
(MOI=5)
35
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV2
(MOI=2)
36
Takegami et al (1998) demonstraram atividade de furanonaftoquinonas contra o viacuterus
da Encefalite Japonesa (Flavivirus) utilizando a concentraccedilatildeo de 3microgmL poreacutem para os
compostos apresentados avaliados pela teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT nenhuma das
concentraccedilotildees apresentadas produziu efeito antiviral significativo em relaccedilatildeo ao controle
celular como observado nas figuras 12 e 13
Apesar da teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT ser interessante como triagem de atividade
antiviral permitindo o teste de vaacuterias concentraccedilotildees dos compostos em menor tempo e
utilizando uma quantidade razoaacutevel de materiais optou-se por utilizar as maiores
concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas encontradas avaliando sua atividade antiviral por outras
teacutecnicas Como natildeo foi avaliada atividade antiviral preacutevia para nenhum dos compostos frente
agrave infecccedilatildeo por DENV1 e 2 foi selecionado o Dengue virus 1 para dar prosseguimento aos
ensaios
55 Ensaio Virucida
O ensaio virucida foi realizado para avaliar um potencial efeito dos compostos
diretamente sobre a partiacutecula viral Este ensaio eacute importante pois possibilita elucidar se o
composto pode produzir algum efeito sobre a partiacutecula viral impedindo que esta possa infectar
as ceacutelulas
Figura 14 Ensaio virucida Neste ensaio as aliacutequotas de DENV1 foram incubadas com as
concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos e titulados (NT) Controle natildeo tratado
37
Tabela 3 Ensaio virucida Caacutelculo do tiacutetulo viral (UFPmL) e porcentagem representante de
cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 254 x 105 100
DMSO 263 x 105 10335
A1 199 x 105 7835
A2 205 x 105 8071
A3 237 x 105 9311
A4 775 x 104 3049
A5 153 x 105 6024
A6 219 x 105 8602
A7 243 x 105 9547
A8 254 x 105 100
Lagrota et al (1988) demonstraram atividade de 2-HO-3-N-benzil-N(N-benzil-2-
etilamina) -14-naftoquinona sobre a partiacutecula viral de enterovirus De forma contraacuteria apesar
de se verificar a reduccedilatildeo de quase uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais
para o composto A4 natildeo considerou-se esta uma alteraccedilatildeo significativa pois devido agrave
magnitude do nuacutemero de UFPs se trata de uma alteraccedilatildeo muito pequena Portanto os
compostos avaliados neste trabalho natildeo produziram atividade virucida aparente frente ao
tratamento com as concentraccedilotildees de uso
56 Ensaio Antiviral
O sobrenadante de ceacutelulas tratadas previamente e infectadas por DENV1 coletado 48
horas poacutes infecccedilatildeo foi avaliado quanto agrave produccedilatildeo viral de partiacuteculas infecciosas pela
contagem de placas de lise e caacutelculo de Unidades Formadoras de Placa (Titulaccedilatildeo viral em
placa ndash UFPmL)
38
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral Sobrenadante de ceacutelulas tratadas e infectadas por DENV1
coletado apoacutes 48 horas e titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado
Tabela 4 Ensaio Antiviral Coleta do sobrenadante de ceacutelulas infectadas por DENV1 Tiacutetulo
viral (UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o
controle natildeo tratado como 100
Ao perceber um aumento no tiacutetulo viral frente ao tratamento com os compostos A1
A2 e A3 e uma reduccedilatildeo frente ao tratamento com A4 A5 e A6 foram escolhidos dois
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 119 x 105 10000
A1 235 x 105 19748
A2 228 x 105 19160
A3 318 x 105 26723
A4 128 x 104 1076
A5 186 x 103 156
A6 190 x 104 1597
A7 280 x 104 2353
A8 350 x 104 2941
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
40
Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
26
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Ensaio de citotoxicidade celular
Para avaliar a viabilidade da linhagem celular BHK-21 frente ao tratamento com oito
diferentes concentraccedilotildees dos compostos (A1 a A8) realizou-se um ensaio de MTT (brometo
de 3-[45-dimetil-tiazol-2-il]-25-difeniltetrazoacutelio) Este ensaio tem o objetivo de quantificar
espectrofotometricamente o crescimento celular a viabilidade e proliferaccedilatildeo podendo ser
utilizado como um indicador direto de citotoxicidade Trata-se de um ensaio colorimeacutetrico
para medir a atividade da redutase mitocondrial em ceacutelulas vivas Ele se baseia na reduccedilatildeo do
sal amarelo tetrazoacutelio (permeaacutevel agrave membrana celular) para cristais de formazan azuis
puacuterpura por ceacutelulas metabolicamente ativas a quantidade de formazan gerada medida por
espectrofotometria eacute proporcional ao nuacutemero de ceacutelulas viaacuteveis
A CC50 foi calculada plotando-se uma curva de porcentagem de viabilidade celular por
concentraccedilatildeo melhor representada na figura 7 pelo composto A7 e os resultados de CC50
para todos os compostos estatildeo representados na tabela 2 Foram feitos ensaios de
citotoxicidade com oito concentraccedilotildees diferentes sendo escolhida a maior concentraccedilatildeo que
natildeo apresentou citotoxicidade
Viabilidade Celular = [ ( A ndash B ) A ] x 100
Onde
A = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas natildeo tratadas
B = Densidade oacutetica (DO490) observada nos poccedilos onde estatildeo presentes ceacutelulas tratadas com
as respectivas concentraccedilotildees de cada composto
27
28
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (A curva dose resposta do composto A7 eacute a que
melhor representa a curva dose resposta esperada) Avaliou-se a viabilidade da linhagem
celular BHK-21 frente agrave diferentes concentraccedilotildees dos compostos realizando o ensaio de MTT
e determinando assim as concentraccedilotildees a serem utilizadas nos proacuteximos ensaios bem como
calculando a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) agrave partir da curva
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo
da concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50)
Composto Concentraccedilatildeo utilizada
[ ] microgmL
Concentraccedilatildeo citotoacutexica 50
(CC50) [ ] microgmL plusmn Desvio
Padratildeo
A1 ([ ]=1 mgmL) 00200 10010 plusmn 0014
A2 ([ ]=1 mgmL) 00025 09561 plusmn 0023
A3 ([ ]=1 mgmL) 00025 09988 plusmn 0017
A4 ([ ]=5 mgmL) 00125 10150 plusmn 0036
A5 ([ ]=10 mgmL) 00250 10590 plusmn 0047
A6 ([ ]=5 mgmL) 00250 08183 plusmn 0030
A7 ([ ]=5 mgmL) 00125 10280 plusmn 0052
A8 ([ ]=5 mgmL) 00125 09758 plusmn 0036
52 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan
Para corroborar o ensaio anterior de citotoxicidade utilizou -se o teste de viabilidade
celular pela teacutecnica da exclusatildeo do azul de tripan com a finalidade de determinar a
viabilidade das ceacutelulas Os procedimentos adotados no ensaio seguiram o manual do
equipamento contador automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL Automated Cell Counter) entatildeo
foi acrescentado agrave 10 microL da suspensatildeo celular 10 microL de azul de tripan (04) Apoacutes
homogeneizaccedilatildeo 10 microL da suspensatildeo foi colocada no local indicado da lacircmina proacutepria para
leitura e foi realizada a contagem sendo consideradas mortas (inviaacuteveis) as ceacutelulas que
incorporavam o corante e viaacuteveis as que excluiacuteam o azul de tripan
29
O equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
(A)
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan A avaliaccedilatildeo da
viabilidade celular foi realizada atraveacutes de um contador automaacutetico de ceacutelulas Este
equipamento possibilita explorar ferramentas de fotografia e avaliar alguns paracircmetros
importantes (A) fotografia das ceacutelulas (B) Zoom na fotografia das ceacutelulas com marcaccedilotildees
(em verde para ceacutelulas vivas e vermelho para mortas) e (D) contagem das ceacutelulas totais
ceacutelulas vivas e mortas graacutefico e meacutedia dos diacircmetros celulares das ceacutelulas vivas e mortas
(B)
(C)
30
O crescimento celular de ceacutelulas natildeo tratadas foi avaliado nos tempos de 0h (momento
da confecccedilatildeo da placa) 24h (momento de tratamento com os compostos) e 96 horas
(Momento em que todas as ceacutelulas foram tripsinizadas e contadas) para avaliar o perfil do
crescimento celular em ceacutelulas natildeo tratadas Foi observado um crescimento celular no periacuteodo
de 24 horas onde as ceacutelulas estavam incubadas com meio acrescido de 10 SFB Em 24
horas o meio foi trocado por 1 SFB e acrescido das substacircncias testes nas menores diluiccedilotildees
natildeo citotoacutexicas determinadas pelo ensaio do MTT Em 96 horas pode ser observado um
decaimento no nuacutemero de ceacutelulas vivas provavelmente devido ao crescimento celular (morte
por confluecircncia)
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas)
(A) (B)
31
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas (A)
Contagem de ceacutelulas vivas (B) Percentual de ceacutelulas viaacuteveis (Viabilidade celular ) e (C)
Meacutedia do diacircmetro apresentado pelas ceacutelulas vivas
Em 96 horas as ceacutelulas natildeo tratadas bem como as ceacutelulas tratadas por 72 horas com as
concentraccedilotildees de uso dos compostos foram tripsinizadas e avaliadas quanto ao nuacutemero de
ceacutelulas vivas viabilidade e diacircmetro celular apresentados na figura 10
Segundo se observa natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo aparente que possa demonstrar que
as concentraccedilotildees de uso dos compostos tenham causado alguma atividade citotoacutexica
corroborando assim os ensaios de citotoxicidade anteriores
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
A infectividade de um viacuterus depende de vaacuterios fatores entre eles da proporccedilatildeo de
partiacuteculas virais completas ou infecciosas da suscetibilidade da ceacutelula hospedeira e da
chance desta partiacutecula encontrar o receptor e penetrar na ceacutelula Quando ceacutelulas suscetiacuteveis
satildeo misturadas com uma suspensatildeo de viacuterus estas podem receber uma duas trecircs ou dez
partiacuteculas virais ou nenhuma Isto depende da proporccedilatildeo entre a quantidade de viacuterus
infecciosos presente no inoculo e a quantidade de ceacutelulas utilizada Esta relaccedilatildeo eacute denominada
de multiplicidade de infecccedilatildeo ou MOI Uma MOI=1 indica que a infecccedilatildeo foi feita em
principio com 1 viacuterus ou 1 dose infectante por ceacutelula
A determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo dos Dengue virus 1 e 2 a serem
utilizadas nos proacuteximos ensaios foi feita a partir da infecccedilatildeo de ceacutelulas BHK-21 por diferentes
(C)
32
concentraccedilotildees de viacuterus e revelaccedilatildeo com cristal violeta Escolheu-se a maior diluiccedilatildeo viral que
possibilitou a letalidade total das ceacutelulas (faixa onde todas as ceacutelulas estatildeo mortas utilizando
menor concentraccedilatildeo de viacuterus) As faixas escolhidas foram entatildeo calculadas levando-se em
consideraccedilatildeo o nuacutemero de ceacutelulas presentes no poccedilo e o nuacutemero de partiacuteculas virais que foram
adicionadas (Faixa3 para DENV2 e 2 para DENV1) Figura 11 Foi estipulado portanto a
Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 2 para DENV 2 e 5 para DENV 1
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI A partir da infecccedilatildeo da linhagem celular BHK-21 em
placa de 96 poccedilos com diferentes diluiccedilotildees de DENV foi determinado que a Multiplicidade
de infecccedilatildeo para o Dengue viacuterus sorotipos 1 e 2 seria de 5 e 2 respectivamente (colunas 2 -
DENV1 e 3 - DENV2)
54 Ensaio dose resposta
Apoacutes a determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas ideais realizou-se um
ensaio dose resposta tratando as ceacutelulas com oito concentraccedilotildees agrave partir das concentraccedilotildees natildeo
citotoacutexicas escolhidas para cada composto e em seguida infectando com DENV sorotipos 1 e
2 nas MOIs estipuladas anteriormente (5 e 2 respectivamente) A porcentagem do efeito
protetor conferida agraves ceacutelulas para cada concentraccedilatildeo de amostra testada foi calculada da
seguinte forma
33
EP = [ (A ndash B) (C ndash B) ] x 100
Onde
A Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas tratadas e infectadas
B Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e infectadas
C Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e natildeo infectadas
Este ensaio tem por objetivo identificar a resposta celular agrave infecccedilatildeo frente ao
tratamento com os compostos em diferentes concentraccedilotildees Assim como o ensaio de
toxicidade este ensaio feito utilizando a teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT permite o teste de vaacuterias
concentraccedilotildees diferentes em um menor tempo e com baixo gasto de material
34
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV1
(MOI=5)
35
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV2
(MOI=2)
36
Takegami et al (1998) demonstraram atividade de furanonaftoquinonas contra o viacuterus
da Encefalite Japonesa (Flavivirus) utilizando a concentraccedilatildeo de 3microgmL poreacutem para os
