Aminoácidos, peptídeos e proteínas 2016.ppt
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Aminoácidos, peptídeos e proteínas
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Características químicas dos aminoácidos
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Os aminoácidos
• Os aminoácidos presentes nas proteínas são isômeros L– A biologia é canhota
• Glicina nãotem isomeriaóptica
Carbono alfa
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Grupo R apolar e alifáticos
• Aminoácidos apolares e hidrofóbicos• Ligações de Van der Waals• Ala, Val, Leu, Iso– Interações hidrofóbicas
• Gly; menor aminoácido• Met– Possui átomo de enxofre
• Pro– Iminoácido, menor flexibilidade estrutural
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Grupo R aromáticos
• Aminoácidos hidrofóbicos• Tirosina pode formar pontes de hidrogênio
com a água• Modificações pós-
traducionais– Fosforilação do OH
da tirosina• Fenilalanina– Mais apolar
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Grupos R polares, não carregados
• Solubilidade intermediária em água• Serina e treonina– Grupos hidroxil
• Asparagina e glutamina– Grupo amida
• Cisteína– Grupo sulfidril– Ligações dissulfeto
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Grupos R carregados• Aminoácidos básicos– Carga positiva– Lisina, segundo grupo amino– Arginina, grupo guanidina– Histidina, grupo aromático
imidazol
• Aminoácidos ácidos– Carga negativa– Possuem segundo grupo
ácido carboxílico
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Aminoácidos incomuns
• Modificações pós-traducionais– 4-hidroxiprolina– 5-hidroxilisina– 6-N-metil-lisina– Gama-carboxiglutamato– Fosforilação de resíduos
• Selenocisteína– Selênio ao invés de enxofre na Cys– É adicionado durante a tradução por
mecanismo específico e regulado
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pH e pKa
• Constantes de dissociação dependem do pH do meio e são diferentes para diferentes moléculas
• Ionização
• < pH; > [H]+
estado não-ionizado
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Aminoácidos são ionizáveis
• Substâncias anfóteras: possuem natureza dual
• Podem funcionar assim como ácidos ou bases– Doam ou recebem
prótons
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Titulação de um aminoácido
• Conclusão: a função das proteínas depende do pH ao qual estão submetidas
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Curvas de titulação predizem a carga elétrica dos aminoácidos
• Alguns aminoácidos podem ter átomos ionizáveis também em sua cadeia lateral
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Peptídeos e proteínas
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Ligações peptídicas e o ângulo omega
Trans: ω = 180º
• Ligações peptídicas tem geometria rígida e planar
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Ângulos torsionais, phi e psi
• Responsáveis pela curvatura na estrutura da proteína
• Entre o C-αe o N (do NH2)e o C (do COOH)
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Omega, phi e psi
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Polipeptídeo
>Insulina [Homo sapiens] MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN
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Peptídeos são ionizáveis
• Ou seja, possuem curva de titulação característica
• Funcionam em faixas de pH ótimas
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Número de resíduos por proteína
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Uso de aminoácidos
• Varia bastante entre as proteínas
• Não permite predizer com precisão o comportamento molecular da molécula
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Proteínas com outros grupos químicos
• Adicionados pós-traducionalmente
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Trabalhando com proteínas
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Proteínas podem ser separadas e purificadas
• Sabendo que a célula possui milhares de proteínas, como purificar uma única delas?– Basta selecionar por propriedade
• Tamanho, carga e propriedades de ligação
• Obter o extrato bruto– “correr” em cromatografia de coluna
• Fase estável (matriz)• Fase móvel (solução com tampão)
– Coluna maior permite maior resolução na separação
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Cromatografia por troca iônica
• Polímero carregado negativamente– Proteínas positivas ligam ao
polímero e demoram mais a ser eluídas da coluna
• Afinidade da proteína é definido também pelo pH
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Cromatografia por exclusão de tamanho
• Grânulos porosos na matriz seguram as moléculas menores
• Moléculas grandes não entram nos poros e são eluídas primeiro
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Cromatografia de afinidade• Adiciona-se à matriz da
coluna algum tipo de molécula ligante da molécula de interesse
• Molécula ligadora de ATP; adiciona-se ATP à matriz
• Elui-se com solução de ATP
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Eletroforese -- Histórico• 1952, Markham and Smith
– Ao estudarem hidrólise de RNA percebem que moléculas de diferentes estruturas têm sua mobilidade diferenciada quando aplicadas num papel e submetidas a um campo elétrico
• 1955, Smithies– Géis de amido funcionam bem para separar
proteínas do soro humano
• 1967, Loening – Géis de acrilamida com maior resolução e permitem
separar ainda moléculas grandes de DNA
• 1980, Schwartz and Cantor – Eletroforese em campo pulsado separa fragmentos
enormes• É hoje impossível imaginar um laboratório de
biomol sem eletroforese acontecendo a todo instante...
