หน้าปก - DLDbiotech.dld.go.th › webnew › Data › Document_Announces › Journal ›...

Journal of Biotechnology in Livestock Production

หนาปก

วารสารเทคโนโลยชวภาพการผลตปศสตว


วตถประสงค 1. สงเสรมการศกษา คนควาและวจยดานการผลต และขยายพนธสตว 2. รวบรวม เผยแพรความรดานการผลตและ ขยายพนธสตวโดยเทคโนโลยชวภาพ 3. สงเสรมความสมพนธ และความรวมมอระหวาง นกวชาการและสถาบนตางๆ

เจาของ ส านกเทคโนโลยชวภาพการผลตปศสตว

ส านกงาน ส านกเทคโนโลยชวภาพการผลตปศสตว

ถ.ตวานนท ต.บางกะด อ.เมอง จ.ปทมธาน 12000

โทร/โทรสาร 0-2501-2116

ก าหนดออก ปละ 1 ฉบบ

คณะทปรกษา นสพ. ไกรวรรณ หงสยนตรชย น.สพ. จรตม รตนเทพ

บรรณาธการบรหาร น.สพ. ณรงค เลยงเจรญ

บรรณาธการ

นสพ. สาโรช งามข า

ผชวยบรรณาธการ นางจตพร พงษเพง

กองบรรณาธการ สพญ. สายใจ ชนสข นสพ. อรณ จนทรกระจาง น.สพ. ณฐนนท ศรรตนธญญะกล น.สพ. พระพงษ ส าราญทรพย ดร. สายณห บวบาน

ดร. มาล อภเมธธ ารง นายสมศกด เปรมปรด

ผจดการวารสาร

สพ.ญ. จรรยาพร รงเรองศกด สพ.ญ. มขสดา เรองกร

สพ.ญ. วชญาณ ภมพทกษกล

น.สพ. สรวทย จนสข


ขอแนะน าส าหรบผเขยน วารสารเทคโนโลยชวภาพการผลตปศสตว เปนวารสารทางวชาการของส านกเทคโนโลย ชวภาพการผลตปศสตว กรมปศสตว ก าหนดออกปละ 1 ฉบบ คอ เดอนกรกฎาคม วารสารน าลงบทความ ผลงานคนควาวจยดานการผลตปศสตว ท งดานการพฒนาและปรบปรงพนธ การจดการอาหาร สขภาพ และระบบสบพนธ ตลอดจนการขยายพนธ และการใชเทคโนโลยชวภาพทกาวหนาในการปรบปรงและเพมประสทธภาพการผลต ปศสตวดานตางๆทกลาวมาขางตน คณะผจ ดท าวารสารเทคโนโลยชวภาพการผลตปศสตว ยนดรบเรองจากทกทานทสงมาเพอเผยแพร และเพอความสะดวกในการพจารณา ขอเสนอแนะดงน 1. เรองทจะน าลง 1.1 งานทดลอง วจย ทางวชาการ (Technical/ Research papers) หรอวทยานพนธ เปนการเสนอผลการวจยทผเขยนไดท าขนเอง 1.2 บทความ (Articles) และยอ เอกสาร (Literature reviewed) ทางวชาการ ทรวบรวมขอมล ความคดเหนและประสบการณของผเขยน 1.3 เ ร อ ง อนๆ ท คณะผ จ ดท าพ จ า รณาเหนสมควร 2. ตนฉบบ 2.1 ตนฉบบทสงมาพมพในวารสารเทคโนโลยชวภาพการผลตปศสตว ไมควรเปนเรองทเคยพมพ หรอ ก าลงอยระหวางการพจารณาเพอลงพมพวารสารอน 2.2 ตนฉบบเปนภาษาไทยหรอภาษาองกฤษพมพบนกระดาษ เอ 4 จ านวนไมเกน 12 หนา โดย

จดพมพดวย Microsoft Word for Windows หรอใชชนดและขนาดตวอกษรตามทก าหนด 2.3 ไมมการสงคนตนฉบบ 3. การล าดบเรองในตนฉบบ เพอใหขบวนการการพจารณาผลงานวชาการและการด าเนนการจดพมพวารสารเปนไปอยางเรยบรอยรวดเรว และถกตอง จงจ าเปนตองใหผเขยนผลงานวชาการปฏบตตามขอก าหนดอยางเครงครด ดงน 3.1 ใหสงตนฉบบผลงานวชาการจ านวน 1 ชด และยงไมตองสงแผนบนทกขอมล (Diskette) 3.2 ตนฉบบผลงานวชาการทสงมา ใหตรวจความถกตองของตวสะกด รปแบบการจดพมพผลงานวชาการใหถกตองตามทก าหนด 3.3 สงแผนบนทกขอมลมาให เมอผลงาน

วชาการนนไดผานการพจารณาจากคณะกรรมการ

วจยส านกเทคโนโลยชวภาพการผลตปศสตว แลว

เทานน โดยเลขาคณะกรรมการวจยฯ จะแจงกลบไป

ยงเจาของผลงานวชาการพรอมสงตนฉบบเพอให

แกไขตามทคณะกรรมการวจยส านกเทคโนโลย

ชวภาพการผลตปศสตวใหขอเสนอแนะ

บนทกผลงานวชาการทแกไข ถกตองแลวตามขอแนะน าของคณะกรรมการวจยส านกเทคโนโลยชวภาพการผลตปศสตว ลงใน Diskette ขนาด 3.5 น ว ห รอ CD-ROM ใ ช โป รแกรม Microsoft Word for Windows โดยมรายละเอยดบนสตกเกอรตดหนา Diskette หรอ CD-ROM ดงน


ชอผลงานวชาการ............................................ ชอเจาของผลงาน............................................. ชอไฟล............................................................. ทอย เบอรโทรศพท/E-Mail................................. หรอสงทาง Internet มายง [email protected]

3.4 ตนฉบบผลงานวชาการทสงใหคณะ กรรมการวจย สทป. พจารณา จะเปนบทความทจดรปแบบไดถกตองตามทก าหนดเทาน น หากผลงานวชาการทสงมาใหไมถกตองตามขอก าหนด จะจดสงคนใหเจาของผลงานวชาการกลบไปแกไขใหถกตอง 3.5 ตนฉบบทจดสงมาตองชดเจน ทงเนอหาและรปภาพประกอบผลงานวชาการ โดยสงมาท 3.6 หรอตดตอสอบถามไดท นางจตพร พงษเพง ส านกเทคโนโลยชวภาพการผลตปศสตว ถ.ตวานนท ต.บางกะด อ.เมอง จ. ปทมธาน 12000 โทรศพท 02-967-9791 หรอ 02-967-9792 โทรสาร. 02-5011386 ดขอมลรายละเอยดเกยวกบขอแนะน าส าหรบผเขยนผลงานทได http://www.dld.go.th/biotech 4. การล าดบเรอง 4.1 ชอเรอง (Title) ควรตองชอใหสนและสอความหมายใหด และพมพโดยใชขนาดตวอกษร 18 และตวหนา 4.2 ชอผเขยนและผรวมงาน (Author and co- workers) เขยนชอนามสกลเตมท งภาษาไทยและภาษาองกฤษ วางกงกลางใตชอเรอง พรอมทงสถานทท างานทตดตอไดสะดวกพมพไวใตชอคณะผวจย โดยใชขนาดตวอกษร 16 และตวปกต

4.3 บทค ด ย อ (Abstract) เ ข ยนส น ๆ ไ ดเนอความคลมวตถประสงค วธการ และผลการทดลอง ความยาวไมควรเกน 3% ของตว เ รอง บทคดยอตองมทงภาษาไทยและภาษาองกฤษ แยกหนา ตางหากจากกนสง บรรณาธการวารสารเทคโนโลย ช วภ าพการผ ลตป ศส ตว ส านกเทคโนโลยชวภาพการผลตปศสตว ถ.ตวานนท ต.บางกะด อ.เมอง จ.ปทมธาน 12000 4.4 ค า ส า ค ญ (Key words) เ ป นค าห ร อ

ขอความสนๆ ทมความหมายแสดงถงความเปนไป

ของการทดลองนนๆ รวมกนแลวไมเกน 5 ค า หาก

ไมสามารถแปลเปนภาษาไทยไดใหใชภาษาองกฤษ

แทน โดยการพมพอยใตบทคดยอ (ขนบรรทดใหม)

4.5 เนอหา (Text) ส าหรบงานวจยประกอบดวย 4.5.1 บทน า (Introduction) อ ธบ า ย ถ งปญหาและวตถประสงคและควรมการตรวจเอกสาร (literature review) 4.5.2 อปกรณและวธการ (Materials and Methods) อธบายเครองมอ อปกรณทใชในการทดลอง วธการทใช ถาคดคนขนควรอธบายอยางละเอยด แตถาเปนททราบกนโดยทวไปใหเขยนในลกษณะอางองถง ถาเปนเครองหมายตราหรอชอการคา ควรท าเปน foot note ไวทดานลางของหนานน 4.5.3 ผล (Results) รายงานผลการทดลองเปนค าบรรยาย ใหละเอยดและเขาใจงาย โดยแบงเปนหลายๆ ยอหนา และจดขอความทมเนอหาเดยวกนไวดวยกน หากเปนไปไดควรเสนอในรปของตารางหรอรปภาพ หรอกราฟพรอมทงบรรยายประกอบ ทงนตาราง รป หรอกราฟ ไมควรแสดงผลทเหมอนกน


- ตาราง (Tables) ควรพมพใหชดเจนเหมาะกบหนา ตองมความหมายในตวเอง และมค าอธบายตารางอยเหนอตารางนนๆ - รปภาพ (Figures) ควรเปนภาพขาว – ด า ภาพสหากจ าเปนผเขยนตองเสยคาใชจายเองอธบายรายละเอยดไวใตรปนนๆ 4.5.4 ว จ า ร ณ (Discussion) เ ป น ก า รวจารณผลการทดลอง โดยมจดมงหมาย เพอใหผอนเหนคลอยถงหลกการทแสดงออกมาจากผลการทดลอง หรอเพอสนบสนน หรอคดคานทฤษฏทมผ เสนอมากอน หรอเพอเปรยบเทยบกบผลการทดลองและการตความหมายของผอน ผเขยนควรพยายามเนนถงปญหาหรอขอโตแยงในสาระส าคญของเรองทก าลงกลาวถง ตลอดจนขอเสนอแนะเพอการวจยในอนาคตและลทางทจะน าผลไปใชเปนประโยชน 4.5.5 สรป (Conclusion) เขยนใจความทส าคญและคณคาของงานเพอใหผอานเขาใจงายขน 4.5.6 กตตกรรมประกาศ (Acknowledgement) ควรมในกรณทไดรบความชวยเหลอ หรอความรวมมอทสนบสนนงานคนควาวจยนนๆ 4.5.7 เอกสารอางอง (References) ก. กรณทอางองในเนอเรอง ควรอางองดงนคอ 1. กรณทอางจากการตรวจเอกสาร โดยผอนๆ ใหใชค าวาอางถงโดย (cited by) 2. กรณผรายงานเอกสารเปนคนไทย เมอเปนประธานของประโยค ใช “วบรณ และ จรรตน (2549), เลศชย และคณะ(2549) กลาววา.......” หรอเมอรายงานอยกลาง หรอทายประโยค ใช (วบรณ, 2549) หรอมเอกสารอางองในเรองเดยวกนมากกวา

1 ฉบบ ใหใช (ถาวรและคณะ, 2547; นรศ และสนสมทร, 2543 .....) 3. กร ณผ ร า ย ง าน เ อกส า ร เ ป นช า วตางประ เทศ เ ม อ เ ปนประธานของประโยค ใ ช “Rudbeck and Dissing (1998), Kashi et al. (1990) กลาววา......... “ หรอเมอผรายงานอยระหวางกลางหรอทายประโยค ใช (Rudbeck and Dissing, 1998; Kashi et al.,1990 .............) 4. กรณอางถงบคคลหรอเรองทไมเคยลง

พมพมากอน (personal communication) ใหอาง

เฉพาะในเนอเรองเทานน ไมตองน าไปลงในรายชอ

เอกสารอางอง เชน ....similar results (Walker,J.M.,

unpublished data), .......for other protocols

(Walker,J.M., personal communication)

ข. การเขยนเอกสารอางองทายเรอง ควรขนตนเอกสารอางองภาษาไทยกอน เขยนเรยงตามล าดบพยญชนะของผเขยน ถาเปนภาษาองกฤษใชชอสกลตามดวยชอยอของผแตง แลวตามดวยป ชอเรองชอหนงสอ หรอชอยอวารสาร ปท ฉบบท และหนาทอางอง ดงตวอยาง วบรณ ตลารกษา และ จรรตน แสนโภชน. 2549.

การสกด ดเอนเอ เซลลรากขนในโคนมไทยโฮลสไตน. การประชมวชาการสตวศาสตร ครงท 2 “กาวทนสมยกบปศสตวไทย” วนท 24 มกราคม 2549. โรงแรมโซฟเทล ขอนแกน. หนา 452-463.

เลศชย จนตพทกษสกล รพพรรณ เออเวชนชกล และกลยา เกงวกยกรรม. 2549. การประเมนวธสกดแยกดเอนเอจากเลอด น าเชอ และเซลลรากขนของพอพนธโค. สตวแพทยสาร. 56 (3) :68-79. Jason, R. H. and Callings, D.F. 1971.


Transplacental infection of piglets with a porcine parvovirus. Res. Vet. Sci. 12: 570-572.

กรณอางองจากต ารา ใหระบชอผเขยน ปทตพมพ ชอเรอง ชอต ารา (พมพครงทเทาใดและบรรณาธการหากม) ส านกพมพ เมองทพมพ หนาแรกและหนาสดทายทอางถง ดงตวอยาง Allison, P.D.2005. Survival analysis using SAS: A

practical guide 8 th edition. SAS institute Inc.,Cary, NC, USA. 292 pp.

Van Oirschot, J. T. 1986. Hog Cholera. In : Disease of Swine, 6 th ed. Leman, A. D. ed. Lowa state university Press. lowa. p. 293-297.

กรณอางองจากเวบไซด (Online references) ดงตวอยาง Weeden, N.F. 1993. Comparison of DNA

extraction protocols. [Online] http://home.twony.rr.com/protocol.htm Access 29/10/2005.

จนทรา แปนตม จฑาพร ศรวพฒน วรวทย แสงสงแกว และ พ งพศ ดลยพชร. 2541. อาหารจากขาวโพด .คมอการสงเสรมการเกษตรท 43. แหลงทมา:

http://www.ku.ac.th/agri/cornn/corn.htm. 27 มนาคม 2541. 5. การพมพผลงานทางวชาการ ตวพมพ ใหพมพดด หรอใชเครองพมพ (Printer) หมกพมพตองเปนสด า คมชด สะดวกแกการอานและใชตวพมพแบบเดยวกนทงฉบบ กรณใชเครองคอมพวเตอรพมพเนอความใหใชตวอกษร

Angsana UPC 16 ตวปกต เทานน ยกเวนหวขอใหญ เชน ชอเรอง บทคดยอ บทน า อปกรณและวธการ ผล ว จ า ร ณ ส รป ก ต ตก รรมประก าศ และเอกสารอางอง พมพโดยใชตวอกษรแบบหนา (Bold) ขนาด 18 สวนหวขอยอย เชน ชอผวจยและคณะ ค าส าคญ ตาราง รปภาพ เปนตน พมพโดยใชตวอกษรแบบหนา (Bold) ขนาด 16กระดาษทใชพมพ ให ใชกระดาษขาวไม มบรรทด ขนาดมาตรฐาน A4 (210 X297 มม.) ใชเพยงหนาเดยว การเวนทวางขอบกระดาษ - ตงกนหนาบนและซายไวท 2.5 เซนตเมตร - ดานขวาและดานลางไวท 2.0 เซนตเมตร

การเวนระยะในการพมพ

- การเวนระยะระหวางบรรทดและการยอ

หนา ควรจดตามความสวยงาม

- กรณค าสดทายไมจบบรรทดนนๆ ใหยกค านนทงค าไปพมพในบรรทดตอไป ไมควรตดสวยทายของ ค าไปพมพในบรรทดใหม เชน กระบอปลก ไมใหแยกเปน กระบอ-ปลก เปนตน จลชพ เชน Escherichia coli หรอพมพตวเอน Escherichia coli - หลงเครองหมาย . และ , หรอ; เคาะ 1 เคาะ พช เชน Oryza sativa หรอพมพตวเอน Oryza sativa - ระหวางค าสดทาย กบเครองหมาย . และ , ไมเวนชองวาง สตว เชน Bos taurus หรอ พมพดวยตวเอน Bos taurus - ไมตองเวนชองวาง ระหวางวงเลบ และค าขางในวงเลบ เชน (รพพรรณ และคณะ)

http://www.ku.ac.th/agri/cornn/corn.htm


การล าดบหนา - ล าดบหนาโดยใชหมาย เลข 1,2,3......ทกงกลางหนากระดาษ ตาราง รปภาพ แผนภม กราฟ - ตารางประกอบดวย เลขทของตาราง (table number) ชอของตาราง (table title) หวตาราง (table heading) และทมาของตาราง (ถาม) โดยใหท าเปนภาษาองกฤษหรอภาษาไทยทงตาราง พมพอยในหนาเดยวกนทงหมด

- กรณตารางมความยาวมาก ไมสามารถสนสดในหนาเดยวได ใหพมพสวนทเหลอในหนาถดไปโดยพมพเลขทตารางและตามดวยค าวา (ตอ) - กรณรปภาพ แผนท แผนภม กราฟ ควรเปนภาพขาวด า และใชแนวทางขางตน การพมพชอวทยาศาสตรของสงมชวต ใหใช

ตามประมวลนามศาสตรสากล (International code

of nomenclature) คอ ขดเสนใต หรอ พมพดวยตว

เอน ชอวทยาศาสตรเปนไปตามการตงชอ


หนา

การศกษาความสมพนธของรปแบบยน Butyrophilin และ DGAT1 ทมผลตอองคประกอบ

และปรมาณน านมในโคพนธทรอปคอลโฮลสไตนดวยวธ Real-time PCR (สาโรช งามข า สายใจ ชนสข)

1

การศกษาความสมพนธของรปแบบยน Inhibin ทมผลตออตราการตกไขในโคลกผสมแองกส ดวยวธ Real-Time PCR (สายใจ ชนสข วษณ ไพศาลรงพนา อนนท เทองสนเทยะ)

14

ผลของ GnRH ตออตราการผสมตดในแพะเน อลกผสมทเหนยวนาการเปนสดดวย CIDR-G®

(ชาญยทธ กาพล จตศกด เมองเขยว อบลรตน วชยดษฐ ณฐพร จยจลเจม)

29

ประสทธภาพของฮอรโมนเอฟเอสเอชและพเอมเอสจ เมอใชรวมกบ CIDR-G® ตอการแสดง

การเปนสดและอตราการผสมตดในแพะ (สาโรช งามข า พระพงษ ส าราญทรพย)

40

ระยะเวลาผสมเทยมหลงเหนยวน าการเปนสดตออตราการผสมตดในแพะเนอลกผสม

(กตตศกด แสงสกล สนชย วโรจนวฒกล)

49

ความสมพนธระหวางโปรตน PDC-109 ใน seminal plasma ของพอพนธโคนมทรอปคอล โฮลสไตน ตอความสามารถในการแชแขงน าเชอ (จรรยาพร รงเรองศกด วรพงษ พงษศร)

58

ผลของวธการปนแยก seminal plasma ดวยสารละลายเพอรคอลตอคณภาพน าเชอแชแขงสกรภายหลงการละลาย (วรพงษ พงษศร จรรยาพร รงเรองศกด )

75


1

การศกษาความสมพนธของรปแบบยน Butyrophilin และ DGAT1 ทมผลตอองคประกอบและ

ปรมาณน านมในโคพนธทรอปคอลโฮลสไตนดวยวธ Real-time PCR

สาโรช งามข า สายใจ ชนสข

บทคดยอ

การศกษานมวตถประสงคเพอศกษารปแบบความถของยน Butyrophillin (BTN) และ Acyl-CoA: diacylglycerol acyltransferase1 (DGAT1) โดยใชเทคนค Real-Time PCR และความสมพนธรปแบบของยนทมผลตอปรมาณน านมท 305 วน เปอรเซนตไขมนและเปอรเซนตโปรตนของโคนมทรอปคอลโฮลสไตนเพศเมยในเขตพนทจงหวดราชบรและสระบร จ านวน 170 ตว ระหวางเดอนมนาคม 2558 ถงกนยายน 2560 โดยเกบตวอยางเลอดโคตวละ 6 ซซ ในหลอดเกบเลอดทมสารกนเลอดแขง (EDTA) น ามาสกดดเอนเอ เพอศกษารปแบบและความถของยน BTN และ DGAT1 ดวยวธ Real-time PCR ระบ genotype ของยน allele และเกบตวอยางน านมเพอวเคราะห เปอรเซนตไขมนและเปอรเซนตโปรตนเดอนละ 1 ครงตดตอกน 10 เดอน ผลการศกษาพบวารปแบบของยน BTN ไมมความสมพนธกบลกษณะทางพนธกรรมของทกลกษณะทศกษา ในขณะทรปแบบของยน DGAT1 มความสมพนธกบลกษณะทางพนธกรรมของเปอรเซนตโปรตนอยางมนยส าคญทางสถต (p<0.05) และอทธพลรวมกนระหวางรปแบบของยน BTN และ DGAT1ไมมผลตอลกษณะทางพนธกรรมของทกลกษณะทศกษา อยางไรกตามรปแบบของยน BTN และ DGAT1 สามารถตรวจสอบไดโดยวธ Real-time PCR ซงใหผลทแมนย าและรวดเรว

ค าส าคญ: โคทรอปคอลโฮลสไตน ปรมาณน านม วธ Real-time PCR ยนButyrophilinยนDGATองคประกอบน านม

เลขทะเบยนวจย: 57(1)-0208-013 ส านกเทคโนโลยชวภาพการผลตปศสตว อ. เมอง จ. ปทมธาน


2

Genotypic Study of Butyrophilin and DGAT1 Gene Related toMilk Composition

and Yield in Tropical Holsteins Using Real-Time PCR

Saroch Ngamkhum Saijai Cheunsuk

Abstract

The objective of this study was to analyze association between Butyrophillin gene (BTN), Acyl-CoA:diacylglycerolacyltransferase1 gene (DGAT1) by Real-Time PCR technic and 305-day milk yield, milk composition (%Fat and %Protein) from Dairy Farm in Saraburi and Ratchaburi province. One hundred and seventy crossbred Holstein primiparous cows were used and their blood samples were taken for the study during March 2016 to September 2017. Real-time PCR was used to identify the allele and genotype of genes. A general linear model and t-test significant differences were used to compare the mean of each trait between genotypes. The results found indicated that DGAT1 to associate with %FAT (p=0.03). Simultaneously, the association between genotype patterns of two genes on estimated breeding value shown that DGAT was associated with %Protein EBV (p=0.01) whereas another combined gene were not associated with estimated breeding value. Key word: Tropical Holstein cow, milk yield, Real-time PCR, Butyrophilin gene, DGAT1 gene,

milk composition

Registered No.: 57(1)-0208-013 Bureau of biotechnology in livestock production


3

ค าน า อตสาหกรรมโคนมและผลตภณฑนมในประเทศไทยมการรบซอน านมตามคณภาพน านม ดงนนการทแม

โคนมสามารถผลตน านมทมคณภาพและปรมาณทสง จะท าใหเกษตรกรผเลยงโคนมมรายไดสงตามมาดวย การปรบปรงพนธโคนมถอวาเปนเครองมอในการพฒนาพนธโคนมในประเทศ ส านกเทคโนโลยชวภาพการผลตปศสตว กรมปศสตว มหนาทและความรบผดชอบในการใชเทคโนโลยชวภาพเพอปรบปรงพนธโคนมของเกษตรกรผเลยงโคนม เพอใหบรรลถงเปาหมายของการเลยงโคนมของเกษตรกรใหมรายไดด ดงนน โปรแกรมการปรบปรงพนธโคนมจะมงเนนใหความส าคญการปรบปรงพนธกรรมดานผลผลตและองคประกอบน านมเปนหลก (Rychtarova et al., 2014) การทสามารถระบยนทเปนตวบงชทางพนธกรรม (genetic marker) ของลกษณะทส าคญทางเศรษฐกจไดแกปรมาณและองคประกอบน านมแลวน ามาคดเลอกโคนมเพอใชในการปรบปรงพนธเปนวธหนงทไดรบความนยมและมประสทธภาพมากในปจจบน (Zhu and Zhao, 2007)

Butyrophilin (BTN) เปน acidic glycoprotein ชนดหนงซงพบไดในปรมาณมากกวา 40% ของ total milk fat globule membrane protein ในโค (Mather et al., 1980) และมสวนส าคญในการชวยขบหลงไขมนในน านมของเตานมระหวางชวงการใหนม (Jack and Mather, 1990) การแสดงออกของยน BTN จะพบจ าเพาะในเตานมและเฉพาะในชวงการใหน านมเทานน (Franke et al, 1981) มการศกษาโดย Bhattacharya et al. (2006) พบวาลกษณะทแตกตางกนภายในยน BTN (genotypic difference) ทงสน 3 แบบ (AA, AB, และ BB) มผลตอการสรางไขมนในน านมโคสายพนธผสมระหวาง Holstein Friesian และ Hariana ซงสอดคลองกบการรายงานผลการทดสอบความสมพนธของยนนกบการสรางไขมนในน านมโคสายพนธ Jersey โดย Komisarek et al. ( 2006) ทงนการทดสอบของทง 2 คณะใชเทคนค PCR-RFLP ในการตรวจสอบ เชนเดยวกบ ยน Acyl - CoA: diacylglycerolacyltransferase1 (DGAT1) ทจดอยในกลมยนทควบคมขบวนการสรางไตรกลเซอไรนซงเปนแหลงเกบพลงงานทส าคญของรางกายและสามารถพบไดในปรมาณสงถง 95% ในไขมนนม ( Jensen, 2002; Farese et al., 2000) การศกษายนนโดยวธ PCR-RFLP ในโคหลายสายพนพบวาโคพนธเจอรซ (Komisarek et al., 2004) พนธ Holstein-Friesian (Winter et al., 2002; Pareek et al., 2005) พนธ Brazilian (Lacorte et al., 2006) พบวายน BTN มความสมพนธในการควบคมลกษณะองคประกอบโปรตนนมและไขมนนมในโคนมลกผสมไทยโฮลสไตน (Saijai et al., 2553) และมสวนส าคญในการชวยขบหลงไขมนในน านมของเตานมระหวางชวงการใหนม (Jack and Mather, 1990)

ในขณะทยน DGAT1 พบวาเปนยนหลกยนหนงทมบทบาทส าคญในการพฒนาเตานมของสตวเลยงลกดวยนมเพศเมยขณะก าลงเจรญเตบโต (Smith et al., 2000) และ ยงมบทบาทส าคญในการสรางเอนไซม Acyl-CoA diacylglycerol acyltransferase ซงมความส าคญในขบวนการเมตาบอรซมของ triglyceride ในรางกาย เชน การดดซม troiglycerideในล าไส การสราง adipose tissue และการสรางน านมเมอสตวคลอดลก (Cases et al., 1998; Smith et al., 2000) พบวาหนเพศเมยทถกสกดกนการแสดงออกของยน DGAT1 ไมสามารถหลงน านมไดเมอคลอดลก ในโคนมยน DGAT1 มต าแหนงอยทสวนปลาย (3 cM) ของโครโมโซมคท 14 (Farnir et al., 2002) ซงตอมาพบวาบน exon xiii ของ DGAT gene มการเปลยนแปลงของล าดบเบสทท าใหการถอดรหสอะมโนแอซด เปลยนจาก Lysine เปน Alanine ( Spelman et al., 2002; Thaller et al., 2003; Weller et al., 2003) การเปลยนแปลงนมผลตอลกษณะการใหน านมในโคนมทพบไดในพนธโฮลสไตนฟรเชยนทงสายพนธ เยอรมน โปแลนด นวซแลนด อสราเอล และในโคบราซล (Thaller et al., 2003; Spelman et al., 2002; Lacorte et al., 2006; Szyda and Komisarek, 2007) ทงนผลของการเปลยนแปลงล าดบเบสตอปรมาณน านม ไขมน โปรตน และเปอรเซนต ไขมน โปรตน แตกตางกนไปในแตละประชากร


4

ปจจบนใชเทคนค PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism) เปนวธเพอตรวจหาลกษณะทแตกตางในระดบเบสของสายดเอนเอของยน แตการตรวจดวยวธนจะใชเวลานาน 2-3 วนและมหลายขนตอนในการตรวจไมเหมาะสมในการปฏบตงาน เพราะอาจเกดการปนเปอนของตวอยางและความผดพลาดระหวางขนตอนไดมาก เทคนค Real-time PCR ซงไดถกพฒนาขนเปนวธเพอลดปญหาดงกลาว โดยอาศยหลกการใช probe ตดสารเรองแสง ทไดรบการออกแบบจ าเพาะเพอคนหาการเปลยนล าดบเบสทตองการตรวจ ท าใหการตรวจใหผลแมนย าและรวดเรว ลดขนตอนการปฏบตงาน

การศกษาครงนมวตถประสงคเพอศกษารปแบบและความถของยน BTN และ DGAT1 ในโคนมทรอปคอลโฮลสไตนเพศเมย โดยใชเทคนค Real-Time PCR และความสมพนธของแตละรปแบบของยนทมตอปรมาณเปอรเซนตไขมนและเปอรเซนตโปรตนของน านม ซงจะท าใหทราบรปแบบของยนทมผลตอการผลตน านมทงปรมาณและคณภาพในโคนมสวนใหญของประเทศทกรมปศสตวใหบรการ แนะน าและสงเสรมการเลยงโคเกษตรกรใหสามารถผลตน านมไดมประสทธภาพทงปรมาณและคณภาพเพราะการปรงปรงพนธทกรมปศสตวจะพฒนาขนโดยล าดบ

อปกรณและวธการ สตวทดลอง

โคนมเพศเมยทมการใหผลผลตครงแรก มอายเฉลยในชวง 2-3 ป จากฟารมเกษตรกรทเขารวมโครงการผลตพอโคนมทรอปคอลโฮลสไตนในเขตจงหวดราชบรและสระบร จ านวน 170 ตว ทมขอมลการเกบตวอยางน านมตลอดระยะการใหนมไดรบการถายพยาธ ฉดวคซนตามโปรแกรม และไดรบอาหาร แรธาตตามสภาพการเลยงในแตละฟารม เกบตวอยางเลอดเพอศกษารปแบบและความถของยน BTN และ DGAT1จากเสนเลอดด าทบรเวณโคนหางจ านวน 6 ซซ ในหลอดเกบเลอดทมสารกนเลอดแขง (EDTA) เพอน ามาสกดดเอนเอ และเกบตวอยางน านมเพอวเคราะหคณภาพน านมเดอนละ 1 ครงตดตอกน 10 เดอน ซงด าเนนการตงแตเดอนมนาคม 2558 ถงเดอนกนยายน 2560 การสกดดเอนเอ

ตวอยางเลอดทงหมดถกเกบรกษาทอณหภม 4 °C กอนน ามาสกด genomic DNA ดวยชดสกด DNA ส าเรจรป (QIAGEN Genomics DNA Extraction Kit, QIAGEN. USA) ตวอยางทงหมดถกเกบไวในสารละลาย TE buffer และท าการวดปรมาณและความบรสทธของ DNA ใหมคา OD ท 260/280 ระหวาง 1.6-1.8 ดวย Microvolume Spectrophotometer (Nanodrop, DeNovix.USA) การทดสอบรปแบบยน BTN และ DGAT1ดวยปฏกรยา PCR-RFLP

น าดเอนเอทสกดไดจากตวอยางเลอดของโคมาเพมขยายชนสวน DNA (PCR) ตามวธของ Saijai et al., 2553 และ Jureeratn et al., 2553 ดงน

การวเคราะหยน BTN ใชปรมาณดเอนเอ 5 μl (20 ng), 10xPCR buffer 2 μl, Forward primer:btnF(TGGAGCTCTATGGAAATGGG)และ Reverseprimer:btnR(TACCCAACAGGAAGAAACAG) อยางละ 2 μl(0.2 µM) Platinum Taq DNA polymerase 0.5 μl(1 unit)dNTPs 5 μl(0.2 mM) MgCl2 1.5 μl (1.5 mM) distilled water 7μl ปรมาตรรวม 20 μlและ PCR condition คอ pre-denaturation 95°C นาน 5 นาท denaturation 95°C นาน 30 วนาท annealing 65°C นาน 60 วนาทและ extension 72°C นาน 60 วนาท จ านวน 35 รอบ ตามดวย 72°C นาน 5 นาท จากนนน าผลผลต PCR (PCR product)ทไดจากขนตอนการเพมชนสวนดเอนเอมาท า purification โดยใช NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up (Macherey-Nagel. Germany) จากนนน ามาตดโดยใชเอนไซมตดจ าเพาะ Hae III โดยมปรมาณดเอนเอ 20 μl (10ng/μl), reaction buffer 2.5 μl, enzyme 2 μl, distilled water 0.5 μlปรมาตรสดทาย25 μlหลงจากนน incubate


5

ทอณหภม 37°C นาน 30 ชวโมงแลวน ามายอมสดวย GelRed Loading Buffer (Biotium, USA) ท าอเลคโตรโฟรซสใน 2% (w/v) agarose gel ท 100 V นาน 30 นาท ตรวจขนาดชนสวนดเอนเอดวยเครอง Gel-Doc system (Alpha image 3400, USA)

การวเคราะหยน DGAT1 ใชปรมาณดเอนเอ 5 μl(20 ng), 10xPCR buffer 2μl, Forward primer: DGAT1-F(GCACCATCCTCTTCCTCAAG) และ Reverseprimer: DGAT1-R (GGAAGCGCTTTCGGATG) อยางละ 2 μl(0.5 µM) Platinum Taq DNA polymerase 0.5 μl(0.8 unit)dNTPs 5 μl(0.2 mM) MgCl2 1.5 μl(1.5 mM) distilled water 7 μl ปรมาตรรวม 20 μlและPCR condition คอ pre-denaturation 94°C นาน 4 นาท, denaturation 94°C นาน 60 วนาท, annealing 66°C นาน 60 วนาท (ลดอณหภมลงรอบละ 1°C) และ extension 72°C นาน 60 วนาท ตามดวย pre-denaturation 94°C นาน 4 นาท, denaturation 94°C นาน 60 วนาท, annealing 60°C นาน 60วนาท และ extension 72°C นาน 60 วนาท จ านวน 25 รอบ และ 72°C นาน 10 นาท น าผลตภณฑทไดจากขนตอนการเพมชนสวนดเอนเอมาท า purification เชนเดยวกบยนBTN จากนนน ามาตดโดยใชเอนไซมตดจ าเพาะCfrI โดยมปรมาณดเอนเอ 20 μl (10ng/μl), reaction buffer 2.5 μl, enzyme 2 μl, distilled water 0.5 μlปรมาตรสดทาย 25 μl หลงจากนน incubate ทอณหภม 37°C นาน 30 ชวโมงแลวน ามายอมสดวย GelRed Loading Buffer (Biotium, USA) ท าอเลคโตรโฟรซสใน 5% (w/v) denaturing polyacrylamide gel ตรวจขนาดชนสวนดเอนเอดวย silver straining K232A การตรวจสอบล าดบเบสของยน BTN และ DGAT1 เพอออกแบบไพรเมอรและโพรบ (primers and probes) ส าหรบปฏกรยา Real-timePCR

