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JOSIANE ALESSANDRA VIGNOLI

EFEITO DA MATRIA-PRIMA E DO PROCESSAMENTO

NOS COMPOSTOS BIOATIVOS E NA ATIVIDADE

ANTIOXIDANTE DO CAF

Londrina

2009




ANTIOXIDANTE DO CAF

Tese apresentada ao Programa de Ps-Graduao, em Cincia de Alimentos da Universidade Estadual de Londrina, como requisito parcial obteno do ttulo de Doutora em Cincia de Alimentos. Orientadora: Profa. Dra. Marta de Toledo Benassi

Londrina

2009




ANTIOXIDANTE DO CAF

Tese apresentada ao Programa de Ps-Graduao, em Cincia de Alimentos da Universidade Estadual de Londrina, como requisito parcial obteno do ttulo de Doutora em Cincia de Alimentos.

BANCA EXAMINADORA

__________________________________________ Profa. Dra. Marta de Toledo Benassi

(DCTA/CCA/UEL)

__________________________________________ Profa. Dra. Maria Beatriz Abreu Glria Farmcia/ Depto. Alimentos/ UFMG

__________________________________________ Profa. Dra. Adriana Zerlotti Mercadante

DCA / FEA / UNICAMP

__________________________________________ Profa. Dra. Andra Diniz Farmcia / CCS / UEL

__________________________________________ Prof. Dr. Rui Srgio dos Santos Ferreira da Silva

(DCTA/CCA/UEL)

Londrina, 12 de maro de 2009.

DEDICATRIA

A meus pais, Antonio e Clita,

A meus avs, Roque e Nair (in memorian),

A meus irmos Leandro e Karina

A minha sobrinha Isabelli; os melhores presentes que j recebi.

A vocs dedico.

AGRADECIMENTOS

Agradeo Prof. Dra. Marta de Toledo Benassi, pela valiosa orientao, pela ateno, carinho

e imensa compreenso que sempre me dedicou no desenvolvimento deste trabalho.

Ao Dr. Denisley Gentil Bassoli, Diretor do setor de Pesquisa e Desenvolvimento da Caf

Iguau, pela oportunidade e confiana concedidas para realizao de todo este trabalho, pelas

preciosas sugestes, o meu imenso agradecimento.

Cia Iguau de Caf Solvel por permitir a realizao deste trabalho.

Ao pessoal do Laboratrio de Pesquisa e Desenvolvimento da Caf Iguau, principalmente ao

Baptistella e Lucas, por todo o trabalho e ateno dedicados durante o desenvolvimento deste

trabalho. Obrigada pela grandiosa e importante colaborao!

Aos professores do Departamento de Cincia e Tecnologia de Alimentos, da UEL, pela

contribuio em minha formao.

A Prof. Dra. Rbia Casagrande pela imensa colaborao nas tcnicas analticas, pelo apoio

em todos os momentos e principalmente pela amizade.

A meus colegas de trabalho e amigos, Marcelo e Karina por toda ajuda que sempre me

dedicaram.

Aos Professores Rui Srgio, Maria Beatriz, Adriana e Andra por aceitarem gentilmente

serem membros da banca deste trabalho.

s minhas queridas amigas Rbia, Jomara, M. Anglica, Cibele, Andrea, Maria e Renata

pelos momentos de alegria e descontrao compartilhados.

A meus pais e irmos por todo apoio, admirao e carinho que sempre me dedicaram.

A Deus, por cuidar da minha vida.

Se o seu navio no chega, nade at ele.

(Jonathan Winters)

VIGNOLI, Josiane Alessandra. Efeito da matria-prima e do processamento nos compostos bioativos e na atividade antioxidante do caf. 2009. 130f. Tese (Doutorado em Cincia de Alimentos) Universidade Estadual de Londrina, Londrina, 2009.

RESUMO O consumo de caf registrou um crescimento significativo nos ltimos anos. As duas espcies mais comercializadas so Coffea arabica e Coffea canephora, sendo a primeira de maior valor comercial e qualidade sensorial. Atualmente, vrios estudos sugerem efeitos potencialmente benficos na sade devido ao consumo da bebida, como a eficincia e proteo contra alguns tipos de cncer, doenas do fgado e danos aos tecidos induzidos por radiao. O caf contm vrios componentes bioativos que podem explicar esse efeito positivo, destacando-se os antioxidantes. Desta maneira, este trabalho teve como objetivo avaliar a atividade antioxidante (AA) do caf arbica e robusta e sua composio qumica, sob influncia de diferentes condies de processamento, como grau de torra e processo de extrao e mtodo de preparo da bebida final, correlacionando a AA com os compostos identificados. A AA foi avaliada pelos mtodos FRAP, ABTS, deoxirribose, DPPH e determinao de fenlicos totais (Folin- Ciocalteau). A composio qumica foi determinada por CLAE e CG/MS. Os compostos que mais se destacaram pelo potencial antioxidante foram o cido 5-cafeoilqunico (5-ACQ), melanoidinas, cafena, maltol e guaiacis, mas a capacidade de cada um foi varivel nos diferentes mtodos empregados. O processo de torra provocou uma degradao de compostos fenlicos, mas esse fato foi compensado pela formao de melanoidinas, o que manteve o equilbrio da AA do produto. Entretanto, quando condies de torra mais severas foram aplicadas, a formao de novos potenciais antioxidantes no foi o suficiente para compensar a degradao, provocando uma diminuio da AA de produtos de cor escura. A maior presena de cafena no caf robusta conferiu a seus produtos maior AA. O processo de extrao utilizado para caf solvel influenciou a composio qumica do produto, principalmente para amostras de cor clara, onde se observou uma maior preservao de 5-ACQ e extrao de cafena no processo utilizando duas correntes de gua. Diferentes mtodos de preparo da bebida levaram a uma diferenciao na composio qumica e AA. Bebidas de filtro e espresso mostraram-se semelhantes quanto composio e AA. A maior extrao de slidos da bebida espresso favoreceu a maior AA observada na maioria dos mtodos. No entanto, todas as bebidas originadas do caf torrado (filtro, espresso e solvel) apresentaram uma expressiva AA que foi atribuda principalmente cafena, 5-ACQ e melanoidinas. Palavras-chave: cido 5- cafeoilqunico. Cafena. Coffea arbica. Coffea canephora. Melanoidinas.

VIGNOLI, Josiane Alessandra. Effect of the raw material and process on bioactive compounds and antioxidant activity of coffee. 2009. 130p. Thesis (Doctor Degree in Food Science) Universidade Estadual de Londrina, Londrina, 2009.

ABSTRACT The consumption of coffee registered a significant growth in the recent years. The species mostly commercialized are Coffea Arabica and Coffea Canephora. Coffee arabica is the quality of highest commercial value and better sensorial quality. Currently, several studies considering the effects of coffee on health suggest potentially beneficial effects of this beverage consumption, such as efficiency and protection against some types of cancer, liver diseases and damage to tissues caused by radiation. Coffee contains several bioactive components that may explain this positive effect, especially the antioxidants. Hence, the aim of this study was to evaluate the antioxidant activity (AA) of arabica and robusta coffees and its chemical composition, under the influence of different processing conditions, such as roasting degree, extraction process and method of preparing the final beverage, correlating the AA with the identified compounds. AA was evaluated by the methods FRAP, ABTS, deoxyribose, DPPH and determination of phenolic compounds (Folin-Ciocalteau). The chemical composition was determined by HPLC and GC / MS. The potential antioxidant was highlighted on the following compounds: 5-caffeoylquinic acid (5-CQA), melanoidins, caffeine, maltol and guayacol, however the ability of each compound has varied depending on the employed method. The roasting process caused a degradation of phenolic compounds, although this fact has been compensated by the formation of melanoidins, maintaining the balance of AA on the product. However, when stricter roasting conditions have been applied, the formation of new potential antioxidants was not enough to compensate the degradation, causing a decrease of AA on the dark roast qualities. Caffeine levels are higher in robusta beans and this has increased its AA. The extraction process used influenced the chemical composition of the product, especially for light roast samples. On these samples, a greater preservation of 5-CQA and extraction of higher caffeine levels were observed on the process using two streams of water. Different methods of preparation of the drink resulted on a differentiation in the chemical composition and AA. Filter beverages and espresso drinks presented to be similar in composition and AA. The higher extraction of solids on espresso drinks has favored the highest AA observed in most of the methods. Although, all drinks originated from roasted and ground coffee (filter, espresso and soluble (instant coffee) have shown a significant AA which was mainly attributed to the caffeine, 5-CQA and melanoidins. Keywords: 5- Caffeoylquinic Acid. Caffeine. Coffea arabic. Coffea canephora. Melanoidins.

LISTA DE FIGURAS

CAPTULO I

Figura 1 Esquema representativo da produo de caf solvel........................................ 23

Figura 2 Estrutura qumica dos principais compostos fenlicos do caf ........................ 28

Figura 3 Estrutura qumica da cafena............................................................................. 29

CAPTULO II

Figura 1 Perfil cromatogrfico dos compostos de interesse na matriz de caf solvel... 59

CAPTULO III

Figura 1 Teores de cafena, trigonelina, furfural, hidroximetilfurfural, 5-ACQ e

melanoidinas nas espcies arbica e robusta ao longo do processo de

torra.................................................................................................................... 71

Figura 2 Atividade antioxidante, avaliada pelos mtodos de Folin, ABTS e FRAP

em caf arbica e robusta ao longo da torra ...................................................... 74

Figura 3 Anlise de componentes principais a partir da atividade antioxidante e

compostos qumicos: projeo das variveis (A) e grfico de amostras

(B)...................................................................................................................... 75

CAPTULO IV

Figura 1 Anlise de componentes principais a partir da atividade antioxidante e

composio: projeo das variveis (A) e grfico de amostras (B).