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Eletroforese• Movimento de partículas dispersas
num fluído sob influência de um campo elétrico uniforme
• DNA, carga negativa– Tem tendência a se dirigir ao polo
positivo quando sujeito a um campo elétrico
• Serve para separar moléculas por tamanho/carga elétrica – Proteína deve ser desnaturada com
detergente (SDS)
• Técnica utilizada à exaustão em trabalhos de biologia molecular
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Eletroforese, etapas
1.Preparação do gel
2.Aplicação das amostras
3.Eletroforese
4.Coloração
5. Análise dos resultados
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Preparação do gel
Horizontal X Vertical
Agarose X Poliacrilamida
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Aplicação das amostras
Definição do mapa das amostras por canaleta
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Corrida do gel• Aplicação do campo elétrico
• Fonte elétrica gera fluxo de íons através da solução tampão
• Terminais positivo e negativo
• Tempo adequado, senão o DNA sai do gel
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Coloração das moléculas
• Prata– Gel SDS-PAGE
• PoliAcrilamide Gel Electrophoresis
– Melhor resolução
• Coomassie blue, etc• Brometo de etídio– Agente intercalante do DNA
• Cancerígeno!
– Composto fluorescente à luz UV– Gel de agarose
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Eletroforese de um resultado de cromatografia
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O marcador de peso molecular• Comprado de uma empresa
– Possui proteínas de peso molecular bem conhecido
• Permite saber o peso molecular da(s) proteína(s) presente(s) numa amostra
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Geis bidimensionais
• Corre-se o gel normalmente em uma dimensão... E depois corre-se em outra dimensão
• Cada ponto representa aproximadamente uma proteína original presente na amostra– Maiores géis dão maiores
resolução
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Proteínas não separadas podem ser quantificadas
• Deve-se saber qual o substrato que a enzima usa
• Deve-se poder medir o produto da ação enzimática
• Uma unidade de enzima digere 1μmol de substrato por minuto a 25ºC
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![Page 43: Aminoácidos, peptídeos e proteínas 2016.ppt](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022061617/577c78c91a28abe05490cb94/html5/thumbnails/43.jpg)
Estrutura primária das proteínas
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Níveis estruturais das proteínas
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Estruturas secundárias• Descreve o arranjo espacial dos
átomos na cadeia principal
• Ocorre quando os ângulos diedros (phi e psi) permanecem quase iguais durante todo um segmento da proteína
• Tipos– Hélices α– Conformações β– Voltas β– Indefinida (loops, coils, turns)
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Alfa-hélices• O arranjo mais simples que as proteínas podem assumir é um
arranjo helicoidal
• Esqueleto polipeptídico fica enrolado em torno de um eixo imaginário– Cada volta contém 3,6 resíduos – Φ = -57º; ψ = -47º
• Grupos R se voltam para fora do eixo
• Em média, 25% dos aminoácidos de qualquer proteína estão em hélices α
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All-alpha proteins
![Page 48: Aminoácidos, peptídeos e proteínas 2016.ppt](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022061617/577c78c91a28abe05490cb94/html5/thumbnails/48.jpg)
Estabilidade da alfa hélice• A hélice é comum porque
nesse modelo as posições das ligações de hidrogênio estão otimizadas– Entre um H ligado ao NH2 e um
O do COOH– Cada ligação peptídica participa
de ligação de hidrogênio, conferindo estabilidade
• Para isso, todos os aminoácidos precisam ter o mesmo tipo de isomeria óptica (L ou D)