น าตวอยางดเอนเอโคทไดทดสอบ genotype จากปฏกรยา PCR-RFLP มาท าการหาล าดบเบสดวยวธ automated dye-terminator cycle sequencing method with AmpliTaq DNA polymerase โดยใชเครอง ABI 3130 DNA Analysis Sequencer (ABI, USA) และวเคราะหต าแหนง SNP ดวยโปรแกรมthe BLAST Sequence Analysis program (National Center for Biotechnology Information, NCBI. USA) เ พ อ ใ ชออกแบบ TaqMan MGB-probes (minor groove binding probes) fluorescence real- time PCR ด วย Primer 5 software โดยใชสฟลออเรสเซนตชนด VIC และ FAM (GENEPLUS, USA) (Table 1) Table 1 Real time PCR-Probes for BTN and DGAT1 gene underline/italic letter represented SNP

polymorphisms Gene Primers Sequence (5’ 3’) BTN F-Rt CGGCCCTTCTTCTGCTTGT

R-Rt CATCAGTGACTGGGCAGATAGT Report-1 (VIC) - CTGTGGTAAAAAGCCCCT

Report-2 (FAM) – TGTGGTAAAAGGCCCCT DGAT1 F-Rt CGCTTGCTCGTAGCTTTGG

R-Rt CGCGGTAGGTCAGGTTGTC Report-1 (VIC) - CGTTGGCCTTCTTACC Report-2 (FAM) – TTGGCCGCCTTACC

การทดสอบรปแบบยน BTN และDGAT1ดวยปฏกรยา Real-time PCR น าตวอยางดเอนเอทสกดจากเลอดโคนมพนธทรอปคอลโฮลสไตนทงหมด 170 ตวอยาง มาทดสอบ genotype ของทง 2 ยน ดวยวธ Real-time PCR โดยใชชดตรวจ CustomTaqMan SNP Genotyping Assay


6

(GENEPLUS, USA.) และเครอง Step One Plus Real-time PCRSystem (GENEPLUS, USA.) ดงนปรมาณดเอนเอ 20 ng2X TaqMan Genotyping MasterMix5 μl, 40X Assay Mix cDNA0.25 μlปรมาตรสดทาย 10 μlและ PCR condition คอ pre-denaturation 95°C นาน 10 นาท , denaturation 95°C นาน 15 วนาท , annealing และ extension 60°C นาน 60 วนาท จ านวน 50 รอบ การตรวจวเคราะหคณภาพน านม การเกบตวอยางน านมส าหรบการตรวจวเคราะหหาเปอรเซนตไขมน และเปอรเซนตโปรตนเดอนละครงตงแตหลงคลอดจนถงแหงนม และตรวจวเคราะหเปอรเซนตไขมน และเปอรเซนตโปรตนของน านมดวยเครอง combifossft+ (Foss, Denmark) การวเคราะหทางสถต:

การวเคราะหขอมลพนธกรรมของลกษณะทศกษาประเมนคาทางพนธกรรม (Breeding value, BV )และคา Yield deviation (YD) ของลกษณะปรมาณน านม เปอรเซนตไขมน และเปอรเซนตโปรตน ดวยโปรแกรม BLUPF90 and AIREMLF90 programs โดยใช BLUPF90-DairyPAK3.0 (Misztal et al., 2002). ดวยโมเดลวเคราะหหา Heterozygozityของ allele frequency โดยใชหลก Hardy-Weinberg Law

n

ili

pHWH1

2

1)(

การวเคราะหความสมพนธศกษาอทธพลของ Allele substitution ของยนส BTN และ DGAT1 ตอ

ปรมาณน านม เปอรเซนตไขมนและเปอรเซนตโปรตน โดยวธ Generalized Linear Model (Henderson, 1984) ทระดบนยส าคญ p<0.05

ผลการทดลองและวจารณ จากการศกษารปแบบยน BTN ใชวธ Real-time PCR ตรวจการเพมขนของ PCR product โดยการ

ออกแบบ Probe และ Primer ทมความจ าเพาะตอ SNPs ของยนและการวดปรมาณส fluorescence 2 ชนด ไดแก allele A ดวย VIC-fluorescence dye (กราฟสเขยว) และ allele B ดวย FAM-fluorescence dye (กราฟสน าเงน) (Figure 1) เชนเดยวกบยน DGAT1 ปฏกรยา Real-time PCR สามารถตรวจ SNP ของยน (Figure 2)

Genotype ของยนBTNในประชากรโคทรอปคอลโฮลสไตนในการทดลองนสามารถแบงไดเปน 2 กลมคอ AA และ AG โดยมจ านวน 136 และ 34 ตว คดเปนความถ 0.80 และ 0.20 ตามล าดบ โดยมความถของ allele A และ G คอ 0.90 และ 0.3 ซงไมพบลกษณะ Genotype แบบ GG เลย (Table 2) ในขณะท genotype ของยน DGAT1 สามารถพบได 3 กลม คอ AA AG และ GG ซงมจ านวน 1888 และ 64 ตามล าดบ คดเปนความถ 0.110.51 และ 0.38 ตามล าดบ โดยมความถของ allele A และ G คอ 0.36 และ 0.64 (Table 3) เมอพจารณาสภาพความสมดลของยน (Equilibrium of genes) พบวาการกระจายตวของทงยนBTN และ DGAT1ไมมความสมดลตามหลกสมการ Hardy-Weinberg ซงอาจเปนผลมาจากการปรบปรงพนธโดยโคเหลานเปนโคทเกดจากการผสมเทยมดวยน าเชอของพอพนธโคจากโครงการผลตพอพนธโคนมทรอปคอลโฮลสไตนของกรมปศสตว ท าใหการผสมพนธไมเปนไปอยางสม (non-random mating) นอกจากนการคดเลอก (selection) ตามลกษณะปรากฎของตวสตว (phenotype) ทตองการเพอน ามาเปนพอแมพนธทจะใชสรางพนธตอไป เชนลกษณะการใหน านม ปรมาณน านม เปนตน สงผลใหเกดการการเปลยนแปลงความถของยนหรอเกดการสญหายของยน (สรนทร, 2552)


7

Figure 1 Real-time PCR genotyping for BTNgene of Tropical Holstein cows.VIC-fluorescence dye (green) and FAM-fluorescence dye (blue) indicated allele A and G, respectively. Graph presented 2 genotypes as AA and AG.

Figure 2 Real- time PCR genotyping for DGAT1gene of Tropical Holstein cows.VIC- fluorescence dye ( green) and FAM- fluorescence dye ( blue) indicated allele AA and GC, respectively. Graph presented 3 genotypes as AA, AGand GG.

Table 2 Genotype and gene frequencies of the BTN gene in 170Tropical Holsteincows.

Genotypes n genotypic frequency

AA 136 0.80

AG 34 0.20

GG 0 0.0

Allele allele frequency

A 0.90

G 0.10


8

Table 3 Genotype and gene frequencies of the DGAT1 gene in 170Tropical Holsteincows.

Genotypes n genotypic frequency

AA 18 0.11

AG 88 0.51

GG 64 0.38

Allele allele frequency

A 0.36

G 0.64

Table 4 Descriptive statistics of the dataof 170 dairy cows. Traits Mean SD Min Max

Milk 305 day (kg) 4,384.12 1,423.05 1,460.94 8,526.70

Fat (%) 3.56 1.12 1.11 6.65

Protein (%) 3.04 0.20 2.45 3.62

คาเฉลยของปรมาณน านมท 305 วนเปอรเซนตไขมนและเปอรเซนตโปรตนมคาเทากบ 4,384.12 กก.

3.56% และ 3.04% ตามล าดบ (Table 4) ซงมคาใกลเคยงกบการศกษาของวนทนาและคณะ (2558) และส านกเทคโนโลยชวภาพการผลตปศสตว (2560)

Table 5 Effect of genotype gene markers on 305-day Milk yield,Fatand Protein (Least square means ± Standard error)

Gene Genotype Milk yield Fat(%) Protein(%)

DGAT AA 4,711.23±390.56 3.89±0.33a 3.05±0.06

AG 4,265.24±232.32 3.68±0.20a 3.08±0.03

GG 4,085.40±272.55 3.24±0.23b 3.04±0.04

P-value 0.23 0.03 0.44

BTN AA 4,239.44±231.96 3.54±0.20 3.05±0.03

AG 4,468.48±313.50 3.67±0.27 3.06±0.05


9

P-value 0.39 0.57 0.90

a,bwithin a column in each gene with no common superscript are significant difference (P<0.05)

ผลการศกษาในครงนไมพบความสมพนธระหวางรปแบบของยน BTN กบคาปรมาณน านมท 305 วน เปอรเซนตไขมน และเปอรเซนตโปรตน ดงแสดงใน Table 5 ซงสอดคลองกบรายงานของ Saijai et al. (2553) วนทนาและคณะ (2558) และ Rychtarova et al. (2014) ทไมพบความสมพนธเชนกนแสดงวารปแบบของยน BTN ไมสามารถใชเปนตวบงบอกความสามารถในการใหผลผลตน านมและองคประกอบน านมได ในขณะทรปแบบของยน DGAT1 พบวามความสมพนธกบเปอรเซนตไขมน โดยลกษณะ genotype GC/GC มเปอรเซนตไขมนต าสด แตไมพบความสมพนธกบปรมาณน านมท 305 วน และเปอรเซนตโปรตน อยางไรกตามจากการศกษาของ Molee et al. (2012) พบวารปแบบของ GC/GC มผลตอลกษณะขององคประกอบของนมทงหมดอยางมนยส าคญทางสถต ซงเปนประชากรแมโคนมลกผสมโฮลสไตนเชนกนซงแตกตางจากศกษาครงนเพราะประชากรโคนมเปนของเกษตรกรทมการจดการทแตกตางกนในแตละฟารมผลการศกษาความสมพนธรปแบบยน BTN และ DGAT1 กบคาการผสมพนธ พบวาไมมความสมพนธระหวางรปแบบของยน BTN กบคาการผสมพนธลกษณะปรมาณน านมท 305 วน เปอรเซนตไขมน และเปอรเซนตโปรตน แตรปแบบของยน DGAT1 มความสมพนธกบคาการผสมพนธลกษณะเปอรเซนตโปรตนอยางมนยส าคญทางสถต (p<0.05)

ความสมพนธของรปแบบgenotpeโดยการรวมยนเครองหมายเขาดวยกน (combined genes) กบคาการผสมพนธในลกษณะทศกษาตางๆ (Table 6) พบวาไมมความสมพนธกน ดงนนอทธพลของรปแบบยน DGAT1 ในการศกษาครงนไมสงจนสามารถใชในการคดเลอกเพอเพมองคประกอบทส าคญในน านมได เนองจากลกษณะการใหผลผลตและคาองคประกอบน านมมยนทควบคมลกษณะการแสดงออกหลายยน และภายใตการเลยงการจดการของฟารมทศกษาครงนอาจจะท าใหการแสดงออกของยนทงคไมสงผลตอความแปรปรวนขององคประกอบและปรมาณน านม (สมศกดและเรงวฒ, 2561) อยางไรกตามอทธพลของรปแบบ GC/GC ในโคนมลกผสมโฮลสไตนอาจไมสงจนสามารถใชในการคดเลอกเพอเพมองคประกอบทส าคญในน านมได ซงอาจมสาเหตจากอทธพลระหวางยนทอยตางต าแหนงกนมผลขมการแสดงออกของยน ทงนอาจเน องจากโครงสรางพนธกรรมของโคลกผสมโฮลสไตนสวนหนงประกอบดวยสายเลอดโคพนเมอง อาจมพนธกรรมทเกยวของกบองคประกอบน านมต า และพนธกรรมดงกลาวอาจมผลตอการแสดงออกของยนน (ณฐญา, 2555; Lillehammer et al., 2009) ยงพบผลกระทบทส าคญของปฏสมพนธระหวางสภาพแวดลอมและการแสดงออกของยน ดงนนกอนท genotype GC/GC จะสามารถน ามาใชในโปรแกรมปรบปรงพนธไดควรศกษาผลกระทบนอกจากนการแสดงออกของยนนขนกบการจดการอาหารสตวและสภาพแวดลอมอน ๆ (Hayes et al., 2003; Lillehammer et al., 2009; Hammami et al., 2009)

Table 6 Effect of genotype gene markers on estimated breeding value 305-day Milk yield,

%Fatand%Protein (Least square means ± Standard error) Gene Genotype Milk yield %Fat %Protein

DGAT AA 62.57±164.60 -0.04±0.05 0.00±0.02ab

AG 90.38±57.32 -0.02±0.02 0.01±0.01a


10

GG 77.55±75.69 -0.06±0.03 -0.03±0.01b

P-value 0.98 0.46 0.01

BTN AA 145.33±47.91 -0.01±0.02 -0.02±0.01

AG 8.33±117.27 -0.07±0.04 0.00±0.02

P-value 0.28 0.15 0.25

Combine AA/AA 232.59±116.39 0.02±0.04 -0.01±0.02

DGAT- BTN AA/AG -107.46±307.93 -0.09±0.10 0.01±0.04

GC/AA 101.03±56.22 0.00±0.02 -0.02±0.01

GC/AG 79.72±99.91 -0.05±0.03 0.03±0.01

GC/AG 102.38±62.86 -0.05±0.02 -0.03±0.01

GC/AG 52.71±137.71 -0.07±0.05 -0.04±0.02

P-value 0.66 0.76 0.12

a,b/within a column in each gene with no common superscript are significant difference (P<0.05) สรปผลการทดลอง

ผลการศกษาพบวารปแบบของยน BTN ไมมความสมพนธกบคาการผสมพนธกบทกลกษณะทศกษา ในขณะทรปแบบของยน DGAT1 มความสมพนธกบคาการผสมพนธของลกษณะเปอรเซนตโปรตนอยางมนยส าคญทางสถต (p<0.05) และอทธพลรวมระหวางรปแบบของยน DGAT1 และ BTN ไมมผลตอคาการผสมพนธของปรมาณน านม เปอรเซนตไขมนและเปอรเซนตโปรตน อยางไรกตามรปแบบของยนBTN และ DGAT1สามารถตรวจสอบไดโดยวธ Real-time PCR ซงใหผลทแมนย าและรวดเรว

เอกสารอางอง ส านกเทคโนโลยชวภาพการผลตปศสตว กรมปศสตว. 2560 สมดพอพนธโคนม 2560 ISSN : 974-682-193-8 ณฐญา, ดวงหะคลง . 2555. อทธพลของยน Acyl-CoA : diacylglycerol acyl transferase1 (DGAT1) ตอ

ลกษณะผลผลตน านมและยน Gonadotropin releasing hormone receptor (GnRHR) ตอลกษณะความสมบรณพนธ ในประชากรโคนมลกผสมโฮลสไตนฟรเชยน. วทยานพนธ . มหาวทยาลยเทคโนโลยสรนาร.นครราชสมา. 83 หนา

วนทนา เจรญโอสถ กองเกยรต ศรสวรรณ มนตชย ดวงจนดา ทองสา บวสข ศรนวล คณานตย และ วฒไกร บญคม. 2558. การศกษาความสมพนธของยนเครองหมายตอการใหผลผลตน านมองคประกอบน านม และสมดลพลงงานในโคนมลกผสมไทยโฮลสไตน. ว. แกนเกษตร. 43: 245-254.


11

สมศกด เปรมปรด และเรงวฒ วรวฒ. 2561. ผลกระทบของอทธพลรวมระหวางพนธกรรมกบสงแวดลอมตอการใหผลผลตน านมของโคนมลกผสมโฮลสไตนฟรเชยนในพนทภาคตะวนตกของประเทศไทย. วารสารเทคโนโลยชวภาพการผลตปศสตว ปท 9 ฉบบพเศษ พ.ศ. 2557-2561

สรนทร ปยะโชคณากล. 2552. เครองหมายดเอนเอ: จากพนฐานสการประยกต. ส านกพมพมหาวทยาลยเกษตรศาสตร กรงเทพฯ.

Bhattacharya, T.K., S.S. Misra, Sheikh, D. Feroz, S. Sukla, P. Kumar, and A Sharma. 2006. Effect of Butyrophilin Gene Polymorphism on Milk Quality Traits in Crossbred Cattle.Asian-Aust. J. Anim. Sci. Vol.19, No.7: 922-926.

Cases, S., S.J. Smith, Y. Zheng, H.M. Myers, S.R. Lear, and E. Snnde. 1998. Identification of a gene encoding an acyl CoA: diacylglycerolacyltransferase, a key enzyme in triglycerol synthesis. ProcNatlAcadSci USA: 95: 13018-13023.

Franke, W.W., H.W. Heid, C. Grand, S. Winter, C. Freudenstein, E. Schmid, E.D. Jarasch, and K.W. Keenan. 1981. Antibodies to the major insoluble milk fat globule membranes-associated protein: specific location in apical regions of lactating epithelial cells. J.Cell Biol. 89: 485-494.

Farese JR, RV., Cases, and S.J Smith. 2000. Triglyceride synthesis: insights from the cloning of diaglycerolacyltransferase. Current Opinion in Lipidology.11: 229-234.

Farnir, F., B. Grisart, W. Coppieters, J. Riquet, P. Berzi, N. Cambisano, L. Karim, M. Mni, P. Simon, D. Waggenaar, J. Vikki, and M. George. 2002. Simultaneous mining of linkage and LD to fine map QTL in outbred half-sib pedigrees: Revisiting the location of a QTL with major effect on milk production on bovine .Genetics.161: 275-287.

Hayes, B. J., Carrick, M., Bowman, P., Godd ard, M.E., 2003. Genotype×environment interaction for milk production of daughters of Australian dairy sires from test-day records. J. Dairy Sci., 86, 3736–3744.

Hammami, H., B. Rekik, C. Bastin, H. Soyeurt, J. Bormann, J. Stoll, N. Gengler, 2009.Environmental sensitivity for milk yield in Luxembourg and Tunisian Holsteins by herd management level. Journal Dairy Science, 92, 4604–4612.

Henderson, C. R. 1984. Applications of linear models in animal breeding.University of Guelph, Ontario, Canada

Jack, L. J.W. and I.H. Mather. 1990. Cloning and analysis of cDNA encoding bovine butyrophilin, an apical glycoproteins expressed in mammary tissue and secreted in association with the milk- fat globule membrane during lactation. J. Bio. Chem. 265: 14481-14486.

Jensen, R.G. 2002. The composition of bovine milk lipids: January 1995 to December 2000. J. of Dairy Science.85: 295-350.

Jureeratn, S., B. Sayan, and T. Kanokporn. 2553. Effect of DGAT1 Major Gene on Milk Production and Quality Traits in Thai- Holstein Dairy Crossbred. วารสารเทคโนโลยชวภาพการผลตปศสตว ปท 5 ฉบบท 1 มถนายน 2553 หนา 9-20.


12

Komisarek, J., K. Waskowicz, A. Michalak, and Z. Dorynek. 2004. Effects of DGAT1 variants on milk production traits in Jersey cattle.Ani.Sci.Paper and Report.Vol. 22 (3): 307-313.

Komisarek, J., K. Waskowicz, and Z. Dorynek. 2006. Analysis of the relationship between twosingle nucleotide polymorphisms of the butyrophilin(BTN1A1) gene and milk production traits in Jersey cattle.Ann. Anim. Sci., Vol. 6, No.1:45-52.

Lacorte, G.A., M.A. Machado, M.L. Martinez, A.L. Campos, R.P. Maciel, R.S. Verneque, R.L. Teodoro, M.G.C.D. Peixoto, M.R.S. Carlvaho, and C.G. Fonseca. 2006. DGAT1 K232A polymorphism in Brazillian cattle breeds. Genetics and Molecular Research.Online.http://www.funpecrp.com.br[ access date: 24/7/2007].

Lillehammer, M., B.J. Hayes, T. H. E. Meuwissen, and M. E. Goddard. 2009. Gene by environment interactions for production traits in Australian dairy cattle Journal Dairy Science, 92,4008–4017.

Mather, I.H., C.B. Tamplin, and M.G. Irving. 1980. Separation of the proteins of bovine milk-fat globule membrane by electrofocusing with retention of enzymatic and immunological activity.Eur. J. Biochem. 110: 327-336.

Misztal I., S. Tsuruta, T. Strabel, B. Auvray, T. Druet, and D. Lee. 2002. BLUPF90 and related programs (BGF90), in Proceedings of the 7th World Congress on Genetics Applied to Livestock Production, Communication Montpellier: 28–27.

Molee A., N. Duanghaklang, and P. Na-Lampang. 2012. Effects of Acyl-CoA: diacylglycerol acyl transferase 1 (DGAT1) gene on milk production traits in crossbred Holstein dairy cattle. Tropical Animal Health and Production 44: 751-755.

Pareek, C.S., U. Czarnik, T. Zabolewicz, R.S. Pareek, and Walawski. 2005. DGAT1 K232A Quantitative Trait Nucleotide Polymorphism in Polish Black-and-White Cattle. J. Appl. Genet. Vol. 46 (1): 85-87.

Rychtarova J., Z. Sztankoova, J. Kyselova, V. Zink, M. Stipkova, M. Vacek, and L. Stolc. 2014. Effect of DGAT1, BTN1A1, OLR1 and STAT1 genes on milk production and reproduction traits in the Czech Fleckvieh breed. Czech J. Anim. Sci. 59: 45-53.

Saijai C., S. Nachai, and K. Kalaya. 2553. Genotypic Effect of Butyrophilin Gene on Milk Fat in Thai-Holstein Dairy Cow. วารสารเทคโนโลยชวภาพการผลตปศสตว ปท 5 ฉบบท 1 มถนายน 2553 หนา 21- 32.

Smith, S. J., S. Cases, D.R. Jensen, H. C. Chen, E. Sande, B. Tow, D.A. Sanan, J. Raber, R.H. Eckel, and R.V. Jr. Farese. 2000. Obesity resistance and multiple mechanisms of triglyceride synthesis in mice lacking DGAT.Nat. Genet. 25 :87-90.

Spelman, R.J., C.A. Ford, P. McElhinney, G.C. George, and R.G. Snell. 2002. Characterization of the DGAT1 gene in the New Zealand dairy population.J. Dairy Sci. 85: 3514-3517.

Szyda, J. and J. Komisarek. 2007. Statistical modeling of candidate gene effects on milk production traits in dairy cattle. J. Dairy Sci. 90: 2971-2979.

http://www.funpecrp.com.br/


13

Thaller, G., W. Kramer, A. Winter, B. Kaupe, G. Erhardt, and R. Fries. 2003. Effects of DGAT1 variants on milk production traits in German cattle breeds.J. Anim. Sci. 81: 1911-1918.

Winter, A., W. Kramer, F. Werner, S. Kollers, S. Kata, G. Durstewitz, J. Buitkamp, J. Womack, G. Thaller, and R. Fries. 2002. Association of a lysine-232/alanine polymorphism in bovine gene encoding acyl-Co A: diaglycerolacyltransferase(DGAT1) with variation at a quantitative trait locus for milk fat content. Proc.Of the Nat. Acad.Of Science of the USA.99: 9300-9305.

Weller , J.I., M. Golik, E. Seroussi, E. Ezra, and M. Ron. 2003. Population –wide analysis of a QTL affecting milk-fat production in the Israel Holstein population. J. Dairy Sci. 86:2219-2227.

Zhu, M., and S. Zhao. 2007. Candidate gene identification approach: progress and challenges. Int. J. Biol. Sci. 3: 420-427.


14

การศกษาความสมพนธของรปแบบยน Inhibin ทมผลตออตราการตกไข

ในโคลกผสมแองกสดวยวธ Real-Time PCR

สายใจ ชนสข1/ วษณ ไพศาลรงพนา2/ อนนท เทองสนเทยะ3/

บทคดยอ

การศกษาในคร งน มจดประสงค เ พอ พฒนาวธว เคราะหรปแบบของ exon 1 ของยน Inhibin (INHAgene)ในโคลกผสมแองกสจ านวน 200 ตวโดยใชเทคนค Real-Time PCR และหาความสมพนธของแตละรปแบบของยนInhibinตออตราการตกไขทเกดจากการเหนยวน าการตกไขหลายใบ (superovulation) ในโคลกผสมแองกสเพศเมยจ านวน 38 ตวผลการทดลองพบวาเมอท าการตรวจ exon 1 ของยนInhibinดวยวธReal-Time PCR โดยการออกแบบฟลออเรสเซนตโพรบใหจ าเพาะตอสนปทต าแหนง A192Gสามารถแบงลกษณะทแตกตางกนของอลลล 2 ลกษณะคอ อลลลแบบ A และแบบ G ท าใหเกดลกษณะทางพนธกรรม 3 แบบไดแก AA AGและ GG โดยมความถอลลล A และ G คอ0.65 และ 0.35 และความถของลกษณะทางพนธกรรมแบบ AA AGและ GG คอ 0.36 0.59และ 0.05 ตามล าดบ ลกษณะทแตกตางกนนพบวามผลตอจ านวนไขและตวออนทไดจากการท า superovulation โดยโคทมรปแบบของexon 1 ของยนInhibinชนด GG จะใหปรมาณตวออนทงหมดและตวออนทยายฝากไดสงกวาชนดรปแบบ AG และ AA อยางมนยส าคญทางสถตในทง 3 ครงของการทดลอง แตไมพบความแตกตางของจ านวนไขทไมถกผสมและจ านวนตวออนตายหรอเสอมสภาพ สรปวาวธ Real-time PCR สามารถใชตรวจสอบรปแบบจโนไทปทแตกตางกนของexon 1 ของยนInhibin และรปแบบทแตกตางของยนนมความสมพนธกบอตราการตกไขจากกระบวนการ superovulationในโคลกผสมแองกส

ค าส าคญ: การตกไขหลายใบโคลกผสมแองกส วธ Real-time PCR ยนInhibin

เลขทะเบยนวจย: 59(1)-0208-006 1/ส านกเทคโนโลยชวภาพการผลตปศสตวกรมปศสตว อ าเภอเมอง จงหวดปทมธาน ประเทศไทย 2/ศนยฝกอบรมและถายทอดเทคโนโลยชวภาพการปศสตว อ าเภอทาหลวง จงหวดลพบรประเทศไทย


15

3/ศนยวจยเทคโนโลยชวภาพการยายฝากตวออนและเซลลสบพนธสตว อ าเภอปากชอง จงหวดนครราชสมา ประเทศไทย

Genotypic Study of InhibinGeneRelated to Ovulation Rate

in Cross-bred Angus Cattle Using Real-Time PCR

Saijai Cheunsuk1/Witsanu Paisalrungphana2/Anone Thuangsanthia3/

Abstract

The aims of this study was to develop a molecular method, Real-time PCR, to identify the genotypes of the exon 1of Inhibingene(INHA) in 200 Cross-bred Angus Cattleas well as the association between the superovulation performance among gene polymorphisms in 38 genotyping cows. The study showed that, by using the fluorescence probe specific to the SNP A192G, the exon 1ofInhibingene was contained with 2 alleles, A and G allele with allelic frequencies of 0.65 and 0.35 respectively and divided into 3 genotypes as AA, AG and GG with genotypic frequencies of 0.36, 0.59, and 0.05, respectively. Moreover, the genotypes had significant effects on the oocytes and embryos under the superovulation procedure. The results showed that the cows with GG genotype resulted in significant different higher increasing in the total number of embryo and the number of transferable embryothan AG and AA genotype in all 3 experiments. However, among 3 genotypes, there was no significant different in the number of unfertilized ova and the number of degenerate embryo in all 3 experiments. These results indicated that Real-time PCR method could be used to identify the polymorphisms of Inhibingeneand these polymorphisms had correlation to the ovulation rate in superovulation practice.

Keywords: Superovulation, Cross-bred Angus cattle, Real-time PCR, Inhibin gene

Registered No.: 59(1)-0208-006 1/Bureau of Biotechnology in Livestock Production. Department of Livestock Development, Amphoe Mueng, Pathumthani. Thailand 2/Livestock Biotechnology Training and Transfer Center. Amphoe Tha Luang, Lopburi Province. Thailand


16

3/Embryo Transfer Technology and Animal Germplasm Research Center. Amphoe Pakchong, Nakhon Ratchasima. Thailand

ค าน า

การท าใหสตวเพศเมยเกดการตกไขจ านวนมาก (Superovulation) เพอใชในการยายฝากตวออน(Multiple ovulation and embryo transfer, MOET)มจดมงหมายใหไดจ านวนตวออนจ านวนมากทสามารถใชในกระบวนการยายฝากตวออน เพมโอกาสเกดลกโคทมลกษณะพนธกรรมทถายทอดจากพอแมทดเยยมไดคราวละหลายๆตว ลดโอกาสการน าโรคเขาสฟารมและเพมความแมนย าในการคดเลอกสตว (Armstrong, 1993)ทงยงสามารถจดเกบรกษาในสภาพแชแขงเพอน าไปใชภายหลงดงนนกระบวนการSuperovulationจงเปนเทคนคทส าคญมากในขนตอนการยายฝากตวออนโดยเฉพาะอยางยงในการเลยงโค เนองจากเปนสตวทมลกคราวละตวเดยวและใชเวลาในการตงทองนาน แตปญหาทส าคญอยางหนงทพบคอการตอบสนองของรงไขตอการกระตนจากฮอรโมนทเกยวของซงจะแตกตางกนในแตละตวสตว (Mapletoft and Hasler, 2005) แมวาจะไดมการพยายามปรบปรงสภาพแวดลอมและการเลยงด หรอการใชฮอรโมนชนดตางๆเขาชวยแตกไมท าใหเกดการตอบสนองเทาทควร(Thatcher et al.,2001;Malhiet al., 2008)สงผลตอประสทธภาพและผลประโยชนทไดรบ

Follicle-Stimulating Hormone (FSH) เปนฮอรโมนทหลงจากตอมใตสมอง(pituitary gland) สามารถพบในกระแสเลอดของรอบการเปนสด (estrous cycle) (Kaneko, 1995) และหลงคลอด (postpartum period) (Sunderland, 1994) หรอในโคทม Follicular cysts (Hamiltonet al., 1995; Todorokiet al., 2001) มหนาทหลกในการควบคมและกระตนการเจรญของไขในรงไขการยบยงการท างานของ FSH จะท าใหไขไมเจรญเตบโตสงผลใหไมมการตกไขในปจจบนมกนยมใช FSH เปนตวหลกในการเหนยวน าซงอาจจะใหผลแตกตางกนในดานการตอบสนองของสตวแตละตว (Hasler, 2003) ท งนขนกบขนาดและระยะเวลาท ใช (Pictonet al., 1990;McNeillyet al., 1991) Takedomi et al. (2005) รายงานวาการหล ง FSH จาก pituitary glandถกควบคมโดยการท างานรวมกนของฮอรโมน 2 ชนด คอ Inhibin และ Estradiol ส าหรบฮอรโมน Inhibin เปนฮอรโมนทถกควบคมการสรางโดยยน Inhibin โดยพบการสรางและขบออกมาสกระแสเลอดจากอณฑะและรงไขซงม 2 ชนดคอ Inhibin A (INHA)และ Inhibin B (INHB) โดยทง 2 ชนดท าหนาทในการกดการหลงของ FSH จาก pituitary cell แตไมมผลตอการสราง LHในเซลลเพาะเลยง (Robertson et al., 1985; Lu et al., 2009) ดงนนปรมาณของฮอรโมนinhibin ในกระแสเลอดนาจะมผลตอการท างานของ FSH หรอปรมาณของฟอลลเคล (Sasakiet al., 2006)

การศกษาโครงสรางของยน Inhibin ในสวนทสรางฮอรโมนINHAในคน พบวามการกลายพนธในต าแหนง A257T จะท าใหเกดภาวะ premature ovarian failure (POF) ซงเปนลกษณะทรงไขหยดท างานกอนวยอนควร (Woad et al., 2009) เปนตน ส าหรบการศกษาในสตวนนHua (2007) พบวาต าแหนง G284A ของยน Inhibin ในสวนทสรางฮอรโมน INHAในแพะทมความแตกตางของรปแบบสนป (Single Nucleotide Polymorphism, SNP) จะมผลตอจ านวนลกตอครอกโดยลกษณะ G ใหลกตอครอกมากกวาลกษณะ Aนอกจากนมการศกษาความส าคญของ Inhibin gene ในโคโดยเคยมการฉด anti-αsubunit inhibinของยน Inhibin ในสวนทสรางฮอรโมน INHAพบวาสามารถเพมการหลง FSH จากตอมใตสมองท าใหมระดบ FSH ในกระแสเลอดเพมขน (Ishigameet al., 2004) และอตราการตกไขรวมถงจ านวนตวออนทสามารถยายฝากไดมปรมาณเพมขน (Takedomiet al., 2005; Mei et al., 2009) แสดงใหเหนถงความส าคญของยน Inhibin ในสวนทสรางฮอรโมน INHAทมผลตอการท า superovulation นอกจากนTanget al. (2011)ใชวธการตรวจแบบ PCR-RFLP เพอหาลกษณะการกลายพนธใน exon I ของยน Inhibin ในสวนทสรางฮอรโมน INHAในโคสายพนธ Chinese Holsteinซงสามารถแบงเปน 3 จโนไทป ไดแก AA AGและ GG พบวาแตละจโนไทปมความสมพนธกบการตอบสนองตอ


17

การเหนยวน าใหเกดการตกไขแตกตางกนแมวาYang et al. (2014) ศกษาลกษณะของ β-A subunit Inhibin geneในโคสายพนธ Chinese Holstein โดยใชวธเดยวกน พบวาทต าแหนง 7639 ของยน Inhibin มการเปลยนล าดบเบสจาก Cเปน T ซงสามารถแยกเปน 3 จโนไทป (CT, TT, CC) เชนกน แตไมมความแตกตางของการตอบสนองตอการท า superovulation ในแตละจโนไทปในทง 2 รายงานแสดงใหเหนวธ PCR-RFLP สามารถใชในการตรวจหา SNP ของยนนไดแมในต าแหนงทแตกตางกน อยางไรกตามวธการตรวจแบบ PCR-RFLP เปนวธทมขนตอนในการตรวจยงยากหลายขนตอน ใชเวลานานทงยงตองเลอกเอนไซมตดเฉพาะทสามารถแยกความแตกตางของต าแหนงของ SNP ไดซงเปนขอจ ากดของวธน

วตถประสงคของการศกษาครงนเพอพฒนาวธวเคราะหรปแบบจโนไทปของ exon 1 ของยน Inhibin ในสวนทสรางฮอรโมน INHAในโคลกผสมแองกสโดยใชเทคนคReal-Time PCRแทนการใชวธเดมคอ วธ PCR-RFLP และความสมพนธของแตละรปแบบจโนไทปของยน Inhibin ในสวนทสรางฮอรโมน INHAทมตออตราการตกไขทเกดจากการเหนยวน าดวยฮอรโมนในโคลกผสมแองกสเพศเมย

อปกรณและวธการทดลอง

สตวทดลองและการเกบตวอยาง โคลกผสมแองกสเพศเมยอาย 3-5 ปทเคยมลกอยางนอย 1 ตวจ านวน 200 ตว เลยงทศนยฝกอบรมและ

ถายทอดเทคโนโลยชวภาพการปศสตว อ าเภอทาหลวง จงหวดลพบร ไดรบการถายพยาธ ฉดวคซนตามโปรแกรม และไดรบอาหาร แรธาตตามขอก าหนดของศนยฯท าการเกบตวอยางเลอดโคจาก jugular veinจ านวนตวละ6 ซซในหลอดเกบเลอดทมสารกนเลอดแขงชนด EDTAน ามาสกดดเอนเอเพอศกษารปแบบและความถจโนไทปของexon 1 ของยน Inhibin ในสวนทสรางฮอรโมน INHAจากนนจดการสมตวอยางโคแบบไมเฉพาะเจาะจงตามกลมจโนไทปดงน AA AG และ GG จ านวนจโนไทปละ 15 ตวส าหรบท าการทดลองตามขนตอนsuperovulationการผสมเทยมและการเกบตวออน โดยแตละตวจะท าการเกบตวอยาง 3 ครง หางกนครงละ 3 เดอน เพอศกษาความสมพนธของแตละรปแบบจโนไทปของยน Inhibinทมผลตออตราการตกไขทเกดจากการเหนยวน าดวยฮอรโมน

