บทท 3 อปกรณและวธการทดลอง

3.1 วสดเกษตร

ผลสบปะรดพนธภแลเกบเกยวทางการคา จากจงหวดเชยงราย คดเลอกผลทเปลอกมสเขยวทงผล ขนาดและรปรางใกลเคยงกน และปราศจากบาดแผล น าหนกประมาณ 500 กรม ขนสงมายงหองปฏบตการสถาบนวจยเทคโนโลยหลงการเกบเกยว มหาวทยาลยเชยงใหม น ามาเกบรกษาทอณหภม 10 และ 30 องศาเซลเซยส

3.2 วสดอปกรณ

1. เครองชงแบบทศนยม 2 ต าแหนง (digital balance, Mettler Toledo, PB 3002-5,

Switzerland) 2. เครองชงแบบทศนยม 4 ต าแหนง (digital balance, Mettler Toledo, PB 3002-5,

Switzerland) 3. เครองวดปรมาณของแขงทงหมดทละลายน าได แบบดจตอล (digital refractometer,

ATAGO, Model PR-101, Japan) 4. เครองไทเทรตอตโนมต (autotitrator, SCHOTT, TitroLine easy, Belgium) 5. เครองวดความเปนกรด-ดาง (pH-meter, SCHOTT GERATE, Consort C 831,

Belgium) 6. เครองวดส (color meter, Minolta CR-400, Japan)

7. เครองท าน าปราศจากไอออน (Easy pure RF, 1051, USA)

8. เครองวดการน าไฟฟา (conductivity meter, Sartorius, PP 20, Germany) 9. หมอนงอดไอ (autoclave, Hirayama, MIV HA-300, Japan)

10. เครองวดคาการดดกลนแสง (spectrophotometer, Analytik Jena, Specord 40,

Germany) 11. เครองปนผสม (homogenizer, Wiggen Hauser, D 500, Germany)

12. เครองเหวยงหนศนยกลางแบบควบคมอณหภม (refrigerated centrifuge, Hettich,

MIKRO 22R, USA)

29

13. เค รองกวนผสมแบบแมเหลกไฟฟา (hot plate stirrer, Harmony, MGS-1001,

Tokyo, Japan)

14. เครองเนยรอนฟราเรดสเปกโทรโฟโตมเตอร (near infrared spectrophotometer,

NIRSystem 6500, Foss NIR system, Silver spring, USA) 15. เครองปนผสม (vortex genic, Sciencetific industries, G-560E, USA) 16. เวอรเนยรคาลปเปอร (vernier caliper, Mitutoyo, Japan)

17. ปเปตตอตโนมต ขนาด 100, 200 ไมโครลตร 18. ปเปตตอตโนมต ขนาด 1, 5, 10 มลลลตร 19. เครองแกวชนดตางๆ 20. มดปอกผลไมและเขยงพลาสตก 21.ผาขาวบาง

3.3 ขอบเขตงานวจย งานวจยนแบงออกเปน 3 การทดลอง คอ การทดลองท 1 การเปลยนแปลงคณภาพทางกายภาพและทางเคมของผลสบปะรดท เกด

อาการไสสน าตาล การทดลองท 2 ความสมพนธระหวางคณภาพทางกายภาพและทางเคมของผลสบปะรดท

เกดอาการไสสน าตาลกบขอมลทไดจากเทคนคเนยรอนฟราเรดสเปกโทรสโกป การทดลองท 3 การทดสอบความแมนย าของสมการเทยบมาตรฐาน

3.4 การทดลองท 1 การเปลยนแปลงคณภาพทางกายภาพและทางเคมของผลสบปะรดทเกดอาการไสสน าตาล

ผลสบปะรดพนธภแลเกบเกยวทางการคา คดเลอกผลทเปลอกมสเขยวทงผล ขนาดและรปรางใกลเคยงกน และปราศจากบาดแผล น าหนกประมาณ 500 กรม น ามาเกบรกษาไวทอณหภม 2 ระดบ คอ 10 และ 30 องศาเซลเซยส เปนระยะเวลา 30 วน จากนนทก 5 วน สมตวอยางครงละ 10 ผลตออณหภม น าผลสบปะรดมาไวทอณหภมหอง (30 องศาเซลเซยส) เปนเวลา 2 วน แลวตรวจวเคราะหคณภาพทางกายภาพและทางเคม ดงน