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Tendência dos Aminoácidos em formar hélices
• O grupo lateral interfere na capacidade do aminoácido em formar hélices– Volume e forma de Asp, Ser, Thr e Cys
desestabilizam se estiverem muito próximos
– Pro e Gly dificultam a formação de hélices
• Relações com o vizinho também são importantes
• Componentes amino a carbonil formam dipolo elétrico
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Restrições para a formação de hélice-α
1. Tendência do resíduo em formar hélice
2. Interações entre os grupos R espaçados 3-4 aa
3. Volumes dos grupos R adjacentes
4. Ocorrência de Pro e Gly5. Interações entre resíduos
das extremidades com o dipolo
1951
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Conformação β (beta)• Esqueleto estendido em
forma de zigue-zague
• Folhas β paralelas e anti-paralelas– Paralela: Φ = -119º; ψ = 113º– Anti-par: Φ = -139º; ψ = 135º
• Quanto as folhas são próximas, os grupos R devem ser pequenos– Teias e queratinas... Gly e Ala
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Estruturas em folhas Beta
• Beta-propeller Beta-barril
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Dicroismo circular (CD)
• Uma assimetria estrutural em uma molécula leva a diferenças de absorção de luz polarizada
• A medida dessa diferença permite-nos ter uma idéia da estrutura secundária de uma proteína.
Dicroismo circular
O CD pode ser empregado na obtenção de detalhes estruturais de diferentes tipos de compostos:▪Proteínas;▪Carboidratos;▪Ácidos nucléicos;▪Fármacos;É considerado o método de escolha para determinação rápida do conteúdo de estrutura 2ª de peptídeos e proteínas;O CD é um método altamente sensível, capaz de distinguir conformações de α-hélice, folhas-β e alças.
![Page 54: Aminoácidos, peptídeos e proteínas 2016.ppt](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022061617/577c78c91a28abe05490cb94/html5/thumbnails/54.jpg)
Estruturas terciárias e quaternárias de proteínas
![Page 55: Aminoácidos, peptídeos e proteínas 2016.ppt](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022061617/577c78c91a28abe05490cb94/html5/thumbnails/55.jpg)
Estrutura terciária (3D)• Arranjo tridimensional total de
todos os átomos de uma proteína• Alcance mais longo e dimensão
total, quando comparado com 2D• Segmentos distantes na estrutura
1D podem ser atraídos por interações fracas
• Algumas proteínas são formadas por mais de um complexo polipeptídico (quaternária)
• Proteínas fibrosas e globulares
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Proteínas fibrosas
• Queratina, colágeno, fibroína– Proteínas estruturais: força e
elasticidade
• Insolúveis em água: aa’s hidrofóbicos (Ala, Val, Leu, Ile, Met e Phe)
• Alfa queratina: cabelo, pelo, unhas, garras, penas, chifres, cascos e parte externa da pele
• Pontes dissulfeto estabilizam e dão mais resistências às cadeias
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Colágeno• Tecidos conectivos:
tendões, cartilagens– Garante resistência
• Hélice específica (phi = -51º; psi = 153º)
• Existem mais de 30 variantes do colágeno dependendo do tecido e da função
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Fibroínas de seda
• Folhas beta• Rica em Ala e Gly
– Alto empacotamento
• Ligações de H entre as cadeias B
• Não é elástica, mas é flexível
• A fibroína, produzida por aranhas e insetos, é uma proteína fibrosa constituída por cadeias β estendidas, e rica em Alanina e Glicina (estudos da sequência indicam a presença da unida de (-Gly-Ser-Gly-Ala-Gly-Ala-)n)• As folhaβ ficam sobrepostas em camadas com um empacotamento de Alaninas numa face e Glicinas na outra• A as propriedades mecânicas da seda podem ser explicadas se considerarmos a sua estrutura:pequena extensibilidade: porque a cadeia β já é uma estruturaquase totalmente estendidaflexibilidade: porque as forças entre camadas sucessivas são de natureza não-covalente (relativamente fracas)