การสกดดเอนเอ ตวอยางเลอดทงหมดถกเกบรกษาทอณหภม 4 องศาเซลเซยสกอนน ามาสกด genomic DNA ดวยชด

สกดDNAส าเรจรป (QIAGEN Genomics DNA Extraction Kit, QIAGEN. USA)ท าการวดปรมาณและความบรสทธ ของDNA ใหมค า OD ท 260/280 ระหวาง 1 .6-1 .8ดวยMicrovolume Spectrophotometer (Nanodrop, DeNovix. USA)ตวอยางทงหมดถกเกบไวในสารละลาย TE buffer ทอณหภม -20°C จนกวาจะท าการทดสอบ

การออกแบบไพรเมอรส าหรบปฏกรยา PCR-RFLPและเอนไซมตดเฉพาะ การออกแบบไพรเมอรจ าเพาะตอ bovine Inhibin gene ทมชนสวนของ SNP-A192G (GenBank

number: rs41257116) (Tang et al., 2011) ใชโปรแกรมPrimer 3 plus (Untergasser and Nijveen, 2007) (Table 1) และ โปรแกรม NEBcutter V2.0 (New England BioLabs, USA) ใชหาต าแหนงตดจ าเพาะและท านายขนาดของนวคลโอไทดของเอนไซมตดจ าเพาะ


18

การทดสอบรปแบบ INHA geneดวยปฏกรยา PCR-RFLP น าดเอนเอทสกดไดจากตวอยางเลอดของโคลกผสมแองกส ปรมาณตวอยางละ 5μl (20 ng/μl) มาเพม

ขยายชนสวน DNA (PCR) ดงน10xPCR buffer 5μl primer InhFและ InhR (Forward และ Reverse primers) (Table 1 ) อย า ง ล ะ 2μl (0 . 2 µ M)Platinum Taq DNA polymerase 0.5μl (1 unit) dNTPs 5μl (0.2 mM)MgCl2 1.5 μl (1.5 mM) distilled water 29μlปร ม าต ร ร วม50μlแล ะ PCR condition ค อ pre-denaturation 95°C นาน 2นาท denaturation 95°C นาน45 วนาท annealing 62°Cนาน 45 วนาทและ extension 72°Cนาน 45 วนาทจ านวน 40รอบ ตามดวย 72°C นาน10นาท น าผลผลตจากปฏกรยา PCR (PCR product) มาคดแยกชนสวนดเอนเอทตองการดวยวธpurification โดยใช NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up (Macherey-Nagel. Germany) และน ามาตดโดยใชเอนไซมตดจ าเพาะ MspIโดยมปรมาณดเอนเอ20 μl(10ng/ μl) reaction buffer 2.5μlMspI restriction enzyme2μldistilled water 0.5μl ปร ม าต รสดทาย 25μlบมทอณหภม 37°Cนาน 30ชวโมงจากนนยอมสดวย GelRed Loading Buffer (Biotium, USA)แยกขนาดชนสวนดเอนเอใน 5% (w/v) Nusieve agarose gel electrophoresisท 100 V นาน 1.5 ชวโมงตรวจขนาดชนสวนดเอนเอดวยเครอง Gel-Doc system (Alpha image 3400, USA)

การตรวจสอบล าดบเบสของ INHAgene เพอออกแบบ primers และ probes ส าหรบปฏกรยา Real-timePCR ตวอยางดเอนเอททราบจโนไทป (AA, AG, GG) จากปฏกรยา PCR-RFLP มาวเคราะหล าดบเบสดวยวธ automated dye-terminator cycle sequencing method with Ampli Taq DNA polymerase โ ด ย ใ ชเครอง ABI 3130 DNA Analysis Sequencer (ABI, USA) และต าแหนงจดตดเฉพาะของเอนไซมตดจ าเพาะ MspIด ว ย โ ป รแกรม the BLAST Sequence Analysis program (National Center for Biotechnology Information, NCBI. USA) และโปรแกรม NEBcutter V2.0 ส าหรบการตรวจสอบรปแบบของสนปทต าแหนง A192G ของ INHA gene ในปฏกรยา Real-time PCR ใช TaqMan MGB-probes (minor groove binding probes) fluorescence real-time PCRทไดรบการออกแบบprimers และ probesดวยโปรแกรม Primer 3 Plusซงจะใชทดสอบ A และ G alleles ในเวลาเดยวกน (Table1)

Table 1. PCR-RFLP Primers and Real-time PCR Primers and Probes with the expecting amplicon sizes, underline and italic letter in Real-time PCR reactions represented SNP polymorphisms

Reactions Primers Sequence (5’ 3’) amplicon sizes PCR-RFLP Inh-F1 GCCCTGTTTCTGGATGCC 249 bp

Inh-R1 ATTCAACCCAACCTGCCTA Real-time PCR F-Rt AAGGTGGAGATCCTGGAGTCA 161 bp

R-Rt GCCCCTGCGCATGAAG Report-1 (VIC)-CTGCACCGAAGGCA


19

การทดสอบรปแบบ INHAgeneดวยปฏกรยา Real-time PCR

ตวอยางดเอนเอจากเลอดโคทง 200 ตวอยางทไดท าการทดสอบจโนไทปดวยวธ PCR-RFLP แลวน ามาทดสอบจโนไทปอกครงดวยวธReal-time PCRโดยใชชดตรวจCustomTaqMan SNP Genotyping Assay (GENEPLUS, USA.) ซงใชสฟลออเรสเซนตชนด VIC และ FAM (GENEPLUS, USA) ดวยเครอง Step-One PlusReal-time PCR System (GENEPLUS, USA)ด ง น ป ร ม าณ ด เ อ น เ อ 2 0 ng2X TaqMan Genotyping MasterMix 5 μl40X Assay Mix cDNA 0 . 25μlปร ม าต รส ดท าย 1 0μlและ PCR condition ค อ pre-denaturation 95°C นาน 10นาท denaturation 95°C นาน15 วนาท annealing และ extension 60°C นาน 60 วนาทจ านวน 50รอบ

การกระตนการตกไขและการเกบตวออน โคทถกแบงออกเปน 3 กลมตาม genotype ไดแก AA AG และGG จะถกเลอกแบบสมไมเฉพาะเจาะจงภายในกลมทมจโนไทปเดยวกน จ านวนจโนไทปละ 15 ตว ใหฮอรโมนเพอกระตนการตกไขหลายใบ ผสมเทยมและเกบตวออนตามขนตอนของศนยวจยเทคโนโลยชวภาพการยายฝากตวออนและเซลลสบพนธสตว อ.ปากชอง จ.นครราชสมา (Figure 1) ท าการเกบตวอยางโดยมการกระตนการตกไขหลายใบ ผสมเทยมดวยน าเชอแชแขงจากพอพนธตวเดยวกนทผลตในครงเดยวกนและเกบตวออนโดยจะท าการเกบตวอยางจากโคแตละตว 3 ครง หางกนครงละ 3 เดอน

Figure1. Superovulation procedures and embryo harvest program followedEmbryo Transfer

Technology and Animal Germplasm Research Centerprotocol. Note: *CIDR-B®: intravaginal progesterone releasing device (Ceva Sante Animale, France)

**Folltropin-V®: FSH (Bioniche Animal Health Canada Inc.) ***Estrumate: prostaglandin F2α (Intervet Canada Inc.)

บนทกขอมลการตกไขเปน 4 ชนดไดแกอตราการตกไขซงหมายถงจ านวนรวมของตวออนทยายฝากได ไข

ทไมไดรบการผสม และตวออนทเสอมสภาพทงหมด (the total number of ovulation; TNO = the total number of transferable embryo/unfertilized ova/degenerate embryo)จ านวนตวออนทยายฝากได


20

(the number of transferable embryo; NTE)จ านวนไขท ไมถกผสม (the number of unfertilized ova; NUO) และจ านวนตวออนตายหรอเสอมสภาพ (the number of degenerate embryo; NDE)

การวเคราะหขอมล น าขอมลทไดมาวเคราะหหาความถของยนและจโนไทปโดยใชสมการ (pA+qa)2 = p2AA+2pqAa+q2aa โดยท A หมายถง A allele a หมายถง G allele P หมายถงความถของA allele q หมายถงความถของ G allele p+q = 1 การศกษาความสมพนธของรปแบบยน Inhibin ทมผลตออตราการตกไขโดยวเคราะหอทธพลของจโน

ไทปของยนกบปรมาณและชนดตวออน/ไขทเกบไดดวยวธ Generalized Linear Model (GLM)ตามสมการ Yikj = u+Gi+Nk+Tj+eijk โดยท Yikj หมายถง phenotypic value of traits U หมายถง population mean Gi หมายถง fixed effect of genotype Nk หมายถง fixed effect of age Tj หมายถง fixed effect of contemporary group และ

eikj หมายถง random residue error

ผลและวจารณการทดลอง

การศกษารปแบบจโนไทปของยน Inhibin ในสวนทสรางฮอรโมน INHA สามารถท าไดโดยการใชวธทางชวโมเลกลซงเดมใชวธ PCR-RFLP ดงนนในการตรวจสอบโดยใชวธใหมคอ Real-time PCR ตองแนใจวาการออกแบบprimers และprobes ของขนตอน Real-time PCR นนมความถกตองและแมนย าตามจโนไทปจรง จงตองมการจดกลมจโนไทปทถกตองในกลมสตวทดลองกอนส าหรบการทดลองครงนมการออกแบบไพรเมอรทใชในวธ PCR-RFLPใหครอบคลมบรเวณ A192G ในexon 1 ของยน Inhibin สวนทสรางฮอรโมน INHAโดยการทดสอบในขนตอนนพบวามขนาดชนสวนของดเอนเอจากปฏกรยา PCR เทากบ 249 bp การกลายพนธจาก A allele (ACCGAAGGCA) เปน Gallele (ACCGGAGGCA)ทต าแหนง 192 (A192G) ท าใหเพมจดตดของเอนไซมตดจ าเพาะ MspI(CCGG) ขนอก 1 ต าแหนง(Figure 2)เมอตรวจสอบขนาดชนสวนDNA หลงการตดดวย MspIพบวาในกลมจโนไทปAA มขนาด 123 95และ31 bp และในกลมจโนไทปGG มขนาด 95 79 44 และ31 bp สวนกลมจโนไทป AG พบทง 5 ขนาด (123 95 79 44 และ 31) (Figure 3)


21

Figure 2. The cleavage point (arrow) of MspI endonuclease (CC-GG) on the 249 bp PCR product of INHAgene. Number in the box indicated number of the cutting side (Aallele: box I and III; G allele: box I, II, and III).

Figure 3.A representative gel showing exon 1 INHAgenegenotyping by PCR-RFLP technique. 50and 100 bp molecular markers were presented on lane 1 and 2, respectively. The 249 bp of uncut PCR product was shown on lane 3, then, Lane 4 and 5: AA genotype (123, 95 and 31bp); lane 6 and 7: AG genotype (123, 95, 79, 44 and 31bp); lane 8 and 9: GG genotype (95, 79, 44 and 31bp)

เมอน าตวอยางดเอนเอชดเดยวกนมาทดสอบดวยวธReal-time PCR ทไดรบการพฒนาขนโดยการออกแบบ primers และprobes ทจ าเพาะตอ SNP ของยนทต าแหนง A192G และตรวจการเพมขนของ PCR product โดยการวดปรมาณส fluorescence 2 ชนด ไดแก A allele ดวยVIC-fluorescence dye (กราฟสเขยว) และ G alleleดวยFAM-fluorescence dye (กราฟสน าเงน) (Figure 4) ซงเมอเปรยบเทยบกบวธ PCR- RFLPแลวพบวาทง 2 วธสามารถตรวจสอบ genotype ของยน Inhibin สวนทสรางฮอรโมน INHAไดและใหผลเหมอนกนทง 200 ตวอยาง


22

Figure 4 . Real-time PCR genotyping for exon I ofINHA gene in Angus crossbred cows. VIC-fluorescence dye (green) and FAM-fluorescence dye (blue)indicated A and G alleles, respectively. a), b) and c) represented AA, AG and GG genotype, respectively.

การตรวจสอบรปแบบจโนไทปของยน Inhibin สวนทสรางฮอรโมน INHAเดมใชวธ PCR-RFLP (Tang et al.,2011)ซงตองผานกระบวนการหลายขนตอนทยงยากรวมถงขนตอนในการเลอกใชเอนไซมตดจ า เพาะ ท าใหเสยเวลาและคาใชจายสง จากการทดสอบครงนแสดงใหเหนวาการตรวจโดยวธ Real-time PCR จะใหผลตรวจเหมอนกนในทกตวอยางเลอดโคลกผสมแองกส (200 ตวอยาง)ทท าการแยกจโนไทปดวยวธPCR-RFLP รวมกบการตดดวยเอนไซมตดเฉพาะ MspIแสดงวาเทคนค Real-time PCR เปนวธทมความถกตองและแมนย าสามารถใชในการตรวจหาจโนไทปของ exon I ในยน Inhibin สวนทสรางฮอรโมน INHAท าใหมความสะดวก ประหยดเวลาและคาใชจายในการทดสอบเมอเทยบกบวธ PCR-RFLP จโนไทปของยน Inhibin สวนทสรางฮอรโมน INHAในประชากรโคลกผสมแองกสส าหรบการทดลองนสามารถแบงไดเปน 3 กลมคอ AA AG และ GG ซงมจ านวน 72 118 และ10 ตว โดยมความถจโนไทปเปน 0.36 0.59 และ 0.05 ตามล าดบและมความถของ A และ G allele คอ 0.65 และ 0.35 ตามล าดบ (Table 2)เมอพจารณาสภาพความสมดลของยน (Equilibrium of genes) พบวาการกระจายตวของยน Inhibin สวนทสรางฮอรโมน INHAไมมความสมดลตามหลกสมการ Hardy-Weinberg(p<0.01) โดยเฉพาะจโนไทป GG พบเพยง 10 ตว ซงอาจเปนผลมาจากการปรบปรงพนธ ซงโคเหลานเปนโคทเกดจากการผสมเทยมโคพนเมองดวยน า เชอพอพนธแองกสทไดรบการคดเลอกและมจ านวนพอพนธจ ากดโดยมจดประสงคเพอพฒนาและปรบปรงพนธกรรมในประชากรเดมท าใหการผสมพนธไมเปนไปอยางสม (non-random mating) นอกจากนการคดเลอก (selection) ตามลกษณะปรากฏของตวสตว (phenotype)เพอน ามาเปนแมพนธทจะใชสรางพนธโคเนอตอไป สงผลใหเกดการเปลยนแปลงความถของยนหรอเกดการสญหายของยน(สรนทร, 2552)


23

Table2. Genotypic and allelic frequencies of the Inhibin gene exon 1 in 200 Angus crossbredcows.

Genotypes n Genotypic frequency

AA 72 0.36

AG 118 0.59

GG 10 0.05

Alleles n Allelic frequency

A 200 0.65

G 0.35

การศกษาความสมพนธของรปแบบจโนไทปยน Inhibin สวนทสรางฮอรโมน INHAกบอตราการตกไขทเกดจากการท า superovulationพบวามแมโคในกลมจโนไทปGG ทมเพยงจ านวน 10 ตวในประชากรโค 200 ตวนนมจ านวน 2 ตวทมความผดปกตของรงไขในขณะทท าการทดสอบ จงเหลอเพยง 8 ตวทสามารถใชในการทดลองทงนจ านวนตวออนและไขทเกดจากการท า superovulation ตามรปแบบจโนไทปของกลมโคทดลองแตละครงของการทดลอง จ านวน 3 ครง หางกนครงละ 3 เดอน แสดงใน Table 3 Table 3. Association analysis of INHAgenotypes with the superovulation traits of the number of total ovulation (TNO), the number of transferable embryo (NTE), the number of unfertilized ova(NUO) and the number of degenerate embryo (NDE) in Angus crossbred cows 3a) the first superovulation testing:

Types AA (15) AG (15) GG (8) P value

TNO 4.20a±0.45 5.27a±0.45 8.00b±0.62 <0.0001

NTE 2.27a±0.51 3.20ab±0.51 4.75b±0.70 0.0259

NUO 1.20±0.29 1.33±0.29 1.88±0.40 0.3893

NDE 0.73±0.20 0.73±0.20 1.38±0.28 0.1385


24

3b) the second superovulation testing: Types AA (15) AG (15) GG (8) P value

TNO 4.87a±0.59 6.47a±0.59 9.75b±0.80 <0.0001

NTE 3.13a±0.61 3.33a±0.61 7.25b±0.83 0.0006

NUO 0.60±0.40 1.93±0.40 1.00±0.55 0.0711

NDE 1.13±0.34 1.20±0.34 1.50±0.47 0.8140

3c) the third superovulation testing: Types AA (15) AG (15) GG (8) P value

TNO 5.00a±0.67 6.47a±0.67 9.87b±0.92 0.0006

NTE 2.33a±0.47 3.00a±0.47 5.87b±0.65 0.0003

NUO 1.33±0.42 1.80±0.42 1.87±0.58 0.6647

NDE 1.33±0.33 1.67±0.33 2.13±0.45 0.3768

Note: number in parenthesis indicated number of cows in each genotype group. Least square means values (±SE) with different letters in the same row were significant different at P value as shown.

ความสมพนธของรปแบบจโนไทปของยน Inhibin สวนทสรางฮอรโมน INHAตออตราการตกไขพบวา โคทมจโนไทปแบบ GG มคาจ านวนการตกไขทงหมด (คารวมของจ านวนตวออนทยายฝากได ไขทไมไดรบการผสมและตวออนทเสอมสภาพ) หรอ TNO สงกวา กลม AA และ AG ในการเกบตวออนจากการท า superovulation อยางมนยส าคญทางสถตในการทดลองทง 3 ครง (P =<0.0001 ในครงท 1 และครงท 2 และ P =0.0006 ในครงท 3) ในขณะทกลม AA และ AG ไมมความแตกตางอยางมนยส าคญทางสถตของ TNOในการทดลองทง 3 ครง (Table 3a, 3b และ 3c) เชนเดยวกบคาของจ านวนตวออนทยายฝากไดหรอ NTE โดยกลม GG มคาสงกวากลม AA และ AG อยางมนยส าคญทางสถตในการทดลองทง 3ครง (P =0.0259 0.0006 และ 0.0003 ตามล าดบ) (Table 3) ยกเวนครงท 1 ทคา NTE ของกลม GG ไมแตกตางจากกลม AG(Table 3a) ส าหรบจ านวนไขทไมถกผสมหรอ NUO และจ านวนตวออนตาย/เสอมสภาพหรอ NDE พบวาไมมความแตกตางอยางมนยส าคญทางสถตในการทดลองทง 3 ครงของทกกลมจโนไทป (Table 3) จากผลการทดลองเหนไดวารปแบบจโนไทปของยน Inhibin สวนทสรางฮอรโมน INHAทมความแตกตางกนของ exon I ในโคลกผสมแองกสซงเปนโคเนอทใชในการทดลองครงนมผลตออตราการตกไขเมอท า superovulation โดยกลม GG จะใหจ านวนตวออนและไขทงหมด (TNO) และจ านวนตวออนทสามารถท าการยายฝากได (NTE) สงกวาลกษณะ AA และ AG ซงสอดคลองกบการทดลองของ Tang et al. (2011)ทพบวาลกษณะ GG ของ INHA gene ในโคนมพนธ Chinese Holstein ใหปรมาณตวออนและไขทงหมด และจ านวนตวออนทสามารถท าการยายฝากไดมากกวาลกษณะ AA ทงนการ


25

เปลยนแปลงล าดบเบสของยนในต าแหนง A192G อาจมผลท าใหการท างานของ INHA gene ลดลงหรอเกดความไมเสถยรของRNA ในขนตอน RNA transcription ท าใหบทบาทในการระงบการท างานของ FSH ทตอมใตสมองลดลง (Sangetal., 2011) ปรมาณ FSH จงเพมขนสงผลใหรงไขถกกระตนใหสรางฟอลลเคลไดมากขน ซงลกษณะของ A allele จะมผลทางลบตอการกระตนการตกไขหลายใบ ในขณะท G allele จะใหผลทางบวก

นอกจากนการทดลองนยงศกษาผลของการเหนยวน าเพอใหเกดการตกไขจ านวนมากซ าๆหลายครงตดตอกนวาจะมตอการตอบสนองตอฮอรโมนในแมโคทดลองหรอไม โดยไมไดค านงถงรปแบบของยน (Table4) พบวาการเหนยวน าเพอใหเกดการตกไขจ านวนมากซ าๆหลายครงตดตอกนไมมผลตอคาเฉลยจ านวนตวออนและไขทง 4 ชนดในแตละครงของการทดลอง ยกเวนพบจ านวนตวออนตาย/เสอมสภาพหรอ NDEในครงท 3 มากกวาครงท 1 อยางมนยส าคญ ซงอาจจะเปนผลมาจากสภาพอากาศและอาหารเนองจากชวงระยะเวลาทท าการเกบตวออนในครงแรกอยในเดอนธนวาคมซงสตวอยในสภาพอณหภมเยนกวาและอาหารมคณภาพดกอนท าการทดลอง สวนในการทดลองครงท3 ทมการเกบตวออนในราวเดอนมถนายนนนสตวอาจมภาวะเครยดสะสมเนองจากผานสภาพอากาศรอนจด (ชวงเดอนเมษายน-มถนายน) และอาหารไมสมบรณนกกอนท าการเกบตวออนสงผลใหเกดตวออนจ านวนหนงไมสมบรณ ตายหรอเสอมสภาพมากขน อยางไรกตามเมอพจารณาในภาพรวมของจ านวน TNOและ NTE พบวาไมมความแตกตางโดยเฉพาะคา NTE ซงบงบอกถงตวออนทยายฝากไดอนเปนสวนส าคญทสดของจดประสงคในการท า superovulation ดงนนการเหนยวน าดวยฮอรโมนใหเกดการตกไขหลายใบสามารถกระท าไดซ าๆอยางนอย 3 ครงตดตอกนโดยไมมผลกระทบตอปรมาณตวออนทยายฝากได

Table 4.Effect of repeated superovulation treatments of the number of TNO, NTE, NUO and NDE

in Angus crossbred cows (n= 38) Types 1st superovulation 2ndsuperovulation

3rdsuperovulation P value

TNO 5.42±0.45 6.53±0.45 6.61±0.45 0.1178

NTE 3.16±0.39 4.08±0.39 3.34±0.39 0.2198

NUO 1.39±0.24 1.21±0.19 1.63±0.24 0.4628

NDE 0.87a±0.19 1.24ab±0.19 1.63b±0.19 0.0183

Note: Least square means values (±SE) with different letters were significant different at P value as shown.

นอกจากนผลการวจยยงพบวาในแตละครงของการทดลองการกระตนการตกไขของโคกลมน จะไดตวออนและไขทงหมด(TNO) (โดยไมค านงถงชนดจโนไทป)ตอแมโคตวให (Donor) เฉลยทง 3 ครงของการทดลองทจ านวน 5.42±0.45 6.53±0.45 และ6.61±0.45ตามล าดบ(Table 4) ซงสอดคลองกบรายงานจ านวนตวออนในการท า superovulation ทวไปจะไดประมาณ6 ตวออนตอแมโคตวให(Bo andMapletoft, 2014)โดยปจจยทมผลตอปรมาณและคณภาพตวออนในกระบวนการ superovulation และ embryo recovery คอ ปจจยจากตวสตวไดแก พนธกรรม ประวตการสบพนธ อาย สายพนธ และสภาวะของระบบสบพนธและรงไขของ donorในขณะทท าการกระตน เปนตน นอกจากนสภาวะแวดลอม ไดแก ปจจยทกอใหเกดความเครยด เชนอณหภม การ


26

จดการ อาหาร รวมถง โปรแกรมการใหฮอรโมนกระตนการตกไข น าเชอทใชในการผสมเทยม และผทท าการผสมเท ยมหร อ เกบต ว ออน (Butler, 2000; Benyeiet al.,2003; Hooperet al., 2015;Biancucciet al., 2016) อยางไรกตามจ านวนโคทใชในการหาความสมพนธระหวางรปแบบจโนไทปของยนและจ านวนตวออนนนอาจจะมจ านวนไมมากนก โดยเฉพาะอยางยงในกลม GG นนมเพยง 8 ตวดงนนจงควรมการศกษาตอในประชากรทมากขน และในโคสายพนธอนๆวามความสมพนธในแนวทางเดยวกนหรอไม

สรปผลการทดลอง

รปแบบจโนไทปของยนInhibin สามารถตรวจสอบไดโดยวธ Real-time PCR โดยใหผลทแมนย าและรวดเรวกวาการตรวจสอบดวยวธ PCR-RFLP ซงเปนวธเดมทมความยงยากและใชเวลามาก ทงนรปแบบจโนไทปทแตกตางกนของexon I ในยน Inhibin สวนทสรางฮอรโมน INHAมผลตออตราการตกไขจากการเหนยวน าใหเกดการตกไขคราวละมากๆ (superovulation) โดยรปแบบ GG จะใหตวออนทสามารถน าไปใชในการยายฝากไดมากทสดตามวตถประสงคของการท า superovulationสามารถใชเปนแนวทางคดเลอกแมโคตวให (donor) ทมลกษณะดตรงตามจดประสงคการสรางและพฒนาสายพนธเพอการผลตตวออนส าหรบการยายฝากเชนการสรางโคเนอคณภาพสงไทยแบลคของกรมปศสตว ชวยลดระยะเวลา คาใชจายในการเลยงดและการเหนยวน าการตกไขและอาจน าไปศกษาตอเนองในโคพนธอนๆตอไป

เอกสารอางอง

สรนทร ปยะโชคณากล. 2552. เครองหมายดเอนเอ: จากพนฐานสการประยกต. ส านกพมพมหาวทยาลยเกษตรศาสตร กรงเทพฯ.

Armstrong, D.T. 1993. Recent advances in superovulation of cattle. Theriogenology 39: 7–24. Benyei, B., A. Gaspardy and S. Cseh. 2003. Effect of the El Nino phenomenon on the ovarian

responsiveness and embryo production of donor cows. Acta Vet Hung. 51: 209-218. Biancucci A., T. Sbaragli, A. Comin, L. Sylla, M. Monaci, T. Peric and G. Stradaioli. 2016. Reducing

treatments in cattle superovulation protocols by combining a pituitary extract with a 5% hyaluronan solution: Is it able to diminish activation of the hypothalamic pituitary adrenal axis compared to the traditional protocol? Theriogenology. 85: 914-921.

Bo G.A and R.J. Mapletoft. 2014. Historical perspectives and recent research on superovulation in cattle. Theriogenology. 81: 38-48.

Butler W.R. 2000. Nutritional interactions with reproductive performance in dairy cattle. Anim Reprod Sci. 60-61: 449-457.

Hamilton S.A., H.A. Garverick, D.H. Keisler, Z.Z. Xu, K. Loos, R.S. Yougquist and B.E. Salfen. 1995. Characterization of ovarian follicular cysts and associated endocrine profiles in dairy cows. Biol Reprod. 53:890–898.

Hasler, JF. 2003. The current status and future of commercial embryo transfer in cattle. Anim Reprod Sci. 79:245–264.


27

Hooper, L.M., R.R. Payton, L.A. Rispoli, A.M. Saxton and J.L. Edwards. 2015. Impact of heat stress on germinal vesicle breakdown and lipolytic changes during in vitro maturation of bovine oocytes. J Reprod Dev. 61: 459-464.

Hua, G.H., S.L. Chen, H.W. Yao, W.S. W.u, Z. Shen, Q.K. Chen, L. Chen, Q.Y. Wen and LG. Yang. 2007. Hae RFLP of INHA and its relationship to goat litter size. Yi Chuan. 29:972–976.

Ishigame, H., M.S. Medan, G. Watanabe and Z. Shi. 2004. A new alternative method for superovulation using passive immunization against inhibin in adult rats. Biol. Reprod. 71: 236-243.

Kaneko, H., H. Kishi, G.Watanabe, K. Taya, S. Sasamoto, and Y. Hasegawa. 1995. Changes in plasma concentrations of immunoreactive inhibin, estradiol and FSH associated with follicular waves during the estrous cycle of the cow. J Reprod Dev. 41:311–320.

Lu, C., W. Yang, M. Chen, T. Liu, J. Yang, P. Tan, L. Li, X. Hu, C. Fan, Z. Hu, and Y. Liu. 2009. Inhibin A inhibits follicle-stimulating hormone (FSH) action by suppressing its receptor expression in cultured rat granulosa cells. Mol Cel Endocrinol. 298:48–56.

Malhi, P.S., G.P. Adams, R.J. Mapletoft, and J. Singh. 2008. Superovulatory response in a bovine model of reproductive aging. Anim. Reprod. Sci. 109: 100-109.

Mapletoft, R.J. and J.F. Hasler. 2005. Assisted reproductive technologies in cattle: a review. Rev. Sci. Tech 24: 393-403.

McNeilly, A.S., W. Crow, and B.K. Campbell. 1991. Effect of follicular fluid and inhibin immunoneutralization on FSH-induced preovulatory follicle growth in the ewe. J Endocrinol 131:401–409.

Mei, C., M.Y. Li, S.Q. Zhong, Y. Lei, and ZD. Shi. 2009. Enhancing embryo yield in superovulated holstein heifers by immunization against inhibin. Rep Domest Anim 44:735–739.

National Center for Biotechnology Information, NCBI. The BLAST Sequence Analysis program. https://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch#

New England BioLabs. NEBcutter V2.0. http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php Picton, HM., CG. Tsonis, and AS. McNeilly. 1990. FSH causes a time dependent stimulation of

preovulatory follicle growth in the absence of pulsatile LH secretion in ewes chronically treated with gonadotrophin-releasing hormone agonist. J Endocrinol 126:297–307.

Robertson, D.M., LM. Foulds. L. Leversha. FJ. Morgan, MTW. Hearn, HG. Burger, REH. Wettenhall. and DM. de Kretser. 1985. Isolation of inhibin from bovine follicular fluid. Biochem. Biophys. Res. Commun., 126, 220-226.

Sang, L., QZ. Du, WC. Yang, KQ. Tang, JN. Yu, GH. Hua, XX. Zhang, and LG. Yang. 2011. Polymorphisms in follicle stimulation hormone receptor, inhibin alpha, inhibin beta A, and prolactin genes, and their association with sperm quality in Chinese Holstein bulls. Anim. Reprod Sci, 126: 151-156.

http://tools/


28

Sasaki, K., MS. Medan, G. Watanabe, S. Sharawy, and K. Taya. 2006. Immunization of goats against inhibin increased follicular development and ovulation rate. J Reprod Dev 52:543–550.

Sunderland, SJ., MA. Crowe, MP. Boland, JF. Roche, and JJ. Ireland. 1994. Selection, dominance and atresia of follicles during the oestrous cycle of heifers. J Reprod Fertil. 101:547–555.

Takedomi, T., H. Kishi, MS. Medan, Y. Aoyagi, M. Konishi, T. Itoh, S. Yazawa, G. Watanabe, and K. Taya. 2005. Active immunization against inhibin improves superovulatory response to exogenous FSH in cattle. J Reprod Dev 51:341–346.

Tang, KQ., SJ. Li, WC. Yang, JN. Yu, L. Han, X. Li, and LG. Yang. 2011. An MspI polymorphism in the inhibin alpha gene and its associations with superovulation traits in Chinese Holstein cows. Mol Biol Rep (2011) 38:17–21.

Thatcher, WW., F. Moreira, JE. Santos, and RC. Mattos. 2001. Effects of hormonal treatments on reproductive performance and embryo production. Theriogenology 55: 75-89.

Todoroki, J., H. Yamakuchi, K. Mizoshita, N. Kubota, N. Tabara, J. Noguchi, K. Kikuchi, G. Watanabe, K. Taya, and H. Kaneko. 2001. Restoring ovulation in beef donor cows with ovarian cysts by progesterone-releasing intravaginal Silastic devices. Theriogenology. 55:1919–1932.

Untergasser, A. and H. Nijveen. 2007. Primer3Plus. http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plusAbout.cgi

Woad, KJ., SM. Pearson, SE. Harris, K. Gersak, and AN. Shelling. 2009. Investigating the association between inhibin alpha gene promoter polymorphisms and premature ovarian failure Fertil Steril. 91:62–66.

Yang, WC, SJ. Li, Y. Chen, and LG. Yang. 2014. Polymorphism of the inhibin βA gene and its relationship with superovulation traits in Chinese Holstein cows. Genet. Mol. Res. 13(1): 269-275 .

http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plusAbout.cgi

http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plusAbout.cgi


29

ผลของ GNRH ตออตราการผสมตดในแพะเน อลกผสมทเหนยวนาการเปนสดดวย CIDR-G®

ชาญยทธ กาพล1/ จตศกด เมองเขยว1/อบลรตน วชยดษฐ1/ณฐพร จยจลเจม2/

บทคดยอ

การศกษาในครงนมวตถประสงคเพอศกษาวงรอบการเปนสดรวมทงระดบฮอรโมนโปรเจสเตอโรน ระยะเวลาการเปนสดและผลของฮอรโมน GnRH ตออตราการผสมตดในแมแพะเนอลกผสมบอร-แองโกลนเบยน การทดลองท 1 ใชแมแพะจ านวน 15 ตว เกบตวอยางเลอด (10 ml.) ทก 3 วนตลอดวงรอบการเปนสดตดตอกน 3 วงรอบตรวจวเคราะหระดบฮอรโมนโปรเจสเตอโรนดวยเทคนค Radioimmunoassay (RIA) ผลการศกษาพบวา วงรอบการเปนสด ระดบฮอรโมนโปรเจสเตอโรนในระยะ follicular phase ระยะ Luteal phase และระยะเวลาเปนสดมคาเฉลยเทากบ 21.16±4.51 วน 0.31±0.25 ng/ml 3.65±1.96 ng/ml และ 41.13±1.17 ชวโมงตามล าดบการทดลองท 2 ใชแมแพะ จ านวน 52 ตว แบงเปน2 กลมๆ ละ 26 ตวกลมควบคม และกลมศกษา ท าการเหนยวน าการเปนสดแมแพะทกตว ดวย CIDR- G®(day 0) 14 วน ฉด PMSG 150 IU และ PGF2α 125 µg. กอนถอด CIDR- G®2 วน (day 12) ผสมเทยมท 24 ชวโมงหลงเปนสดยนนงทง 2 กลม แตกลมศกษา(Experimental group) ไดรบGnRH 10 µg. เขากลามเนอพรอมผสมเทยม ผลการศกษาพบวาอตราการผสมตด ในกลมควบคมและกลมศกษามคาเฉลย 38.46±0.49 และ 42.31±0.50 เปอรเซนต ตามล าดบ ไมแตกตางอยางมนยส าคญทางสถต (P>0.05)

ค าส าคญ: GnRH อตราการผสมตด วงรอบการเปนสด แพะ เลขทะเบยนวจย: 57(1)–0208-003 1/ศนยวจยการผสมเทยมและเทคโนโลยชวภาพสราษฏรธานสราษฎรธาน อ าเภอพนพน จงหวดสราษฎรธาน 2/มหาวทยาลยราชภฏสราษฎรธานอ าเภอเมอง จงหวดสราษฎรธาน


30

Effect of GnRH on conception rate in crossbred meat goats

synchronized for estrus with CIDR-G®

Chanyut kaphol1/Jitthasak Maungkhiow1/Ubonrat Wichaidit1 Nattaporn Juijuljerm2/

Abstract

The objectives of this study were to determine estrous cycle and its progesterone hormonal profile, duration of estrous and effect of GnRH on conception rate in Boer-Anglo Nubian crossbred does. Experiment 1 were conducted in 15 does, blood samples(10 ml.) were collected every 3 days during the estrous cycle, 3 cycles consecutively. Progesterone profile analysis was determined by Radioimmunoassay (RIA). The results showed estrous cycle and its progesterone profile (follicular phase as well as luteal phase) and duration of estrous as21.16± 4.51days, 0.31±0.25 ng/ml (follicular phase), 3.65±1.96 ng/ml.(luteal phase) and 41.13± 1.17 hrs, respectively. Experiment 2: Fifty two does were divided into control group (n=26) and experimental group (n=26). All does were estrous synchronized with CIDR-G® (first day of insertion, d. 0)14 days, PMSG 150 IU. and PGF2α 125 µg. i/m on d.12 (2 days before CIDR-G® removal) and artificial inseminated (AI) 24 hrs after standing heat. Only does in experimental group were i/m with GnRH 10 µg. at the time of AI. The result revealed the conception rates of the control and experimental groups were 38.46±0.49% and 42.31±0.50%, respectively, (P>0.05).