1.ระดบความรนแรงของการเกดอาการไสสน าตาล (อษยาและจรงแท, 2551) ประเมนระดบความรนแรงของอาการไสสน าตาลในผลสบปะรด โดยประเมนจากพนท

หนาตดทเกดอาการไสสน าตาล ก าหนดเปนคะแนนจาก 0-5 ดงภาพท 3.1

30

0 คะแนน คอ ไมพบอาการไสสน าตาล

1 คะแนน คอ พบอาการไสสน าตาลนอยกวารอยละ 10 ของพนทหนาตด

2 คะแนน คอ พบอาการไสสน าตาลรอยละ 10-25 ของพนทหนาตด

3 คะแนน คอ พบอาการไสสน าตาลรอยละ 25-50 ของพนทหนาตด

4 คะแนน คอ พบอาการไสสน าตาลรอยละ 50-75 ของพนทหนาตด

5 คะแนน คอ พบอาการไสสน าตาลมากกวา รอยละ 75 ของพนทหนาตด

ภาพท 3.1 ระดบความรนแรงของการเกดอาการไสสน าตาล

31

2. การวเคราะหทางกายภาพ

2.1 เปอรเซนตการสญเสยน าหนก (weight loss)

การสญเสยน าหนกคอ น าหนกทหายไปของผลสบปะรดระหวางการเกบรกษา ชงน าหนกผลสบปะรดท งผล (รวมน าหนกจกและขวผล) ดวยเครองชงแบบทศนยม 2 ต าแหนง ค านวณหาเปอรเซนตการสญเสยน าหนกสดผลสบปะรด จากสตร

การสญเสยน าหนก (%) = (น าหนกผลกอนเกบรกษา – น าหนกผลหลงเกบรกษา) ×100

น าหนกผลกอนเกบรกษา 2.2 สของผลสบปะรด (color) วดสเปลอก สเนอ และสแกนของผลสบปะรด สวนขวผลและปลายผล ดวยเครองวดส แสดงในระบบ CIE บนทกคา L*, a*, b*, C* และ h ดงภาพท 3. 2 คา L* เปนคาแสดงความสวางของส ซงคา L* ม คา 0 ถง 100 ถาคา L* สง หมายถง มความสวางมาก แตถาคา L* ต า หมายถง มสมดมาก

คา a* เปนคาแสดงระดบสแดง และสเขยว เมอคา a* มคาเปนบวก แสดงวา วตถมสแดง ถาคา a* เปนลบ แสดงวา วตถมสเขยว คาทหางจาก 0 มาก หมายถงการปรากฏของสเดนชดมากขน

คา b* เปนคาแสดงระดบสเหลอง และสน าเงน เมอคา b* มคาเปนบวก แสดงวา วตถมสเหลอง ถาคา b* เปนลบ แสดงวา วตถมสน าเงน

เมอทง a* และ b* มคาเทากบ 0 แสดงวาวตถมสเทา คา Chroma (C*) เปนคาแสดงความเขมของสวตถ คา C* มคาเขาใกล 0 แสดงวา

วตถมสซดจาง (เทา) หากมคาเขาใกล 60 แสดงวาวตถมสเขม คา Hue angle (h°) เปนคาทแสดงสทแทจรงของวตถ ชวงมม 0-360 องศา ดงน

0-45 องศา แสดงสมวงแดงถงสสมแดง 45-90 องศา แสดงสสมแดงถงสเหลอง 90-135 องศา แสดงสเหลองถงสเหลองเขยว 135-180 องศา แสดงสเหลองเขยวถงสเขยว 180-225 องศา แสดงสเขยวถงสน าเงน 225-270 องศา แสดงสน าเงนเขยวถงสน าเงน 270-315 องศา แสดงสน าเงนถงสมวง 315-360 องศา แสดงสมวงถงสมวงแดง

32

ภาพท 3.2 CIE 1976 L*, a*, b* Color Space (Konica Minolta Sensing, Inc.)