Espcies: arbica (A) ......................................................................................... 90

CAPTULO V

Figura 1 Estrutura qumica dos principais compostos do caf relacionados atividade

antioxidante ..................................................................................................... 105

CAPTULO VI

Figura 1 Cromatogramas tpicos das bebidas por anlise em GC-MS identificando

os picos de interesse ........................................................................................ 120

Figura 2 Cromatogramas tpicos das bebidas na anlise por CLAE, identificando os

picos de interesse nas bebidas de Filtro, Espresso e Solvel .......................... 121

LISTA DE TABELAS

CAPTULO I

Tabela 1 Composio qumica do caf solvel com diferentes cores de torra para

produtos 100% arbica e 100% robusta .......................................................... 24

CAPTULO II

Tabela 1 Concentraes de caf solvel e torrado utilizadas na validao de

diferentes metodologias................................................................................... 54

Tabela 2 Avaliao da preciso inter-dias em diferentes mtodos para o caf

torrado e solvel .............................................................................................. 57

Tabela 3 Parmetros da regresso linear das curvas de calibrao dos compostos

bioativos .......................................................................................................... 60

Tabela 4 Limites de deteco (LD) e quantificao (LQ) e teores dos diferentes

compostos encontrados no caf torrado e solvel ........................................... 61

CAPTULO III

Tabela 1 Valores correspondentes de cores IR em luminosidade (L*) e tonalidade

cromtica (H*) para cafs torrados e modos das espcies arbica e

robusta ............................................................................................................. 67

CAPTULO IV

Tabela 1 Valores de capacidade antioxidante do caf solvel avaliados por

diferentes mtodos, para as diferentes condies de processo e espcies ....... 89

Tabela 2 Teores de 5-ACQ, cafena e melanoidinas do caf solvel para as

diferentes condies de processo e espcies.................................................... 90

CAPTULO V

Tabela 1 AA de compostos puros e caf solvel avaliada pelos diferentes

mtodos.......................................................................................................... 100

CAPTULO VI

Tabela 1 Teores dos compostos bioativos nas bebidas e na frao voltil................... 122

Tabela 2 Atividade antioxidante das bebidas solvel, de filtro e espresso

avaliadas por diferentes mtodos................................................................... 124

SUMRIO

1 INTRODUO .............................................................................................................. 16

2 OBJETIVOS ................................................................................................................... 19

2.1 OBJETIVO GERAL............................................................................................................ 19

2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS ................................................................................................. 19

CAPTULO I REVISO BIBLIOGRFICA

1 CAF: COMPOSIO QUMICA E PROCESSAMENTO .......................................... 20

2 COMPOSTOS PRESENTES NO CAF ASSOCIADOS COM A CAPACIDADE

ANTIOXIDANTE................................................................................................... 25

2.1 COMPOSTOS FENLICOS ................................................................................................. 25

2.2 CAFENA ......................................................................................................................... 29

2.3 MELANOIDINAS .............................................................................................................. 30

2.4 OUTROS COMPOSTOS DO CAF ASSOCIADOS ATIVIDADE ANTIOXIDANTE .................. 33

3 RADICAIS LIVRES E ANTIOXIDANTES ................................................................... 34

4 MTODOS PARA AVALIAO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE ..................... 37

5 REFERNCIAS ............................................................................................................... 41

CAPTULO II PADRONIZAO E VALIDAO DE MTODOS PARA

AVALIAO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE E

QUANTIFICAO DOS COMPOSTOS BIOATIVOS DE CAF

TORRADO E SOLVEL

RESUMO ............................................................................................................................ 48

1 INTRODUO................................................................................................................ 49

2 MATERIAL E MTODOS.............................................................................................. 50

2.1 MATERIAL ...................................................................................................................... 50

2.2 MTODOS ....................................................................................................................... 51

2.2.1 Preparao das amostras............................................................................................. 51

2.2.2 Caracterizao da atividade antioxidante ................................................................... 51

2.2.3 Validao das metodologias ....................................................................................... 53

2.2.4 Avaliao Cromatogrfica.......................................................................................... 55

3 RESULTADOS E DISCUSSO ..................................................................................... 56

3.1 AVALIAO DOS MTODOS DE DETERMINAO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE ............. 56

3.2 AVALIAO DO MTODO CROMATOGRFICO ................................................................ 59

4 CONCLUSO.................................................................................................................. 61

5 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ............................................................................. 61

CAPTULO III COMPORTAMENTO DE COMPOSTOS ANTIOXIDANTES

NO PROCESSO DE TORRA DE CAF ARBICA E ROBUSTA

RESUMO ............................................................................................................................ 64

1 INTRODUO................................................................................................................ 65


2.1 MATERIAL ...................................................................................................................... 66

2.2 MTODOS ....................................................................................................................... 68

2.2.1 Avaliao da Atividade Antioxidante......................................................................... 68

2.2.2 Determinao de 5-ACQ, cafena, trigonelina, furfural e HMF................................. 69

2.2.3 Determinao de melanoidinas................................................................................... 69

2.2.4 Anlise Estatstica ...................................................................................................... 70


3.1 COMPOSIO QUMICA DAS AMOSTRAS DE ARBICA E ROBUSTA DURANTE O

PROCESSO DE TORRA................................................................................................. 70

3.2 AVALIAO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE .................................................................. 73

4 CONCLUSO.................................................................................................................. 73

5 REFERNCIAS ............................................................................................................... 78

CAPTULO IV ATIVIDADE ANTIOXIDANTE, POLIFENIS, CAFENA E

MELANOIDINAS DE CAF SOLVEL: INFLUNCIA DAS

CONDIES DE PROCESSAMENTO E MATRIA- PRIMA

RESUMO ............................................................................................................................ 82

1 INTRODUO................................................................................................................ 83


2.1 MATERIAL ...................................................................................................................... 84

2.2 MTODOS ....................................................................................................................... 86

2.2.1 Metodologias de Determinao da Atividade Antioxidante....................................... 86

2.2.2 Determinao dos Compostos Boativos do Caf Solvel .......................................... 88

2.2.3 Anlise Estatstica ...................................................................................................... 88


4 CONCLUSO.................................................................................................................. 94

5 REFERNCIAS ............................................................................................................... 95

CAPTULO V INVESTIGAO E AVALIAO DE CONSTITUINTES

DO CAF COM ATIVIDADE ANTIOXIDANTE

RESUMO ............................................................................................................................ 98

1 INTRODUO................................................................................................................ 99

2 MATERIAL E MTODOS............................................................................................ 101

2.1 MATERIAL .................................................................................................................... 101

2.2 MTODOS ..................................................................................................................... 102

2.2.1 Medida da Atividade Antioxidante........................................................................... 102

2.2.2 Anlise Estatstica .................................................................................................... 104

3 RESULTADOS E DISCUSSO ................................................................................... 104

4 CONCLUSO................................................................................................................ 109

5 REFERNCIAS ............................................................................................................. 110

CAPTULO VI INFLUNCIA DO PREPARO DA BEBIDA NA

EXTRAO DOS COMPOSTOS BIOATIVOS E NA ATIVIDADE

ANTIOXIDANTE DE CAF ARBICA

RESUMO .......................................................................................................................... 113

1 INTRODUO.............................................................................................................. 114

2 MATERIAL E MTODOS............................................................................................ 115

2.1 MATERIAL .................................................................................................................... 115

2.1.1 Material e Preparo das amostras............................................................................... 115

2.1.2 Reagentes e equipamentos........................................................................................ 116

2.2 MTODOS ..................................................................................................................... 117

2.2.1 Avaliao da Atividade Antioxidante....................................................................... 117

2.2.2 Determinao de melanoidinas................................................................................. 118

2.2.3 Determinao de 5-ACQ, cafena, furfural e hidroximetilfurfural por cromatografia

lquida de alta eficincia (CLAE).......................................................................... 119

2.2.4 Determinao dos compostos volteis por cromatografia gasosa (CG) ................... 119

2.2.5 Anlise Estatstica .................................................................................................... 119

3 RESULTADOS E DISCUSSO ................................................................................... 119

3.1 COMPOSIO QUMICA E ATIVIDADE ANTIOXIDANTE................................................... 120

4 CONCLUSO................................................................................................................ 127

5 REFERNCIAS ............................................................................................................. 127

CONCLUSO GERAL .................................................................................................. 130

16

1 INTRODUO

O caf a segunda mercadoria mais importante para a economia mundial

depois do petrleo (BORRELI et al., 2002). Setenta e cinco por cento das bebidas tipo soft

drink consumidas regularmente no mundo so caf; sendo que os tipos de bebidas e a

modalidade de consumo so fortemente associados com os hbitos sociais e culturas dos

diferentes pases (LPEZ-GALILEA; DE PENA; CID, 2007). Uma pesquisa mostra que 9

em cada 10 brasileiros acima de 15 anos consomem caf diariamente, o que faz deste a

segunda bebida com maior penetrao na populao, atrs apenas da gua e frente dos

refrigerantes e do leite (ABIC, 2008). Segundo dados da Secretaria de Produo e

Agroenergia do Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento (Mapa), em 2008, o

Brasil, entre os pases produtores fechou como maior consumidor, representando 53% de todo

o consumo de pases produtores, seguido pelo Mxico (7%), Indonsia (6%) e Etipia (5%)

(MAPA, 2008).