Keywords: GnRH,Progesterone,Conception rate,Estrous cycle, Boer-Anglo Nubian crossbred Registered No. 57(1) – 0208 – 003 1/Suratthani Biotechnology and Artificial Insemination Research Center Phunphin District Suratthani 2/Suratthani Rajabhat University Mueang Suratthani


31

ค าน า

แพะจดเปนสตวเคยวเอองขนาดเลก มระยะการอมทองประมาณ 150 วน และมโอกาสเกดลกแฝดสง สามารถกนไดทงใบไม พชใบพมตลอดจนหญา และพชตระกลถวตางๆ ไดด ในพนทภาคใตเกษตรกรใหความสนใจเลยงแพะเนอและนยมเลยงมากทสดคอแพะเนอลกผสมบอร-แองโกลนเบยน เพราะเปนทตองการของตลาดเนอแพะ การเพมประสทธภาพการผลตแพะจงเปนสงจ าเปนตองด าเนนการอยางเรงดวน เพอเพมปรมาณและกระจายแพะพนธดใหเพยงพอกบความตองการของตลาดและผบรโภค จ าเปนตองใชเทคโนโลยชวภาพทางการสบพนธชวยพฒนาการผลตแพะโดยเฉพาะการผสมเทยมซงเปนวธการเพมประสทธภาพการผลตสตวและกระจายพนธกรรมของสตวพนธด ไดอยางรวดเรว อยางไรกตาม จากผลการศกษาทผานมาพบวาการผสมเทยมแพะมอตราการผสมตดคอนขางผนแปรเชน อตราการผสมตด 32.00-52.00 เปอรเซนต (นวฒน และคณะ, 2550) 13.33-30.00 เปอรเซนต (อภชย และคณะ, 2553) 15.4-75.0 เปอรเซนต (มาลและคณะ, 2556) 41.5-50.0 เปอรเซนต (วศษฐ และคณะ, 2557) อตราการผสมตดจากการผสมเทยมทมความผนแปรอาจมผลจากแพะทเลยงในเขตรอนชนสามารถเปนสดไดตลอดทงป มวงรอบการเปนสด 3 รปแบบ คอ วงรอบสน (11.50±3.02 วน) วงรอบปกต (21.83±2.03 วน) และวงรอบยาว (23.81±3.14 วน) (จรวย และศรชย, 2541) ระยะเวลาเปนสดยนนงไมแนนอน 34.06±8.91 ชวโมง (ทองยศ และคณะ, 2527) 23.64±12.86 ชวโมง (จรวย, 2540) แพะแสดงอาการเปนสดไมชดเจนสงเกตอาการเปนสดไดยาก(Cheminear et al.,1992) และเวลาการตกไขของแพะกมความหลากหลายไมแนนอน เชน 20-48 ชวโมง (Akusu et al.,1986) 30-36 ชวโมง (Gordon,1997) และ 38 ชวโมง (Greyling and Van Niekerk, 1990) หลงเรมเปนสดยนนงหรอไขจะตกในชวงปลายของการเปนสดยนนง (Goel and Angawel, 2003) จงยากทจะก าหนดเวลาทเหมาะสมในการท าผสมเทยมใหสอดคลองกบเวลาการตกไขของแพะ การใชฮอรโมนเหนยวน าการเปนสดรวมกบฮอรโมนทกระตนการตกไขส าหรบควบคมวงรอบการเปนสดและเวลาการตกไขเพอก าหนดเวลาทเหมาะสมในการผสมสมเทยมเปนวธการหนงทจะท าใหอตราการผสมตดเพมขน เชนใชฮอรโมน Gonadotropin Releasing Hormone (GnRH) รวมกบฮอรโมนอนในการเหนยวน าการเปนสดเพอกระตนใหระดบฮอรโมน Luteinizing hormone (LH) สงขน (Beck et al., 1996) ซง LH จะไปกระตนใหเกดการตกไข และอตราการผสมตดจะเพมขน (Pierson et al.,2003)

ดงนนจงมความจ าเปนตองศกษาใหทราบถงวงรอบการเปนสดระยะเวลาการเปนสด ทแนนอนของแพะ โดยการตรวจวเคราะหระดบฮอรโมนโปรเจสเตอโรนในระหวางวงรอบการเปนสดซงจะบงชไดอยางชดเจนวา แพะนนก าลงเปนสดอยางแทจรงหรอไม หรอมการเจรญและเปลยนแปลงของ follicle หรอ corpus luteum (CL) หรออยในระยะใดของวงรอบการเปนสด ซงจะท าใหสามารถก าหนดเวลาทเหมาะสมในการผสมเทยมแพะจากการเปนสดตามธรรมชาตไดถกตองเพอเพมประสทธภาพการผสมตดและสรางองคความรเพมเตมเพอพฒนางานผสมเทยมแพะตอไป

การศกษาครงนมวตถประสงค เพอศกษาวงรอบการเปนสดระดบฮอรโมนโปรเจสเตอโรน ระยะเวลาการเปนสด ของแพะเนอลกผสมบอร-แองโกลนเบยนและเพอเปรยบเทยบผลของฮอรโมน GnRH รวมกบโปรแกรมการเหนยวน าการเปนสดดวย CIDR-G® ตออตราการผสมตด (conception rate) ในแมแพะเนอลกผสมบอร-แองโกลนเบยน ระยะเวลาหลงถอด CIDR- G® ถงเปนสดยนนง


32

อปกรณและวธการทดลอง การทดลองท 1 สตวทดลอง

แมแพะเนอลกผสมบอร-แองโกลนเบยนหลงคลอดลกไมนอยกวา 30-45 วน จ านวน 15 ตว สขภาพสมบรณแขงแรง ไมมความผดปกตของระบบสบพนธใหลก(parity)มาแลว 1 ครอก น าหนกตวระหวาง25-45กโลกรมแพะทกตวไดรบอาหารหยาบและน าสะอาดแบบเตมท เสรมอาหารขนโปรตนไมนอยกวา 14เปอรเซนตปรมาณ 300 กรม/ตว/วน มแรธาตกอนใหตลอดการทดลอง ปรบสภาพแมแพะโดยการถายพยาธและฉดวตามนบ ารง ใหมคะแนนรางกายระหวาง 3-3.5 (BCS 1-5) กอนเรมด าเนนการทดลอง แพะทกตวมระบบการเลยงและการจดการเหมอนกนโดยท าการทดลอง ณ ศนยวจยการผสมเทยมและเทคโนโลยชวภาพสราษฎรธาน

วธการทดลอง เกบตวอยางเลอด 10 มลลลตรตอตว บรเวณเสนเลอดด าทคอ ( jugular vein) ตดตอกน 3 วงรอบการ

เปนสดปนแยกซรม (Serum) ภายใน 2 ชวโมง เกบซรมทอณหภม -20 องศาเซลเซยส ตรวจวเคราะหปรมาณของฮอรโมนโปรเจสเตอโรน ดวยเทคนค Radioimmunoassay (RIA) และตรวจการเปนสดวนละ 4 ครง โดยใชแพะพอพนธทเบยงเบนลงครวมกบสงเกตอาการเปนสดของแมแพะ การบนทกขอมล

1) วงรอบการเปนสด (Estrous cycle: day) หมายถง ระยะเวลาทแพะเปนสดยนนงยอมรบการขนทบจากพอแพะครงแรกในรอบการเปนสดครงท 1 ถงเวลาทแพะเปนสดยนนงยอมรบการขนทบจากพอแพะครงแรกในรอบการเปนสดครงถดไป

2) ระยะเวลาการเปนสด (Duration of estrus: hr.) หมายถง ระยะเวลาทแพะเรมเปนสดยนนงยอมรบการขนทบของพอแพะครงแรกถงครงสดทายในรอบการเปนสดเดยวกน

การวเคราะหขอมลทางสถต วเคราะหขอมลเบองตนของวงรอบการเปนสดและระยะเวลาการเปนสด โดยน ามาหาพสย คาเฉลยและ

สวนเบยงเบนมาตรฐาน และวเคราะหระดบฮอรโมนโปรเจสเตอโรนแตละระยะโดยน ามาหา พสย คาเฉลยและสวนเบยงเบนมาตรฐาน

การทดลองท 2

สตวทดลอง แมแพะเนอลกผสมบอร-แองโกลนเบยนจ านวน 52 ตว มสขภาพแขงแรงไมมความผดปกตของระบบ

สบพนธ น าหนกตวระหวาง25-45 กโลกรมมคะแนนรางกายระหวาง 2.0-4.0 (BCS 1-5) มสภาพการเลยงและสภาพแวดลอมคลายคลงกนจ านวน2 ฟารมๆ ละ 26 ตว ในพนทใกลเคยงกน ของจงหวดสราษฏรธาน ในแตละฟารมแบงแพะออกเปน 2 กลมๆละ 13 ตว ดงน

กลมท 1 กลมควบคม (Control group) สอด CIDR- G®14 วน(day 0) ฉด PMSG 150 IU และ PGF2α 125 µg. กอนถอด CIDR- G®2 วน (day 12) ผสมเทยมท 24 ชวโมงหลงแพะเปนสดยนนง

กลมท 2 กลมศกษา (Experimental group) สอด CIDR- G®14 วน(day 0) ฉด PMSG 150 IU และ PGF2α 125 µg. ก อนถอด CIDR- G®2 ว น (day 12) ฉ ด GnRH 10 µg. (GnRH: Receptal®, 1 ml. ประกอบดวย Buserslin acetate 4.00 µg.) เขากลามเนอพรอมผสมเทยมท 24 ชวโมงหลงแพะเปนสดยนนง

วธการทดลอง แมแพะทงสองกลมไดรบการผสมเทยมเพยงครงเดยวในชวโมงท 24 หลงเรมเปนสดยนนง ดวยน าเชอแช

แขง (Frozen semen) ขนาด 0.25 มลลลตรทมจ านวนอสจไมนอยกวา 150 ลานตว และอตราการเคลอนไหว


33

(motility) ไมนอยกวา 40 เปอรเซนตจากน าเชอพอพนธตวเดยวกน ท าการผสมเทยมดวยเจาหนาทคนเดยวกนตลอดการทดลอง ตรวจการตงทองท 45 วน หลงผสมเทยมดวยเครองอลตราซาวนด บนทกขอมลระยะเวลาหลงถอด CIDR- G® ถงเวลาเรมเปนสดยนนง

การวเคราะหขอมลทางสถต วเคราะหขอมลเบองตนของอตราการผสมตด และระยะเวลาหลงถอด CIDR- G® ถงเวลาเรมเปนสดยนนง

โดยน ามาหา พสย คาเฉลยและสวนเบยงเบนมาตรฐาน เปรยบเทยบอตราการผสมตดดวยวธ Chi-square test

ผลการทดลองและวจารณ ผลการทดลองท 1

วงรอบการเปนสด (estrus cycle) แพะเนอลกผสมบอร-แองโกลนเบยน มจ านวนวงรอบการเปนสดทงหมด 47 วงรอบ มความยาว

วงรอบการเปนสดระหวาง 9 -27 วน คาเฉลยวงรอบการเปนสดเทากบ 19.96±5.36 วน (Table 1) แบงเปน 3 กลมตามวธของ สรยและคณะ (2535) ดงนแบบวงรอบสน (ความยาววงรอบนอยกวา 17 วน) แบบวงรอบปกต(ความยาววงรอบ 17-25 วน) และ แบบวงรอบยาว (ความยาววงรอบมากกวา 25 วน) คาเฉลยวงรอบการเปนสดของแตละแบบเทากบ 10.33±2.65, 21.26±2.00 และ 27.00±0.89 วน ตามล าดบ ใกลเคยงกบรายงานของ ทองเจอ (2545) ท าการศกษาในแพะพนเมองและลกผสมพนเมองคาเฉลยวงรอบการเปนสดแตละแบบเทากบ12.83±5.41 20.91±1.17 และ 36.77±10.49 วน ตามล าดบ ขณะทรายงานของ จรวยและศรชย (2541) มคาเฉลยวงรอบการเปนสดแตละแบบเทากบ 6.77±3.92, 21.70±1.98 และ 50.45±29.71 วน ตามล าดบ เชนเดยวกบรายงานของ สรยและคณะ(2535) เทากบ 7.15±0.86, 21.25±0.52 และ 50.89±6.73 วนตามล าดบ จงสรปไดวาวงรอบการเปนสดตามธรรมชาตของแพะสามารถเกดไดถง 3 รปแบบดงกลาว แตสวนใหญทพบมากทสด คอ วงรอบการเปนสดแบบปกต คอ ระหวาง 17- 25 วน ซงในการศกษาครงนมถง 73.33 เปอรเซนต เทากบการศกษาของ Farshad et al. (2008) ทศกษาในแพะพนธ Markhoz ไวท 73.00 เปอรเซนต และคาเฉลยวงรอบการเปนสดแบบปกตสอดคลองกบรายงานของ จรวยและ ศรชย (2541) (21.70±1.98 วน) สวนทองเจอ (2545) ศกษาในแพะสาวและแพะนางมวงรอบการเปนสดเฉลย 20.62±2.58 และ 20.91±1.17 วน ตามล าดบ ซงใกลเคยงกบหลายการทดลองทมวงรอบการเปนสดเทากบ 21.7±0.7 วน (Thompson et al.,1983) 20.7±0.7 วน (Greyling, 2000) 21.2±1.5 วน (Zarkawi and Soukouti, 2001) แตสงกวาในแพะพนเมองในการศกษาของทองยศและคณะ (2527) และ ฉววรรณ และคณะ (2526) มวงรอบการเปนสด 18.23±4.40 วน และ17.94±5.02 วน ตามล าดบ ทงนนาจะเนองมาจากแพะพนเมองมความสมบรณพนธสงกวาแพะเนอลกผสมบอร-แองโกลนเบยน และขนกบพนธ อาย ฤดกาล (Romano and Abella,1997)


34

Table 1 Mean ± SD and percentage of estrous cycle in crossbred goats.

Estrous cycle (days) Mean±SD Percentage

<17 10.33±2.65 6.67

17-25 21.26±2.00 73.33

>25 27.00±0.89 20.00

Overall 19.96±5.36 100.00

ระยะเวลาการเปนสด (duration of estrus)

แพะเนอลกผสมบอร-แองโกลนเบยนมระยะเวลาการเปนสด แบงเปน 3 กลม คอ กลมท 1 ระยะเวลาการเปนสดนอยกวา 36 ชวโมง (26.67%) กลมท 2 ระยะเวลาการเปนสด 36-48 ชวโมง (20.00 %) และกลมท 3 ระยะเวลาการเปนสดมากกวา 48 ชวโมง (53.33 %) มคาเฉลยในแตละกลมเทากบ 29.36±3.35, 43.33±3.39 และ 50.70±3.07 ชวโมง ตามล าดบ มคาเฉลยทงหมดเทากบ41.13±1.17 ชวโมง (Table 2) สงกวารายงานของ ทองยศ และคณะ (2527) จรวย (2540) และทองเจอ (2545) ท าการศกษาในแพะพนเมองและแพะลกผสมพนเมองเทากบ 34.06±8.91 ชวโมง, 23.64±12.86 ชวโมง และ 21.80±2.98 ชวโมง ตามล าดบ สาเหตทระยะเวลาการเปนสดมความผนแปรอาจเนองมาจากปจจยของพนธ และปจจยอนๆ เชนอาย โภชนะ ฤดกาล และอทธพลจากแพะตวผ เปนตน (Gordon.I,1997) หากพจารณาในกลมท 2 และ 3 ทมระยะเวลาการเปนสดตงแต 36 ชวโมง คดเปน 73.33 เปอรเซนต ซงแสดงไดวาแพะสวนมากจะมระยะเวลาการเปนสดยนนงนานกวา 36 ชวโมงและ Goel and Angawel (2003) รายงานวาแพะทเปนสดไขจะตกในชวงปลายของการเปนสดยนนง ดงนน จงมขอแนะน าใหท าการผสมเทยมแพะ 2 ครง ในชวโมงท 36 และ 48 หลงเรมเปนสดยนนงจากการเปนสดตามธรรมชาต

Table 2 Mean ± SD and percentage duration of estrus in crossbred goats.

Duration of estrus (hrs.) Mean±SD Percentage

<36 29.36±3.35 26.67

36-48 43.33±3.39 20.00

>48 50.70±3.07 53.33

Overall 41.13±1.17 100.00


35

ระดบฮอรโมนโปรเจสเตอโรน (plasma progesterone profile) แมแพะเนอลกผสมบอร-แองโกลนเบยนทมวงรอบการเปนสดแบบปกต จ านวน 22 วงรอบในวนท

0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21และ 24 หลงเปนสดยนนง ปรมาณฮอรโมนโปรเจสเตอโรนเฉลยเทากบ 0.17±0.08, 0.87±0.35, 2.70±1.37, 4.26±1.94, 4.80±1.99, 4.15±2.26, 1.66±1.94, 0.17±0.07 ng/ml และ 0.20±0.06 ng/ml. ตามล าดบ โดยในวนท 0 เรมเปนสดยนนง มปรมาณฮอรโมนโปรเจสเตอโรนต าสด มคาเฉลย 0.17±0.08 ng/ml จนถงในวนท 3 หลงเปนสดยนนง ซงระดบฮอรโมนโปรเจสเตอโรนมคาเฉลย 0.87±0.35 ng/ml (Figure 1) ทงนเนองจากอทธพลของฮอรโมน FSH จากตอมใตสมองสวนหนากระตนใหเกดการเจรญของ follicle พรอมกบผลต estrogen ออกมา ท าใหแพะแสดงอาการเปนสดในชวง 1-3 วนแรก ไขจะตกในชวงนหลงการตกไขจะมการเจรญของ luteal cell พฒนาเปน CL ท าหนาทผลตและสรางฮอรโมนโปรเจสเตอโรน ระดบของฮอรโมนโปรเจสเตอโรนจงเรมเพมขนมากกวา 1.00 ng/ml ตงแตวนท 6 หลงเปนสดยนนงวนท 12 ระดบฮอรโมนโปรเจสเตอโรน มคาเฉลยสงสด 4.80±1.99 ng/ml และยงคงรกษาระดบไปจนถง วนท 15จงเรมลดลงอกครง และลดลงอยางรวดเรวในวนท 18และต ากวา 1.00 ng/ml ในวนท 21 (0.17±0.07ng/ml) จนถงวนท 24 (0.20±0.06 ng/ml) ซงเปนชวงทแมแพะจะกลบมาแสดงอาการเปนสดอกครงจากการเปลยนแปลงระดบของฮอรโมนโปรเจสเตอโรน สามารถแบงวงรอบการเปนสดได 2 ระยะ คอ ระยะ Luteal phase หรอชวงทม CL ระยะเวลาประมาณ15 วน ระดบฮอรโมนโปรเจสเตอโรนมคาเฉลย 3.65±1.96 ng/ml(1.00-11.57 ng/ml) และระยะ follicular phase หรอชวงทม follicle และเกดการตกไข ระยะเวลาประมาณ6 วน ระดบฮอรโมนโปรเจสเตอโรนมคาเฉลย 0.31±0.25ng/ml(0.01-0.98 ng/ml) (Table 3) ซงระดบโปรเจสเตอโรนในชวงทแพะเปนสดครงนมคาสงกวาทมรายงานในแพะพนเมองไทยในชวงเปนสดระหวาง 0.10-0.20 ng/ml (กตยาและคณะ , 2528) และ 0.04±0.30ng/ml (ฉววรรณและคณะ, 2526) นอกจากนพบวา การแสดงพฤตกรรมการเปนสดและการเปลยนแปลงทางสรรวทยาของแพะจากการสงเกตในแบบวงรอบสน แบบวงรอบปกต และแบบวงรอบยาวในครงนเปนไปในท านองเดยวกน

Figure.1 Plasma progesterone level (ng/ml) during the normal estrus cycle of crossbred goats.

0.17±0.08

0.87±0.35

2.70±1.37

4.26±1.94

4.80±1.99

4.15±2.26

1.66±1'94

0.17±0.17 0.20±0.06 -

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

d0 d3 d6 d9 d12 d15 d18 d21 d24

Prog

este

rone

leve

l (ng

/ml.)

Estrus cycle (days)

Progesterone level


36

Table 3 Plasma progesterone level (ng/ml) during the estrous cycle of crossbred goats.

Estrous cycle

Plasma progesterone level (ng/ml)

Luteal phase Follicular phase

Range Mean±SD Range Mean±SD

Short cycle (<18) 1.07-5.14 2.37±1.47 0.07-0.38 0.22±0.06

Normal cycle (18-24) 1.02-11.57 3.88±1.99 0.04-0.98 0.32±0.25

Long cycle (>24) 1.00-5.76 3.12±1.27 0.01-0.92 0.29±0.27

Total 1.00-11.57 3.65±1.96 0.01-0.98 0.31±0.25

Table 4 Effect of GnRH on conception rate in crossbred does synchronized for estrus with CIDR-G

Group No. crossbred does.(heads)

No.pregnancy.

(heads)

Conception rate.

(%)

Standard error mean

Control 26 10 38.46 0.097

Experimental 26 11 42.31 0.099

ผลการทดลองท 2

อตราการผสมตดในกลมควบคมและกลมศกษาเฉลยเทากบ38.46และ42.31 เปอรเซนต ตามล าดบ ซงไมแตกตางอยางมนยส าคญทางสถต (P>0.05) แตกลมศกษามแนวโนมสงกวา (Table 4) อยางไรกตามยงมคาต ากวาการศกษาของ Pierson et al., (2003) ทศกษาในแกะโดยใช MAP-sponge และ PGF2α รวมกบการฉด GnRH หลงถอด MAP-sponge 24 ชวโมง อตราการผสมตดในกลมทฉดและในกลมทไมฉด เทากบ 83.00 และ 50.00เปอรเซนต ตามล าดบ Riaz et al., (2012) รายงานการฉด GnRH รวมกบการฉด PG ในแพะและใชพอพนธผสมพบวามอตราการผสมตด 60.00 และ 78.00เปอรเซนต ตามล าดบ

ระยะเวลาหลงถอด CIDR-G ถงเรมเปนสดยนนง (Time of CIDR-G removal to Onset of estrus) มคาเฉลยเทากบ 23.82±4.64 ชวโมง (12.35-47.05 ชวโมง) ใกลเคยงกบ อภชยและคณะ (2553) รายงานคานไวท 29.05±7.64 ชวโมง (CIDR-G-Day16) แตนอยกวารายงานของ Romano (2004) (40.2 ±10.5 h.)



37

1. วงรอบการเปนสดในแมแพะเนอลกผสมบอร-แองโกลนเบยนม 3 รปแบบ คอ แบบวงรอบสน(10.33±2.65วน) แบบวงรอบปกต (21.26±2.00วน) และแบบวงรอบยาว (27.00±0.89 วน) เฉลยเทากบ 19.96±5.36วน

2. ระยะเวลาการเปนสดในแมแพะเนอลกผสมบอร-แองโกลนเบยนแบงเปน 3 กลม คอ นอยกวา 36 ชวโมง 36-48 ชวโมง และมากกวา 48 ชวโมงเฉลยเทากบ 41.13±1.17 ชวโมง

3. ระดบฮอรโมนโปรเจสเตอโรนในระยะ follicular phase มคาเฉลย 0.31±0.25 ng/ml และระยะ Luteal phase มคาเฉลย 3.65±1.96 ng/ml

4. ระยะเวลาหลงถอด CIDR-Gถงเปนสดยนนงมคาเฉลย 23.82±4.64 ชวโมง 5. อตราการผสมตดในแพะลกผสมบอร-แองโกลนเบยนจากการเหนยวน าการเปนสดดวย CIDR- G® 14

วน ระหวางกลมไมฉด GnRH และกลมทฉด GnRH พรอมกบการผสมเทยมไมแตกตางกน (38.46±0.49 และ 42.31±0.50 เปอรเซนต)

กตตกรรมประกาศ ขอขอบคณส านกงานคณะกรรมการวจยแหงชาตทสนบสนนทนวจย กรมปศสตวทใหการ

สนบสนนโครงการวจยและผมสวนรวมในการศกษาวจยครงน เจาของฟารมผเลยงแพะและเจาหนาททกทานของศนยวจยการผสมเทยมและเทคโนโลยชวภาพสราษฏรธาน ทใหความชวยเหลอในการปฏบตการ การเกบขอมลและการอ านวยความสะดวกตางๆ ตลอดจนผทรงคณวฒทใหค าปรกษา ตรวจทาน แกไข งานวจยฉบบนจนท าใหส าเรจลลวงดวยด

เอกสารอางอง กตยา ศรศกดวฒนะ ฉววรรณ จนสกล,จนทรเพญ พนธสนและ มณวรรณ กมลพฒนะ. 2528. ปลาสมาโปรเจส

เตอโรนและเอสโตรนซลเฟตระหวางการตงทองคลอดและหลงคลอดในแพะพนเมองไทย โดยเทคนคทางไมคไตเตอเพลทเอนไซมอมมโนเอสเซ, น 73-75. ในบทคดยอการประชมทางวชาการของมหาวทยาลยเกษตรศาสตร ครงท 23 (สาขาสตวแพทย). มหาวทยาลยเกษตรศาสตร,กรงเทพฯ.

จรวย บญช. 2540. วงรอบการเปนสดของแพะและการชกน าใหเกดการตกไขมากกวาปกตโดยใช Preqnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG).วทยานพนธวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาสตวศาสตร มหาวทยาลยสงขลานครนทร.

จรวย บญช และศรชยศรพงศพนธ. 2541. วงรอบการเปนสดและการเปนสดแบบมพกยกในแพะ. เอกสารการประชมทางวชาการของมหาวทยาลยเกษตรศาสตร ครงท 36 (สาขาสตวศาสตร). มหาวทยาลยเกษตรศาสตร,กรงเทพฯ.

ฉววรรณ จนสกล จนทรเพญ พนธสน และ มณวรรณ กมลพฒนะ. 2526. การศกษาวงจรสดของแพะพนเมองไทยและระดบโปรเจสเตอโรนระหวางวงจรสดโดยเทคนคทางเรดโออมมโนเอสเซ, น51. ใน เรองยอการประชมทางวชาการของมหาวทยาลยเกษตรศาสตรครงท 20 (สาขาสตวศาสตร). มหาวทยาลยเกษตรศาสตร, กรงเทพฯ.

ทองเจอ แดงชน. 2545. สมรรถภาพทางการสบพนธในแพะทชกน าดวยการเปนสดดวย Prostagradin F2α (PGF2α).วทยานพนธวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาสตวศาสตร มหาวทยาลยสงขลานครนทร.

ทองยศ อเนกเวยง สรชย ชาครยรตน และชวนศนดากร วรวรรณ. 2527. การตรวจการเปนสดและการตกไขของแพะพนเมอง, น24.ใน การประชมทางวชาการของมหาวทยาลยเกษตรศาสตรครงท 20 (สาขาสตวศาสตร). มหาวทยาลยเกษตรศาสตร, กรงเทพฯ.


38

นวฒน ถาวระ อนนท เทองสนเทยะ และบนลอ กล าพล. 2550. การเหนยวน าการเปนสดดวย CIDR-Gและ PGF2α รวมกบ PMSG ตออตราการผสมตดในแพะพนธซาแนน. วารสารเทคโนโลยชวภาพการผลตปศสตว 2(1):1-7.

มาล อภเมธธ ารง จกรภพ จนทรสะอาด บรรจง จงรกษวฒนา วทยา ขจรมย อรณ ชมแกว และณรงค เลยงเจรญ. 2556. อตราการตงทองหลงผสมเทยมแบบก าหนดเวลาในแพะทเหนยวน าการเปนสดแบบโปรแกรมระยะสน. ว วทย. กษ. 44:1 (พเศษ): 207-210

วศษฐ ทองเทยง กฤษณ วระวงศ วทยา ขจรมย และอรณ ชมแกว. 2557. เปรยบเทยบอตราผสมตดระหวางการผสมเทยมครงเดยวและสองครงแบบก าหนดเวลาหลงการเหนยวน าการเปนสดในแพะพนเมองลกผสมในภาคใตของประเทศไทย.http://req.dld.go.th:28080/research/index.jsp, 4 กรกฎาคม 2559.

สรย ชาตวยงาม มณวรรณ กมลพฒนะ พรพมล ศรรตน พชรา ศภธสกล มกดา ปลกผล และศรชย ศรพงศพนธ. 2535. การศกษาการเปลยนแปลงของระดบฮอรโมนภายในวงจรการเปนสดของแพะพนเมองไทยโดยวธเรดโออมมโนเอสเซ. รายงานการวจยฉบบสมบรณของโครงการวจยทไดรบทนอดหนนการวจยเพอพฒนาเศรษฐกจและสงคมดวยวทยาศาสตรและเทคโนโลย จากส านกงานคณะกรรมการวจยแหงชาตประจ าป 2533-2535. ภาควชากายวภาคศาสตร คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยสงขลานครนทร.

อภชย พลชย อนนท เทองสนเทยะ ณรงค เลยงเจรญ บนลอ กล าพล และมาล อภเมธธ ารง. 2553. การเหนยวน าการเปนสดและผสมเทยมแพะดวยน าเชอแชแขง. วารสารเทคโนโลยชวภาพการผลตปศสตว 5(1):110-119.

Akusu, M. O., A. I. A. Osuagwuh, J. U. Akpokodje and G. N. Egbunike. 1986. Ovarian activities of the West Africa Dwarf goat (Capra hircus) during oestrus.Journal of Reproduction and Fertility. 78: 459-462.

Beck, N. F. G., M. Jones, G. E. Mann and A. R. Peter. 1996. The effect of GnRH analoque (buserelin) on day 12 post-mating on ovarian structure and plasma oestradiol and progesterone concentration in ewes. Anim Sci. 63: 407-412.

Chemineau, P., A. Deveau, F. Maurice and J. A. Delgadillo. 1992. Seasonality of oestrus and ovulation is not modified by subjecting female Alping goat to a tropical photoperied. Small Rum.Research. 8: 299-312.

Farshad, A., S. Akhondzadeh, M. J. Zamiri and G. H. Sadeghi. 2008. The estrus cycle of the markhoz goat in Iran. Asian-Aust. J. Anim. Sci.Vol. 21(10) : 1411 – 1415.

Goel, A.K. and K.P. Agrawel, 2003. Ovulation jakhrana goat native to tropical climates. Small Ruminant Research. 3(5): 457-464.

Gordon, I. 1997. Controlled Reproduction in sheep and goats CABI publishing, New city 450 pp. Greyling, J.P.C. and Van Niekerk, C.H. 1990. Ovulation in the boer goat doe. Small Ruminant

Research. 3(5): 457-464. Greyling, J.P.C. 2000. Reproduction traits in Boer goat doe.Small Rumin. Res. 36:171-177. Pierson, J.T.H., Baldassarre, C.L. keefer and B.R. Downey. 2003. Influence of GnRH administration

on timing of the LH surge and ovulation in dwarf goat. Theriogenology 60:397-406.

http://req.dld.go.th:28080/research/index.jsp


39

Riaz, H., A. Sattar, M.A. Arshad and N. Ahmad. 2012. Effect of synchronization protocols and GnRH treatment on the reproductive performance in goats. Small Ruminant Research. 104 : 151-155.

Romano, J. E. and D. F. Abella. 1997. Effect of service on durationof oestrus and ovulation in dairy goats. Anim. Reprod. Sci.47:107-112.

Romano, J. E. 2004. Synchronization of estrus using CIDR, FGA or MAP intravaginal pessaries during the season in Numian goats. Small Ruminant Research.55:15-19.

Thompson, F. N., E. Abrams and D. M. Miller. 1983. Reproductivetraits in Nubian dairy goats. Anim. Reprod. Sci. 6:59-65.

Zarkawi, M. and A. Soukouti. 2001. Serum progesterone levelsusing radioimmunoassay during oestrous cycle of indigenousDamascus does. New Zealand. J. Agric. Res. 44:165-169.