compostos apresentados avaliados pela teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT nenhuma das
concentraccedilotildees apresentadas produziu efeito antiviral significativo em relaccedilatildeo ao controle
celular como observado nas figuras 12 e 13
Apesar da teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT ser interessante como triagem de atividade
antiviral permitindo o teste de vaacuterias concentraccedilotildees dos compostos em menor tempo e
utilizando uma quantidade razoaacutevel de materiais optou-se por utilizar as maiores
concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas encontradas avaliando sua atividade antiviral por outras
teacutecnicas Como natildeo foi avaliada atividade antiviral preacutevia para nenhum dos compostos frente
agrave infecccedilatildeo por DENV1 e 2 foi selecionado o Dengue virus 1 para dar prosseguimento aos
ensaios
55 Ensaio Virucida
O ensaio virucida foi realizado para avaliar um potencial efeito dos compostos
diretamente sobre a partiacutecula viral Este ensaio eacute importante pois possibilita elucidar se o
composto pode produzir algum efeito sobre a partiacutecula viral impedindo que esta possa infectar
as ceacutelulas
Figura 14 Ensaio virucida Neste ensaio as aliacutequotas de DENV1 foram incubadas com as
concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos e titulados (NT) Controle natildeo tratado
37
Tabela 3 Ensaio virucida Caacutelculo do tiacutetulo viral (UFPmL) e porcentagem representante de
cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 254 x 105 100
DMSO 263 x 105 10335
A1 199 x 105 7835
A2 205 x 105 8071
A3 237 x 105 9311
A4 775 x 104 3049
A5 153 x 105 6024
A6 219 x 105 8602
A7 243 x 105 9547
A8 254 x 105 100
Lagrota et al (1988) demonstraram atividade de 2-HO-3-N-benzil-N(N-benzil-2-
etilamina) -14-naftoquinona sobre a partiacutecula viral de enterovirus De forma contraacuteria apesar
de se verificar a reduccedilatildeo de quase uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais
para o composto A4 natildeo considerou-se esta uma alteraccedilatildeo significativa pois devido agrave
magnitude do nuacutemero de UFPs se trata de uma alteraccedilatildeo muito pequena Portanto os
compostos avaliados neste trabalho natildeo produziram atividade virucida aparente frente ao
tratamento com as concentraccedilotildees de uso
56 Ensaio Antiviral
O sobrenadante de ceacutelulas tratadas previamente e infectadas por DENV1 coletado 48
horas poacutes infecccedilatildeo foi avaliado quanto agrave produccedilatildeo viral de partiacuteculas infecciosas pela
contagem de placas de lise e caacutelculo de Unidades Formadoras de Placa (Titulaccedilatildeo viral em
placa ndash UFPmL)
38
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral Sobrenadante de ceacutelulas tratadas e infectadas por DENV1
coletado apoacutes 48 horas e titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado
Tabela 4 Ensaio Antiviral Coleta do sobrenadante de ceacutelulas infectadas por DENV1 Tiacutetulo
viral (UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o
controle natildeo tratado como 100
Ao perceber um aumento no tiacutetulo viral frente ao tratamento com os compostos A1
A2 e A3 e uma reduccedilatildeo frente ao tratamento com A4 A5 e A6 foram escolhidos dois
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 119 x 105 10000
A1 235 x 105 19748
A2 228 x 105 19160
A3 318 x 105 26723
A4 128 x 104 1076
A5 186 x 103 156
A6 190 x 104 1597
A7 280 x 104 2353
A8 350 x 104 2941
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
40
Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
27
28
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (A curva dose resposta do composto A7 eacute a que
melhor representa a curva dose resposta esperada) Avaliou-se a viabilidade da linhagem
celular BHK-21 frente agrave diferentes concentraccedilotildees dos compostos realizando o ensaio de MTT
e determinando assim as concentraccedilotildees a serem utilizadas nos proacuteximos ensaios bem como
calculando a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) agrave partir da curva
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo
da concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50)
Composto Concentraccedilatildeo utilizada
[ ] microgmL
Concentraccedilatildeo citotoacutexica 50
(CC50) [ ] microgmL plusmn Desvio
Padratildeo
A1 ([ ]=1 mgmL) 00200 10010 plusmn 0014
A2 ([ ]=1 mgmL) 00025 09561 plusmn 0023
A3 ([ ]=1 mgmL) 00025 09988 plusmn 0017
A4 ([ ]=5 mgmL) 00125 10150 plusmn 0036
A5 ([ ]=10 mgmL) 00250 10590 plusmn 0047
A6 ([ ]=5 mgmL) 00250 08183 plusmn 0030
A7 ([ ]=5 mgmL) 00125 10280 plusmn 0052
A8 ([ ]=5 mgmL) 00125 09758 plusmn 0036
52 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan
Para corroborar o ensaio anterior de citotoxicidade utilizou -se o teste de viabilidade
celular pela teacutecnica da exclusatildeo do azul de tripan com a finalidade de determinar a
viabilidade das ceacutelulas Os procedimentos adotados no ensaio seguiram o manual do
equipamento contador automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL Automated Cell Counter) entatildeo
foi acrescentado agrave 10 microL da suspensatildeo celular 10 microL de azul de tripan (04) Apoacutes
homogeneizaccedilatildeo 10 microL da suspensatildeo foi colocada no local indicado da lacircmina proacutepria para
leitura e foi realizada a contagem sendo consideradas mortas (inviaacuteveis) as ceacutelulas que
incorporavam o corante e viaacuteveis as que excluiacuteam o azul de tripan
29
O equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
(A)
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan A avaliaccedilatildeo da
viabilidade celular foi realizada atraveacutes de um contador automaacutetico de ceacutelulas Este
equipamento possibilita explorar ferramentas de fotografia e avaliar alguns paracircmetros
importantes (A) fotografia das ceacutelulas (B) Zoom na fotografia das ceacutelulas com marcaccedilotildees
(em verde para ceacutelulas vivas e vermelho para mortas) e (D) contagem das ceacutelulas totais
ceacutelulas vivas e mortas graacutefico e meacutedia dos diacircmetros celulares das ceacutelulas vivas e mortas
(B)
(C)
30
O crescimento celular de ceacutelulas natildeo tratadas foi avaliado nos tempos de 0h (momento
da confecccedilatildeo da placa) 24h (momento de tratamento com os compostos) e 96 horas
(Momento em que todas as ceacutelulas foram tripsinizadas e contadas) para avaliar o perfil do
crescimento celular em ceacutelulas natildeo tratadas Foi observado um crescimento celular no periacuteodo
de 24 horas onde as ceacutelulas estavam incubadas com meio acrescido de 10 SFB Em 24
horas o meio foi trocado por 1 SFB e acrescido das substacircncias testes nas menores diluiccedilotildees
natildeo citotoacutexicas determinadas pelo ensaio do MTT Em 96 horas pode ser observado um
decaimento no nuacutemero de ceacutelulas vivas provavelmente devido ao crescimento celular (morte
por confluecircncia)
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas)
(A) (B)
31
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas (A)
Contagem de ceacutelulas vivas (B) Percentual de ceacutelulas viaacuteveis (Viabilidade celular ) e (C)
Meacutedia do diacircmetro apresentado pelas ceacutelulas vivas
Em 96 horas as ceacutelulas natildeo tratadas bem como as ceacutelulas tratadas por 72 horas com as
concentraccedilotildees de uso dos compostos foram tripsinizadas e avaliadas quanto ao nuacutemero de
ceacutelulas vivas viabilidade e diacircmetro celular apresentados na figura 10
Segundo se observa natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo aparente que possa demonstrar que
as concentraccedilotildees de uso dos compostos tenham causado alguma atividade citotoacutexica
corroborando assim os ensaios de citotoxicidade anteriores
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
A infectividade de um viacuterus depende de vaacuterios fatores entre eles da proporccedilatildeo de
partiacuteculas virais completas ou infecciosas da suscetibilidade da ceacutelula hospedeira e da
chance desta partiacutecula encontrar o receptor e penetrar na ceacutelula Quando ceacutelulas suscetiacuteveis
satildeo misturadas com uma suspensatildeo de viacuterus estas podem receber uma duas trecircs ou dez
partiacuteculas virais ou nenhuma Isto depende da proporccedilatildeo entre a quantidade de viacuterus
infecciosos presente no inoculo e a quantidade de ceacutelulas utilizada Esta relaccedilatildeo eacute denominada
de multiplicidade de infecccedilatildeo ou MOI Uma MOI=1 indica que a infecccedilatildeo foi feita em
principio com 1 viacuterus ou 1 dose infectante por ceacutelula
A determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo dos Dengue virus 1 e 2 a serem
utilizadas nos proacuteximos ensaios foi feita a partir da infecccedilatildeo de ceacutelulas BHK-21 por diferentes
(C)
32
concentraccedilotildees de viacuterus e revelaccedilatildeo com cristal violeta Escolheu-se a maior diluiccedilatildeo viral que
possibilitou a letalidade total das ceacutelulas (faixa onde todas as ceacutelulas estatildeo mortas utilizando
menor concentraccedilatildeo de viacuterus) As faixas escolhidas foram entatildeo calculadas levando-se em
consideraccedilatildeo o nuacutemero de ceacutelulas presentes no poccedilo e o nuacutemero de partiacuteculas virais que foram
adicionadas (Faixa3 para DENV2 e 2 para DENV1) Figura 11 Foi estipulado portanto a
Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 2 para DENV 2 e 5 para DENV 1
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI A partir da infecccedilatildeo da linhagem celular BHK-21 em
placa de 96 poccedilos com diferentes diluiccedilotildees de DENV foi determinado que a Multiplicidade
de infecccedilatildeo para o Dengue viacuterus sorotipos 1 e 2 seria de 5 e 2 respectivamente (colunas 2 -
DENV1 e 3 - DENV2)
54 Ensaio dose resposta
Apoacutes a determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas ideais realizou-se um
ensaio dose resposta tratando as ceacutelulas com oito concentraccedilotildees agrave partir das concentraccedilotildees natildeo
citotoacutexicas escolhidas para cada composto e em seguida infectando com DENV sorotipos 1 e
2 nas MOIs estipuladas anteriormente (5 e 2 respectivamente) A porcentagem do efeito
protetor conferida agraves ceacutelulas para cada concentraccedilatildeo de amostra testada foi calculada da
seguinte forma
33
EP = [ (A ndash B) (C ndash B) ] x 100
Onde
A Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas tratadas e infectadas
B Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e infectadas
C Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e natildeo infectadas
Este ensaio tem por objetivo identificar a resposta celular agrave infecccedilatildeo frente ao
tratamento com os compostos em diferentes concentraccedilotildees Assim como o ensaio de
toxicidade este ensaio feito utilizando a teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT permite o teste de vaacuterias
concentraccedilotildees diferentes em um menor tempo e com baixo gasto de material
34
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV1
(MOI=5)
35
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV2
(MOI=2)
36
Takegami et al (1998) demonstraram atividade de furanonaftoquinonas contra o viacuterus
da Encefalite Japonesa (Flavivirus) utilizando a concentraccedilatildeo de 3microgmL poreacutem para os
compostos apresentados avaliados pela teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT nenhuma das
concentraccedilotildees apresentadas produziu efeito antiviral significativo em relaccedilatildeo ao controle
celular como observado nas figuras 12 e 13
Apesar da teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT ser interessante como triagem de atividade
antiviral permitindo o teste de vaacuterias concentraccedilotildees dos compostos em menor tempo e
utilizando uma quantidade razoaacutevel de materiais optou-se por utilizar as maiores
concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas encontradas avaliando sua atividade antiviral por outras
teacutecnicas Como natildeo foi avaliada atividade antiviral preacutevia para nenhum dos compostos frente
agrave infecccedilatildeo por DENV1 e 2 foi selecionado o Dengue virus 1 para dar prosseguimento aos
ensaios
55 Ensaio Virucida
O ensaio virucida foi realizado para avaliar um potencial efeito dos compostos
diretamente sobre a partiacutecula viral Este ensaio eacute importante pois possibilita elucidar se o
composto pode produzir algum efeito sobre a partiacutecula viral impedindo que esta possa infectar
as ceacutelulas
Figura 14 Ensaio virucida Neste ensaio as aliacutequotas de DENV1 foram incubadas com as
concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos e titulados (NT) Controle natildeo tratado
37
Tabela 3 Ensaio virucida Caacutelculo do tiacutetulo viral (UFPmL) e porcentagem representante de
cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 254 x 105 100
DMSO 263 x 105 10335
A1 199 x 105 7835
A2 205 x 105 8071
A3 237 x 105 9311
A4 775 x 104 3049
A5 153 x 105 6024
A6 219 x 105 8602
A7 243 x 105 9547
A8 254 x 105 100
Lagrota et al (1988) demonstraram atividade de 2-HO-3-N-benzil-N(N-benzil-2-
etilamina) -14-naftoquinona sobre a partiacutecula viral de enterovirus De forma contraacuteria apesar