No Brasil, o consumo per capita para o ano de 2008 foi de 5,64 kg de caf

em gro cru ou 4,51 kg de caf torrado, quase 74 litros para cada brasileiro por ano,

registrando uma evoluo de 2,1% em relao ao perodo anterior. Este resultado iguala o

consumo por habitante/ano do Brasil ao da Itlia (5,63 kg/hab.ano), supera o da Frana (5,07

kg/hab.ano) ficando pouco abaixo da Alemanha (5,86 kg/hab.ano). Os campees de consumo,

entretanto, ainda so os paises nrdicos - Finlndia, Noruega, Dinamarca - que consomem

cerca de 13 kg/hab.ano. Por outro lado, considerando o caf j torrado e modo, o consumo

per capita de 4,51 kg/hab.ano aproxima-se do consumo histrico de 1965, que foi de 4,72

kg/hab.ano (ABIC, 2008).

O caf pertence ao gnero Coffea e, de dezenas de espcies, somente duas

tm importncia econmica no mercado mundial: arbica (Coffea arabica) e robusta (Coffea

canephora). O caf arbica mais valorizado economicamente devido ao seu aroma e sabor.

Ao longo dos sculos, diversas variedades foram plantadas em solo

brasileiro. Atualmente as duas variedades de arbica mais cultivadas so Mundo Novo e

Catua. O caf robusta, apesar de menos valorizado economicamente, tem grande aceitao no

mercado norte-americano e europeu. Isso se deve principalmente ao fato de ser utilizado na

fabricao de caf solvel, por possuir maior teor de substncias solveis, acares e cafena,

em comparao ao caf arbica. (COFFEE BREAK, 2006).

Nos ltimos anos, devido a um grande interesse em alimentos que

17

promovam funes fisiolgicas, a relao entre caf e sade tem sido extensivamente

estudada. A bebida do caf vem se destacando entre outras pelo seu potencial antioxidante,

alm de seu sabor e aroma agradveis. conhecido que gros de caf verde, caf torrado e a

bebida do caf contm compostos que exercem atividade antioxidante (PARRAS et al., 2007).

A presena de grande quantidade de cidos clorognicos no caf contribui significativamente

para sua atividade antioxidante. Apesar do decrscimo destes polifenis no processo de torra,

recentemente tm sido mostrado que cido qunico e cafico, componentes dos cidos

clorognicos, so quimicamente incorporados s melonoidinas durante este processo

(BEKEDAM et al., 2008 a), alm da potencial atividade antioxidante j demonstrada para

cafena (SHI; DALAL, 1991).

Diferentes mtodos so utilizados para caracterizar a capacidade

antioxidante de alimentos. Entretanto, no h nenhum mtodo universal pelo qual a atividade

antioxidante possa ser medida precisamente e quantitativamente (PRIOR; WU; SCHAICH,

2005). A capacidade antioxidante da bebida do caf j foi estudada pelos ensaios de FRAP

(Ferric Reducing Antioxidant Power) (SNCHEZ GONZLEZ; JIMNEZ-ESCRIB;

SAURA- CALIXTO, 2005), ABTS (2,2'-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) e

DMPD (N, N-dimethil-p-phenylenediamine) (SNCHEZ GONZLEZ; JIMNEZ-

ESCRIG; SAURA-CALIXTO; BORRELI et al., 2002), deoxirribose (DAGLIA et al.,2004),

DPPH (2,2 Difenil-1- picrilhidrazil) (BORRELI et al., 2002) e determinao de fenlicos

totais (BORRELI et al., 2002). Muitos desses estudos referem-se ao caf verde e torrado,

porm muitas vezes no h um controle da matria-prima e das condies de processo

dificultando a comparao entre dados da literatura. Sobre os antioxidantes presentes no caf

solvel, pouco conhecido.

Desta maneira, este trabalho teve como objetivo avaliar a influncia do

processo de torra e extrao na atividade antioxidante do caf, e posteriormente a influncia

do mtodo de preparo das bebidas, relacionando a atividade antioxidante avaliada por

diferentes mtodos, com os compostos bioativos presentes.

Dentro do contexto do trabalho, o captulo 1 apresenta uma reviso

bibliogrfica, abrangendo composio qumica e processamento do caf; os compostos

presentes possivelmente associados a AA; radicais livres e antioxidantes e mtodos para

avaliao da atividade antioxidante.

O captulo 2 refere-se adequao e preciso de diferentes tcnicas de

medida de atividade antioxidante para o caf torrado e solvel, assim como de uma tcnica

cromatogrfica para determinao dos principais compostos potencialmente associados a AA

18

dos produtos. As metodologias validadas nesse captulo foram empregadas em todo o

desenvolvimento do trabalho.

O captulo 3 refere-se ao estudo de composio qumica e AA para caf

torrado e modo, descrevendo o comportamento dos principais compostos considerados como

antioxidantes durante o processo de torra de cafs arbica e robusta, bem como a medida da

atividade antioxidante dos produtos por diferentes metodologias e sua correlao com a

composio.

No captulo 4, um estudo similar foi feito com cafs solveis. Foi avaliado o

efeito das condies do processamento de caf solvel (torra e mtodo de extrao) bem

como das matrias-primas (arbica e robusta), sobre a capacidade antioxidante do produto

final, relacionando-se a AA medida por diferentes tcnicas composio qumica.

No captulo 5, compostos naturalmente presentes no caf ou formados no

processamento (5-ACQ, cafena, trigonelina, fraes com diferentes PM incluindo

melanoidinas, furfural, 5-HMF, maltol e guaiacol), selecionados com base na sua potencial

contribuio para a AA, foram submetidos determinao da AA por mtodos associados a

diferentes mecanismos de atuao (Folin-Ciocalteau, TEAC, FRAP, DPPH, e deoxirribose).

Essa avaliao permitiu comparar o impacto dos diversos constituintes de caf na atividade

antioxidante.

No captulo 6, para concluir o estudo, comparou-se bebidas produzidas a

partir de caf arbica. As mesmas amostras foram processadas para caf torrado (bebida de

torrado e espresso) e posteriormente extradas e liofilizadas para produo de caf solvel

(bebida de solvel). Estudou-se a influncia do preparo da bebida (filtrado, espresso e solvel)

na AA, relacionando-a a composio qumica das bebidas e dos volteis.

19

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar o efeito das condies do processamento do caf (torra e mtodo

de extrao); do mtodo de preparo de bebida, bem como das matrias-primas (espcies

Coffea arabica e Coffea canephora), na composio qumica e capacidade antioxidante do

produto final, relacionando-se a AA medida por diferentes tcnicas composio qumica.

2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS

o Adequar e validar as metodologias ABTS, DPPH, Deoxirribose, FRAP e

Fenlicos Totais e cromatogrfica (compostos bioativos) para aplicao

em caf torrado e solvel;

o Determinar os teores de cafena, cidos clorognicos, trigonelina, furfural,

5- hidroximetilfurfural e melanoidinas presentes nos diferentes produtos;

o Avaliar a atividade antioxidante presente em caf torrado e caf solvel

atravs dos ensaios ABTS, DPPH, Deoxirribose, FRAP e Fenlicos

Totais (Folin- Ciocalteau);

o Verificar a influncia da matria-prima na atividade antioxidante dos

produtos;

o Determinar a influncia das condies de torra na atividade antioxidante

dos produtos;

o Determinar a influncia de diferentes processos de extrao na capacidade

antioxidante do produto solvel;

o Estabelecer uma correlao entre os diferentes compostos e as

metodologias de avaliao da atividade antioxidante;

o Avaliar a atividade antioxidante de compostos isolados, que fazem parte

da composio do caf;

o Verificar a influncia do procedimento de preparo das bebidas espresso,

de filtro e solvel na sua atividade antioxidante e na extrao dos

compostos bioativos.

20

CAPTULO I REVISO BIBLIOGRFICA

1 CAF: COMPOSIO QUMICA E PROCESSAMENTO

A composio qumica do caf verde depende da espcie e da variedade em

questo, alm de outros fatores como solo, clima, regime de chuvas, altitude do terreno,

prticas da agricultura, grau de maturao e condies de armazenamento (COFFEE BREAK,

2009).

Dentre os acares presentes manose representa 44%, galactose 23%,

arabinose 12%, glicose 15%, ramnose 1% e xilose 2%. Sendo assim, 80% dos carboidratos do

caf verde esto presentes como galactomananos e arabinogalactanos. Os galactomananos

consistem em uma cadeia principal de manose unidas por ligaes glicosdicas 1 4 e

ramificadas com unidades de galactose no C-6, com variado grau de ramificao, enquanto

que os arabinogalactanos consistem em uma cadeia principal de galactoses unidas por

ligaes 1 3 e ramificadas no C-6 com cadeias laterais contendo resduos de arabinose e/ou

galactose (NUNES et al., 2006).

O caf verde tambm apresenta considervel teor de lipdios, principalmente

no endosperma, cujos teores ficam por volta de 11,4% no caf arbica e de 6,1% no caf

robusta (LAGO, 2001). Protenas tambm so encontradas em grande proporo sendo que

gros verdes podem apresentar teores de 11 a 13% e torrados de 13 a 15% (CLIFFORD,

1975).