ประสทธภาพของฮอรโมนเอฟเอสเอชและพเอมเอสจ เมอใชรวมกบ CIDR-G

ตอการแสดงการเปนสดและอตราการผสมตดในแพะ


40

สาโรช งามข า1/ พระพงษ ส าราญทรพย2/

บทคดยอ

การศกษานมวตถประสงคเพอเปรยบเทยบผลของการเหนยวน าการเปนสดโดยใชฮอรโมนเอฟเอสเอช และพเอมเอสจ รวมกบฮอรโมนโปรเจสเตอโรนชนดสอดชองคลอดตอการแสดงอาการเปนสดและ อตราการผสมตดในแพะโดยใชแมแพะนมพนธซาเนนจ านวน 20 ตวแบงแพะออกเปน 2 กลมๆละ 10 ตวท าการสอดฮอรโมน CIDR-G เปนเวลา 13 วนและในวนทถอดฮอรโมนออก กลมท 1 ฉดฮอรโมนพเอมเอสจ 200 IU.และกลมท 2 ฉดฮอรโมนเอฟเอสเอช 55 mg. ตรวจอาการเปนสดแพะทกตว และท าการผสมเทยมดวยน าเชอแชแขงทมจ านวนตวอสจไมต ากวา 200 ลานตว/โดสโดยปลอยน าเชอทบรเวณคอมดลกในชวโมงท 48 และ 72 หลงถอด CIDR-G ตรวจการตงทองโดยใชเครองอลตราซาวดหลงจากการผสมเทยมไปแลว 35 วนและตดตามลกเกด ท าการทดลองซ าในแพะทงสองกลม จนถงการใหลกในทองท 3 ผลการทดลองพบวา แพะแสดงอาการเปนสดอตราการผสมตดและจ านวนลกเกดไมมความแตกตางกนทางสถต (P>0.05) โดยแพะในกลมท 1และกลมท 2มระยะเวลาแสดงอาการเปนสดเทากบ39.6. ± 10.8 ชวโมงและ 35.2 ±10.7 ชวโมง และอตราการผสมมคาเทากบ 47% และ50% สรปผลการทดลองไดวาการใชฮอรโมน CIDR-G รวมกบฮอรโมนพเอมเอสจหรอฮอรโมนเอฟเอสเอชเพอเหนยวน าการเปนสดและท าการผสมเทยมสามารถท าใหแพะแสดงอาการเปนสดและมอตราการผสมตดไมแตกตางกน

ค าส าคญ พเอมเอสจ เอฟเอสเอช อตราการผสมตดแพะ

เลขทะเบยนวจย: 54(1)-0108-041 1/ส านกเทคโนโลยชวภาพการผลตปศสตว 2/ ศนยวจยการผสมเทยมและเทคโนโลยชวภาพราชบรส านกเทคโนโลยชวภาพการผลตปศสตว

Comparative Efficiency of FSH and PMSG with CIDR-G


41

on Estrus response and Pregnancy rate in Goats

Saroch Ngamkhum1/ Peerapong Sumransap2/

Abstract

The objectives of this study were to compare the results of repeated used of pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) and follicle stimulating hormone (FSH) with progesterone intra vaginal device (CIDR-G) for estrus induction and conception rate in goats. Twenty saanen goats were divided into 2 groups. Each group included 10 does that was inserted with CIDR-Gfor 13days. At the day of removed hormone, Does in the first groups was injected with PMSG 200 IU while the second group was injected with FSH 55 mg intramuscular. Estrus detection was done and all does that showed estrus sign were intra cervical inseminated with frozen semen which have total sperms 200 million per dose at the 48th and 72th h after hormone removal. Pregnancy diagnosis was done by ultrasound at 35th days after insemination then observe the kids. Then do the repeated experiment until the does gave the third kids. The results showed that there was no statistical difference between the group in estrus response and conception rate (p>0.05). Goats showed estrus by duration of estrus for both groups were 39.6. ± 10.8h and 35 . 2 ± 10. 7h and conception rate of group I was 47% and group II was 50%. It can indicated that synchronized estrus using CIDR-G with PMSG or FSH mg be the same effective in estrus response and conception rate although repeated use of PMSG or FSH

Key word: PMSG, FSH, pregnancy rate, goat Registered No. 54(1)-0108-041 1Bureau of biotechnology in livestock production 2Ratchaburi artificial insemination and biotechnology research center Bureau of biotechnology in livestock production

ค าน า


42

ปจจบนเกษตรกรมการเลยงแพะเพมขน รปแบบการเลยงสวนใหญยงเปนการเลยงแบบปลอยและใชพอพนธแพะคมฝง ซงหากไมมการจดการฝงทดและปลอยใหคมฝงเปนเวลานาน ปญหาทเกดตามมาคอ การผสมเลอดชดเปนผลใหลกมอตราการเจรญเตบโตต า สขภาพไมแขงแรง ตดโรคไดงาย และอาจท าใหเกดการแพรโรคทางระบบสบพนธ เนองจากการใชพอพนธทไมไดผานการตรวจคดกรองโรคกอนน าเขาฝง นอกจากนยงท าใหการปรบปรงพนธเปนไปอยางคอนขางชา หากพอพนธหรอแมพนธมจ านวนไมเพยงพอ การเหนยวน าการเปนสดและผสมเทยมดวยน าเชอแชแขงเปนวธทสามารถชวยแกปญหานได

ปจจบนการเหนยวน าการเปนสดในแพะเพอท าการผสมเทยม นยมใชฮอรโมนโปรเจสเตอโรนในรปแบบทส อด ไ ว ใ น ช อ ง คลอด (intravaginal device) เ ช น Controlled internal drug release – Goat (CIDR-G) (Motlomelo et al., 2002; Romano, 2004) รวมกบการฉดฮอรโมนพเ อมเอสจ (Pregnant mare serum gonadodotropins) พบวาแพะจะแสดงอาการเปนสดชดเจนท าใหก าหนดระยะเวลาการตกไขและผสมเทยมไดในระยะเวลาทเหมาะสม ฮอรโมนพเอมเอสจมระยะเวลาการออกฤทธยาวนานและราคาถก (Drion et al., 2001)ซงฮอรโมนพเอมเอสจเปนโปรตนทมโมเลกลขนาดใหญ มผลกระตนการเจรญเตบโตของฟอลเคลและการตกไข เมอใชซ าบอยๆรางกายจะมการสรางภมคมกนขนมาตอตานฮอรโมนนได ท าใหการเหนยวการเปนสดในครงตอไปอาจไมไดผลหรอไมมการตอบสนองตอฮอรโมนดงกลาว (Beckers et al., 1990; Remy et al., 1991; Bodin et al., 1995; Baril et al., 1992) ในขณะทฮอรโมนเอฟเอสเอช (Follicle stimulating hormone) ซงเปน สเตยรอยดทมโมเลกลขนาดเลก และมผลกระตนการเจรญของฟอลลเคล (Pendelton et al., 1992)เชนเดยวกบพเอมเอสจ แตไมมผลท าใหรางกายสรางภมคมกนขนมาตอตานฮอรโมน

ดงนนจงท าการศกษาเพอเปรยบเทยบผลของการเหนยวน าการเปนสดโดยใชฮอรโมนเอฟเอสเอช และพเอมเอสจ รวมกบฮอรโมนโปรเจสเตอโรนชนดสอดชองคลอดตอการแสดงอาการเปนสดและ อตราการผสมตดในแพะ


สตวทดลอง

ท าการศกษาในแมแพะนมพนธซาเนนอาย 2–5 ปจ านวน 20 ตว ทมสขภาพรางกายสมบรณ ไมเคยไดรบการเหนยวน าการเปนสดดวยฮอรโมน และผานการตรวจโรคตดตอทางระบบสบพนธ ทศนยวจยการผสมเทยมและเทคโนโลยชวภาพราชบร ระหวางเดอนมนาคม พ.ศ. 2555 ถงเดอนกนยายน 2558 แบงแมแพะออกเปน 2 กลมๆละ 10 ตวโดยวธการสมท าการเหนยวน าการเปนสดแมแพะทง 2 กลม โดยการสอดฮอรโมนโปรเจสเตอโรนชนดสอดชองคลอด (EAZI-BREEDTM CIDR® Sheep and GoatDevice, Pharmacia & Upjohn, NSW) เปนเวลา 13 วน และในวนทถอดฮอรโมนแพะในกลมท 1 ฉดพเอมเอสจเขากลามเนอขนาด 200 IU. (Folligon®, Intervet International BV, Holland) กลมท2 ฉดเอฟเอสเอชเขากลามเนอขนาด 55 mg. (Folltropin®, Vetoquinol, Canada) ตรวจการแสดงอาการเปนสดหลงถอด CIDR-Gทก 3 ชวโมง

วธการทดลอง


43

แพะทงสองกลมท าการผสมเทยมดวยน าเชอแชแขงทมจ านวนตวอสจ 200 ลานตว/โดส จ านวน 2 ครง ท 48 ชวโมง และ 72 ชวโมงภายหลงถอด CIDR-G โดยปลอยน าเชอบรเวณคอมดลก ตรวจการตงทองดวยเครองอลตราซาวดหลงจากผสมเทยม 35 วน และตดตามลกเกดโดยแพะทไมตงทองจะเหนยวน าการเปนสดและผสมเทยมจนกวาจะตดตงทอง ซงแพะทใหลกในทองแรกแลว จะท าการพกทอง 3 เดอนและเรมเขาสการทดลองซ าจนกวาจะใหลกครบ 3 ทองตดตอกน

การวเคราะหทางสถต

วเคราะหทางสถต เปรยบเทยบการแสดงอาการเปนสดและอตราผสมตดดวยใช chi-square test ทระดบความเชอมนรอยละ 95(p<0.05)

ผลการทดลองและวจารณ

แพะในกลมทเหนยวน าการเปนสดดวย CIDR-G รวมกบ พเอมเอสจมอตราการเปนสดสงสดในครงแรกของการเหนยวน าและจะคอยๆลดลง ในรอบการการเหนยวน าการเปนสดถดมา แตไมแตกตางกนอยางมนยส าคญ และมระยะเวลาการแสดงการเปนสดทไมแตกตางกน โดยมระยะเวลาการแสดงการเปนสดเฉลย 39.6±10.8 ชม. อตราการผสมตดและจ านวนลกเกดในแตละรอบการใหลกไมมความแตกตางกน โดยมอตราการผสมตดรอยละ47และจ านวนลกเกดเฉลยเทากบ 1.2 ตว จ านวนครงของการผสมเทยมทท าใหเกดการตดตงทองในแตละรอบของการใหลก พบวาผสมเทยมครงเดยวแลวตดตงทองจะมจ านวนสงสด รองลงมาเปนการผสมเทยมสองครง และใชการผสมเทยมสามครงตามล าดบ(Figure 1)

Figure 1 Services per conception in each born kids of goats induced estrus with CIDR-G and PMSG

0

2

4

6

8

10

12

first born kids second born kids third born kids

1 time AI 2 times AI 3 times AI


44

แพะกลมทเหนยวน าการเปนสดดวย CIDR-G รวมกบฮอรโมนเอฟเอสเอชในขนาด 55 mgพบวาในการเหนยวการเปนสดครงแรกนน มอตราการตอบสนองตอการเหนยวน าเปนสดทสงสดและจะลดลง เมอจ านวนครงการเหนยวน าเปนสดเพมขน แตไมแตกตางกนทางสถตและมระยะเวลาการแสดงการเปนสดทไมแตกตางกน โดยมระยะเวลาการแสดงการเปนสดเฉลย 35.2 ± 10.7 ชม. อตราการผสมตดและจ านวนลกเกดในแตละรอบการใหลกไมมความแตกตางกน โดยมอตราการผสมตดรอยละ50และจ านวนลกเกดเฉลยเทากบ 1.3ตว จ านวนครงของการผสมเทยมทท าใหเกดการตดตงทองในแตละรอบของการใหลก พบวาท าการผสมเทยมครงเดยวแลวตดตงทองจะมจ านวนสงสด รองลงมาเปนการผสมเทยมสองครง และใชการผสมเทยมสามครงตามล าดบ (Figure 2)

Figure 2 Services per conception in each born kids of goats induced estrus with CIDR-G and FSH

แพะในกลมทเหนยวน าการเปนสดดวย CIDR-G รวมกบพเอมเอสจ กบกลมทเหนยวน าการเปนสดดวย CIDR-G รวมกบเอฟเอสเอชนน กลมทใชพเอมเอสจมอตราการตอบสนองตอการเหนยวน าเปนสดทต ากวา แตไมแตกตางกนอยางมนยส าคญ ระยะเวลาทเรมแสดงการเปนสดในกลมทใช พเอมเอสจคอ 33.2±9.6 ชม. ซงชากวากลมทใชเอฟเอสเอชทใชระยะเวลา 28.0 ±7.8 ชม. และมระยะเวลาการแสดงการเปนสดทไมแตกตางกน กลมทใชพเอมเอสจมระยะเวลาการแสดงการเปนสดเฉลย 39.6±10.8 ชม. กลมทใชเอฟเอสเอชมระยะเวลาการแสดงการเปนสดเฉลย 35.2±10.7 ชม. อตราการผสมตดและจ านวนลกเกดในทงสองกลมไมมความแตกตางกน โดยมอตราการผสมตดรอยละ 47 และ 50 สวนจ านวนลกเกดเฉลยเทากบ 1.2 และ 1.3 ตว ตามล าดบ (Table 1)

0

1

2

3

4

5

6

first born kids second born kids third born kids

1 time AI 2 times AI 3 times AI


45

Table 1 Comparison the Pregnancy rate, estrus response and number of kids in goats induced estrus used CIDR-G withPMSGand CIDR-Gwith FSH

Treatment groups

Estrus response

(%)

Onset of estrus (h)

Estrus duration (h)

Pregnancy rate (%)

PMSG 94.4 33.2±9.6 39.6±10.8 47

FSH 96 28.0±7.8 35.2±10.7 50

ฮอรโมนพเอมเอสจ นยมใชรวมกบฮอรโมนโปรเจสเตอโรนในการเหนยวน าการเปนสดและผสมเทยมในแพะ ขนาดทใชมความแตกตางกนคอนขางมาก ตงแต 200-600 IU (Amarantidis et al., 2004; Leboeuf et al., 1998) ฮอรโมนพเอมเอสจมระยะเวลาในการในการออกฤทธยาวนาน (Drion et al., 2001; Fonseca et al., 2005) พบวาการใชฮอรโมนพเอมเอสจรวมในการเหนยวน าการเปนสดในแพะ นอกจากจะท าใหประสทธภาพการสบพนธสงขนแลวยงสงผลท าใหจ านวนลกตอครอกเพมสงขนดวย แตกมการศกษาตอมาทพบวาการใชฮอรโมนพเอมเอสจ ซ าจ านวน 5 ครง อาจจะกระตนการสรางแอนตบอด ซงจะสงผลตอประสทธภาพของฮอรโมน (Becker et al., 1990; Bodin et al., 1995; Remy et al., 1991) อาจพบการเปนสดหรอตกไขลาชาหรออาจท าใหไมแสดงการเปนสด จากการเพมขนแอนตบอดตอฮอรโมน (Baril et al., 1996) แตในการศกษาครงนซงใชฮอรโมนพเอมเอสจในขนาด 200 IU ไมพบการลดลงของประสทธภาพระบบสบพนธ แมจะมการลดลงในการตอบสนองการเปนสด และอตราการผสมตด เมอจ านวนครงในการใชฮอรโมนเพอเหนยวน าการเปนสดเพมขน สวนระยะเวลาการแสดงการเปนสดและจ านวนลกเกดมแนวโนมทเพมขน แตไมมความแตกตางกนซงแตกตางกบการศกษาของ Baril et al. (1992) ทพบวาการใชฮอรโมนพเอมเอสจซ าในการเหนยวน าการเปนสดจะสงผลใหประสทธภาพในการเหนยวน าการเปนสดลดลงอยางมนยส าคญโดยการใชฮอรโมนPMSGครงแรกจะมประสทธภาพในการเหนยวน าการเปนสดทดทสด

สวนฮอรโมนเอฟเอสเอชทมฤทธในการกระตนการเจรญของกระเปาะไขไดเหมอนฮอรโมนพเอมเอสจ แตจะมผลท าใหระยะเวลาการแสดงการเปนสดทยาวนานกวา รวมทงอาจท าใหจ านวนกระเปาะไขทเจรญเตมทมมากขน (Drion et al., 2001; Amoah and Gelaye, 1990)มกถกใชในแพะเพอกระตนการเปนสดและท าใหเกดการตกไขหลายใบ โดยพบวามประสทธภาพในการกระตนเพมการตกไขทดกวา PMSG ทงในแงปรมาณและคณภาพ (Pendelton et al., 1992; Rosnina, et al., 1992; Tsunada and Sugies, 1989) Knight et al.(2001) ใ ชฮอรโมนเอฟเอสเอชขนาด 55 มก. รวมกบโปรเจสเตอโรนในการเหนยวน าการเปนสดในแกะ ไดผลอตราการผสมตดครงแรกรอยละ 49 เปอรเซนต และพบวาการตอบสนองการเปนสด จ านวนกระเปาะทมากขนและขนาดของกระเปาะไขทใหญกวา รวมทงอตราการตกไขทมากวาเมอเปรยบเทยบกบการใชฮอรโมนโปรเจสเตอโรนเพยงอยางเดยว Pendleton et al.(1992) ใชฮอรโมนโปรเจสเตอโรน รวมกบฮอรโมนเอฟเอสเอช ขนาด 24 มก.โดยแบงฉดเปน 4 ชวงเวลา พบอตราการเปนสด 88 เปอรเซนต ซงใกลเคยงกบการศกษาในครงน โดยเมอใชฮอรโมน


46

เอฟเอสเอชซ า เพอเหนยวน าการเปนสดและผสมเทยมในวงรอบการใหลกถดมา ไมพบการลดลงของประสทธภาพระบบสบพนธ การตอบสนองการเปนสด ระยะเวลาการแสดงการเปนสดรวมทงอตราการผสมตดมแนวโนมลดลงแตไมมความแตกตางตามจ านวนครงในการใชฮอรโมนเพอเหนยวน าการเปนสดทเพมขน สวนคาเฉลยจ านวนลกเกดแมมแนวโนมทเพมขน แตกไมมความแตกตางกนและเมอเปรยบเทยบการใชฮอรโมน CIDR-G รวมกบฮอรโมนพเอมเอสจหรอใชฮอรโมน CIDR-G รวมกบฮอรโมนเอฟเอสเอชเพอเหนยวน าการเปนการเปนสดซ าหลายๆครง พบวามประสทธภาพไมแตกตางกน โดยแพะทงสองกลมมอตราตอบสนองตอการเปนสด ระยะเวลาแสดงการเปนสดอตราการผสมตดและจ านวนลกเกดไมแตกตางกนแตกตางจากการศกษาของ Becker et al. (1990) Bodinet al. (1995) รวมทง Remy et al.(1991 ) ซงอาจเปนผลมาจากขนาดของฮอรโมนพเอมเอสจ 200 IU ใชในการศกษาครงนเปนขนาดทคอนขางต า ถงแมจะมการใชซ าหลายครง โอกาสทจะเกดแอนตบอดกจะนอย สวนขนาดของฮอรโมนเอฟเอสเอช 55 mg ทใชถงแมจะมขนาดในเกณฑสง แตเมอเทยบกบโอกาสทจะเกดแอนตบอดทนอยกวา จงท าใหผลการทดลองในครงนไมพบความแตกตางกน


การเหนยวน าการเปนสดโดยใชฮอรโมนโปรเจสเตอโรนชนดสอดชองคลอดรวมกบฮอรโมนพเอมเอสจ หรอรวมกบฮอรโมนเอฟเอสเอชเพอผสมเทยมสามารถท าใหแพะแสดงอาการเปนสดและมอตราการผสมตดไมแตกตางกนและการเหนยวน าการเปนสดรวมกบฮอรโมนพเอมเอสจซ า พบวาสามารถกระตนใหแพะแสดงอาการเปนสด และตงทองไดตามปกต

ขอเสนอแนะ

การเหนยวน าการเปนสดในแพะโดยใชฮอรโมนโปรเจสเตอโรนชนดสอดชองคลอดรวมกบฮอรโมนพเอมเอสจ หรอฮอรโมนเอฟเอสเอช ตองพจารณาถงตนทนของฮอรโมนทมตนทนต ากวา ในการทดลองนพบวาตนทนของฮอรโมนกลมท 1 ฉดฮอรโมนพเอมเอสจ 200 IU. เทากบ 350 บาท และกลมท 2 ฉดฮอรโมนเอฟเอสเอช 55 mgเทากบ 500 บาท

กตตกรรมประกาศ

ขอขอบคณผมสวนรวมในการศกษาวจย เจาหนาทผเลยงดแพะ และเจาหนาทหองปฏบตการของศนยวจยการผสมเทยมและเทคโนโลยชวภาพราชบร ทใหความชวยเหลอในดานปฏบตการ การเกบขอมล และการอ านวยความสะดวกตางๆ ทท าใหการศกษาวจยครงนส าเรจลลวงดวยด


47


Amarantidis, I., A. Karagiannidis, P.H. Saratsi and P. Brikas, 2004. Efficiency of methods used for estrous synchronization in indigenous Greek goats. Small Ruminant Research 52: 247–252.

Amoah, E.A. and S. Gelaye, 1990. Superovulation, synchronization and breeding of does.Small Rum. Res. 3:63-72.

Baril, G., B. Remy, J.C. Vallet and J.F. Beckers, 1992. Effectof repeated use of progestagen- PMSG treatment for estruscontrol in dairy goats out of the breeding season. Reprod.Dom. Anim., 27:161-168.

Baril, G., B. Remy, B. Leboeuf, J.F. Beckers and J. Saumane, 1996. Synchronisation of estrus in goats: the relationship between CG binding in plasma, time occurrence of estrus and fertility following insemination. Theriogenology, 45:1553-1559.

Beckers, J.F., G.Baril, J.C. Vallet, D. Chupin, B. Remy and J. Saumane, 1990. Are porcine follicle stimulating hormone antibodies associated with decreased superovulatory response in the goats. Theriogenology, 33:192-196.

Bodin, L., P.V. Drion, B. Remy, M.C. Maurel and J.F. Beckers, 1995. Effect of repeated PMSG treatment on sheep reproduction.46th Annual meeting of the European Association for animal production. Prague, Czech Republic.

Drion, P.V., V. Furtoss, G. Baril, E. Manfredi, F. Bouvier, J.L. Pougnard, D. Bernelas, P. Caugnon, E.M. McNamara, B. Remy, J. Sulon, J.F. Beckers, L. Bodin and B. Leboeuf, 2001. Four years of induction/synchronization of estrus in dairy goats. Reprod. Nutr. Dev. pp 401-412.

Fonseca, J.F., J.H. Bruschi, Zambrini, F.N. Demczuk, J.H.M. Viana and M.P. Palhao, 2005. Induction of synchronized estrus in dairy goats with different gonadotrophins. Anim. Reprod. 2: 50-53.

Knights, M., T. Hoehn, P.E. Lewis and E.K. Inskeep, 2001. Effectiveness of intravaginal progesterone inserts and FSH for inducingsynchronized estrus and increasing lambing rate in anestrous ewes. J. Anim Sci. 79:1120-1131.

Leboeuf, B., E. Manfredi, P. Boue, A. Piacére, G. Brice, G. Baril, C. Broqua, P. Humblot, and M. Terqui, 1998. Artificial insemination of dairy goats in France.Livest. Prod. Sci. 55, 193-203.


48

Motlomelo, K.C., J.P.C. Greyling and L.M.J. Schwalbach. 2002. Synchronisation of oestrus in goats: the use of different progestagen treatments. Small Rumin. Res. 45, 45-49.

Pendleton, R.J., C.R. Youngs, R.W. Rorie, S.H. Pool, M.A. Memonand R.A. Godke, 1992. Comparison of fluorogestone acetate sponges with norgestomet implants for induction of estrus and ovulation in anestrous dairy goats. Small Rumin. Res. 8, 269-273.

Remy, B., G. Baril, J.C. Vallet, R. Dufour, C. Chouvet, J. Saumande, D. Chupin and J.F Beckers, 1991. Are antibodies responsible for a superovulatory response in goats which have been treated repeatedly with porcine follicle stimulating hormone. Theriogenology. 36, 389-399.

Romano, J.E., 2004. Synchronization of estrus using CIDR, FGA or MAP intravaginal pessaries during the breeding season in Nubian goats.Small Rumin. Res. 55:15-19.

Tsunada, Y. and T. Sugies, 1989. Superovulation in nonseasonable Japanese native goats with special reference to the developmental progression of embryos. Theriogenology. 31: 991-996.


49

ระยะเวลาผสมเทยมหลงเหนยวน าการเปนสดตออตราการผสมตด

ในแพะเนอลกผสม

กตตศกด แสงสกล1/สนชย วโรจนวฒกล1/

บทคดยอ

การศกษาในครงนมวตถประสงคเพอศกษาระยะเวลาผสมเทยมหลงเหนยวน าการเปนสดตออตราการผสมตดในแพะเนอลกผสม โดยท าการศกษาระหวางเดอนมกราคม พ.ศ.2557 – ธนวาคม พ.ศ. 2558 ในแพะเนอลกผสมในฟารมเกษตรกรเขตจงหวดชลบร จ านวน 40 ตว การทดลองท 1 ศกษาระยะเวลาทแพะแสดงอาการเปนสดหลงจากเหนยวน าการเปนสดโดยใชโปรแกรมการเหนยวน าการเปนสดดวยฮอรโมน progesterone ชนดสอดชองคลอดรวมกบ PG และ PMSG ท าการตรวจการเปนสดดวยพอพนธทกๆ 3 ชวโมง การทดลองท 2 ศกษาระยะเวลาผสมเทยมตออตราการผสมตด โดยแบงแพะออกเปน 2 กลมเทาๆ กน เพอผสมเทยมตามระยะเวลา ทก าหนดจากการเหนยวน าการเปนสดดวยฮอรโมน โดยกลมท 1 ผสมเทยมโดยใชน าเชอแชแขงในชวโมงท 48 และ 72 หลงจากถอดฮอรโมน progesterone และกลมท 2 ผสมเทยมโดยใชน าเชอแชแขงในชวโมงท 12 และ 36 หลงจากแสดงอาการเปนสดยนนง ผลการทดลองพบวาแพะเนอลกผสมแสดงอาการเปนสดยนนงเฉลยท 25.96±5.11 ชวโมงหลงถอดฮอรโมน และมระยะเวลาเปนสดนาน เฉลย 18.60±3.73 ชวโมง อยางไรกด กลมทดลองมอตราการผสมตดไมแตกตางกบกลมควบคม คอมอตราการผสมตดทรอยละ 50 และ 55 ตามล าดบ

ค าส าคญ: ระยะเวลาผสมเทยม โปรแกรมการเหนยวน าการเปนสด แพะ อตราการผสมตด

เลขทะเบยนวจย: 58(1)-0208-004 1/ศนยวจยการผสมเทยมและเทคโนโลยชวภาพชลบร อ. บานบง จ. ชลบร


50

Effect of insemination time on conception rate after estrus synchronization

in crossbred meat goats

Kittisak Sangsakul1/ Sinchai Wirojwutthikul1/

Abstract

The objective of this study was to determine the effect of insemination time on conception rate after estrus synchronization in crossbred meat goats. This was performed in 40 crossbred meat goats in local farms located at Chonburi province, during January 2014– December 2015. The experiments of this study consisted of 2 parts. The first part was conducted to study the appropriate time of estrus after applying an estrus synchronization program with intra-vaginal progesterone, prostaglandin and PMSG injection. Heat detection was administered every 3 hours in order to evaluate the estrus period. Then, the second experiment was approached to assess the effect of insemination time on conception rate. All experimental goats were divided equally into 2 groups. In control group, the goats were inseminated twice using frozen semen at 48 and 72 hours after progesterone withdrawal while the experimental group were inseminated at 12 and 36 hours after onset of standing heat detection. The result of this study showed that the average onset of estrus could be detected at 25.96±5.11 hours after progesterone withdrawal. The average of estrus period was 18.60± 3.73 hours. However, the conception rate between control and experimental groups was not significantly different which was 50% and 55%, respectively.

KEYWORDS: ARTIFICIAL INSEMINATION TIME, SYNCHRONIZATION PROGRAM, GOATS, CONCEPTION RATE

Registered No: 58(1)-0208-004 1/ Chonburi Artificial Insemination and Biotechnology Research Center Banbueng Chonburi.


51

ค าน า

เทคโนโลยการผสมเทยมเปนแนวทางหนงในการปรบปรงและขยายพนธแพะดวยการเหนยวน าใหเกดการเปนสดพรอมกนและผสมเทยมในระยะเวลาทก าหนดไว สามารถชวยใหการจดการผสมพนธไดสะดวกประหยดเวลาและคาใชจายในการออกปฏบตงานของเจาหนาทโดยการเหนยวน าการเปนสดในแพะ คอการควบคมระยะ luteal phase ในวงรอบของการเปนสด (estrous cycle) โดยใชฮอรโมน progesterone การกระต นใหเกดการเปนสดและตกไขในระยะเวลาท ตองการ (premature luteolysis) (Amoah and Gelaye, 1990; Wildeus, 1999) โดยฮอรโมน progesterone ทใชในการเหนยวน ามหลายรปแบบ นยมใชกนมากในแพะ คอ controlled internaldrug-releasing device (CIDR-G) ซงเปนแทงซลโคน มตวยาเปน progesterone ฉาบอย ส าหรบสอดเขาไวในชองคลอด (Knights et al., 2001)

จากผลการศกษาทผานมาพบรายงานการศกษาโปรแกรมการเหนยวน าการเปนสดเพอการผสมเทยม

โดยใชฮอรโมน progesterone รวมกบ PMSG และ PGF2α ขนาดตงแต150 IU – 500 IU และก าหนดเวลาในการผสมเทยมแพะดวยน าเชอแชแขงในชวโมงท 48 และ 72 พบวาสามารถเหนยวน าการเปนสดไดเปนอยางด และอตราการผสมตด 52% (นวตน และคณะ, 2550; Bongso et al.,1982) ในขณะท Dogan et al. (2005) รายงานวาการผสมเทยมแพะภายหลงการเหนยวน าการเปนสดชวโมงท 36 และ48 หลงถอดฮอรโมน progesterone ดวยน าเชอสดมอตราการตงทองเฉลยสงถง 70% ซงไมแตกตางกบการผสมเทยมในแพะทเปนสดโดยธรรมชาต สวน Motlomelo et al. (2002) เหนยวน าการเปนสดในแพะพนธบอร ดวย CIDR พบวาแพะยนนง ชวโมงท 27 หลงจากถอด CIDR ท าการผสมเทยมแบบก าหนดเวลาดวยน าเชอสด ในชวโมงท 48 และ 60 พบวามอตราการตงทอง 47% ทงนแตละโปรแกรมขนอยกบชวงทแพะแสดงอาการเปนสดซงแตกตางกนไปในแตละสายพนธ (Bretzlaff and Madrid, 1989; Waldrona et al., 1999) ตงแต 22–30 ชวโมงหลงถอดฮอรโมน (Greyling and van Niekerk, 1986; Akusu and Egbunike, 1984)

วตถประสงคเพอศกษาชวงเวลาการเปนสดของแพะเนอลกผสมทไดรบการเหนยวน าการเปนสดดวยฮอรโมนและก าหนดเวลาผสมเทยมทเหมาะสมทอาจสงผลใหมอตราการผสมตดทสงขน


52


แพะทดลอง แพะเนอลกผสมทเคยใหลกมาแลวอยางนอย 1 ตว อายประมาณ 2-4ป มรางกายสมบรณแขงแรงในฟารมเกษตรกรเขตจงหวดชลบรจ านวน 40 ตว กอนเขาสงานทดลองไดรบการถายพยาธดวยยาฉด IVERMEC-F และฉดวตามน AD3E ท าการศกษาระหวางเดอนมกราคม 2557– ธนวาคม 2558 วธการทดลอง การทดลองท 1 การศกษาระยะเวลาทแพะแสดงอาการเปนสดหลงจากเหนยวน าการเปนสด

แพะทงหมดไดรบการเหนยวน าการเปนสดดวยโปรแกรมการเหนยวน า (Figure 1) ดงน

Day 0 สอดฮอรโมน Progesterone ชนดสอดเขาชองคลอด (CIDR-G; EAZI-BREED, CIDR®, Pharmacia & Upjohn)

Day 14 ฉดฮอรโมน PMSG (Folligon®, Intervet International B.V., Holland) ปรมาณ 150 IU (0.75 ml.) และฉดฮอรโมน PGF2α (Estrumate®, Essex Animal Health, Germany) ปรมาณ 125 µg. เขากลามเนอ

Day 16 ถอดฮอรโมน CIDR-G Day 17 สงเกตอาการเปนสด หลงถอดฮอรโมน CIDR-G โดยใชพอพนธตรวจการเปนสดทกๆ 3 ชวโมง

บนทกอาการและเวลาเปนสดตงแตแพะเรมแสดงอาการเปนสด (onset) จนกระทงเปนสดยนนงยอมใหพอแพะขนข (standing heat) จนถงไมแสดงอาการแลว

Insert PMSG Remove

CIDR-G PGF2α CIDR-G

Detect heat

D 0 D 14 D 16

Figure 1 Estrous synchronization program

วเคราะหขอมลชวโมงทแพะเปนสดยนนงภายหลงถอดฮอรโมน progesterone และระยะเวลาทแสดงอาการเปนสดดวยดวยสถตพรรณนา

การทดลองท 2 ศกษาระยะเวลาผสมเทยมตออตราการตงทองโดยแบงแพะออกเปน 2 กลมเทาๆ กน ดวยวธการสม เพอผสมเทยมตามระยะเวลาดงน

กลมท 1 กลมควบคมโดยเหนยวน าการเปนสดดวยฮอรโมนตามโปรแกรมในการทดลองท 1 และผสมเทยมโดยใชน าเชอแชแขงทมอสจอย 200 ลานตว และมอตราการเคลอนทของอสจ 40% ในชวโมงท 48 และ 72 หลงจากถอดฮอรโมน progesterone (นวตน และคณะ,2550) บนทกขอมลการผสมเทยม (Figure 2)

X


53

Insert PMSG Remove

CIDR-G PGF2α CIDR-G AI 1 AI 2

D 0 D 14 D 16 48 hr. 72 hr.

Figure 2 Estrous synchronization program and fixed-time AI (Group 1)

กลมท 2 กลมทดลอง เหนยวน าการเปนสดดวยฮอรโมนตามโปรแกรมในการทดลองท 1 และผสมเทยมโดยใชน าเชอแชแขงทมอสจอย 200 ลานตว และมอตราการเคลอนทของอสจ 40% ในชวโมงท 12 และ 36 ภายหลงแพะแสดงอาการเปนสดยนนง และบนทกขอมลการผสมเทยม (Figure 3)

Insert PMSG Remove

CIDR-G PGF2α CIDR-G AI 1 AI 2

Standing heat

D 0 D 14 D 16 12 hr. 24 hr.

Figure 3 Estrous synchronization program and Fixed-time AI (Group 2)

ตรวจการตงทองแมแพะทง 2 กลม ภายหลงการผสมเทยมอยางนอย 45 วนดวยเครองอลตราซาวดและวเคราะหเปรยบเทยบความแตกตางของอตราการผสมตดดวยวธ Chi-Square


การศกษาระยะเวลาทแพะแสดงอาการเปนสดหลงการเหนยวน าดวยฮอรโมนพบวาแพะแสดงอาการเปนสดยนนงตงแต 18 ชวโมง จนถง 39 ชวโมงหลงถอดฮอรโมน โดยมจ านวนแพะทแสดงอาการเปนสดสงสด คอ 12 ตว จาก 40 ตว ท 24 ชวโมง (Figure 4)

X


54

Figure 4 Frequency distribution of onset of estrous following CIDR-G withdrawal in does

เมอวเคราะหหาคาเฉลยทสตวแสดงอาการเปนสด พบวาแพะเนอลกผสม จะแสดงอาการเปนสดเฉลย ท 25.96±5.11 ช ว โมงหลงถอดฮอร โมน (Table 1) ซ ง ใหผลใกล เคยงกบ Akusu and Egbunike (1984) ท

ท าการศกษาในแพะพนเมองแอฟรกนตะวนตก โดยการเหนยวน าการเปนสดดวย Postraglandin F2α พบวา แพะแสดงอาการเปนสดยนนงเฉลย 22.4±8.6 ชวโมง และ Bretzlaff and Madrid (1989) ท าการศกษาการเหนยวน าการเปนสดในแพะนม โดยใชฮอรโมน progesterone ชนดสอดชองคลอด รวมกบ PG และ PMSG พบวาแพะแสดงอาการเปนสดยนนงท 22±6.3 ชวโมงหลงถอดฮอรโมน

Table1 Mean and SD of onset of estrous after CIDR-G withdrawal and estrous periods in does

Parameters Mean SD Min Max

Onset of estrous after CIDR-G withdrawal (hr.) 25.96 5.11 18 39

Estrous periods (hr.) 18.60 3.73 12 27

ในการศกษาครงนเปนแพะเนอลกผสมทมสายเลอดของแพะพนธบอร ซงแสดงอาการเปนสดยนนงท

25.96±5.11 ชวโมง และมระยะเวลาเปนสดสนเพยง 18.6±3.73 ชวโมง เมอเปรยบเทยบกบ Motlomelo et al. (2002) ซงศกษาในแพะบอรพนธแท พบวาแพะแสดงอาการเปนสดยนนงท 27.2±0.4 ชวโมงหลงถอดฮอรโมน progesterone และมชวงระยะเวลาเปนสดทคอนขางนาน 35.2±0.7 ชวโมง ในขณะทพระพงษ และคณะ (2552) ท าการศกษาการเหนยวน าการเปนสดในแพะนมลกผสม โดยใชฮอรโมน progesterone ชนดสอดชองคลอด รวมกบ PG และ PMSG พบวาแพะมระยะเวลาแสดงอาการเปนสดท 48.2±7.4 ชวโมง นบจากเรมแสดงอาการเปนสด

0

2

4

6

8

10

12

14

18 21 24 27 30 33 36 39

(No

. of

do

es)

Onset of estrous following CIDR-G withdrawal (hr.)