de se verificar a reduccedilatildeo de quase uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais
para o composto A4 natildeo considerou-se esta uma alteraccedilatildeo significativa pois devido agrave
magnitude do nuacutemero de UFPs se trata de uma alteraccedilatildeo muito pequena Portanto os
compostos avaliados neste trabalho natildeo produziram atividade virucida aparente frente ao
tratamento com as concentraccedilotildees de uso
56 Ensaio Antiviral
O sobrenadante de ceacutelulas tratadas previamente e infectadas por DENV1 coletado 48
horas poacutes infecccedilatildeo foi avaliado quanto agrave produccedilatildeo viral de partiacuteculas infecciosas pela
contagem de placas de lise e caacutelculo de Unidades Formadoras de Placa (Titulaccedilatildeo viral em
placa ndash UFPmL)
38
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral Sobrenadante de ceacutelulas tratadas e infectadas por DENV1
coletado apoacutes 48 horas e titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado
Tabela 4 Ensaio Antiviral Coleta do sobrenadante de ceacutelulas infectadas por DENV1 Tiacutetulo
viral (UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o
controle natildeo tratado como 100
Ao perceber um aumento no tiacutetulo viral frente ao tratamento com os compostos A1
A2 e A3 e uma reduccedilatildeo frente ao tratamento com A4 A5 e A6 foram escolhidos dois
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 119 x 105 10000
A1 235 x 105 19748
A2 228 x 105 19160
A3 318 x 105 26723
A4 128 x 104 1076
A5 186 x 103 156
A6 190 x 104 1597
A7 280 x 104 2353
A8 350 x 104 2941
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
40
Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
28
Figura 7 Ensaio de Citotoxicidade (A curva dose resposta do composto A7 eacute a que
melhor representa a curva dose resposta esperada) Avaliou-se a viabilidade da linhagem
celular BHK-21 frente agrave diferentes concentraccedilotildees dos compostos realizando o ensaio de MTT
e determinando assim as concentraccedilotildees a serem utilizadas nos proacuteximos ensaios bem como
calculando a concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50) agrave partir da curva
Tabela 2 Concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas escolhidas para os proacuteximos ensaios e caacutelculo
da concentraccedilatildeo citotoacutexica 50 (CC50)
Composto Concentraccedilatildeo utilizada
[ ] microgmL
Concentraccedilatildeo citotoacutexica 50
(CC50) [ ] microgmL plusmn Desvio
Padratildeo
A1 ([ ]=1 mgmL) 00200 10010 plusmn 0014
A2 ([ ]=1 mgmL) 00025 09561 plusmn 0023
A3 ([ ]=1 mgmL) 00025 09988 plusmn 0017
A4 ([ ]=5 mgmL) 00125 10150 plusmn 0036
A5 ([ ]=10 mgmL) 00250 10590 plusmn 0047
A6 ([ ]=5 mgmL) 00250 08183 plusmn 0030
A7 ([ ]=5 mgmL) 00125 10280 plusmn 0052
A8 ([ ]=5 mgmL) 00125 09758 plusmn 0036
52 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan
Para corroborar o ensaio anterior de citotoxicidade utilizou -se o teste de viabilidade
celular pela teacutecnica da exclusatildeo do azul de tripan com a finalidade de determinar a
viabilidade das ceacutelulas Os procedimentos adotados no ensaio seguiram o manual do
equipamento contador automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL Automated Cell Counter) entatildeo
foi acrescentado agrave 10 microL da suspensatildeo celular 10 microL de azul de tripan (04) Apoacutes
homogeneizaccedilatildeo 10 microL da suspensatildeo foi colocada no local indicado da lacircmina proacutepria para
leitura e foi realizada a contagem sendo consideradas mortas (inviaacuteveis) as ceacutelulas que
incorporavam o corante e viaacuteveis as que excluiacuteam o azul de tripan
29
O equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
(A)
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan A avaliaccedilatildeo da
viabilidade celular foi realizada atraveacutes de um contador automaacutetico de ceacutelulas Este
equipamento possibilita explorar ferramentas de fotografia e avaliar alguns paracircmetros
importantes (A) fotografia das ceacutelulas (B) Zoom na fotografia das ceacutelulas com marcaccedilotildees
(em verde para ceacutelulas vivas e vermelho para mortas) e (D) contagem das ceacutelulas totais
ceacutelulas vivas e mortas graacutefico e meacutedia dos diacircmetros celulares das ceacutelulas vivas e mortas
(B)
(C)
30
O crescimento celular de ceacutelulas natildeo tratadas foi avaliado nos tempos de 0h (momento
da confecccedilatildeo da placa) 24h (momento de tratamento com os compostos) e 96 horas
(Momento em que todas as ceacutelulas foram tripsinizadas e contadas) para avaliar o perfil do
crescimento celular em ceacutelulas natildeo tratadas Foi observado um crescimento celular no periacuteodo
de 24 horas onde as ceacutelulas estavam incubadas com meio acrescido de 10 SFB Em 24
horas o meio foi trocado por 1 SFB e acrescido das substacircncias testes nas menores diluiccedilotildees
natildeo citotoacutexicas determinadas pelo ensaio do MTT Em 96 horas pode ser observado um
decaimento no nuacutemero de ceacutelulas vivas provavelmente devido ao crescimento celular (morte
por confluecircncia)
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas)
(A) (B)
31
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas (A)
Contagem de ceacutelulas vivas (B) Percentual de ceacutelulas viaacuteveis (Viabilidade celular ) e (C)
Meacutedia do diacircmetro apresentado pelas ceacutelulas vivas
Em 96 horas as ceacutelulas natildeo tratadas bem como as ceacutelulas tratadas por 72 horas com as
concentraccedilotildees de uso dos compostos foram tripsinizadas e avaliadas quanto ao nuacutemero de
ceacutelulas vivas viabilidade e diacircmetro celular apresentados na figura 10
Segundo se observa natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo aparente que possa demonstrar que
as concentraccedilotildees de uso dos compostos tenham causado alguma atividade citotoacutexica
corroborando assim os ensaios de citotoxicidade anteriores
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
A infectividade de um viacuterus depende de vaacuterios fatores entre eles da proporccedilatildeo de
partiacuteculas virais completas ou infecciosas da suscetibilidade da ceacutelula hospedeira e da
chance desta partiacutecula encontrar o receptor e penetrar na ceacutelula Quando ceacutelulas suscetiacuteveis
satildeo misturadas com uma suspensatildeo de viacuterus estas podem receber uma duas trecircs ou dez
partiacuteculas virais ou nenhuma Isto depende da proporccedilatildeo entre a quantidade de viacuterus
infecciosos presente no inoculo e a quantidade de ceacutelulas utilizada Esta relaccedilatildeo eacute denominada
de multiplicidade de infecccedilatildeo ou MOI Uma MOI=1 indica que a infecccedilatildeo foi feita em
principio com 1 viacuterus ou 1 dose infectante por ceacutelula
A determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo dos Dengue virus 1 e 2 a serem
utilizadas nos proacuteximos ensaios foi feita a partir da infecccedilatildeo de ceacutelulas BHK-21 por diferentes
(C)
32
concentraccedilotildees de viacuterus e revelaccedilatildeo com cristal violeta Escolheu-se a maior diluiccedilatildeo viral que
possibilitou a letalidade total das ceacutelulas (faixa onde todas as ceacutelulas estatildeo mortas utilizando
menor concentraccedilatildeo de viacuterus) As faixas escolhidas foram entatildeo calculadas levando-se em
consideraccedilatildeo o nuacutemero de ceacutelulas presentes no poccedilo e o nuacutemero de partiacuteculas virais que foram
adicionadas (Faixa3 para DENV2 e 2 para DENV1) Figura 11 Foi estipulado portanto a
Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 2 para DENV 2 e 5 para DENV 1
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI A partir da infecccedilatildeo da linhagem celular BHK-21 em
placa de 96 poccedilos com diferentes diluiccedilotildees de DENV foi determinado que a Multiplicidade
de infecccedilatildeo para o Dengue viacuterus sorotipos 1 e 2 seria de 5 e 2 respectivamente (colunas 2 -
DENV1 e 3 - DENV2)
54 Ensaio dose resposta
Apoacutes a determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas ideais realizou-se um
ensaio dose resposta tratando as ceacutelulas com oito concentraccedilotildees agrave partir das concentraccedilotildees natildeo
citotoacutexicas escolhidas para cada composto e em seguida infectando com DENV sorotipos 1 e
2 nas MOIs estipuladas anteriormente (5 e 2 respectivamente) A porcentagem do efeito
protetor conferida agraves ceacutelulas para cada concentraccedilatildeo de amostra testada foi calculada da
seguinte forma
33
EP = [ (A ndash B) (C ndash B) ] x 100
Onde
A Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas tratadas e infectadas
B Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e infectadas
C Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e natildeo infectadas
Este ensaio tem por objetivo identificar a resposta celular agrave infecccedilatildeo frente ao
tratamento com os compostos em diferentes concentraccedilotildees Assim como o ensaio de
toxicidade este ensaio feito utilizando a teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT permite o teste de vaacuterias
concentraccedilotildees diferentes em um menor tempo e com baixo gasto de material
34
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV1
(MOI=5)
35
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV2
(MOI=2)
36
Takegami et al (1998) demonstraram atividade de furanonaftoquinonas contra o viacuterus
da Encefalite Japonesa (Flavivirus) utilizando a concentraccedilatildeo de 3microgmL poreacutem para os
compostos apresentados avaliados pela teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT nenhuma das
concentraccedilotildees apresentadas produziu efeito antiviral significativo em relaccedilatildeo ao controle
celular como observado nas figuras 12 e 13
Apesar da teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT ser interessante como triagem de atividade
antiviral permitindo o teste de vaacuterias concentraccedilotildees dos compostos em menor tempo e
utilizando uma quantidade razoaacutevel de materiais optou-se por utilizar as maiores
concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas encontradas avaliando sua atividade antiviral por outras
teacutecnicas Como natildeo foi avaliada atividade antiviral preacutevia para nenhum dos compostos frente
agrave infecccedilatildeo por DENV1 e 2 foi selecionado o Dengue virus 1 para dar prosseguimento aos
ensaios
55 Ensaio Virucida
O ensaio virucida foi realizado para avaliar um potencial efeito dos compostos
diretamente sobre a partiacutecula viral Este ensaio eacute importante pois possibilita elucidar se o
composto pode produzir algum efeito sobre a partiacutecula viral impedindo que esta possa infectar
as ceacutelulas
Figura 14 Ensaio virucida Neste ensaio as aliacutequotas de DENV1 foram incubadas com as
concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos e titulados (NT) Controle natildeo tratado
37
Tabela 3 Ensaio virucida Caacutelculo do tiacutetulo viral (UFPmL) e porcentagem representante de
cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 254 x 105 100
DMSO 263 x 105 10335
A1 199 x 105 7835
A2 205 x 105 8071
A3 237 x 105 9311
A4 775 x 104 3049
A5 153 x 105 6024
A6 219 x 105 8602
A7 243 x 105 9547
A8 254 x 105 100
Lagrota et al (1988) demonstraram atividade de 2-HO-3-N-benzil-N(N-benzil-2-
etilamina) -14-naftoquinona sobre a partiacutecula viral de enterovirus De forma contraacuteria apesar
de se verificar a reduccedilatildeo de quase uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais
para o composto A4 natildeo considerou-se esta uma alteraccedilatildeo significativa pois devido agrave
magnitude do nuacutemero de UFPs se trata de uma alteraccedilatildeo muito pequena Portanto os
compostos avaliados neste trabalho natildeo produziram atividade virucida aparente frente ao
tratamento com as concentraccedilotildees de uso
56 Ensaio Antiviral
O sobrenadante de ceacutelulas tratadas previamente e infectadas por DENV1 coletado 48
horas poacutes infecccedilatildeo foi avaliado quanto agrave produccedilatildeo viral de partiacuteculas infecciosas pela
contagem de placas de lise e caacutelculo de Unidades Formadoras de Placa (Titulaccedilatildeo viral em
placa ndash UFPmL)
38
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral Sobrenadante de ceacutelulas tratadas e infectadas por DENV1
coletado apoacutes 48 horas e titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado
Tabela 4 Ensaio Antiviral Coleta do sobrenadante de ceacutelulas infectadas por DENV1 Tiacutetulo
viral (UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o
controle natildeo tratado como 100
Ao perceber um aumento no tiacutetulo viral frente ao tratamento com os compostos A1
A2 e A3 e uma reduccedilatildeo frente ao tratamento com A4 A5 e A6 foram escolhidos dois
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 119 x 105 10000
A1 235 x 105 19748
A2 228 x 105 19160
A3 318 x 105 26723
A4 128 x 104 1076
A5 186 x 103 156
A6 190 x 104 1597
A7 280 x 104 2353
A8 350 x 104 2941
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
40
Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
29
O equipamento foi ajustado em brilho 15 e foi considerada a leitura da primeira inserccedilatildeo da