Dentre os compostos nitrogenados do caf verde encontram-se, alm das

protenas, trigonelina e cafena. A trigonelina, uma N-metil-betana, importante para o sabor e

aroma do caf encontrada no gro verde em quantidades de 0,8% no caf arbica e 0,7% em

caf robusta. A cafena representa cerca de 2,2% da matria seca no caf robusta e 1,3% no

caf arbica (LELOUP, 2006).

O processo de fabricao do caf, utilizado para o preparo da bebida, da

matria- prima at o produto final, inclui os procedimentos de torra e moagem, para as

bebidas preparadas a partir do gro torrado e ainda extrao, secagem do extrato (atomizao

ou liofilizao) e embalagem do p para o mercado, para a bebida do caf solvel.

21

As caractersticas aromticas e de cor do produto so exclusivamente

formadas durante a torra. O caf verde usualmente torrado a uma temperatura final de 200-

250C dentro de um tempo determinado que pode chegar at 20 minutos (WEIJAN WU,

1994). A composio do caf torrado altamente dependente do processo e do grau de torra.

Durante a torra muitas reaes complexas ocorrem, incluindo interao e

condensao entre grupos amino e carbonil (reao de Maillard), destruio e caramelizao

de acares e hidrlise/despolimerizao de protenas e polissacardeos. As caractersticas de

aroma e sabor de diferentes produtos so formadas por estes processos complexos.

Os carboidratos so os componentes mais afetados pelo processo de torra,

que induz mudanas na quantidade e estrutura dos componentes em relao ao caf verde

(NUNES; COIMBRA, 2001). Dependendo da estabilidade ao calor dos diferentes

polissacardeos eles sero decompostos mais ou menos fortemente (LELOUP; LIARDON,

1993). Durante a torra, mono e oligossacardeos so novamente formados atravs da hidrlise

de polissacardeos. Por outro lado, em maior extenso, eles tambm reagem com aminocidos

livres ou peptdeos formando complexos de melanoidinas. A diminuio no teor de

carboidratos deve-se converso de parte dos acares a produtos de reaes de Maillard e

reaes de pirlise (LELOUP; LIARDON, 1993).

A cafena relativamente resistente s temperaturas utilizadas na torra. Na

substncia pura, perdas pequenas de cafena podem ocorrer por sublimao a 178C. Como o

processo realizado a temperaturas em torno de 200-230C, uma perda considervel deveria

ser observada durante o processamento, mas isso no ocorre. Os dois fatores que mais

contribuem para a estabilidade so provavelmente, um aumento no ponto de sublimao da

cafena, como resultado de presses internas mais elevadas geradas dentro do gro e uma

baixa taxa de difuso do vapor atravs das camadas externas do gro (TRUGO; MOREIRA;

DE MARIA, 2000).

A trigonelina sensvel a altas temperaturas e o grau de degradao trmica

varia conforme as condies de torra do caf. Somente 15% da trigonelina inicial permanece

aps o processo de torra a 230C por 15 minutos. A 180C foi observada pequena perda aps

15 minutos (2%), chegando a 60% com o aumento do tempo de torra para 45 minutos. A

degradao da trigonelina gera compostos no volteis e volteis, sendo um deles o cido

nicotnico (TRUGO; MOREIRA; DE MARIA, 1999).

cidos clorognicos tambm so degradados durante a torra. Em estudo

sobre o efeito da temperatura, Trugo, Moreira e De Maria (1999) observaram perdas em torno

de 60%, aps torra a 205C por 7 minutos. Um aumento na perda ocorreu em condies mais

22

severas. Aproximadamente metade do contedo total de cidos clorognicos perdidos na torra

pde ser encontrada na frao de pigmentos, na forma de cido qunico livre e como

compostos fenlicos de baixo peso molecular. Parte dos produtos de degradao foi perdida

por volatilizao, e uma grande parte permaneceu sem caracterizao.

Lipdios presentes no caf verde, principalmente no endosperma, aumentam

proporcionalmente aps a torra, devido degradao de carboidratos. No caf arbica o

aumento relatado foi de 11,4% para 15,4% e, no robusta, de 6,1% para 9,6% (LAGO, 2001).

Em teores de aproximadamente 13% no gro cru, as protenas do

contribuies marcantes ao sabor do caf atravs dos produtos de sua decomposio nas

reaes de pirlise durante a torra. Na torra ocorre hidrlise das ligaes peptdicas das

molculas proticas, com liberao de carbonilas e aminas; os aminocidos reagem com

carboidratos e polimerizam formando produtos caramelizados escuros (melanoidinas). H

tambm produo de aminas responsveis pelo odor de peixe e de amonaco dos cafs

excessivamente torrados. Nenhum aminocido permanece livre aps a torra por 5 minutos em

220 C. Uma outra contribuio importante para as caractersticas do caf, ligada a

substncias proticas, deve-se ao fato de as partculas insolveis de protenas se ligarem a

substncias graxas formando no caf coado partculas coloidais responsveis pela turbidez da

bebida (CARVALHO et al., 1997).

O produto solvel passar ainda por etapas adicionais de processamento. O

caf solvel o produto da extrao dos gros torrados e modos. Os gros so submetidos

extrao sob presso em altas temperaturas (180C) o que promove, na verdade, um

enriquecimento de slidos solveis em relao matria-prima. O extrato ento desidratado

em vaporizadores ou liofilizadores originando o caf solvel em p ou granulado.

23

Figura 1 Esquema representativo do processo de produo de caf solvel.

A composio desse material solvel depender, alm das condies do

processamento, das espcies e variedades utilizadas nos "blends" (NOGUEIRA; TRUGO,

2003), fatores que tambm afetaro a capacidade antioxidante. A Figura 1 apresenta o

esquema de produo do caf solvel.

Este processo usualmente realizado numa bateria de percoladores

resultando em 45 a 50% de rendimento de slidos solveis. O alto rendimento de extrao

devido principalmente alta temperatura, superior a 180C, e ao uso do princpio contra-

corrente. A gua quente primeiramente introduzida na primeira coluna contendo a maioria

do caf extrado e flui para o prximo percolador. No meio tempo, os slidos solveis do

extrato aumentam, mas a temperatura cai devido perda de calor, ento a ltima coluna

contendo caf fresco extrada a uma temperatura prxima a 100C estando sujeito a danos

mnimos. O extrato concentrado atravs da evaporao a menor presso e seco por

asperso ou liofilizao. Freqentemente as partculas obtidas por asperso so aglomeradas

em grnulos maiores, tornando-se maiores, porosas, com melhores propriedades de

reidratao (WEIJAN WU, 1994). O extrato concentrado atomizado em forma de gotculas

no topo de uma torre de secagem ao mesmo tempo em que submetido a uma corrente de ar

quente, provocando a evaporao da gua. O produto coletado na base dessa torre o caf

solvel, que pode ser transformado em caf aglomerado se submetido a uma etapa adicional

24

de processamento Na secagem por liofilizao o extrato congelado a temperaturas inferiores

a -30 C , sendo ento triturado em moinhos especiais e conduzido cmara de vcuo dentro

de bandejas, onde a gua removida por sublimao. O produto final o caf liofilizado, que

produz bebida de melhor qualidade pela preservao das caractersticas aromticas. Com o

processo de extrao observam-se alteraes na composio qumica do caf como

enriquecimento de cafena, diminuio do teor de lipdeos, solubilizao de melanoidinas

(Tabela 1).

Tabela 1 Composio qumica do caf solvel com diferentes cores de torra para produtos 100% arbica e 100% robusta.

Fonte: Leloup (2006) * Carboidratos totais no caf verde tambm incluem cidos urnicos.

25

2 COMPOSTOS PRESENTES NO CAF ASSOCIADOS COM A CAPACIDADE

ANTIOXIDANTE

A capacidade antioxidante do caf tem sido atribuda a diferentes

compostos, dentre eles destacam-se os compostos fenlicos (como cidos clorognicos,

cafico, ferlico), a cafena e as melanoidinas, bem como trigonelina e alguns volteis.

2.1COMPOSTOS FENLICOS

Os compostos fenlicos so metablitos secundrios de plantas envolvidos

na adaptao a condies de estresse ambiental. Normalmente, esto envolvidos na defesa

contra radiao ultravioleta ou agresso por patgenos. Milhares de compostos fenlicos tm

sido descritos em plantas alimentares e podem ser agrupados em diferentes classes de acordo

com sua estrutura qumica bsica (tais como tipo e nmero de anis fenlicos), e em

diferentes subclasses de acordo com substituies especficas na estrutura bsica, associao

com carboidratos e formas polimerizadas. Enquanto na polpa os taninos representam os

principais compostos fenlicos, os cidos clorognicos e compostos relacionados so os

principais componentes da frao fenlica dos gros de caf verde, alcanando teores de at

14% (em peso seco). Estes compostos apresentam propriedades benficas sade, no s

devido sua potente atividade antioxidante, mas tambm como agentes hepatoprotetores,

hipoglicemiantes e antivirais (FARAH; DONANGELO, 2006).