55

ในวงรอบการเปนสดของแพะ เมอแพะเรมแสดงอาการเปนสด อกประมาณ 30-36 ชวโมง จะเกดกระบวนการตกไข (เทวนทร, 2542) ดงนนจ าเปนตองท าการผสมเทยมกอนการตกไข เนองจากอสจตองใชเวลาเดนทางในทอน าไขและเกดขบวนการเตรยมพรอมเพอเขาปฏสนธกบไขได ดงนนจากผลการศกษาในครงน พบวาแพะแสดงอาการเปนสดเฉลยท 25.96±5.11 ชวโมงหลงถอดฮอรโมน ดงนนจงท าการผสมเทยมครงท1 ท 44 ชวโมง และผสมเทยมครงท 2 ท 68 ชวโมงหลงถอดฮอรโมน

การศกษาระยะเวลาผสมเทยมตออตราการผสมตด พบวา แพะกลมควบคมทผสมเทยมทชวโมง 48 กบ 72 ชวโมงหลงถอดฮอรโมน มอตราการผสมตดไมแตกตางกนทางสถตกบแพะทผสมเทยมภายหลงการเปนสดยนนงท 12 ชวโมงและ 36 ชวโมง คอม 50% และ 55% ตามล าดบ (Table 2)

Table 2 Conception rate in does.

Control Group Treatment Group P value

No. of does 20 20

Conception rate (%) 50 55 0.78

จากผลการศกษาในครงน พบวาแพะทง 2 กลมมอตราการผสมตดไมแตกตางกน ทงนเนองจากการผสมเทยมอยในชวงเวลาทไมแตกตางกนมากนก และเปนชวงเวลาทกอนจะมการตกไขและใหผลใกลเคยงกบการศกษาทผานมา พบวาในป พ.ศ. 2550 มการศกษาเหนยวน าการเปนสดในแพะพนธซาเนน ดวยฮอรโมนprogesterone รวมกบ PGF2α และ PMSG ในการผสมเทยมแบบก าหนดเวลาดวยน าเชอแชแขงในชวโมงท 48 และชวโมงท 72 พบวามอตราการผสมตดทรอยละ 52 (นวตนและคณะ2550) และพระพงษและคณะ (2552) ไดทดลองเหนยวน าการเปนสดดวย ฮอรโมน PMSG และผสมเทยมแพะพนธซาเนน พบวาอตราการผสมตดเทากบรอยละ 47-50 ตอมาในป พ.ศ. 2553 พระพงษและสาโรช ศกษาผลของใช CIDR®และ Chornogest ในการเหนยวน าการเปนสดและผสมเทยมในแพะซาเนน พบวามอตราการผสมตดเทากบรอยละ 39.9-43.1 ในขณะท Holtz et al. (2008) ใชน าเชอแชแขงผสมเทยมแพะทไดรบการเหนยวน าพบวามอตราการผสมตดใกลเคยงกน คอรอยละ 58 โดยผสมเทยมครงเดยวท 46 ชวโมงภายหลงถอดฮอรโมนprogesteroneชนดฟองน าสอดชองคลอดมอตราผสมตดทรอยละ 48.7 (Arrebola et al., 2012) และDogan et al. (2004) ศกษาเปรยบเทยบฮอรโมนฟรออโรเจสโตนและเมดดรอกซโปรเจสเตอโรนแบบฟองน าชนดสอดชองคลอดเหนยวน าการเปนสดและผสมเทยมครงเดยวชวโมงท 48 หลงถอดฮอรโมน progesterone พบวามอตราผสมตดรอยละ 52.6 และ 50 ตามล าดบ


แพะเนอลกผสมทเหนยวน าการเปนสดดวยฮอรโมน progesterone ชนดสอดชองคลอด รวมกบ PG และ PMSG จะแสดงอาการเปนสดยนนงเฉลยท 25.96±5.11 ชวโมงหลงถอดฮอรโมน มระยะเวลาเปนสดนานเฉลย 18.60±3.73 ชวโมง และการผสมเทยมท 12 และ 36 ชวโมงภายหลงแพะแสดงอาการเปนสดยนนง มผลตออตราการผสมตดไมแตกตางกบการผสมเทยมแบบก าหนดเวลาท 48 และ 72 ชวโมงภายหลงถอดฮอรโมน progesterone


56


ปจจบนการผสมเทยมแพะเขามามบทบาทส าคญในการปรบปรงและขยายพนธแพะ ซงสวนใหญยงเปนการใหบรการโดยเจาหนาท จากผลการทดลองพบวาทง 2 โปรแกรมมผลตออตราการผสมตดไมแตกตางกน การผสมเทยมแบบก าหนดเวลาท 48 และ 72 ชวโมงภายหลงถอดฮอรโมน progesterone สามารถชวยใหการจดการแผนการด าเนนงานไดสะดวก ประหยดเวลาและคาใชจายในการออกปฏบตงานของเจาหนาท สวนในกรณทฟารมเกษตรกรสามารถจบสดไดแมนย า อาจพจารณาใชการผสมเทยมท 12 และ 36 ชวโมง ภายหลงการแสดงอาการเปนสด ซงมแนวโนมท าใหอตราการผสมตดดกวา

กตตกรรมประกาศ

งานวจยน ไดรบการสนบสนนจากส านกงานคณะกรรมการวจยแหงชาต (วช.) คณะผวจย ขอขอบคณคณจตพร พงษเพง นกวชาการสตวบาลช านาญการพเศษ น.สพ.อรณ จนทรกระจาง ผอ านวยการศนยวจยการผสมเทยมและเทคโนโลยชวภาพสระบร และเจาหนาทของศนยวจยการผสมเทยมและเทคโนโลยชวภาพสงขลา ทใหการชวยเหลอและสนบสนนใหสามารถด าเนนการวจยเปนไปตามวตถประสงค


เทวนทร วงษพระลบ. 2542. การสบพนธในสตวเลยง. ภาควชาสตวศาสตร คณะเกษตรศาสตร มหาวทยาลยขอนแกน, ขอนแกน. นวตน ถาวระ อนนทเทองสนเทยะ และบรรลอ กล าพล. 2550. การเหนยวน าการเปนสดดวย CIDR®และ PGF2α

รวมกบ PMSG ตอการผสมตดของแพะพนธซาเนน. วารสารเทคโนโลยชวภาพการผลตปศสตว. ปท 2 ฉบบท 1 สงหาคม 2550. หนา 1-7.

พระพงษ ส าราญทรพย สาโรช งามข า อนนท เทองสนเทยะ และณรงค เลยงเจรญ . 2552. ประสทธภาพการลดฮอรโมน PMSG ในการเหนยวน าการเปนสดและผสมเทยมดวยน าเชอแชแขง ในแพะ.ว.เทคโนโลยชวภาพการผลตปศสตว 4(1):16-23. Akusu, M. O., and G.N. Egbunike. 1984. Fertility of West African Dwarf goat in its native

environmentfollowing prostaglandin F2α induced estrus. Vet. Q. 6:173–176. Amoah, E. A., and S. Gelaye. 1990. Superovulation, synchronization and breeding of does.

Small Rumin. Res. 3:63–72.

Arrebola, F.A., B. Pardo, M.Sanches, M.D. Lopez and C.C. Perez-Marin, 2012. Factor influencing the successof an artificial insemination program in Florida goats. Spanish Journal of Agricultural Research. 10(2): 338- 344.


57

Bongso, T.A., I. FatimahandS.Dass. 1982. Synchronisation of oestrus of goat treated with progestagen-impregnated intravaginal sponges and PMSG, and reproductive performance following natural mating or A.I. with frozen semen. 5(2): 111 -116.

Bretzlaff, K.N. and N. Madrid. 1989. Clinical use of Norgestromet ear implants or intravaginal pessaries for synchronization of estrus in anestrous dairy goats.

Theriogenology. 24(2): 419-423.

Dogan, I., Z. Nur, U. Gunay, M.K. Soylu and C. Sonmez. 2004. Comparison of fluorgestone and medroxyprogesterone intravaginal sponges for oestrus synchronization in Saanen does during the transition period.South African Journal of Animal Science. 34(1): 18-22.

Dogan, I., Z. Nur, U. Gunay, H. Sagirkay, M.K. Soylu and C.Sonmez. 2005. Estrous synchronization during the natural breeding season in Anatolian black does. Vet. Med. – Czech (1): 33-38.

Greyling, J. P. C., and C. H. van Niekerk. 1986. Synchronization of oestrus in the Boer goat doe: Does effect of prostaglandin in the double injection regime. S. Afr. J. Anim. Sci. 16: 146-150.

Holtz, W. H., H. Sohnrey, M. Gerland and M. A. Driancourt. 2008.Ovsynch synchronization and fixed-time insemination in goats.Theriogenology.69(7): 785-792.

Knights, M., T. Hoehn, P.E. Lewis, and E.K. Inskeep. 2001. Effectiveness of intravaginal progesterone inserts and FSH for inducing synchronized estrus and increasing lambing rate in anestrous ewes. J. Anim. Sci. 79: 1120-1131.

Motlomelo, K.C., J.P.C. Greyling, and L.M.L. Schwalbach. 2002. Synchronisation of oestrus in goats; the use of different progestagen treatments. Small Rumin. Res. 45: 45-49.

Waldrona, D.F., T.D. Willinghama, P.V. Thompsona, and K.N. Bretzlaffb. 1999. Effect of concomitant injection of prostaglandin and PMSG on pregnancy rate and prolificacy of artificially inseminated Spanish goats synchronized with controlled internal drug release devices. Small Rumin. Res. 31(2):177-179.

Wildeus, S. 1999. Current concepts in synchronization of estrus: Sheep and goats. Proc. Am. Soc. Anim. Sci. Available: http://www.asas.org./JAS/symposia/proceedings/0016.pdf. July 10, 2003.

http://www.asas.org./JAS/symposia/proceedings/0016.pdf.%20July%2010

http://www.asas.org./JAS/symposia/proceedings/0016.pdf.%20July%2010


58

ความสมพนธระหวางโปรตน PDC-109 ใน seminal plasma ของพอพนธโคนมทรอปคอล โฮลสไตน ตอความสามารถในการแชแขงน าเชอ

จรรยาพร รงเรองศกด วรพงษ พงษศร

บทคดยอ

การศกษาครงนมวตถประสงคเพอศกษาความสมพนธระหวางโปรตน PDC-109 ในเซมนอลพลาสมาของ พอพนธโคนมทรอปคอล โฮลสไตน ตอความสามารถในการแชแขงน าเชอ ท าการศกษาในน าเชอ 60 ตวอยาง จากพอพนธจ านวน 12 ตว อาย 3-4 ป ของศนยวจยและผลตน าเชอแชแขงพอพนธล าพญากลาง ท าการรดเกบน าเชอดวยชองคลอดเทยม สปดาหละ 1 ครง ตดตอกน 5 สปดาห โดยแบงน าเชอเปน 2 สวน สวนแรกน าไปผลตน าเชอแชแขงและประเมนความสามารถในการแชแขง สวนทสองท าการปนแยกเฉพาะเซมนอลพลาสมาและเกบรกษาไวทอณหภม -80 °C เพอน าไปสกดและตรวจหาโปรตน ผลการทดลองพบวาน าเชอแชแขงในกลมทมความสามารถในการแชแขงสงมอตราการเคลอนทเฉลย 53.79 ± 9.49% และกลมทมความสามารถในการแชแขงต ามอตราการเคลอนทเฉลย 23.61 ± 9.31% สวนการศกษาปรมาณโปรตน PDC-109 ในเซมนอลพลาสมาทน าไปวเคราะหดวยเทคนค Sodium Dodecyl Sulfate–Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) และตรวจสอบปรมาณโปรตน PDC-109 ดวยเทคนค western blot พบวาปรมาณโปรตน PDC-109 ใน เซมนอลพลาสมาของน าเชอทมความสามารถในการแชแขงสงและต ามคาไมแตกตางกนอยางมนยส าคญทางสถต (P>0.05) โดยมคาเฉลย 0.13 ± 0.05 และ 0.14 ± 0.06 ตามล าดบ โดยขนาดโปรตนทเปนองคประกอบใน เซมนอลพลาสมาของพอพนธโคนมทรอปคอล โฮลสไตน อยในชวงตงแต 14-97 kDa และกลมโปรตนทมขนาดต ากวา 14 kDa โดยพบแถบโปรตนทมปรมาณมากทสด (major protein) ทขนาดโมเลกลประมาณ 16 kDa และ ไมพบความสมพนธระหวางอตราการเคลอนทของอสจ ลกษณะการเคลอนทของอสจ อสจมชวต และความสมบรณของอะโครโซม ตอปรมาณโปรตน PDC-109 (P>0.05) สรปวาปรมาณโปรตน PDC-109 ในเซมนอล พลาสมาของพอพนธโคนมทรอปคอล โฮลสไตน ไมมความสมพนธตอความสามารถในการแชแขงซงมผลตอเนองไปถงคณภาพน าเชอแชแขงภายหลงการละลาย

ค าส าคญ: ความสามารถในการแชแขงน าเชอ น าเชอแชแขงโค โปรตนในเซมนอลพลาสมา

เลขทะเบยนวจย: 61(1)-0208-011 ส านกเทคโนโลยชวภาพการผลตปศสตว อ.เมอง จ.ปทมธาน


59

Relationship between PDC-109 in seminal plasma of Tropical Holstein sire and freezability of spermatozoa

Janyaporn Rungruangsak Worapong Pongsiri

Abstract

The aim of the study was to investigate the relationship between the amount of PDC-109 protein in seminal plasma proteins in 60 ejaculates from 12 Tropical Holstein sires, ranging of age between 3-4 years, and its freezability. All sires were raised and fed under the same environment at Lumphayaklang Livestock Semen Production Center, Lopburi province. Semen samples were collected once a week for 5 weeks and each sample was separated into 2 parts. The first part, semen samples were used for frozen semen production following conventional method and determination of semen freezability. Another part, semen samples were centrifuged for seminal plasma collection and kept at -80 degree Celsius for protein extraction. The results showed that the average motil ity of high and low freezability groups were 53.79 ± 9.49% and 23.61 ± 9.31%, respectively. Consideration on the protein study in seminal p l a sma u s i n g Sodium Dodecyl Sulfate–Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) and western blot methods, it represented that the amounts of PDC-109 protein between high and low freezability groups did not show significantly different (P>0.05) which were 0.13 ± 0.05 and 0.14 ± 0.06, respectively. In addition, the sizes of seminal plasma proteins found in this study were varied from 14 to 97 kDa which a major 16 kDa protein band was shown. In addition, a group of lower molecular weight protein under 14 kDa was also detected . However, the amount of PDC-109 seminal plasma protein did not correlate to the sperm motility, kinematic movement, sperm viability and acrosomal integrity (P>0.05). In conclusion, the amount of PDC-109 in seminal plasma of Tropical Holstein sires did not associate to the semen freezability which indicated the frozen semen quality of Tropical Holstein bull.

Keywords: freezability, bull frozen semen, seminal plasma protein

Registered No: 61(1)-0208-011 Bureau of Biotechnology in Livestock Production, Muang district, Pathum Thani province


60

ค าน า

การผสมเทยมเปนเครองมอทมประสทธภาพในการผลตและปรบปรงพนธโคนม โดย 80% ของโคนมทวโลกมการผสมเทยมดวยน าเชอแชแขง (Morrell et al., 2018) คณภาพน าเชอแชแขงในโคนมจงเปนปจจยหนงทบงชถงความสมบรณพนธได ซงปจจบนแนวโนมในการศกษาเกยวกบโปรตนในเซมนอลพลาสมา (seminal plasma) และอสจ (spermatozoa) ทสงผลตอความสามารถในการแชแขงและความสมบรณพนธ พบในสตวเศรษฐกจหลายขนดรวมถง โคนมดวย ซงโปรตนในระบบสบพนธเพศผมบทบาทมากตอการท าหนาทและ การเปลยนแปลงรปรางของอสจเพอใหพรอมตอการปฏสนธ (Belleannée et al., 2011; Dacheux et al., 2003) รวมถงคณภาพน าเชอภายหลงการหลงออกมา (ejaculation) ดวย ทงน ผลของโปรตนยงมบทบาท ในกระบวนการเกด capacitation และปฏกรยาระหวางอสจกบเซลลบทอน าไข (Gwathmey et al., 2006; Therien et al., 1998, 1999) รวมทงสงผลตอการเปลยนแปลงของอะโครโซม (acrosomal reaction) และการพฒนาของตวออนอกดวย การศกษาเชงโปรตโอมกส ซงเปนการศกษาวจยโปรตน ทงการระบชนดและปรมาณโปรตนในเซมนอลพลาสมาและอสจ เพอน าไปหา biomarker ตางๆ จงมบทบาทและเปนทแพรหลายในสตวหลายชนด ทงในมนษย (Martínez-Heredia et al., 2006) หน (Baker et al., 2008) โค กระบอ (Peddinti et al., 2008) และสกร (González-Cadavid et al., 2014) โปรตนในเซมนอลพลาสมาและอสจ ถกพบวา มความสมพนธตอความสามารถในการแชแขงในโค (Jobim et al., 2004) และสตวชนดอน เชน มา (Jobim et al., 2011) เปนตน องคประกอบของโปรตนในเซมนอลพลาสมา และอสจยงมหลายองคประกอบทยงไมรหนาทแนชด ซงจากการศกษากอนหนานสามารถบงชแนวโนมวาโปรตนหลายชนดมความสมพนธกบความสามารถในการแชแขงและความสมบรณพนธ (Gaviraghi et al., 2010)

โปรตน PDC-109 เปนกลมโปรตน binding sperm protein ท เปนองคประกอบหลกในเซมนอล พลาสมาของโค (Jobim et al., 2004) ซงสงผลตอความสามารถในการแชแขง (freezability) ของอสจโคและกระบอ (Singh et al., 2014) เมอหลงน าเชอออกมา โปรตน PDC-109 ในเซมนอลพลาสมาจะเขาจบสวนผวของอสจ (Manjunath et al., 1994) สงผลใหโคลนฟอสโฟลปด (choline phospholipid) และโคเลสเตอรอล (cholesterol) ไหลออก (efflux) จากสวนหวของอสจ กระตนการเกด capacitation และเกดการเปลยนแปลงของอะโครโซม ท าใหอสจสามารถเจาะผาน zona pellucida ของไขเพอเขาปฏสนธได (Therien et al., 1998; Therien et al., 2001) อยางไรกตาม หากมโปรตน PDC-109 ความเขมขนทสงเกนไปและสมผสกบอสจเปนเวลานานจะสงผลเสยใหกบอสจดวยเชนกน เนองจากกระตนใหเกดการไหลออกของฟอสโฟลปดและโคเลสเตอรอลทกอใหเกดความไมคงตวของเยอหมอสจ (plasma membrane) ท าใหอสจมความไวตออนมลอสระออกซเจน (Reactive Oxygen Species; ROS) และเกดความไวตอการเปลยนแปลงในขนตอนของการผลตน าเชอแชแขง (Srivastava et al., 2012)

การศกษานจงมจดประสงคเ พอหาความสมพนธระหวางโปรตน PDC-109 ในเซมนอลพลาสมา ของพอพนธโคนมทรอปคอล โฮลสไตน (Tropical Holstein) ตอความสามารถในการแชแขงน าเชอ เพอมาใชรวมเปนเกณฑการคดเลอกพอพนธนอกเหนอไปจากการคดเลอกลกษณะอนๆ ตลอดจนวางแผนการผลตและ พฒนาเทคนคการผลตน าเชอแชแขงในโคนมใหมคณภาพสงขน


61

อปกรณและวธการทดลอง สตวทดลอง พอพนธโคนมทรอปคอล โฮลสไตน ระดบสายเลอด 93.75-96.87% HF ทมอายระหวาง 3-4 ป จ านวน 12 ตว ของศนยวจยและผลตน าเชอแชแขงพอพนธล าพญากลาง จงหวดลพบร เกบตวอยางน าเชอจาก พอพนธทงหมด 12 ตว สปดาหละ 1 ครง ตดตอกนเปนเวลา 5 สปดาห ดวยชองคลอดเทยม (artificial vagina) โดยก าหนดใหน าเชอสดมอตราการเคลอนทของอสจไมต ากวา 70% และมความผดปกตของอสจสวนหวและสวนหางไมเกน 12% และ 25% ตามล าดบ (รพพรรณ, 2551) การวางแผนการทดลอง *ภาคผนวก

แบงน าเชอออกเปนสองสวนเทากน สวนท 1 น าไปผลตเปนน าเชอแชแขง ตามวธการของศนยวจยและผลตน าเชอแชแขงพอพนธล าพญากลาง

ตรวจคณภาพน าเชอแชแขงภายหลงการละลาย ดวยเครอง CASA (The IVOS II, Hamilton Thorne Inc. Beverly, USA.) เพอประเมนความสามารถในการแชแขง (รพพรรณ, 2551) ดงน

กลมท 1 น าเชอทความสามารถในการแชแขงสง (good freezability) หมายถงน าเชอทมอตราการเคลอนทเทากบหรอมากกวา 40%

กลมท 2 น าเชอทมความสามารถในการแชแขงต า (poor freezability) หมายถงน าเชอทมอตราการเคลอนทต ากวา 40%

สวนท 2 ปนแยกเซมนอลพลาสมาดวยเครองปนแยก ความเรว 10,000 x g ท 4 ๐C นาน 15 นาท และท าการเกบสวนใส ใสหลอดขนาด 1.5 มลลลตร เกบทอณหภม -80 ๐C เพอท าการตรวจวเคราะหโปรตนตอไป

การตรวจคณภาพน าเชอแชแขง

การตรวจคณภาพน าเชอแชแขง โดยสมน าเชอแชแขงชดการผลตละ 3 หลอด ท าการละลายโดยแชในน าอนอณหภม 37 ๐C นาน 30 วนาท จากนนตรวจคณภาพน าเชอดวยเครอง CASA

1) อตราการเคลอนท (motility; %) และอตราการเคลอนทไปขางหนา (progressive motility; %) 2) ความเรวในการเคลอนท (velocity) ไดแก

- Average Path Velocity (VAP; µm/s) หมายถง ความเรวในการเคลอนทเฉลยจากระยะทางจรงใน 1 วนาท

- Straight Line Velocity (VSL; µm/s) หมายถง ความเรวในการเคลอนทวถตรง เปนการค านวณจากจดหนงไปยงอกจดหนงในแนวเสนตรงในชวงระยะเวลา 1 วนาท

- Curvilinear Velocity (VCL; µm/s) หมายถงความเรวในการเคลอนทวถโคง เปนการค านวณแนวโนมของการเคลอนทเฉลยใน 1 วนาท

3) ลกษณะการเคลอนท (kinematic movement) ไดแก - Amplitude of Lateral Head Displacement (ALH; µm) หมายถง ความกวางของสวนหว

ของอสจทสายไปมา - Beat Cross Frequency (BCF; Hz) หมายถง ความถของการสายสวนหวของอสจ


62

- Straightness (STR; %) หมายถง ความตรงในการเคลอนท ซงค านวณจากอตราสวนความเรวของการเคลอนทในวถตรง (VSL) ตอความเรวเฉลยในการเคลอนท (VAP) คณดวยรอย

- Linearity (LIN; %) หมายถง อตราสวนความเรวของการเคลอนทในวถตรงตอความเรวเฉลยของการเคลอนทวถโคง (VCL) คณดวยรอย

- Wobble (WOB; %) หมายถง อตราสวนความเรวเฉลยในการเคลอนท (VAP) ตอความเรวเฉลยของการเคลอนทวถโคง (VCL) คณดวยรอย

4) ความผดปกตในสวนหางของอสจโดยใชโปรแกรมตรวจความผดปกตอสจดวยเครอง CASA 5) อสจมชวต (sperm viability; %) กอนการแชแขงโดยใชวธยอมส eosin และ nigrosin ตามวธการ

ของ Dott and Foster (1972) และภายหลงการแชแขงดวยสยอมชนด SYBR-14 และPropidium iodide (Molecular Probes Inc., USA) ตามวธการของ Garner and Johnson (1995)

6) ความผดปกตของเซลลอสจ (morphology) กอนการแชแขง โดยใชวธยอมส William’s staining (Blom and Birch-Andersan, 1970)

7) ความสมบรณของอะโครโซม (acrosome integrity) โดยใชวธยอมส FITC-PNA (fluorescein Isothiocyanate - conjugated peanut agglutinin) ตามวธการของ Axnér et al. (2004)

8) ความสมบรณของเยอหมตวอสจ (membrane integrity) ดวยวธ Hypo-osmotic swelling test (HOS test) ตามวธการของ Revell and Mrode (1994)

การวเคราะหโปรตนดวยเทคนค SDS-PAGE และ Western blot

เลอกตวอยางเซมนอลพลาสมาของน าเชอกลมทมความสามารถในการแชแขงสงและต า กลมละ 30 ตวอยาง น ามาตรวจวเคราะหโปรตนดวยวธ SDS-PAGE และ Western blot เพอหาปรมาณโปรตน PDC-109 จากแถบโปรตนทวดไดเทยบกบปรมาณโปรตนรวม การวเคราะหปรมาณโปรตนรวมในเซมนอลพลาสมา ดวยชดทดสอบโปรตน (Quick Start Bradford Protein Assay; Bio-Rad®, USA) ตามว ธ Bradford’s assay (Bradford., 1976) โ ด ยย น ย น ชน ด โ ป ร ต น PDC-109 โดยเทคนค Western blot ตามวธของ Thepparat et al., (2012) โดยสงเขปดงน เตรยม 15% separating gel จ านวน 2 แผน โดยใชตวอยางเซมนอลพลาสมา ตวอยางละ 10 µg อเลกโตรโฟรซสดวยกระแสไฟฟา 150 V นาน 90 นาท จากนนน าเจล 1 แผนไปยอมดวยส Coomassie Brilliant Blue R-250 เพอแยกแถบโปรตนในตวอยาง เจลแผนท 2 จะถกน าไปถายแถบโปรตนลงสแผน nitrocellulose โดยบมใน blocking solution (5% skim milk ในสารละลาย TBST buffer) เปนเวลา 1 ชวโมง ทอณหภม 4oC จากนนน าแผ น nitrocellulose บมร วมกบ primary antibody (seminal plasma protein PDC-109 monoclonal antibodies; AbX™) ในอตราสวน 1:500 ทเจอจางดวย blocking solution ทงไวทอณหภม 4oC นาน 1 ชวโมง จากนนลางแผน nitrocellulose ดวยสารละลาย TBST buffer 3 ครงๆ ละ 5 นาท น าแผน nitrocellulose มาบมตอดวย secondary antibody conjugated anti-mouse IgG ในอตราสวน 1:2000 ทอณหภม 4oC นาน 1 ชวโมง จากนนลางแผน nitrocellulose ดวยบพเฟอร TBST buffer 3 ครง ครงละ 5 นาท แลวน าแผน nitrocellulose มาแชในสารละลายซบสเตรตบพเฟอร (substrate buffer) 2 ครง ครงละ 30 วนาท ตรวจสอบผลการเกดปฏกรยาดวยการเตมสารละลายซบสเตรต (substrate solution) เขยาในทมดท 25oC นาน 5-10 นาท จนมองเหนแถบสมวงปรากฏชดบนแผน nitrocellulose จงหยดปฏกรยาดวยน ากลน


63

การวดโปรตนจากเทคนค western blot ดวยโปรแกรม ImageJ

วเคราะหความแตกตางของปรมาณโปรตนของตวอยางเซมนอลพลาสมา โดยแผน nitrocellulose จะถกน ามายอมส Coomassie Brilliant Blue R-250 ตามวธการของ Welinder and Ekblad (2011) เพอน ามา normalized กบแถบโปรตนทวดได และวเคราะหผลดวยโปรแกรม ImageJ (Version 1.6; NIH)

ปรมาณโปรตน PDC-109 = ความเขมของแถบโปรตน PDC-109/ปรมาณโปรตนรวม

โดยหนวยทไดของ ความเขมของแถบโปรตน PDC-109 และปรมาณโปรตนรวมเปน pixel/mm2

การศกษาแบบแผนโปรตนดวยเทคนค Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2D-PAGE)

น าเซมนอลพลาสมาจากกลมตวอยางน าเชอทมความสามารถในการแชแขงสงและต า จ านวน 5 สปดาห โดยน าแตละกลมมาท าการรวมกน (pool) และศกษาแบบแผนของโปรตนดวยเทคนค 2D-PAGE เพอดความแตกตางของชนดและรปแบบโปรตนจากเซมนอลพลาสมาของทงสองกลม

การแยกโปรตนในทศทางแรก โดยโปรตนจะถกแยกโดยอาศยสมบตทแตกตางกนของประจ pI โดยใส (load) โปรตนลงบน dry strip ในชวง pH 3-10 ขนาด 7 เซนตเมตร จากนนท าการแยกโปรตนดวยเครอง Ettan® IPGphor (Amersham Biosciences, USA) ซงมขนตอนดงน วาง strip holder ลงบนเครอง Ettan® IPGphor จากนนใสสารละลายโปรตน 100 µg/strip ทท าการผสมกบ rehydration buffer (7 M urea, 2 M thiourea, 2% (w/v) CHAPS, 2 mM DTT, 0.8% (w/v) IPG buffer and 0.2% bromophenol blue) เรยบรอยแลวลงใน strip holder โดยปรมาตรสดทายคอ 250 µL แลวจงท าการวาง IPG strip pH 3-10 ลงใน strip holder จากนน overlay IPG strip ดวยน ายาเคมชนดแหง (dry strip cover fluid) ประมาณ 700 µL แลวตงคาโปรแกรม IEF ส าหรบการบม IPG strip โดยท าการบม IPG strip (pH 3-10) กบ equilibration solution ปรมาตร 2.5 mL ทม dithiothreitol (DTT) 0.025 g นาน 30 นาท จากนนท าการบม IPG strip ตอดวย equilibration solution ปรมาตร 2.5 mL ทม iodoacetamide (IAA) 0.0625 g นาน 30 นาท หลงจากแยกโปรตนในทศทางแรกแลวโปรตนจะถกแยกอกครงในทศทางทสองโดยอาศยสมบตของขนาดของโมเลกลทแตกตางกน โดยในการทดลองน จะใช 13.5% separating gel (SDS-PAGE) จากนนวาง strip และกระดาษกรองทใส protein marker ปรมาตร 2 µL ลงดานบนของเจล โดยตงโปรแกรมท 10 mA นาน 15 นาท จากนนเพมเปน 20 mA นาน 20 นาท แลวน าเจล ทไดมาท าการยอมโดยใช Coomassie Brilliant blue R-250

การวเคราะหขอมลจากเจลดวยโปรแกรม ImageMasterTM 2D Platinum

สแกนแผนเจลและวเคราะหความแตกตางของจด (spot) โปรตนของตวอยางแตละกลมดวยโปรแกรม ImageMasterTM 2D platinum version 7.0 เพอใหไดจดโปรตนทสนใจ คอโปรตนทมการแสดงออกเพมขน หรอลดลง หรอมการแสดงออกเฉพาะในบางกลมทดลอง ท าการเปรยบเทยบแบบแผนของโปรตนจาก เซมนอลพลาสมาของพอโคในกลมทมความสามารถในการแชแขงทสงและต า


64

การวเคราะหทางสถต

ท าการวเคราะหผลของคณภาพน าเชอแชแขงพอพนธโคนมภายหลงการละลาย ไดแก อตราการเคลอนท ความเรวในการเคลอนท และลกษณะการเคลอนทของอสจ อสจมชวต ความสมบรณของเยอหมเซลลอสจ และความผดปกตของอสจ โดยเปรยบเทยบคณภาพน าเชอแชแขงภายหลงการละลายระหวางกลมทมความสามารถในการแชแขงน าเชอทสงและต า และเปรยบเทยบปรมาณโปรตน PDC-109 ระหวางกลมทมความสามารถในการแชแขงน าเชอทสงและต า ดวย t-test for independent samples และวเคราะหความสมพนธโดยใชคาสมประสทธสหสมพนธ (correlation coefficient; r) ระหวางพารามเตอรของคณภาพน าเชอแชแขงภายหลงการละลายและปรมาณโปรตน PDC-109 ทงน การวเคราะหทางสถตของการทดลองดงกลาวน ก าหนดคาความแตกตาง อยางมนยส าคญทระดบ รอยละ 95 (P<0.05) โดยใชโปรแกรมทางสถต R commander version 3.5.2 (R Core Team, 2018)


การเปรยบเทยบคณภาพน าเชอแชแขง

ผลการเปรยบเทยบคณภาพน าเชอแชแขงระหวางกลมทมความสามารถในการแชแขงน าเชอทสงและต า (Table 1) พบวา พารามเตอรของคณภาพน าเชอแชแขง ไดแก อตราการเคลอนทของอสจ ความเรวในการเคลอนทของอสจ และลกษณะการเคลอนทของอสจแบบ ALH ในกลมทมความสามารถในการแชแขงสง มากกวา กลมทมความสามารถในการแชแขงต าอยางมนยส าคญทางสถต (P<0.05) ความผดปกตในสวนหางของอสจในกลมทมความสามารถในการแชแขงต า สงกวา กลมทมความสามารถในการแชแขงสงอยางมนยส าคญทางสถต (P<0.05) นอกจากนพบวา อสจมชวตและความสมบรณของเยอหมอสจ ในกลมทมความสามารถในการแชแขงสง มากกวา กลมทมความสามารถในการแชแขงต าอยางมนยส าคญทางสถต (P<0.05) ทงน ผลของคณภาพน าเชอแชแขงเพอน าไปใชในการแบงกลมคณภาพน าเชอดงกลาวฯ น สอดคลองกบการแบงกลมตวอยางเพอหาความสมพนธของโปรตนในเซมนอลพลาสมาตอคณภาพน าเชอแชแขงพอพนธโคของ Sarsaifi et al. (2015) ทแบงกลมคณภาพน าเชอแชแขงออกเปน 3 กลม ไดแก คณภาพสง กลาง และต า โดยพบวาน าเชอแชแขงภายหลงการละลายทมคณภาพสง มอตราการเคลอนทของอสจ ความเรวในการเคลอนท ลกษณะการเคลอนท ของอสจ อสจมชวต และความสมบรณของเยอหมอสจ สงกวากลมคณภาพน าเชอแชแขงคณภาพต าอยางมนยส าคญทางสถต โดยคาพารามเตอรของคณภาพน าเชอแชแขงทไดจากการตรวจวเคราะหดวยเครอง CASA น มรายงานวาพบความสมพนธในเชงบวกตอความสมบรณพนธ โดยคาพารามเตอรตางๆ มผลตอการปฏสนธดวย (Budworth et al. 1987; Farrell et al. 1998) และยงพบวาความเรวในการเคลอนทแบบ VSL และ VCL และลกษณะ การเคลอนทแบบ ALH และ LIN นน มความสมพนธในเชงบวกตอความสมบรณพนธอกดวย (Farrell et al. 1996; Perumal et al. 2011)


65

Table 1. Semen quality parameters of frozen-thawed bull semen (mean ± SD)

ab Different superscripts within the same row demonstrate significant differences (P0.05) รปแบบโปรตนในเซมนอลพลาสมาและปรมาณโปรตน PDC-109

เมอตรวจวเคราะหรปแบบของโปรตนทเปนองคประกอบในเซมนอลพลาสมาของทง 2 กลม ใน SDS-PAGE พบวามรปแบบโปรตนทคลายกน โดยมขนาดโมเลกลสวนใหญระหวาง 14-97 kDa (Figure 1) และสามารถพบขนาดโมเลกลเลกกวา 14 kDa ในปรมาณไมมากนก ทงนแถบโปรตนทมปรมาณมากทสด (major

Sperm quality parameters Semen quality performance groups Good (n=30) Poor (n=30)

sperm motility Total motility (%) 53.79a + 9.49 23.61b + 9.31 Progressive motility (%) 29.80a + 6.90 11.98b + 5.37 Velocity Straight Line Velocity (VSL; µm/s) 66.45a + 5.79 58.29b + 7.12 Curvilinear Velocity (VCL; µm/s) 146.50a + 20.77 127.50b + 18.83 Average Path Velocity (VAP; µm/s) 80.84a + 7.42 70.52b + 8.18 Kinematic movement Amplitude of Lateral Head Displacement (ALH; µm)

6.92a + 1.34 6.26b + 1.16

Beat Cross Frequency (BCF; Hz) 28.68 + 2.76 27.99 + 3.93 Straightness (STR; %) 80.36 + 4.04 80.46 + 3.92 Linearity (LIN; %) 46.96 + 5.38 47.05 + 5.41 Wobble (WOB; %) 56.80 + 4.20 56.81 + 4.25 Sperm defects Bent tail (%) 13.86b + 3.35 19.08a + 4.76 Coiled tail (%) 1.46b + 0.69 2.18a + 1.03 Proximal droplet (%) 3.09b + 1.09 5.31a + 3.16 Distal droplet (%) 4.94b + 1.32 7.87a + 1.48 Sperm function Sperm viability (%) 84.11a + 9.34 76.67b + 15.59 Acrosome integrity (%) 68.38 + 15.73 65.38 + 19.15 Plasma membrane integrity (%) 52.81a + 13.44 45.09b + 16.13


66

protein) มขนาดโมเลกลประมาณ 16 kDa (Figure 2a) ซงเปนขนาดเดยวกนกบโปรตน PDC-109 โดย Thepparat et al. (2012) ทรายงานการวเคราะหเซมนอลพลาสมาดวยเทคนคโปรตโอมกส โดยใชเทคนค 2D-PAGE วาโปรตน PDC-109 เปนโปรตนทมมวลโมเลกลประมาณ 16.5 kDa ส าหรบการศกษารปแบบโปรตนในสตวชนดอน เชน การวเคราะหโปรตนดวย SDS-PAGE ในเซมนอล พลาสมาของกระบอ พบโปรตน 25 ชนดทมน าหนกโมเลกลระหวาง 14.4-80.5 kDa โดยโปรตนสวนมากจะน าหนกนอยกวาและเทากบ 35.5 kDa พบเปน 28% ของโปรตนรวมทงหมด (Asadpour et al., 2007) การศกษารปแบบโปรตนในพอพนธแกะ พบโปรตนทมขนาด 15–108 kDa (Jobim et al., 2005) การศกษารปแบบโปรตนในในมาพบโปรตนขนาด 14–30 kDa (Töpfer et al., 2005) ทงน การศกษาของ Arangasamy et al. (2005) ในกระบอทรายงานวาพบโปรตน 18 ชนดโดยมขนาดโปรตนตงแต 12 -127 kDa นน แตกตางจากการศกษาของ Asadpour et al. (2007) โดยความแตกตางของจ านวนแถบโปรตนทพบในการศกษาแตละวธนน อาจเกดจากความแตกตางกนของวธการเตรยมโปรตน

Figure 1 SDS-PAGE patterns of proteins in bovine seminal plasma. The gels were stained with Coomassie Brilliant Blue R-250. M lane indicated low molecular weight standard.