placa para todos os compostos e para o controle
(A)
Figura 8 Avaliaccedilatildeo da viabilidade celular por exclusatildeo de azul de tripan A avaliaccedilatildeo da
viabilidade celular foi realizada atraveacutes de um contador automaacutetico de ceacutelulas Este
equipamento possibilita explorar ferramentas de fotografia e avaliar alguns paracircmetros
importantes (A) fotografia das ceacutelulas (B) Zoom na fotografia das ceacutelulas com marcaccedilotildees
(em verde para ceacutelulas vivas e vermelho para mortas) e (D) contagem das ceacutelulas totais
ceacutelulas vivas e mortas graacutefico e meacutedia dos diacircmetros celulares das ceacutelulas vivas e mortas
(B)
(C)
30
O crescimento celular de ceacutelulas natildeo tratadas foi avaliado nos tempos de 0h (momento
da confecccedilatildeo da placa) 24h (momento de tratamento com os compostos) e 96 horas
(Momento em que todas as ceacutelulas foram tripsinizadas e contadas) para avaliar o perfil do
crescimento celular em ceacutelulas natildeo tratadas Foi observado um crescimento celular no periacuteodo
de 24 horas onde as ceacutelulas estavam incubadas com meio acrescido de 10 SFB Em 24
horas o meio foi trocado por 1 SFB e acrescido das substacircncias testes nas menores diluiccedilotildees
natildeo citotoacutexicas determinadas pelo ensaio do MTT Em 96 horas pode ser observado um
decaimento no nuacutemero de ceacutelulas vivas provavelmente devido ao crescimento celular (morte
por confluecircncia)
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas)
(A) (B)
31
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas (A)
Contagem de ceacutelulas vivas (B) Percentual de ceacutelulas viaacuteveis (Viabilidade celular ) e (C)
Meacutedia do diacircmetro apresentado pelas ceacutelulas vivas
Em 96 horas as ceacutelulas natildeo tratadas bem como as ceacutelulas tratadas por 72 horas com as
concentraccedilotildees de uso dos compostos foram tripsinizadas e avaliadas quanto ao nuacutemero de
ceacutelulas vivas viabilidade e diacircmetro celular apresentados na figura 10
Segundo se observa natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo aparente que possa demonstrar que
as concentraccedilotildees de uso dos compostos tenham causado alguma atividade citotoacutexica
corroborando assim os ensaios de citotoxicidade anteriores
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
A infectividade de um viacuterus depende de vaacuterios fatores entre eles da proporccedilatildeo de
partiacuteculas virais completas ou infecciosas da suscetibilidade da ceacutelula hospedeira e da
chance desta partiacutecula encontrar o receptor e penetrar na ceacutelula Quando ceacutelulas suscetiacuteveis
satildeo misturadas com uma suspensatildeo de viacuterus estas podem receber uma duas trecircs ou dez
partiacuteculas virais ou nenhuma Isto depende da proporccedilatildeo entre a quantidade de viacuterus
infecciosos presente no inoculo e a quantidade de ceacutelulas utilizada Esta relaccedilatildeo eacute denominada
de multiplicidade de infecccedilatildeo ou MOI Uma MOI=1 indica que a infecccedilatildeo foi feita em
principio com 1 viacuterus ou 1 dose infectante por ceacutelula
A determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo dos Dengue virus 1 e 2 a serem
utilizadas nos proacuteximos ensaios foi feita a partir da infecccedilatildeo de ceacutelulas BHK-21 por diferentes
(C)
32
concentraccedilotildees de viacuterus e revelaccedilatildeo com cristal violeta Escolheu-se a maior diluiccedilatildeo viral que
possibilitou a letalidade total das ceacutelulas (faixa onde todas as ceacutelulas estatildeo mortas utilizando
menor concentraccedilatildeo de viacuterus) As faixas escolhidas foram entatildeo calculadas levando-se em
consideraccedilatildeo o nuacutemero de ceacutelulas presentes no poccedilo e o nuacutemero de partiacuteculas virais que foram
adicionadas (Faixa3 para DENV2 e 2 para DENV1) Figura 11 Foi estipulado portanto a
Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 2 para DENV 2 e 5 para DENV 1
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI A partir da infecccedilatildeo da linhagem celular BHK-21 em
placa de 96 poccedilos com diferentes diluiccedilotildees de DENV foi determinado que a Multiplicidade
de infecccedilatildeo para o Dengue viacuterus sorotipos 1 e 2 seria de 5 e 2 respectivamente (colunas 2 -
DENV1 e 3 - DENV2)
54 Ensaio dose resposta
Apoacutes a determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas ideais realizou-se um
ensaio dose resposta tratando as ceacutelulas com oito concentraccedilotildees agrave partir das concentraccedilotildees natildeo
citotoacutexicas escolhidas para cada composto e em seguida infectando com DENV sorotipos 1 e
2 nas MOIs estipuladas anteriormente (5 e 2 respectivamente) A porcentagem do efeito
protetor conferida agraves ceacutelulas para cada concentraccedilatildeo de amostra testada foi calculada da
seguinte forma
33
EP = [ (A ndash B) (C ndash B) ] x 100
Onde
A Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas tratadas e infectadas
B Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e infectadas
C Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e natildeo infectadas
Este ensaio tem por objetivo identificar a resposta celular agrave infecccedilatildeo frente ao
tratamento com os compostos em diferentes concentraccedilotildees Assim como o ensaio de
toxicidade este ensaio feito utilizando a teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT permite o teste de vaacuterias
concentraccedilotildees diferentes em um menor tempo e com baixo gasto de material
34
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV1
(MOI=5)
35
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV2
(MOI=2)
36
Takegami et al (1998) demonstraram atividade de furanonaftoquinonas contra o viacuterus
da Encefalite Japonesa (Flavivirus) utilizando a concentraccedilatildeo de 3microgmL poreacutem para os
compostos apresentados avaliados pela teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT nenhuma das
concentraccedilotildees apresentadas produziu efeito antiviral significativo em relaccedilatildeo ao controle
celular como observado nas figuras 12 e 13
Apesar da teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT ser interessante como triagem de atividade
antiviral permitindo o teste de vaacuterias concentraccedilotildees dos compostos em menor tempo e
utilizando uma quantidade razoaacutevel de materiais optou-se por utilizar as maiores
concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas encontradas avaliando sua atividade antiviral por outras
teacutecnicas Como natildeo foi avaliada atividade antiviral preacutevia para nenhum dos compostos frente
agrave infecccedilatildeo por DENV1 e 2 foi selecionado o Dengue virus 1 para dar prosseguimento aos
ensaios
55 Ensaio Virucida
O ensaio virucida foi realizado para avaliar um potencial efeito dos compostos
diretamente sobre a partiacutecula viral Este ensaio eacute importante pois possibilita elucidar se o
composto pode produzir algum efeito sobre a partiacutecula viral impedindo que esta possa infectar
as ceacutelulas
Figura 14 Ensaio virucida Neste ensaio as aliacutequotas de DENV1 foram incubadas com as
concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos e titulados (NT) Controle natildeo tratado
37
Tabela 3 Ensaio virucida Caacutelculo do tiacutetulo viral (UFPmL) e porcentagem representante de
cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 254 x 105 100
DMSO 263 x 105 10335
A1 199 x 105 7835
A2 205 x 105 8071
A3 237 x 105 9311
A4 775 x 104 3049
A5 153 x 105 6024
A6 219 x 105 8602
A7 243 x 105 9547
A8 254 x 105 100
Lagrota et al (1988) demonstraram atividade de 2-HO-3-N-benzil-N(N-benzil-2-
etilamina) -14-naftoquinona sobre a partiacutecula viral de enterovirus De forma contraacuteria apesar
de se verificar a reduccedilatildeo de quase uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais
para o composto A4 natildeo considerou-se esta uma alteraccedilatildeo significativa pois devido agrave
magnitude do nuacutemero de UFPs se trata de uma alteraccedilatildeo muito pequena Portanto os
compostos avaliados neste trabalho natildeo produziram atividade virucida aparente frente ao
tratamento com as concentraccedilotildees de uso
56 Ensaio Antiviral
O sobrenadante de ceacutelulas tratadas previamente e infectadas por DENV1 coletado 48
horas poacutes infecccedilatildeo foi avaliado quanto agrave produccedilatildeo viral de partiacuteculas infecciosas pela
contagem de placas de lise e caacutelculo de Unidades Formadoras de Placa (Titulaccedilatildeo viral em
placa ndash UFPmL)
38
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral Sobrenadante de ceacutelulas tratadas e infectadas por DENV1
coletado apoacutes 48 horas e titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado
Tabela 4 Ensaio Antiviral Coleta do sobrenadante de ceacutelulas infectadas por DENV1 Tiacutetulo
viral (UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o
controle natildeo tratado como 100
Ao perceber um aumento no tiacutetulo viral frente ao tratamento com os compostos A1
A2 e A3 e uma reduccedilatildeo frente ao tratamento com A4 A5 e A6 foram escolhidos dois
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 119 x 105 10000
A1 235 x 105 19748
A2 228 x 105 19160
A3 318 x 105 26723
A4 128 x 104 1076
A5 186 x 103 156
A6 190 x 104 1597
A7 280 x 104 2353
A8 350 x 104 2941
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
40
Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
30
O crescimento celular de ceacutelulas natildeo tratadas foi avaliado nos tempos de 0h (momento
da confecccedilatildeo da placa) 24h (momento de tratamento com os compostos) e 96 horas
(Momento em que todas as ceacutelulas foram tripsinizadas e contadas) para avaliar o perfil do
crescimento celular em ceacutelulas natildeo tratadas Foi observado um crescimento celular no periacuteodo
de 24 horas onde as ceacutelulas estavam incubadas com meio acrescido de 10 SFB Em 24
horas o meio foi trocado por 1 SFB e acrescido das substacircncias testes nas menores diluiccedilotildees
natildeo citotoacutexicas determinadas pelo ensaio do MTT Em 96 horas pode ser observado um
decaimento no nuacutemero de ceacutelulas vivas provavelmente devido ao crescimento celular (morte
por confluecircncia)
Figura 9 Curva de multiplicaccedilatildeo celular em diferentes tempos (0 24 e 96 horas)
(A) (B)
31
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas (A)
Contagem de ceacutelulas vivas (B) Percentual de ceacutelulas viaacuteveis (Viabilidade celular ) e (C)
Meacutedia do diacircmetro apresentado pelas ceacutelulas vivas
Em 96 horas as ceacutelulas natildeo tratadas bem como as ceacutelulas tratadas por 72 horas com as
concentraccedilotildees de uso dos compostos foram tripsinizadas e avaliadas quanto ao nuacutemero de
ceacutelulas vivas viabilidade e diacircmetro celular apresentados na figura 10
Segundo se observa natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo aparente que possa demonstrar que
as concentraccedilotildees de uso dos compostos tenham causado alguma atividade citotoacutexica
corroborando assim os ensaios de citotoxicidade anteriores
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
A infectividade de um viacuterus depende de vaacuterios fatores entre eles da proporccedilatildeo de
partiacuteculas virais completas ou infecciosas da suscetibilidade da ceacutelula hospedeira e da
chance desta partiacutecula encontrar o receptor e penetrar na ceacutelula Quando ceacutelulas suscetiacuteveis
satildeo misturadas com uma suspensatildeo de viacuterus estas podem receber uma duas trecircs ou dez
partiacuteculas virais ou nenhuma Isto depende da proporccedilatildeo entre a quantidade de viacuterus
infecciosos presente no inoculo e a quantidade de ceacutelulas utilizada Esta relaccedilatildeo eacute denominada
de multiplicidade de infecccedilatildeo ou MOI Uma MOI=1 indica que a infecccedilatildeo foi feita em
principio com 1 viacuterus ou 1 dose infectante por ceacutelula
A determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo dos Dengue virus 1 e 2 a serem
utilizadas nos proacuteximos ensaios foi feita a partir da infecccedilatildeo de ceacutelulas BHK-21 por diferentes
(C)
32
concentraccedilotildees de viacuterus e revelaccedilatildeo com cristal violeta Escolheu-se a maior diluiccedilatildeo viral que
possibilitou a letalidade total das ceacutelulas (faixa onde todas as ceacutelulas estatildeo mortas utilizando
menor concentraccedilatildeo de viacuterus) As faixas escolhidas foram entatildeo calculadas levando-se em
consideraccedilatildeo o nuacutemero de ceacutelulas presentes no poccedilo e o nuacutemero de partiacuteculas virais que foram
adicionadas (Faixa3 para DENV2 e 2 para DENV1) Figura 11 Foi estipulado portanto a
Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 2 para DENV 2 e 5 para DENV 1
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI A partir da infecccedilatildeo da linhagem celular BHK-21 em
placa de 96 poccedilos com diferentes diluiccedilotildees de DENV foi determinado que a Multiplicidade
de infecccedilatildeo para o Dengue viacuterus sorotipos 1 e 2 seria de 5 e 2 respectivamente (colunas 2 -
DENV1 e 3 - DENV2)
54 Ensaio dose resposta
Apoacutes a determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas ideais realizou-se um