3. การวเคราะหทางเคม 3.1 ปรมาณของแขงทงหมดทละลายน าได (total soluble solids, TSS)

ปรมาณของแขงทงหมดทละลายน าได คอ ปรมาณของสารประกอบชนดตางๆ ทละลายไดอยางสมบรณในตวท าละลายทมอยในน าผลไม ของแขงทละลายน าไดมกจะเปนน าตาลและกรดอนทรยชนดตางๆ รวมทงกรดอะมโนและกรดแอสคอรบกดวย (ลกขณาและนธยา, 2544) วธวเคราะห น าน าคนของเนอสบปะรดจากสองสวน คอ เนอสวนขวผลและปลายผล มาวดปรมาณของแขงทงหมดทละลายน าไดทงหมด ดวยเครองวดปรมาณของแขงทงหมดทละลายน าไดทงหมด หยดน าคนลงบนแผนปรซมของเครองมอ ซงอานคาไดตงแต 0-45 เปอรเซนต 3.2 ปรมาณกรดทไทเทรตได (titratable acidity, TA)

การวเคราะหปรมาณกรดทงหมดทไทเทรตได โดยการน าน าคนของเนอสบปะรดตวอยางทมจ านวนแนนอนมาไทเทรตกบสารละลายดางมาตรฐาน จนถงจดยต (end point) โดยใชคาพเอชเทากบ 8.2

33

การเตรยมสารละลาย สารละลายโซเดยมไฮดรอกไซด (NaOH) ความเขมขน 0.1 นอรมล: เตรยมโดยชง

โซเดยมไฮดรอกไซด (sodium hydroxide, MERCK, Darmstadt, Germany) 4.0 กรม ละลายในน ากลน แลวปรบปรมาตรดวยน ากลนใหครบ 1,000 มลลลตร

วธวเคราะห ปรมาณกรดทไทเทรตไดวเคราะหโดยวธไทเทรตชน น าน าสบปะรดปรมาตร 5

มลลลตร มาเตมน ากลน 45 มลลลตร ผสมตวอยางกบน าใหเขากน แลวจงไทเทรตดวยเครองไทเทรตอตโนมต กบสารละลายโซเดยมไฮดรอกไซดความเขมขน 0.1 นอรมล จนสารละลายมคา พเอชเทากบ 8.2 บนทกปรมาตรของสารละลายโซเดยมไฮดรอกไซดทใช ค านวณหาปรมาณกรดทงหมดทไทเทรตไดในรปของกรดซตรก มหนวยเปนเปอรเซนต (กรมตอ 100 กรมน าสบปะรดคน) โดยเปรยบเทยบกบคามาตรฐานดงน (AOAC, 2000) 1 มลลลตร สารละลายโซเดยมไฮดรอกไซด ความเขมขน 0.1 นอรมล ท าปฏกรยาสมมลพอดกบกรดซตรก 0.07 กรม ปรมาณกรดทงหมด (%) = ความเขมขนของNaOH (0.1N) × ปรมาตรของNaOH (ml.) × 0.07 ×100 ปรมาตรน าสบปะรด (ml.)

* milliequivalent of citric acid (anhydrous) = 0.07

3.3 สารประกอบฟนอลทงหมด (total polyphenol) ใชวธของ Singleton and

Rossi (1965) และ Ketsa and Atantee (1998)

การเตรยมสารละลาย 1. สารละลายเอทานอลความเขมขน 80% (v/v) เตรยมโดยตวงเอทานอล

(ethanol, Merck, Germany) ความเขมขน 95% ปรมาตร 210.5 มลลลตร ใสลงในขวดปรบปรมาตร 250 มลลลตร แลวปรบปรมาตรดวยน ากลนจนครบ 250 มลลลตร

2. Folin-Ciocalteu reagent ความเขมขน 10% (v/v) เตรยมโดยปเปตต Folin-

Ciocalteu reagent (Folin-Ciocalteu reagent, Merck, Germany) ปรมาตร 10 มลลลตร ใสลงในขวดปรบปรมาตร 100 มลลลตร แลวปรบปรมาตรดวยน ากลนจนครบ 100 มลลลตร

3. สารละลายโซเดยมคารบอเนตความเขมขน 7.5% (w/v) เตรยมโดยชงโซเดยมคารบอเนตแอนไฮดรส (sodium carbonate anhydrous, Fisher, United Kingdom) น าหนก7.5 กรม แลวปรบปรมาตรใหครบ 100 มลลลตร ดวยน ากลนในขวดปรบปรมาตร

34

4. สารละลายกรดแกลลกความเขมขน 0.1 มลลกรม/มลลลตร เตรยมโดยชงกรดแกลลก (gallic acid, AR Grade, Fluka, Switzerland) น าหนก 0.01 กรม แลวปรบปรมาตรใหครบ 100 มลลลตร ดวยน ากลนในขวดปรบปรมาตร