เทคนค western blot ถกน ามาใชเพอยนยนชนดของโปรตนจากเซมนอลพลาสมาดงกลาวฯ โดยใช

mouse monoclonal anti PDC-109 พบวาโปรตนทมขนาดมวลโมเลกล 16 kDa ซงพบเปนโปรตนหลกใน SDS-PAGE สามารถจบไดอยางจ าเพาะกบโปรตน PDC-109 (Figure 2b)

Figure 2a Figure 2b Figure 2 SDS-PAGE patterns of proteins in bovine seminal plasma in both groups (good and poor sperm freezability; 2a). Western blot images show representative protein patterns for PDC-109 in 2 groups (2b).


67

ความสมพนธของโปรตน PDC-109 ตอคณภาพน าเชอแชแขง

จากการเปรยบเทยบปรมาณโปรตน PDC-109 ในเซมนอลพลาสมาระหวางน าเชอโคทงสองกลม (Table 2) พบวา มคาไมแตกตางกนอยางมนยส าคญทางสถต (P>0.05) และไมพบความสมพนธระหวางปรมาณโปรตน PDC-109 กบความสามารถในการแชแขงซงมผลตอเนองไปถงคณภาพน าเชอแชแขงภายหลงการละลายในทกลกษณะ (Table 3)

Table 2. Amount of PDC-109 in seminal plasma of good and poor freezability groups (mean ± SD)

Group (n=30) PDC-109

Good freezability 0.13 + 0.05 Poor freezability 0.14 + 0.06

Table 3 Correlation coefficients between sperm quality parameters of frozen-thawed semen and amount of PDC-109

Parameters Correlation coefficients (r) between sperm quality parameters

and amount of PDC-109 (n=60)

P-value

Sperm motility (%) Total motility -0.077 0.600 Progressive motility -0.102 0.482 Slow motility -0.008 0.956 Static sperm 0.077 0.600 Velocity VSL (µm/s) 0.051 0.689 VCL (µm/s) 0.029 0.768 VAP (µm/s) 0.040 0.784 Kinematic movement ALH (µm) -0.058 0.690 BCF (Hz) 0.253 0.079 STR (%) -0.034 0.813 LIN (%) 0.09 0.560 WOB (%) 0.132 0.363 Sperm with tail defects (%) Bent tail -0.067 0.963 Coiled tail 0.117 0.424 Proximal droplets 0.08 0.967 Distal droplets -0.049 0.740 Sperm functions (%) Sperm viability 0.050 0.755 Acrosome integrity 0.262 0.082


68

ส าหรบการศกษาน คณภาพน าเชอแชแขงภายหลงการละลายทมความแตกตางกนนน อาจเกดขนไดจากหลายปจจย เชน ปรมาณโปรตนชนดอนทมความแตกตางกนนอกจากโปรตน PDC-109 ในเซมนอลพลาสมา (Sarsaifi et al., 2015) เชน อลบมน (albumin) ชวยปองกนความเสยหายของเยอหมอสจ และเพมอตราการเคลอนทของอสจ โปรตนคลสเตอรน (clusterin protein) ชวยปองกนความเสยหายจาก oxidative stress และยบยงการท าลายอสจ (Moura et al., 2007) นอกจากน Schöneck et al. (1996) ไดรายงานวาโปรตน bovine acidic seminal fluid สามารถปองกนความเสยหายบรเวณเยอหมอสจได ท าใหอสจมชวตและอตราการเคลอนทของอสจสงขน สอดคลองกบการศกษาของ Jobim et al. (2004) ทรายงานวาพบความสมพนธในเชงบวกระหวางปรมาณโปรตน bovine acidic seminal fluid กบคณภาพน าเชอหลงท าละลาย นอกจากน สารตานอนมลอสระตางๆ (antioxidants) เชน วตามนเอ วตามนอ กรดแอสคอบก (ascorbic acid) และซลเนยม รวมถงเอนไซมทชวยก าจดอนมลอสระออกซเจน (enzymatic ROS scavengers) เชน คะตะเลส (catalase) กลตาไทโอน เปอรออกซเดส (glutathione peroxidase) และ ซปเปอรออกไซดดสมวเทส (superoxide dismutase) ทอยในเซมนอลพลาสมากเปนปจจยหนงทชวยปกปองอสจจากอนมลอสระ (Gürler et al., 2015) ซงความแตกตางของโปรตนหรอองคประกอบอนในเซมนอลพลาสมา อาจเปนปจจยทอาจสงผลกบความสามารถในการแชแขงซงมผลตอเนองไปถงคณภาพน าเชอแชแขงภายหลงการละลายได

ในขณะท Singh et al. (2014) ไดท าการศกษาความสมพนธระหวางโปรตน HBP และ PDC-109 ในน าเชอกระบอ พบวาน าเชอกระบอกลมทมความสามารถในการแชแขงต ามปรมาณโปรตน PDC-109 สงกวากลมทมความสามารถในการแชแขงสง ซงแตกตางจากการศกษาในครงน และจากการศกษาของ Sánchez-Luengo et al. (2004) ท าการทดลองโดยเกบน าเชอจากสวนตางๆ ของอพดไดมส (epididymis) เพอศกษาความเขมขนของโปรตน PDC-109 ตอการเคลอนทไดของอสจทไมไดผานกระบวนการแชแขง พบวาโปรตน PDC-109 ทความเขมขนแตกตางกนสามารถเพมอตราการเคลอนทของอสจได เนองจากการเกบตวอยางจากอพดไดมส ยงไมมอทธพลจากน ายาเจอจางน าเชอ อกทงการรดเกบน าเชอจนเขาสกระบวนการผลตน าเชอใชระยะเวลาไมนาน ท าใหอสจสมผสกบโปรตน PDC-109 ในเซมนอลพลาสมาในชวงเวลาสนๆ รวมทงการเตมน ายาเจอจางน าเชอชนดไขแดงทรสในขบวนการแชแขง สามารถชวยลดความเขมขนของโปรตนชนดตางๆ เนองจากโปรตนทเปนองคประกอบหลกในเซมนอลพลาสมาจะเขาจบกบ LDL ซงเปนองคประกอบในไขแดงอยางรวดเรวและจ าเพาะจงชวยลดปรมาณของโปรตนในเซมนอลพลาสมาทจะเขาจบกบอสจ (Manjunath and Therien, 2002) รวมถงโปรตน PDC-109 ซงมบทบาทส าคญในกระบวนการ sperm capacitation เพอเตรยมความพรอมส าหรบการเขาปฏสนธกบไข ท าใหอสจไวตอการเกด cold shock จากกระบวนการแชแขง (Purdy and Graham, 2004; Therien et al., 1998) โดยหากอสจสมผสเซมนอลพลาสมาในเวลานานจะท าใหเกดภาวะการเปลยนแปลงรปรางและกลไกการท างานของอสจกอนทจะเขาสระบบสบพนธเพศเมย (pre-capacitation) ท าใหน าเชอมคณภาพลดลงกวาทควรจะเปน (Therien et al., 1998) และจากการศกษาของ Vishwanath et al. (1992) และ Bergeron et al. (2007) พบวาน ายาเจอจางน าเชอทมสวนผสมของไขแดงทเปนทนยมใชในการผลตน าเชอแชแขงนน ชวยลดอนตรายจากการทอสจสมผสเซมนอลพลาสมา โดยโปรตนในไขแดงสามารถเคลอบทเยอหมอสจและยงสามารถจบกบโปรตน PDC-109 ไดอยางรวดเรวกอนเขาสกระบวนการแชแขง นอกจากน การศกษาของ


69

Singh et al. (2007) รายงานวาน ายาเจอจางน าเชอทมสตรเปนไขแดงทรสสามารถลดความเสยหายของอสจจากการแชแขงในน าเชอกระบอได

การศกษาของ Srivastava et al. (2012) ซงไดท าการทดลองโดยการแบงน าเชอจากพอโคพนธผสม (cross breed) ออกเปน 3 กลม โดยกลมแรกจะเตมเฉพาะน ายาเจอจางน าเชอทมสวนผสมของไขแดงทรส กลมท 2 จะมการเคลอบหลอดทเกบน าเชอดวยสาร anti-PDC109 และใชน ายาเจอจางน าเชอสตรทไมมไขแดง สวนกลมท 3 จะมการเคลอบหลอดทเกบน าเชอดวยสาร anti-PDC109 และเตมน ายาเจอจางน าเชอทมสวนผสมของไขแดง โดยผลการทดลองพบวา กลมท 3 มคณภาพน าเชอภายหลงการละลาย ไดแกอตราการมชวตของอสจ ความสมบรณของเยอหมอสจ และความสมบรณของอะโครโซม สงกวากลมท 1 และกลมท 2 อยางมนยส าคญทางสถต ซงแสดงใหเหนวาแมจะมการเตมน ายาเจอจางน าเชอ โปรตน PDC-109 ยงคงมอทธพลตอคณภาพน าเชอทงกอนและหลงการแชแขง แตอยางไรกตาม ผลการศกษาในครงนอาจสรปไดวาน าเชอของพอโคนมพนธทรอปคอลโฮลสไตนมปรมาณและความเขมขนของโปรตน PDC-109 ทต ากวา เมอเปรยบเทยบกบพอโคสายพนธอน และรวมกบภายหลงจากการรดน าเชอไดเขาสกระบวนการเตมน ายาเจอจางน าเชออยางรวดเรว ยอมท าใหผลของโปรตน PDC-109 ตออสจลดลง ทงนผลการทดลองจาก Table 3 ไมพบความสมพนธระหวางปรมาณโปรตน PDC-109 ตอคณภาพน าเชอภายหลงการละลาย ซงสอดคลองกบการศกษาของ Srivastava et al. (2012) ทพบวาสารละลายเจอจางน าเชอสตรทมไขแดง ชวยลดผลทางดานลบของโปรตน PDC-109 นอกจากน ยงอาจเกดจากปจจยอนๆ เชน ความแตกตางระหวางสายพนธของโค และพนธกรรม ซงสงผลตอการแสดงออกของยนได ซงจากการศกษาของ Intasqui et al. (2013) พบวาทงความสมบรณและความเสยหายของดเอนเอ เกดจากความแตกตางในการแสดงออกของโปรตน ซงสงผลตออตราการเคลอนทของอสจได

Figure 3 Two-dimensional polyacrylamide electrophoretic gel of bovine seminal plasma proteins were stained with Coomassie Brilliant blue R-250.

อยางไรกตาม จากการทดสอบดวยเทคนค 2D-PAGE ไดมการคนพบความแตกตางของรปแบบโปรตนอน

นอกเหนอไปจากโปรตนเปาหมายหลก PDC-109 โดยพบวาโปรตนในเซมนอลพลาสมาทงสองกลมมการแสดง


70

ออกของโปรตนทแตกตางกนตามการกระจายตวของโปรตนทแยกบนเจล (Figure 3) ในกลมน าเชอทมความสามารถในการแชแขงสงและต า ซงเมอน าเซมนอลพลาสมาจากพอพนธโคนมทรอปคอล โฮลสไตนจากกลมตวอยางน าเชอทมความสามารถในการแชแขงสงและต า จ านวน 5 สปดาห มาท าการรวมกนและศกษาแบบแผนของโปรตนดวยเทคนค 2D-PAGE นน ผลการศกษาพบวา โปรตนในเซมนอลพลาสมาทงสองกลมมการแสดงออกของโปรตนทแตกตางกน (Figure 3) ซงการศกษาดงกลาวฯ อาจตองมการศกษาตอไปในอนาคต ทงในสวนของรปแบบโปรตนในเซมนอล พลาสมาในพอพนธโคนมทรอปคอล โฮลสไตนทจะมผลตอความสามารถในการแชแขงซงมผลตอเนองไปถงคณภาพน าเชอแชแขงภายหลงการละลายและความสมบรณพนธของพอโค ซงอาจท าใหคนพบกระบวนการทชวยในการเพมคณภาพน าเชอแชแขงพอพนธโคภายหลงการละลาย รวมถงเปนสวนหนงในการคดพอโคทไมเหมาะสมออกกอนเขาสกระบวนการผลตน าเชอแชแขงได


น าเชอจากพอพนธโคนมทรอปคอล โฮลสไตนกลมทมความสามารถในการแชแขงสงและต า มปรมาณโปรตน PDC-109 ในเซมนอลพลาสมาไมแตกตางกน และปรมาณโปรตน PDC-109 ไมมความสมพนธกบความสามารถในการแชแขงของน าเชอซงมผลตอเนองไปถงคณภาพน าเชอแชแขงภายหลงการละลาย


แมวาในการศกษาครงน PDC-109 ไมมความสมพนธกบความสามารถในการแชแขงของน าเชอซงมผลตอเนองไปถงคณภาพน าเชอแชแขงภายหลงการละลาย แตถาพจารณาถงรปแบบของโปรตนในเซมนอลพลาสมาเมอตรวจดวยเทคนค 2D-PAGE ในน าเชอทมความสามารถในการแชแขงสงและต า จะพบวามการแสดงออกทแตกตางกน ซงอาจมโปรตนทสงผลตอความสามารถในการแชแขงชนดอนซงมผลตอคณภาพน าเชอแชแขง จงควรท าการศกษาโปรตนอนทเปนองคประกอบในเซมนอลพลาสมาในกลมพอโคทมคณภาพน าเชอทแตกตางกน รวมทงความสามารถในการแชแขงสงและต าตอไป เพอน ามาใชในการรวมเปนเกณฑการคดเลอกพอพนธนอกเหนอไปจากการคดเลอกลกษณะอนๆ การวางแผนการผลตและพฒนาเทคนคการผลตน าเชอแชแขงในโคนมใหมคณภาพสงขน

กตตกรรมประกาศ งานวจยน ไดรบการสนบสนนจากส านกงานคณะกรรมการวจยแหงชาต (วช.) คณะผวจย ขอขอบคณ

ผอ านวยการศนยวจยและผลตน าเชอแชแขงพอพนธล าพญากลาง เจาหนาทของกลมวจยการผลตและมาตรฐานน าเชอ และเจาหนาทของศนยวจยและผลตน าเชอฯ ล าพญากลาง ทใหการชวยเหลอและสนบสนนใหสามารถด าเนนการวจยเปนไปตามวตถประสงค


71


รพพรรณ เออเวชนชกล. 2551. คมอการปฏบตงาน การควบคมคณภาพน าเชอพอพนธผสมเทยม (Quality control of livestock semen for artificial insemination). ส านกเทคโนโลยชวภาพการผลตปศสตว. Arangasamy, A., L.P. Singh, N. Ahmed, M.R. Ansari and C.G. Ram. 2005. Isolation and characterization of heparin and gelatin binding buffalo seminal plasma proteins and their effect on cauda epididymal spermatozoa. Anim. Reprod. Sci. 90(3):243–254. Asadpour, R., S.M. Alavi-Shoushtari, S.A. Rezaii and M.H.K. Ansari. 2007. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of buffalo bull seminal plasma proteins and their relation with semen freezability. Animal Reproduction Science. 102(3):308-313. Axnér, E., U. Hermansson and C. Linde-Forsberg. 2004. The effect of Equex STM paste and sperm morphology on post-thaw survival of cat epididymal spermatozoa. Animal Reproduction Science. 84(1):179-191. Baker, M.A., L. Hetherington, G.M. Reeves and R.J. Aitken. 2008. The mouse sperm proteome characterized via IPG strip prefractionation and LC-MS/MS identification. Proteomics. 8(8):1720-1730. Belleannée, C., V. Labas, A. Teixeira-Gomes, J.L. Gatti, J.L. Dacheux and F. Dacheux. 2011. Identification of luminal and secreted proteins in bull epididymis. Journal of Proteomics. 74(1):59-78. Bergeron, A., Y. Brindle, P. Blondin and P. Manjunath. 2007. Milk caseins decrease the binding of the major bovine seminal plasma proteins to sperm and prevent lipid loss from the

sperm membrane during sperm storage. Biol. Reprod. 77:120–126. Blom, E. and A. Birch-Andersen. 1970. Ultrastructure of the decapitated sperm defects in

Guernsey bulls. Reproduction. 23(1):67-72. Bradford, M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities

of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72(12):248–254.

Budworth, P.R., R.P. Amann and R.H. Hammerstedt. 1987. A microcomputer-photographic method for evaluation of motility and velocity of bull sperm. Journal of Dairy Science. 70(9):1927–1936. Dacheux, J.L., J.L. Gatti and F. Dacheux. 2003. Contribution of epididymal secretory proteins for

spermatozoa maturation. Microsc. Res. Tech. 61:7–17. Dott, H.M. and G.C. Foster. 1972. A technique for studying the morphology of mammalian

spermatozoa which are eosinophilic in a differential live/dead stain. J. Reprod. Fert. 29:443-445.

Farrell P.B., R.H. Foote, M.M. McArdle, V.L. Trouerntrend and A.L. Tardif. 1996. Media and dilution procedures tested to minimize handling effects on human, rabbit, and bull


72

sperm for computer-assisted sperm analysis (CASA). Journal of Andrology. 17(3):293–300. Farrell P.B., G.A. Presicce, C.C. Brocektt and R.H. Foote. 1998. Quantification of bull sperm characteristics measured by computer–assisted sperm analysis (CASA) and their relationship to fertility. Theriogenology. 49:871–879. Garner, D. and L. Johnson. 1995. Viability assessment of mammalian sperm using SYBR-14 and

propidium iodide. Biol. Reprod. 53(2):276-284. Gaviraghi, A., F. Deriu, A. Soggiu, A. Galli, C. Bonacina, L. Bonizzi and P. Roncada. 2010. Proteomics to investigate fertility in bulls. Veterinary Research Communications. 34(1):33-36. González-Cadavid, V., J.A.M. Martins, F.B. Moreno, T.S. Andrade, A.C.L. Santos, A.C.O. Monteiro-Moreira, R.A. Moreira and A.A. Moura. 2014. Seminal plasma proteins of adult boars and correlations with sperm parameters. Theriogenology. 82(5):697-707. Gürler, H., O. Calisici and H. Bollwein. 2015. Inter- and intra-individual variability of total antioxidant capacity of bovine seminal plasma and relationships with sperm quality before and after cryopreservation. Animal Reproduction Science. 155:99-105. Gwathmey, T.M., G.G. Ignotz, J.L. Mueller, P. Manjunath and S.S. Suarez. 2006. Bovine seminal

plasma proteins PDC-109, BSP-A3, and BSP-30-kDa share functional roles in storing sperm in the oviduct. Biol. Reprod. 75(4):501-507.

Intasqui, P., M. Camargo, G.P.T. Del, D.M. Spaine, V.M. Carvalho, K.H.M. Cardozo, A.P. Cedenho and R.P. Bertolla. 2013. Unraveling the sperm proteome and post-genomic pathways associated with sperm nuclear DNA fragmentation. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30(9):1187-1202. Jobim, M.I.M., E.R. Oberst, C.G. Salbego, D.O. Souza, V.B. Wald, F. Tramontina and R.C. Mattos. 2004. Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis of bovine seminal plasma proteins and their relation with semen freezability. Theriogenology. 61(2):255-266. Jobim, M.I.M., E.R. Oberst, C.G. Salbego, V.B. Wald, A.P. Horn and R.C. Mattos. 2005. BSP A1/A2 like proteins in ram seminal plasma. Theriogenology. 63(7):2053–2062. Jobim, M.I.M., C. Trein, H. Zirkler, R.M. Gregory, H. Sieme and R.C. Mattos. 2011. Two- dimensional polyacrylamide gel electrophoresis of equine seminal plasma proteins and their relation with semen freezability. Theriogenology. 76(4):765-771. Manjunath, P., L. Chandonnet, E. Leblond and L. Desnoyers. 1994. Major proteins of bovine

seminal vesicles bind to spermatozoa. Biol. Reprod. 50:27–37. Manjunath, P. and I. Therien. 2002. Role of seminal plasma phospholipid-binding proteins in sperm membrane lipid modification that occurs during capacitation. Journal of Reproductive Immunology. 53(1):109-119. Martínez-Heredia, J., J.M. Estanyol, J.L. Ballescà, and R. Oliva. 2006. Proteomic identification of human sperm proteins. Proteomics. 6(15):4356-4369. Morrell, J.M., A.S. Valeanu, N. Lundeheim and A. Johannisson. 2018. Sperm quality in frozen


73

beef and dairy bull semen. Acta Veterinaria Scandinavica. 60(1):41. Moura, A.A., D.A. Chapman, H. Koc and G.J. Killian. 2007. A comprehensive proteomic analysis of

the accessory sex gland fluid from mature Holstein bulls. Animal Reproduction Science. 98(3): 169-188.

Peddinti, D., B. Nanduri, A. Kaya, J.M. Feugang, S.C. Burgess and E. Memili. 2008. Comprehensive proteomic analysis of bovine spermatozoa of varying fertility rates and identification of biomarkers associated with fertility. BMC Systems Biology. 2:19-20. Perumal, P., S. Selvaraju and S. Selvakumar. 2011. Effect of pre-freeze addition of cysteine hydrochloride and reduced glutathione in semen of crossbred jersey bulls on sperm parameters and conception rates. Reproduction in Domestic Animals. 46(4):636–641. Purdy, P.H. and J.K. Graham. 2004. Effect of cholesterol-loaded cyclodextrin on the cryosurvival

of bull sperm. Cryobiology. 48(1):36-45. R Core Team. 2018. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for statistical computing, Vienna, Austria. Revell, S.G. and R.A. Mrode. 1994. An osmotic resistance test for bovine semen. Animal

Reproduction Science. 36(1):77-86. Sánchez-Luengo, S., G. Aumüller, M. Albrecht, P.C. Sen, K. Röhm and B. Wilhelm. 2004. Interaction of PDC-109, the major secretory protein from bull seminal vesicles, with bovine sperm membrane Ca2+-ATPase. Journal of Andrology. 25(2):234-244. Sarsaifi, K., A.W. Haron, J. Vejayan, R. Yusoff, H. Hani, M.A. Omar, L.W. Hong, N. Yimer, J.T. Ying and

A.M. Othman. 2015. Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis of Bali bull ( Bos javanicus) seminal plasma proteins and their relationship with semen quality. Theriogenology. 84(6):956-968.

Schöneck, C., J. Braun and R. Einspanier. 1996. Sperm viability is influenced in vitro by the bovine seminal protein aSFP: Effects on motility, mitochondrial activity and lipid peroxidation. Theriogenology. 45(3):633-642.

Singh, L.P., H.M. Harshan and M.R. Ansari. 2007. Effect of egg yolk and seminal plasma heparin binding protein interaction on the freezability of buffalo cauda epididymal spermatozoa. Anim. Reprod. Sci. 99:395–400.

Singh, M., S.K. Ghosh, J.k. Prasad, A. Kumar, R.P. Tripathi, S.K. Bhure and N. Srivastava. 2014. Seminal PDC- 109 protein vis- à- vis cholesterol content and freezability of buffalo

spermatozoa. Animal Reproduction Science. 144(1):22-29. Srivastava, N., S.K. Srivastava, S.K. Ghosh, L.P. Singh, J.K. Prasad, A. Kumar, P. Perumal, A. Jerome

and A. Thamizharasan. 2012. Sequestration of PDC-109 protein improves freezability of crossbred bull spermatozoa. Anim. Reprod. Sci. 131(12):54-62.

Thepparat, T., S. Katawatin, T. Vongpralub, M. Duangjinda, S. Thammasirirak and A. Utha. 2012. Separating of bovine seminal plasma proteins by using 2D-PAGE revealed the


74

different profile of PDC-109. Khon Kaen Agricultural Journal. 40(2):387-391. Therien, I., S. Soubeyrand and P. Manjunath. 1998. Major proteins of bovine seminal plasma

modulate sperm capacitation by high-density lipoprotein. Biol. Reprod. 57(5):1080-1088. Therien, I., R. Moreau and P. Manjunath. 1999. Bovine seminal plasma phospholipid-binding

proteins stimulate phospholipid efflux from epididymal sperm. Biol. Reprod. 61:590–598. Therien, I., D. Bousquet and P. Manjunath. 2001. Effect of seminal phospholipid-binding proteins

and follicular fluid on bovine sperm capacitation. Biol. Reprod. 65(1):41-51. Töpfer, P.E., M. Ekhlasi-Hundrieser, C. Kirchhoff, T. Leeb and H. Sieme. 2005. The role of stallion

seminal proteins in fertilization. J. Anim. Reprod. 89(1):159–170. Vishwanath, R., P. Shannon and B. Curson. 1992. Cationic extracts of egg yolk and their effects on

motility, survival and fertilizing ability of bull sperm. Anim. Reprod. Sci. 29:185-194. Welinder, C. and L. Ekblad. 2011. Coomassie staining as loading control in Western blot analysis.

Journal of Proteome Research. 10(3):1416-1419.


75

ผลของวธการปนแยก seminal plasma ดวยสารละลายเพอรคอล ตอคณภาพน าเชอแชแขงสกรภายหลงการละลาย

วรพงษ พงษศร จรรยาพร รงเรองศกด

บทคดยอ

การทดลองนมวตถประสงคเพอศกษาผลของการปนแยกเซมนอลพลาสมาดวยสารละลายเพอรคอลตอคณภาพน าเชอแชแขงสกรภายหลงการละลาย โดยใชน าเชอจากสกรพอพนธจ านวน 9 ตว อาย 2-3 ป จากศนยวจยและพฒนาสกร จงหวดนครราชสมา รดเกบน าเชอสปดาหละ 1 ครง ตดตอกน 4 สปดาห ภายหลงปรบสมดลอณหภมท 15 °C นาน 120 นาท แบงน าเชอออกเปน 3 กลม กลมควบคมไมใชสารละลายเพอรคอล กลมท 2 ใชสารละลาย เพอรคอลชนเดยวทความเขมขน 80% และกลมท 3 ใชสารละลายเพอรคอลสองชน ชนท 1 ความเขมขน 80% และชนท 2 ความเขมขน 45% ท าการปนแยกเซมนอลพลาสมา ทความเรว 2,000 รอบตอนาท นาน 15 นาท น าสวนทตกตะกอนเขาสขบวนการแชแขงและเกบรกษาภายใตระดบไนโตรเจนเหลวอยางนอย 24 ชวโมง สมตรวจอตราการเคลอนท ความเรวในการเคลอนท ลกษณะการเคลอนท และความผดปกตในสวนหางของอสจดวยเครอง CASA ตรวจอสจมชวตและความสมบรณของอะโครโซมดวยเครอง flow cytometer ผลการทดลองพบวาน าเชอแชแขงในกลมท 2 และ 3 มคณภาพน าเชอแชแขงภายหลงการละลายทสงกวากลมควบคมอยางมนยส าคญทางสถต (P<0.05) ไดแก อตราการเคลอนท (32.94 ± 11.80, 35.72 ± 10.52 และ 25.22 ± 13.45) อตราการเคลอนทไปขางหนา (12.99 ± 5.86, 14.09 ± 5.51 และ 7.04 ± 5.22) ความเรวในการเคลอนทแบบ VSL (52.91 ± 11.16, 54.04 ± 8.29 และ 46.20 ± 9.99) ลกษณะการเคลอนทแบบ STR (81.33 ± 6.82, 79.70 ± 6.89 และ 74.08 ± 8.37) แบบ LIN (51.85 ± 9.20, 49.27 ± 9.38 และ 42.90 ± 9.31) และแบบ WOB (61.82 ± 6.58, 59.72 ± 6.72 และ 55.64 ± 6.34) ในขณะทอสจมชวตในกลมท 3 สงกวากลมท 2 และกลมควบคม (54.99 ± 11.19, 51.36 ± 11.97 และ 48.30 ± 10.15 ตามล าดบ) แตลกษณะความผดปกตสวนหางของอสจทงกลมท 2 และ 3 ต ากวากลมควบคมอยางมนยส าคญทางสถต (P<0.05) ในขณะทความสมบรณของอะโครโซมของทงสามกลมไมแตกตางกน (P>0.05) (58.61 ± 24.97, 58.11 ± 25.43 และ 63.79 ± 22.08 ตามล าดบ) สรปไดวาการปนแยกเซมนอลพลาสมาโดยใชสารละลายเพอรคอลทงแบบชนเดยวและแบบสองชนมคณภาพน าเชอแชแขงสกรสงกวาการปนแยกเซมนอลพลาสมาแบบไมใชสารละลายเพอรคอล โดยคณภาพน าเชอแชแขงสกรภายหลงการละลายจากการปนแยกดวยสารละลายเพอรคอลแบบสองชนสงกวาการปนแยกดวยสารละลายเพอรคอลแบบชนเดยว

ค าส าคญ: เซมนอลพลาสมา น าเชอแชแขงสกร สารละลายเพอรคอล เลขทะเบยนวจย: 60(1)-(60:02)-0208-025 ส านกเทคโนโลยชวภาพการผลตปศสตว อ.เมอง จ.ปทมธาน


76

Effect of Percoll density gradient centrifugation for boar thawing semen quality

Worapong Pongsiri Janyaporn Rungruangsak

Abstract

The present experiment aimed to evaluate the effects of different Percoll density gradient centrifugations on frozen-thawed boar semen quality. Nine mature boars aged 2 to 3 years old, were collected semen at one-week interval over a 4-week period. After incubation at 15 °C for 120 minutes, semen was divided into 3 groups; control group: separated without using Percoll, group 2: separated using one-step Percoll at 80% concentration, and group 3: separated using two-step Percoll with lower part of 80% and upper part of 45% concentrations. All semen samples were centrifuged for seminal plasma separation at 2,000 rpm for 15 minutes. The sperm pellets from each group, were used to continue the process of frozen-thawed boar semen production and stored in liquid nitrogen at least 24 hours before semen quality evaluation. The frozen semen quality was evaluated including sperm motility, velocity, kinematic movement, and sperm with tail defects using CASA as well as sperm viability and acrosomal integrity using flow cytometer. The results showed that frozen-thawed boar semen quality from group 2 and 3 were significantly better than the control group (P<0.05) including motility (32.94 ± 11.80, 35.72 ± 10.52 and 25.22 ± 13.45), progressive motility (12.99 ± 5.86, 14.09 ± 5.51 and 7.04 ± 5.22), velocity VSL (52.91 ± 11.16, 54.04 ± 8.29 and 46.20 ± 9.99), kinematic movement STR (81.33 ± 6.82, 79.70 ± 6.89 and 74.08 ± 8.37), LIN (51.85 ± 9.20, 49.27 ± 9.38 and 42.90 ± 9.31), and WOB (61.82 ± 6.58, 59.72 ± 6.72 and 55.64 ± 6.34). Moreover, sperm viability from group 3 was higher than group 2 and control group (54.99 ± 11.19, 51.36 ± 11.97 and 48.30 ± 10.15 respectively) with statistical significance (P<0.05). The sperm with tail defects from group 2 and 3, were significantly lower than control group (P<0.05), whereas the acrosomal integrity did not show a significant difference (P>0.05) among the groups (58.61 ± 24.97, 58.11 ± 25.43 and 63.79 ± 22.08 respectively). In conclusion, the process of seminal plasma separation using both one-step Percoll at 80% concentration and two-step Percoll with lower part of 80% and upper part of 45% concentrations, provided better quality of frozen-thawed boar semen than those from the centrifugation without Percoll. Furthermore, two-step Percoll provided better quality of frozen-thawed boar semen than one-step Percoll.