ensaio dose resposta tratando as ceacutelulas com oito concentraccedilotildees agrave partir das concentraccedilotildees natildeo
citotoacutexicas escolhidas para cada composto e em seguida infectando com DENV sorotipos 1 e
2 nas MOIs estipuladas anteriormente (5 e 2 respectivamente) A porcentagem do efeito
protetor conferida agraves ceacutelulas para cada concentraccedilatildeo de amostra testada foi calculada da
seguinte forma
33
EP = [ (A ndash B) (C ndash B) ] x 100
Onde
A Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas tratadas e infectadas
B Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e infectadas
C Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e natildeo infectadas
Este ensaio tem por objetivo identificar a resposta celular agrave infecccedilatildeo frente ao
tratamento com os compostos em diferentes concentraccedilotildees Assim como o ensaio de
toxicidade este ensaio feito utilizando a teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT permite o teste de vaacuterias
concentraccedilotildees diferentes em um menor tempo e com baixo gasto de material
34
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV1
(MOI=5)
35
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV2
(MOI=2)
36
Takegami et al (1998) demonstraram atividade de furanonaftoquinonas contra o viacuterus
da Encefalite Japonesa (Flavivirus) utilizando a concentraccedilatildeo de 3microgmL poreacutem para os
compostos apresentados avaliados pela teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT nenhuma das
concentraccedilotildees apresentadas produziu efeito antiviral significativo em relaccedilatildeo ao controle
celular como observado nas figuras 12 e 13
Apesar da teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT ser interessante como triagem de atividade
antiviral permitindo o teste de vaacuterias concentraccedilotildees dos compostos em menor tempo e
utilizando uma quantidade razoaacutevel de materiais optou-se por utilizar as maiores
concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas encontradas avaliando sua atividade antiviral por outras
teacutecnicas Como natildeo foi avaliada atividade antiviral preacutevia para nenhum dos compostos frente
agrave infecccedilatildeo por DENV1 e 2 foi selecionado o Dengue virus 1 para dar prosseguimento aos
ensaios
55 Ensaio Virucida
O ensaio virucida foi realizado para avaliar um potencial efeito dos compostos
diretamente sobre a partiacutecula viral Este ensaio eacute importante pois possibilita elucidar se o
composto pode produzir algum efeito sobre a partiacutecula viral impedindo que esta possa infectar
as ceacutelulas
Figura 14 Ensaio virucida Neste ensaio as aliacutequotas de DENV1 foram incubadas com as
concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos e titulados (NT) Controle natildeo tratado
37
Tabela 3 Ensaio virucida Caacutelculo do tiacutetulo viral (UFPmL) e porcentagem representante de
cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 254 x 105 100
DMSO 263 x 105 10335
A1 199 x 105 7835
A2 205 x 105 8071
A3 237 x 105 9311
A4 775 x 104 3049
A5 153 x 105 6024
A6 219 x 105 8602
A7 243 x 105 9547
A8 254 x 105 100
Lagrota et al (1988) demonstraram atividade de 2-HO-3-N-benzil-N(N-benzil-2-
etilamina) -14-naftoquinona sobre a partiacutecula viral de enterovirus De forma contraacuteria apesar
de se verificar a reduccedilatildeo de quase uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais
para o composto A4 natildeo considerou-se esta uma alteraccedilatildeo significativa pois devido agrave
magnitude do nuacutemero de UFPs se trata de uma alteraccedilatildeo muito pequena Portanto os
compostos avaliados neste trabalho natildeo produziram atividade virucida aparente frente ao
tratamento com as concentraccedilotildees de uso
56 Ensaio Antiviral
O sobrenadante de ceacutelulas tratadas previamente e infectadas por DENV1 coletado 48
horas poacutes infecccedilatildeo foi avaliado quanto agrave produccedilatildeo viral de partiacuteculas infecciosas pela
contagem de placas de lise e caacutelculo de Unidades Formadoras de Placa (Titulaccedilatildeo viral em
placa ndash UFPmL)
38
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral Sobrenadante de ceacutelulas tratadas e infectadas por DENV1
coletado apoacutes 48 horas e titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado
Tabela 4 Ensaio Antiviral Coleta do sobrenadante de ceacutelulas infectadas por DENV1 Tiacutetulo
viral (UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o
controle natildeo tratado como 100
Ao perceber um aumento no tiacutetulo viral frente ao tratamento com os compostos A1
A2 e A3 e uma reduccedilatildeo frente ao tratamento com A4 A5 e A6 foram escolhidos dois
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 119 x 105 10000
A1 235 x 105 19748
A2 228 x 105 19160
A3 318 x 105 26723
A4 128 x 104 1076
A5 186 x 103 156
A6 190 x 104 1597
A7 280 x 104 2353
A8 350 x 104 2941
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
40
Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
31
Figura 10 Paracircmetros avaliados a partir do contador automaacutetico de ceacutelulas (A)
Contagem de ceacutelulas vivas (B) Percentual de ceacutelulas viaacuteveis (Viabilidade celular ) e (C)
Meacutedia do diacircmetro apresentado pelas ceacutelulas vivas
Em 96 horas as ceacutelulas natildeo tratadas bem como as ceacutelulas tratadas por 72 horas com as
concentraccedilotildees de uso dos compostos foram tripsinizadas e avaliadas quanto ao nuacutemero de
ceacutelulas vivas viabilidade e diacircmetro celular apresentados na figura 10
Segundo se observa natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo aparente que possa demonstrar que
as concentraccedilotildees de uso dos compostos tenham causado alguma atividade citotoacutexica
corroborando assim os ensaios de citotoxicidade anteriores
53 Determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI)
A infectividade de um viacuterus depende de vaacuterios fatores entre eles da proporccedilatildeo de
partiacuteculas virais completas ou infecciosas da suscetibilidade da ceacutelula hospedeira e da
chance desta partiacutecula encontrar o receptor e penetrar na ceacutelula Quando ceacutelulas suscetiacuteveis
satildeo misturadas com uma suspensatildeo de viacuterus estas podem receber uma duas trecircs ou dez
partiacuteculas virais ou nenhuma Isto depende da proporccedilatildeo entre a quantidade de viacuterus
infecciosos presente no inoculo e a quantidade de ceacutelulas utilizada Esta relaccedilatildeo eacute denominada
de multiplicidade de infecccedilatildeo ou MOI Uma MOI=1 indica que a infecccedilatildeo foi feita em
principio com 1 viacuterus ou 1 dose infectante por ceacutelula
A determinaccedilatildeo da multiplicidade de infecccedilatildeo dos Dengue virus 1 e 2 a serem
utilizadas nos proacuteximos ensaios foi feita a partir da infecccedilatildeo de ceacutelulas BHK-21 por diferentes
(C)
32
concentraccedilotildees de viacuterus e revelaccedilatildeo com cristal violeta Escolheu-se a maior diluiccedilatildeo viral que
possibilitou a letalidade total das ceacutelulas (faixa onde todas as ceacutelulas estatildeo mortas utilizando
menor concentraccedilatildeo de viacuterus) As faixas escolhidas foram entatildeo calculadas levando-se em
consideraccedilatildeo o nuacutemero de ceacutelulas presentes no poccedilo e o nuacutemero de partiacuteculas virais que foram
adicionadas (Faixa3 para DENV2 e 2 para DENV1) Figura 11 Foi estipulado portanto a
Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 2 para DENV 2 e 5 para DENV 1
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI A partir da infecccedilatildeo da linhagem celular BHK-21 em
placa de 96 poccedilos com diferentes diluiccedilotildees de DENV foi determinado que a Multiplicidade
de infecccedilatildeo para o Dengue viacuterus sorotipos 1 e 2 seria de 5 e 2 respectivamente (colunas 2 -
DENV1 e 3 - DENV2)
54 Ensaio dose resposta
Apoacutes a determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas ideais realizou-se um
ensaio dose resposta tratando as ceacutelulas com oito concentraccedilotildees agrave partir das concentraccedilotildees natildeo
citotoacutexicas escolhidas para cada composto e em seguida infectando com DENV sorotipos 1 e
2 nas MOIs estipuladas anteriormente (5 e 2 respectivamente) A porcentagem do efeito
protetor conferida agraves ceacutelulas para cada concentraccedilatildeo de amostra testada foi calculada da
seguinte forma
33
EP = [ (A ndash B) (C ndash B) ] x 100
Onde
A Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas tratadas e infectadas
B Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e infectadas
C Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e natildeo infectadas
Este ensaio tem por objetivo identificar a resposta celular agrave infecccedilatildeo frente ao
tratamento com os compostos em diferentes concentraccedilotildees Assim como o ensaio de
toxicidade este ensaio feito utilizando a teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT permite o teste de vaacuterias
concentraccedilotildees diferentes em um menor tempo e com baixo gasto de material
34
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV1
(MOI=5)
35
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV2
(MOI=2)
36
Takegami et al (1998) demonstraram atividade de furanonaftoquinonas contra o viacuterus
da Encefalite Japonesa (Flavivirus) utilizando a concentraccedilatildeo de 3microgmL poreacutem para os
compostos apresentados avaliados pela teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT nenhuma das
concentraccedilotildees apresentadas produziu efeito antiviral significativo em relaccedilatildeo ao controle
celular como observado nas figuras 12 e 13
Apesar da teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT ser interessante como triagem de atividade
antiviral permitindo o teste de vaacuterias concentraccedilotildees dos compostos em menor tempo e
utilizando uma quantidade razoaacutevel de materiais optou-se por utilizar as maiores
concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas encontradas avaliando sua atividade antiviral por outras
teacutecnicas Como natildeo foi avaliada atividade antiviral preacutevia para nenhum dos compostos frente
agrave infecccedilatildeo por DENV1 e 2 foi selecionado o Dengue virus 1 para dar prosseguimento aos
ensaios
55 Ensaio Virucida
O ensaio virucida foi realizado para avaliar um potencial efeito dos compostos
diretamente sobre a partiacutecula viral Este ensaio eacute importante pois possibilita elucidar se o
composto pode produzir algum efeito sobre a partiacutecula viral impedindo que esta possa infectar
as ceacutelulas
Figura 14 Ensaio virucida Neste ensaio as aliacutequotas de DENV1 foram incubadas com as
concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos e titulados (NT) Controle natildeo tratado
37
Tabela 3 Ensaio virucida Caacutelculo do tiacutetulo viral (UFPmL) e porcentagem representante de
cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 254 x 105 100
DMSO 263 x 105 10335
A1 199 x 105 7835
A2 205 x 105 8071
A3 237 x 105 9311
A4 775 x 104 3049
A5 153 x 105 6024
A6 219 x 105 8602
A7 243 x 105 9547
A8 254 x 105 100
Lagrota et al (1988) demonstraram atividade de 2-HO-3-N-benzil-N(N-benzil-2-
etilamina) -14-naftoquinona sobre a partiacutecula viral de enterovirus De forma contraacuteria apesar
de se verificar a reduccedilatildeo de quase uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais
para o composto A4 natildeo considerou-se esta uma alteraccedilatildeo significativa pois devido agrave
magnitude do nuacutemero de UFPs se trata de uma alteraccedilatildeo muito pequena Portanto os
compostos avaliados neste trabalho natildeo produziram atividade virucida aparente frente ao
tratamento com as concentraccedilotildees de uso
56 Ensaio Antiviral
O sobrenadante de ceacutelulas tratadas previamente e infectadas por DENV1 coletado 48
horas poacutes infecccedilatildeo foi avaliado quanto agrave produccedilatildeo viral de partiacuteculas infecciosas pela
contagem de placas de lise e caacutelculo de Unidades Formadoras de Placa (Titulaccedilatildeo viral em
placa ndash UFPmL)
38
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral Sobrenadante de ceacutelulas tratadas e infectadas por DENV1
coletado apoacutes 48 horas e titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado
Tabela 4 Ensaio Antiviral Coleta do sobrenadante de ceacutelulas infectadas por DENV1 Tiacutetulo
viral (UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o
controle natildeo tratado como 100
Ao perceber um aumento no tiacutetulo viral frente ao tratamento com os compostos A1
A2 e A3 e uma reduccedilatildeo frente ao tratamento com A4 A5 e A6 foram escolhidos dois
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 119 x 105 10000
A1 235 x 105 19748
A2 228 x 105 19160
A3 318 x 105 26723
A4 128 x 104 1076
A5 186 x 103 156
A6 190 x 104 1597
A7 280 x 104 2353
A8 350 x 104 2941
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
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Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
32
concentraccedilotildees de viacuterus e revelaccedilatildeo com cristal violeta Escolheu-se a maior diluiccedilatildeo viral que