การสรางแผนภาพมาตรฐานของสารประกอบฟนอล ปเปตตสารละลายกรดแกลลกความเขมขน 0.1 มลลกรม/มลลลตร 50, 100, 150,

200, และ 250 ไมโครลตร ลงในหลอดทดลอง เตมน ากลนโดยใหปรมาตรรวมในแตละหลอดเทากบ 500ไมโครลตร เตมสารละลาย Folin-Ciocalteu reagent ความเขมขน 10% ปรมาตร 2.5 มลลลตร ลงในหลอด ผสมใหเขากนแลวตงทงไวทอณหภมหอง เปนเวลา 8 นาท หลงจากนนเตมสารละลายโซเดยมคารบอเนตความเขมขน 7.5% ลงไปหลอดๆ ละ 2 มลลลตร ผสมใหเขากน ตงไวทอณหภมหอง เปนเวลา 1 ชวโมง แลวน าไปวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 765 นาโนเมตร ดวยเครองสเปกโตรโฟโตมเตอร ตวอยางแผนภาพมาตรฐานแสดงในภาคผนวก ข (ภาคผนวก ข 1)

การสกดสารประกอบฟนอลทงหมด

ชงเนอและแกนผลสบปะรดทสบละเอยด 1 กรม ใสในบกเกอร เตมสารละลายส าหรบสกด (extraction solution) คอ เอทานอลความเขมขน 80% ทเยนจดลงไปปรมาตร 12 มลลลตร ปนใหละเอยดดวยเครองปนผสม ประมาณ 1 นาท แลวปรบปรมาตรดวยเอทานอลความเขมขน 80% ใหครบ 15 มลลลตร แลวน าไปปนดวยเครองเหวยงหนศนยกลางแบบควบคมอณหภม ดวยความเรว 5,000×g ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 20 นาท ภายหลงการปนน าเฉพาะของเหลวใส ซงเปนสารละลายทสกดไดไปใชวเคราะหหาปรมาณสารประกอบฟนอลทงหมด

วธวเคราะหปรมาณสารประกอบฟนอลทงหมด น าสารละลายใสทสกดไดมาเจอจาง 10 เทาโดยปรมาตร โดยน าสารละลายทสกด

ไดปรมาตร 1 มลลลตร ปรบปรมาตรดวยน ากลนใหครบ 10 มลลลตร ในขวดปรบปรมาตรแลว ปเปตตมา 0.5 มลลลตร ใสลงในหลอดทดลองเตมสารละลาย Folin-Ciocalteu reagent ความเขมขน 10% ปรมาตร 2.5 มลลลตรลงไป ผสมใหเขากนแลววางไวทอณหภมหอง เปนเวลา 8 นาท หลงจากนนเตมสารละลายโซเดยมคารบอเนตความเขมขน 7.5% ปรมาตร 2 มลลลตร ผสมใหเขากนวางไวทอณหภมหอง เปนเวลา 1 ชวโมง แลวน าไปวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 765 นาโนเมตร ดวยเครองสเปกโตรโฟโตมเตอร ค านวณหาปรมาณสารประกอบฟนอลทงหมด โดยน าคาไปเปรยบเทยบกบแผนภาพมาตรฐาน แลวค านวณหนวยเปนมลลกรม/กรมของเนอผลไม แสดงวธการค านวณในภาคผนวก ข 1

35

3.4 การรวไหลของสารอเลกโตรไลต (electrolyte leakage, EL) ใชวธของ (McCollum and McDonald, 1991; Weerahewa and Adikaram, 2005b)

การเตรยมสารละลาย สารละลายแมนนทอลความเขมขน 0.4 โมลาร เตรยมโดยชงแมนนทอล

(mannitol, AR grade, Fisher, United Kingdom) 72.868 กรม แลวปรบปรมาตรใหครบ 1,000 มลลลตร ดวยน ากลนในขวดปรบปรมาตร