Keywords: seminal plasma, frozen boar semen, Percoll

Registered No: 60(1)-(60:02)-0208-025 Bureau of Biotechnology in Livestock Production, Muang district, Pathum Thani province


77

ค าน า

ปจจบนการใชน าเชอแชแขงสกรในอตสาหกรรมการผลตสกรทวโลกมประมาณ 1% เทานน (Yeste, 2015) เนองมาจากมประสทธภาพในการผสมเทยมตออตราการผสมตดและจ านวนลกสกรตอครอกทต ากวาการใชน าเชอสดหรอแชเยน (Chanapiwat et al., 2014; Martinez-Alborcia et al., 2012) แตขอดของการเกบรกษาน าเชอดวยวธการแชแขงคอสามารถเกบรกษาอสจใหคงสภาพทดไดเปนเวลายาวนาน เพอน ากลบมาใชในการเพาะขยายพนธสกรทมคณคาทางเศรษฐกจสง ลดขอจ ากดดานอายของพอพนธสกรผสมเทยม (Safranski et al., 2011) สามารถขนสงระยะทางไกลและลดความเสยงในการแพรผานของโรคทางระบบสบพนธ (Chanapiwat et al., 2014)

น าเชอแชแขงสกรคณภาพดเปนอกปจจยหนงทจะสามารถเพมประสทธภาพการผสมเทยม ดงนนจงมความส าคญทจะพฒนาขบวนการผลตเพอเพมคณภาพน าเชอแชแขงสกร ซงมขนตอนและเทคนคทซบซอนกวาน าเชอปศสตวชนดอน โดยเฉพาะขนตอนการปนแยกเซมนอลพลาสมา (seminal plasma) ซงเปนขนตอนในการเพมความเขมขนของอสจใหสามารถเตมสารละลายในขบวนการแชแขง อกทงยงสามารถคดแยกอสจคณภาพดออกจากอสจคณภาพต า รวมถงสงปนเปอนอนๆ (Matás et al., 2011; Suzuki and Nagai, 2003) โดยวธทนยมคอการใชสารละลายเพอรคอลเพอเพมประสทธภาพการในปนแยก ซงเพอรคอลไมเปนพษตอเซลล (Avery and Greve, 1995)

การใชสารละลายเพอรคอลในขนตอนการปนแยกเซมนอลพลาสมาจากน าเชอ อาศยหลกการของสารละลายทมคาความหนาแนนทไมตอเนองกนหลายระดบ (discontinuous density gradient) โดยท าใหสารทตองการคดแยกเคลอนทไปสจดทมคาความหนาแนนทตรงกน ซงเทคนคการปนแยกนสามารถใชแยกอสจทเคลอนทไดออกจาก เซมนอลพลาสมา อสจทไมสามารถเคลอนทได และเซลลปนเปอนชนดอนๆ (Morrell, 2006) และเปนทนยมในสตวหลายชนด (Arias et al., 2017) เชน สนข (Phillips et al., 2012) สกร (Grant et al., 1994; Jeong, B.S. and X. Yang, 2001; Matás et al., 2011; Mattioli et al., 1989) มา (Lindsey et al., 2002) โค (Arias et al., 2017; Cesari et al., 2006; Lee et al., 2009) โดยมรายงานการศกษาการใชสารละลายเพอรคอลเพอปนแยกน าเชอสกรทงแบบสารละลายเพอรคอลแบบชนเดยวทระดบความเขมขน 15%, 30%, 45%, 60%, 75% และ 90% พบวาทความเขมขน 90% สามารถปนแยกอสจสกรไดดกวาเมอเปรยบเทยบกบระดบความเขมขนอน (Suzuki and Nagai, 2003) ในขณะทการปนแยกแบบสองชน ชนท 1 ความเขมขน 90% และชนท 2 ความเขมขน 45% มความเรวและลกษณะการเคลอนทของอสจสงกวากลมควบคมทไมใชสารละลายเพอรคอล (Matás et al., 2011) แตในการศกษานพบวาการเตรยมสารละลายเพอรคอลทความเขมขน 90% ท าใหอสจผานลงมาไดนอยไมเพยงพอตอการผลตน าเชอแชแขงสกรจงไดท าการปรบระดบความเขมขนของเพอรคอลใหเหมาะสมกบการศกษาในครงน

โดยมวตถประสงคเพอศกษาผลของการปนแยกเซมนอลพลาสมาดวยสารละลายเพอรคอลตอคณภาพน าเชอ แชแขงสกรภายหลงการละลาย ในขบวนการผลตน าเชอแชแขงสกรเพอใหไดน าเชอสกรทมคณภาพสงขน


สตวทดลอง พอพนธสกรสายพนธดรอค ลารจไวท และแลนดเรซ ทมความสมบรณพนธ อายระหวาง 2-3 ป

สายพนธละ 3 ตว จ านวน 9 ตว จากศนยวจยและพฒนาสกร จงหวดนครราชสมา รดเกบน าเชอโดยใชเทคนคการใชมอบบนวดทปลายอวยวะสบพนธเพศผ (gloved hand technique) สปดาหละ 1 ครง เปนเวลา 4 สปดาหตดตอกน โดยน าเชอสดสกรทน ามาผลตน าเชอแชแขงตองมคาอตราการเคลอนทของอสจไมต ากวา 70% (Buranaamnuay et al. 2009; Kaeoket et al. 2010) และคาความผดปกตของอสจในสวนหวและสวนหางไม


78

เกน 12% และ 25% ตามล าดบ โดยดดแปลงจากเกณฑคาความผดปกตของอสจในการผลตน าเชอแชแขงสกรของ Kaeoket et al. (2010) โดยใชวธยอมส William’s staining (Blom and Birch-Andersan, 1970)

การวางแผนการทดลอง วางแผนการทดลองแบบ Randomized Complete Block Design (RCBD) ก าหนดใหสายพนธ

พอสกรเปนบลอก (block) โดยน าน าเชอพอพนธสกรทรดเกบไดเจอจางดวยน ายาเจอจางน าเชอชนด Duragen®

(Magapor, Spain) อตราสวน 1:1 (v/v) บรรจในหลอดทดลอง และวางในภาชนะทหลอดวยน าใหมระดบเดยวกนกบของเหลวภายในขวด บมทอณหภม 15 °C นาน 120 นาท จากนนแบงน าเชอออกเปน 3 กลมเทาๆ กน คอ กลมควบคม ปนแยกเซมนอลพลาสมาโดยไมเตมสารละลายเพอรคอล กลมท 2 เตมสารละลายเพอรคอลชนเดยวท 80% และกลมท 3 ใชสารละลายเพอรคอลสองชน ชนท 1 ความเขมขน 80% และชนท 2 ความเขมขน 45% น าไปปนเหวยงทความเรว 2,000 รอบตอนาท อณหภม 20 °C เปนเวลา 15 นาท

การผลตน าเชอแชแขง ด าเนนการผลตน าเชอแชแขงดดแปลงจากวธของ Buranaamnuay et al. (2009) โดยแยกเอาของเหลว

สวนบนทง เจอจางดวย lactose-egg yolk (LEY; 20% ไขแดง ในสารละลาย 11% lactose) ใหอสจมความเขมขน 1.5x109 ตว/มลลลตร และแชเยนท 4 °C นาน 120 นาท หลงจากนนเจอจางดวยน ายาเจอจาง LEY ผสมกบ 9% glycerol และ 1.5% Equex-STM ใหมความเขมขน 1.0x109 ตว/มลลลตร

การบรรจและการแชแขง บรรจน าเชอดวยหลอดบรรจน าเชอขนาด 0.5 มลลลตร จากนนน าไปองไวเหนอไอไนโตรเจน 3-4

เซนตเมตร อณหภมประมาณ -120 °C นาน 20 นาท และเกบรกษาไวภายใตระดบไนโตรเจนเหลวเพอตรวจคณภาพน าเชอตอไป

การตรวจวเคราะหคณภาพน าเชอ คณภาพน าเชอสดและน าเชอภายหลงการปนแยกเซมนอลพลาสมา ดวยการตรวจอตราการเคลอนทของ

อสจ (motility) และความผดปกตของอสจ (abnormal morphology) ดวยเครอง CASA (Computer Assisted Sperm Analyzer; IVOS II Motility Analyzer version, Hamilton-Thorne, Biosciences, MA., USA.) แ ล ะความเขมขนของอสจดวย hemocytometer

คณภาพน าเชอแชแขงภายหลงการละลาย สมน าเชอแชแขงจากทกชดการผลตๆ ละ 3 หลอดตอ พอพนธสกร ละลายน าเชอแชแขงสกรดวยวธการอนในน าอณหภมท 50 °C นาน 12 วนาท และตวอยางบมไวทอณหภม 37 °C ตลอดการตรวจคณภาพ ดงน

1) อตราการเคลอนท (motility; %) อตราการเคลอนทไปขางหนา (progressive motility; %) อตราการเคลอนทแบบชา (slow motility; %) และอสจทไมเคลอนท (static sperm; %) 2) ความเรวในการเคลอนท ไดแก

- Average Path Velocity (VAP; µm/s) หมายถง ความเรวในการเคลอนทเฉลยจากระยะทางจรงใน 1 วนาท

- Straight Line Velocity (VSL; µm/s) หมายถง ความเรวในการเคลอนทวถตรง เปนการค านวณจากจดหนงไปยงอกจดหนงในแนวเสนตรงในชวงระยะเวลา 1 วนาท


79

- Curvilinear Velocity (VCL; µm/s) หมายถง ความเรวในการเคลอนทวถโคง เปนการค านวณแนวโนมของการเคลอนทเฉลยใน 1 วนาท 3) ลกษณะการเคลอนท ไดแก

- Amplitude of Lateral Head Displacement (ALH; µm) หมายถง ความกวางของสวนหวของอสจทสายไปมา

- Beat Cross Frequency (BCF; Hz) หมายถง ความถของการสายสวนหวของอสจ - Straightness (STR; %) หมายถง ความตรงในการเคลอนท ซงค านวณจากอตราสวนความเรว

ของการเคลอนทในวถตรง (VSL) ตอความเรวเฉลยในการเคลอนท (VAP) คณดวยรอย - Linearity (LIN; %) หมายถง อตราสวนความเรวของการเคลอนทในวถตรงตอความเรวเฉลย

ของการเคลอนทวถโคง (VCL) คณดวยรอย - Wobble (WOB; %) หมายถง อตราสวนความเรวเฉลยในการเคลอนท (VAP) ตอความเรว

เฉลยของการเคลอนทวถโคง (VCL) คณดวยรอย 4) ความผดปกตในสวนหางของอสจโดยใชโปรแกรมตรวจความผดปกตอสจดวยเครอง CASA 5) อสจมชวตและความสมบรณของอะโครโซมดวยเครอง flow cytometer (Attune NxT, Thermo Fisher Scientific, USA) ดงน - ความสมบ รณ ของอะโคร โซมโดยย อมด วยส FITC-PNA (Lectin PNA From Arachis

hypogaea (peanut), Alexa Fluor™ 488, Thermo Scientific, Kalamazoo, MI, L21409.) แ ล ะ PI (LIVE/DEAD Sperm Viability Kit ,Molecular Probes) ตามวธการของ Nagy et al., (2003) นบจ านวนอสจทงสน 10 ,000 ตวอสจ

เกณฑการพจารณาคณภาพน าเชอทง 3 กลม ภายหลงการปนแยกดวยสารละลายเพอรคอล *ภาคผนวก

การวเคราะหทางสถต วเคราะหความแปรปรวนของขอมลดวย one-way analysis of variance (one-way ANOVA) และ

เปรยบเทยบผลเฉลยดวยวธ Tukey’s multiple comparison test ก าหนดคาความแตกตางอยางมนยส าคญทระดบรอยละ 95 (P<0.05) โดยใชโปรแกรมทางสถต R commander version 3.5.2 (R Core Team, 2018)

ผลการทดลอง

อตราการเคลอนทของอสจ จาก Table 1 ผลการวเคราะหคณภาพน าเชอแชแขงสกรภายหลงการละลายในกลมท 2 ปนแยกดวย

สารละลายเพอรคอลชนเดยวทความเขมขน 80% และกลมท 3 ปนแยกสารละลายเพอรคอลสองชน ชนท 1 ความเขมขน 80% และชนท 2 ความเขมขน 45% พบวาอตราการเคลอนทและอตราการเคลอนทไปขางหนาสงกวากลมควบคมทไมไดใชสารละลายเพอรคอล อยางมนยส าคญทางสถต (P<0.05) แตไมพบความแตกตางระหวางกลมท 2 และกลมท 3 (P>0.05) สวนอสจทไมเคลอนทในกลมควบคม มคาสงกวากลมท 2 และกลมท 3 อยางมนยส าคญทางสถต (P<0.05)


80

Table 1 Sperm motility parameters of frozen-thawed boar semen from three different Percoll density gradient centrifugations (mean ± SD)

Parameters (%)

Treatment

Without Percoll (N=36)

Percoll 80% (N=36)

Percoll 80/45% (N=36)

Total motility 25.22b ± 13.45 32.94a ± 11.80 35.72a ± 10.52 Progressive motility 7.04b ± 5.22 12.99a ± 5.86 14.09a ± 5.51 Slow motility 9.33 ± 4.01 10.21 ± 4.13 10.46 ± 4.04 Static sperm 74.78a ± 11.54 67.06b ± 10.97 64.28b ± 10.41

ab Different superscripts within the same row demonstrate significant differences (P0.05)

ความเรวและลกษณะการเคลอนทของอสจ เมอพจารณาความเรวและลกษณะการเคลอนทของตวอสจในน าเชอแชแขงสกรภายหลงการละลาย

พบวาในกลมท 2 และกลมท 3 มความเรวในการเคลอนทของอสจ VSL และลกษณะการเคลอนทแบบ STR แบบ LIN และแบบ WOB สงกวากลมควบคม (P<0.05) ซงไมพบความแตกตางระหวางกลมท 2 และกลมท 3 (Table 2)

Table 2 Velocity and kinematic movement parameters of frozen-thawed boar semen from three different Percoll density gradient centrifugations (mean ± SD)

Parameters

Treatment

Without Percoll (n=36)

Percoll 80% (n=36)

Percoll 80%/45% (n=36)

Velocity VAP (µm/s) 64.88 ± 15.93 66.16 ± 14.63 68.78 ± 10.34 VSL (µm/s) 46.20b ± 9.99 52.91a ± 11.16 54.04a ± 8.29 VCL (µm/s) 125.14 ± 34.96 113.87 ± 30.81 121.98 ± 24.32

Kinematic movement ALH (µm) 5.02 ± 0.67 4.56 ± 1.24 4.90 ± 1.06 BCF (Hz) 34.04 ± 5.50 32.89 ± 3.52 34.33 ± 3.64 STR (%) 74.08b ± 8.37 81.33a ± 6.82 79.70a ± 6.89 LIN (%) 42.90b ± 9.31 51.85a ± 9.20 49.27a ± 9.38 WOB (%) 55.64b ± 6.34 61.82a ± 6.58 59.72a ± 6.72

abDifferent superscripts within the same row demonstrate significant differences (P0.05)

ความผดปกตของอสจสวนหาง ส าหรบการวเคราะหคณภาพน าเชอแชแขงสกรดานรปรางและความผดปกตของตวอสจสวนหาง (Table

3) พบวากลมท 2 และกลมท 3 มความผดปกตในสวนหางทงแบบหางงอ (bent tail) และแบบมกอนคลายหยดน า


81

ทหางตรงสวนปลาย (distal droplet) ต ากวากลมควบคม และไมพบความแตกตางระหวางกลม ท 2 และกลมท 3 (P>0.05) สวนความผดปกตของอสจแบบหางมวน (coiled tail) ในกลมท 3 มคาต ากวากลมท 2 และกลมควบคม (P<0.05)

Table 3 Sperm with tail defects of frozen-thawed boar semen from three different Percoll density gradient centrifugations (mean ± SD)

Parameters (%)

Treatment


Percoll 80% (n=36)

Percoll 80%/45% (n=36)

Bent tail 21.48a ± 8.20 16.94b ± 9.36 16.01b ± 6.75 Coil tail 2.8a ± 1.80 2.47a ± 1.71 1.64b ± 0.97 Proximal droplet 16.21 ± 8.40 13.03 ± 5.72 14.78 ± 5.74 Distal droplet 9.98a ± 4.31 7.09b ± 3.98 7.84b ± 4.43


อสจมชวตและความสมบรณของอะโครโซม ส าหรบการวเคราะหคณภาพน าเชอแชแขงสกรดานจ านวนอสจมชวตและความสมบรณของอะโครโซม

(Table 4) พบวาอสจมชวตในกลมท 3 มคาสงกวากลมท 2 และกลมควบคม อยางมนยส าคญทางสถต (P<0.05) ในขณะทความสมบรณของอะโครโซมของอสจสกรจากทง 3 กลมไมแตกตางกนทางสถต (P>0.05)

Table 4 Sperm viability and sperm with intact acrosome of frozen-thawed boar semen from three different Percoll density gradient centrifugations (mean ± SD)

Parameters (%)

Treatment


Percoll 80% (n=36)

Percoll 80%/45% (n=36)

Sperm viability 48.30b ± 10.15 51.36b ± 11.97 54.99a ± 11.19 Intact acrosome 58.61 ± 24.97 58.11 ± 25.43 63.79 ± 22.08


เมอท าการตรวจอสจมชวตและความสมบรณของอะโครโซมโดยการยอมสฟลออเรสเซนตชนด FITC ทบงบอกถงความผดปกตของอะโครโซม และชนด PI ทบงบอกถงความผดปกตของผนงหมเซลลอสจ (plasma membrane) หรออสจทตายดวยเครอง Flow cytometer พบวาอสจทมชวตและมความสมบรณของอะโครโซมตองไมตดสทง 2 ชนด (FITC-, PI-) (Figure1 , 2)


82

Figure 1. Flow cytometric out-gating of egg yolk particles based on scatter properties after dual-staining. (A) and (B) show small particles as judged on two-dimensional forward-scatter and sideways-scatter dot plot properties (A) were gated out for analyses to selectively analyze particles with sperm-like scatter properties (B). The two-dimensional fluorescence dot plot of PI and FITC-PNA fluorescence (C).

Figure 2. The lower left quadrant represents sperm cells with intact plasma membrane

and acrosome, and the lower right quadrant shows sperm cells with intact plasma membranes but after the reaction of acrosome. The upper quadrants indicate the same acrosomal status of deteriorated cells, respectively.


83

วจารณผลการทดลอง

จากผลการศกษาพบวา น าเชอแชแขงสกรภายหลงการละลายในกลมทผานขบวนการปนเหวยงเพอแยกเซมนอลพลาสมาดวยสารละลายเพอรคอลทงแบบชนเดยวทความเขมขน 80% และแบบสองชน ชนท 1 ความเขมขน 80% และชนท 2 ความเขมขน 45% ใหผลอตราการเคลอนทและอตราการเคลอนทไปขางหนาของอสจมคาสงกวากลมทไมไดใชสารละลายเพอรคอลในการปนแยก นอกจากนยงพบวาความเรวในการเคลอนทของอสจแบบ VSL และลกษณะการเคลอนทแบบ STR, LIN และ WOB ของอสจสกรภายหลงการละลาย ในกลมทผานขบวนการปนเหวยงเพอแยกเซมนอลพลาสมาดวยสารละลายเพอรคอล ทงแบบชนเดยวและแบบสองชน มคาสงกวากลมทไมไดใชสารละลายเพอรคอลในการปนแยกเซมนอลพลาสมา ซงแสดงใหเหนวาการปนเหวยงเพอแยก เซมนอลพลาสมาดวยสารละลายเพอรคอลชวยเพมคณภาพน าเชอแชแขงสกรภายหลงการละลายใหสงขน จากคาความเรวในการเคลอนทแบบ VSL ลกษณะการเคลอนทแบบ STR, LIN และ WOB ทเพมขน แสดงถงอสจ มความสามารถในการเคลอนทไดดขนในขณะทยงคงลกษณะการเคลอนทปกตของอสจไว โดยประเมนจากลกษณะการเคลอนทแบบ ALH และ BCF ทไมแตกตางกบกลมทไมไดใชสารละลายเพอรคอลในการปนแยก สอดคลองกบการศกษาของ Grant et al. (1994) และ Matás et al. (2011) ทรายงานวาอตราการเคลอนท ความเรวและลกษณะการเคลอนทของอสจมคาสงขนภายหลงการปนแยกดวยสารละลายเพอรคอล ในท านองเดยวกบ Suzuki and Nagai (2003) ทรายงานวาการปนแยกดวยสารละลายเพอรคอลมผลใหอตราการเคลอนทและอตราการเคลอนทไปขางหนาของอสจสกรเพมขน

นอกจากนการปนแยกน าเชอดวยสารละลายเพอรคอลยงสามารถแยกอสจทมความผดปกตออกได โดยพบวาความผดปกต ในส วนหางของอสจสกรแชแข งภายหล งการละลายท งแบบหางงอ (bent tail) แบบหางมวน (coiled tail) และแบบมหยดน าทบรเวณสวนปลายของหาง (distal droplets) มคาต ากวาน าเชอแชแขงสกรทไมผานขบวนการปนแยกดวยสารละลายเพอรคอล สอดคลองกบการศกษาของ Matás et al. (2011) ทพบวาวาการคดแยกอสจสกรดวยสารละลายเพอรคอลสามารถชวยลดความผดปกตในสวนหางและความผดปกตแบบมหยดน าทบรเวณสวนปลายของหาง สวนความสมบรณของอะโครโซมพบวาการปนแยกดวยสารละลาย เพอรคอลไมมผลตออะโครโซมของอสจสกร โดยอะโครโซมของอสจสกรแชแขงทผานขบวนการปนแยกดวยสารละลายเพอรคอลมความสมบรณของอะโครโซมไมแตกตางกบอะโครโซมของอสจสกรแชแขงทไมผานขนตอนการปนแยกดวยสารละลายเพอรคอล สอดคลองกบการศกษาของ Matás et al. (2011) ทพบวาการปนแยกอสจสกรดวยจ านวนชนและความเขมขนของเพอรคอลทแตกตางกนไม มผลตอความสมบรณของอะโครโซม ซง อะโครโซมเปนสวนทหอหมเอนไซมหลายชนดทมความจ าเปนตอการปฏสนธในระบบสบพนธเพศเมย (Senger, 2012) แตอยางไรกตามในการทดลองครงนพบวาการปนแยกดวยสารละลายเพอรคอลแบบสองชนจะมปรมาณอสจมชวตสงกวาเมอปนแยกดวยสารละลายเพอรคอลแบบชนเดยว อาจเนองมาจากสารละลายเปอรคอลแบบสองชนมคาความหนาแนนของสารละลายแตกตางกน 2 ระดบ คอคาความเขมขน 80% และ 45% โดยอสจทมชวตและมรปรางปกตจะมคาความหนาแนนมากกวาและเคลอนทไดดกวา สามารถผานระดบชนความเขมขนทแตกตางซงคลายกบการคดแยกกนสองระดบไดดกวา อสจทตายแลวหรอเคลอนทไมได ทงนอสจเหลานจะตดอยในชนความเขมขนของเพอรคอล 80% และ 45% ดงนนจงพบจ านวนอสจมชวตจากการปนแยกดวยสารละลายเพอรคอลแบบสองชนสงกวาจากการปนแยกดวยสารละลายเพอรคอลแบบชนเดยวทความเขมขน 80% โดยสอดคลองกบการศกษาของ Sharma et al. (1997) ทเปรยบเทยบระหวางการคดแยกอสจโดยใชสารละลายเปอรคอลแบบชนเดยวและแบบสองชน พบวาการคดแยกอสจโดยใชสารละลายเปอรคอลแบบสองชน มอตราการเคลอนทของอสจและอสจมชวตดกวาการคดแยกอสจโดยใชสารละลายเปอรคอลแบบชนเดยวอยางมนยส าคญ


84

จากผลการศกษาในครงนแสดงใหเหนวาการเพมขนตอนการปนแยกดวยสารละลายเพอรคอลในขบวนการผลตน าเชอแชแขงสกรสามารถเพมคณภาพน าเชอแชแขงสกร โดยจ านวนอสจมชวตเพมขน อสจทมรปรางผดปกตลดลง และไมมผลตอความสมบรณของอะโครโซม ซงชวยเพมโอกาสในการปฏสนธไดมากขนส าหรบการผสมเทยมสกร รวมทงการปฏสนธภายนอกรางกาย (IVF) โดยมรายงานวา ผลการปฏสนธดวยเทคนค IVF โดยการใชอสจสกรแชแขงน ามาผานการปนแยกดวยสารละลายเพอรคอล ใหผลการปฏสนธทดกวาเมอเปรยบเทยบกบแบบไมไดปนแยกดวยสารละลายเพอรคอลถง 50% (Suzuki and Nagai, 2003) นอกจากน การปนแยกน าเชอดวยสารละลายเพอรคอลยงเปนการคดแยกอสจทตายแลวออกจากน าเชอทจะใชผลตน าเชอ แชแขง สงผลใหอนมลอสระออกซเจน (Reactive Oxygen Species; ROS) ลดลง โดยการศกษาของ Roca et al. (2013) รายงานวาอสจทตายแลวทมอยในน าเชอมผลเสยตอการใชน าเชอแชแขงสกร โดยพบวาอสจทตายจะสงผลลบตอการใชน าเชอแชแขงสกร ซงอาจเกดจากการสรางอนมลอสระออกซเจนทผลตภายในอสจ (endogenous ROS) ออกมาในปรมาณมากในระหวางขบวนการแชแขงอสจ ดงนนการคดแยกอสจทตายแลวออกกอนการผลตน าเชอแชแขง จงเปนการชวยเพมคณภาพน าเชอภายหลงการละลาย

โดยทวไปเมอเกบรกษาน าเชอแชแขงในไนโตรเจนเหลวทอณหภม -196 °C จะสามารถคงคณภาพ (quality) และหน าท (function) ของอส จ ส าหรบการผสมเทยมได (Mazur, 1984) แตอย า ง ไรกตาม จากการศกษาของ Li et al. (2018) ไดรายงานวา คณภาพน าเชอแชแขงสกรสามารถลดลงไดหากเกบรกษาเปนระยะเวลาทยาวนานหลายปภายใตระดบไนโตรเจนเหลว แมวาจ านวนอสจสกรมชวตไมแตกตางกน แตอตราการเคลอนทและอตราการเคลอนทไปขางหนาของอสจลดลงเมอเกบเปนระยะเวลายาวนานมากกวา 4 ป สอดคลองกบการศกษาของ Fraser et al. (2014) ทพบวาการเกบรกษาน าเชอแชแขงสกรเปนระยะเวลาทยาวนาน อาจสงผลใหคณภาพอสจภายหลงการละลาย เชน อตราการเคลอนทของอสจภายหลงการละลายลดลง เปนตน การใชเทคนคการปนแยกเซมนอลพลาสมาดวยสารละลายเพอรคอลจากการศกษาในครงน จงเปนการพฒนาวธเพอเพมจ านวนอสจทมคณภาพใหดยงขน เพอใชในการเกบรกษาดวยวธการแชแขง และสงผลใหคณภาพน าเชอแชแขงภายหลงการละลายดขนกวาการผลตน าเชอแชแขงสกรทไมไดปนแยกดวยสารละลายเพอรคอลทงในดานอตราการเคลอนท ความเรวในการเคลอนท ลกษณะการเคลอนทของอสจ และความสมบรณของอะโครโซม อยางไรกตามการปนแยกเซมนอลพลาสมาดวยสารละลายเพอรคอล 2 ชนจะใหอสจมชวตในปรมาณทสงกวาและมความผดปกตของอสจแบบหางมวนต ากวาแบบปนแยกเซมนอลพลาสมาดวยสารละลายเพอรคอลชนเดยว

สรปผลการทดลอง การปนแยกเซมนอลพลาสมาดวยสารละลายเพอรคอลชนเดยวทความเขมขน 80% และสารละลาย

เพอรคอลสองชนทความเขมขน 80% และ 45% มผลท าใหคณภาพน าเชอแชแขงสกร ทงอตราการเคลอนท ความเรวในการเคลอนท ลกษณะการเคลอนทของอสจ สงกวาการปนแยกแบบไมใชสารละลายเพอรคอล ทงนการปนแยกดวยสารละลายเพอรคอลแบบ 2 ชนใหคณภาพน าเชอแชแขงสกรดกวาแบบชนเดยว

ขอเสนอแนะ แมวาการใชสารละลายเพอรคอลในขนตอนการปนแยกเซมนอลพลาสมาจะสามารถเพมคณภาพน าเชอ

แชแขงสกรภายหลงการละลายไดดกวาการปนแยกแบบไมใชสารละลายเพอรคอล แตกเปนการเพมตนทนในกระบวนการผลตน าเชอแชแขงสกร เนองจากปรมาตรน าเชอสกรทคอนขางมากเมอเปรยบเทยบกบการใชสารละลายเพอรคอลในสตวชนดอนจงตองใชสารละลายเพอรคอลในปรมาณทมากกวา ดงนน การเพมขนตอนการปนแยกดวยสารละลายเพอรคอลน จงเหมาะสมตอการใชในดานการอนรกษสกรสายพนธด มคณคา


85

ทางเศรษฐกจสง หรอประยกตใชกบน าเชอของพอพนธสกรทพบปญหาในการผลตดวยวธการแชแขงแบบปกต เพอใหไดอสจแชแขงสกรภายหลงการละลายทมคณภาพดหรอประยกตใชกบเทคโนโลยชวภาพชนดอน

กตตกรรมประกาศ งานวจยน ไดรบการสนบสนนจากส านกงานคณะกรรมการวจยแหงชาต (วช.) คณะผวจยขอขอบคณ

ผอ านวยการศนยวจยและพฒนาสกร จงหวดนครราชสมา ผอ านวยการศนยวจยเทคโนโลยชวภาพการยายฝากตวออนและเซลลสบพนธสตว เจาหนาทของศนยวจยและพฒนาสกรและศนยวจยเทคโนโลยชวภาพการยายฝากตวออนและเซลลสบพนธสตวทใหการชวยเหลอและสนบสนนใหสามารถด าเนนการวจยเปนไปตามวตถประสงค


86

เอกสารอางอง Arias, M.E., K. Andara, E. Briones and R. Felmer. 2017. Bovine sperm separation by Swim-up and density gradients (Percoll and BoviPure): Effect on sperm quality, function and gene expression. Reproductive Biology. 17(2):126-132. Avery, B. and T. Greve. 1995. Impact of Percoll on bovine spermatozoa used for in vitro insemination. Theriogenology. 44(6):871-878. Blom, E. and A. Birch-Andersen. 1970. Ultrastructure of the decapitated sperm defects in

Guernsey bulls. Reproduction. 23(1):67-72. Buranaamnuay, K., P. Tummaruk, J. Singlor, H. Rodriguez-Martinez and M. Techakumphu. 2009. Effects of straw volume and Equex-STM® on boar sperm quality after cryopreservation. Reproduction in Domestic Animals. 44(1): 69-73. Cesari, A., G.G. Kaiser, N. Mucci, A. Mutto, A. Vincenti, M.W. Fornés and R.H. Alberio. 2006. Integrated morphophysiological assessment of two methods for sperm selection in bovine embryo production in vitro. Theriogenology. 66(5):1185-1193. Chanapiwat, P., E. Olanratmanee, K. Kaeoket and P. Tummaruk. 2014. Conception rate and litter size in multiparous sows after intrauterine insemination using frozen-thawed boar semen in a commercial swine herd in Thailand. Journal of Veterinary Medical Science. 76(10):1347-1351. Fraser, L., J. Strzeżek and W. Kordan. 2014. Post-thaw sperm characteristics following long- term storage of boar semen in liquid nitrogen. Animal Reproduction Science. 147(3):119-127. Grant, S.A., S.E. Long and T.J. Parkinson. 1994. Fertilizability and structural properties of Boar spermatozoa prepared by Percoll gradient centrifugation. 1994. J. Reprod. Fertil. 100:477-483 Jeong, B.S. and X. Yang. 2001. Cysteine, glutathione, and Percoll treatments improve porcine oocyte maturation and fertilization in vitro. Molecular Reproduction and Development. 59(3):330-335. Kaeoket, K., P. Sang‐urai, A. Thamniyom, P. Chanapiwat and M. Techakumphu. 2010, Effect of docosahexaenoic acid on quality of cryopreserved boar semen in different breeds. Reproduction in domestic animals. 45:458-463. Lee, H.L., S.H. Kim, D.B. Ji and Y.J. Kim. 2009. A comparative study of Sephadex, glass wool and Percoll separation techniques on sperm quality and IVF results for cryopreserved bovine semen. Journal of veterinary science. 10(3):249-255. Li, J., I. Parrilla, M.D. Ortega, E.A. Martinez, M.H. Rodriguez and J. Roca. 2018. Post-thaw boar sperm motility is affected by prolonged storage of sperm in liquid nitrogen: A retrospective study.2018. Cryobiology. 80:119-125. Lindsey, A.C., L.H.A. Morris, W.R. Allen, J.L. Schenk, E.L. Squires and J.E. Bruemmer. 2002. Hysteroscopic insemination of mares with low numbers of non-sorted or flow


87

sorted spermatozoa. Equine Veterinary Journal. 34(2):128-132. Martinez-Alborcia, M.J., A. Valverde, I. Parrilla, J.M. Vazquez, E.A. Martinez and J. Roca. 2012. Detrimental effects of non-functional spermatozoa on the freezability of functional spermatozoa from boar ejaculate. Plos one. 7(5):36-55. Matás, C., L. Vieira, F.A. García-Vázquez, K. Avilés-López, R. López-Úbeda, J.A. Carvajal and J. Gadea.2011. Effects of centrifugation through three different discontinuous Percoll gradients on boar sperm function. Animal Reproduction Science. 127(1):62-72. Mattioli, M., M.L. Bacci, G. Galeati and E. Seren. 1989. Developmental competence of pig oocytes matured and fertilized in vitro. Theriogenology. 31(6):1201-1207. Mazur, P. 1984. Freezing of living cells: mechanisms and implications. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 247(3):125-142. Missio, D., N.P. Folchini, F.G. Leivas, C.I.I.U.M. Pavin, H.F. Pinto, F.W.S. Cibin and D.S. Brum. 2018. Reduction in Percoll volume increases recovery rate of sex-sorted semen of Bulls without affecting sperm quality and early embryonic development. Animal Reproduction Science. 192:146-153. Morrell, J.M. 2006. Update on Semen Technologies for Animal Breeding. Reproduction in Domestic Animals. 41(1):63-67. Nagy, S., J. Jansen, E.K. Topper and B.M. Gadella. 2003. A triple-stain flow cytometric method to assess plasma- and acrosome-membrane integrity of cryopreserved bovine sperm immediately after thawing in presence of egg-yolk particles. Biology of Reproduction. 68(5):1828-1835. Phillips, T.C., G.K. Dhaliwal, K.M. Verstegen-Onclin and J.P. Verstegen. 2012. Efficacy of four density gradient separation media to remove erythrocytes and nonviable sperm from canine semen. Theriogenology.77(1):39-45. R Core Team. 2018. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for statistical computing, Vienna, Austria. Roca, J., M.J. Martinez-Alborcia, M.A. Gil, I. Parrilla and E.A. Martinez. 2013. Dead spermatozoa in raw semen samples impair in vitro fertilization outcomes of frozen-thawed spermatozoa. Fertility and Sterility. 100(3):875-881. Safranski, T.J., J.J. Ford, G.A. Rohrer and H.D. Guthrie. 2011. Plenary contribution to International conference on boar semen preservation 2011: genetic selection for freezability and its controversy with selection for performance. Reproduction in Domestic Animals. 46(2):31-34. Senger, P.L. 2012. Reproductive behavior, pp. 228-253. Pathways to pregnancy and parturition. Current Conceptions, Inc. Redmond. Sharma, R.K., K. Seifarth and A. Agarwal. 1997. Comparison of single- and two-layer Percoll separation of motile spermatozoa. Int J Fertil Womens Med. 42(6):412-417 Suzuki, K. and T. Nagai. 2003. In vitro fertility and motility characteristics of frozen–thawed


88

boar epididymal spermatozoa separated by Percoll. Theriogenology. 60(8):1481- 1494. Yeste, M. 2015. Recent advances in boar sperm cryopreservation: state of the art and current perspectives. Reproduction in Domestic Animals. 50(2):71-79.

หน้าปก - DLDbiotech.dld.go.th › webnew › Data › Document_Announces › Journal ›...

Documents

Transcript of หน้าปก - DLDbiotech.dld.go.th › webnew › Data › Document_Announces › Journal ›...