Os cidos clorognicos so uma famlia de compostos de steres, formados

principalmente pelo cido qunico com certos cidos cinmicos como o cafico, o ferlico ou

o cumrico. A composio de cidos clorognicos do caf extremamente complexa com

pelo menos cinco maiores grupos. Caf verde contm os seguintes: trs monosteres de cido

cafico (cidos cafeolqunicos, ACQ); trs monosteres do cido -cumrico (cidos

cumaroilqunicos, ACQ); trs monosteres do cido ferlico (cidos feruloilqunicos, AFQ);

trs disteres de cido cafico (cidos dicafeoilqunicos, diACQ), e seis disteres de cido

cafico e ferlico (cidos dicafeoilferuloilqunicos, ACFQ). O representante majoritrio do

grupo ACG o cido 5-cafeoilqunico (5-ACQ), para qual muitas vezes se emprega o termo

clorognico (DE MARIA; MOREIRA, 2004).

26

Apesar da larga distribuio dos cidos clorognicos em plantas, o caf

verde conhecido como o principal alimento fonte deste composto, com contedo sendo igual

ou excedido apenas por folhas verdes de Illex paraguayensis (erva mate) (CLIFFORD, 1999).

O contedo de cido clorognico total do gro de caf verde pode variar de acordo com a

espcie, grau de maturao e com menor importncia pelas prticas agrcolas, clima e solo

(FARAH et al., 2005).

Durante o processo de torrefao estes compostos fenlicos so

intensamente degradados, originando pigmentos e componentes volteis do aroma, como

fenol e vinilguaiacol (MOREIRA; TRUGO; DE MARIA, 2000). Para um grau de torra

similar (perda matria seca) o caf robusta perde uma maior quantidade absoluta de cidos

clorognicos produzindo uma maior quantidade de pequenos fenis volteis e guaiacol que

contribuem para um aroma de fumaa menos atrativo (CLIFFORD, 1997). A destruio

destes cidos progressiva com a torra com aproximadante 8 a 10% de perdas para cada 1%

de perda de matria seca (CLIFFORD, 1985).

Durante as ltimas dcadas, estudos in vitro e in vivo levaram os

pesquisadores a atribuir diferentes funes farmacolgicas aos ACG, tais como a ligao a

centros opiides do crebro, atividade inibitria sobre as integrases que participam na

replicao do vrus HIV, induo da diminuio dos nveis sanguneos de glicose, por meio da

inibio da enzima glicose-6-fosfatase, efeito indutor na replicao e na mobilidade de

macrfagos de camundongos, o que acarretaria um aumento da imunidade e caracterstica

anti-mutagnica (MONTEIRO; TRUGO, 2005).

Alm disso, cidos clorognicos e cafico tm apresentado atividade

antimicrobiana para alguns microrganismos especficos como j verificado por Almeida et al.,

2006.

Compostos fenlicos tm recebido muita ateno devido ao seu potencial

antioxidante, e sua contribuio para a AA do caf foi avaliada por diversos estudos.

Morishita e Kido (1995) relataram a potencial contribuio dos cidos clorognicos para

atividade antioxidante do caf pelo uso do sistema de seqestro de radicais (DPPH) e

peroxidao do cido linolico mediada pelo nion superxido. MOREIRA et al. (2005)

encontraram forte correlao entre os cidos clorognicos, particularmente, os ismeros 3, 4 e

5-ACQ e a atividade redutora de ferro, avaliada pelo mtodo FRAP.

Daglia et al. (2004) demonstraram que cafs verde e torrado das espcies C.

arbica e C. canephora possuem atividade anti-radical hidroxlicos, que foi avaliada in vitro e

em sistema celular biolgico. No houve diferena nos experimentos in vitro, mas nos ensaios

27

biolgicos foi observada uma maior proteo anti-radical livre nas amostras de caf torrado C.

canephora. Vrios compostos presentes no caf foram avaliados, sendo que, nos ensaios

biolgicos, o 5-ACQ destacou-se como o mais eficiente.

Snchez-Gonzlez, Jimnez-Escrig e Saura-Calixto (2005) encontraram

uma alta correlao entre o contedo de polifenis presente em bebidas preparadas por

diferentes procedimentos (italiano, espresso e liofilizado) e a atividade seqestradora de

radicais ABTS (r= 0,99).

Gmez-Ruiz, Leake e Ames (2007) realizaram um estudo sobre o poder

antioxidante, com padres dos compostos fenlicos encontrados no caf, contra os radicais

ABTS+ e peroxil, utilizando os mtodos TEAC e ORAC, respectivamente. Considerando-se

o mtodo TEAC, cido ferlico foi o composto que apresentou maior atividade antioxidante.

cido cafico e 5-cafeoilqunico (5-ACQ) mostraram atividade semelhante, porm inferior ao

ferlico. No mtodo ORAC foi detectada a mais alta AA para cido cafico, seguido por 5-

ACQ e ferlico levemente menores. Em ambos os mtodos a AA dos padres fenlicos foi

maior que os padres de cafena e seus metablitos.

Padres de 5-ACQ e cido cafico foram avaliados por Parras et al. (2007)

como seqestradores do radical lipoperoxil e causaram uma inibio na peroxidao em 45,1

e 18,1%, respectivamente. Apesar dos compostos isolados demonstrarem AA, esta foi inferior

AA apresentada pelas bebidas de caf espresso, de filtro e italiano. Rice-Evans, Miller e

Paganga (1996) tambm demonstraram um forte poder antioxidante para o cido cafico em

estudos realizados in vitro.

Mltiplas atividades biolgicas para cido cafico foram encontradas. Uma

resistncia aumentada frente a um determinado stress oxidativo foi observada em moncitos

humanos linhagem U937. Este efeito foi atribudo ao poder de cido cafico de incorporar-se

s clulas sem qualquer influncia citotxica, para reduzir depleo de glutationa durante o

stress oxidativo e inibir peroxidao lipdica (NARDINI et al., 1998).

Efeitos protetores de cido cafico, baseados em sua atividade antioxidante

foram demonstrados contra irradiao UV, especialmente UVA e UVB, em sistemas in vitro e

in vivo (SAIJA et al., 1999, 2000). NERADIL et al. (2003), demonstraram que o cido cafico

possui efeito protetor tambm contra irradiao UVC. Este efeito provavelmente baseado na

atividade antioxidante e poder seqestrador deste composto, o que pode reduzir os danos

oxidativos do DNA e de membranas ricas em lipdios.

A estrutura qumica de compostos fenlicos (Figura 2) que confere sua

capacidade de atuar como seqestradores de radicais livres. O tipo de composto, o grau de

28

metoxilao e o nmero de hidroxilas so alguns dos parmetros que determinam esta

atividade antioxidante. Frente ao radical peroxil, por exemplo, pode ser inferido que um

aumento no nmero de hidroxilas conduz a um aumento na atividade anti-radical livre

(GMEZ-RUIZ; LEAKE; AMES, 2007). Tem sido descrito que ligaes duplas nas cadeias

de cidos hidroxicinmicos, participam na estabilizao do radical por ressonncia

(NATELLA et al., 1999).

O caf sem dvida a fonte mais importante da dieta deste grupo de

compostos fenlicos. A quantidade de cido cafico, assim como clorognico para atuar como

antioxidante in vivo, depender da absoro de cada um deles pelo intestino. A literatura cita

que humanos absorvem cerca de 33% do cido clorognico e 95% do cido cafico ingeridos

(OLTHOF et al., 2001). Depois da ingesto, steres de cido cafico, liberam este cido pela

ao de esterases da microbiota intestinal. O cido cafico livre capaz de passar pela parede

do intestino, sendo identificado no soro e urina de humanos (CREMIN et al., 2001). O

contedo de cido clorognico de uma xcara de caf de 200 mL tem sido registrado em torno

de 70-350mg (CLIFFORD, 1999).

Figura 2 Estrutura qumica dos principais compostos fenlicos do caf.

29

2.2 CAFENA

Cafena (Figura 3) um alcalide pertencente ao grupo das metilxantinas

Na natureza, encontrada em mais de 60 espcies de plantas e suas principais fontes

alimentares so o caf, mate e guaran. Ela inodora e possui sabor amargo bastante

caracterstico, contribuindo com uma nota de amargor importante para o sabor e aroma da

bebida do caf (MONTEIRO; TRUGO, 2005).

Apesar da estabilidade trmica ao processo de torra, o teor de cafena no

caf dependente de uma srie de fatores como a variedade da planta, mtodo de cultivo,

condies de crescimento, alm de aspectos genticos e sazonais. No caso da bebida, por

exemplo, alm da quantidade de p, influenciam tambm o tipo do produto (torrado ou

solvel, descafeinado ou regular) e o processo utilizado no seu preparo (CAMARGO;

TOLEDO, 1998). Para o caf solvel, Nogueira e Trugo (2003) relatam que a extrao sob

presso em altas temperaturas promove um enriquecimento de slidos solveis em relao

matria-prima do gro torrado, com conseqente aumento no teor de cafena. Considerando-se

a espcie, cafena representa cerca de 2,2% da matria seca em caf robusta e 1,3% em caf

arbica (LELOUP, 2006). Segundo Camargo e Toledo (1988); para cafs brasileiros o teor

mdio de cafena encontrado nas bebidas de filtro, espresso e solvel, giram em torno de 0,6;

0,9 e 0,7mg/mL, respectivamente.

Aps ingesto, a cafena rapidamente e quase completamente absorvida no

estmago e intestino delgado, sendo distribuda a todos os tecidos incluindo o crebro. O

metabolismo da cafena ocorre primariamente no fgado, com o processo de desmetilao que

resulta na formao de 1,7 dimetilxantina (paraxantina). Paraxantina pode ser desmetilada

para formar 1-metilxantina, que pode ser oxidada a cido 1-metilrico. Paraxantina pode

tambm ser hidroxilada para formar cido 1,7 dimetilrico ou acetilada para formar 5-

acetilamina-6-amino-3-metiluracil (CREWS; OLIVIER; WILSON, 2001).