วธวเคราะห น าเนอสบปะรดสวนใกลแกนผลและแกนผลสบปะรดบรเวณขวผลและปลายผล เจาะดวยเครองเจาะ (cork borer) ขนาดเสนผานศนยกลาง 1 เซนตเมตร ตดชนเนอใหมความหนาประมาณ 2 มลลเมตร จ านวน 4ชน/ตวอยาง ลางชนตวอยางดวยน าปราศจากไอออน (deionized

water) จากน นน าไปแชในหลอดทดลองทมสารละลายแมนนทอล ความเขมขน 0.4 โมลาร ปรมาตร 25 มลลลตร เปนเวลา 3 ชวโมง แลวจงวดคาการน าไฟฟาดวยเครองวดคาการน าไฟฟา จากนนน าไปนงดวยหมอนงอดไอ ทอณหภม 121 องศาเซลเซยส เปนระยะเวลา 30 นาท พกไวใหเยน แลวจงวดคาการน าไฟฟาอกครง เพอน าไปค านวณเปอรเซนตการรวไหลของสารอเลกโตรไลต ดงสมการ

การรวไหลของสารอเลกโตรไลต (%) = คาการน าไฟฟาของสารอเลกโตรไลตกอน autoclave X 100 คาการน าไฟฟาของสารอเลกโตรไลตหลง autoclave 4. การวเคราะหทางชวเคม

4.1 กจกรรมของเอนไซมโพลฟนอลออกซเดส (polyphenol oxidase activity,

PPO) ดดแปลงจากวธของ จฬาลกษณ (2552) การเตรยมสารละลายส าหรบสกดเอนไซม 1. สารละลายโซเดยมคลอไรดความเขมขน 2 โมลาร เตรยมโดยชงโซเดยมคลอ

ไรด (sodium chloride, AR Grade, E. Merck, Germany) น าหนก 11.70 กรม ละลายในน ากลน ปรบปรมาตรเปน 100 มลลลตรในขวดปรบปรมาตร

2. สารละลายไดโซเดยมไฮโดรเจนฟอสเฟตความเขมขน 0.5โมลาร เตรยมโดยชงไดโซเดยมไฮโดรเจนฟอสเฟตไดไฮเดรต (disodium hydrogen phosphate, AR Grade, Qrec,

New Zealand) น าหนก 8.8995 กรม ละลายในน ากลน แลวปรบปรมาตรใหเปน 100 มลลลตร ในขวดปรบปรมาตร

36

3. สารละลายโซเดยมไดไฮโดรเจนฟอสเฟตความเขมขน 0.5 โมลาร เตรยมโดยชงโซเดยมไดไฮโดรเจนฟอสเฟตไดไฮเดรต (sodium dihydrogen phosphate, AR Grade, Qrec,

New Zealand) น าหนก 7.8005 กรม ละลายในน ากลนปรบปรมาตรเปน 100 มลลลตร ในขวดปรบปรมาตร

4. สารละลายโซเดยมฟอสเฟตบฟเฟอรความเขมขน 0.5 โมลาร พเอช 6.4 เตรยมโดยน าสารละลายจากขอ 3 ปรมาตร 100 มลลลตร แลวเตมสารละลายจากขอ 2 ในขณะเตมสารละลายผสมใหเขากนตลอดเวลา จนสารละลายมคาพเอชเทากบ 6.4

5. สารละลายส าหรบสกดเอนไซม คอ สารละลายโซเดยมฟอสเฟตบฟเฟอรความเขมขน 0.05 โมลาร พเอช 6.4 ทมสารละลายโซเดยมคลอไรดความเขมขน 0.1 โมลาร เตรยมโดยน าสารละลายจากขอ 4 ปรมาตร 50 มลลลตร แลวเตมสารละลายจากขอ 1 ปรมาตร 25 มลลลตร จากนนปรบปรมาตรเปน 500 มลลลตร ในขวดปรบปรมาตร

การสกดเอนไซม ดดแปลงจากวธของ Flurkey and Jen (1978) ชงเนอสบปะรดทบดละเอยดน าหนก 1 กรม เตมสารละลายส าหรบสกด คอ

สารละลายโซเดยมฟอสเฟตบฟเฟอรความเขมขน 0.05 โมลาร พเอช 6.4 ทมสารละลายโซเดยม- คลอไรดความเขมขน 0.1 โมลาร ปรมาตร 10 มลลลตร จากนนปนใหละเอยดประมาณ 1 นาท ดวยเครองปนผสม ปรบปรมาตรของสารละลายใหครบ 10 มลลลตร ดวยสารละลายส าหรบสกด แลวน าไปปนดวยเครองเหวยงหนศนยกลางแบบควบคมอณหภม ความเรว 7,000 rpm ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 30 นาท ภายหลงการปนน าเฉพาะของเหลวใส (supernatant) ซงเปนสารละลายเอนไซมทสกดได (crude enzyme) ไปใชในการวดกจกรรมของเอนไซม