possibilitou a letalidade total das ceacutelulas (faixa onde todas as ceacutelulas estatildeo mortas utilizando
menor concentraccedilatildeo de viacuterus) As faixas escolhidas foram entatildeo calculadas levando-se em
consideraccedilatildeo o nuacutemero de ceacutelulas presentes no poccedilo e o nuacutemero de partiacuteculas virais que foram
adicionadas (Faixa3 para DENV2 e 2 para DENV1) Figura 11 Foi estipulado portanto a
Multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 2 para DENV 2 e 5 para DENV 1
Figura 11 Determinaccedilatildeo da MOI A partir da infecccedilatildeo da linhagem celular BHK-21 em
placa de 96 poccedilos com diferentes diluiccedilotildees de DENV foi determinado que a Multiplicidade
de infecccedilatildeo para o Dengue viacuterus sorotipos 1 e 2 seria de 5 e 2 respectivamente (colunas 2 -
DENV1 e 3 - DENV2)
54 Ensaio dose resposta
Apoacutes a determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees de uso natildeo citotoacutexicas ideais realizou-se um
ensaio dose resposta tratando as ceacutelulas com oito concentraccedilotildees agrave partir das concentraccedilotildees natildeo
citotoacutexicas escolhidas para cada composto e em seguida infectando com DENV sorotipos 1 e
2 nas MOIs estipuladas anteriormente (5 e 2 respectivamente) A porcentagem do efeito
protetor conferida agraves ceacutelulas para cada concentraccedilatildeo de amostra testada foi calculada da
seguinte forma
33
EP = [ (A ndash B) (C ndash B) ] x 100
Onde
A Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas tratadas e infectadas
B Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e infectadas
C Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e natildeo infectadas
Este ensaio tem por objetivo identificar a resposta celular agrave infecccedilatildeo frente ao
tratamento com os compostos em diferentes concentraccedilotildees Assim como o ensaio de
toxicidade este ensaio feito utilizando a teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT permite o teste de vaacuterias
concentraccedilotildees diferentes em um menor tempo e com baixo gasto de material
34
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV1
(MOI=5)
35
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV2
(MOI=2)
36
Takegami et al (1998) demonstraram atividade de furanonaftoquinonas contra o viacuterus
da Encefalite Japonesa (Flavivirus) utilizando a concentraccedilatildeo de 3microgmL poreacutem para os
compostos apresentados avaliados pela teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT nenhuma das
concentraccedilotildees apresentadas produziu efeito antiviral significativo em relaccedilatildeo ao controle
celular como observado nas figuras 12 e 13
Apesar da teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT ser interessante como triagem de atividade
antiviral permitindo o teste de vaacuterias concentraccedilotildees dos compostos em menor tempo e
utilizando uma quantidade razoaacutevel de materiais optou-se por utilizar as maiores
concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas encontradas avaliando sua atividade antiviral por outras
teacutecnicas Como natildeo foi avaliada atividade antiviral preacutevia para nenhum dos compostos frente
agrave infecccedilatildeo por DENV1 e 2 foi selecionado o Dengue virus 1 para dar prosseguimento aos
ensaios
55 Ensaio Virucida
O ensaio virucida foi realizado para avaliar um potencial efeito dos compostos
diretamente sobre a partiacutecula viral Este ensaio eacute importante pois possibilita elucidar se o
composto pode produzir algum efeito sobre a partiacutecula viral impedindo que esta possa infectar
as ceacutelulas
Figura 14 Ensaio virucida Neste ensaio as aliacutequotas de DENV1 foram incubadas com as
concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos e titulados (NT) Controle natildeo tratado
37
Tabela 3 Ensaio virucida Caacutelculo do tiacutetulo viral (UFPmL) e porcentagem representante de
cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 254 x 105 100
DMSO 263 x 105 10335
A1 199 x 105 7835
A2 205 x 105 8071
A3 237 x 105 9311
A4 775 x 104 3049
A5 153 x 105 6024
A6 219 x 105 8602
A7 243 x 105 9547
A8 254 x 105 100
Lagrota et al (1988) demonstraram atividade de 2-HO-3-N-benzil-N(N-benzil-2-
etilamina) -14-naftoquinona sobre a partiacutecula viral de enterovirus De forma contraacuteria apesar
de se verificar a reduccedilatildeo de quase uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais
para o composto A4 natildeo considerou-se esta uma alteraccedilatildeo significativa pois devido agrave
magnitude do nuacutemero de UFPs se trata de uma alteraccedilatildeo muito pequena Portanto os
compostos avaliados neste trabalho natildeo produziram atividade virucida aparente frente ao
tratamento com as concentraccedilotildees de uso
56 Ensaio Antiviral
O sobrenadante de ceacutelulas tratadas previamente e infectadas por DENV1 coletado 48
horas poacutes infecccedilatildeo foi avaliado quanto agrave produccedilatildeo viral de partiacuteculas infecciosas pela
contagem de placas de lise e caacutelculo de Unidades Formadoras de Placa (Titulaccedilatildeo viral em
placa ndash UFPmL)
38
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral Sobrenadante de ceacutelulas tratadas e infectadas por DENV1
coletado apoacutes 48 horas e titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado
Tabela 4 Ensaio Antiviral Coleta do sobrenadante de ceacutelulas infectadas por DENV1 Tiacutetulo
viral (UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o
controle natildeo tratado como 100
Ao perceber um aumento no tiacutetulo viral frente ao tratamento com os compostos A1
A2 e A3 e uma reduccedilatildeo frente ao tratamento com A4 A5 e A6 foram escolhidos dois
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 119 x 105 10000
A1 235 x 105 19748
A2 228 x 105 19160
A3 318 x 105 26723
A4 128 x 104 1076
A5 186 x 103 156
A6 190 x 104 1597
A7 280 x 104 2353
A8 350 x 104 2941
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
40
Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
33
EP = [ (A ndash B) (C ndash B) ] x 100
Onde
A Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas tratadas e infectadas
B Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e infectadas
C Leitura da absorbacircncia dos poccedilos com ceacutelulas natildeo tratadas e natildeo infectadas
Este ensaio tem por objetivo identificar a resposta celular agrave infecccedilatildeo frente ao
tratamento com os compostos em diferentes concentraccedilotildees Assim como o ensaio de
toxicidade este ensaio feito utilizando a teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT permite o teste de vaacuterias
concentraccedilotildees diferentes em um menor tempo e com baixo gasto de material
34
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV1
(MOI=5)
35
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV2
(MOI=2)
36
Takegami et al (1998) demonstraram atividade de furanonaftoquinonas contra o viacuterus
da Encefalite Japonesa (Flavivirus) utilizando a concentraccedilatildeo de 3microgmL poreacutem para os
compostos apresentados avaliados pela teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT nenhuma das
concentraccedilotildees apresentadas produziu efeito antiviral significativo em relaccedilatildeo ao controle
celular como observado nas figuras 12 e 13
Apesar da teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT ser interessante como triagem de atividade
antiviral permitindo o teste de vaacuterias concentraccedilotildees dos compostos em menor tempo e
utilizando uma quantidade razoaacutevel de materiais optou-se por utilizar as maiores
concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas encontradas avaliando sua atividade antiviral por outras
teacutecnicas Como natildeo foi avaliada atividade antiviral preacutevia para nenhum dos compostos frente
agrave infecccedilatildeo por DENV1 e 2 foi selecionado o Dengue virus 1 para dar prosseguimento aos
ensaios
55 Ensaio Virucida
O ensaio virucida foi realizado para avaliar um potencial efeito dos compostos
diretamente sobre a partiacutecula viral Este ensaio eacute importante pois possibilita elucidar se o
composto pode produzir algum efeito sobre a partiacutecula viral impedindo que esta possa infectar
as ceacutelulas
Figura 14 Ensaio virucida Neste ensaio as aliacutequotas de DENV1 foram incubadas com as
concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos e titulados (NT) Controle natildeo tratado
37
Tabela 3 Ensaio virucida Caacutelculo do tiacutetulo viral (UFPmL) e porcentagem representante de
cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 254 x 105 100
DMSO 263 x 105 10335
A1 199 x 105 7835
A2 205 x 105 8071
A3 237 x 105 9311
A4 775 x 104 3049
A5 153 x 105 6024
A6 219 x 105 8602
A7 243 x 105 9547
A8 254 x 105 100
Lagrota et al (1988) demonstraram atividade de 2-HO-3-N-benzil-N(N-benzil-2-
etilamina) -14-naftoquinona sobre a partiacutecula viral de enterovirus De forma contraacuteria apesar
de se verificar a reduccedilatildeo de quase uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais
para o composto A4 natildeo considerou-se esta uma alteraccedilatildeo significativa pois devido agrave
magnitude do nuacutemero de UFPs se trata de uma alteraccedilatildeo muito pequena Portanto os
compostos avaliados neste trabalho natildeo produziram atividade virucida aparente frente ao
tratamento com as concentraccedilotildees de uso
56 Ensaio Antiviral
O sobrenadante de ceacutelulas tratadas previamente e infectadas por DENV1 coletado 48
horas poacutes infecccedilatildeo foi avaliado quanto agrave produccedilatildeo viral de partiacuteculas infecciosas pela
contagem de placas de lise e caacutelculo de Unidades Formadoras de Placa (Titulaccedilatildeo viral em
placa ndash UFPmL)
38
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral Sobrenadante de ceacutelulas tratadas e infectadas por DENV1
coletado apoacutes 48 horas e titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado
Tabela 4 Ensaio Antiviral Coleta do sobrenadante de ceacutelulas infectadas por DENV1 Tiacutetulo
viral (UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o
controle natildeo tratado como 100
Ao perceber um aumento no tiacutetulo viral frente ao tratamento com os compostos A1
A2 e A3 e uma reduccedilatildeo frente ao tratamento com A4 A5 e A6 foram escolhidos dois
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 119 x 105 10000
A1 235 x 105 19748
A2 228 x 105 19160
A3 318 x 105 26723
A4 128 x 104 1076
A5 186 x 103 156
A6 190 x 104 1597
A7 280 x 104 2353
A8 350 x 104 2941
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
40
Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
34
Figura 12 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV1 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV1
(MOI=5)
35
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV2
(MOI=2)
36
Takegami et al (1998) demonstraram atividade de furanonaftoquinonas contra o viacuterus
da Encefalite Japonesa (Flavivirus) utilizando a concentraccedilatildeo de 3microgmL poreacutem para os
compostos apresentados avaliados pela teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT nenhuma das
concentraccedilotildees apresentadas produziu efeito antiviral significativo em relaccedilatildeo ao controle
celular como observado nas figuras 12 e 13
Apesar da teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT ser interessante como triagem de atividade
antiviral permitindo o teste de vaacuterias concentraccedilotildees dos compostos em menor tempo e
utilizando uma quantidade razoaacutevel de materiais optou-se por utilizar as maiores
concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas encontradas avaliando sua atividade antiviral por outras
teacutecnicas Como natildeo foi avaliada atividade antiviral preacutevia para nenhum dos compostos frente
agrave infecccedilatildeo por DENV1 e 2 foi selecionado o Dengue virus 1 para dar prosseguimento aos
ensaios
55 Ensaio Virucida
O ensaio virucida foi realizado para avaliar um potencial efeito dos compostos
diretamente sobre a partiacutecula viral Este ensaio eacute importante pois possibilita elucidar se o
composto pode produzir algum efeito sobre a partiacutecula viral impedindo que esta possa infectar
as ceacutelulas
Figura 14 Ensaio virucida Neste ensaio as aliacutequotas de DENV1 foram incubadas com as
concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos e titulados (NT) Controle natildeo tratado
37
Tabela 3 Ensaio virucida Caacutelculo do tiacutetulo viral (UFPmL) e porcentagem representante de
cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 254 x 105 100
DMSO 263 x 105 10335
A1 199 x 105 7835
A2 205 x 105 8071
A3 237 x 105 9311
A4 775 x 104 3049
A5 153 x 105 6024
A6 219 x 105 8602
A7 243 x 105 9547
A8 254 x 105 100
Lagrota et al (1988) demonstraram atividade de 2-HO-3-N-benzil-N(N-benzil-2-
etilamina) -14-naftoquinona sobre a partiacutecula viral de enterovirus De forma contraacuteria apesar
de se verificar a reduccedilatildeo de quase uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais
para o composto A4 natildeo considerou-se esta uma alteraccedilatildeo significativa pois devido agrave
magnitude do nuacutemero de UFPs se trata de uma alteraccedilatildeo muito pequena Portanto os
compostos avaliados neste trabalho natildeo produziram atividade virucida aparente frente ao