Figura 3 Estrutura qumica da cafena.

30

Diversos efeitos so atribudos ingesto da cafena, como a estimulao do

sistema nervoso central, diminuio do sono e estimulao do msculo cardaco (NEHLIG,

1999). Alm destes, efeitos relacionados sua atividade antioxidante tm sido estudados.

A cafena um eficiente seqestrante de radicais hidroxlicos (OH.), o que

sugere uma base para suas propriedades anticarcinognicas (SHI; DALAL, 1991).

Lee (2000) estudou a habilidade de cafena e seus metablitos em reagir

com espcies reativas de oxignio e em inibir a peroxidao da LDL (lipoprotena de baixa

densidade) em concentraes habituais no organismo aps ingesto de caf. Embora cafena

no tenha apresentado atividade nas concentraes estudadas, observou-se AA para 1-

metilxantina (1-X) e cido 1-metilrico (1-U), seus principais metablitos em humanos.

Gmez-Ruiz, Leake e Ames (2007) encontraram atividade antioxidante dos

metablitos de cafena, 1-metilxantina e cido 1, 3, 7- trimetilrico, contra os radicais ABTS+

e peroxlicos, e retardamento da oxidao do LDL pelo cobre, apesar de cafena no ter

demonstrado essa atividade.

Lpez-Galilea, De Pea e Cid (2007), em estudo sobre a influncia do

preparo da bebida, relataram correlao entre teor de cafena e a AA avaliada por DPPH

(r:0,826) e, alta correlao com o potencial redox (r=-0,844).

O mecanismo de ao antioxidante sugerido para metilxantinas, incluindo

cafena e alguns de seus derivados, deve-se presena de um anel imidazol intacto e a

existncia de um doador de eltrons na posio C8 do grupo imidazol (Figura 3) (GMEZ-

RUIZ; LEAKE ; AMES, 2007).

Segundo Higdon e Frei (2006), apesar de ser frequentemente assumido que

uma xcara de caf fornea em torno de 100 mg de cafena, numa anlise de 14 diferentes

cafs de filtro comprados em cafeterias nos Estados Unidos encontrou-se uma variao no

teor de 72 a 130 mg de cafena por xcara de 240mL. Tem sido considerado ainda que existam

benefcios sade no consumo moderado de caf, equivalendo a 3-4 xcaras/dia, fornecendo

300- 400mg/dia de cafena (HIGDON; FREI, 2006).

2.3 MELANOIDINAS

Durante a torra, a baixa atividade de gua e alta temperatura favorecem o

desenvolvimento da reao de Maillard, com a formao de produtos de reao entre

protenas e carboidratos. , tambm, provvel que compostos fenlicos participem na reao,

31

tornando-se parte dos polmeros marrons, solveis em gua, chamados melanoidinas do caf

(NUNES; COIMBRA, 2001).

Como a estrutura molecular das melanoidinas pouco conhecida, estes

compostos so genericamente definidos como complexos macromoleculares que so marrons

e contm nitrognio. A literatura relata que a composio das melanoidinas difere dependendo

da composio dos alimentos e dos processamentos empregados. O conhecimento da estrutura

das melanoidinas do caf est ainda no seu incio, e na verdade, nem a estrutura, nem a

natureza e a quantidade de compostos fenlicos que esto incorporados no polmero foram

esclarecidas (BORRELI et al., 2002).

Bekedam et al. (2008b), avaliando o efeito da torra na formao das

melanoidinas do caf, observaram que no incio (do gro verde para uma cor clara) ocorre

principalmente a formao de melanoidinas com um peso molecular (PM) intermedirio. A

torra prolongada conduz, predominantemente, formao de melanoidinas com um alto PM

(>12-14 KDa). Bekedam et al. (2008c) sugeriram que as arabinogalactanas so as principais

envolvidas na formao da estrutura da melanoidina, alm dos grupamentos fenlicos j

identificados, e que a solubilidade da melanoidina em etanol aumenta com o nmero de

grupamentos fenlicos.

As melanoidinas de baixo PM (inferiores a 3,5KDa) apresentam

caractersticas similares com as de alto PM, porm o principal acar presente glicose,

provavelmente oriunda da sacarose presente na estrutura da melanoidina e os fenlicos

representam 47% do complexo (BEKEDAM et al., 2008 d). Na tentativa de uma melhor

elucidao da estrutura das melanoidinas bem como da contribuio para a atividade

antioxidante do caf torrado, Bekedam et al. (2008 a) investigaram a presena de ACG nestas

molculas, com a utilizao de enzimas, e puderam observar a presena dos cidos cafico e

qunico aps saponificao de fraes de melanoidinas.

As melanoidinas so um dos mais importantes componentes da bebida do

caf torrado, contribuindo com aproximadamente 25% da matria seca. Vrios estudos

sugerem que so responsveis pela forte propriedade antioxidante e habilidade de quelar

metais mostrada pela bebida (NICOLI et al. 1997; DAGLIA et al., 2004). Alm disso, um

estudo realizado por Cmmerer e Kroh (2006) onde uma reao entre acares e compostos

amino foi facilitada, mostrou que os produtos gerados pela reao de Maillard apresentaram

uma promissora atividade antioxidante.

Borreli et al. (2002) caracterizaram quimicamente fraes de melanoidinas

de caf com cores de torra clara, mdia e escura e determinaram suas propriedades

32

antioxidantes utilizando diferentes metodologias. A atividade antioxidante da bebida

originria de torra clara, determinada pelo mtodo ABTS.+, foi significantemente maior

quando comparado com torras mdia e escura. Quando a bebida foi dividida em diferentes

fraes de acordo com seu peso molecular, a atividade antioxidante manteve-se em todas as

fraes, mas as fraes contendo melanoidinas (de alto PM), bem como as fraes de baixo

PM, rica em compostos fenlicos foram as mais ativas. A atividade antioxidante das

melanoidinas decresceu com o aumento da severidade da torra. Para caracterizar a atividade

antioxidante das melanoidinas, a frao que continha uma alta concentrao destas foi

analisada por diferentes ensaios antioxidantes, DMPD+ , inibio da peroxidao de cido

linolico e potencial redox. A capacidade de seqestrar radicais DMPD+ decresceu com o

aumento da intensidade da torra em concordncia com os ensaios para ABTS+. Ao contrrio, a

habilidade das fraes de alto peso molecular para prevenir a peroxidao de cido linolico

aumentou com o aumento do grau de torra.

Snchez-Gonzlez, Jimnez-Escrig e Saura-Calixto (2005) estudando a

atividade antioxidante em bebidas preparadas por diferentes procedimentos observaram que

as amostras de torra escura exibiram maior ao antioxidante que amostras de torra mdia, e

relacionaram esse efeito ao aumento dos produtos de reao de Maillard durante o processo.

Porm, ainda no foi completamente esclarecida a real contribuio de cada

composto para a AA do caf. Quando o produto torrado avaliado quanto ao seu poder

antioxidante, difcil atribuir qual a participao relativa aos compostos fenlicos e quanto

devido aos antioxidantes formados pela reao de Maillard.

Faz-se necessrio ento, um mtodo de deteco especfico para

antioxidantes no fenlicos do caf. Bekedam et al. (2008 e), com o objetivo de elucidar esta

questo, isolaram grupos de melanoidinas da bebida do caf com 4 diferentes graus de torra e

avaliaram sua propriedade antioxidante. Esta avaliao foi realizada com a utilizao da

tcnica de espectroscopia de ressonncia de spin utilizando o radical TEMPO (Tetrametil-1-

piperidinil- oxi), que no seqestrado por cidos clorognicos. Desta maneira, puderam

observam que realmente o processo de torra gera compostos com AA e que estes tiveram uma

melhor eficincia quando provenientes de torras mais escuras. Comparou-se tambm a AA da

poro fenlica avaliada utilizando como radical o sal de Fremy com a AA das melanoidinas

contra o radical TEMPO. Assim, estes autores concluram que apesar de compostos gerados

na torra apresentarem poder antioxidante, este no equivalente ao poder antioxidante dos

compostos fenlicos que so dominantes na contribuio para a AA total da bebida. Todavia,

o fato de no ocorrer alterao na AA com o aumento do grau de torra foi explicado pela

33

manuteno da AA dos polifenis mesmo incorporado na estrutura das melanoidinas com o

processo de torra. Estes no estariam na forma livre mas provavelmente ligados a outras

molculas por ligaes inicas, ster ou ter ( BEKEDAM et al., 2008 a).

Para avaliao da contribuio das melanoidinas como antioxidantes em

alimentos e em humanos, Rufin-Henares e Morales (2007) simularam um processo digestivo

utilizando a enzima gstrica pepsina. Foram liberados no processo digestivo compostos de

menor peso molecular que apresentaram uma alta AA, superior ao complexo de melanoidinas

que lhe deu origem. A diminuio do peso molecular pela digesto permite ento uma rpida

absoro de compostos potencialmente ativos. Este estudo suporta a hiptese de que as

melanoidinas teriam uma importante contribuio para a AA do caf torrado.