การเตรยมสารละลายส าหรบวเคราะหกจกรรมของเอนไซมโพลฟนอลออกซเดส 1. สารละลายไดโซเดยมไฮโดรเจนฟอสเฟตความเขมขน 0.2 โมลาร เตรยมโดยชง

ไดโซเดยมไฮโดรเจนฟอสเฟตไดไฮเดรต (disodium hydrogen phosphate, AR Grade, Qrec,

New Zealand) น าหนก 8.8995 กรม ละลายในน ากลน แลวปรบปรมาตรใหเปน 250 มลลลตร ในขวดปรบปรมาตร

2. สารละลายโซเดยมไดไฮโดรเจนฟอสเฟตความเขมขน 0.2 โมลาร เตรยมโดยชงโซ เดยมไดไฮโดรเจนฟอสเฟต (sodium dihydrogen phosphate, AR Grade, Qrec, New

Zealand) น าหนก 7.8005 กรม ละลายในน ากลนแลวปรบปรมาตรเปน 250 มลลลตร ในขวดปรบปรมาตร

3. สารละลายโซเดยมไดไฮโดรเจนฟอสเฟตความเขมขน 0.2 โมลาร พเอช 7.1

เตรยมโดยน าสารละลายจากขอ 2 ปรมาตร 50 มลลลตร แลวคอยๆ เตมสารละลายไดโซเดยม

37

ไฮโดรเจนฟอสเฟต พรอมคนสารละลายผสมใหเขากนตลอดเวลา จนสารละลายมคาพเอชเทากบ 7.1

4. สารละลายแคทคอลความเขมขน 0.25 โมลาร เตรยมโดยชงไพโรแคทคอล

(pyrocatechol, AR Grade, Merck, Switzerland) น าหนก 2.7527 กรม ละลายในน ากลน ปรบปรมาตรเปน 100 มลลลตร ในขวดปรบปรมาตร ซงสารละลายนจะตองเตรยมใหมทกครงกอนท าการทดลอง

วธวเคราะหกจกรรมของเอนไซมโพลฟนอลออกซเดส ดดแปลงจากวธของ Flurkey and Jen (1978) และวธของ Lee and Smith (1979)

ปเปตตสารละลายเอนไซมทสกดไดปรมาตร 0.25 มลลลตร ใสลงในหลอดทดลองทมสารต งตน คอ สารละลายแคทคอลปรมาตร 0.25 มลลลตร และปเปตตสารละลายโซเดยมฟอสเฟตบฟเฟอรความเขมขน 0.2 โมลาร พเอช 7.1 ปรมาตร 2 มลลลตร แลวน าไปวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 420 นาโนเมตรทนท ดวยเครองสเปกโตรโตรโฟโตมเตอรทอณหภม 25 องศาเซลเซยส แลวน าคาทวดไดไปเขยนแผนภาพระหวางระยะเวลากบคาการดดกลนแสงทวดได วเคราะหกจกรรมของเอนไซมทมอยในตวอยางในชวงของแผนภาพทมความชนเปนเสนตรง โดยก าหนดใหกจกรรมของเอนไซมโพลฟนอลออกซเดส 1 หนวย (unit) เทากบปรมาณเอนไซมทท าใหคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 420 นาโนเมตร เพมขน 0.001 หนวย ในเวลา 1 นาท ทคาพเอช 7.1 แลวค านวณหากจกรรมของเอนไซมโพลฟนอลออกซเดสเปนหนวยตอมลลกรมของโปรตนคานาท แสดงวธการค านวณในภาคผนวก ข 2 การเตรยมสารละลายส าหรบวเคราะหหาปรมาณโปรตน

1. สารละลายโซเดยมฟอสเฟตบฟเฟอรความเขมขน 0.05 โมลาร พเอช 6.4 ทมสารละลายโซเดยมคลอไรดความเขมขน 0.1 โมลาร ซงเปนสารละลายชนดเดยวกบทใชในการสกดเอนไซม

2. สารละลายโปรตนมาตรฐาน

- stock solution ความเขมขน 1% (w/v) เตรยมโดยชงโปรตนอล- บมนมาตรฐาน (bovine serum albumin, AR Grade, Sigma-Aldrich,USA) น าหนก 0.2500 กรม ละลายดวยน ากลนและปรบปรมาตรเปน 25 มลลลตรในขวดปรบปรมาตร