tratamento com as concentraccedilotildees de uso
56 Ensaio Antiviral
O sobrenadante de ceacutelulas tratadas previamente e infectadas por DENV1 coletado 48
horas poacutes infecccedilatildeo foi avaliado quanto agrave produccedilatildeo viral de partiacuteculas infecciosas pela
contagem de placas de lise e caacutelculo de Unidades Formadoras de Placa (Titulaccedilatildeo viral em
placa ndash UFPmL)
38
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral Sobrenadante de ceacutelulas tratadas e infectadas por DENV1
coletado apoacutes 48 horas e titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado
Tabela 4 Ensaio Antiviral Coleta do sobrenadante de ceacutelulas infectadas por DENV1 Tiacutetulo
viral (UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o
controle natildeo tratado como 100
Ao perceber um aumento no tiacutetulo viral frente ao tratamento com os compostos A1
A2 e A3 e uma reduccedilatildeo frente ao tratamento com A4 A5 e A6 foram escolhidos dois
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 119 x 105 10000
A1 235 x 105 19748
A2 228 x 105 19160
A3 318 x 105 26723
A4 128 x 104 1076
A5 186 x 103 156
A6 190 x 104 1597
A7 280 x 104 2353
A8 350 x 104 2941
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
40
Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
35
Figura 13 Ensaio dose resposta com infecccedilatildeo por DENV2 As ceacutelulas foram tratadas com
as concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas dos compostos em seguida infectadas por DENV2
(MOI=2)
36
Takegami et al (1998) demonstraram atividade de furanonaftoquinonas contra o viacuterus
da Encefalite Japonesa (Flavivirus) utilizando a concentraccedilatildeo de 3microgmL poreacutem para os
compostos apresentados avaliados pela teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT nenhuma das
concentraccedilotildees apresentadas produziu efeito antiviral significativo em relaccedilatildeo ao controle
celular como observado nas figuras 12 e 13
Apesar da teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT ser interessante como triagem de atividade
antiviral permitindo o teste de vaacuterias concentraccedilotildees dos compostos em menor tempo e
utilizando uma quantidade razoaacutevel de materiais optou-se por utilizar as maiores
concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas encontradas avaliando sua atividade antiviral por outras
teacutecnicas Como natildeo foi avaliada atividade antiviral preacutevia para nenhum dos compostos frente
agrave infecccedilatildeo por DENV1 e 2 foi selecionado o Dengue virus 1 para dar prosseguimento aos
ensaios
55 Ensaio Virucida
O ensaio virucida foi realizado para avaliar um potencial efeito dos compostos
diretamente sobre a partiacutecula viral Este ensaio eacute importante pois possibilita elucidar se o
composto pode produzir algum efeito sobre a partiacutecula viral impedindo que esta possa infectar
as ceacutelulas
Figura 14 Ensaio virucida Neste ensaio as aliacutequotas de DENV1 foram incubadas com as
concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos e titulados (NT) Controle natildeo tratado
37
Tabela 3 Ensaio virucida Caacutelculo do tiacutetulo viral (UFPmL) e porcentagem representante de
cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 254 x 105 100
DMSO 263 x 105 10335
A1 199 x 105 7835
A2 205 x 105 8071
A3 237 x 105 9311
A4 775 x 104 3049
A5 153 x 105 6024
A6 219 x 105 8602
A7 243 x 105 9547
A8 254 x 105 100
Lagrota et al (1988) demonstraram atividade de 2-HO-3-N-benzil-N(N-benzil-2-
etilamina) -14-naftoquinona sobre a partiacutecula viral de enterovirus De forma contraacuteria apesar
de se verificar a reduccedilatildeo de quase uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais
para o composto A4 natildeo considerou-se esta uma alteraccedilatildeo significativa pois devido agrave
magnitude do nuacutemero de UFPs se trata de uma alteraccedilatildeo muito pequena Portanto os
compostos avaliados neste trabalho natildeo produziram atividade virucida aparente frente ao
tratamento com as concentraccedilotildees de uso
56 Ensaio Antiviral
O sobrenadante de ceacutelulas tratadas previamente e infectadas por DENV1 coletado 48
horas poacutes infecccedilatildeo foi avaliado quanto agrave produccedilatildeo viral de partiacuteculas infecciosas pela
contagem de placas de lise e caacutelculo de Unidades Formadoras de Placa (Titulaccedilatildeo viral em
placa ndash UFPmL)
38
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral Sobrenadante de ceacutelulas tratadas e infectadas por DENV1
coletado apoacutes 48 horas e titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado
Tabela 4 Ensaio Antiviral Coleta do sobrenadante de ceacutelulas infectadas por DENV1 Tiacutetulo
viral (UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o
controle natildeo tratado como 100
Ao perceber um aumento no tiacutetulo viral frente ao tratamento com os compostos A1
A2 e A3 e uma reduccedilatildeo frente ao tratamento com A4 A5 e A6 foram escolhidos dois
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 119 x 105 10000
A1 235 x 105 19748
A2 228 x 105 19160
A3 318 x 105 26723
A4 128 x 104 1076
A5 186 x 103 156
A6 190 x 104 1597
A7 280 x 104 2353
A8 350 x 104 2941
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
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Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
36
Takegami et al (1998) demonstraram atividade de furanonaftoquinonas contra o viacuterus
da Encefalite Japonesa (Flavivirus) utilizando a concentraccedilatildeo de 3microgmL poreacutem para os
compostos apresentados avaliados pela teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT nenhuma das
concentraccedilotildees apresentadas produziu efeito antiviral significativo em relaccedilatildeo ao controle
celular como observado nas figuras 12 e 13
Apesar da teacutecnica de reduccedilatildeo de MTT ser interessante como triagem de atividade
antiviral permitindo o teste de vaacuterias concentraccedilotildees dos compostos em menor tempo e
utilizando uma quantidade razoaacutevel de materiais optou-se por utilizar as maiores
concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas encontradas avaliando sua atividade antiviral por outras
teacutecnicas Como natildeo foi avaliada atividade antiviral preacutevia para nenhum dos compostos frente
agrave infecccedilatildeo por DENV1 e 2 foi selecionado o Dengue virus 1 para dar prosseguimento aos
ensaios
55 Ensaio Virucida
O ensaio virucida foi realizado para avaliar um potencial efeito dos compostos
diretamente sobre a partiacutecula viral Este ensaio eacute importante pois possibilita elucidar se o
composto pode produzir algum efeito sobre a partiacutecula viral impedindo que esta possa infectar
as ceacutelulas
Figura 14 Ensaio virucida Neste ensaio as aliacutequotas de DENV1 foram incubadas com as
concentraccedilotildees de uso dos respectivos compostos e titulados (NT) Controle natildeo tratado
37
Tabela 3 Ensaio virucida Caacutelculo do tiacutetulo viral (UFPmL) e porcentagem representante de
cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 254 x 105 100
DMSO 263 x 105 10335
A1 199 x 105 7835
A2 205 x 105 8071
A3 237 x 105 9311
A4 775 x 104 3049
A5 153 x 105 6024
A6 219 x 105 8602
A7 243 x 105 9547
A8 254 x 105 100
Lagrota et al (1988) demonstraram atividade de 2-HO-3-N-benzil-N(N-benzil-2-
etilamina) -14-naftoquinona sobre a partiacutecula viral de enterovirus De forma contraacuteria apesar
de se verificar a reduccedilatildeo de quase uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais
para o composto A4 natildeo considerou-se esta uma alteraccedilatildeo significativa pois devido agrave
magnitude do nuacutemero de UFPs se trata de uma alteraccedilatildeo muito pequena Portanto os
compostos avaliados neste trabalho natildeo produziram atividade virucida aparente frente ao
tratamento com as concentraccedilotildees de uso
56 Ensaio Antiviral
O sobrenadante de ceacutelulas tratadas previamente e infectadas por DENV1 coletado 48
horas poacutes infecccedilatildeo foi avaliado quanto agrave produccedilatildeo viral de partiacuteculas infecciosas pela
contagem de placas de lise e caacutelculo de Unidades Formadoras de Placa (Titulaccedilatildeo viral em
placa ndash UFPmL)
38
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral Sobrenadante de ceacutelulas tratadas e infectadas por DENV1
coletado apoacutes 48 horas e titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado
Tabela 4 Ensaio Antiviral Coleta do sobrenadante de ceacutelulas infectadas por DENV1 Tiacutetulo
viral (UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o
controle natildeo tratado como 100
Ao perceber um aumento no tiacutetulo viral frente ao tratamento com os compostos A1
A2 e A3 e uma reduccedilatildeo frente ao tratamento com A4 A5 e A6 foram escolhidos dois
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 119 x 105 10000
A1 235 x 105 19748
A2 228 x 105 19160
A3 318 x 105 26723
A4 128 x 104 1076
A5 186 x 103 156
A6 190 x 104 1597
A7 280 x 104 2353
A8 350 x 104 2941
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
40
Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
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Tabela 3 Ensaio virucida Caacutelculo do tiacutetulo viral (UFPmL) e porcentagem representante de
cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 254 x 105 100
DMSO 263 x 105 10335
A1 199 x 105 7835
A2 205 x 105 8071
A3 237 x 105 9311
A4 775 x 104 3049
A5 153 x 105 6024
A6 219 x 105 8602
A7 243 x 105 9547
A8 254 x 105 100
Lagrota et al (1988) demonstraram atividade de 2-HO-3-N-benzil-N(N-benzil-2-
etilamina) -14-naftoquinona sobre a partiacutecula viral de enterovirus De forma contraacuteria apesar
de se verificar a reduccedilatildeo de quase uma unidade logariacutetmica no nuacutemero de partiacuteculas virais
para o composto A4 natildeo considerou-se esta uma alteraccedilatildeo significativa pois devido agrave
magnitude do nuacutemero de UFPs se trata de uma alteraccedilatildeo muito pequena Portanto os
compostos avaliados neste trabalho natildeo produziram atividade virucida aparente frente ao
tratamento com as concentraccedilotildees de uso
56 Ensaio Antiviral
O sobrenadante de ceacutelulas tratadas previamente e infectadas por DENV1 coletado 48
horas poacutes infecccedilatildeo foi avaliado quanto agrave produccedilatildeo viral de partiacuteculas infecciosas pela
contagem de placas de lise e caacutelculo de Unidades Formadoras de Placa (Titulaccedilatildeo viral em
placa ndash UFPmL)
38
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral Sobrenadante de ceacutelulas tratadas e infectadas por DENV1
coletado apoacutes 48 horas e titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado
Tabela 4 Ensaio Antiviral Coleta do sobrenadante de ceacutelulas infectadas por DENV1 Tiacutetulo
viral (UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o
controle natildeo tratado como 100
Ao perceber um aumento no tiacutetulo viral frente ao tratamento com os compostos A1
A2 e A3 e uma reduccedilatildeo frente ao tratamento com A4 A5 e A6 foram escolhidos dois
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 119 x 105 10000
A1 235 x 105 19748
A2 228 x 105 19160
A3 318 x 105 26723
A4 128 x 104 1076
A5 186 x 103 156
A6 190 x 104 1597
A7 280 x 104 2353
A8 350 x 104 2941
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
40
Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
38
Figura 15 Titulaccedilatildeo viral Sobrenadante de ceacutelulas tratadas e infectadas por DENV1
coletado apoacutes 48 horas e titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado
Tabela 4 Ensaio Antiviral Coleta do sobrenadante de ceacutelulas infectadas por DENV1 Tiacutetulo
viral (UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o
controle natildeo tratado como 100
Ao perceber um aumento no tiacutetulo viral frente ao tratamento com os compostos A1
A2 e A3 e uma reduccedilatildeo frente ao tratamento com A4 A5 e A6 foram escolhidos dois
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 119 x 105 10000
A1 235 x 105 19748
A2 228 x 105 19160
A3 318 x 105 26723
A4 128 x 104 1076
A5 186 x 103 156
A6 190 x 104 1597
A7 280 x 104 2353
A8 350 x 104 2941
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
40
Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
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8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
39
compostos que obtiveram aumento (A1 e A3) em relaccedilatildeo ao tiacutetulo viral e os dois que
produziram valores de diminuiccedilatildeo no tiacutetulo viral em relaccedilatildeo ao controle (A4 e A5)
O experimento foi repetido nos mesmos moldes para estes compostos com a diferenccedila
que foram realizados em triplicata para verificar se houve variaccedilatildeo significativa dos valores
Figura 16 Titulaccedilatildeo viral dos compostos selecionados O sobrenadante de ceacutelulas tratadas
com os compostos selecionados e infectadas por DENV1 foi coletado apoacutes 48 horas e
titulado (NT) controle infectado e natildeo tratado (ANOVA Poacutes teste de Tukey ndash Natildeo houve
diferenccedila significativa entre as ceacutelulas tratadas e o controle natildeo tratado)
Tabela 5 Ensaio Antiviral com os compostos selecionados Coleta do sobrenadante de