2.4 OUTROS COMPOSTOS DO CAF ASSOCIADOS ATIVIDADE ANTIOXIDANTE

Alm dos compostos usualmente considerados antioxidantes, discutidos

anteriormente, outros componentes presentes no caf j foram destacados quanto ao seu

potencial antioxidante.

Compostos volteis incluindo pirris, furanos, tiofenos e tiazis foram

examinados por Fuster et al. (2000) quanto s suas propriedades antioxidantes. Para avaliao

da AA foi acompanhada a converso oxidativa de hexanal a cido hexanico, atravs de

cromatografia gasosa. Observou-se que pirris, furanos e tiofenos inibiram a oxidao do

hexanal com atividade antioxidante comparvel a 50g/mL do antioxidante sinttico

hidroxitolueno butilado (BHT). Por outro lado, Lpez-Galilea, De Pea e Cid (2007) no

puderam encontrar nenhuma correlao entre a AA avaliada atravs dos mtodos DPPH e

FRAP com os compostos volteis acima mencionados.

Fujioka e Shibamoto (2006) investigaram a AA de extratos de diferentes

amostras comerciais de caf, correlacionando com alguns componentes, volteis ou no. Foi

possvel verificar que dentre 31 compostos qumicos identificados, guaiacol, etilguaiacol e

vinilguaiacol exibiram atividades antioxidantes comparveis ao - tocoferol.

Utilizando padres, Daglia et al. (2004) avaliaram o poder de seqestro de

radicais OH de alguns compostos presentes no caf, como trigonelina e cido nicotnico.

Trigonelina na concentrao 3,0 mM inibiu a degradao de deoxirribose em 19,3 % in vitro e

15,7% em condies ex vivo. cido nicotnico na concentrao 0,15mM teve a mesma

eficincia nas condies in vitro e 23,2% nos ensaios ex vivo.

34

3 RADICAIS LIVRES E ANTIOXIDANTES

Os radicais livres so definidos como qualquer espcie qumica com

existncia independente, que possuam um ou mais eltrons desemparelhados, estando este

eltron sozinho no orbital. Os radicais livres importantes em organismos vivos incluem

hidroxil (OH), nion superxido (O2-), xido ntrico (NO) e peroxil (RO2). Peroxinitrito

(ONOO-), cido hipocloroso (HOCl), perxido de hidrognio (H2O2), oxignio no estado

singleto (1O2) e oznio O3 no so radicais livres, porm podem facilmente sofrer reaes,

formando radicais livres no organismo. Os radicais tem reatividade variada, mas so

normalmente menos estveis que espcies no radicais. Uma vez formado, o radical pode

reagir com outro ou com outra molcula por vrias interaes. A velocidade e a seletividade

desses tipos de reaes dependem de fatores como a concentrao do radical e da localizao

do eltron desemparelhado. O termo espcies reativas de oxignio (EROs)

freqentemente usado para incluir espcies de radicais cujo eltron desemparelhado encontra-

se no tomo de oxignio e tambm as espcies no radicais comentadas (ARUOMA, 1998).

As EROs possuem diferentes aes in vivo. Algumas so positivas e esto

relacionadas com seu envolvimento na produo de energia, fagocitose, controle do

crescimento celular, sinalizao intercelular e sntese de compostos biologicamente

importantes. Entretanto, as EROs podem ser prejudiciais atacando protenas nos tecidos ou

enzimas, carboidratos, DNA e lipdios nas membranas celulares, modificando sua fluidez e

ocasionando a perda de funes essenciais (PIETTA, 2000). Em organismos saudveis o

balano entre a formao de EROs com a produo de antioxidantes, deve estar em equilbrio.

Quando a gerao de EROs se sobrepe as barreiras de defesa do organismo, se inicia a

ocorrncia de danos oxidativos nas estruturas biolgicas de macromolculas como DNA,

protenas e lipdios. Quando ocorre este desequilbrio, chega-se ao estresse oxidativo. Um

severo estresse oxidativo pode causar danos e morte celular, o que sugere a participao de

espcies radicais em doenas como cncer, aterosclerose, artrite reumatide e

envelhecimento. A morte celular por sua vez, pode liberar ons metlicos de seus stios de

ligao e estes podem ser quelados por molculas de DNA (ARUOMA, 1999). Os metais de

transio so fortemente implicados na gerao de radicais livres pela decomposio de H2O2

ou hidroperxidos lipdicos (SUGIHARA et al., 1999).

Os radicais livres podem ser produzidos atravs de fontes endgenas e

exgenas e so metabolizados no organismo pelo sistema de antioxidantes enzimticos (por

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ao das enzimas superxido dismutase, glutationa peroxidase e catalase) ou tambm, podem

ser neutralizados atravs de substncias antioxidantes no enzimticas (como tocoferis,

cido ascrbico e carotenides).

Todas as classes de biomolculas (carboidratos, protenas, cidos nuclicos

e lipdios) podem ser atacadas pelos radicais livres, porm os lipdios so provavelmente os

mais susceptveis (INAL; KANBAK; SUNAL, 2001). Membranas biolgicas contm

considervel quantidade de lipdios insaturados banhados por fluidos ricos em oxignio e

metal (BUEGE; AUST, 1978). Uma grande quantidade de radicais livres pode levar a uma

incontrolvel reao em cadeia de peroxidao lipdica. A formao do radical peroxil (RO2)

o principal passo na cadeia de propagao da peroxidao lipdica, porm RO2 pode

tambm ser formado em sistemas no lipdicos tais como protenas, que so danificadas pelos

lipdios peroxidados, alm de contribuir para oxidao do DNA levando carcinognese

(HALLIWELL et al., 1995).

Peroxidao lipdica ocorre em 3 estgios: iniciao, propagao e

finalizao. No estgio inicial, radicais livres retiram hidrognio de cidos graxos

poliinsaturados (PUFA) formando o radical lipdico. No estgio de propagao, o radical

lipdico reage com o oxignio molecular e forma o radical peroxil que quebrado para gerar

mais radicais livres mantendo a reao em cadeia. No estgio terminal, espcies de radicais

livres reagem entre si ou com o antioxidante para formar produtos inertes. A reao pode ser

inibida pela inativao de enzimas envolvidas na formao de radicais livres e/ou

antioxidantes que inibem o estgio inicial (COOK; SAMMAN, 1996).

Antioxidantes ingeridos na dieta, de fontes exgenas como vegetais, frutas e

verduras, bebidas, ervas e especiarias, podem ser efetivos na limitao do processo oxidativo

em sistemas tanto in vitro como in vivo (SCHULER, 1990).

Uma substncia considerada antioxidante quando, presente em baixa

concentrao comparada do substrato oxidvel, diminui ou inibe significativamente a

oxidao daquele substrato (RICE-EVANS; MILLER; PAGANGA, 1996). Antioxidantes

podem ser definidos como compostos, naturais ou sintticos, que apresentam elevada

estabilidade oxidativa e que tm propriedade de prevenir a oxidao de outras substncias

como protenas, cidos nuclicos e lipdios (MOREIRA; MANCINI-FILHO, 2003).

Os antioxidantes podem ser classificados como primrios, onde atuam como

doadores de prtons, impedindo o processo de iniciao desencadeado pelos radicais livres.

Nesta classe de antioxidantes so encontrados os compostos fenlicos, aminocidos, tocoferol

e carotenides. Os antioxidantes secundrios atuam no bloqueio da decomposio dos

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perxidos e hidroperxidos, convertendo-os na forma inativa por ao de agentes redutores,

bloqueando a reao em cadeia atravs da captao de intermedirios reativos como os

radicais peroxila e alcoxila. Entre eles so tambm caracterizados os antioxidantes sintticos,

as vitaminas A e E, e os compostos fenlicos (DONELLI; ROBINSON, 1995).

Entre os antioxidantes presentes nos alimentos, os compostos fenlicos

esto entres os que mais se destacam. As propriedades benficas destes compostos podem ser

atribudas sua capacidade seqestradora de espcies radicais, principalmente devido

hidroxilas vicinais ligadas ao anel aromtico (HALLIWELL et al., 1995). Os compostos

fenlicos podem ainda quelar metais de transio, impedindo que estes participem de reaes

redox e prevenindo, conseqentemente, eventos oxidativos.

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4 MTODOS PARA AVALIAO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE

A atividade antioxidante de alimentos envolve pelo menos duas questes: o

potencial antioxidativo, que determinado pela composio e propriedades antioxidantes dos

constituintes e os efeitos biolgicos que dependem, entre outras coisas, da biodisponibilidade

do antioxidante (ROGINSKY; LISSI, 2005).

Experimentos simples podem ser realizados para examinar diretamente a

habilidade antioxidante in vitro e para testar possvel efeito anti ou pr-oxidante em diferentes

alvos moleculares. Esta investigao pode ser usada para excluir uma possvel atividade

antioxidante in vivo: um composto que pouco efetivo in vitro possivelmente no ter melhor

ao in vivo (ARUOMA, 1999).

Duas abordagens so aplicadas para a determinao da atividade

antioxidante, direta ou indireta. Quando o mtodo indireto aplicado estuda-se mais

freqentemente a habilidade do antioxidante em seqestrar alguns radicais livres, que no

esto associados com a real degradao oxidativa, por exemplo, alguns radicais livres estveis

e coloridos so populares devido intensa absorbncia na regio do visvel. Neste caso,

determina-se a atividade antioxidante por determinao da capacidade doadora de hidrognio.