- working solution ความเขมขน 200 ไมโครกรม/มลลลตร เตรยมโดย ปเปตตสารละลาย stock solution ความเขมขน 1% (w/v) ปรมาตร 500 ไมโครลตร แลวปรบปรมาตรเปน 25 มลลลตร ในขวดปรบปรมาตรดวยสารละลายขอ 1

38

3 . ส ารล ะ ล าย ส ย อ ม เต ร ย ม โด ยช ง Coomassie Brilliant Blue G-250

(Coomassie Brilliant Blue G-250, Merck, Germany) น าหนก 0.0125 กรม ละลายในเอทา-นอลความเขมขน 95% (ethanol absolute, Merck, Germany) ปรมาตร 12.5 มลลลตร เตมกรดฟอสฟอรก (ortho-phosphoric acid, Merck, Germany) ปรมาตร 25 มลลลตร ปรบปรมาตรดวยน ากลนจนครบ 250 มลลลตร ในขวดปรบปรมาตร วธวเคราะหปรมาณโปรตนโดยวธ Dye binding วธของ Bradford (1976)

การสรางแผนภาพมาตรฐานของโปรตน

ปเปตตสารละลายโปรตนมาตรฐานความเขมขน 200 ไมโครกรม/มลลลตร ปรมาตร 50, 100, 150, 200 และ250 ไมโครลตร ลงในหลอดทดลอง เตมสารละลายโซเดยมฟอสเฟตบฟเฟอรความเขมขน 0.05 โมลาร พเอช 6.4 ทมสารละลายโซเดยมคลอไรดความเขมขน 0.1 โมลาร ลงในหลอดทดลอง โดยใหปรมาตรรวมในแตละหลอดเทากบ 300 ไมโครลตร จากนนเตมสารละลายสยอม Coomassie Brilliant Blue G-250 ลงไปหลอดละ 3.0 มลลลตร ผสมสารละลายใหเขากน ตงทงไว 10 นาท แลวน าไปวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 595 นาโน-เมตร ดวยเครองสเปกโตรโฟโตมเตอร ตวอยางแผนภาพมาตรฐานในภาคผนวก ข (ภาคผนวก ข 3)

วธวเคราะหปรมาณโปรตน ปเปตตสารละลายเอนไซมทสกดไดปรมาตร 200 ไมโครลตรใสลงในหลอด

ทดลอง เตมสารละลายโซเดยมฟอสเฟตบฟเฟอรความเขมขน 0.05 โมลาร พเอช 6.4 ทมสารละลายโซเดยมคลอไรด ความเขมขน 0.1โมลาร ลงไป 100 ไมโครลตร หลงจากนนเตมสารละลายสยอม Coomassie Brilliant Blue G-250 ลงไปหลอดละ 3.0 มลลลตร ผสมสารละลายใหเขากน แลวตงทงไว 10 นาท น าไปวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 595 นาโนเมตร ดวยเครองสเปกโตร- โฟโตมเตอร น าคาการดดกลนแสงทอานไดไปเปรยบเทยบหาปรมาณโปรตนจากแผนภาพโปรตนมาตรฐาน แสดงวธการค านวณในภาคผนวก ข 3

5. การวเคราะหผลทางสถต วางแผนการทดลองแบบ T-test (Two-samples T-test) ม 10 ซ าตออณหภม ซ าละ 1 ผล

น าขอมลผลการทดลองทไดมาวเคราะหผลทางสถตดวยวธการหาคาเฉลย และเปรยบเทยบความแตกตางระหวางคาเฉลยของอณหภมทเกบรกษาเปนระยะเวลา 30 วน

39

3.5 การทดลองท 2 ความสมพนธระหวางคณภาพทางกายภาพและทางเคมของผลสบปะรดทเกดอาการไสสน าตาลกบขอมลทไดจากเทคนคเนยรอนฟราเรดสเปกโทรสโกป

เกบเกยวผลสบปะรดพนธภแลทระยะแกส าหรบทางการคา คดเลอกผลทเปลอกมสเขยวทงผล ขนาดและรปรางใกลเคยงกน และปราศจากบาดแผล น าหนกประมาณ 500 กรม น าผลสบปะรดมากระตนใหแสดงอาการไสสน าตาล โดยเกบรกษาทอณหภม 10 องศาเซลเซยส นาน 10 และ 25 วน จากนนยายไปเกบรกษาทอณหภมหอง (30°C) เปนระยะเวลา 2 วน แลวน าผลสบปะรดมาวดสเปกตรม