ceacutelulas tratadas com os compostos selecionados e infectadas por DENV1Tiacutetulo viral
(UFPmL) e porcentagem representante de cada valor levando-se em consideraccedilatildeo o controle
natildeo tratado como 100
Composto Tiacutetulo (UFPmL)
Natildeo tratado 470 x 105 100
A1 170 x 105 36
A3 170 x 105 36
A4 166 x 105 35
A5 155 x 105 33
40
Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
40
Costa et al (2013) demonstraram atividade antiviral contra DENV2 frente ao
tratamento de ceacutelulas Vero com piranonaftoquinonas isocircmeras do Lapachol β- e α-
Lapachona obtendo ateacute 99 de inibiccedilatildeo do viacuterus em concentraccedilotildees de aproximadamente
100microM No entanto mediante o tratamento com os compostos nas concentraccedilotildees citadas
avaliados pelas teacutecnicas claacutessicas natildeo foi obtido valores de inibiccedilatildeo significativos
57 Avaliaccedilatildeo do crescimento celular pela exclusatildeo do azul de tripan frente ao
tratamento com os compostos A1 A3 A4 e A5
Para avaliar se os compostos selecionados possuiacuteam algum efeito sobre a atividade
celular em decorrecircncia do tempo as ceacutelulas foram incubadas juntamente com os compostos
no momento da confecccedilatildeo da placa (0h) e os paracircmetros de crescimento viabilidade e
diacircmetro celulares foram avaliados em diferentes tempos (0 12 24 48 e 72 horas poacutes
tratamento)
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
41
Figura 18 Viabilidade e Diacircmetro celular Variaccedilatildeo da viabilidade e do diacircmetro celular de
acordo com o tempo frente ao tratamento com os compostos selecionados (BHK-21 ndash ceacutelulas
natildeo tratadas)
De acordo com os resultados obtidos observou-se que natildeo houve alteraccedilatildeo aparente
nas curvas de crescimento viabilidade e diacircmetro celular frente ao tratamento de nenhum dos
compostos avaliados em relaccedilatildeo ao controle celular natildeo tratado Portanto a taxa de
crescimento bem como o diacircmetro e a porcentagem na viabilidade celular de ceacutelulas BHK-
Figura 17 Curva de crescimento celular As ceacutelulas foram contadas em um contador
automaacutetico de ceacutelulas (Countess II FL) em diferentes tempos frente ao tratamento ou
natildeo com os compostos selecionados (NT ndash Natildeo tratado)
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
42
21 natildeo satildeo alterados mediante o tratamento com os compostos Demonstrando mais uma vez
a natildeo citotoxicidade dos compostos nas concentraccedilotildees utilizadas no decorrer do estudo
Eacute importante ressaltar o refinamento que esta pesquisa se encontra para realizaccedilatildeo de
triagem e rastreio de drogas potencialmente antivirais
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
43
VI CONCLUSAtildeO
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
44
6 CONCLUSAtildeO
Diante dos resultados obtidos a partir dos ensaios descritos podemos concluir que
apesar de alguns compostos terem apresentado reduccedilatildeo de ateacute uma unidade logariacutetmica no
nuacutemero de partiacuteculas virais os resultados indicaram que estes faacutermacos natildeo demonstraram
atividade antiviral nas concentraccedilotildees testadas
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
45
VII PERSPECTIVAS
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
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8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
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ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
46
7 PERSPECTIVAS
1 Avaliar a atividade de outros compostos disponiacuteveis atraveacutes dos meacutetodos empregados neste
estudo
2 Desenvolver novos meacutetodos de triagem como por exemplo a teacutecnica de PCR e tempo Real
que possam ser utilizados para permitir a avaliaccedilatildeo de uma maior quantidade de condiccedilotildees
experimentais como concentraccedilotildees e tempos de incubaccedilatildeo diferentes
3 Promover uma triagem virtual das moleacuteculas com a utilizaccedilatildeo de softwares
4 Avaliar se o armazenamento dos compostos com o DMSO interfere na qualidade das
moleacuteculas e consequentemente na sua funccedilatildeo
5 Promover a anaacutelise cromatograacutefica dos compostos para verificar se houve degradaccedilatildeo
6 Repetir testes de titulaccedilatildeo vira com compostos receacutem sintetizados
7 Repetir os experimentos e triplicata para os compostos A4 e A5 a fim de obter a
significacircncia entre as diferenccedilas de ceacutelulas tratadas por estes compostos e ceacutelulas controle
47
VIII REFEREcircNCIAS
48
8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
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VIII REFEREcircNCIAS
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8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
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8 REFEREcircNCIAS
AMBROGI V ARTINI D CARNERI I CASTELLINO S DRADI E LOGEMANN W
MEINARDI G SOMMA M TOSOLINI G VECCHI E (1970) Studies on the antibacterial
and antifungal properties of 1 4-naphthoquinones British Journal of Pharmacology v40
p871-880
ARAUacuteJO EL ALENCAR JRB NETO PJR (2002) Lapachol seguranccedila e eficaacutecia na
terapecircutica Revista Brasileira de Farmacognosia v 12 p 57-59
ARAUacuteJO SAC TEIXEIRA MFS DANTAS TVM MIRANDA AM LIMA FES MELO
VSP RICARTE ARF COSTA EC (2008) Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica de
drogas antivirais em fibroblastos caprinos Ciecircncia Animal v18 p25-31
BHATT S GETHING PW BRADY OJ MESSINA JP FARLOW AW MOYES
CL DRAKE JM BROWNSTEIN JS HOEN AG SANKOH O MYERS MF GEORGE DB
JAENISCH T WINT GRW SIMMONS CP SCOTT TW FARRAR JJ HAY SI (2013)
The global distribution and burden of dengue Nature v 496 p504-507
BRANDELLI A BIZANI D MARTINELLI M STEFANI V GERBASE AE (2004)
Antimicrobial activity of 14-naphthoquinones by metal complexation Revista Brasileira de
Ciecircncias Farmacecircuticas v40 p140-147
BRASIL (2016) Boletim Epidemioloacutegico Secretaria de Vigilacircncia em Sauacutede minus Ministeacuterio
da Sauacutede v47
COSTA ECB RAQUEL AMORIM R SILVA FC ROCHA DR PAPA MP ARRUDA
LB BORGES RM FERREIRA VF TANURI A COSTA LJ FERREIRA SB (2013)
Synthetic 14-Pyran Naphthoquinones are Potent Inhibitors of Dengue Virus Replication
PLoS One v8 p12-21
CUNHA MSS ALVES FC ALVES GMC MONTEIRO DB MEDEIROS FPMM ROLIM
PJ (2005) Beta-lapachona desenvolvimento e validaccedilatildeo de metodologia analiacutetica para nova
alternativa terapecircutica antineoplaacutesica Revista Brasileira de Farmaacutecia v86 p39-43
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
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MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
49
DATAN E ROY SG GERMAIN G ZALI N MCLEAN JE GOLSHAN G HARBAJAN S
LOCKSHIN RA ZAKERI Z (2016) Dengue-induced autophagy virus replication and
protection from cell death require ER stress (PERK) pathway activation Cell Death amp
Disease
FERREIRA SB GONZAGA DTG SANTOS WC ARAUacuteJO KGL FERREIRA VF (2010)
β-Lapachona Sua importacircncia em quiacutemica medicinal e modificaccedilotildees estruturais Revista
Virtual de Quimica v2 p140-160
FERREIRA VF (1996) Aprendendo sobre os conceitos de aacutecido e base Quiacutemica nova na
escola v4 p 35-36
FIGUEIREDO LT (2000) The Brazilian Flaviviruses Microbes and Infection Institut
Pasteur v2 p1643-1649
FONSECA SGC BRAGA RMC SANTANA DP (2003) Lapachol - Quiacutemica farmacologia
e meacutetodos de dosagem Revista Brasileira de Farmaacutecia v84 p9-16
FRANCISCO AI CASELLATO A NEVES AP CARNEIRO JWM VARGAS MD
VISENTIN LCV MAGALHAtildeES A CAcircMARA CA PESSOA C LOTUFO LVC
MARINHO JDB MORAES MO (2010) Novel 2-(R-phenyl) amino-3-(2-methylpropenyl) -
[14]-naphthoquinones synthesis characterization electrochemical behavior and antitumor
activity Journal of the Brazilian Chemical Society v21 p169-178
GAUNT MW SALL AA DE LAMBALLERIE X FALCONAR AK DZHIVANIAN TI
GOULD EA (2001) Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology disease association and biogeography Journal of General Virolgy v82
p1867-1876
GOULART MOF LIMA NMF SANTrsquoANA AEG FERRAZ PAL CAVALCANTI JCM
FALKOWSKI P OSSOWSKI T LIWO A (2004) Electrochemical studies of isolapachol
with emphasis on oxygen interaction with its radical anions Journal of Electroanalytical
Chemistry v566 p25-29
GUZMAN MG HALSTEAD SB ARTSOB H BUCHY P FARRAR J GUBLER DJ
HUNSPERGER E KROEGER A MARGOLIS HS MARTIacuteNEZ E NATHAN MB
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
50
PELEGRINO JL SIMMONS C YOKSAN S PEELING RW (2010) Dengue a continuing
global threat Nature Reviews Microbiology v8 p57-66
HAWLEY WA REITER P COPELAND RS PUMPUNI CB CRAIG JR GB (1987)
Aedes albopictus in North America probable introduction in used tires from northern Asia
Science v 236 p1114-1116
HUSSAIN H KROHN K AHMAD VU MIANA GA GREEN IR (2007) Lapachol an
overview Special Issue Reviews and Accounts v2 p145-171
KINNEY RM HUANG CY (2001) Development of new vaccines against dengue fever and
Japanese encephalitis Intervirology v44 p176-97
LAGROTA MHC WIGG MD SANTOS MGM PINTO AV PINTO MCFR (1988)
Atividade antiviroacutetica de naftoquinonas II Derivados 14-naftoquinocircnicos frente a
enteroviacuterus Revista de Microbiologia v19 p338-342
LEE J KIM YE KIM HY SINNIAH M CHONG CK SONG HO (2015) Enhanced
performance of an innovative dengue IgGIgM rapid diagnostic test using an anti-dengue
EDI monoclonal antibody and dengue virus antigen Scientific Reports
LI L LOK SM YU IM ZHANG Y KUHN RJ CHEN J ROSSMANN MG (2008) The
flavivirus precursor membrane-envelope protein complex structure and maturation Science
v319 p1830-1834
LINDENBACH BD THIEL HJ RICE CM (2007) Flaviviridae the viruses and their
replication Fields Virology
LOacutePEZ LIL FLORES QFB BELMARES SYS GALINDO AS (2014) Naphthoquinones
biological properties and synthesis of lawsone and derivatives-a structured review
Vitae v21 p248-258
MACKENZIE JS GUBLER DJ PETERSEN LR (2004) Emerging flaviviruses the spread
and resurgence of Japanese encephalitis West Nile and dengue viruses Nature Medicine
v12 p98-109
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
51
MCARTHUR MA SZTEIN MB EDELMAN R (2014) Dengue vaccines recent
developments ongoing challenges and current candidates Expert Review of Vaccines v12
p933-953
MUKHOPADHYAY S KUHN RJ ROSSMANN MG (2005) A structural perspective of
the flavivirus life cycle Nature Reviews Microbiology v3 p13-22
NAGATA K HIRAI KI KOYAMA J WADA Y TAMURA T (1998) Antimicrobial
activity of novel furanonaphthoquinone analogs Antimicrobial Agents and Chemotherapy
v42 p700-712
NORMILE D (2013) Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control
efforts Science v342 p415-425
OLIVEIRA AB RASLAN DS MIRAGLIA MCM MESQUITA AAL (1990) Estrutura
quiacutemica e atividade bioloacutegica de naftoquinonas de Bignoniaacuteceas brasileiras Quiacutemica Nova
v13 p302-307
PERERA R KHALIQ M e KUHN RJ (2009) Closing the door on flaviviruses entry as a
target for antiviral drug design National Institute of Health v80 p11ndash22
PERRY ST BUCK MD SHRESTA S (2011) Better Late Than Never - Antivirals for
Dengue Expert Review of Anti-Infective Therapy v9 p755-767
RAHMOUN NM ATMANI ZB BENABDALLAH M BOUCHERIT K DIDIER
VILLEMIN D BRAHAM NC (2013) Antimicrobial Activities of the Henna Extract and
Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives American Journal of Medical and
Biological Research v1 p16-22
REINICKE KE BEY EA BENTLE MS PINK JJ INGALLS ST HOPPEL CL MISICO
RI ARZAC GM BURTON G BORNMANN WG SUTTON D GAO J BOOTHMAN DA
(2005) Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with
elevated NAD(P)H Quinone oxidoreductase Clinical Cancer Research v11 p3055-3064
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345
52
ROBERTSON SJ MITZE DN TAYLOR RT BEST SM BLOOM ME (2009) Tick-borne
flaviviruses dissecting host immune responses and virus countermeasures Immunologic
research v43 p172ndash186
SILVA ARA MORAIS SM MARQUES MMM LIMA DM SANTOS SCC ALMEIDA
RR VIEIRA IGP GUEDES MIF (2011) Antiviral activities of extracts and phenolic
components of two Spondias species against Dengue virus Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases v17 p406-413
SILVA MN FERREIRA VF SOUZA MCBV (2003) Um panorama atual da quiacutemica e da
farmacologia de naftoquinonas com ecircnfase na β-lapachona e derivados Quimica Nova v
26 p407-416
TAKEGAMI T SIMAMURA E HIRAI KI KOYAMA J (1998) Inhibitory effect of
furanonaphthoquinone derivatives on the replication of Japanese Encephalitis virus Antiviral
Research v 37 p37ndash45
TANDON VK CHHOR RB SINGHRV RAI S YADAV DB (2004) Design synthesis
and evaluation of novel 14-naphthoquinone derivatives as antifungal and anticancer agents
Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v 14 p1079ndash1083
TANDON VK YADAV DB RAVINDRA V SINGH RVMEENU VAISH MV
CHATURVEDI AK SHUKLA PK (2005) Synthesis and biological evaluation of novel 14-
naphthoquinone derivatives as antibacterial and antiviral agents Bioorganic amp Medicinal
Chemistry Letters v15 p3463ndash3466
VILLORDO SM CARBALLEDA JM FILOMATORI CV GAMARNIK AV (2002) RNA
Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation Cell v24 p270-283
WEAVER SC REISEN WK (2010) Present and future arboviral threats Antiviral
Research v85 p328-345