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Proteínas globulares
• Diversidade estrutural reflete diversidade funcional– Dobramento gera estrutura compacta
• Teem partes em hélices-a e partes em folhas-B• Motivos estruturais
– Padrão identificável– Envolve elementos 2D
e conexões entre eles
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Classificação estrutural das proteínas
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Classificação estrutural das proteínas
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SCOP – Famílias de proteínas
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Estrutura quaternária
• Dímeros, homodímeros, heterodímeros
• Trímero, tetrâmero• Oligômero, multímero
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Desnaturação de proteínas
• Condições diferentes das celulares levam as proteínas à desnaturação
• Perda da estrutura leva também à perda da função
• Calor, pHs extremos, temperatura (?), solventes orgânicos, detergentes
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Renaturação de proteínas• A sequência terciária é
determinada pela sequência primária, certo?
• As proteínas desnaturadas, portanto, podem voltar aos estados nativos através de renaturação, quando o estímulo é retirado
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Enovelamento protéico
• Lento e gradual• Diminuição da entropia
até alcançar um estadoestável
• Algumas proteínas se dobramde forma assistida pelasproteínas chaperonas
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As estruturas primárias das proteínas são conhecidas
• Para todos os genomas sequenciados, conhece-se a estrutura primária de todas as proteínas para este organismo
• As pontes dissulfeto podem se formar entre diferentes cadeias protéicas– E principalmente dentro da
mesma
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Sequenciamento de peptídeos• Degradação de Edman– Marca e remove apenas o
resíduo N-terminal
• Método ineficiente, permite sequenciamento de pequenas porções das moléculas
• Sequenciamento do RNAm é muito mais simples e preciso; permite sequenciar proteínas enormes – como a titina
![Page 69: Aminoácidos, peptídeos e proteínas 2016.ppt](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022061617/577c78c91a28abe05490cb94/html5/thumbnails/69.jpg)
Produção de peptídeos
• Purificação a partir de tecidos
• Engenharia genética
• Síntese química direta
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Alinhamento de sequências• Os organismos possuem,
em grande medida, as mesmas proteínas (ortólogas)– Derivam do ancestral
comum entre os organismos
• O alinhamento permite que identifiquemos as porções mais importantes (conservadas) da proteína
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![Page 72: Aminoácidos, peptídeos e proteínas 2016.ppt](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022061617/577c78c91a28abe05490cb94/html5/thumbnails/72.jpg)
Evolução molecular
• Quanto mais similares as sequências das proteínas dos organismos, mais próximos eles são evolutivamente
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Árvore molecular da vida
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Conclusões• Diferentes características químicas das cadeias laterais dos
aminoácidos definem características de peptídeos e proteínas• Os resíduos de aminoácidos são ligados às centenas
ou milhares para formar peptídeos e proteínas• As proteínas podem ser modificadas pós-traducionalmente• As proteínas podem ser separadas por carga, tamanho e
afinidade e assim estudadas isoladamente – cromatografia e eletroforese
• As proteínas podem ser sequenciadas e sua estrutura primária (seq. de aminoácidos é conhecida)
• As sequências das proteínas são excelentes marcadores da evolução da vida na terra