1. การวดสเปกตรม

สมตวอยางผลสบปะรดในแตละระยะการเกบ รกษามาวดส เปกตรมดวย เค รอง NIRSystem 6500 ภาพท 3.3 คอ วดขวผล วดแกมผล (ไมปอกเปลอก) วดแกมผล (ปอกเปลอก) จากนนน าผลสบปะรดมาผาตามความยาวผลและวดสเปกตรมทแกนผลและเนอใกลแกนผล บรเวณขวผลและปลายผล ดงภาพท 3.4 ในชวงความยาวคลน 700-1100 นาโนเมตร ซงเปนชวงคลนส น ดวยหววด fiber optic probe ซงว ดแบบ interaction โดยใชผลสบปะรดจ านวน 50 ผลตอระยะเวลาการเกบรกษา จากนนน ามาวดคณภาพทางกายภาพและทางเคมทสมพนธกบการเกดอาการไสสน าตาลในผลสบปะรดทไดจากการทดลองท 1

ภาพท 3.3 การวดสเปกตรมผลสบปะรดดวยเครอง NIRSystem 6500 ดวย fiber optic probe

40

(a) (b) (c)

ภาพท 3.4 ต าแหนงทวดสเปกตรมของผลสบปะรด ไดแกขวผล, แกมผล (ไมปอกเปลอก) (a) แกมผล (ปอกเปลอก) (b) แกน และเนอผล สวนขวผล ปลายผล (c)

2. การวเคราะหขอมลทางสถตและการสรางสมการ

วางแผนการทดลองแบบ Completely randomized design (CRD) ม 50 ซ า ต อระยะเวลาการเกบรกษา ซ าละ 1 ผล น าขอมลผลการทดลองทไดมาวเคราะหผลทางสถตดวยวธการหาคาเฉลย และเปรยบเทยบความแตกตางระหวางคาเฉลยของระยะเวลาการเกบรกษา ดวยวธ Duncan’s test (Duncan’s multiple rank test) และหาความสมพนธระหวางขอมลคณภาพทางกายภาพและทางเคมของผลสบปะรดทเกดอาการไสสน าตาลกบขอมลสเปกตรมดวยโปรแกรม The Unscrambler version 9.8 (Camo, Oslo, Norway)

3.6 การทดลองท 3 การทดสอบความแมนย าของสมการเทยบมาตรฐาน (validation)

เกบเกยวผลสบปะรดพนธภแลทระยะแกส าหรบสงออก (150-160 วนหลงดอกบาน) คดเลอกผลทเปลอกมสเขยวทงผล ขนาดและรปรางใกลเคยงกน และปราศจากบาดแผล น าหนกประมาณ 500 กรม น ามาเกบรกษาไวทอณหภม 2 ระดบ คอ 10 องศาเซลเซยส (เพอกระตนใหแสดงอาการไสสน าตาล) และ 30 องศาเซลเซยส นาน 25 วน จากนนสมตวอยาง 50 ผล ทอณหภม 10 องศาเซลเซยส แลวยายมาไวทอณหภมหอง (30 องศาเซลเซยส) เปนเวลา 2 วน และน ามาทดสอบสมการ โดยน าผลสบปะรดมาวดสเปกตรมและวเคราะหคาทางเคมทสมพนธกบอาการไสสน าตาล (ทกขนตอนท าเหมอนขนตอนสรางสมการ)

41

การวเคราะหขอมลทางสถตและการทดสอบสมการ วางแผนการทดลองแบบ T-test (Two-samples T-test) ม 50 ซ าตออณหภม ซ าละ 1 ผล

น าขอมลผลการทดลองทไดมาวเคราะหผลทางสถตดวยวธการหาคาเฉลย และเปรยบเทยบความแตกตางระหวางคาเฉลยของอณหภมทเกบรกษา แลวน าขอมลทมความสมพนธระหวางขอมลคณภาพทางกายภาพและทางเคมของผลสบปะรดทเกดอาการไสสน าตาลกบขอมลสเปกตรมไปทดสอบสมการดวยโปรแกรม The Unscrambler version 9.8 (Camo, Oslo, Norway) เปรยบเทยบคาทไดจากการท านายดวยสมการเทยบมาตรฐานกบคาทวเคราะหไดจากวธอางอง