Mtodos diretos caracterizam-se pela presena de uma competio entre uma sonda oxidvel

e o antioxidante pelos radicais gerados por uma fonte de radicais livres. Como substrato de

oxidao pode ser utilizado lipdios, misturas lipdicas, protenas, DNA, ou espcies

relevantes biologicamente contendo lipdios, tais como, plasma sangineo, LDL, membranas

biolgicas. Peroxidao lipdica mostra-se como o mais conveniente para este propsito

(ROGINSKY; LISSI, 2005).

Diferentes mtodos para avaliao da capacidade antioxidante em alimentos

tm sido estudados. De acordo com Prior, Wu e Schaich (2005), no h nenhum mtodo

universal pelo qual a atividade antioxidante pode ser medida precisamente e

quantitativamente. Na seleo de qualquer mtodo para padronizao, a primeira

considerao que o mtodo tenha sido utilizado numa quantidade de vezes suficiente em

diferentes laboratrios para que as vantagens e desvantagens do ensaio sejam aparentes. Um

mtodo ideal para determinar capacidade antioxidante deveria ainda seguir os seguintes

critrios: medir compostos qumicos que realmente ocorrem em potenciais aplicaes; utilizar

uma fonte de radical relevante biologicamente; ser simples; ter um mecanismo qumico

definido; instrumentao ser disponvel; adaptveis para ensaios de antioxidantes lipoflicos e

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hidroflicos e uso de diferentes fontes de radicais; adaptveis para anlises de controle de

qualidade (PRIOR; WU; SCHAICH, 2005).

A capacidade antioxidante do caf, atribuda a diferentes compostos, tem

sido avaliada por diferentes ensaios os quais incluem: FRAP (SANCHEZ-GONZLEZ;

JIMNEZ-ESCRIG; SAURA-CALIXTO, 2005), ABTS e DMPD (SANCHEZ-GONZLEZ;

JIMNEZ-ESCRIG; SAURA-CALIXTO, 2005; BORRELI et al., 2002), deoxirribose

(DAGLIA et al., 2004), DPPH (BORRELI et al.,2002) e determinao de fenlicos totais

(BORRELI et al., 2002). Mais recentemente, Bekedam et al. (2008 e) estudaram um mtodo

especfico para determinao de antioxidantes no fenlicos no caf. Esta avaliao foi

realizada com a utilizao da tcnica de espectroscopia de ressonncia de spin utilizando o

radical TEMPO (tetrametil- piperidine-1-oxil) que no seqestrado por cidos clorognicos.

O mtodo de FRAP foi inicialmente desenvolvido para medir poder redutor

no plasma, mas o ensaio tem sido adaptado e utilizado para ensaios de antioxidantes em

plantas.

A reao mede a reduo frrica de 2,4,6-tripiridil -s- triazina (TPTZ) para

um produto colorido (BENZIE, 1996). A reao detecta compostos com potencial redox <

0,7V (o potencial redox do Fe+3- TPTZ). O poder redutor mostra estar relacionado com o grau

de hidroxilao e extenso de conjugao em polifenis (PULIDO, BRAVO, SAURA-

CALIXTO, 2000). Porm, FRAP no detecta compostos que atuam bloqueando radicais pela

transferncia de H, particularmente tiol e protenas.

O ensaio de FRAP mede somente os mecanismos de transferncia de

eltrons, ento em combinao com outros mtodos pode ser til na distino de mecanismos

dominantes com diferentes antioxidantes (PRIOR; WU; SCHAICH, 2005). importante

observar que resultados de FRAP podem diferenciar-se grandemente dependendo da escala de

tempo de anlise, devido a diferentes reatividades de polifenis. Porm, em comparao com

outros ensaios, FRAP simples, rpido, barato e robusto, no requerendo equipamentos

especializados.

Os ensaios utilizando o radical ABTS entre eles o TEAC, so baseados na

habilidade dos antioxidantes em seqestrar o nion radical de longa vida ABTS+. Neste

ensaio o ABTS oxidado pelo radical peroxil ou outros oxidantes para seu radical ction,

ABTS+ , que intensamente colorido, e a capacidade antioxidante medida pela habilidade

que o composto em teste possui em decrescer a cor reagindo diretamente com o radical

ABTS+ . Por ser um mtodo operacionalmente simples, tem sido utilizado em muitos estudos

de avaliao da capacidade antioxidante. Alm disso, ABTS+ solvel tanto em solventes

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aquosos como orgnicos e no afetado pela fora inica podendo ento ser usado em muitos

meios para determinar a capacidade antioxidante de extratos lipoflicos e hidroflicos

(AWIKA et al., 2003). Pode tambm ser utilizado em uma grande faixa de pH e para o estudo

de efeitos do pH em mecanismos antioxidantes. Termodinamicamente, um composto pode

reduzir ABTS+ quando tem um potencial redox menor que o ABTS (0,68V). Muitos

compostos fenlicos tm baixos potenciais redox e podem ento reagir com ABTS+.

importante observar que o TEAC pode no ser o mesmo para reaes lentas, e pode levar um

longo tempo para atingir o ponto final. Pelo uso de um ponto final de curta durao (4 ou 6

minutos) a leitura pode ser feita antes da reao estar terminada e resultar em menores valores

de TEAC (AWIKA et al., 2003).

Outro mtodo para avaliar a atividade seqestradora de compostos

especficos ou extratos o DPPH, que est sendo utilizado pela rapidez e facilidade. A

reduo do radical estvel DPPH (2,2-difenil -1- picrilhidrazil) monitorada pela diminuio

da absorvncia deste radical a 515 nm. Este radical um dos poucos radicais nitrogenados

estveis que possui uma cor prpura intensa. comercialmente disponvel e no necessita ser

gerado antes do ensaio como o ABTS+ (BONDET et al, 1997). O mecanismo DPPH

considerado principalmente pela reao de transferncia de eltron sendo a abstrao do

tomo de hidrognio uma reao de via marginal (OU et al., 2005). Apesar de simples, sua

interpretao pode ser complicada quando os compostos em teste possuem um espectro que

sobrepe o do DPPH a 515nm, como por exemplo, os carotenides.

Testes com deoxirribose tm tambm sido utilizados para caf. Este ensaio

permite a determinao da razo constante de reaes com o radical hidroxil. um teste em

tubo, relativamente simples, no qual o radical gerado pela mistura de ascorbato, perxido de

hidrognio e Fe3+- EDTA (HALLIWELL et al., 1995). Aps aquecimento em condies

cidas, tambm ocorre a formao de MDA (malondialdedo), um produto secundrio de

peroxidao lipdica, que ento detectado pela complexao com o TBA (cido

tiobarbitrico). Porm alguns aspectos devem ser considerados: checar se a substncia no

reage com o perxido de hidrognio, se o ataque do radical substncia pode formar

compostos que reagem com o TBA, assegurar que a substncia no interfere com os produtos

de medida (HALLIWELL et al., 1995).

Outro mtodo muito utilizado para determinar capacidade antioxidantes o

Folin- Ciocalteu (F-C) ou Compostos Fenlicos Totais. Sempre h controvrsia sobre o que

est sendo detectado nos ensaios de capacidade antioxidantes: somente fenis ou fenis mais

agentes redutores e possivelmente metais quelantes. O ensaio F-C, utilizado h muitos anos

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como medida de fenlicos totais em produtos naturais, mas o mecanismo bsico uma reao

de oxidao/reduo e como tal pode ser considerado um outro mtodo de atividade

antioxidante (PRIOR; WU; SCHAICH, 2005). O mtodo simples, sensvel e preciso; porm

falta especificidade. Singleton e Rossi (1965) melhoraram o mtodo com o reagente

molybdotungstophosphoric heteropolyanion que reduz fenis mais especificamente; e o

comprimento de onda mximo para o produto 765 nm. Algumas condies foram impostas

para obter dados confiveis e previsveis: razo volume de lcali reagente de F-C; tempo e

temperatura de reao timos para o desenvolvimento da cor, monitoramento da densidade

ptica a 765 nm e uso de cido glico como padro fenlico de referncia. Estas condies

minimizariam variabilidade e eliminariam resultados irregulares. O mtodo de F-C sofre

interferncia de um nmero de substncias, particularmente, acares, aminas aromticas,

dixido de enxofre, cido ascrbico, cidos orgnicos e FeII; portanto correo de

interferentes deve ser realizada. Algumas sustncias inorgnicas podem tambm reagir com

F-C, entre elas sulfato de amnia, sulfato de ferro, hidrazina, nitrito de potssio, fosfato de

sdio dando elevada concentrao aparente de fenlicos (BOX, 1983). Entretanto, levando-se

em conta os fatores mencionados, o mtodo pode ser considerado como apropriado e uma

anlise uniformemente aceitvel de fenlicos totais pode ser estabelecida.

Um mtodo amplamente utilizado e aceito para anlise da atividade

antioxidante de alimentos tem sido o ORAC. O mtodo de ORAC mede a inibio da

oxidao induzida pelo radical peroxil, por um antioxidante. A atividade antioxidante

medida pela transferncia do tomo de H. O radical peroxil reage com um composto

fluorescente para formar um produto no fluorescente que pode ser quantificado facilmente

por fluorescncia. Entretanto, pode no ser de fcil acesso para a maioria dos laboratrios.

Marcadores fluorescentes, requerem deteco por fluormetros, que podem no ser

disponveis rotineiramente em laboratrios analticos, embora seja usado em muitos

laboratrios de culturas de clulas (PRIOR; WU; SCHAICH, 2005).

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